CN1844356A - 黄色短杆菌突变株及用于发酵法生产l－缬氨酸的工艺 - Google Patents
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Abstract
黄色短杆菌突变株及用于发酵法生产L－缬氨酸的工艺。以黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)HL41(CICC 10135)为出发菌种，选育具有遗传标记(Ile－+Leu－+SGr+α－ABr+2－TAr)的突变株TV230，使其具有L－缬氨酸的生物合成能力。用黄色短杆菌突变株TV230经扩培、发酵培养、及L－缬氨酸的提取步骤可得到L－缬氨酸粗品，进一步精制可得到L－缬氨酸纯品。本发明利用突变株发酵生产L－缬氨酸，可以大大提高L－缬氨酸的产率，最高产量可达55g/L，其产量完全满足实现大规模工业化生产的要求。本发明利用金属膜过滤法预处理发酵液，并以离子交换法提取L－缬氨酸，纯度可达95％以上，提取率85％以上。
Description
【技术领域】：本发明属于生化工程领域，涉及一种棒杆菌属(Brevibacteriumflavum)菌种以及应用该菌种发酵生产L-缬氨酸的方法。
【背景技术】：L-缬氨酸(L-Valine)的化学名为L-α-氨基异戊酸，L-缬氨酸是人与动物自身不能合成而必须依赖外源供给的八大必需氨基酸之一，又是三种支链氨基酸之一，因其特殊的结构和功能，因此，在人类生命代谢中具有特别重要的地位。
近年来，由于氨基酸在食品、医药、饲料、农业和日用化工等方面有极其广泛的用途，尤其随着抗癌药物制剂、氨基酸输液制剂及甜味二肽生产的飞速发展，对原料氨基酸的需求量日益增长，市场需求量不断增加。最近，人们发现L-缬氨酸是合成一种免疫抗生素的重要中间体，其年消耗量猛增到数千吨，现在世界L-缬氨酸年产量已达到1000吨以上，其中日本是主要生产国。而国内目前大批量生产厂家极少，仅配制氨基酸输液就需进口几百吨。随着氨基酸输液需求的不断增长，L-缬氨酸的需求也将增长。解决目前存在的问题，在我国开展此方面的研究对于国内L-缬氨酸产业化，促进医药行业的发展有重要的意义。
目前，L-缬氨酸的生产方法有提取法、合成法、发酵法等。提取法主要是从动物血粉和蚕蛹水解液中，应用离子交换技术从混合氨基酸中分离L-缬氨酸，分离的效率高，提取操作简单，生产周期短，但是成本高，不适合于现代化大工业生产。合成法很多，一种是由异丁酸与氨生成氨基异丁醇，再与氰化氢合成氨基异丁腈，然后水解而成。一种是由异丁醛与氰化氢合成羟基异丁腈，再与氨作用生成氨基异丁腈，水解得DL-缬氨酸，经化学法或酶法拆分得L-缬氨酸。也可由异丁醛与氰化钠和氯化铵直接合成氨基异丁腈，再水解而成。化学合成法生产成本高，反应复杂，步骤多，且有许多副产物。
发酵法利用微生物发酵法生产L-缬氨酸具有原料成本低，反应条件温和及易实现大规模生产等优点，是一种非常经济的生产方法。主要包括添加前体物发酵法和直接发酵法。添加前体物发酵法又称微生物转化法。这种方法使用葡萄糖作为发酵碳源、能源，再添加特异的前体物质即在氨基酸生物合成途径中的一些合适中间代谢产物，以避免氨基酸生物合成途径中的反馈调节作用，经微生物作用将其有效转化为目的氨基酸。由于其前体物质如丙酮酸等稀少或价格昂贵，目前已很少采用此法生产L-缬氨酸。直接发酵法是借助于微生物具有合成自身所需氨基酸的能力，通过对特定微生物的诱变处理，选育出营养缺陷型及氨基酸结构类似物抗性突变株，以解除代谢调节中的反馈抑制和反馈阻遏作用，从而达到过量积累某种氨基酸的目的。
【发明内容】：本发明目的之一是提供一种新的棒杆菌属的黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)，该菌具有提高L-缬氨酸产率的能力。
本发明的目的之二是解决现有 法和 ，无法实现产业化生产的问题，提供用上述菌种发酵法生产 的生产工艺。
本发明提供的黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)突变株TV230，以棒杆菌属的黄色短杆菌HL41(保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CICC 10135)为出发菌株，经硫酸二乙酯(DES)和紫外线诱变处理，定向选育出一株L-亮氨酸生产菌株TV230(Ile-+Leu-+SGr+α-ABr+2-TAr)，其遗传标记为异亮氨酸缺陷(Ile-)、亮氨酸缺陷(Leur)、磺胺胍抗性(SGr)、α-氨基丁酸(α-ABr)抗性、2-噻唑丙氨酸抗性(2-TAr)，使其具有L-缬氨酸的生物合成能力。
(注：黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)突变株TV230(Ile-+Leu-+SGr+α-ABr+2-TAr)曾于2002年12月在《天津轻工业学院学报》第4期上公开，现保藏于天津科技大学代谢控制发酵研究室，公众如有需要，可直接与该研究室联系。)
上述黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)突变株TV230的选育方法，其具体过程为：
第一步、诱变初筛：
将黄色短杆菌HL41经硫酸二乙酯(DES)常规诱变后菌株，经离心洗涤制成菌悬液，稀释后分别涂布于：
——基本培养基平板，其组成为：葡萄糖10-30g/L，(NH4)2SO45-20g/L，KH2PO4·3H2O 0.5-2g/L，MgSO4·7H2O 0.1-1.0g/L，FeSO4·7H2O 0.05-0.05g/L，MnSO4·H2O 0.005-0.05g/L，生物素100-1000μg/L，VB1 100-1000μg/L，琼脂粉15-35g/L，PH 7.0～7.2；
——以及抗性药物梯度平板，其组成为：基本培养基+L-亮氨酸10mg/L、L-异亮氨酸10mg g/L+2％结构类似物；完全培养基，其组成为：葡萄糖5g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 2.5g/L，琼脂条20g/L，pH 7.0～7.2 1.0kg/cm2，20min；+2％磺胺胍；
——或基本培养基添加了甲硫氨酸Met 0.0005-0.05％，或异亮氨酸Ile0.0005-0.05％的补充培养基平板；
28℃恒温静置培养4～6天，挑选在抗性药物梯度平板上生长的单菌落、或在甲硫氨酸或异亮氨酸补充培养基平板上生长而在基本培养基平板不生长的单菌落，并于斜面内保存待筛；
第二步、诱变复筛
摇瓶水平上对原菌株与各突变株产L-缬氨酸性能比较：
从上步新鲜斜面分别挑取一环原菌株与各突变株菌苔于种子培养基中，其组成g/L：葡萄糖10-35，玉米浆5-40，酵母粉2-20，MgSO4·7H2O0.2-1.0，MnSO4·H2O 0.005-0.015，生物素100-1000μg，VB1 100-1000μg，尿素0-3；pH7.0～7.2 0.75kg/cm2 20min，尿素分消0.5kg/cm2 3min；500mL三角瓶装液量30mL，9层纱布封口，置于旋转式摇床上200r/min，32℃振荡培养18小时；以接种量10％，初始pH7.0，接入发酵培养基中，其组成g/L：葡萄糖80-180，硫酸铵5-25，豆饼水解液5-35mL，K2HPO40.2-1.8，MgSO4·7H2O 0.2-1.0，MnSO4·H2O 0.005-0.015，生物素50-1000μg，VB150-1000μg，L-异亮氨酸0.01-0.5，L-亮氨酸0.01-0.5，pH7.0～7.2，碳酸钙10-40，分消，140℃3h，0.75kg/cm2 20min；32℃振荡培养72小时，转速为220r/min，间歇流加30％尿素控制pH在7.0左右；在所有的突变株中，L-缬氨酸产量最高的突变株为黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)突变株TV230。其L-缬氨酸产量为29.3g/L左右。
一种利用上述黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)突变株TV230直接发酵法生产L-缬氨酸的生产工艺，包括：
A.将黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)突变株TV230进行常规扩大培养；
B.将步骤A中获得的扩大培养的菌种接入同权利要求2中的发酵培养基中进行发酵；发酵培养基中碳源含量应为1％～30％，氮碳比N∶C应介于5∶100～50∶100之间，无机盐含量应为0.0001～10％，发酵培养基的初始pH6.0～8.0，培养温度20℃～40℃，振荡培养或发酵罐培养1～5天，接种量为0.01％～20％(V/V)；发酵过程中，添加碳酸钙和流加尿素、氨水调节发酵培养基的PH6.0～8.0；
C.L-缬氨酸的提取步骤：采用金属膜过滤除菌体和蛋白，而后采用活性炭对滤液进行脱色处理，活性炭用量为0.1％～5％，pH范围0～14，操作温度为0～60℃，脱色时间为1～60min；脱色液通过阳离子交换法提取L-缬氨酸，离子交换过程中的上柱料液的pH范围0～14，操作温度为0～40℃，流速为1～6倍床体积/h。使用旋转蒸发仪将离子交换洗脱液在60℃～70℃减压蒸发至出结晶，加入一倍体积50％～95％乙醇，冷藏过夜，进行重结晶，烘干后得L-缬氨酸结晶。
上述B步发酵培养基中的碳源为：糖，即葡萄糖，蔗糖，果糖，麦芽糖，甘露糖，淀粉或糖浆；或糖醇，甘油；或有机酸，醋酸；或低分子醇，乙醇；碳源含量最佳为10％～20％。
上述B步中采用分阶段供氧控制模式，发酵前期溶氧(以空气中的溶氧为100，以饱和亚硫酸纳中的溶氧为0)控制在10～100％，后期控制在0～40％。
上述B步发酵培养基中的氮源为氨或铵盐：硫酸铵，醋酸铵，硝酸铵，磷酸铵，乙酸铵或氯化铵；或有机氮：蛋白胨，牛肉膏，玉米浆，或豆饼水解液。
上述B步发酵培养基中无机盐为：磷酸钾，硫酸镁，碳酸钙，硫酸亚铁，或硫酸锰。
发酵培养基中可加入营养物，氨基酸及维生素。
上述C步中的金属膜采用不锈钢管式膜分离系统，其孔径为50nm～100nm，截留分子量2000～50000MW，pH范围0～14，操作温度为0～80℃，操作压差为0.1～1.0MPa。
上述C步中，洗脱液为0.1～10mol/L氨水，或氯化铵溶液，或硫酸铵溶液，或醋酸铵溶液，或乙醇溶液。
上述C步中的离子交换树脂采用强酸型阳离子交换树脂，JK006，HD-8，732，D061，D001-CC或HZ014；离子交换柱采用串联方式。
上述C步中金属膜过滤除菌体和蛋白前，发酵液进行预处理，加热到80℃以上5-20分钟，然后注入不锈钢管式膜分离系统，操作温度控制在10-80℃，进膜压力与出膜压力差0.1～0.8kg/cm2，滤速控制在50～300ml/min。
本发明的优点和积极效果：本发明利用黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)突变株TV2564，在10L全自动控制发酵罐采用该生产工艺发酵生产L-缬氨酸，可以大大提高L-缬氨酸的产率，最高产量可达50g/L以上。本发明利用金属膜过滤法预处理发酵液，并以离子交换法提取L-缬氨酸，纯度可达95％以上，提取率85％以上。
选育L-亮氨酸缺陷标记的目的，是切断L-亮氨酸合成代谢流，使用于合成L-亮氨酸的前体物α-乙酰异戊酸完全用于L-缬氨酸的生物合成，即相对提高用于合成L-缬氨酸的比例。
选育L-异亮氨酸缺陷标记有三重意义：①切断L-异亮氨酸合成代谢流，节约丙酮酸；②L-异亮氨酸缺陷导致L-异亮氨酸不能合成，从而打破三个支链氨基酸对其合成途径上三个共用酶的协同反馈阻遏作用；③使三个共用酶全部用于α-乙酰异戊酸的合成。
选育磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活力减弱、天冬氨酸族氨基酸缺陷等突变株，可增大L-缬氨酸生物合成代谢流，节约碳源，从而有利于L-缬氨酸产量的提高。
2-噻唑丙氨酸(2-TA)是L-缬氨酸的结构类似物，通过选育2-TAr抗性标记，有利于解除乙酰羟基酸合成酶和α-异丙基苹果酸合成酶所受到的反馈抑制和阻遏。α-氨基丁酸(α-AB)是缬氨酸的结构类似物，选育α-ABr有利于解除缬氨酸对乙酰羟基酸合成酶的反馈抑制，从而大幅度地提高L-缬氨酸的产量。
磺胺类药物是细菌生长所必需的代谢物对氨基苯甲酸(PABA)的竞争性抑制物。它们竞争性地与二氢叶酸合成酶结合，阻止或取代了对氨基苯甲酸掺入到叶酸分子中去，从而阻断了细菌细胞重要组分叶酸的合成。利用磺胺类药物如磺胺胍抗性(SGr)突变株，从而解除磺胺胍的抑制作用，并造成四氢叶酸的大量合成。四氢叶酸是多种酶的辅酶，起一碳基转移作用，因而对维持菌体的正常代谢十分重要。
利用金属膜过滤预处理可以有效除去发酵液中的菌体、杂蛋白质等悬浮物，有利于L-缬氨酸的吸附。使用001×7苯乙烯强酸型阳离子交换树脂，发酵液用草酸酸化至pH＝2，双柱串连吸附，用pH＝9的0.5mol/L NH4Cl洗脱，经过活性炭吸附脱色后，用95％乙醇结晶纯化，纯度可达98％以上，提取率55％。
【具体实施方式】：
实施例1：突变株TV230的获得
本发明提供的黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)突变株TV230，以棒杆菌属的黄色短杆菌HL41为出发菌株，经硫酸二乙酯(DES)和紫外线诱变处理，定向选育出一株L-缬氨酸生产菌株TV230，其遗传标记为亮氨酸缺陷(Ile-)、亮氨酸缺陷(Leur)、磺胺胍抗性(SGr)、α-氨基丁酸(α-ABr)抗性、2-噻唑丙氨酸抗性(2-TAr)(Ile-+Leu-+SGr+α-ABr+2-TAr)，使其具有L-缬氨酸的生物合成能力。
L-缬氨酸生产菌株的具体选育过程：
第一步、诱变初筛：
将黄色短杆菌HL41经DES常规诱变后菌株，经离心洗涤制成菌悬液，稀释后涂布于基本培养基平板(葡萄糖20g/L，(NH4)2SO4 10g/L，KH2PO4·3H2O 1g/L，MgSO4·7H2O 0.4g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L，MnSO4·H2O0.01g/L，生物素200μg/L，VB1 200μg/L，琼脂粉20g/L，PH7.0～7.2)以及抗性药物梯度平板(基本培养基+L-亮氨酸10mg/L、L-异亮氨酸10mgg/L+2％结构类似物；完全培养基(葡萄糖5g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 2.5g/L，琼脂条20g/L，pH7.0～7.21.0kg/cm2，20min)+2％磺胺胍；)或基本培养基中添加了甲硫氨酸或异亮氨酸(0.01％)补充培养基平板，28℃恒温静置培养4～6天，挑选在抗性药物梯度平板上生长的单菌落或在甲硫氨酸补充培养基平板上生长而在基本培养基平板不生长的单菌落，并于斜面内保存待筛。
第二步、诱变复筛
摇瓶水平上对原菌株与各突变株产L-缬氨酸性能比较。
从上步新鲜斜面分别挑取一环原菌株与各突变株菌苔于种子培养基中(葡萄糖30，玉米浆20，酵母粉5，MgSO4·7H2O 0.4，MnSO4·H2O 0.01，生物素200μg，VB1 200μg，尿素1，pH7.0～7.2 0.75kg/cm2 20min，(尿素分消0.5kg/cm2 30min)，500mL三角瓶装液量30mL，9层纱布封口。置于旋转式摇床上(200r/min)，32℃振荡培养18小时。以接种量10％，初始pH7.0，接入发酵培养基中(葡萄糖130，硫酸铵15，豆饼水解液20mL，K2HPO41.0，MgSO4·7H2O 0.4，MnSO4·H2O 0.01，生物素100μg，VB1200μg，L-异亮氨酸0.06，L-亮氨酸0.2，pH7.0～7.2，碳酸钙20(分消)，0.75kg/cm220min)。32℃振荡培养72小时，转速为220r/min，间歇流加30％尿素控制pH在7.0左右。在所有的突变株中，L-缬氨酸产量最高的突变株为黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)突变株TV230，其L-缬氨酸产量为29.3g/L左右。
实施例2：
磺胺胍抗性突变株的选育(选育菌株TV230的一个步骤)
在氨基酸产生菌的育种实践中，通常添加磺胺胍抗性标记可显著提高产酸水平。本项试验筛选磺胺胍抗性标记提高L-缬氨酸产量。
对菌株TV54(Leu-+Ile-)(该菌株由黄色短杆菌HL41诱变而来)的磺胺胍抗性临界浓度进行了测定，结果见表1。
表1 磺胺胍抗性临界浓度
| 磺胺胍质量浓度(g/L) | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| 菌体生长情况 | + | ± | - | - | - | - |
注：+生长，±微弱生长，-不生长
由表1可知，磺胺胍对菌株TV54生长的抑制临界浓度为2g/L，因此选择4g/L为磺胺胍抗性平板的起始浓度。将DES诱变处理后的菌液经适当稀释，涂布于磺胺胍抗性平板(完全培养基(同实施例1)+4g/L磺胺胍)上，32℃恒温培养48h后，挑取在平板上生长良好的大菌落转接斜面。经摇管初筛和摇瓶复筛，得到L-缬氨酸产量明显提高的菌株9株，其中菌株TV123的L-缬氨酸产量较高，为13.6g/L。经标记验证带有所需标记Ile-+Leu-+SGr。
实施例3：
2-噻唑丙氨酸抗性突变株的选育
以TV123菌株(Ile-+Leu-+SGr)作为进一步诱变的出发菌株(2-TA的临界致死浓度为1.0g/L)。将TV123经紫外诱变处理后，把菌悬液直接涂布于Leu+Ile+2-TA+SGr+α-ABr药物筛选平板上(2-TA浓度为3g/L，SG浓度为4g/L，α-AB浓度为4g/L)，32℃恒温培养72～96h，从平板上挑取生长良好的大菌落。对这些菌株进行摇管初筛，进一步作摇瓶发酵试验，得到L-缬氨酸产量提高的菌株TV230(24.4g/L)。经标记验证带有所需标记(Leu-+Ile-+2-TAr+SGr+α-ABr)。
实施例4：以黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)突变株TV230摇瓶发酵生产L-缬氨酸
从新鲜斜面挑取一环TV230菌株的菌苔于种子培养基中，斜面种子培养及种子与发酵培养条件均同实施例1，种子培养基成分同实施例1。以接种量10％，初始pH7.0，接入发酵培养基中(g/L)(葡萄糖76.0，(NH4)2SO46.0，豆饼水解液20mL(含氮3.0％)，玉米浆25.0mL(含氮2.0％)，KH2PO4 1.2，MgSO4·7H2O0.45，MnSO40.01，Met0.5，Ile0.06，Leu0.4，VB10.2mg/L，VH0.12mg/L，pH7.0-7.2)。500mL三角瓶装液量30mL。32℃振荡培养72小时，转速为220r/min，间歇流加30％尿素控制pH在7.0左右。当残糖量下降至15～20g/L时开始补料，分几次补完，每次补料后总糖不超过30g/L，发酵结束后，L-缬氨酸产量可达41.8g/L。
实施例5：以黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)突变株TV230在10升发酵罐生产L-缬氨酸
从新鲜斜面挑取一环TV2564菌株的菌苔于种子培养基中，斜面种子培养及种子培养条件均同实施例1，种子培养基成分同实施例1。按10％接种量将种子液600mL接入10L发酵罐中，发酵培养基成分同实施例2。初始装液量6L，初始溶氧控制在30％以上，16h后降到10％左右，培养温度32℃，通过自动流加25％的氨水溶液控制pH7.0±0.05，发酵期间，每隔2h取样测残糖，当残糖降至10～20g/L即补入浓度80％葡萄糖。根据耗糖速率确定补料量，维持葡萄糖浓度15g/L左右。补料结束，残糖低于10g/L结束发酵。TV230菌株在发酵8h后进入产酸期，发酵72h后，L-缬氨酸产量可达53.4g/L。
实施例6：L-缬氨酸的提取和精制
用NaOH将10L-缬氨酸发酵液加热80℃以上5-20分钟后，将发酵液倒入金属膜过滤器，控制温度25℃左右，进膜压力与出膜压力差0.6kg/cm2，当进出膜压差明显降低时，补入适量去离子水，滤速控制在200～300ml/min，将滤液pH调至4.5，加入1％粉末状活性炭，60℃下脱色1h，过滤后用草酸或盐酸将过滤后的发酵液调至pH＝3备用。将处理成H+型的001×7树脂装入直径2.4cm的离子交换柱中，装柱高12cm，两柱串连，操作温度为室温，上柱速度为0.5BV/h，上柱后，用两倍发酵液体积pH＝3的酸性水洗涤树脂，流速为1BV/h，将洗涤液收集准备再次上柱。用氨水将0.5mol/LNH4Cl调至pH＝9，0.6BV/h洗脱，收集pH＝2～9部分的洗脱液。
使用旋转蒸发仪将洗脱液在60℃～70℃减压蒸发至出结晶，加入一倍体积95％乙醇，冷藏过夜，过滤后得粗结晶。用一定量的蒸馏水溶解粗结晶，再加入等体积的95％乙醇，冷藏过夜，过滤晶体，烘干后得L-缬氨酸结晶，纯度可达95％以上，提取率85％以上。
Claims (10)
1、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)突变株TV230，以黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)HL41(保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CICC 10135)为出发菌种，选育具有异亮氨酸缺陷(Ile-)、亮氨酸缺陷(Leur)、磺胺胍抗性(SGr)、α-氨基丁酸(α-ABr)抗性、2-噻唑丙氨酸抗性(2-TAr)，使其具有L-缬氨酸的生物合成能力。
2、一种权利要求1所述的黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)突变株TV230的选育方法，其具体过程为：
第一步、诱变初筛：
将黄色短杆菌HL41经硫酸二乙酯DES常规诱变后的菌株，经离心洗涤制成菌悬液，稀释后分别涂布于：
——基本培养基平板，其组成为：葡萄糖10-30g/L，(NH4)2SO4 5-20g/L，KH2PO4·3H2O 0.5-2g/L，MgSO4·7H2O 0.1-1.0g/L，FeSO4·7H2O 0.05-0.05g/L，MnSO4·H2O 0.005-0.05g/L，生物素100-1000μg/L，VB1 100-1000μg/L，琼脂粉15-35g/L，PH7.0～7.2；
——以及抗性药物梯度平板，其组成为：基本培养基+L-亮氨酸10mg/L、L-异亮氨酸10mg g/L+2％结构类似物；完全培养基(葡萄糖5g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 2.5g/L，琼脂条20g/L，pH7.0～7.21.0kg/cm2，20min)+2％磺胺胍；
——或基本培养基添加了甲硫氨酸Met 0.0005-0.05％，或异亮氨酸Ile0.0005-0.05％的补充培养基平板；
28℃恒温静置培养4～6天，挑选在抗性药物梯度平板上生长的单菌落、或在甲硫氨酸或异亮氨酸补充培养基平板上生长而在基本培养基平板不生长的单菌落，并于斜面内保存待筛；
第二步、诱变复筛
摇瓶水平上对原菌株与各突变株产L-缬氨酸性能比较：
从上步新鲜斜面分别挑取一环原菌株与各突变株菌苔于种子培养基中，其组成g/L：葡萄糖10-35，玉米浆5-40，酵母粉2-20，MgSO4·7H2O0.2-1.0，MnSO4·H2O 0.005-0.015，生物素100-1000μg，VB1 100-1000μg，尿素0-3；pH7.0～7.20.75kg/cm2 20min，尿素分消0.5kg/cm2 3min；500mL三角瓶装液量30mL，9层纱布封口，置于旋转式摇床上200r/min，32℃振荡培养18小时；以接种量10％，初始pH7.0，接入发酵培养基中，其组成g/L：葡萄糖80-180，硫酸铵5-25，豆饼水解液5-35mL，K2HPO40.2-1.8，MgSO4·7H2O 0.2-1.0，MnSO4·H2O 0.005-0.015，生物素50-1000μg，VB150-1000μg，L-异亮氨酸0.01-0.5，L-亮氨酸0.01-0.5，pH7.0～7.2，碳酸钙10-40，分消，140℃3h，0.75kg/cm2 20min；32℃振荡培养72小时，转速为220r/min，间歇流加30％尿素控制pH在7.0左右；在所有的突变株中，L-缬氨酸产量最高的突变株为黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)突变株TV230。
3、一种利用黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)突变株TV230直接发酵法生产L-缬氨酸的生产工艺，包括：
A.将黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)突变株TV230进行常规扩大培养；
B.将步骤A中获得的扩大培养的菌种接入同权利要求2中的发酵培养基中进行发酵；发酵培养基中碳源含量应为1％～30％，氮碳比N∶C应介于5∶100～50∶100之间，无机盐含量应为0.0001～10％，发酵培养基的初始pH6.0～8.0，培养温度20℃～40℃，振荡培养或发酵罐培养1～5天，接种量为0.01％～20％(V/V)；发酵过程中，添加碳酸钙和流加尿素、氨水调节发酵培养基的PH6.0～8.0；
C.L-缬氨酸的提取步骤：采用金属膜过滤除菌体和蛋白，而后采用活性炭对滤液进行脱色处理，活性炭用量为0.1％～5％，pH范围0～14，操作温度为0～60℃，脱色时间为1～60min；洗脱液通过阳离子交换法提取L-缬氨酸，离子交换过程中的上柱料液的pH范围0～14，操作温度为0～40℃，流速为1～6倍床体积/h；使用旋转蒸发仪将离子交换洗脱液在60℃～70℃减压蒸发至出结晶，加入一倍体积50％～95％乙醇，冷藏过夜，进行重结晶，烘干后得L-缬氨酸结晶。
4、根据权利要求3所述的生产工艺，其特征在于C步中的金属膜采用不锈钢管式膜分离系统，其孔径为50nm～100nm，截留分子量2000～50000MW，pH范围0～14，操作温度为0～80℃，操作压差为0.1～1.0MPa。
5、根据权利要求3所述的生产工艺，其特征在于C步中，洗脱液为0.1～10mol/L氨水，或氯化铵溶液，或硫酸铵溶液，或醋酸铵溶液，或乙醇溶液。
6、根据权利要求3所述的生产工艺，其特征在于C步中的离子交换树脂采用强酸型阳离子交换树脂，JK006，HD-8，732，D061，D001-CC或HZ014；离子交换柱采用串联方式。
7、根据权利要求3所述的生产工艺，其特征在于B步中采用分阶段供氧控制模式，发酵前期溶氧控制在10～100％，后期控制在0～40％。
8、根据权利要求3所述的生产工艺，其特征在于B步发酵培养基中的碳源为：糖，即葡萄糖，蔗糖，果糖，麦芽糖，甘露糖，淀粉或糖浆；或糖醇，甘油；或有机酸，醋酸；或低分子醇，乙醇；氮源为氨或铵盐：硫酸铵，醋酸铵，硝酸铵，磷酸铵，乙酸铵或氯化铵；或有机氮：蛋白胨，牛肉膏，玉米浆，或豆饼水解液。
9、根据权利要求3所述的生产工艺，其特征在于B步发酵培养基中无机盐为：磷酸钾，硫酸镁，碳酸钙，硫酸亚铁，或硫酸锰。
10、根据权利要求3所述的生产工艺，其特征在于过滤前，发酵液进行预处理，用碱将发酵液pH调至9～12，搅拌并加热到80℃，后注入不锈钢管式膜分离系统，操作温度控制在10-80℃，进膜压力与出膜压力差0.1～0.8kg/cm2，滤速控制在50～300ml/min。
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