CN102040531B - 一种提取l-异亮氨酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物化工领域，公开了一种提取L-异亮氨酸的方法。本发明所述方法包括将L-异亮氨酸发酵液絮凝，絮凝后的澄清溶液用孔径为50nm、分子量为30KD的陶瓷膜微滤；微滤后所得滤液用强酸性阳离子树脂吸附，然后用0.2～0.6mol/L的氨水或氢氧化钠对强酸性阳离子树脂洗脱，收集洗脱开始至洗脱液pH值为7～8时的A洗脱液，收集洗脱液pH值为7～8至洗脱液pH值为9.5～10.5时的B洗脱液；所述A洗脱液进行浓缩、过滤、脱色，结晶后获得L-异亮氨酸晶体，所述B洗脱液重复离子交换吸附。本发明能有效去除滤液以及洗脱液中的杂质，提高L-异亮氨酸的提取率和品质，可广泛应用于L-异亮氨酸的生产中。

Description

一种提取L-异亮氨酸的方法

技术领域

本发明涉及生物化工领域，具体提供了一种提取L-异亮氨酸的方法。

背景技术

异亮氨酸，学名2-氨基-3-甲基戊酸，别名异白氨酸，是20种基本氨基酸的其中一种，几乎存在于所有蛋白质的结构中。异亮氨酸有2个不对称碳原子，故其存在4种立体异构体和2个L-异亮氨酸的非对映体，但是自然界中只存在L-异亮氨酸一种类型。由于L-异亮氨酸不能在人体内合成，所以它是人体必需氨基酸，与L-亮氨酸、L-缬氨酸统称为支链氨基酸，因其特殊的结构和功能，在人体生命代谢中具有重要作用。

在国际上，L-异亮氨酸生产厂家主要有日本味之素、协和发酵、田边制药以及德国Degussa等4家公司，均采用发酵法工艺生产L-异亮氨酸。其中，日本在L-异亮氨酸产量、品质和科技上居世界领先地位，其L-异亮氨酸产酸率为35-50g/L，提取率在70％。在国内，生产厂家主要有湖北宜药集团公司、宜昌三峡药业有限公司、无锡晶海氨基酸公司、南宁安力泰药业有限责任公司等。同时国内对离子交换吸附法提取L-异亮氨酸也有不少报道和专利，例如，来彩霞和刘清华分别在沈阳药科大学学报、无锡轻工大学学报上报道了利用离子交换法提取L-异亮氨酸的工艺；中国专利CN200510123082.X公开了离子交换法从发酵液中提取L-异亮氨酸的清洁生产工艺。但是，这些报道中的L-异亮氨酸的提取率只有50～60％，而且品质也较低。

造成L-异亮氨酸的提取率和品质较低的主要原因是，目前的工艺在离子交换吸附阶段普遍采取一次性收集洗脱液的方法，但随着洗脱时间的延长，洗脱液中的杂氨基酸含量会逐渐增加，这对L-异亮氨酸的提取和品质造成了影响。此外，目前的过滤工艺无法最大限度的去除菌体蛋白，而且现阶段的结晶工艺也无法高效地收获L-异亮氨酸晶体，这些也是造成L-异亮氨酸提取率和品质较低的因素之一。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种提取L-异亮氨酸的方法，该方法有效地解决了离子交换法中由于一次性收集洗脱液，造成洗脱液中杂氨基酸增加影响L-异亮氨酸提取的问题，提高了L-异亮氨酸的提取率和品质。

本发明提供一种提取L-异亮氨酸的方法，包括：

步骤1、将L-异亮氨酸发酵液絮凝，絮凝后的澄清溶液用孔径为50nm、分子量为30KD的陶瓷膜微滤；

步骤2、微滤后所得滤液用强酸性阳离子树脂吸附，然后用0.2～0.6mol/L的氨水或氢氧化钠对强酸性阳离子树脂洗脱，收集洗脱开始至洗脱液pH值为7～8时的A洗脱液，收集洗脱液pH值为7～8至洗脱液pH值为9.5～10.5时的B洗脱液；

步骤3、所述A洗脱液进行浓缩、过滤、脱色、结晶后，获得L-异亮氨酸晶体；

步骤4、B洗脱液用强酸性阳离子树脂吸附，然后用0.2～0.6mol/L的氨水或氢氧化钠对强酸性阳离子树脂洗脱，收集洗脱开始至洗脱液pH值为7～8时的洗脱液进行浓缩、过滤、脱色、结晶后获得L-异亮氨酸晶体；

步骤5、收集洗脱液pH值为7～8至洗脱液pH值为9.5～10.5时的B洗脱液重复步骤4。

具体流程图参见图1。

其中，L-异亮氨酸发酵液是由工业上常用L-异亮氨酸生产菌株与原料发酵后获得。

在过滤阶段，现有工艺是絮凝后直接进行一般过滤，这样就使L-异亮氨酸发酵液经过膜系统的多次循环，将絮凝的菌体打碎，影响了絮凝的效果，使滤液中存在菌体蛋白。而本发明采用絮凝与陶瓷膜微滤相结合的工艺，同时在微滤时取絮凝后的澄清溶液微滤，极大的减少了滤液的菌体蛋白含量。

其中，所述微滤的滤液与L-异亮氨酸发酵液的浓缩比为1∶6～10，所述微滤为在操作压力为0.2～0.8Mpa，过膜温度为40～60℃，添加透析水量为L-异亮氨酸发酵液的30～50％的操作要求下微滤，所述絮凝为用0.1～4％添加量的聚氯化铝、壳聚糖或阳性聚丙酰胺絮凝。在本发明中，所有的百分比均是指质量百分比。

在离子交换吸附阶段，本发明采用分段收集洗脱液的方法，并对不同阶段的洗脱液做不同处理。本发明用高效液相色谱法对不同阶段的洗脱液进行检测，检测结果显示从洗脱开始至洗脱液pH值为7～8时，洗脱液L-异亮氨酸含量大于0.2％且杂氨基酸含量小于0.15％，其杂氨基酸含量对L-异亮氨酸的后期提取无影响，故命名此阶段洗脱液为A洗脱液并收集，直接送入下一工序。由于采用氨水或氢氧化钠来洗脱，随着洗脱的不断进行，洗脱液的pH值会越来越大，检测结果显示从洗脱液pH值为7～8至洗脱液pH值为9.5～10.5时，洗脱液L-异亮氨酸含量大于0.2％且杂氨基酸含量为0.15～0.5％，命名此阶段洗脱液为B洗脱液并收集，其所含杂氨基酸略微超出标准，需要再次进行离子交换吸附，这样不但保证下次收集到的A洗脱液的质量较高，同时可以避免对洗脱液的损耗，确保L-异亮氨酸的提取率和品质。

其中，所述杂氨基酸是指洗脱液中除L-异亮氨酸外的其他所有氨基酸，所述洗脱速度为0.2～0.5m/s，所述强酸性阳离子树脂为732型、JK008型或JK006型树脂。

在其他工序阶段，本发明改变原有先脱色后浓缩工序，采用先浓缩后脱色的方法，有效的减少活性炭的用量。所述A洗脱液浓缩后进行分离，得到包含L-异亮氨酸的固体和母液，大部分杂质进入到母液中，而固体中的色素和其他杂质就会减少，这样固体再溶解脱色时不但可以减少活性炭的用量，还提高了产品的质量。

本发明在结晶阶段采用梯度降温、低温育晶的方法，用12h梯度降温至-10～8℃，然后育晶2～8h。粗大的晶体利于分离洗涤且质量较好，细小的晶体在分离中容易流失。如果使用快速降温，晶体无生长过程，会产生大量细小晶体，并且这种析出过快的晶体容易夹带杂质，会降低L-异亮氨酸的提取率和品质。因此，本发明使用梯度降温控制晶体生长速度，使晶体缓慢生长为粗大晶体，并且在低温下育晶可以进一步降低L-异亮氨酸在水中的溶解度，利于析出更多的晶体。

此外，本发明所述方法还包括对所述结晶后的残液进行分类处理，具体为：

当残液杂氨基酸含量小于4％且硫酸盐含量小于1％时，残液重复步骤3所述脱色、结晶；当残液杂氨基酸含量大于4％或硫酸盐含量大于1％时，残液重复步骤3所述浓缩、过滤、脱色、结晶。

本发明能够有效去除滤液以及洗脱液中的杂质，提高L-异亮氨酸的提取率和品质，节约成本，有利于保护自然环境，可广泛应用于L-异亮氨酸的生产中。

附图说明

图1所示为本发明所述提取L-异亮氨酸的方法流程图。

具体实施方式

本发明公开了一种提取L-异亮氨酸的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

依照本发明，所述一种提取L-异亮氨酸的方法，包括：

步骤1、将L-异亮氨酸发酵液絮凝，絮凝后的澄清溶液用孔径为50nm、分子量为30KD的陶瓷膜微滤；

步骤2、微滤后所得滤液用强酸性阳离子树脂吸附，然后用0.2～0.6mol/L的氨水或氢氧化钠对强酸性阳离子树脂洗脱，收集洗脱开始至洗脱液pH值为7～8时的A洗脱液，收集洗脱液pH值为7～8至洗脱液pH值为9.5～10.5时的B洗脱液；

步骤3、所述A洗脱液进行浓缩、过滤、脱色、结晶后，获得L-异亮氨酸晶体，所述B洗脱液重复步骤2。

其中，所述微滤的滤液与L-异亮氨酸发酵液的浓缩比为1∶6～10，所述微滤为在操作压力为0.2～0.8Mpa，过膜温度为40～60℃，添加透析水量为L-异亮氨酸发酵液的30～50％的操作要求下微滤，所述絮凝为用0.1～4％添加量的聚氯化铝、壳聚糖或阳性聚丙酰胺絮凝。

其中，所述洗脱速度为0.2～0.5m/s，所述强酸性阳离子树脂为732型、JK008型或JK006型树脂；所述结晶为梯度降温至-10～8℃，然后育晶2～8h。

此外，本发明所述方法还包括对所述结晶后的残液进行分类处理，具体为：

当残液杂氨基酸含量小于4％且硫酸盐含量小于1％时，残液重复步骤3所述脱色、结晶；当残液杂氨基酸含量大于4％或硫酸盐含量大于1％时，残液重复步骤3所述浓缩、过滤、脱色、结晶。

经本发明所述方法提取的L-异亮氨酸提取率达到70％左右，其百分含量经高效液相色谱检测达到98.5％以上，表明本发明所述方法能够提高L-异亮氨酸的提取率和品质。

此外，本发明还对滤液中菌体蛋白的湿固含量进行了检测，结果为0，而采用一般方法过滤后的滤液，其菌体蛋白的湿固含量为0.3％，充分说明了本方法较一般方法更能有效去除菌体蛋白。

下面结合实施例，进一步阐述本发明。

实施例1：本发明所述方法提取L-异亮氨酸

1、提取方法

经灭酶处理的L-异亮氨酸发酵液，用盐酸调节发酵液pH至3，按0.1％的添加量加入壳聚糖，维持絮凝温度20℃，并搅拌30min。采用孔径为50nm、分子量为30KD、面积为117m²的陶瓷膜对絮凝后的澄清溶液微滤，控制过陶瓷膜操作压力为0.2Mpa，过膜温度40℃，添加透析水量为发酵液的30％(体积比)，滤液与L-异亮氨酸发酵液的浓缩比为1∶6。将滤液直接在732型强酸型阳离子树脂上进行吸附，上柱速度为0.2m/s。吸附饱和后，采用去离子水清洗树脂杂质。然后采用0.2mol/L氨水进行洗脱，洗脱速度采用0.2m/s，收集由洗脱开始至洗脱液pH 7的A洗脱液；收集由洗脱液pH 7开始至洗脱液pH 9.5的B洗脱液。

将所述B洗脱液再次送入离子交换吸附阶段进行下一个循环。所述A洗脱液进入单效结晶罐浓缩，真空度≤0.92Mpa，温度控制在60℃，当浓缩后的A洗脱液与浓缩前的A洗脱液的体积比为1∶6时，冷却至0℃进行放罐。将浓缩后的A洗脱液板框过滤，当进料压力＞0.3Mpa时，停止进料，采用0.3Mpa空气进行顶料直至无水滴出为止，得到滤饼。然后根据滤饼含量，按L-异亮氨酸折纯4％采用去离子水进行溶解。升温至60℃，按0.5～2％进行投炭。脱色时间1小时，中间可分次投炭，直至粗品透光率大于99％。

将脱色后的溶液蒸发，控制蒸发温度60℃，真空度≤0.92Mpa，当蒸发后溶液与蒸发前溶液体积比达到1∶5时停止，放料。采用梯度降温，12小时降至-10℃，每小时降温幅度不超过6℃，并在此温度下育晶2小时。育晶结束后，从育晶罐放料到离心机离心，至无残液流出为止，中间可根据料液情况适当洗水，所得晶体为L-异亮氨酸，所得残液根据料液质量情况做以下处理：

当残液杂氨基酸含量小于4％且硫酸盐含量小于1％时，将残液送入脱色工序，进入下一个循环；当残液杂氨基酸含量大于4％或硫酸盐含量大于1％时，将残液送入浓缩工序，进入下一个循环。

2、产品检测

统计L-异亮氨酸产品的提取率，为71.2％；用高效液相色谱对产品进行含量检测，L-异亮氨酸含量为98.7％。检测结果表明，本发明所述方法提高了L-异亮氨酸提取率，同时产品质量达到较高水平。

实施例2：本发明所述方法提取L-异亮氨酸

1、提取方法

经灭酶处理的L-异亮氨酸发酵液，用盐酸调节发酵液pH至3，按4％的添加量加入氯化铝，维持絮凝温度70℃，并搅拌120min。采用孔径为50nm、分子量为30KD、面积为117m²的陶瓷膜对絮凝后的澄清溶液微滤，控制过陶瓷膜操作压力为0.8Mpa，过膜温度60℃，添加透析水量为发酵液的50％(体积比)，滤液与L-异亮氨酸发酵液的浓缩比为1∶10。将滤液直接在JK008型强酸型阳离子树脂上进行吸附，上柱速度为1m/s。吸附饱和后，采用去离子水清洗树脂杂质。然后采用0.6N氢氧化钠进行洗脱，洗脱速度采用0.5m/s，收集由洗脱开始至洗脱液pH 8的A洗脱液；收集由洗脱液pH 8开始至洗脱液pH 10.5的B洗脱液。

将所述B洗脱液再次送入离子交换吸附阶段进行下一个循环。所述A洗脱液进入单效结晶罐浓缩，真空度≤0.92Mpa，温度控制在80℃，当浓缩后的A洗脱液与初始A洗脱液的体积比为1∶8时，冷却至30℃进行放罐。将浓缩后的A洗脱液板框过滤，当进料压力＞0.3Mpa时，停止进料，采用0.3Mpa空气进行顶料直至无水滴出为止，得到滤饼。然后根据滤饼含量，按L-异亮氨酸折纯4％采用去离子水进行溶解。升温至60℃，按0.5～2％进行投炭。脱色时间1小时，中间可分次投炭，直至粗品透光率达到＞99％。

将脱色后的溶液蒸发，控制蒸发温度60℃，真空度≤0.92Mpa，当蒸发后溶液与蒸发前溶液体积比达到1∶5时停止，放料。采用梯度降温，12小时降至8℃，每小时降温幅度不超过5℃，并在此温度下育晶8小时。育晶结束后，从育晶罐放料到离心机离心，至无残液流出为止，中间可根据料液情况适当洗水，所得晶体为L-异亮氨酸，所得残液根据料液质量情况做以下处理：

当残液杂氨基酸含量小于4％且硫酸盐含量小于1％时，将残液送入脱色工序，进入下一个循环；当残液杂氨基酸含量大于4％或硫酸盐含量大于1％时，将残液送入浓缩工序，进入下一个循环。

2、产品检测

统计L-异亮氨酸产品的提取率，为72.4％；用高效液相色谱对产品进行含量检测，L-异亮氨酸含量为98.1％。检测结果表明，本发明所述方法提高了L-异亮氨酸提取率，同时产品质量达到较高水平。

实施例3：本发明所述方法提取L-异亮氨酸

1、提取方法

经灭酶处理的L-异亮氨酸发酵液，用盐酸调节发酵液pH至3，按4％的添加量加入氯化铝，维持絮凝温度45℃，并搅拌60min。采用孔径为50nm、分子量为30KD、面积为117m²的陶瓷膜对絮凝后的澄清溶液微滤，控制过陶瓷膜操作压力为0.5Mpa，过膜温度50℃，添加透析水量为发酵液的40％(体积比)，滤液与L-异亮氨酸发酵液的浓缩比为1∶8。将滤液直接在JK006型强酸型阳离子树脂上进行吸附，上柱速度为0.6m/s。吸附饱和后，采用去离子水清洗树脂杂质。然后采用0.4N氨水进行洗脱，洗脱速度采用0.3m/s，收集由洗脱开始至洗脱液pH 8的A洗脱液；收集由洗脱液pH 8开始至洗脱液pH10.5的B洗脱液。

将所述B洗脱液再次送入离子交换吸附阶段进行下一个循环。所述A洗脱液进入单效结晶罐浓缩，真空度≤0.92Mpa，温度控制在70℃，当浓缩后的A洗脱液与初始A洗脱液的体积比为1∶7时，冷却至15℃进行放罐。将浓缩后的A洗脱液板框过滤，当进料压力＞0.3Mpa时，停止进料，采用0.3Mpa空气进行顶料直至无水滴出为止，得到滤饼。然后根据滤饼含量，按L-异亮氨酸折纯4％采用去离子水进行溶解。升温至60℃，按0.5～2％进行投炭。脱色时间1小时，中间可分次投炭，直至粗品透光率达到＞99％。

将脱色后的溶液蒸发，控制蒸发温度60℃，真空度≤0.92Mpa，当蒸发后溶液与蒸发前溶液体积比达到1∶5时停止，放料。采用梯度降温，12小时降至0℃，每小时降温幅度不超过5℃，并在此温度下育晶5小时。育晶结束后，从育晶罐放料到离心机离心，至无残液流出为止，中间可根据料液情况适当洗水，所得晶体为L-异亮氨酸，所得残液根据料液质量情况做以下处理：

当残液杂氨基酸含量小于4％且硫酸盐含量小于1％时，将残液送入脱色工序，进入下一个循环；当残液杂氨基酸含量大于4％或硫酸盐含量大于1％时，将残液送入浓缩工序，进入下一个循环。

2、产品检测

统计L-异亮氨酸产品的提取率，为73.3％；用高效液相色谱对产品进行含量检测，L-异亮氨酸含量为97.7％。检测结果表明，本发明所述方法提高了L-异亮氨酸提取率，同时产品质量达到较高水平。

实施例4：本发明所述方法去菌体蛋白效果检测

L-异亮氨酸发酵液中的菌体蛋白含量通常用湿固含量来表示。湿固含量的检测方法为用离心的方式分离菌体蛋白，然后测定湿蛋白的质量从而得出其在发酵液中的含量。

本发明对实施例1至3中微滤后的滤液进行菌体蛋白湿固含量检测，作为比较，对采用一般方法直接过滤的滤液和未过滤的发酵液也进行菌体蛋白湿固含量检测，具体结果参见表1。

表1菌体蛋白含量

	未过滤	一般方法	实施例1	实施例2	实施例3
						菌体蛋白湿固含量	15％	0.3％	0	0	0

结果显示，L-异亮氨酸发酵液在经过本发明所述方法微滤后，菌体蛋白湿固含量均为0，而采用一般方法直接过滤后的滤液，其菌体蛋白湿固含量为0.3％，未过滤的发酵液菌体蛋白湿固含量为15％。实验数据表明本发明所述方法能够有效地去除发酵液中菌体蛋白，消除其对L-异亮氨酸提取率和品质的影响。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种提取L-异亮氨酸的方法，其特征在于，包括： 

步骤1、将L-异亮氨酸发酵液絮凝，絮凝后的澄清溶液用孔径为50nm、分子量为30KD的陶瓷膜微滤； 

所述微滤的滤液与L-异亮氨酸发酵液的浓缩比为1:6~10，所述微滤为在操作压力为0.2~0.8MPa，过膜温度为40~60℃，添加透析水量为L-异亮氨酸发酵液的30~50%的操作要求下微滤； 

步骤2、微滤后所得滤液用强酸性阳离子树脂吸附，然后用0.2~0.6mol/L的氨水或氢氧化钠对强酸性阳离子树脂洗脱，收集洗脱开始至洗脱液pH值为7~8时的A洗脱液，收集洗脱液pH值为7~8至洗脱液pH值为9.5~10.5时的B洗脱液； 

步骤3、A洗脱液进行浓缩、过滤、脱色、结晶后，获得L-异亮氨酸晶体； 

步骤4、B洗脱液用强酸性阳离子树脂吸附，然后用0.2~0.6mol/L的氨水或氢氧化钠对强酸性阳离子树脂洗脱，收集洗脱开始至洗脱液pH值为7~8时的洗脱液进行浓缩、过滤、脱色、结晶后获得L-异亮氨酸晶体； 

步骤5、收集洗脱液pH值为7~8至洗脱液pH值为9.5~10.5时的B洗脱液重复步骤4； 

所述强酸性阳离子树脂为732型、JK008型或JK006型树脂。 

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述絮凝为用0.1~4%添加量的聚氯化铝、壳聚糖或阳性聚丙酰胺絮凝。 

3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述洗脱为以0.2~0.5m/s的速度洗脱。 

4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述结晶为梯度降温至-10~8℃，然后育晶2~8h。 

5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，还包括对所述结晶后的残液进行分类处理，具体为： 

当残液杂氨基酸含量小于4%且硫酸盐含量小于1%时，残液重复步骤3所述脱色、结晶；当残液杂氨基酸含量大于4%或硫酸盐含量大于1%时，残液重复步骤3所述浓缩、过滤、脱色、结晶。