CN101497574B - 膜分离与工业色谱分离联用提取分离l-异亮氨酸的方法 - Google Patents
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Abstract
膜分离与工业色谱分离联用提取分离L-异亮氨酸的方法，属于生物化工领域。本发明由(1)发酵液除菌体；(2)工业色谱高效分离无机盐及其他氨基酸；(3)发酵液除杂质及色素；(4)发酵液浓缩结晶等步骤组成。本发明方法具有条件温和、操作简便、分离步骤少、选择性好，清洁生产等特点，克服了现有技术存在的收率不高、污水排量大及生产强度大的缺点，并且使L-异亮氨酸的收率和质量显著提高。
Description
技术领域
本发明涉及一种L-异亮氨酸的提取分离方法，尤其涉及一种利用膜分离与工业色谱分离组合技术从发酵液中分离提取L-异亮氨酸的方法。属于生物化工领域。
背景技术
L-异亮氨酸作为支链氨基酸之一，系人体必须氨基酸，具有多种生理功能。因其特殊的结构和功能，在人类生命代谢中占特别重要的地位，主要用以配制复合氨基酸输液、合成多肽药物和食品抗氧化剂等，尤其是在医学研究和治疗中的作用，日益受到重视。它在血脑屏障、肝昏迷、慢性肝硬化以及肾功能衰竭的治疗，先天性代谢缺陷病的膳食治疗，败血症及术后糖尿病患者的治疗，加快外科创伤愈合，肿瘤患者的营养支持治疗中应用广泛。因此，在医药和食品行业具有广泛的应用及商业价值。
L-异亮氨酸的生产方法有提取法、化学合成法、发酵法。提取法和化学合成法由于原料来源受限制，生产成本高，污染环境，难以实现工业化生产。自1956年日本协和发酵公司用发酵法生产谷氨酸以后，氨基酸的发酵生产发展很快，到目前为止，绝大多数氨基酸已能用发酵法和酶法生产。微生物发酵法生产L-异亮氨酸具有原料成本低、反应条件温和、容易实现大规模生产等优点，是目前生产L-异亮氨酸最主要的方法。
目前，L-异亮氨酸的提取普遍采用离子交换工艺。该工艺的一般过程为：发酵液过滤除去菌体、采用该工艺从发酵液中分离提取L-异亮氨酸存在以下问题：一是采用过滤的方法去除菌体，由于菌体细小，通常菌体去除不彻底；二是L-异亮氨酸发酵液色值比较高，普通活性炭脱色不完全并且用量大，影响产品质量和收率；三是L-异亮氨酸发酵液中杂质成分多、含量高，直接使用离子交换法处理，树脂污染严重，容易引起树脂结构破环而失去再生能力，增加了运行成本，同时高含量的离子性物质会使树脂快速饱和，增加树脂再生次数，造成污水排放量大等问题。
国内L-异亮氨酸发酵生产提取方法基本沿用上述方法，个别工序进行了调整，但未从根本上解决L-异亮氨酸提取过程中发酵液杂质去除不彻底、离子交换树脂污染严重、L-异亮氨酸提取收率低、L-异亮氨酸产品纯度低等问题。
上述L-异亮氨酸提取工艺是二十世纪八十年代建立起来的。随着生化分离技术的进步，各种先进的分离设备和工艺在生产中发挥越来越大的作用，特别是膜分离技术和工业色谱分离技术的发展和应用，使各种生化分离工艺大为改观。膜分离技术用于发酵产品的分离精制已有成功的先例，但利用膜分离与工业色谱分离组合技术从发酵液中分离提取L-异亮氨酸，还未见报道。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供膜分离与工业色谱分离组合技术从发酵液中分离提取L-异亮氨酸的方法，该方法具有条件温和、操作简便、分离步骤少、选择性好，清洁生产环保的特点，克服了现有技术存在的收率不高、污水排量大及生产强度大的缺点，并且使L-异亮氨酸的收率和质量显著提高。
本发明的技术方案：基本步骤是：首先将发酵液利用孔径0.1-0.6μm的微孔滤膜去除菌体，得到发酵清液经工业色谱柱分离无机盐及部分杂酸，再用纳滤膜去除色素和小分子杂质，得到的澄清淡黄色的L-异亮氨酸溶液，经过RO反渗透膜预浓缩、结晶等步骤制得粗品，粗品经精制后得到高纯度的L-异亮氨酸产品。
一种利用膜分离与工业色谱分离组合技术从发酵液中提取分离L-异亮氨酸的方法，由以下步骤组成：
(1)发酵液超滤除菌体：将发酵液通过截留相对分子质量10万-100万D的0.1-0.6μm微孔滤膜，彻底去除发酵液中的菌体，得到L-异亮氨酸发酵清液，操作压力为0.3-0.8MPa，操作温度为10-60℃，透析水量以体积百分计占进料发酵液体积的10％-90％；
(2)工业色谱分离：将步骤(1)得到的L-异亮氨酸发酵清液预浓缩至固含物3％-6％，上工业色谱柱，用1-5倍发酵清液体积的水做助推剂进行分离，操作温度20-60℃去除无机盐和发酵液中的杂酸，得到高纯度的分离发酵清液；分离出的无机盐部分的分离液用于发酵液的配料；
(3)纳滤去除小分子蛋白杂质及色素：将步骤(2)得到的高纯度分离后的L-异亮氨酸清液用截留相对分子质量为100-3000D的纳滤膜去除色素和小分子蛋白杂质，得到澄清无色的L-异亮氨酸溶液，操作压力为1.0-3.0MPa，操作温度为10-60℃，透析水量以体积百分计占进料清液体积的10％-90％；
(4)发酵液反渗透膜预浓缩：将步骤(3)得到澄清无色的L-异亮氨酸溶液通过反渗透膜浓缩，得到固含物为3％-7％的浓缩料液，操作压力为0.5-1.5MPa，操作温度为10-60℃，透析水量以体积百分计占进料液体积的10％-90％；
(5)以常规方法进行浓缩、结晶得到L-异亮氨酸粗品。
步骤(1)所述发酵液超滤除菌体的操作温度选用20-40℃。
步骤(2)所述的工业色谱分离，以1-3倍发酵清液体积的水做助推剂，操作温度选用20-40℃。
步骤(3)所述的纳滤，纳滤膜用截留相对分子质量为300-1000D，操作压力选用1.0-2.0MPa，操作温度选用20-40℃，透析水量以体积百分计占进料清液体积的10％-50％。
步骤(4)所述反渗透膜预浓缩，操作温度选用20-40℃，透析水量以体积百分计占进料液体积的10％-50％；得到固含物为3％-7％的浓缩料液。
本发明的有益效果：本发明涉及的从发酵液中分离提取L-异亮氨酸的方法，首次将膜分离技术引入发酵法生产L-异亮氨酸的的分离提取，并根据发酵液中杂质的粒度分布建立了一套多级膜分离体系，克服了现有技术存在的收率不高、污水排放量大及生产强度高的缺陷，使L-异亮氨酸的收率和质量显著提高，生产成本降低。与现有工艺技术相比，本发明方法的优越性如下：
1、本发明采用微孔滤膜过滤去除发酵液中的菌体，改变了常规压滤机过滤的方法。经微滤膜过滤去除菌体彻底，过滤清液澄清透明，还能去除大分子蛋白，除菌效果大大高于过滤法。
2、本发明采用膜分离技术使L-异亮氨酸发酵液中的离子性杂质和色素含量大大降低。
3、工业色谱分离技术替代了离子交换的传统生产工艺，以水作为助推剂，避免了离子交换再生、洗脱过程形成的大量废水，发挥了清洁生产的功效。同时工业色谱的高效分离，能够去除发酵液其他与异亮氨酸具有相似化学物理性质的氨基酸，产品的纯度比传统离子交换提取工艺的纯度明显提高。
具体实施方式
实施例1
L-异亮氨酸发酵液4L经过截留分子量20万微滤膜过滤去除菌体，操作压力0.3MPa，温度30℃，透析水量1L，滤液彻底去除菌体；然后经1L的工业色谱柱分离，用水量5升，温度30℃，得到分离的异亮氨酸清液。分离清液经过截留分子量为500的钠滤膜过滤去除小分子杂质和色素，操作压力1.2MPa，温度30℃，透析水量1.5L，然后经过RO反渗透膜预浓缩。结果见下表。
| T(640nm) | 体积(L) | L-异亮氨酸(g/L) | 收率(％) | |
| 发酵液 | 8.3 | 4.0 | 27.1 | 100 |
| 微滤膜滤液 | 71.3 | 4.5 | 23.6 | 98.2 |
| 工业色谱柱 | 83.4 | 5.6 | 20.5 | 97.4 |
| 钠滤清液 | 99.5 | 6.0 | 18.8 | 96.1 |
| RO膜 | 99.1 | 4.1 | 24.7 | 93.6 |
| 总收率 | 93.6 |
实施例2
L-异亮氨酸发酵液300L经过截留分子量80万微滤膜过滤去除菌体，操作压力0.35MPa，温度30℃，透析水量90L，滤液彻底去除菌体；然后经80L的工业色谱柱分离，用水量500升，温度30℃，得到分离的异亮氨酸清液。分离清液经过截留分子量为500的钠滤膜过滤去除小分子杂质和色素，操作压力1.2MPa，温度30℃，透析水量1.5L，然后经过RO反渗透膜预浓缩。结果见下表。
| T(640nm) | 体积(L) | L-异亮氨酸(g/L) | 收率(％) | |
| 发酵液 | 9.1 | 300 | 28.9 | 100 |
| 微滤膜滤液 | 75.2 | 334 | 25.7 | 98.9 |
| 工业色谱柱 | 85.3 | 402 | 21.1 | 97.9 |
| 钠滤清液 | 99.2 | 436 | 19.1 | 96.3 |
| RO膜 | 98.9 | 300 | 27.3 | 94.6 |
| 总收率 | 94.6 |
实施例3
L-异亮氨酸发酵液4.5M3经过截留分子量80万微滤膜过滤去除菌体，操作压力0.4MPa，温度30℃，透析水量1.5吨，滤液彻底去除菌体；然后经80L的工业色谱柱分离，用水量7吨，温度30℃，得到分离的异亮氨酸清液。分离清液经过截留分子量为1000的钠滤膜过滤去除小分子杂质和色素，操作压力1.2MPa，温度30℃，透析水量1.5L，然后经过RO反渗透膜预浓缩。结果见下表。
| T(640nm) | 体积(M3) | L-异亮氨酸(g/L) | 收率(％) | |
| 发酵液 | 9.2 | 4.5 | 28.6 | 100 |
| 微滤膜滤液 | 75.1 | 5.1 | 24.8 | 98.1 |
| 工业色谱柱 | 83.6 | 6.1 | 20.6 | 97.8 |
| 钠滤清液 | 93.1 | 7.4 | 16.8 | 96.9 |
| RO膜 | 99.5 | 5.1 | 23.8 | 94.2 |
| 总收率 | 94.2 |
实施例4
L-异亮氨酸发酵液45.8M3经过经过截留分子量80万微滤膜过滤去除菌体，操作压力0.35MPa，温度30℃，透析水量90L，滤液彻底去除菌体；然后经80L的工业色谱柱分离，用水量700升，温度30℃，得到分离的异亮氨酸清液。分离清液经过截留分子量为500的钠滤膜过滤去除小分子杂质和色素，操作压力1.2MPa，温度30℃，透析水量1.5L，然后经过RO反渗透膜预浓缩。结果见下表。
| T(640nm) | 体积(M3) | L-异亮氨酸(g/L) | 收率(％) | |
| 发酵液 | 9.5 | 45.8 | 28.6 | 100 |
| 微滤膜滤液 | 72.9 | 53.1 | 24.4 | 98.9 |
| 工业色谱柱 | 85.2 | 59.6 | 21.1 | 95.9 |
| 钠滤清液 | 92.8 | 71.3 | 17.3 | 94.3 |
| RO膜 | 99.5 | 48.2 | 25.3 | 93.2 |
| 总收率 | 93.2 |
Claims (5)
1.一种利用膜分离与工业色谱分离组合技术从发酵液中提取分离L-异亮氨酸的方法，由以下步骤组成：
(1)发酵液超滤除菌体：将发酵液通过截留相对分子质量10万-100万D的0.1-0.6μm微孔滤膜，彻底去除发酵液中的菌体，得到L-异亮氨酸发酵清液，操作压力为0.3-0.8MPa，操作温度为10-60℃，透析水量以体积百分计占进料发酵液体积的10％-90％；
(2)工业色谱分离：将步骤(1)得到的L-异亮氨酸发酵清液预浓缩至固含物3％-6％，上工业色谱柱，用1-5倍发酵清液体积的水做助推剂进行分离，操作温度20-60℃去除无机盐和发酵液中的杂酸，得到高纯度的分离发酵清液；
(3)纳滤去除小分子蛋白杂质及色素：将步骤(2)得到的高纯度分离后的L-异亮氨酸清液用截留相对分子质量为100-3000D的纳滤膜去除色素和小分子蛋白杂质，得到澄清无色的L-异亮氨酸溶液，操作压力为1.0-3.0MPa，操作温度为10-60℃，透析水量以体积百分计占进料清液体积的10％-90％；
(4)发酵液反渗透膜预浓缩：将步骤(3)得到澄清无色的L-异亮氨酸溶液通过反渗透膜浓缩，得到固含物为3％-7％的浓缩料液，操作压力为0.5-1.5MPa，操作温度为10-60℃，透析水量以体积百分计占进料液体积的10％-90％；
(5)以常规方法进行浓缩、结晶得到L-异亮氨酸粗品。
2.如权利要求1所述的一种利用膜分离与工业色谱分离组合技术从发酵液中提取分离L-异亮氨酸的方法，其特征在于，步骤(1)所述发酵液微滤除菌体的操作温度选用20-40℃。
3.如权利要求1所述的一种利用膜分离与工业色谱分离组合技术从发酵液中提取分离L-异亮氨酸的方法，其特征在于，步骤(2)所述的工业色谱分离，以1-3倍发酵清液体积的水做助推剂，操作温度选用20-40℃。
4.如权利要求1所述的一种利用膜分离技术从发酵液中提取分离L-异亮氨酸的方法，其特征在于，步骤(3)所述的纳滤，纳滤膜用截留相对分子质量为300-1000D，操作压力选用1.0-2.0MPa，操作温度选用20-40℃，透析水量以体积百分计占进料清液体积的10％-50％。
5.如权利要求1所述的一种利用膜分离与工业色谱分离组合技术从发酵液中提取分离L-异亮氨酸的方法，其特征在于，步骤(4)所述反渗透膜预浓缩，操作温度选用20-40℃，透析水量以体积百分计占进料液体积的10％-50％；得到固含物为3％-7％的浓缩料液。
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