CN107058417B - 一种色氨酸提质增效新工艺 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种色氨酸提质增效新工艺，采用微生物发酵法，其特征在于：所述微生物发酵法采用的培养基材料包括酵母抽提物：3.9‑4.1g/L，N源材料液氨，所述培养基所用的糖与其他物料分开消毒灭菌；所述培养基发酵过程的温度控制33‑35℃，溶氧控制：25‑30％。本发明的有益效果是：通过对发酵配方及温度、溶氧等控制参数的优选，加之用液氨代替尿素、底糖与其他材料分别消毒灭菌等措施，色氨酸生产指标达到产酸≥60g/L、转化率≥45％，达到了国际领先水平。

Description

一种色氨酸提质增效新工艺

技术领域

本发明涉及一种色氨酸生产方法，即一种色氨酸提质增效新工艺。

背景技术

色氨酸是Hopkins和Cole在1902年发现并分离到的一种氨基酸，化学名称：α-氨基-β-吲哚丙酸，分子式：C₁₁H₁₂N₂O₂，分子量：204.23，是人体和动物生命活动中八种必需氨基酸之一，参与机体蛋白质合成和代谢网络调节，对人和动物的生长、发育具有重要作用，因此被广泛应用于医药、食品和饲料等领域，市场需求量不断增加，已经呈现供不应求的市场态势。

色氨酸生产有蛋白水解法、化学合成法、酶法及微生物发酵法。近年来，随着高新技术在微生物领域的不断应用，微生物发酵法成为大规模生产色氨酸的首选技术。色氨酸发酵法生产目前在国外应用较多，产酸水平只有50-60g/L，但国内企业应用的比较少，其生产水平仍然很低，大规模生产的产酸水平只有40g/L，转化率30％左右，与国际先进水平具有较大的差距，这也使得我国现有的色氨酸使用仍主要依靠进口。

为了解决上述问题，业内开展了多项研究，并且取得了大量成果。可是，现有研究多围绕菌种的选育等热点进行。本发明研究过程中发现，培养基当中的酵母抽提物用量、温度、溶氧量、N源材料以及消毒灭菌方式是制约色氨酸质量和得率的敏感因素。现有酵母抽提物用量偏高，且比较随意。温度控制偏高，菌体代谢快，易衰老。溶氧只用通风量来控制，很不准确。N源材料采用尿素，尿素分解成氨，致使pH值检测滞后，不能真实反映pH值的实际参数。尿素还需要加水配制成溶液，对发酵料液有稀释作用，降低了色氨酸含量。消毒灭菌是对发酵培养基配料集中进行，糖与有机氮在高温下会发生反应，损失部分营养成分，并且生成羟胺络合物还会对菌体生长产生一定的毒害影响，并且加深产品颜色，降低产品质量。糖在125-130℃的高温下发生焦糖化反应，不仅造成葡萄糖损失，还会抑制菌体生长，降低菌体活力，减缓产酸效率，还对最终的产品质量产生不良影响。

发明内容

本发明的目的是提供一种能够大幅提高色氨酸产品产量和质量的新工艺。

上述目的是由以下技术方案实现的：提供一种色氨酸提质增效新工艺，采用微生物发酵法，其特点是：所述微生物发酵法采用的培养基材料包括酵母抽提物：3.9-4.1g/L，N源材料液氨，所述培养基所用的糖与其他物料分开消毒灭菌；所述培养基发酵过程的温度控制33-35℃，溶氧控制：25-30％。

所述酵母抽提物：4g/L，温度控制34℃，溶氧控制：28％。

所述微生物发酵法采用的培养基材料有：底糖：9.5-10.5g/L；K₂HPO₄：8-8.4g/L；MgSO₄：2.2-2.6g/L；(NH₄)₂SO₄：1.6-2g/L；Na₂SO₄：0.02-0.024g/L；柠檬酸：2.2-2.6g/L；FeSO₄：0.08-0.086g/L；所述培养基的发酵接种量：17-19％；流加糖：浓度54-56％；放罐前加热至58-62℃，并维持8-12min；pH值控制：6.4-6.6；罐压控制：0.06-0.10Mpa。

所述培养基材料的优选配方：底糖：10g/L；K₂HPO₄：8.2g/L；MgSO₄：2.4g/L；(NH₄)₂SO₄：1.8g/L；Na₂SO₄：0.022g/L；柠檬酸：2.4g/L；FeSO₄：0.084g/L；发酵接种量：18％；流加糖：浓度55％；温度控制：34℃；放罐前加热至60℃，并维持10min；pH值控制：6.5，液氨流加；罐压控制：0.08Mpa。

所述消毒灭菌的温度是：底糖120-122℃，培养基其他物料125-130℃。

所述发酵过程采用溶解氧电极测定溶氧指标。

本发明的有益效果是：通过对发酵配方及温度、溶氧等控制参数的优选，加之用液氨代替尿素、底糖与其他材料分别消毒灭菌等措施，色氨酸生产指标显著提高，产酸≥60g/L、转化率≥45％，达到了国际领先水平。

附图说明

图1是菌体量、色氨酸产量-酵母抽提物关系图；

图2是色氨酸产酸-温度关系图；

图3是色氨酸产酸与溶氧关系图；

图4是大生产实验验证结果图。

具体实施方式

培养基配料：底糖：9.5-10.5g/L；K₂HPO₄：8-8.4g/L；MgSO₄：2.2-2.6g/L；(NH₄)₂SO₄：1.6-2g/L；Na₂SO₄：0.02-0.024g/L；柠檬酸：2.2-2.6g/L；FeSO₄：0.08-0.086g/L；酵母抽提物：3.9-4.1g/L，N源材料液氨，所述培养基的发酵接种量：17-19％；流加糖：浓度54-56％；放罐前加热至58-62℃，并维持8-12min；pH值控制：6.4-6.6；罐压控制：0.06-0.10Mpa。培养基所用的糖与其他物料分开消毒灭菌；培养基发酵过程的温度控制33-35℃，溶氧控制：25-30％。所述培养基材料的优选配方：底糖：10g/L；K₂HPO₄：8.2g/L；MgSO₄：2.4g/L；(NH₄)₂SO₄：1.8g/L；Na₂SO₄：0.022g/L；柠檬酸：2.4g/L；FeSO₄：0.084g/L；酵母抽提物：4g/L，N源材料液氨，发酵接种量：18％；流加糖：浓度55％；温度控制：34℃；放罐前加热至60℃，并维持10min；pH值控制：6.5，液氨流加；罐压控制：0.08Mpa。所述培养基所用的糖与其他物料分开消毒灭菌；温度是：底糖120-122℃，培养基其他物料125-130℃。所述培养基发酵过程的温度控制34℃，溶氧控制：28％，采用溶解氧电极把测定溶氧指标转化成数字报出，可根据数据随时调整。

L-色氨酸发酵法生产工艺研究前后技术指标对比表

色氨酸发酵生产工艺改进之后，发酵产酸比传统工艺提高20g/L左右，转化率提高15％左右，扭转了色氨酸生产技术落后的局面。

实验情况简述

1.制约因子分析筛查：

以本公司以前自行研发且产量较低的现有工艺为实验基础：

色氨酸菌种是大肠杆菌基因工程菌，菌种室一级培养条件不变。菌种室培养结束后装入接种瓶，然后送入二级培养工序。一级菌种移入二级培养时，采用火焰灭菌方式消毒、软管对接接种针方式移种。二级菌种移入发酵罐时，采用管道输送方式，管道用蒸汽进行灭菌。

色氨酸发酵原配方及工艺控制条件如下：

培养基配方：(g/L)

工艺控制条件：

灭菌方式：混料连消，温度125-130℃。

运行温度：35℃，放罐前加热至60℃，并维持10min。

运行pH值：6.5-7.0(尿素流加)

流加糖：浓度50-55％

风量：控制通风比在0.3-0.35V/V/min

分析研究：

按照已有信息，此类研究主要集中在菌种筛选和温度、溶氧控制方面。本研究采用的色氨酸菌种是大肠杆菌基因工程菌，在生产实践中曾出现多次高产记录，说明该菌种不是制约生产的要素，故排出。配方中酵母抽提物用量随意性太大：生产好时，为节省成本，酵母抽提物用量会降低；菌体生长缓慢时，又会不断的提高用量。在控制上，发酵控制的三个关键因素温度、溶氧、pH中，只有温度有具体数据，pH值因用尿素流加，无法精确控制，至于溶氧控制，只是沿用传统技术的通风比，并不能真实反应料液中氧的溶解情况。

通过以上分析，选定酵母抽、温度、溶氧为主要考察因素，进行以下实验：

2.小型实验：

实验地点：通辽梅花生物科技有限公司研发中心

实验方案：采用培养、发酵一体化，不再单独进行二级种培养。采用L₁₆(3⁴)正交设计探索酵母抽提物、温度和溶氧对色氨酸发酵的影响。

实验设施：50L发酵实验罐

培养基配方：(g/L)

工艺控制条件

灭菌方式：采用实消，实消温度125-130℃，20分钟。

运行温度：按正交设计

运行pH值：6.5-7.0

流加糖控制：浓度50-55％

小试结果及分析

(1)实验因子和实验水平

实验因子和水平表

(2)正交实验设计表

L₁₆(3⁴)正交实验设计表

实验组次	酵母抽提物g/L	温度℃	溶氧％
				1	0	30	10
2	0	32	20
				3	0	34	30
4	0	36	40
				5	2	30	20
6	2	32	10
				7	2	34	40
8	2	36	30
				9	4	30	30
10	4	32	40
				11	4	34	10
12	4	36	20
				13	6	30	40
14	6	32	30
				15	6	34	20
16	6	36	10

(3)实验结果

正交实验结果汇总表(单位g/L)

(4)结果分析

实验结果分析表

实验小结

A对菌体量的影响

从实验结果看，对菌体影响最大的是酵母抽提物，且随着酵母抽提物用量的增加菌体量明显增加；温度也有一定的影响，但影响相对较小，高温或低温都会抑制菌体的生长；溶氧对菌体的生长也有一定影响，溶氧不足，菌体生长慢。但过高会加速菌体老化，反倒抑制菌体生长。从总体上说，控制菌体量的关键因素在酵母抽提物，温度和溶氧虽有一定影响，但都在生产适用范围，不超出一定范围时，可以不予考虑。

B对产酸的影响

产酸是生产的目的。从实验结果看，三项因子对产酸影响都较大，都有一个最佳的控制量，超出或低于这个最适量，产酸都会降低。从结果看，酵母水平控制4g/L，温度34℃，溶氧30％时产酸最佳。

3.放大实验及结果分析

根据氨基酸发酵行业的经验，因微生物发酵有其特殊性，受限较多，小型实验结果无法直接应用于生产，必须还要进行放大实验验证后才能应用于生产。根据小试基础，我公司技术人员在色氨酸生产线逐步开展了放大实验验证，进一步确定实际控制参数，以便将技术应用于生产。在实验过程中，对小试中的酵母抽提物及温度、溶氧等控制条件分别进行实验，以验证小试结果并探索最佳生产使用量。

(1)酵母抽提物水平实验：

实验地点：通辽梅花生物科技有限公司色氨酸车间

实验设施：采用车间15m³种子罐做放大实验的发酵罐

实验原料：车间生产原料

依据小试实验，设计酵母抽提物水平如下：

酵母抽提物水平表

序号	1	2	3	4	5	6
							添加量g/L	0	2	4	6	8	10

其它物料配比(g/L)：

控制条件如下：

发酵接种量：18％

流加糖：浓度55％左右

连消灭菌：混料消毒，温度125-130℃；

温度控制：35℃；放罐前温度由35℃加热至60℃，并维持10min。

pH值控制：6.5-7.0(尿素流加)

罐压控制：0.06-0.10Mpa

放罐残糖：≤0.3％

发酵周期：36hr

实验结果如下：

酵母抽提物含量与菌体量、色氨酸产酸实验结果汇总表

结合图1《菌体量、色氨酸产量-酵母抽提物关系图》可以看出：随着酵母抽提物的增加，色氨酸积累量逐渐提高，当添加量超过4g/L时，积累量出现明显下降。结果趋势与小试相符。

分析原因：酵母抽提物为采用以蛋白质含量丰富的食用酵母为原料，采用自溶、酶解、分离、浓缩等现代生物高新技术，将酵母细胞内的蛋白质、核酸等进行降解后精制而成的一种棕黄色可溶性膏状或浅黄色粉状纯天然制品。主要成分为多肽、氨基酸、呈味核苷酸、B族维生素及微量元素。是一种优良的天然调味料，在食品行业中具有广泛的用途。也是最为理想的生物培养基原料和发酵工业中的主要原料，其功效与8倍的酵母相当，可以大大提高菌种的生产速率及发酵产品得率。

正因为酵母抽提物营养丰富，特别是氨基酸等有机氮物质含量极高，过量的加入使培养基中的C/N失衡，导致菌体初期生长旺盛，繁殖量大，比生长速率过大，代谢废物增多、粘度大，影响溶氧，使菌体后期生长缓慢，代谢异常，从而影响目标产物的合成。因此，根据实验结果，确定发酵培养基中酵母抽提物为4g/L。

(2)发酵控制条件研究

A、温度

物料配比(g/L)：

控制条件如下：

发酵接种量：18％

流加糖：浓度55％左右

温度控制：按设计温度控制，放罐前温度加热至60℃，并维持10min。

pH值控制：6.5

罐压控制：0.06-0.10Mpa

放罐残糖：≤0.3％

发酵周期：36hr

采用自动温度控制，按设定的温度进行实验，收集设计温度条件下色氨酸的产酸量。

温度实验数据如下：

色氨酸温度实验数据汇总表

结合图2《色氨酸产酸-温度关系图》可以看出，在34℃以下时，色氨酸产酸积累随温度升高而升高；但温度超过34℃，随温度上升，色氨酸产酸呈下降趋势。原因在于：色氨酸菌种是生命体，其生长繁殖等生命活动都是在酶的作用下进行。酶是蛋白质，其活性受温度影响极大，低温时处于休眠状态，温度过高时蛋白质变性，酶失去生命活性，生命体出现衰亡。对色氨酸菌种来说，温度低于34℃时，色氨酸菌体代谢缓慢，且温度越低，菌体休眠程度越高；随着温度的升高，代谢越来越旺盛，至34℃时达到最顶峰。温度继续升高，逐渐超过了色氨酸生物酶的耐受范围，开始失活，色氨酸菌种逐渐衰亡；温度越高，色氨酸菌种衰亡越快，到40℃时菌种很快就会彻底死亡，产出的色氨酸也就越来越少。所以也就出现了一条在28℃至40℃的范围内随温度上升色氨酸产量先上升再下降的曲线。

依据实验结果，确定色氨酸生产最适温度为34℃。

B、溶氧

氧是构成生命体的基本元素之一，它在生命体的生长代谢中起着不可替代的作用。糖、脂肪、蛋白质等在氧的作用下，生成水、二氧化碳等代谢产物，同时释放出大量的热量。

目前微生物发酵法生产色氨酸大多采用是大肠杆菌基因工程菌，大肠杆菌表达系统广泛用于异源蛋白的表达，质粒稳定性是影响产酸量的重要因素。携带质粒的基因生产菌对氧的需求量较大，发酵液中必须有足够浓度的溶解氧，才能满足菌体生长及合成色氨酸的需要。但溶氧过大，菌体生物酶活力过度，菌体衰亡快，同时会造成代谢过度，大量的葡萄糖会完全代谢，生成水和二氧化碳，同时释放热量，而不是合成色氨酸，这显然不是生产的目的。因此，合适的溶氧对色氨酸发酵来说是必须的。

溶氧控制实验情况如下：

物料配比(g/L)：

控制条件如下：

发酵接种量：18％

流加糖：浓度55％左右

温度控制：34℃(依据实验结论)；放罐前温度加热至60℃，并维持10min。

pH值控制：6.5

罐压控制：0.06-0.10Mpa

放罐残糖：≤0.3％

发酵周期：36hr

溶氧实验数据如下：

色氨酸生产溶氧实验数据汇总表

结合图3《色氨酸产酸与溶氧关系图》可以看出，溶氧在25-30％时，产酸相对稳定，一般在60g/L左右，溶氧不足或过量，产酸都会下降。依次，确定色氨酸溶氧条件在25-30％。

(3)液氨代替尿素实验分析

色氨酸是氨基酸，在合成时需要N元素补给。在色氨酸发酵生产原有工艺中，N由尿素提供。色氨酸释放出尿酶，尿素在尿酶催化作用下，与水反应生成NH₃和CO₂，NH₃被色氨酸菌体吸收利用，合成其它物质，CO₂作为废气排放。

尿素的弊端：尿素在流加前，必须要配制成溶液，且要消毒灭菌，然后才能使用。纵然如此，因尿素消毒时操作不当，仍然会有杂菌带入，引起污染。尿素在发酵生产中存在一个分解过程，由尿素分解成氨，致使pH值的检测有一个滞后过程，不能真实反映当前pH值的实际控制参数，控制难度较大。

通过比较，发现液氨不存在尿素的上述缺点。利用液氨做N源，不仅去除了尿素分解的这个过程，可以直接反映当前的真实pH值，对生产的稳定更有利；而且，液氨的温度极低，pH值很高，对生命体具有一定的杀灭作用，几乎没有杂菌能够在液氨中存活，省去了消毒灭菌的过程，减少了杂菌侵入的机会；液氨在溶解时要吸收大量的热，还能起到降温的作用；另外尿素需要配制成溶液，对发酵料液有稀释作用，无形中降低了色氨酸含量，而液氨则没有这一弊端，所以液氨代替尿素有利于色氨酸产酸水平的提高。

(4)底糖分消实验分析

色氨酸发酵为纯种发酵，发酵培养基需经杀灭杂菌后才能进行正常的接种发酵。在传统的色氨酸生产中，发酵培养基配料是将各种营养物质和糖液按照一定的配比混合在一起，搅拌均匀后再进行连消灭菌，灭菌温度125-130℃。分析认为：混料高温灭菌对色氨酸发酵影响很大，主要原因在于：第一，培养基中需添加酵母抽提物或酵母膏等，含有大量有机氮，糖与有机氮在高温下会发生反应，生产羟胺络合物。不仅白白损失了糖、有机氮等营养成分，而且，生成的羟胺络合物还会对菌体生长产生一定的毒害影响。同时，羟胺络合物颜色深，直接影响了产品质量。第二，葡萄糖在125-130℃的高温下，自身会发生焦糖化反应；不仅损失了葡萄糖，而且焦糖对色氨酸影响极大，焦糖含量高时，菌体生长繁殖慢，菌体活力弱，产酸慢；同时，焦糖同羟胺络合物一样，对最终的产品质量会产生影响。

发酵底糖采用分消工艺，优点在于：除去葡萄糖后，培养基主要是一些无机盐和有机氮源，灭菌温度125-130℃，可有效杀灭杂菌；而葡萄糖消毒温度120-122℃，温度低，焦糖化等副反应少，同时消除了羟胺反应，避免了有毒有害物质的产生，消除了发酵过程中对菌体生长和代谢的抑制作用，提高了葡萄糖转化率和发酵产酸率。

基于上述分析，进一步将尿素去除，用液氨代替，同时将底糖分消，进行了一下实验：

实验地点：通辽梅花生物科技有限公司色氨酸发酵车间

实验设备：15m³种子罐

物料配比：同温度、溶氧实验控制

实验控制：温度控制34℃，溶氧控制25-30％，其它控制条件除实验条件外不变。

实验结果如下：

液氨为氮源、底糖分消实验结果汇总表

通过实验结果可以看出，工艺研究后色氨酸发酵指标明显上升，工艺研究取得可喜效果。

(5)大型综合实验

根据15m³罐放大实验结果，确定色氨酸发酵工艺方案如下：

发酵配方：初糖：10g/L；K₂HPO₄：8.2g/L；MgSO₄：2.4g/L；(NH₄)₂SO₄：1.8g/L；Na₂SO₄：0.022g/L；柠檬酸：2.4g/L；FeSO₄：0.084g/L；酵母抽提物：4g/L

消毒方式：培养基与底糖分开消毒，培养基125-130℃，底糖120-122℃；

发酵接种量：18％；

流加糖：浓度55％左右；

温度控制：34℃；放罐前加热至60℃，并维持10min。

pH值控制：6.5，液氨流加；

罐压控制：0.06-0.10Mpa

溶氧控制：25-30％

根据确定方案，在色氨酸发酵车间150m³发酵罐进行大生产验证实验。结果如下：

大生产实验结果汇总表

实验批次	1	2	3	4	5	平均
							产酸g/L	61	62	60	61	59	60.6
转化率％	46.2	45.3	44.9	46.2	45.5	45.6

结合图4《大生产实验验证结果图》可见，按照研究结果应用于生产，色氨酸产酸60.6g/L，糖酸转化率45.6％，完全达到了预期目标。

4研究结论

(1)研究结果汇总

通过对发酵配方和发酵控制过程的控制的调整，以及液氨代替尿素和底糖分消等技术应用于发酵生产，我公司色氨酸生产得到了研究，生产条件更有利于色氨酸生产水平的提高。

研究后工艺条件：

发酵配方：初糖：10g/L；K₂HPO₄：8.2g/L；MgSO₄：2.4g/L；(NH₄)₂SO₄：1.8g/L；Na₂SO₄：0.022g/L；柠檬酸：2.4g/L；FeSO₄：0.084g/L；酵母抽提物：4g/L

连消方式：培养基与底糖分开消毒，培养基125-130℃，底糖120-122℃；

发酵接种量：18％；

流加糖：浓度55％左右；

温度控制：34℃；放罐前加热至60℃，并维持10min。

pH值控制：6.5，液氨流加；

罐压控制：0.06-0.10Mpa

溶氧控制：25-30％

通过以上对发酵配方及温度、溶氧等控制参数的研究确定以及用液氨代替尿素、连消底糖分消等措施，色氨酸生产指标得到提升，最终色氨酸生产指标达到了产酸≥60g/L、转化率≥45％的重大突破。

(2)主要技术指标

将工艺研究前后指标对照如下：

L-色氨酸发酵法生产工艺研究前后技术指标对比表

色氨酸发酵生产工艺创新之后，发酵产酸比传统工艺提高20g/L左右，转化率提高15％左右，一举扭转了我公司色氨酸生产技术落后的局面，研究后工艺指标发酵产酸率≥60g/L、糖酸转化率≥45％。

Claims (2)

1.一种色氨酸提质增效新工艺，提供一种色氨酸提质增效新工艺，采用微生物发酵法，其特征在于：所述微生物发酵法采用的培养基材料包括酵母抽提物：3.9-4.1g/L，N源材料液氨，所述培养基所用的糖与其他物料分开消毒灭菌；所述培养基发酵过程的温度控制33-35℃，溶氧控制：25-30％；

所述微生物发酵法采用的培养基材料有：底糖采用葡萄糖：9.5-10.5g/L；K₂HPO₄：8-8.4g/L；MgSO₄：2.2-2.6g/L；(NH₄)₂SO₄：1.6-2g/L；Na₂SO₄：0.02-0.024g/L；柠檬酸：2.2-2.6g/L；FeSO₄：0.08-0.086g/L；所述培养基的发酵接种量：17-19％；流加糖：浓度54-56％；放罐前加热至58-62℃，并维持8-12min；pH值控制：6.4-6.6；罐压控制：0.06-0.10Mpa；

所述消毒灭菌的温度是：葡萄糖120-122℃，培养基其他物料125-130℃。

2.根据权利要求1所述的一种色氨酸提质增效新工艺，其特征在于：所述酵母抽提物：4g/L，温度控制34℃，溶氧控制：28％；

所述培养基材料的优选配方：葡萄糖：10g/L；K₂HPO₄：8.2g/L；MgSO₄：2.4g/L；(NH₄)₂SO₄：1.8g/L；Na₂SO₄：0.022g/L；柠檬酸：2.4g/L；FeSO₄：0.084g/L；发酵接种量：18％；流加糖：浓度55％；温度控制：34℃；放罐前加热至60℃，并维持10min；液氨流加控制pH值：6.5；罐压控制：0.08Mpa；

所述发酵过程采用溶解氧电极测定溶氧指标。

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