CN107164419A - 一种活化菌株发酵生产l‑丙氨酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种活化菌株发酵生产L‑丙氨酸的方法，属于生物技术领域，本发明通过诱变活化菌株生产L‑丙氨酸，主要包括菌体活化、温料双控发酵培养和产物的提取；本发明所用的原材料葡萄糖属于可再生纯天然资源，来源广泛，价格低廉，且厌氧发酵减少了动力消耗，降低了生产成本；提纯过程中使用改性陶瓷粒或大孔柱状硅胶进行分离过滤去除杂质，并经过纳滤膜进一步过滤滤液，保证了产品质量，适合规模工业化生产。

Description

一种活化菌株发酵生产L-丙氨酸的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种活化菌株发酵生产L-丙氨酸的方法。
背景技术
L-丙氨酸是组成蛋白质的氨基酸之一，虽然为人体非必须氨基酸，但却是人体血液中含量最高的氨基酸，在医药、高分子材料、食品等领域具有广泛的用途。在医药领域：L-丙氨酸作为医药中间体，是生产维生素B6及L-氨基丙醇的主要原料；与糖代谢密切相关，在转氨反应中是主要的氨基供体，具有重要的生理功能，在临床上常添加到输液中；另外，L-丙氨酸还是一种很好的利尿药。在高分子材料领域：近年来发现聚乳酸中添加L-丙氨酸可有效提高聚乳酸的性能。在食品领域：L-丙氨酸具有独特的改善风味的效果，与其他氨基酸配合能加强食品和饮料的风味；添加L-丙氨酸可以明显提高食品和饮料中蛋白质的利用率；还可以改善有机酸的酸味，越来越受到人们的欢迎和重视。目前，L-丙氨酸的主要工业化生产方法就是酶法转化，即通过富有L-天冬氨酸-β-脱羧酶活力的微生物细胞催化L-天冬氨酸而得到。酶法转化工艺的特点是酶活力高，设备投资小，提取工艺简单，但其主要原材料L-天冬氨酸价格较贵，造成其生产成本较高。
发明内容
根据以上现有技术的不足，本发明所要解决的技术问题是提出一种活化菌株发酵生产L-丙氨酸的方法，通过诱变活化菌株生产L-丙氨酸。
为达到上述目的，本发明提出一种活化菌株发酵生产L-丙氨酸的方法包括菌体活化、温料双控发酵培养和产物提取。
上述活化菌株发酵生产L-丙氨酸的方法，包括以下步骤：
(1)菌体活化
选用黄色短杆菌，置于斜面培养基中，25～32℃的温度条件下培养至对数生长期，冷却至20～25℃，加入等离子体，在紫外灯照射下进行菌体诱变，得到活化黄色短杆菌；
(2)温料双控发酵培养
将步骤(1)得到的活化黄色短杆菌，置于发酵培养基中，培养温度为35～40℃，培养pH值为6.85～7.10，培养至发酵培养基中糖分≤0.01％，停止发酵培养；
(3)产物提取
将步骤(2)所得混合液经过改性陶瓷粒或大孔柱状硅胶进行分离提纯，清洗，干燥，即得L-丙氨酸。
上述菌体活化，是采用添加0.1～0.2％的等离子氮，在转动搅拌的条件下紫外线照射25～45s，进行黄色短杆菌的活化。
上述温料双控发酵培养，是采用1～10％的尿素与氨水作为氮源，在发酵培养基中添加尿素作为底物氮源，发酵过程中通过滴加氨水调节发酵的pH值作为滴加氮源。
上述温料双控发酵培养，在35℃条件下培养5h，升温至38～40℃，培养至发酵培养基中糖分≤0.01％。
上述产物提取，待发酵结束，取出发酵液经过改性陶瓷粒或大孔柱状硅胶进行分离，得到滤液，为提高产物纯度，再通过纳滤膜进一步过滤滤液，取的滤液，在低温真空下，干燥，结晶，离心，即得产品。
本发明有益效果是:本发明黄色短杆菌为菌源，采用等离子氮注入和紫外线照射协同作用法诱变处理菌体，用该突变株以葡萄糖等糖类物质为底物，在35～40℃，pH 6.85～7.10厌氧条件下发酵生产L-丙氨酸。选择黄色短杆菌作为出发菌株，因为该菌种兼性厌氧，会大大提高正突变和发酵培养目标物的效率；所用的原材料葡萄糖属于可再生纯天然资源，来源广泛，价格低廉，且厌氧发酵减少了动力消耗，降低了生产成本；提纯过程中使用改性陶瓷粒或大孔柱状硅胶进行分离过滤去除杂质，并经过纳滤膜进一步过滤滤液，保证了产品质量，适合规模工业化生产；采用的等离子紫外诱变法具有突变谱广、死亡率低、正突变率高、性状稳定等优点。
具体实施方式
通过对实施例的进一步详细的说明，以帮助本领域技术人员对本发明的发明构思、技术方案有更完整、准确和深入的理解。
本发明提出一种活化菌株发酵生产L-丙氨酸的方法包括菌体活化、温料双控发酵培养和产物提取。
上述活化菌株发酵生产L-丙氨酸的方法，包括以下步骤：
(1)菌体活化
选用黄色短杆菌，置于斜面培养基中，25～32℃的温度条件下培养至对数生长期，冷却至20～25℃，加入0.1～0.2％的等离子氮，在转动搅拌的条件下紫外线照射25～45s，进行黄色短杆菌的活化，得到活化黄色短杆菌；
(2)温料双控发酵培养
将步骤(1)得到的活化黄色短杆菌，置于发酵培养基中，培养温度为35～40℃，培养pH值为6.85～7.10，培养至发酵培养基中糖分≤0.01％，停止发酵培养；
(3)产物提取
待发酵结束，取出发酵液经过改性陶瓷粒或大孔柱状硅胶进行分离，得到滤液，为提高产物纯度，再通过纳滤膜进一步过滤滤液，取的滤液，在低温真空下，干燥，结晶，离心，即得产品。
上述温料双控发酵培养，是采用1～10％的尿素与氨水作为氮源，在发酵培养基中添加尿素作为底物氮源，发酵过程中通过滴加氨水调节发酵的pH值作为滴加氮源。
上述温料双控发酵培养，在35℃条件下培养5h，升温至38～40℃，培养至发酵培养基中糖分≤0.01％。
实施例一
在具体实施方式的基础上，本实施的活化菌株发酵生产L-丙氨酸的方法包括以下步骤：
(1)菌体活化
选用黄色短杆菌，置于斜面培养基中，28℃的温度条件下培养至对数生长期，冷却至20℃，加入0.2％的等离子氮，在200rad/s转动搅拌的条件下紫外线照射35s，进行黄色短杆菌的活化，得到活化黄色短杆菌；
(2)温料双控发酵培养
将步骤(1)得到的活化黄色短杆菌，以0.5％的接菌量置于发酵培养基中，培养温度为35℃，培养5h后，升温至40℃，继续培养至发酵培养基中糖分≤0.01％，停止发酵培养，发酵过程滴加氨水保持发酵培养的pH值为7.0±0.5；
(3)产物提取
待发酵结束，取出发酵液经过改性陶瓷粒或大孔柱状硅胶进行分离，得到滤液，为提高产物纯度，再通过纳滤膜进一步过滤滤液，取的滤液，在0℃,100Pa的条件下干燥，结晶，离心，即得产品。
本实施例采用的斜面培养基包括以下组成成分：蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，乙酸钠0.5％，吐温80 0.1％，七水硫酸镁0.02％，碳酸钙2％，牛肉膏1％，葡萄糖1％，柠檬酸二胺0.2％，磷酸氢二钾0.2％，七水硫酸锰0.005％，琼脂2％，氨水1.075％，碳酸钠0.4％，无菌水90％。
本实施例采用发酵培养基包括以下组成成分：葡萄糖6％，磷酸二氢钾0.2％，磷酸氢二钾1.2％，无水硫酸镁0.02％，尿素2.85％，无菌水90％。
本实施例得到的L-丙氨酸的产量为85g/l，产品为白色粉末状。
实施例二
在具体实施方式的基础上，本实施的活化菌株发酵生产L-丙氨酸的方法包括以下步骤：
(1)菌体活化
选用黄色短杆菌，置于斜面培养基中，32℃的温度条件下培养至对数生长期，冷却至25℃，加入0.1％的等离子氮，在200rad/s转动搅拌的条件下紫外线照射40s，进行黄色短杆菌的活化，得到活化黄色短杆菌；
(2)温料双控发酵培养
将步骤(1)得到的活化黄色短杆菌，以0.5％的接菌量置于发酵培养基中，培养温度为35℃，培养5h后，升温至38℃，继续培养至发酵培养基中糖分≤0.01％，停止发酵培养，发酵过程滴加氨水保持发酵培养的pH值为7.0±0.5；
(3)产物提取
待发酵结束，取出发酵液经过改性陶瓷粒或大孔柱状硅胶进行分离，得到滤液，为提高产物纯度，再通过纳滤膜进一步过滤滤液，取的滤液，在0℃,100Pa的条件下干燥，结晶，离心，即得产品。
本实施例采用的斜面培养基包括以下组成成分：蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，乙酸钠0.5％，吐温80 0.1％，七水硫酸镁0.02％，碳酸钙2％，牛肉膏1％，葡萄糖1％，柠檬酸二胺0.2％，磷酸氢二钾0.2％，七水硫酸锰0.005％，琼脂2％，氨水1.075％，碳酸钠0.4％，无菌水90％。
本实施例采用发酵培养基包括以下组成成分：葡萄糖6％，磷酸二氢钾0.2％，磷酸氢二钾1.2％，无水硫酸镁0.02％，尿素2.85％，无菌水90％。
本实施例得到的L-丙氨酸的产量为60g/l，产品为白色粉末状。
上面对本发明进行了示例性描述，显然本发明具体实现并不受上述方式的限制，只要采用了本发明的方法构思和技术方案进行的各种非实质性的改进，或未经改进将本发明的构思和技术方案直接应用于其它场合的，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。

Claims (5)

1.一种活化菌株发酵生产L-丙氨酸的方法，其特征在于：包括菌体活化、温料双控发酵培养、产物提取。
2.根据权利要求1所述的活化菌株发酵生产L-丙氨酸的方法，其特征在于，所述活化菌株发酵生产L-丙氨酸的方法，包括以下步骤：
(1)菌体活化
选用黄色短杆菌，置于斜面培养基中，25～32℃的温度条件下培养至对数生长期，冷却至20～25℃，加入等离子体，在紫外灯照射下进行菌体诱变，得到活化黄色短杆菌；
(2)温料双控发酵培养
将步骤(1)得到的活化黄色短杆菌，置于发酵培养基中，培养温度为35～40℃，培养pH值为6.85～7.10，培养至发酵培养基中糖分≤0.01％，停止发酵培养；
(3)产物提取
将步骤(2)所得混合液经过改性陶瓷粒或大孔柱状硅胶进行分离提纯，清洗，干燥，即得L-丙氨酸。
3.根据权利要求1或2所述的活化菌株发酵生产L-丙氨酸的方法，其特征在于：所述菌体活化，是采用添加等离子氮与照射紫外线的协同作用进行黄色短杆菌的活化。
4.根据权利要求1或2所述的活化菌株发酵生产L-丙氨酸的方法，其特征在于：所述温料双控发酵培养，是采用尿素与氨水作为氮源，在发酵培养基中添加尿素作为底物氮源，发酵过程中通过滴加氨水调节发酵的pH值作为滴加氮源。
5.根据权利要求1或2所述的活化菌株发酵生产L-丙氨酸的方法，其特征在于：所述温料双控发酵培养，在38℃条件下培养5h，升温至40～42℃，培养至发酵培养基中糖分≤0.01％。
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