CN101985638B - 前体流加发酵生产l-色氨酸的方法 - Google Patents
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Abstract
前体流加发酵生产L-色氨酸的方法，涉及L-色氨酸。先对ATCC 27325进行筛选，制作成冷冻甘油管，然后接种于一级摇瓶种子培养基培养成一级种子，再接种于种子罐中培养成二级种子，最后接种于装有发酵培养基的发酵罐中发酵，发酵采用在菌体进入对数期时开始流加浓度为200～300g/L的邻氨基苯甲酸，初始流加速度为0.1～0.3g/L/h，之后逐渐增大，至发酵结束时流加速度为0.6～0.8g/L/h。采用发酵法生产的L-色氨酸的产量可达40～50g/L，糖酸转化率20％～22％，且发酵周期短，生产工艺简单，生产成本低，可满足工业化生产L-色氨酸的要求，具有很大的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及L-色氨酸，尤其是涉及一种前体流加发酵生产L-色氨酸的方法。
背景技术
L-色氨酸(L-Trp)是一种含有吲哚基的中性芳香族氨基酸，是人和动物生命活动中不可缺少的必需氨基酸之一。由于L-色氨酸及其代谢产物对机体的广泛作用，其在医药领域的用途一度成为医学界的研究热门，到目前为止，L-色氨酸作为治疗癞皮病、精神分裂症、营养药剂、人工膳食和必需氨基酸片的用途已经得到了广泛的承认(李剑欣，张绪梅，徐琪寿.色氨酸的生理生化作用及其应用[J]氨基酸和生物资源，2005，27(3)：58-62)。L-色氨酸在食品工业的应用价值主要在于它被广泛地用作食品添加剂、调味剂和抗氧化防腐剂。近年来，由于在配合饲料中大量使用合成的蛋氨酸和赖氨酸，使得L-色氨酸成为饲料中主要的限制性氨基酸，是继蛋氨酸和赖氨酸之后的第三大饲料添加剂(张炳荣.氨基酸工业大全[M].北京：轻工业出版社，1991)。
早期的L-色氨酸的生产方法主要依靠化学合成法和蛋白质水解法，但是由于这些方法存在着材料来源有限、周期长、工艺复杂、产品成分复杂等缺点，因而在上世纪90年代逐渐被淘汰，随着对微生物法生产L-色氨酸研究的不断深入，微生物法已经走向实用并且处于主导地位。微生物法大体上又可以分为酶法、微生物转化法和微生物发酵法(张克旭.氨基酸发酵工艺学[M].北京：中国轻工业出版社.1992：712-722)。酶法和微生物转化法的高成本已困扰研究工作者多年，进展不大，难以实现大规模低成本生产L-色氨酸。而微生物发酵法具有产酸高、成本低、质量好等优势，将是未来大规模生产L-色氨酸的首选技术。
目前，微生物发酵产L-色氨酸主要使用到的菌种为谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌。在谷氨酸棒杆菌方面，Katsumata等(Katsumata R，Ikeda M.Hyperproductiion of tryptophan inCorynebacterium glutamicum by pathway engineering.Nature Bioechnology，1993，11：921-925)将带有7-磷酸-2-酮-3-脱氧庚糖酸(DAHP)合成酶和色氨酸合成酶的质粒引入产色氨酸的谷氨酸棒杆菌KY10894，发酵80h使得L-色氨酸的产量比原始菌株提高了54％，达到43g/L；Ikeda等(Ikeda M，Nakanishi K，Kino K，et al.Fermentative production of tryptophan by a stablerecombinant strain of Corynebacterium glutamicum with a modified serine-biosynthetic pathway[J]Biosci Biotechnol Biochem，1994，58(4)：674-678)又将丝氨酸代谢途径中的磷酸甘油酸脱氢酶的基因克隆岛表达aroG基因与色氨酸合成酶基因的质粒pWK99中，构建出重组质粒pWK9901，并将后者转入色氨酸生产菌KY10894，解决了发酵过程中丝氨酸供给量较少而积累副产物吲哚等问题，发酵80h后，产量达50g/L。Ikeda等(Ikeda M，Katsumata R.Hyperproduction of tryptophan by Corynebacterium glutamicum with the modified pentosephosphate pathway[J]Applied and environmental microbiology，1999，51(2)：201-206)通过代谢途径分析，发现在产色氨酸的谷氨酸棒杆菌pIK9960中过表达tktA可增加磷酸戊糖途径中E4P的量，从而提高芳香族氨基酸生物合成产率，最终发酵80h色氨酸的产量可达到58g/L。在大肠杆菌方面，日本三乐公司从大肠杆菌K12中取出色氨酸操纵子，组合于载体质粒后，导入大肠杆菌3110，转化株经NTG诱变，得到质粒稳定的6-FT抗性株，再附加8-氮鸟嘌呤抗性，成功选育出L-色氨酸高产株，菌体以葡萄糖和邻氨基苯甲酸为原料进行发酵，培养120h后，产量可达40.3g/L；Berry(Berry A.Improving production of aromatic compounds inEscherichia coli by metabolic engineering[J]Trends Biotechnol，1996，14(7)：250-256)克隆了编码DAHP合成酶的aroG基因以及整个色氨酸操纵子，并对aroG和trpE基因进一步改构，在大肠杆菌中进行高表达，发酵50h后，产量达45g/L；Park等(ParkYH，Lim SJ，Kim BH，etal.E.coli mutant containing mutant genes related with tryptophan biosynthesis and productionmethod of tryptophan by using the same[P].U.S.2008：NO.0299644)通过诱变色氨酸合成途径中的多个基因，成功选育出L-色氨酸的高产株CJ285，发酵61h后，L-色氨酸产量达28.2g/L，糖酸转化率为11.6％。尽管在前人的研究基础上L-色氨酸的产量已有所提高，但还存在发酵周期长、糖酸转化率低等问题，若要满足工业化生产的需求，还需要进一步提高L-色氨酸的产量和糖酸转化率，缩短发酵时间，从而降低生产成本。
发明内容
本发明的目的在于提供一种前体流加发酵生产L-色氨酸的方法。
本发明的技术方案包括以下步骤：
1)菌种筛选：取大肠杆菌基因工程菌(E.coli K12W3110)ATCC 27325菌液(可购自美国菌种保藏中心)，用已灭过菌的pH为6～8的磷酸盐缓冲液稀释103～106倍后涂布于LB平板，于35～37℃培养18～30h；从LB平板中挑选单菌落涂布于新的LB平板，于35～37℃再培养18～30h，将得到的单菌落用pH为6～8的磷酸盐缓冲液振荡稀释，然后涂布于新的LB平板，于35～37℃培养18～30h后得到菌层，用LB培养基洗下菌层，然后将菌液加入到无菌保种管，按1∶1比例加入40％的无菌甘油后于-20℃保存备用；
2)一级摇瓶种子：将步骤1)得到的菌液以0.1％～1％的接种量接种于装有一级种子培养基的摇瓶中，于35～37℃，以150～250rpm培养10～20h；
3)二级发酵罐种子：将步骤2)得到的一级摇瓶种子以1％～10％的接种量接种于装有二级种子培养基的种子罐中，控制风量6～12L/min，转速300～500rpm，温度35～37℃，罐压0.05～0.08MPa，pH值通过氨水控制在6.5～7.0，培养10～20h；
4)发酵培养：将步骤3)得到的二级发酵罐种子以1％～10％的接种量接种于装有发酵培养基的发酵罐中发酵，控制风量15～30L/min，转速300～700rpm，温度35～37℃，罐压0.05～0.08MPa，pH值通过氨水控制在6.5～7.0；流加葡萄糖浓度为500～600g/L，采用低糖补料的方法，维持溶氧在10％～30％，同时在菌体进入对数期时开始流加浓度为200～300g/L的邻氨基苯甲酸，初始流加速度为0.1～0.3g/L/h，之后逐渐增大，至发酵结束时流加速度为0.6～0.8g/L/h，发酵周期30～40h，产物L-色氨酸产量40～50g/L，邻氨基苯甲酸转化量6～8g/L，糖酸转化率20％～22％。
在步骤1)中，所述LB培养基的组成可为酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，琼脂15～20g/L，盐酸四环素10～100mg/L，灭菌前pH值7.2～7.5。
在步骤2)中，所述一级种子培养基的组成可为磷酸氢二钾15～30g/L，酵母粉10～20g/L，磷酸二氢钾6～18g/L，硫酸铵2～10g/L，七水硫酸镁1～5g/L，葡萄糖20～40g/L，盐酸四环素10～100mg/L，灭菌前pH值7.2～7.5。
在步骤3)中，所述二级种子培养基的组成可为磷酸氢二钾2～8g/L，酵母粉1～5g/L，七水硫酸镁1～5g/L，硫酸铵1～5g/L，柠檬酸三钠二水物1～5g/L，葡萄糖20～50g/L。
在步骤4)中，所述发酵培养基的组成可为磷酸氢二钾5～15g/L，酵母粉1～5g/L，七水硫酸镁1～5g/L，硫酸铵1～5g/L，柠檬酸1～5g/L，硫酸亚铁50～200mg/L，葡萄糖10～30g/L。
本发明通过大肠杆菌基因工程菌(E.coli K12W3110)ATCC 27325发酵生产L-色氨酸，采用前体流加的发酵工艺，有效地提高了L-色氨酸的产量和糖酸转化率，能够在较短发酵周期内实现L-色氨酸的高产量积累，最终L-色氨酸产量可达40～50g/L，糖酸转化率20％～22％(接近理论转化值22.7％)，同时发酵周期短，生产成本低，生产工艺简单，可满足工业化生产L-色氨酸的要求，具有很大的应用前景。
附图说明
图1为实施例1中L-色氨酸基因工程菌(E.coli K12W 3110)ATCC 27325在发酵培养基中生产L-色氨酸的过程曲线。在图1中，横坐标为时间Cultivation time(h)，左纵坐标为菌体OD值OD660(○)和L-色氨酸产量L-Trp(g/L)(★)，第一右纵坐标为残糖量RG(g/L)(◆)，第二右纵坐标为溶氧DO(％)(-)。
图2为实施例2中L-色氨酸基因工程菌(E.coli K12W 3110)ATCC 27325在发酵培养基中流加前体生产L-色氨酸的过程曲线。在图2中，横坐标为时间Cultivation time(h)，左纵坐标为菌体OD值OD660(○)和L-色氨酸产量L-Trp(g/L)(★)，第一右纵坐标为残糖量RG(g/L)(◆)，第二右纵坐标为溶氧DO(％)(-)。
图3为实施例3中L-色氨酸基因工程菌(E.coli K12W 3110)ATCC 27325在发酵培养基中流加前体生产L-色氨酸的过程曲线。在图3中，横坐标为时间Cultivation time(h)，左纵坐标为菌体OD值OD660(○)和L-色氨酸产量L-Trp(g/L)(★)，第一右纵坐标为残糖量RG(g/L)(◆)，第二右纵坐标为溶氧DO(％)(-)。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例1
1)菌种筛选：打开冷冻甘油管，取15μL的大肠杆菌基因工程菌(E.coli K12W3110)ATCC 27325菌液，用已灭过菌的pH为7的磷酸盐缓冲液稀释104倍；取200μL稀释液涂布于LB平板，于37℃培养20h；从LB平板中挑选单菌落涂布于新的LB平板，以便得到新的单菌落，于37℃培养20h；将最终得到的单菌落用pH为7的磷酸盐缓冲液1mL振荡稀释，取200μL稀释液涂布于新的LB平板以便得到菌层，于37℃培养20h；最后用3mL的LB培养基洗下菌层，然后将菌液加入到空的无菌保种管，按1∶1比例加入40％的无菌甘油；甘油管-20℃保存备用。LB平板培养基组成为酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，琼脂15g/L，盐酸四环素20mg/L，灭菌前pH值7.2。
2)一级摇瓶种子：将步骤1)中的甘油管，以0.1％的接种量接种于装有75mL一级种子培养基的500mL摇瓶中，于37℃，以150rpm培养12h。一级摇瓶种子培养基组成为磷酸氢二钾20g/L，酵母粉10g/L，磷酸二氢钾10g/L，硫酸铵4g/L，七水硫酸镁3g/L，葡萄糖20g/L，盐酸四环素20mg/L，灭菌前pH值7.2。
3)二级发酵罐种子：将步骤2)的一级摇瓶种子，以1％的接种量接种于装有6L二级种子培养基的10L种子罐中，培养过程中，风量控制在6L/min，转速控制在300rpm，温度控制在37℃，罐压保持在0.05MPa，pH值通过氨水控制在7.0，培养12h。二级发酵罐种子培养基组成为磷酸氢二钾4g/L，酵母粉1g/L，七水硫酸镁2g/L，硫酸铵2g/L，柠檬酸三钠二水物4g/L，葡萄糖50g/L。
4)发酵培养：将步骤3)的二级发酵罐种子，以5％的接种量接种于装有15L发酵培养基的30L发酵罐中发酵，发酵过程中，风量控制在15L/min，转速控制在300～600rpm，温度控制在37℃，罐压保持在0.05MPa，pH值通过氨水控制在7.0；流加葡萄糖浓度为500g/L，采用低糖补料的方法，维持溶氧在10～30％；发酵周期36h。发酵培养基组成为磷酸氢二钾5g/L，酵母粉1g/L，七水硫酸镁4g/L，硫酸铵4g/L，柠檬酸1g/L，硫酸亚铁50mg/L，葡萄糖20g/L。
采用液相色谱对产物进行测定，HPLC流动相：按体积比，0.15％磷酸二氢钠∶甲醇＝85∶15。色谱条件为色谱柱：C18ODS；柱温：36℃；检测器：DAD(HP1200)；检测波长：278nm；流速：1mL/min；进样量：20μL。由图1的发酵过程曲线可知，通过发酵罐培养36h，最终L-色氨酸的产量积累可达30g/L，而糖酸转化率为14％。
实施例2
1)菌种筛选：打开冷冻甘油管，取15μL的ATCC 27325菌液，用已灭过菌的pH为7的磷酸盐缓冲液稀释104倍；取200μL稀释液涂布于LB平板，于37℃培养20h；从LB平板中挑选单菌落涂布于新的LB平板，以便得到新的单菌落，于37℃培养20h；将最终得到的单菌落用pH为7的磷酸盐缓冲液1mL振荡稀释，取200μL稀释液涂布于新的LB平板以便得到菌层，于37℃培养20h；最后用3mL的LB培养基洗下菌层，然后将菌液加入到空的无菌保种管，按1∶1比例加入40％的无菌甘油；甘油管-20℃保存备用。LB平板培养基组成为酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，琼脂15g/L，盐酸四环素20mg/L，灭菌前pH值7.2。
2)一级摇瓶种子：将步骤1)中的甘油管，以0.1％的接种量接种于装有75mL一级种子培养基的500mL摇瓶中，于37℃，以150rpm培养12h。一级摇瓶种子培养基组成为磷酸氢二钾20g/L，酵母粉10g/L，磷酸二氢钾10g/L，硫酸铵4g/L，七水硫酸镁3g/L，葡萄糖20g/L，盐酸四环素20mg/L，灭菌前pH值7.2。
3)二级发酵罐种子：将步骤2)的一级摇瓶种子，以1％的接种量接种于装有6L二级种子培养基的10L种子罐中，培养过程中，风量控制在6L/min，转速控制在300rpm，温度控制在37℃，罐压保持在0.05MPa，pH值通过氨水控制在7.0，培养12h。二级发酵罐种子培养基组成为磷酸氢二钾4g/L，酵母粉1g/L，七水硫酸镁2g/L，硫酸铵2g/L，柠檬酸三钠二水物4g/L，葡萄糖50g/L。
4)发酵培养：将步骤3)的二级发酵罐种子，以5％的接种量接种于装有15L发酵培养基的30L发酵罐中发酵，发酵过程中，风量控制在15L/min，转速控制在300～600rpm，温度控制在37℃，罐压保持在0.05MPa，pH值通过氨水控制在7.0；流加葡萄糖浓度为500g/L，采用低糖补料的方法，维持溶氧在10％～30％；同时在菌体进入对数期时开始流加浓度为200g/L的邻氨基苯甲酸，初始流加速度为0.3g/L/h，之后逐渐增大，至发酵结束时流加速度为0.8g/L/h。发酵周期36h。发酵培养基组成为磷酸氢二钾5g/L，酵母粉1g/L，七水硫酸镁4g/L，硫酸铵4g/L，柠檬酸1g/L，硫酸亚铁50mg/L，葡萄糖20g/L。
液相色谱的测定条件同实施例1，由图2发酵过程曲线可知，通过发酵罐培养36h，最终L-色氨酸的产量积累可达40g/L，糖酸转化率为20％。而L-色氨酸产量和糖酸转化率相对于实施例1中没有流加前体的结果分别提高了33.3％和42.9％。
实施例3
1)菌种筛选：打开冷冻甘油管，取15μL的ATCC 27325菌液，用已灭过菌的pH为7的磷酸盐缓冲液稀释104倍；取200μL稀释液涂布于LB平板，于37℃培养24h；从LB平板中挑选单菌落涂布于新的LB平板，以便得到新的单菌落，于37℃培养24h；将最终得到的单菌落用pH为7的磷酸盐缓冲液1mL振荡稀释，取200μL稀释液涂布于新的LB平板以便得到菌层，于37℃培养24h；最后用3mL的LB培养基洗下菌层，然后将菌液加入到空的无菌保种管，按1∶1比例加入40％的无菌甘油；甘油管-20℃保存备用。LB平板培养基组成为酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，琼脂15g/L，盐酸四环素20mg/L，灭菌前pH值7.2。
2)一级摇瓶种子：将步骤1)中的甘油管，以0.1％的接种量接种于装有75mL一级种子培养基的500mL摇瓶中，于37℃，以150rpm培养15h。一级摇瓶种子培养基组成为磷酸氢二钾20g/L，酵母粉10g/L，磷酸二氢钾10g/L，硫酸铵4g/L，七水硫酸镁3g/L，葡萄糖20g/L，盐酸四环素20mg/L，灭菌前pH值7.2。
3)二级发酵罐种子：将步骤2)的一级摇瓶种子，以1％的接种量接种于装有6L二级种子培养基的10L种子罐中，培养过程中，风量控制在8L/min，转速控制在400rpm，温度控制在37℃，罐压保持在0.05MPa，pH值通过氨水控制在7.0，培养12h。二级发酵罐种子培养基组成为磷酸氢二钾4g/L，酵母粉1g/L，七水硫酸镁2g/L，硫酸铵2g/L，柠檬酸三钠二水物4g/L，葡萄糖50g/L。
4)发酵培养：将步骤3)的二级发酵罐种子，以10％的接种量接种于装有15L发酵培养基的30L发酵罐中发酵，发酵过程中，风量控制在20L/min，转速控制在400～700rpm，温度控制在37℃，罐压保持在0.05MPa，pH值通过氨水控制在7.0；流加葡萄糖浓度为500g/L，采用低糖补料的方法，维持溶氧在10％～30％；同时在菌体进入对数期时开始流加浓度为200g/L的邻氨基苯甲酸，初始流加速度为0.3g/L/h，之后逐渐增大，至发酵结束时流加速度为0.8g/L/h。发酵周期36h。发酵培养基组成为磷酸氢二钾5g/L，酵母粉1g/L，七水硫酸镁4g/L，硫酸铵4g/L，柠檬酸1g/L，硫酸亚铁50mg/L，葡萄糖20g/L。
液相色谱的测定条件同实施例1，由图3发酵过程曲线可知，通过发酵罐培养36h，最终L-色氨酸的产量积累可达47g/L，糖酸转化率为22％。而L-色氨酸产量和糖酸转化率相对于实施例1中没有流加前体的结果分别提高了56.7％和57.1％。
Claims (5)
1.前体流加发酵生产L-色氨酸的方法，其特征在于包括以下步骤：
1）菌种筛选：取大肠杆菌基因工程菌K12W3110ATCC27325菌液，用已灭过菌的pH为6~8的磷酸盐缓冲液稀释103~106倍后涂布于LB平板，于35~37℃培养18~30h；从LB平板中挑选单菌落涂布于新的LB平板，于35~37℃再培养18~30h，将得到的单菌落用pH为6~8的磷酸盐缓冲液振荡稀释，然后涂布于新的LB平板，于35~37℃培养18~30h后得到菌层，用LB培养基洗下菌层，然后将菌液加入到无菌保种管，按1∶1比例加入40%的无菌甘油后于-20℃保存备用；
2）一级摇瓶种子：将步骤1）得到的菌液以0.1%~1%的接种量接种于装有一级种子培养基的摇瓶中，于35~37℃，以150~250rpm培养10~20h；
3）二级发酵罐种子：将步骤2）得到的一级摇瓶种子以1%~10%的接种量接种于装有二级种子培养基的种子罐中，控制风量6~12L/min，转速300~500rpm，温度35~37℃，罐压0.05~0.08MPa，pH值通过氨水控制在6.5~7.0，培养10~20h；
4）发酵培养：将步骤3）得到的二级发酵罐种子以1%~10%的接种量接种于装有发酵培养基的发酵罐中发酵，控制风量15~30L/min，转速300~700rpm，温度35~37℃，罐压0.05~0.08MPa，pH值通过氨水控制在6.5~7.0；流加葡萄糖浓度为500~600g/L，采用低糖补料的方法，维持溶氧在10%~30%，同时在菌体进入对数期时开始流加浓度为200~300g/L的邻氨基苯甲酸，初始流加速度为0.1~0.3g/L/h，之后逐渐增大，至发酵结束时流加速度为0.6~0.8g/L/h，发酵周期30~40h，产物L-色氨酸产量40~50g/L，邻氨基苯甲酸转化量6~8g/L，糖酸转化率20%~22%。
2.如权利要求1所述的前体流加发酵生产L-色氨酸的方法，其特征在于上述步骤1）中，所述LB培养基的组成为酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，琼脂15~20g/L，盐酸四环素10~100mg/L，灭菌前pH值7.2~7.5。
3.如权利要求1所述的前体流加发酵生产L-色氨酸的方法，其特征在于上述步骤2）中，所述一级种子培养基的组成为磷酸氢二钾15~30g/L，酵母粉10~20g/L，磷酸二氢钾6~18g/L，硫酸铵2~10g/L，七水硫酸镁1~5g/L，葡萄糖20~40g/L，盐酸四环素10~100mg/L，灭菌前pH值7.2~7.5。
4.如权利要求1所述的前体流加发酵生产L-色氨酸的方法，其特征在于上述步骤3）中，所述二级种子培养基的组成为磷酸氢二钾2~8g/L，酵母粉1~5g/L，七水硫酸镁1~5g/L，硫酸铵1~5g/L，柠檬酸三钠二水物1~5g/L，葡萄糖20~50g/L。
5.如权利要求1所述的前体流加发酵生产L-色氨酸的方法，其特征在于上述步骤4）中，所述发酵培养基的组成为磷酸氢二钾5~15g/L，酵母粉1~5g/L，七水硫酸镁1~5g/L，硫酸铵1~5g/L，柠檬酸1~5g/L，硫酸亚铁50~200mg/L，葡萄糖10~30g/L。
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