CN109628516B - 一种l-异亮氨酸的生产和提取工艺 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种L‑异亮氨酸的生产和提取工艺，其包括如下步骤：步骤1)发酵，步骤2)过滤除菌，步骤3)色谱分离，步骤4)浓缩，步骤5)结晶，步骤6)干燥，步骤7)废物处理。本发明采用陶瓷膜‑脱色膜、吸附树脂色谱、双锥回转真空干燥等步骤得到L‑异亮氨酸精品，自动化程度高，操作简单，节约人工。

Description

一种L-异亮氨酸的生产和提取工艺

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及L-异亮氨酸生产技术领域，具体涉及一种L-异亮氨酸的生产和提取工艺。

背景技术

L-异亮氨酸分子式C₆H₁₃NO₂，相对分子质量131.17，熔点285℃－286℃。L-异亮氨酸比旋光度为[α]20D＝+41.1°(6NHCl，C＝4)，它的解离常数pK1(α-COOH)和pK2(α-NH₃ ⁺)分别为2.36与9.68；等电点(pI)为6.02。L-异亮氨酸溶于水，难溶于乙醇、乙醚，几乎不溶于其它有机溶剂，在水中的溶解度随着温度的升高而增大。

L-异亮氨酸是生命有机体的重要组成部分，是人体必需氨基酸之一，具有多种生理功能，在人类生命体内代谢调控和信息传递等许多方面扮演着重要角色。在医药方面，L-异亮氨酸可用于营养型复合氨基酸输液、要素膳。在饲料方面，L-异亮氨酸作为畜禽必需氨基酸对动物有特殊营养作用，可作为饲料添加剂使用。

L-异亮氨酸生产方法有提取法、化学合成法和发酵法三种。提取法主要是将大豆蛋白等进行水解，然后加入盐酸以生成并沉淀出L-异亮氨酸-盐酸盐晶体。该法分离效果好，提取操作简单，生产周期短，但是L-异亮氨酸的收率较低，导致生产成本居高不下，致使该法难以在工业化生产中得到推广。化学合成法具有多种合成方式，但是生产成本较高，反应步骤多，反应过程复杂，导致副产物较多，同样很难嫁接于工业化规模生产。生物发酵法则是利用L-异亮氨酸生产菌发酵生产目标产品，具有原料成本低、反应条件温和等优点，易于实现大规模生产，是一种非常经济的生产方法。

鉴于L-异亮氨酸生产的高难度，L-异亮氨酸一直是高价氨基酸。近年来，随着L-异亮氨酸及其代谢产物研究的深入，近十年我国发酵法生产L-异亮氨酸已取得较大进步。目前，L-异亮氨酸逐渐成为一种国际市场发展潜力巨大、国内市场需求较大的产品。

目前，L-异亮氨酸的生产方法有提取法、化学合成法、发酵法。工业生产上实施的大部分为发酵法。申请人之前的专利CN105274179A公开了一种提取L-异亮氨酸的工艺，其包括：1)混合发酵；2)过滤；3)浓缩重溶；4)离子交换，该工艺通过两种菌株混合发酵技术，大大提高了L-异亮氨酸的产量，较单一发酵相比提高了20％以上，但是存在两种菌株发酵工艺复杂，参数条件要求极为严格等缺陷。在此基础上，申请人对单一菌株的发酵条件进行了改进，参见专利“一种发酵提取L-异亮氨酸的工艺”对谷氨酸棒杆菌发酵条件进行了优化，L-异亮氨酸的浓度可达到3g/100L左右。

从发酵液中提取L-异亮氨酸是发酵法生产L-异亮氨酸的关键工序，现有的提取工艺主要存在以下几个问题。第一：传统的提取工艺主要采用离交，耗费大量的试剂，并需要增加工序去除这些试剂；这不仅增加了工艺的复杂性和工作量，还会造成不必要的生产浪费。第二：采用活性炭对L-异亮氨酸进行脱色，产生大量的废水和活性炭废料。

发明内容

为了克服现有技术中存在的不足之处，本发明提供了一种L-异亮氨酸的生产和提取工艺，该工艺操作简单，自动化程度高，节约人工；可创收更高的效益，可大规模推广使用。

本发明是通过以下生产技术方案实现的：

一种L-异亮氨酸的生产和提取工艺，其包括如下步骤：步骤1)发酵，步骤2)过滤除菌，步骤3)色谱分离，步骤4)浓缩，步骤5)结晶，步骤6)干燥，步骤7)废物处理。

进一步地，所述工艺包括如下步骤：

步骤1)发酵：将谷氨酸棒杆菌种子液按照10％接种量接种到发酵培养基中，发酵培养60-72小时，发酵培养条件为：温度30-32℃，溶氧量为20-30％，pH为6.5-6.8，得到L-异亮氨酸发酵液；

步骤2)过滤除菌：将L-异亮氨酸发酵液经过陶瓷膜过滤，得到截留物和滤液；

步骤3)色谱分离：步骤2)所得滤液经过吸附色谱分离，得到L-异亮氨酸提取液；

步骤4)浓缩：将步骤3)所得L-异亮氨酸提取液打入低温浓缩锅浓缩，得到L-异亮氨酸浓缩液；

步骤5)结晶：将步骤4)所得L-异亮氨酸浓缩液打入结晶罐中结晶，离心分离后，收集上清液和结晶沉淀；

步骤6)干燥：将步骤5)结晶沉淀打入双锥回旋真空干燥、粉碎、包装得到L-异亮氨酸产品；

步骤7)废物处理：将步骤2)所得截留物和步骤5)所得上清液一起送入下游饲料生产车间。

优选地，所述发酵培养基的组分为：葡萄糖110-160g/L，(NH₄)₂SO₄20-30g/L，KH₂PO₄2.2 g/L，K₂HPO₄1.0 g/L，MgSO₄·7H₂O 0.4g/L，FeSO₄·7H₂O 0.015g/L，MnSO₄·H₂O0.015g/L，VH 80μg/L，VB₁2.5mg/L，Met 30mg/L，Glu 20mg/L，肌醇20mg/L。

优选地，所述陶瓷膜的孔径为20-100nm，操作温度：45-50℃，工作压力差为1-2bar。

优选地，所述浓缩参数为：温度55-65℃，真空度-0.075MPa。

优选地，所述双锥回旋真空干燥的参数为：温度65-70℃，干燥时间2-3h。

本发明还要求保护上述工艺制备的产品。

本发明的技术方案具有以下突出优点及创新点：

1、本发明对培养基进行了优化，在培养基中添加了适量谷氨酸，对谷氨酸棒杆菌产谷氨酸途径产生反馈抑制，降低了谷氨酸脱氢酶活性，从而有助于代谢流向异亮氨酸产生途径；通过添加蛋氨酸造成蛋氨酸过剩，反馈抑制高丝氨酸转乙酰酶的合成，进而促进异亮氨酸的合成；适量的肌醇可以强化CO₂固定反应,促进氨基酸的积累，提高发酵转化率；多种因素相互协同，提高了异亮氨酸的发酵产量；

2、本发明分别采用陶瓷膜过滤系统对L-异亮氨酸发酵液进行预处理，相对于传统的板框过滤除蛋白的工序，蛋白的回收率较高，可大幅提高生产效率。

3、本发明引入膜分离技术，可以简化生产工艺，操作简单；同时膜设备占地面积小，操作及维护简单，节约产品成本，具有快速、经济的优点。

4、本发明采用双锥回转真空干燥机，使干燥效率显著提升，节省了水、电、气的消耗和人工成本，提高产品质量的同时降低了生产成本。

5、本发明无需加入絮凝剂等化学试剂，避免了絮凝剂残留对氨基酸的纯度造成影响。

说明书附图

图1：Glu添加量对发酵液中L-异亮氨酸浓度的影响；

图2：培养时间对发酵液中L-异亮氨酸浓度的影响。

具体实施例

为了使本技术领域的人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合本申请具体实施例，对本发明进行更加清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

实施例1

一种L-异亮氨酸的生产和提取工艺，其包括如下步骤：

步骤1)：将谷氨酸棒杆菌(CGMCC NO.12153，天津科技大学赠与使用)培养至浓度为5×10⁸CFU/mL的种子液，然后按照10％接种量接种到发酵培养基中，发酵培养72小时，发酵培养条件为：温度30℃，溶氧量为30％，pH为6.5-6.8，得到L-异亮氨酸发酵液；所述发酵培养基的组分为：葡萄糖120g/L，(NH₄)₂SO₄20g/L，FeSO₄·7H₂O 0.015g/L，MgSO₄·7H₂O0.4g/L，MnSO₄·H₂O 0.015g/L，KH₂PO₄2.2 g/L，K₂HPO₄1.0 g/L，VH 80μg/L，VB₁2.5mg/L，Met30mg/L，Glu 20mg/L，肌醇20mg/L；

步骤2)：将L-异亮氨酸发酵液经过陶瓷膜(20nm)去除菌体蛋白；膜过滤操作温度：45℃，工作压力差为1.2bar，得到截留物和滤过的清液；

步骤3)：步骤2)所得滤液经过吸附色谱分离，得到L-异亮氨酸提取液；

吸附色谱参数：色谱柱直径均为3000mm；柱高：CH200A--7800mm，CH200B--5750mm；材料是碳钢衬胶；设计压力是7.5MPa；设计温度是100℃；每个分离室高1100mm；树脂体积：每个分离室体积7200L；树脂总体积：7个室×7200升＝50400升；石英砂总体积：565升×7个室＝3850升；吸附树脂种类：XA5082；

步骤4)：将步骤3)所得L-异亮氨酸提取液打入低温浓缩锅浓缩，得到L-异亮氨酸浓缩液；浓缩锅温度60℃，真空度-0.075MPa，结晶体含量32％；

步骤5)：将步骤4)所得L-异亮氨酸浓缩液打入结晶罐中结晶，离心分离后，收集上清液和结晶沉淀；

步骤6)：将步骤5)结晶沉淀打入双锥回旋真空干燥、粉碎、包装得到L-异亮氨酸产品；锥内温度65℃，干燥时间3h，确保异亮氨酸水分小于0.3％；

步骤7)：将步骤2)所得截留物和步骤5)所得液一起送入下游饲料生产车间。

实施例2

一种L-异亮氨酸的生产和提取工艺，其包括如下步骤：

步骤1)：将谷氨酸棒杆菌(CGMCC NO.12153，天津科技大学赠与使用)培养至浓度为5×10⁸CFU/mL的种子液，然后按照10％接种量接种到发酵培养基中，发酵培养75小时，发酵培养条件为：温度30℃，溶氧量为30％，pH为6.5-6.8，得到L-异亮氨酸发酵液；所述发酵培养基的组分为：葡萄糖160g/L，(NH₄)₂SO₄30g/L，FeSO₄·7H₂O 0.015g/L，MgSO₄·7H₂O0.4g/L，MnSO₄·H₂O 0.015g/L，KH₂PO₄2.2 g/L，K₂HPO₄1.0 g/L，VH 80μg/L，VB₁2.5mg/L，Met30mg/L，Glu 20mg/L，肌醇20mg/L；

步骤2)：将L-异亮氨酸发酵液经过陶瓷膜(50nm)去除菌体蛋白；膜过滤操作温度：50℃，工作压力差为1.5bar，得到截留物和滤过的清液；

步骤3)：步骤2)所得滤液经过吸附色谱分离，得到L-异亮氨酸提取液；

吸附色谱参数：色谱柱直径均为3000mm；柱高：CH200A--7800mm，CH200B--5750mm；材料是碳钢衬胶；设计压力是7.5MPa；设计温度是100℃；每个分离室高1100mm；树脂体积：每个分离室体积7200L；树脂总体积：7个室×7200升＝50400升；石英砂总体积：565升×7个室＝3850升；吸附树脂种类：XA5082；

步骤4)：将步骤3)所得L-异亮氨酸提取液打入低温浓缩锅浓缩，得到L-异亮氨酸浓缩液；浓缩锅温度65℃，真空度-0.08MPa，结晶体含量34％；

步骤5)：将步骤4)所得L-异亮氨酸浓缩液打入结晶罐中结晶，离心分离后，收集上清液和结晶沉淀；

步骤6)：将步骤5)结晶沉淀打入双锥回旋真空干燥、粉碎、包装得到L-异亮氨酸产品；锥内温度70℃，干燥时间2h，确保异亮氨酸水分小于0.3％；

步骤7)：将步骤2)所得截留物和步骤5)所得液一起送入下游饲料生产车间。

实施例3

以200L发酵培养基为例，共获得L-异亮氨酸产品6.53kg，产品外观洁白透亮，经过检测(使用液相法测含量(《中华人民共和国药典》2015年版四部通则0512))，产品纯度为99.4％。

本发明还检测了培养基以及培养时间对发酵液中L-异亮氨酸浓度的影响。

以实施例1作为实验组，设置培养基中的Glu浓度为0，10,20,30,40,50(mg/L)，如图1所示，随着Glu浓度的增加，L-异亮氨酸的产量增加明显，当Glu浓度增大到20mg/L后，L-异亮氨酸的浓度没有明显变化，考虑到增产以及经济因素，选择20mg/L的含量最合适。

设置发酵培养的时间为24，36,48,60,72,84(h)，通过图2可见，随着发酵时间的增加，发酵液中L-异亮氨酸的浓度增幅明显，发酵时间达到60h时，增幅放缓，发酵时间在72h时达到峰值，继续增加发酵时间，L-异亮氨酸浓度没有变化。

本发明还检测了Met和肌醇两种调节因子的协同作用及对发酵产L-异亮氨酸的影响，其中，不添加肌醇，L-异亮氨酸的浓度下降3.3％；不添加Met，L-异亮氨酸的浓度下降4.6％；不添加肌醇和Met，L-异亮氨酸的浓度下降9.7％。

上述虽然结合实施例对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

Claims (1)

1.一种L-异亮氨酸的生产和提取工艺，其特征在于，所述工艺包括如下步骤：

步骤1)发酵：将谷氨酸棒杆菌种子液按照10%接种量接种到发酵培养基中，发酵培养60-72小时，发酵培养条件为：温度30-32℃，溶氧量为20-30%，pH为6.5-6.8，得到L-异亮氨酸发酵液；

步骤2)过滤除菌：将L-异亮氨酸发酵液经过陶瓷膜过滤，得到截留物和滤液；

步骤3)色谱分离：步骤2)所得滤液经过吸附色谱分离，得到L-异亮氨酸提取液；

步骤4)浓缩：将步骤3)所得L-异亮氨酸提取液打入低温浓缩锅浓缩，得到L-异亮氨酸浓缩液；

步骤5)结晶：将步骤4)所得L-异亮氨酸浓缩液打入结晶罐中结晶，离心分离后，收集上清液和结晶沉淀；

步骤6)干燥：将步骤5)将结晶沉淀打入双锥回旋真空干燥、粉碎、包装得到L-异亮氨酸产品；

步骤7)废物处理：将步骤2)所得截留物和步骤5)所得上清液一起送入下游饲料生产车间；

所述发酵培养基的组分为：葡萄糖110-160 g/L，(NH₄)₂SO₄ 20-30g/L，KH₂PO₄ 2.2 g/L，K₂HPO₄ 1.0 g/L，MgSO₄·7H₂O 0.4 g/L，FeSO₄·7H₂O 0.015 g/L， MnSO₄·H₂O 0.015 g/L，VH 80μg/L，VB₁ 2.5mg/L，Met 30mg/L，Glu 20mg/L，肌醇20mg/L；

所述陶瓷膜的孔径为20-100nm，操作温度：45-50℃，工作压力差为1-2bar；

所述浓缩参数为：温度55-65℃，真空度-0.075MPa；

所述双锥回旋真空干燥的参数为：温度65-70℃，干燥时间2-3h。

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