JPS62208284A - 新規なプラスミド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新規なプラスミドに関し、さらに詳しくは、ア
ントラニル酸シンターゼに対するトリプトファンによる
フィードバック阻害が解除されたトリプトフアンオペロ
ンと、セリンヒドロキシ′チルトランスフエラーゼの生
合成を司る遺伝子とを併せ有する組換えプラスミド、該
プラスミドで形質転換した微生物及び該微生物を用いる
トリプトファンの製造方法に関する。

従来、微生物を用いてＬ−）リプドアアン（以下、単に
「トリプトファン」という）を製造する方法として、栄
養培地中にアントラニル酸、インドールを添加し、微生
物を培養する方法（例えば、特公昭３５４２３８４号公
報参照）、Ｌ−セリンを含む培地に微生物を培養する方
法（特開昭５５−１６２７７１号公報参照）等が知られ
ている。

本発明者らは先に、トリプトファンオペロンを含有する
プラスミドで形質転換した、トリプトファナーゼの生合
成を司る遺伝子が欠失しているエシェリヒア属に属する
微生物をｆｆｌ！ｌ、その微生物を用いてトリプトファ
ンを製造する方法を提案した（特開昭５７−８０３９８
号公報参照）６上記提案の方法によれば、培地にアント
ラニル酸を添加して培養することにより、培養物中のト
リプトファンの蓄積量を飛躍的に高めることができるが
、同様にインドールも＊ｍし、上記微生物によるトリプ
トファンの生産活性が低下するという問題がある。この
インドールの蓄積は、トリプト７アンシンターゼの基質
であるし一セリン（以下、単に「セリン」という）の供
給能力が弱いためであると考えられ、従って、セリンを
培地に添加すれば、トリプトファンの生産性は向上する
ものと期待されるが、セリンは高価であるため実用的で
はない。

本発明者らは、かかる課題を解決する手段として、培地
中にグリシンを添加することを提案した（特開昭５９−
１４０８９１号公報参照）、この方法によれば、グリシ
ンを添加することでインドールの！ｒ！積が減少し、ト
リプトファンの′４ＩＩ積景を成る程度増大させること
ができるが、グリシンの添加の効果には限度があり、濃
度を成る程度以」−増加しても、トリプトファンの生成
量はそれ以上増加しないという問題がある。これはグリ
シンとセリンとの相互変換を触媒するセリンヒドロキシ
′チルトランスフエラーゼ（以下Ｓ　ＨＴ　ａｓｅと略
記する）の細胞内の活性が低いことに原因があると考え
られる。

５ＨＴａｓｅ活性を強化する方法として、例えば、ＤＮ
Ａ組換え技術によりＳ　Ｈ”Ｉ’　ａｓｅの生合成を司
る遺伝子、すなわち吐ＤＪ伝子を上記のプラスミドに組
み込み、いわゆる遺伝子増幅効果を利用することが考え
られる。しかして、１１Ｊヨとトリプトフアンオペロン
を併せもつ組換えプラスミドを作製すれば、グリシンの
添加効果が増大し、トリプトフアン生産性が向上するこ
とが期待される。

吐已Ｊ伝子とトリプトフアンオベロンとを併せもつ組換
えプラスミドとして、ノー・ニス・スコグ？　：／　（
Ｇ　、　Ｓ　、　Ｓ　ｋｏｇｍａｎ）らは、エシェリヒ
ア・コ’）　（Ｆ、　５ａ１５ｅｒｊｃ足ｉｓ、、　ｃ
ｏｌｉ）Ｋ　　１２株由米の野性型のトリプトフアンオ
ペロンと吐Ｌ３伝子とを、制限酵素影旦ＲＩを用いてｐ
１３Ｒ３２２にクローン化し、ｒＡＪ伝子と野性型のト
リプトフアンオペロンを有するプラスミドｐＳＧＳ１４
を作製し、このプラスミドｐＳＧＳ、１４で形質転換さ
れたＥ、ｃｏｌｉＡｃＢｉ株をグリシンを含む栄養培地
で培養したが、トリプトファン生産性の向上を観察する
ことはできなかったと報告している［ジャーナル・オプ
・ゼネラル・マイクロバイオロジー（Ｊ　、　Ｇ　ｅｎ
、　Ｍ　１ｃｒｏｂｉｏ１．　）、１３０：３０９１−
３１００．１９８４］。トリプトファンの生産性の向上
を観察することができなかった原因として、クローン化
されているトリプトフアンオペロンが野生型で、そのア
ントラニル酸シンターゼ（以下Ａ　Ｓ　ａｓｅと略記す
る）がトリプトファンによるフィードバック阻害を受け
ていること、並びに宿主として用いたＥ、ｃｏｌｉＡｃ
Ｂ　１株がトリプトファンレプレッサー活性を有してい
ることの２点が考えられる。

そこで本発明者らは、Ａ　Ｓ　ａｓｅがフィードバック
阻害に耐性となったトリプトファンオペロンと社己Ｊ伝
子とを有する組換えプラスミドを作製し、該プラスミド
をトリプト７アンレプレツサー及びトリプトファナーゼ
の生合成を司る遺伝子が欠損しているエシェリヒア属に
属する微生物に導入し、該微生物を栄養培地で培養した
ところ、培地に添加するグリシン濃度の上昇とともにト
リプトファンＷ積量が増大することを見い出し、本発明
を完成するに至った。

しかして、本発明によれば、アントラニル酸シンターゼ
に対するトリプトファンによるフィードバック阻害が解
除されたトリプト７アンオベロンと、セリンヒドロキシ
′チルトランスフエラーゼの生合成を司る遺伝子を含有
することを特徴とするプラスミドが提供される。

以下、本発明についてさらに詳しく説明する。

トリプトファンオペロン 本発明のプラスミドに含まれるトリプト７アンオベロン
は％　Ａ　Ｓ　ａｓｅに対するトリプトファンによるフ
ィードバック阻害が解除されたものである。

微生物体内でのトリプトファンの合成経路の第一段階は
Ａ　Ｓ　ａｓｅによるコリスミン酸のアント２ニル酸へ
の変換であるが、Ａ　Ｓ　ａｓｅは通常トリプトファン
によるフィードバック阻害を受ける。しかし、例えば、
アプライド・エンピロメンタル・マイクロバイオロジー
（Ａ　ｐｐｌ、　Ｅ　ｎｖｉｒｏｎ、　Ｍ　１ｃｒｏ−
ｂｉｏｌ、）４３　２８９　２９７（１９８２）や特開
昭５７−８０３９８号公報等に記載の方法で変異処理す
ることにより、トリプトファンの同族体、例えば５−メ
チルトリプトファンに耐性をもつようになった微生物菌
株の中には、Ａ　Ｓ　ａｓｅに対するトリプトファンに
よるフィードバック阻害が解除されたものが存在する。

そのような菌株としては、エシェリヒア・コリＡＧＸＧ
（ｐＧＸ５０）（ａｒｏＰ）［ＮＲＲＬＢ１２２６４］
（米国特許第４３７１６１４号明細書）、同Ｗ３１１０
　　（」ノリ旦」−虹且ＲｔｎａＡ　　（ｐｓｃｌｏｌ
−ｔｒｐ・１１５）（ＡＴＣＣ３１７４３）、同Ｗ３１
１０　　リ」Ｊユ旦」エリ」実−ＬｕａＡ　　（ｐＳ　
Ｃ１０１−ｔｒｐ　・ｒ　５　）（特開昭５７−８０３
９８号公報）等が知られている。

これらの菌体から抽出されるプラスミドは、ＡＳ　ａｓ
ｅに対するトリプトファンによるフィードバック阻害が
解除されたトリプトフアンオペロンを含んでおり、その
まま本発明のプラスミドの調製に使用することができ、
或いは該プラスミドからそれ自体既知の方法、例えばア
プライド・エンピロメンタル・マイクロバイオロジー（
Ａ　ｐｐｌ、　Ｅ　＋＋ｖｉｒｏｎ、Ｍｉａｒｏｂｉｏ
１．）４３　２８９−２９７（１９８２）４９に記載の
方法に従って該トリプトフアンオペロンを担うＤＮＡ断
片を単離し、それをベクタープラスミドに組み込んでも
よい。

ベクタープラスミドとしては、エシェリヒア属細菌内で
自律増殖が可能で且つ該細菌の細胞分裂の際に娘細胞に
安定に受は継がれていくための機構を備えたものが有利
に用いられる。ここで娘細胞に安定に受は継がれていく
ための８１構としては、複製されたプラスミドＤＮＡ分
子を等数ずつ娘細胞に分配する均等分配機構と、プラス
ミドの増殖複製に細胞分裂を共役させる細胞分裂８！構
とがあるが、本発明では殊に前者の均等機構を司る遺伝
子を含有するプラスミドをベクターとして使用する。こ
のような均等分配機構を司る遺伝子としては、例えばｐ
ｓｃｌｏｌのＱｒｉｌ伝子、ＲプラスミドＮＲＩの１東
−遺伝子、プラスミドＲ１のｄ伝子またはＦプラスミド
のす且遺伝子等が挙げられ、これら遺伝子を含有するプ
ラスミドの具体的には、ｐｓｃｌｏｌ（ＣｅｌＬ２０：
５２９−５４２．１９８０）、ＲプラスミドＮＲ１（Ｊ
、Ｂａｄｅｒｉｏｌ、、１４↓−＝８７〜９９．１９８
０）、プラスミドＲ１’（ＰＩａｓｍｉｄ、４　：２１
５−２２７．１９８０）、Ｆプラスミド（Ｃｅｌｌ、Ｌ
Ｌ：３５１〜３６０．１９８３）など、或いは、これら
プラスミドから誘導される小型のプラスミド、例えば、
ｐｓｃ１３８（Ｐｒｏｃ、ＮａＬｌ、Ａｅａｄ、Ｓｃｉ
、ＵＳＡ％７２：２２４２−２２４６．１９７５）や、
コピー数変異プラスミド、例えばｐＲＲ１２（Ｊ、Ｂａ
ｃＬｅｒｉｏｌ、１±［８７−９９，１９８０）などが
挙げられる。芦らに、本末は明瞭な均等分配機構を備え
ていないベクタープラスミドであっても、遺伝子組換え
操作により外部から上記のような娘細胞への均等分配機
構をｆｆｊる遺伝子を含むＤＮＡ断片を組み込むことに
より、娘細胞への均等分配８！ｌ構を司る遺伝子を人為
的に含ませたプラスミドもベクターとして利用すること
ができる。この遺伝子組換え操作は例えば、図１を参照
しつつ以下に説明する１）ＳＣＩＯＩの凹工遺伝子を導
入したｐＡｃＹｃ１８４の誘導体の作製方法に準じて実
施できる。

即ち、図１において（１）まず、ｐｓｃｌｏｌを制限酵
素ＨｉｎｃＩＩで切断する。ＨｉｎｅＩ［はＤＮＡの↓ ５′・・・ＧＴＰｙ　ＰｕＡＣ・・・３′の所で切３′
・・・ＧＡＰｕ　ＰｙＴＧ争・・５′↑ 断して平滑末端（ｂｌｕｎｔ　　ｅｎｄ）を生成する。

（２）このｐｓｃｌｏｌの巨Ｃ■切断部位にＴ４す〃−
ゼを作用させて１阻ＲＩリンカ−（ｌｉｎｋｅｒ）を連
結する。凡ｅｏＲＩリンカ−は ５’−ＧＧＡＡＴＴＣＣ−３’　　の塩基配列を持つ３
’−ＣＣＴＴＡＡＧＧ−５’ それ自体公知の合成りＮＡ鎖であり、ＥｃｏＲＩに対す
る切断部位 するものである。なお、このＥｃｏＲＩリンカ−は市販
品として人手可能である（ベーリン〃−・マンハイム社
）。

（３）次にＥｃｏＲＩリンカ−と結合しているｐｓＣｌ
ｏｌの巨Ｃ■断片をＥｃｏＲＩで切断し、（４）同じ＜
−じ−ｃｇＲＩで切断されたｐＡｃＹｃ１８４に］４す
〃−ゼで連結する。ｐＡｃＹｃ１８４はテトラサイクリ
ン耐性（Ｔｃ　　）及びクロラムフェニコール耐性（Ｃ
■　）であるが、ＥｃｏＲＩ切断部位がＣｍ　　　遺伝
子内にあるため、Ｅｃ。

Ｒ１部位に他のＤＮＡが挿入されるとＣ醜　を失う。従
って、目的のプラスミドはＴｃ　　で且っりロラムフェ
ニコール感受性（Ｃｍ　　）となった形質転換株からプ
ラスミドを抽出し、抽出したプラスミドをそれぞれＥｃ
ｏＲＩで切断し、２８７０ｂ、のｕＪ伝子を含む旦１ｎ
ｃＩｌ断片が挿入されたプラスミドを検索することによ
り得られ、この媒作で得られるプラスミドとしては、た
とえばｐＴｕｉがある。

（５）挿入された２８７０ベースペア（ｂｐ）の胆ｃｍ
断片は凹工以外のＤＮＡ部分を含むので、余分のＤＮＡ
部分を除くため、ｐＴｕｌを制限酵素の見ｃｏＲＩと戊
ルーで同時に切断する。戊■Ｉは↓ ５′、・・ＣＰｙＣＧＰｕＧ・・・３′のＤＮＡ配３′
・　・　φＧＰｕＧＣＰｙ　Ｃ−壷　−５′↑ 列を切断する。切断されたＤＮＡ断片はアクリルアミド
デル（４％）電気泳動で分離した後、凹二を含む４１０
ｂｐの旦阻ＲＩ−戊阻工断片をデルから抽出する（例え
ば、Ｐｒｏｃ、Ｎａｂｌ、Ａｃ１ｄ、Ｓｃｉ、Ｕ　ＳＡ
、７４：５６０〜５６４（１９７７）参照）。

次に旦ｃｏＲＩと戊■Ｉで同時に切断されたｐＡＣＹＣ
１８４と４１０ｂｐのＥｃｏＲＩ−戊阻ｌ断片をＴ４す
〃−ゼで連結する。目的のプラスミドは、ＲＳ Ｔｃ　　で且つＣ論　となった形質転換株からプラスミ
ドを抽出し、それぞれのプラスミドをＥｃｏＲＩとＡｖ
ａＩで同時に切断し、４ｉｏｂｐの旦ｃｏＲＩ　−Ａ　
ｖａ　Ｉ断片を生じるものを検索することにより得られ
る。この撹作で得られるプラスミドとして、たとえばｐ
ＰＭ３１がある（Ｃｅｌｌ、　２０　；５２９−５４２
．１９８０）。

（６）他方、４１０ｂｐのＥｃｏＲＩ−！い工ｌ断片を
、ＥｃｏＲＩとＡｖａＩで同時に切断されたｐＢＲ３２
２に連結すれば巳を持つｐＢＲ３２２誘導体、たとえば
ｐｓＧｓｌｏが得られる（Ｇｅｎｅ、　２３　：１０５
〜１１５．１９８３参照）。

ｐＢＲ３２２はアンピシリン耐性（Ａｐ　　）−Ｔｃ　
　であるが、ＥａｏＲＩとＡｖａＩの同時切断により′
ｒｃ　を失う、従って目的のプラスミドはＲＳ Ａｐ　　で且っＴｃ　　となった形質転換株からプラス
ミドを抽出し、それぞれのプラスミドをＥａｏＲＩとＡ
」１エ■で同時に切断し、４１０ｂｐの旦笠Ｒ１Ｎμｌ
断片を生じるものを検索することにより得られる。

これらのうち、Ｓ　ＨＴ　ａｓｅの発現能に影響を与え
るコピー数及び安定性の観点から、好ましいベクタープ
ラスミドとしては、ｐｓｃｌｏｌ、ｐＳＧ８１０又はｐ
ＰＭ３１を挙げることができる。

かくすることにより、娘細胞への均等分配ｌ！枯を川る
遺伝子を含有するベクタープラスミドが得られる。

このベクタープラスミドは、前記のＡ　Ｓ　ａｓｅに対
するトリプトファンによるフィードバック阻害が解除さ
れたトリプト７アンオベロンを含むＤＮＡ断片の単離に
際して用いたと同じ制限酵素又はこの制限酵素と同じ粘
着末端又は平滑末端を与える他の制限酵素で切断した後
、該ＤＮＡ断片と一緒にしＴ４−リガーゼを作用させる
ことにより、上記トリプトファンオペロンを含むプラス
ミドが得られる。

ベクタープラスミドの切断に使用する制限酵素は、ベク
タープラスミドの複製や分配などの必須機能を担うＤＮ
Ａ塩基配列部分に認識部位をもたない限り、特に制約は
なく、ｐｓｃ１０１由来のプラスミドをベクターとする
場合に好適に用いうる制限酵素としては旦吐ＲＩ、辻道
ｄｌ［Ｉ、β」リーｆ（Ｉ　、江Ｉ等が挙げられる。

Ａ　Ｓ　ａｓｅに対するトリプトファンによるフィード
バック阻害が解除されたトリプト７アンオベロンを含む
プラスミドの中で、好適なものとしては、娘細胞への均
等分配機構を司る遺伝子をも併有する、前記エシェリヒ
ア−コリＷ３１１０Ｑ」Ｊ！Ｐ−１■正【ｔｎａＡ　　
（ｐＳＣｌ　０１−ｔｒｐ・Ｉ　１５）（ＡＬａｃ３１
７４３　）が保有するプラスミドｐｓｃｔ０１−Ｌｒｐ
・Ｉ　１５が挙げられる。

Ｓ　ＨＴ　ａｓｅの１．合成をｉ”ｌ　’、ｌｉ子−セ
リン＃グリシン＋ホルムアルデヒドの相互変換反応を触
媒するＳ　ＨＴ　ａｓｅの・生合成を司る遺伝子、すな
わち吐ハＪ伝子は、微生物及び動物細胞の染色体ＤＮＡ
中に広く存在しており、本発明においては、どの細胞の
染色体ＤＮＡから採取したものでも使用することができ
るが１．入手の容易性等の観点から、エシェリヒア属細
ＩＷの染色体ＤＮＡから採取されたものが好適である。

ＩＪＪユ遺伝子供与菌としてのエシェリヒア属細菌とし
ては、５ＨＴａｓｅ活性の発現能力をもつものであれば
、野生株及び変異株のいずれでも用いることができる。

エシェリヒア属細菌の１１過工遺伝子は、Ｌ−セリン、
グリシン、葉酸、Ｌ−メチオニン、プリン及び／又はピ
リミジン塩基によるフィードバック調節を受けているこ
とが多いが、かかる物質によるフィードバック調節機構
をもたないか又は解除されているエシェリヒア属細菌を
１１Ｊユ遺伝子供与菌として用いることも勿論可能であ
る。

しかして、エシェリヒア属に属する１１Ｊ２遺伝子供与
菌の具体例には、エシェリヒア・コリに−１２（ＡＴＣ
Ｃ１０７９８）、同Ｗ１４８５（ＡＴＣＣｅ１２４３５
）、同Ｗ３１００（ＡＴＣＣｅ１４９４８）、同Ｗ３０
０１（ＡＴＣＣ１５１５３）、同Ｗ３１１０り四−Ａｌ
シ」エ　リ」」エ　い見Ａ（ｐｓｃｌ　０１−ｔｒｐ、
Ｉ　１５）（ＡＴＣＣ３１７４３）、同ＭＭ２９４（Ａ
’ｒＣＣ３３６２５）などが挙げられる。

畦己」包子供与細胞からの染色体ＤＮＡの抽出はそれ自
体公知の方法で行なうことができ［例えば蛋白質　核酸
　酵素　１１：４４６−４５０．１９８Ｇ］、抽出され
た染色体ＤＮＡは次いで少なくとも１種の制限１素で闇
！２させることにより、吐己Ａ伝子を担うＤＮＡ断片を
含むＤＮＡ断片の混合物が得られる。二のＤＮＡ断片の
混合物は、それ自体既知の方法、例えば、Ｇ　ｅｎｅ％
１±（１９８１）６３−７２に記載の方法でクローニン
グすることができる。

７・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｌ＋ｉａ　　ｃｏｌｉ−）
Ｋ−１２株を用いる場合には、常法に従い、該菌株をリ
ゾチツム及び界面活性剤で溶菌し除蛋白した後、エタノ
ールなどの有機溶媒で処理すれば、゛染色体ＤＮＡが沈
殿として得られる。この染色体ＤＮＡは適当な緩衝溶液
中に再溶解し、平衡密度勾配超遠心等の処理に付し、精
製した後、ＥｃｏＲＩで開裂させることにより、目的と
するＬＬＬ！！Ｊ伝子を担うＤＮＡ断片を含むＤＮＡ断
片の混合物が得られ、このものはベクタープラスミドを
用いてクローニング操作に付すことができる。

このクローニングに使用するベクタープラスミドとして
は前述したトリプトファンオペロンの組込みに用いたと
同様のベクタープラスミドの中から過当に選ぶことがで
き、このベクタープラスミドは、上記の、ｌｙＡ遺伝子
を担うＤＮＡ断片を含むＤＮＡ断片の混合物の調製に際
して用いたと同じ制限酵素又はこの制限酵素と同じ粘着
末端又は平滑末端を与える他の制限酵素で切断した後、
該Ｄ　Ｎ　Ａ　’Ｗｔ　１４−　ｔｎ　ｍ　６　ｍと−
ｘｔ＝　Ｉ−７４−１１ｆｆ−−Ｗｔｒ作用させること
により、組換えプラスミドを作製する。

ベクタープラスミドの切断に使用する制限酵素は、ベク
タープラスミドの複製や分配などの必須機能を担つ、Ｄ
　Ｎ　Ａ塩基配列部分に認識部位をもたない限り、特に
制約はなく、ｐｓｃ１０１由米のプラスミドをベクター
とする場合に好適に用いうる制限酵素としては１竺Ｒ１
，旦１１■、比視ＨＩ、影桂■等が挙げられる。

或いは、前記の如く開裂した染色体ＤＮＡと適当な制限
酵素で開裂したベクタープラスミドをターミナルトラン
スフェラーゼ法［Ｐｒｏｃ、Ｎａｒｌ。

Ａ　ａｉｄ、　Ｓ　ｅｉ、Ｕ　Ｓ　Ａ　、１蛋、２９０
４−２９０９．１９７２参照ｌで連結させることに上り
組換えプラスミドを作製することもできる。

このようにして得られる組換えプラスミドからのｄＬ■
遺伝子を含有するプラスミドの選択は次のようにして行
なうことができる０例えば、ｄＬ戊遺伝子が欠損した宿
主菌を上記の如（して作製した組換えプラスミドで形質
転換した後、５ＨＴａｓｅ活性を発現する形質転換株を
選択することにより、１１Ｊユ遺伝子をクローニングし
た組換えプラスミドを保持した形質転換株が得られる。

ここで使用しうる宿主菌としてはグリシン要求性のもの
であれば特に制限はなく、いずれのエシェリヒア属細菌
でも使用することができる。

゛　明のプラスミドのｔ製 本発明のプラスミドは、前記のＡ　Ｓ　ａｓｅに対する
トリプトファンによるフィードバック阻害が解除された
トリプト７アンオベロンを含むプラスミドに、上記の如
くしてクローニングされたＵヨ遺伝子を担うＤＮＡｔ１
片を組み込むことにより作製することができる。

或いは上記の如くしてクローニングされたｄＬ戊遺伝子
を含む組換えプラスミドに、単離したＡＳ　ａｓｅに対
するトリプトファンによるフィードバック阻害が解除さ
れたトリプト７アンオベロンを担うＤＮＡ断片を組み込
むことによっても作製することができる。

上記ＤＮＡ断片の該プラスミドへの組込みはそれ自体既
知の方法、例えばジャーナル・オプ・ゼネラル◆マイク
ロバイオロノー（Ｊ　、Ｇ　ｅｎ６Ｍ　１ｃｒｏｂｉｏ
１．）１３０：３０９１−３１００．１９８４に記載の
方法で行なうことができる。

本発明により提供されるプラスミドは、Ａ　Ｓ　ａｓｅ
に対するトリプトフアンによるフィードバック阻害′ｆ
ＪＣ解除されたトリプト７アンオベロンと、ＬＬＬ友遺
伝子とを併有するため、このプラスミドで形質転換した
微生物はトリプトファンオペロンによるインドールの生
合成に充分に見合う量のセリンの生合成を可能とし、し
かもトリプトファンオペロンはトリプトファンによるフ
ィードバック阻害が解除されているため、トリ１）ファ
ンを多量に生産する能力を有している。

従って、本発明により提供されるプラスミドで形質転換
された微生物は、トリプトファンの発酵生産において極
めて有用である。

阪ｌ（失 本発明のプラスミドを用いて形質転換することハｆｉｌ
ｌ々ル杼ｈｔかｈｓｋ　ｌイｔ◆　稙【ゆ　し１１イＬ
フアンリプレツサー及びトリプトファナーゼの生合成を
司る遺伝子が欠損しているエシェリヒア属に属する微生
物が好適であり、例えばエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈ
ｅｒｉｃｂｉａ　　ｃｏｌｉ）Ｗ　３１１０　廊ｉ工Ｅ
ｌ　　肚ｌ【　江り配［７プライド・エンピロメンタル
◆マイクロバイオａジー（Ａ　ｐｐｌ、　Ｅ　ｎｖｉｒ
ｏｎ。

Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ）４３　２８９−２９７（１９８２
）］、同ＪＰ２２６９［アプライド・エンピロメンタル
・マイクロバイオロジ−（Ａ　ｐｐｌ、Ｅ　ｎｖｉｒｏ
ｎ。

Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ）３８　１８１−１９０（１９７９
月、同ＡＧＸ６［米国特許第４３７１６１４号明ｍ　４
’ｊ−１等が揚げられる。

本発明のプラスミドによるかかる微生物の形質転換はそ
れ自体既知の方法、例えばアプライド・エンピロメンタ
ル・マイクロバイオロジー（Ａｐｐｌ。

Ｅｎｖｉｒｏｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ）４３　：２８
９　２９７．１９８２に記載の方法で行なうことができ
る。

形　゛　された微　物によるトリプトファンの製造− 上記の如くして形質転換された微生物の培養は、該微生
物の種類に応じて、それ自体既知の方法で行なうことが
できる。一般に、該培養に使用する培地は炭素源、窒素
源、無機塩類、その他必要に応じてアミノ酸、ビタミン
等の有機微量栄養素索を含有する通常の栄養培地が使用
される。炭素源としてはグルコース、ンユークａ−ス、
マルトース、澱粉氷解物、糖蜜等が使用され、その他エ
タノール、酢酸、クエン酸等も単独或は上記他の炭素源
と併用して用いられる。窒素源としては硫酸アンモニウ
ム、クエン酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸
アンモニウム等のアンモニウム塩、硝酸塩、尿素、ペプ
トン等有機或は無機の窒素源が使用される。有機微量栄
養素としてはアミノ酸、ビタミン、脂肪酸、核酸、更に
これらのものを含有するペプトン、カザミノ酸、酵母エ
キス、大豆蛋白分解物等が使用され、生育にアミノ酸等
を要求する栄養要求性変異株を使用する場合には要求さ
れる栄養素を補添することが必要である。無機塩類とし
てはリン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩、
マンガン塩等が使用される。

トリプトファン生合成の中間体であるアントラニル酸は
、必要があれば通常の栄養培地に添加してもよく、その
濃度は０．１ｇ／ｌから３０８７１までの範囲であり、
好適には０　、５　ｇ／　Ｎがら１０ｇ／ｌである。

グリシンは通常の栄養培地に初発から添加してもよいし
、該微生物が通常の栄養培地で増殖した後に間欠的ある
いは連続的に添加しあるいは追加してもよい。初発培地
に添加する場合、その濃度は通常０　、５　ｇ／　ｆか
ら１０ｇ／ｌまでであり、好適には１ｇ／Ｉｌから６ｇ
／ｌまでである。該微生物の増殖後に添加あるいは追加
する場合は、通常１２時間あたり０．１ｇ／ｌがら１１
）ｇ／ｌまでであり、好適には１ｇＺｌから５ｇ／ｉま
でである。

培養は通常の培養条件下で行えば良く、ｍｌ（を５ない
し９、温度を２０ないし４０℃に制御しつつ１〜４日間
振盪培養又は通気攪件培禿することにより培１！液中に
ｉｔのトリプトファンがＭｌｔｒｔされる。培養中にｐ
Ｈが下がる場合には、炭素カルシウムを別殺菌して加え
るが又はアンモニア水、７ンモニ７がス等のアルカリで
中和する。又、有８！酸を炭素源とする場合は１１１Ｈ
の上昇を鉱酸又は有機酸で中和する。

培養液からトリプトファンを採取する方法は、公知のト
リプトファン回収方法に従って行えばよく、例えば、培
を液から菌体を除去した後、濃縮晶析する方法或いはイ
オン交換クロマトグラフィー等によって行なうことがで
きる。

以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。

実施例１ （１）　　　　　ＤＮＡの　１１ Ｅｓｃｂｅｒｉｃｌ＋ｉａ　　ｃｏｌｉ　Ｗ３１１０　
　辻１すＬＬｔｒＩＬｔｎａＡ（ｐＳＣ１０１−ｔｒｐ
・Ｉ　１５　）［ＡＴＣＣ３１７４３］株を５００ｍ１
のし一培地（バクトドリブ１冫１０ ５ｇ／ｌ　　ｐＨ７．１）中で３７℃で４時間培養し、
対数増殖期の菌体を集めた。菌体を生理食塩水（０．９
％）で洗浄した後、２０ｙａＨの卵白リゾチームを含む
１０謡ｌの０．１　５Ｍ　　ＮｍＣｌ−０．１ＭＥＤＴ
Ａ溶液（奮）Ｈ８．０）に懸濁し３７℃の温浴中に５分
間静置した。次いで、５０ｍＡ’の０．１　ＭＮａＣｌ
Ｏ，ＩＭ　　）リス・塩酸−１％ＳＤＳ溶液（ｐＨ８．
０）を加え直ちに攪拌した。得られた溶菌液に２５曽！
のＴＥＩＸ！Ｌ衝液（１０ｍＭ）リス・塩酸−１ｍＭ　
　ＥＤＴＡ：ｐＨ８．０）で飽和したフェノールを加え
て３０分間おだやかに攪拌しタンパク質を変性させた，
３０００ｒｐ＋ｉ、５分間の遠心操作で得られた水Ｍ画
分に２．５倍容量のエタノール（−２０℃）を加え、沈
殿したＤＮＡを１０，０００ｒｐｍｌＯ分間の遠心操作
で分離した。ＤＮＡ沈殿物は６ｍｌのＴＥ緩衝液に溶解
し、６ｇのＣｓＣ１と０．３ｇのエチジウムブロマイド
（　１　０　ｍｇ／　＋＊１　）を加えて３６．０００
ｒｐｍで４０時間の平衡密度勾配超遠心を行ない、染色
体ＤＮＡを含む両分を分離した。次いでｎ−ブタノール
でエチジウムブロマイドを抽出し、ＴＥｉ衝液で透析し
て精％！された染色体ＤＮＡＩ，３＋ａｇを取得した。

（２）　プラスミドＤ町人！す１１ プ７Ｘミ）ｒＤＮＡ（例エバ、ｐｓｃｌｏｌ、Ｉ）ＳＣ
ｌ０ｌ−ｔｒｐ−１１５、ｐＫｓＴ２０１：図１参照）
を次のようにして採取した。プラスミＶを含有するＥｓ
ｃｌ＋ｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ菌株を１０　ｍｇ／
　１のテトフサイクリンを含む１００ｍ１のし一培地で
３７℃にて１６時間培養後集菌した。菌体を２０ｕ＋ｆ
の２５１ＩＭトリス・塩酸−１０鋤Ｍ　　ＥＤＴＡ−５
０ｍＭグルコース−０、２ｍｇ／　ｌリゾチーム溶液（
ｐＨ８。

０）に懸濁し、水浴中で３０分間静置した１次いで４０
＋ｏｌの０．２Ｎ　　ＮａＣ１１％ＳＤＳ溶液を加えて
溶菌し、５分間に３０ＩＩｉの３Ｍ酢酸ナトリウム溶液
（ｐＨ４，８）を追加し水浴上で１時間静置した。次い
で、１０，０００ｒｐ＋ｍ２０分間の遠心分離で得られ
た上清液に２．５倍容量の冷エタノール（−２０℃）を
加え、−２０℃で１時間装置した。得られた沈殿を遠心
分離し、１０ｍＡ’の０，１Ｍ酢酸ナトリウム−０，０
５Ｍ）リス・塩酸溶液（ｐＨ８，０）に溶解後、２５ｍ
１の冷エタノール（−２０℃）を加えて、−２０℃で２
０分間静置し、生じた沈殿を遠心分離した。得られた沈
殿を６−！のＴＥＩｉ衝液に溶解し６ｇｆ）ＣｓＣＩと
０　、３　曽１のエチノウムプロマイド（１０ｍｇ／　
ｔｎｌ　）を加えて３６．０００ｒｐｍで４０時間遠心
分離した。プラスミドＤＮＡｅ含む画分を分離し、１１
−ブタ／−ルでエチノツムブロマイドを抽出し、Ｔ　Ｅ
緩衝液で透析した。

なお、ｐｓｃｌｏｌはＥｓｃｌ＋ｅｒｉｃｈｉａ　　ｃ
ｏｌｉ：ｐｓｃｌｏｌ［ＡＴｃｃ３７０３２］から上記
方法で採取した。　ｐｓｃｌ　０１−ｔｒｐ・Ｉ　１５
はＥｓｃｈｅｒ丘遅１　蚊柱Ｗ３１１０　　匣旦口ｌ艮
捷ａＡｂ＋５ｃ１０１−ｔｒ＋ｚ・１１５）［ＡＴＣＣ
３１７４３１から採取した。ｐＫＳ６はＥｓｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａ　　ｃｏｌｉＧｌ　７（ｐＫＳ６）［ＦＥＲＭ
　　Ｐ−７９９９］から採取した。

（３）１昌Ｊ伝子のクローニング （３−１）　　染色体ＤＮＡとベクターＤＮＡとの連結 前記（１）で得られた染色体ＤＮＡ２μｇを５０μｌの
ＥｃｏＲＩ用反応液（９０ｍＭ）リス・塩酸、５０ｍＭ
　　ＮａＣ１，１０ｍＭ　　ＭｇＣＬ　　ｐＨ７，５）
に加え、制限酵素ＥｃｏＲＩを１０単位与えて３７℃で
５分間、１０分間、３０号間あるいは６０分間反応させ
、部号分解あるいは完全分解させた。

一方、前記（２）で得られたｐｓｃｌｏｌ　　ＤＮＡ１
μｇｅ５０μｌのＥｃｏＲＩ反応液に入れ、１０単位の
ＥｃｏＲＩを与え３７℃６０分間の反応により完全分解
させた。６５℃、１０分間の熱処理でＥｃｏＲＩを失活
させた後に両者のＤＮＡを混合し、１Ｍ酢酸ナトリウム
（ｐＨ６，０）を３５μｌ加え、さらに２．５倍容量の
冷エタノール（−２０℃）を加九で一２０℃で３０分間
静置した。１ｏｏｏ。

ｒｐｍ、５分間の遠心分離で得られたＤＮＡを１００μ
！のＴ４す〃−ゼ反応液（５０ｍＭ）リス−塩酸、１０
　＋＊Ｍ　　ＭｇＣ１２，２０＋ａＭジチオスレイトー
ル、１＋ａＭ　　ＡＴＰ、５０℃ｇ／ｍｌ牛血清フルプ
ミン）（ｐＨ７、８）で溶解し、Ｔ４す〃−ゼ４単位を
加えて１２℃で４０時間反応させた０次いで、３５μｌ
のＩＭ酢酸ナトリ１ンム（ｐＨ６，０）と２゜５倍容量
の冷エタノール（−２０℃）を加えて一２０℃で３０分
間静置し、１１００００ｒｐ、５分間の遠心分離後得ら
れたＤＮＡを１００μ２のＴＥ４１１１１液に溶解した
。

（３−２）　　ｇｌｙＡ遺伝子を担うＤＮＡ断片を組み
込んだ組換えプラスミドによる形質転換。

グリシン要求性変異株であるＥ、ｃｏｌｉ　　Ｇ１７株
を２０ｍｆｆ１のＬ−培地で３７℃４時間培養し対数増
殖期の菌体を集めた。この菌体な２０ＩＩｌｌの１００
　ｍＭ　　ＭｇＣＩ２で水冷下で洗浄後、１０１Ｉｌｌ
の１００１１Ｍ　　ＣＩＬＣ＋２に懸濁し水浴上で２０
分間静置した０次いで遠心分離で菌体を集め、ｌｌ１ｌ
の１００　ｗＭ　　ＣａＣｌ□浴溶液再懸濁した。得ら
れた菌懸濁液２００μｌに上記（３−１）で得られた染
色体ＤＮＡとベクターＤＮＡの連結物１ｏｏμｌを混合
し水浴上で０置した。３０分後に４２℃の湯浴中で２分
間保温し、再び水浴上に戻して２０分間ｅ装して１）Ｎ
Ａを菌体に取り込ませた０次にこの細胞懸濁液に３ｍ１
ｌのし一培地を加え３７℃で９０分間振どう培養した後
、集菌しＶＩＢ培地（Ｋ　ｔ　ＨＰ　Ｏ４１０ｇ／　Ｉ
ｔ、Ｎ　ａＮ　Ｈ４ＨＰ　Ｏ４・４Ｈ２０３，５ｇ／１
％Ｍｇ５Ｏ＜・７Ｈ２００，２ｇ／ｌ、　クエンＦ１１
２ｇ／ｌ）で洗浄、懸濁し、１０ＩＩＩｇ／１のテトラ
サイクリンを含有する最少寒天培地（ＶＩＢ培地にグル
コース５ｇ／ｌ、トリプトファン５０　ｍｇ／　ｌ　、
ロイシン５０ＩＩ１ｇ／ｉ、スレオニン５０ｍｇ／ｌ、
チアミン１０１１μｌ　ｌおよび寒天１５ｇ／ｌを加え
たもの）上に塗布した。３７℃で３日間培養した後に生
じたコロニーを釣菌し、その形質を調べたところ全てテ
トラサイクリンに耐性でグリシン非要求性であった。

この形質転換体の具体的なものとしては昭和５９年１２
　）’１１３日付にて工業技術院微生物工業技術研究所
にそれぞれエシェリヒア・コリＧ１７（ｐＫＳ３）（Ｆ
ＥＲＭＲ−７９９８）及１同Ｇ１７（ｐＫｓ６ＨＦＥＲ
Ｍ　　Ｐ−７９９９）として受託されている。

なお宿主として用いたグリシン要求性変異株である見、
阻朋　Ｇ１７株は旦、竺柱　Ｃ６００−１株（スレオニ
ン、ロイシン、チアミン、トリプトファン要求性。Ｊ、
　Ｇｅｎ、　Ｍｉｅｒｏｂｉｏｌ、１１８：２５３−２
６１．１９８０、参照）から次の方法により得た。Ｅ、
咀匡　Ｃ６００−１株をＬ−プロスで対数増殖期まで培
養後、集菌し、１００μｇ／翰！のＮ−メチルＮ′−二
）＋１７−Ｎ−ニトロソグアニジン（Ｎ　Ｔ　Ｇ　）を
含むＶ＆Ｂ培地に懸濁して３７℃で３０分間放置した。

次にＮＴＧで処理された菌をＬ−ブロスに植菌し、３７
℃で１８時間培養後、Ｖ＆Ｂ培地で適当に希釈し、５０
１１１μｌ　ｌのグリシンを含む最少寒天培地上に塗布
し３７℃で２日間培養した。生育したコロニーをレプリ
カ法でグリシンを含まない最少寒天培地上に移し、３７
℃で２日間培養した。この繰作で、グリシンを含む最少
寒天培地では生育できるが、グリシンを含まない最少寒
天培地では生育できないグリシン要求性の変異株である
一６ユ、ｃｏｌｉＧ１７株を得た。

上記（３−２）で得られた形質転換株がら組換えプラス
ミドを（２）の方法に従って分離精製した。

その結果２種の組換えプラスミドが得られ、それぞれｐ
ＫＳ３及ＶｐＫＳ６と命名した。このようにして得られ
た組換えプラスミドのｐＫＳ３とｐＫＳ６の制限酵素地
図を図３に示す、ｐＫＳ３の分子量は２４．３Ｋｂであ
り、ｐｓｃｌｏｌのし性ＲＩ切断部位に１２．３Ｋｂと
３．ＯＫｂの２つのＥｃｏＲ工による染色体ＤＮＡ断片
が組み込まれており、吐已Ｊ伝子は１２．３　ＫｂのＤ
ＮＡ断片に含まれている。ｐＫＳ６の分子量は２１．３
ＫｂでありｐＳＣｌｏｌの旦性ＲＩ切断部位に１２，３
Ｋｂ　　旦組′ＲＩ染色体切断断片が１ヶ組み込まれて
いる。

ＬＬＬＡ遺伝子の供与体としてｐＫｓｅを用いた。

Ａ　Ｓ　ａｓｅに対するフィードバック阻害が解除され
たｔｒｐ−ｏｐｅｒｏｎの供与体としてｐＳＣ１０１−
ｔｒｐ・１１５を用いた。

ｐＫＳ６ＤＮＡとｐＳＣ１０１−ｔｒｐ・Ｉ　１５　Ｄ
ＮＡは、それぞれ、（２）に記載の方法により採取した
。

ρＫＳ６ＤＮＡ１μｇを５０μｌのジ阻３Ａ１反応液（
６１Ｍトリス・塩酸、５０＋＊Ｍ　　ＮａＣ１，５ＩＩ
Ｍ　　ＭｇＣｌ２、ｐＨ７，５）に加え、０．５単位の
５ａｕ３Ａ１を与え３７℃５分間の反応により部分分解
させた。一方、ｐｓｃｌ　０１（ｒｐ・Ｉ　１５ＤＮＡ
Ｉμｇを５０μ！のｌ視Ｈ１反応Ｎ、（１０ｍＭトリス
・塩酸、７ｍＭ　　ＭｇＣｌ□、１００ｍＭＫＣｌ、７
論Ｍ　２−メルカプトエタノール０μｇ／ｍｌ牛血清ア
ルブミン、ｐＨ７．５）に入れ、１単位のＢａｗｌ−７
１を与え３７℃１５分間の反応により部分分解させた。

それぞれの反応液を６５℃で１０分間過熱処理して、制
限酵素を失活させた後に、両者のＤＮＡを混合し、１Ｍ
酢酸す）　１７ウム（ｐＨ６．０）を３５μ！加え、さ
らに２．５倍容量の冷エタノール（−２０℃）を加えて
、−２０℃で３０分間静置した。１　０，０　０　０ｒ
ｐｎ＋５分間の遠心分離で得られたＤＮＡを１００μｌ
のＴ４す〃ーゼ反応液で溶解し、４単位のＴ　４　１７
　ｆｆ−ゼを加えて１２℃で４０時間反応させた。次い
で３５μ２の１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ６．０）と２．
５倍容量の冷エタノール（−２０℃）を加えて一２０℃
で３０５７間ｏｒ！！し、１　０　０　０　０ｒｐｍ，
　５分間の遠心分離後、得られたＤＮＡを１０μｌのＴ
Ｅ緩衝液に溶解した。このＤＮＡ溶液で、上記（３−２
）の方法に従って、Ｅ、ｅｏｌｉ　　Ｇ１７株を形質転
換し、１０　ａａＢ／　１のテトラサイクリンを含有し
トリプトファンを含有しない最少寒天培地」−で生￥ｒ
するコロニーを選択した。３７℃で３日ｆｉｌｌ培養し
た後ｌ二生じたコロニーを釣萌し、その形質を調べたと
ころ全てテトラサイクリンに耐性で、グリシン非要求性
かつトリプトファン非要求性であった。これらの形質転
換体の一株から、（２）の方法に従ってプラスミドＤＮ
Ａを抽出し、ρＫＳＴ６と命名した。

次に、ｐＫＳ６ＤＮＡ１μｇを５０μｌの旦」Ｊ−■反
応ｆｉ（１０＋ｅＭ）リス・塩ｆｉ１５０ｍＭ　ＮａＣ
ｌ、１０　＋ｎＭ　　ＭｇＣ１２，１０ｍＭ２−メルカ
プトエタノール、１＋８７．５）に加え、１０単位の旦
、１ｚｌ［を与え３７℃：４０分間の反応により完全分
解し、その後６５℃１０分間の過熱処理により旦ｇｌ　
ＩＩを失活させた。このＤＮＡと前記記載と同様の方法
でＢａｍＨ１処理されたｐｓｃｌ　０１−ｔｒｐ・Ｉ　
１５ＤＮＡとを混合し、前記記載と同様の方法でＴ４す
〃−ゼ処理を行ない、ｌ＞、　ｃｏｌｉＧ　１７株を形
質転換した。テトラサイクリンに耐性で、グリシン非要
求性かつトリプトファン非要求性の形質転換体の一株か
ら、上記（２）の方法に従ってプラスミドＤＮＡを抽出
し、これをｐＫｓＴ２０１と命名した。

組換えプラスミドｐＫＳＴ６とｐＫＳＴ２０１の制限酵
素地図を図３に示す０．ＫＳＴ６の分子量は３２．ＯＫ
ｂで、ｐＫｓＴ２０１の分子量は３５゜２Ｋｂであり、
それぞれは、白人遺伝子とＡＳａｓｅに対するフィード
バック阻害が解除されたｔｒｌｒｏｐｅｒｏｎとを併せ
持ツ、　ｐＫ　Ｓ　１’　６では、ＩＩＬＩＡを含む６
．４Ｋｂの影匹３　Ａ　Ｉ　ＤＮＡ断片がｐｓｃｌｏｌ
　−ｔｒｐＩ　１５のｊ３ａｍＨ１（第２図下方）切断
部位に挿入されている。ｐＫｓＴ２０１では、Ｕ工を含
む９．６ＫｂのＢ、１■断片がｐｓｃｌ　０１−Ｉ　１
５のｐａｍＨ１切断部位に挿入されている。

（５）ｐＫＳＴ６またはｐＫｓＴ２０１を保有するエシ
ェリヒアｉｓｍ菌の８１１　Ｔａ５ｅ％　Ａ　Ｓ　ａｓ
ｅおよびトリプトファン合成酵素（Ｔ　Ｓ　ａｓｅ）活
性、ｐＫＳＴ６またはｐＫｓ’ｌ’２０１ＤＮＡで、見
、阻匡Ｗ　３１１０　リ」Ｊ工旦ｊエロ」」２ＬｎａＡ
　（以下、Ｔｎａと略す）を（３−２）に記載の方法に
準じて形質転換した。Ｔｎａ株は、トリプトファン要求
性、トリプト７アンレブレツサー欠損、およびトリプト
ファナーゼ欠損変異株であり、このものは特開昭５７−
８０３９８号公報に記載の方法に従い作製できる。

得られた形質転換体について５ＨＴａｓｅ、ＡＳａｓｅ
及びＴ　Ｓ　ａｓｅ活性を測定した。Ａ　Ｓ　ｕｓｅに
ついては、その活性を５０％阻害するのに必要なトリプ
トファン濃度についても示した（表１　）、　Ｔｎａ（
ｐＫＳ’ｒ６）またはＴｎａ（ｐＫｓＴ２０１）株を５
０−１の最少培地（最少寒天培地から寒天を除いたもの
）に植菌し３７℃で２４時間培養して菌体を集めた。

菌体を食塩水（０，９％）で洗浄したのち４ｍｌの１０
（ｌａＭカリウム−リン酸緩衝液（ｐＨ７，０）に懸濁
した。この１３濁液を１５秒２回の超音波で処理するこ
とにより菌体を破壊し、次いで１３０　（ｌ　Ｑｒｐｍ
２０分間の遠心分離を行いその上清液を得てこれを粗酵
素液とした。

ＳＨＴａ５ｅ活性の測定はｌｌ１１の反応液（１００ｍ
Ｍｈ　’）’７ムーＶ　ン酸緩衝［ｐＨ７，０，５０ｍ
Ｍグリシン、０．１量Ｍピリドキサールリン酸、２゜５
１１ＩＭホルムアルデヒド、１ｍＨテトラヒドロ葉酸、
粗酵素液）中で、３７℃１０分間反応させ、ホルムアル
デヒドの減少を定量することにより行なった。また粗酵
素液のタンパク質量はＬ　ｏｗｒｙ法により測定した。

１ユニツトは３７℃で１分間１　ｎｍｏｌｅのホルムア
ルデヒドを消費する酵素量とした（表１）。

ＡＳａｓｅ活性の測定は１ｍ／の反応液（５０ｍＭ）リ
ス・塩酸ＤＨ８，２，５ｓ＋Ｍ　　ＭｇＣ１２，０、５
ｍＭＬ−グルタミン、ｏ、５ｕｒＭコリスミン酸および
粗酵素液）中で、３７℃２０分間反応させ、アント２ニ
ル酸の生成量を定量することによＩ）行なった。１ユニ
ツトは３７℃で２０分間に０．１μ１１１ｏ１ｅのアン
トラニル酸を生成する酵素量とした。

Ｔ　Ｓ　ａｓｅ活性の測定は１ｗｆの反応［（１００ｅ
ｍＭトリス・塩酸ｐＨ７，８，０、４ａ＋Ｍインドール
、８０ｍＭ　　ＤＬ−セリン、０，０３輸Ｍピリドキサ
ールリン酸、３０μ！飽和食塩水お上び粗酵′Ｊｋ液）
中で３７℃２０分間反応させ、インドールの減少量を定
量することにより行なった。１ユニツトは３７℃で２０
分間に０．１μｍｏｌｅのインドールを消費する酵素量
とした。

ｊｉＬｉには対照として、Ｔ　ｎａ（ｐＳ　Ｃ１０１−
ｔｒｐ　・１１５）［ＡＴＣＣ３１７４３］、およびＴ
ｎａ（ｐＳＣ１０１−ｔｒｐ）株の酵素活性についても
示した。

ｐＳ　Ｃ１０１−ｔｒｐは、野生型のｔｒｐ−ｏｐｅｒ
ｏｎを持つ組換えプラスミドで、これを保持するＴｎａ
株については、アプライド・エンピロメンタル・マイク
ロバイオロノ−（Ａ　ｐｐｌ、　Ｅ　ｎｖｉｒｏｎ、　
Ｍ　１ｃｒｏｂｉｏｌ、　）■　２８９−２９７（１９
８２）に記載の方法に従って作製した。

人」−」！米１目１ ａ、ＡＳｍｓｅ活性を５０％阻害するのに必要なトリプ
トファン濃度 表１の結果は、ｐＫＳＴ６およびｐＫｓＴ２０１が、吐
μ（伝子（ＳＨＴａｓｅ）とフィードバック阻害が解除
されたｔｒｐ−ｏｐｅｒｏｎ（Ａ　Ｓ　ａｓｅ、　Ｔ　
Ｓ　ａｓｅ）とを併せ持つ組換えプラスミドであること
を示している。

１２！と支所− Ｔｎａ（ｐＫＳＴ６）、Ｔｎａ（ｐＫｓＴ２０１）およ
びＴｎａ（ｐＳ　Ｃ１０１−ｔｒｐ−Ｉ　１５　）株を
それぞれ３０ｇｇ／ｍｉのテトラサイクリンを含むし一
培地（２０ｍｊ！　／　１０　Ｃ）ｍｌ三角７フスコ）
に植菌し、３７℃で２０時間培養して前培１！液をｆ１
４’ｌｌシた。この前培１！液２論ｌを２０ＩＩｌｉの
７ラスコ生産培地（ＫＨ２ＰＯ４２ｇ１ク工ン酸ニアン
モニ９ム１０ｇ１　カザミノＷＩＬｏｇ、＃母エキス６
ｇ、ＭｇＳＯ４・　７Ｈ２０１ｇ、　　ＦｅＳＯ４令　
７Ｈｚ０　　　１　０ｍｇ。

７トンラニルｆｌ！４．５ｇ、グルコース６０１ＳＣａ
ＣＯｓ　　４０ｇ、テトラサ゛イクリン３０鎗ｇ１　グ
リシンＯまたは２＊たは４ｇ／ｌ、ｐＨ７，０）を含む
５００ｍｊ７容三角フラスコに植菌し３３℃で培養した
。培養途中で必要に応じて、１２時間毎に２ｇ／ｌのグ
リシンを追加し、６４時間培養を続けた。

図４は、Ｔｎａ（ｐＫｓＴ２０１　）とＴ　ｎａ（ｐｓ
　Ｃ１０１４ｒｐ−Ｉ　１５）株について、培地の全グ
リシン欲に対するトリプトファン生成量を示したもので
ある。Ｔｎａ（ｐＳ　ＣＩ　Ｏ１（ｒｐ・Ｉ　１５　）
株では、撓曲は扱廟十７．ゲＩＩ　　Ｆ、−ノ憾酢講ｚ
　９　、　／　６　　つ１柄１ぞトリプトファン生成に
対するグリシン添加効果が認められるが、２ｇ／１以上
のグリシン濃度では添加効果は認められず、トリプトフ
ァン生成量は最高７．Ｏｇ／ｌであった。一方、Ｔｎａ
（ｐＫ　Ｓ　Ｔ　２０１）株では、グリシンの添加効果
が顕著であり、１０　ｇ／　ｌ　ノ！　！／　ンン添加
により、９．２ｇ／ｅｆ）トリプトファンが生成した。

また、Ｔ　ｎａ（ｐＫ　Ｓ　Ｔ６）株では、８　、３　
ｇ／　１のトリプトファン生成量であった。以上の結果
から、白人遺伝子とＡＳａｓｅに対するフィードバック
阻害が解除されたトリプト７アンオベａンとを併せ持つ
組換えプラスミドがトリプトファン生産に有効であるこ
とは明らかである。

【図面の簡単な説明】

ｆｊＳ１図は、娘細胞への均等分配機構を司る遺伝子を
含有するベクタープラスミドの作製工程を表わすフロー
シートである。 第２図は、ｍ及びＡ　Ｓ　ａｓｅに対するフィードバッ
ク阻害が解除されたＬｒｐ−ｏｐｅｒｏｎとを併せ持つ
組換えプラスミドの作製］−程を表わす７０−シートで
ある。 第３図は、実施例１で得られた組換えプラスミドＤＫＳ
３、ｐＫｓ６、ｐＫｓ’ｒｅおよＣ／ｐＫｓＴ２０１の
制限酵素地図を表わし、図中、太線はｐＳＣｌｏｌのＤ
ＮＡ断片、細線は染色体ＤＮＡ断片、−コ　はｔｒｐ−
ｏｐｅｒｏｎ、　　口　は吐己Ｊ伝子、Ｔｃ　　はテト
ラサイクリン耐性遺伝子を示し、ＥｌＢ、Ｂｇ、Ｓ、は
それぞれ制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＢａａＨｌ、且１ＬＩＩ
、旦ａｌ　ｌの切断部位を示す。 第４図は、実施例１で得られた形質転換微生物、Ｔｎａ
（ｐＫＳ　Ｔ　２０１　）及びＴｎＡ（ｐＳ　Ｃ１０１
−ｔｒｐ・１１５）株について、培地の全グリシン量に
対するトリプトフアン生成量を示したグラフである。 そ剋ぞ太ｆ）ＩＩＩＪＰ匠爵１トの騒石［次１て工す茅
２図 第４図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、アントラニル酸シンターゼに対するトリプトフアン
   によるフィードバック阻害が解除されたトリプトフアン
   オペロンと、セリンヒドロキシメチルトランスフエラー
   ゼの生合成を司る遺伝子を含有することを特徴とするプ
   ラスミド。 ２、娘細胞への均等分配機構を司る遺伝子をさらに含有
   する特許請求の範囲第１項記載のプラスミド。 ３、アントラニル酸シンターゼに対するトリプトフアン
   によるフィードバック阻害が解除されたトリプトフアン
   オペロンと、セリンヒドロキシメチルトランスフエラー
   ゼの生合成を司る遺伝子を含有するプラスミドで形質転
   換された、トリプトフアンリプレッサー及びトリプトフ
   アナーゼの生合成を司る遺伝子が欠損しているエシエリ
   ヒア属に属する微生物。 ４、エシエリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃ
   ｏｌｉ）Ｗ３１１０ｔｒｐＡＥ１　ｔｒｐＲ　ｔｎａＡ
   （ｐＫＳＴ６）又はエシエリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒ
   ｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）Ｗ３１１０ｔｒｐＡＥ１　ｔｒ
   ｐＲ　ｔｎａＡ（ｐＫＳＴ２０１）である特許請求の範
   囲第３項記載の微生物。 ５、アントラニル酸シンターゼに対するトリプトフアン
   によるフィードバック阻害が解除されたトリプトフアン
   オペロンと、セリンヒドロキシ′チルトランスフエラー
   ゼの生合成を司る遺伝子を含有するプラスミドで形質転
   換された、トリプトフアンリプレッサー及びトリプトフ
   アナーゼの生合成を司る遺伝子が欠損しているエシエリ
   ヒア属に属する微生物を栄養培地で培養し、培養物から
   トリプトフアンを採取することを特徴とするトリプトフ
   アンの製造方法。 ６、栄養培地にグリシンを添加する特許請求の範囲第５
   項記載の方法。