JPS6379597A - Ｌ−アルギニンの製造法 - Google Patents

Ｌ−アルギニンの製造法

Info

Publication number
JPS6379597A
JPS6379597A JP61224189A JP22418986A JPS6379597A JP S6379597 A JPS6379597 A JP S6379597A JP 61224189 A JP61224189 A JP 61224189A JP 22418986 A JP22418986 A JP 22418986A JP S6379597 A JPS6379597 A JP S6379597A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
arginine
auxotrophy
enzyme
brevibacterium
dna
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP61224189A
Other languages
English (en)
Other versions
JPH0728749B2 (ja
Inventor
Ryoichi Katsumata
勝亦　瞭一
Haruhiko Yokoi
横井　治彦
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
KH Neochem Co Ltd
Original Assignee
Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd filed Critical Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Priority to JP61224189A priority Critical patent/JPH0728749B2/ja
Priority to DE87113780T priority patent/DE3785530T2/de
Priority to KR1019870010471A priority patent/KR900004425B1/ko
Priority to EP87113780A priority patent/EP0261627B1/en
Priority to US07/099,798 priority patent/US5017482A/en
Publication of JPS6379597A publication Critical patent/JPS6379597A/ja
Publication of JPH0728749B2 publication Critical patent/JPH0728749B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/10—Citrulline; Arginine; Ornithine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/67—General methods for enhancing the expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/77—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Corynebacterium; for Brevibacterium
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/84—Brevibacterium
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/843—Corynebacterium

Landscapes

  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明はコリネバクテリウム属またはブレビバクテリウ
ム属に属する微生物のＬ−アルギニン生合成に係わる酵
素、特にＮ−アセチルグルタミン酸キナーゼ（以下ＡＧ
Ｋと略す）、Ｎ−アセチル−γ−グルタミルリン酸レダ
クターゼ（以下ＡＧＰＲと略す）、Ｎ−アセチルオルニ
チン−δ−アミノトランスフェラーゼ（以下式〇ＡＴと
略す）、オルニチンカルバミルトランスフェラーゼ（以
下ＯＣＴと略す）、大腸菌のＮ−アセチルグルタミン酸
シンテターゼ（以下ＡＧＳと略す）欠損変異株のアルギ
ニン要求性を非要求性に回復させる活性を有する酵素、
および大腸菌のＮ−アセチルオルニチンデアセチラーゼ
（以下ＡＯＤと略す）欠損変異株のアルギニン要求性を
非要求性に回復させる活性を有する酵素から選ばれる少
なくとも１つ以上の酵素の合成に関与する遺伝子を含む
組換え体プラスミドをコリネバクテリウム属またはブレ
ビバクテリウム属に属する微生物に保有させ、該微生物
を培地に培養し、培養物中に生成蓄積したＬ−アルギニ
ンを採取することを特徴とするＬ−アルギニンの製造法
に関する。従って本発明はバイオインダス）ＩＪ−の産
業分野に関し、特に医薬品、食品において宥用なＬ−ア
ルギニンの製造分野に関する。
従来の技術 ］リネバクテリウム属やブレビバクテリウム属などのコ
リネ型グルタミン酸生産菌を用いる発酵法によるＬ−ア
ルギニンの製造法については、該菌種の野生株から誘導
された突然変異株を用いる方法が知られている。Ｌ−ア
ルギニン生産性変異株としては、例えばアグリカルチユ
ラル゛・アンド・バイオロジカル・ケミストリイ（Ａｇ
ｒｉｃ、　Ｂｉｏｌ。
Ｃｈｅｍ、）、　３６．１６７５〜１６８４（１９７２
）、特公昭５４−３７２３５、特開昭５７−１５０３８
１などに記載されているように、アミノ酸のアナログや
核酸のアナログに対する耐性変異あるいはそれらに核酸
塩基の要求性を付与した菌株が知られている。
また、組換えＤＮＡ技術により育種された菌株を用いる
Ｌ−アルギニンの製造法も知られている。
例えば大腸菌のアルギニン生合成に係わる酵素の遺伝子
を担うＤＮＡ断片を含む組換え体プラスミドＤＮＡをコ
リネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属菌種に
保有させ、該菌株を用いてＬ−アルギニンを発酵生産す
る方法が知られている（特開昭６Ｏ−６６９８９）。
発明が解決しようとする問題点 近年、Ｌ−アルギニンに対する需要が増大するにつれ、
Ｌ−アルギニンの製造法の改善がますます望まれている
。
問題点を解決するだめの手段 本発明者は、組換えＤＮＡ技術によりコリネバクテリウ
ム属またはブレビバクテリウム属菌種のＬ−アルギニン
の生産能力を向上させるために鋭意研究を重ねた。その
結果、先に大腸菌のＬ−アルギニン生合成に係わる酵素
をコードする遺伝子を含む組換え体プラスミド（ｐＥａ
ｒｇｌ）をコリネバクテリウム属またはブレビバクテリ
ウム属菌種に導人、保有させることにより、Ｌ−アルギ
ニンの生産性が向上することを見出し、特開昭６０−６
６９８９に開示したが、さらにコリネバクテリウム属ま
たはブレビバクテリウム属菌種のＬ−アルギニン生合成
に係わる酵素、特にＡＧＫ　、＾ＧＰＲ，＾０＾Ｔ、　
ＯＣＴ　。
大腸菌のＡＧＳ欠損変異株のアルギニン要求性を非要求
性に回復させる活性を有する酵素、および大腸菌のＡＯ
Ｄ欠損変異株のアルギニン要求性を非要求性に回復させ
る活性を有する酵素から選ばれる少なくとも１つ以上の
酵素の合成に関与する遺伝子を含む組換え体プラスミド
をコリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属菌
種に導入、保有させることにより、ｐＢａｒｇ］導入株
よりもＬ−アルギニン生産性の向上した菌株が得られる
ことを見出し、本発明を完成するに至った。
以下、本発明の詳細な説明する。
本発明は、コリネバクテリウム属またはブレビバクテリ
ウム属に属する微生物のＬ−アルギニン生合成酵素の合
成に関与する遺伝情報を含むＤＮＡ断片とベクターＤＮ
Ａとの組換え体ＤＮＡを保有するコリネバクテリウム属
またはブレビバクテリウム属に属する微生物を培地に培
養し、培養物中にＬ−アルギニンを生成蓄積させ、該培
養物からＬ−アルギニンを採取することを特徴とするＬ
−アルギニンの製造法を提供する。
Ｌ−アルギニンの生合成酵素の合成に関与する遺伝情報
とは、Ｎ−アセチルグルタミン酸キナーゼ、Ｎ−アセチ
ル−Ｔ−グルタミルリン酸レダクターゼ、Ｎ−アセチル
オルニチン−δ−アミノトランスフェラーゼまたはオル
ニチンカルバミルトランスフェラーゼの合成に関与する
もの、あるいは大腸菌のＮ−アセチルグルタミン酸シン
テターゼ欠損変異株またはＮ−アセチルオルニチンデア
セチラーゼ欠損変異株のアルギニン要求性を非要求性に
回復させるものなどがあげられる。
宿主微生物として用いるコリネバクテリウム属またはブ
レビバクテリウム属に属する微生物としては、いわゆる
コリネ型グルタミン酸生産菌として知られる微生物は全
て用いることができるが、好適には下記の菌株が用いら
れる。
コリネバクテリウム・グルタミクム　ＡＴＣＣ１３０３
２コリネバクテリウム・グルタミクム　ＡＴＣＣ３１８
３３コリネバクテリウム・アセトアシドフィラムＡＴＣ
Ｃ１３８７０ コリネバクテリウム・ハーキユリス　ＡＴＣＣ１３８６
８コリネバクテリウム・リリウム　　　ＡＴＣＣ１５９
９０ブレビバクテリウム・ディバリカラム　ＡＴＣＣ１
４０２０ブレビバクテリウム・フラブム　　　ＡＴＣＣ
１４０６７ブレビバクテリウム・イマリオフィラムＡＴ
ＣＣ１４０６８ブレビバクテリウム・ラクトファーメン
タムＡＴＣＣ１３８６９ ブレビバクテリウム・チオゲンタリス　＾ＴＣＣ１９２
４０宿主としては、Ｌ−アルギニン生産能を有しない野
生株を用いることもできるが、Ｌ−アルギニン生産能を
有する菌株を用いることもできる。アルギニン生産能を
有する菌株としては、アミノ酸アナログ耐性変異株など
公知の菌株が使用できる。
本発明において、Ｌ−アルギニン生合成に係わる酵素の
遺伝子の供給源となる微生物としては、コリネ型グルタ
ミン酸生産菌でこれら酵素活性を有するものであればい
かなる微生物でもよ（、例えばコリネバクテリウム属ま
たはブレビバクテリウム属に属する微生物の野生株ある
いはそれから誘導したＬ−アルギニン生産性変異株を用
いることができる。これらの菌株の染色体ＤＮＡは、本
発明者が特開昭５８−１２６７８９に示したように、培
養中にペニシリン処理した菌体をリゾチームおよび界面
活性剤で処理して溶菌した後、常法で除蛋白し、次いで
エタノールで沈澱させることにより単離できる。
染色体ＤＮＡから得られるアルギニン生合成に係わる酵
素の遺伝子を含むＤＮＡ断片を組み込むためのベクター
としては、コリネバクテリウム属およびブレビバクテリ
ウム属菌種中で複製できるものであれば特に限定されな
いが、例えば本発明者が開発したｐｃＧｌ　（特開昭５
７−１３４５００）　、ｐＣＧ２（特開昭５８−３５１
９７）、ｐＣＧ４、Ｊ）ＣＧＩＩ　　（いずれも特開昭
５７−１８３７９９）　、ｐｃＢ５１　、ｐＣＥ５２　
、ｐＣＥ５３　　〔イずれもモレキュラー・アンド・ジ
ェネラル・ジエネテイクス（Ｍｏ１．Ｇｅｎ、　Ｇｅｎ
ｅｔ、　）、　１９６　、１７５（１９８４）　）ｐＣ
Ｅ５４　、ｐｃＢｌｏｌ　（いずれも特開昭５８−１０
５９９９）などのプラスミドを使用することができる。
プラスミドベクターは、本発明者が特開昭５７−１３４
５００あるいは特開昭５７−１８６４８９に開示したよ
うに、菌体をリゾチームおよび界面活性剤で溶菌後クリ
アートライゼートを調製し、ポリエチレングリコールで
ＤＮＡを沈澱させ、しかる後に塩化セシウム−エチジウ
ムブロマイド密度勾配遠心にかけ、ＣＣＣ−ＤＮＡとし
て単離、精製することができる。
アルギニン生合成に係わる酵素の遺伝子を含むＤＮＡ断
片とベクタープラスミドとの組換え体は、染色体ＤＮＡ
とベクタープラスミドＤＮＡを制限酵素で切断した後、
ＤＮＡ！Ｉガーゼで処理するか、あるいはその切断末端
をターミナルトランスフェラーゼやＤ　Ｎ　Ａポリメラ
ーゼなどで処理した後、Ｄ　Ｎ　Ａ　ＩＪガーゼを作用
させて結合するなどの常法〔メソッヅ・イン・エンザイ
モロジイ（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ
）　、６８（１９７９））により、種々の組換え体混成
物として生成させることができる。
この組換え体混成物を用いて、アルギニン生合成に係わ
る酵素が欠損したコリネバクテリウム属またはブレビバ
クテリウム属の変異株を形質転換し欠損形質が参目補さ
れた形質転換株を選択する組換えＤＮＡ技法によって、
アルギニン生合成に係わる酵素の遺伝子を含むＤＮＡ断
片とベクターＤＮＡとの組換え体プラスミドを取得する
ことができる。コリネバクテリウム属およびブレビバク
テリウム属の形質転換法としては、本発明者が開発した
プロトプラストを用いる方法（特開昭５７−１８６４９
２および特開昭５７−１８６４８９、具体的には実施例
に示す）により実施することができる。
コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属菌株
で直接組換え体Ｄ　Ｎ　Ａを選択するかわりに、例えば
大腸菌のようにすでに遺伝子組換え技法が確立している
宿主−ベクター系を用いることもできる。すなわち、該
遺伝子の供与体ＤＮＡと大腸菌のベクターＤＮＡの試験
管内結合反応物を用い、アルギニン生合成に係わる酵素
の遺伝子の欠損した大腸菌の変異株を形質転換し、欠損
形質が相補された形質転換株を選択し、この形質転換株
から該遺伝子を含むクローン化ＤＮＡ断片を得ることが
できる。該ＤＮＡ断片をコリネバクテリウム属またはブ
レビバクテリウム属細菌のベクターＤＮＡと試験管内で
組み換えて、コリネバクテリウム属またはブレビバクテ
リウム属細菌を形質転換すれば、該細菌にクローン化し
た該遺伝子を含む組換え体ＤＮＡを保育させることがで
きる。
以上のようにしてコリネバクテリウム属またはブレビバ
クテリウム属菌種の野生株の染色体ＤＮＡを供与源とし
て野生型のアルギニン生合成酵素の遺伝子を含む組換え
体が得られ、これをコリネバクテリウム属あるいはブレ
ビバクテリウム属細菌に保有させ、アルギニン生産性を
向上させることができる。
コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属菌種
などのコリネ型グルタミン酸生産菌および大腸菌におい
ては、Ｌ−アルギニン生合成径路の各生合成酵素の合成
がアルギニンによって抑制されること（Ｙｏｓｈｉｄａ
、　Ｈ，見見、、　アグリカルチュラル・アンド・バイ
オロジカル・ケミストリイ（Ａｇｒｉｃ、　Ｂ１０１．
　Ｃｈｅｍ、）、　４３．１０５（１９７９）　）　、
また、コリネ型グルタミン酸生産菌では、Ｌ−アルギニ
ン生合成経路の第２酵素であるＮ−アセチルグルタミン
酸キナーゼ（ＡＧＫ＞にアルギニンによるフィードバッ
ク阻害がかかることｌ：Ｕｄａｋａ、　Ｓ、、ジャーナ
ル−オブ・バタテリオロジイ（Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏ
！、　）。
９１、６１７（１９６６）　）が知られている。このこ
とより、コリネバクテリウム属およびブレビバクテリウ
ム属菌種の野生株からクローン化された野生型のアルギ
ニン生合成酵素の遺伝子も生成するアルギニンによる調
節を受けるものと考えられる。従ってＬ−アルギニンの
生産には、これらの調節が解除された変異型遺伝子を有
する組換え体プラスミドを用いるほうが、増産効果が高
まり好ましい。このような変異型遺伝子を含む組換え体
プラスミドは、アグリカルチュラル・アンド・バイオロ
ジカル・ケミストリイ（Ａｇｒｉｃ、　Ｂｉｏｌ、Ｃｈ
ｅｍ、）、４３．　１８９９（１９７９）に記載されて
いるように、Ｌ−アルギニンのアナログ、例えばＤ−ア
ルギニンに対する耐性を指標にして選択された、Ｌ−ア
ルギニンによる阻害に非感受性となったＡＧＫを有する
変異株の染色体ＤＮＡを供与源として、野生型の遺伝子
を得たのと同様の方法で取得できる。あるいは、野生型
遺伝子を含む組換え体プラスミドを例えばモレキユラー
・アンド・ジェネラル・ジエネティクス（Ｍｏｌ、　Ｇ
ｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、）、　１４５　、１０１（１９７
８）に記載されている方法でｉｎ　ｖｉｔｒｏで変異を
付与するか、またはそれを保有する微生物をｉｎ　ｖｉ
ｖｏで変異処理するかして変異型遺伝子を含む組換え体
プラスミドを取得することもできる。
野生型あるいは変異型のアルギニン生合成遺伝子を含む
組換え体プラスミドは前記のようにプロトプラストを用
いる形質転換法によりコリネバクテリウム属またはブレ
ビバクテリウム属菌種に導入できる。これらの組換え体
プラスミド保有株によるＬ−アルギニンの生産は、従来
の発酵法によるＬ−アルギニン製造に用いられる培養方
法により行うことができる。
すなわち、該形質転換株を炭素源、窒素源、無機物、ア
ミノ酸、ビタミンなどを含有する通常の培地中、好気的
条件下、温度、ｐＨなどを調節しつつ培養を行えば、培
養物中にＬ−アルギニンが生成蓄積するので、これを採
取する。
炭素源としてはグルコース、グリセロール、フラクトー
ス、シニークロース、マルトース、マンノース、澱粉、
澱粉加水分解物、糖蜜などの種々の炭水化物、ポリアル
コール、ピルビン酸、フマール酸、乳酸、酢酸などの各
種有機酸が使用できる。さらに菌の資化性によって、炭
化水素、アルコール類なども用いろる。とくに廃糖蜜は
好適に用いられる。
窒素源としてはアシモニアあるいは塩化アンモニウム、
硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウ
ムなどの各種無機および有機アンモニウム塩類あるいは
尿素および他の窒素含有物質ならびにペプトン、ＮＺ−
アミン、肉エキス、酵母エキス、コーン・スチープ・リ
カー、カゼイン加水分解物、フィツシュミールあるいは
その消化物、脱脂大豆粕あるいはその消化物、嬬加水分
解物などの窒素含有有機物など種々のものが使用可能で
ある。
さらに無機物としては、リン酸第−水素カリウム、リン
酸第二水素カリウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニ
ウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄
、硫酸マンガンふよび炭酸カルシウムなどを使用する。
微生物の生育に必要とするビタミン、°アミノ酸源など
は、前記したような他の培地成分に従って培地に供給さ
れれば特に加えなくてもよい。
培養は振盪培養あるいは通気攪拌培養などの好気的条件
下に行う。培養温度は一般に２０〜４０℃が好適である
。培養中の培地のｐＨは中性付近に維持することが望ま
しい。培養期間は通常１〜５日間で培地中にＬ−アルギ
ニンが蓄ｉする。
培養終了後、菌体を除去して活性炭処理、イオン交換樹
脂処理などの公知の方法で培養液からＬ−アルギニンを
回収する。
このようにしてコリネ型グルタミン酸生産菌のアルギニ
ン生合成に係わる酵素の遺伝子を含む組換え体プラ頃ミ
ドを保有させたコリネバクテリウム属またはブレビバク
テリウム属の菌株を用いることにより、非保有株または
ｐＥａｒｇｌ導入株に比導入−収率でＬ−アルギニンを
生産することができる。
かかる微生物として具体的には、コリネバクテリウム・
グルタミクムＫ　６４　（ＦＥＲＭ　ＢＰ−１１１４）
、コリネバクテリウム・グルタミクムＫ　６５　（ＦＥ
Ｒｌ　ＢＰ−１１１５）などがあげられる。これらの菌
株は、工業技術院微生物工業技術研究所（微工研）に昭
和６１年７月２４日付で寄託されている。
以下に本発明の実施例を示す。
実施例 （１）　　コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム
ＡＴＣＣ１３８７０の染色体ＤＮＡ１１７）調製ＮＢ培
地（粉末ブイヨン２０ｇ１酵母エキス５ｇを純水１１に
含み、ｐ　Ｈ７，２に調整した培地）で培養したコリネ
バクテリウム・アセトアシドフィラムＡＴＣＣ１３８７
０の種培養１０ｍ１を４００＋ｎｌの半合成培地ＳＳＭ
　（グルコース２０ｇ、　（Ｎｌ（４）２８０４　１０
　ｇ、尿素　３ｇ、酵母エキス　　ＩｇＳ　ＫＨｚＰＯ
４ＩｇＳ　ＭｇＣＬ　・６Ｈ２００，４ｇＳ　ＦｅＳ口
＜　　・７Ｌ０　　１０ｍｇ５　Ｍｎ５Ｏｎ　　１４〜
６Ｌ００、２　ｍｇＳＺｎＳＯａ　・ｌＮ２Ｏ０，９ｍ
ｇ、Ｃｕ５Ｏ−・５ｆｔ２００、４　ｍｇ、　Ｎａ２Ｂ
、Ｏｔ　’　１０８２００．０９　ｍｇ、　（ＮＨ４）
１Ｍｏ７０ｚａ・４）１２００．０４ｍｇ、ビオチン３
０■、サイアミン塩酸塩１ｍｇを水１βに含み、ｐ　Ｈ
７，２に調整した培地〕に接種して３０℃で振盪培養し
た。東京光電比色計で６６０ｎｍにおける吸光度（Ｏｎ
＞　　（以下、特記しない限り吸光度は６６０ｎｍで測
定）を測定し、ＯＤ　０．２になった時点で０．５単位
／ｍｌの濃度になるようにペニシリンＧを添加した。さ
らに培養を続け、ＯＤ　０．６になるまで生育させた。
培養液から菌体を集菌し、ＴＢＳ緩衝液Ｃｏ、　０３Ｍ
　トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（以下トリ
スと略す）、０．００５Ｍエチレンジアミン四酢酸二ナ
トリウム（以下ＥＤＴＡと略す）、０．０５Ｍ　　Ｎａ
Ｃｊ！５ｐＨ８，０）　で洗浄後、リゾチーム溶液〈２
５％ショ糖、０．ＩＭＮａＣＲｌｏ、０５Ｍ）リス、０
．８ｍｇ／ｍｌリゾチーム、ｐＨ８，０）Ｉ　Ｑｍｌに
懸濁し、３７℃で４時間反応させた。集菌した菌体から
高値らの方法〔バイオキミカ・工・バイオフィジカ・ア
クタ（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、＾ｃｔａ）
、　７２．６１９（１９６３）　）に従って高分子染色
体ＤＮＡを単離した。
（２）制限欠損変異とアルギニン生合成遺伝子欠損変異
を併せ持つ大腸菌変異株の取得 大腸菌の宿主−ベクター系を用いて外来性遺伝子である
コリネ型グルタミン酸生産菌のアルギニン生合成に係わ
る酵素の遺伝子をより容易にクローン化するために、宿
主菌として宿主特異的制限欠損変異（ｈｓｄＲ）　とア
ルギニン生合成遺伝子欠損変異（ａｒｇ−）　　とを併
せ持つ大腸菌変異株を以下のように取得した。
宿主特異的制限欠損変異（ｈｓ＋ＪＲ）を有する大腸菌
に１２株亜株ＷＡ８０２　　＜メチオニン要求性二ＦＥ
ＲＭ　ＢＰ−７１８）にＮ−メチル−Ｎ′−二トローＮ
−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）４００ｒ／ｍ＋を用い
て通常の変異処理〔エックスペリメント・イン・モレキ
ュラー・ジェネティクス（εｘｐｅｒｉｍｅｎｔｉｎ　
Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）　Ｐ、１２５
コールド　スプリング　ハーバ−ラボラトリ−（１９７
２）　）を施した後、ペニシリンを用いる栄養要求株の
濃縮法〔エックスベリメント・イン・モレキユラー・ジ
ェネティクス（εｘｐｅｒｉｍｅｎｔ　ｉｎ　！ｏｌｅ
ｃｕｌａｒＧｅｎｅｔｉｃｓ）　Ｐ、２３０コールド　
スプリング　ハーバ−ラボラド’）　−（１９７２）　
）に従ってアルギニン要求株を濃縮後、選択した。得ら
れたアルギニン要求株の変異遺伝子の同定は各アルギニ
ン生合成酵素の活性を測定することで行った。各酵素活
性の測定法は、ＡＧＳについてはヨーロピアン・ジャー
ナル・オブ・バイオケミストリー（Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ、）、　３１．２９０（１９７２）　、＾
ＧＫとΔＯＤについてはジャーナル・オブ・ジェネラル
・ミクロバイオロジイ（Ｊ、　Ｇｅｎ０Ｍ１ｃｒｏｂｉ
ｏ１．）６９、３６５（１９７１）に従って行った。そ
の結果へＧＳ欠損変異株としてＥＡ−ＩＳＡＧＫ欠損変
異株としてＥＡ−２１、ＡＯＤ欠損変異株としてＥＡ−
４をそれぞれ取得した。
（３）アルギニン生合成遺伝子を含むＤＮＡ断片のクロ
ーニング クローン化は大腸菌の宿主−ベクター系にて実施した。
ベクターとして使用したｐＢＲ３２２（アンピシリン耐
性、テトラサイクリン耐性）は宝酒造社製の市販品を用
いた。ｐＢＲ３２２プラスミドＤＮＡ１■および実施例
（１）で調製したコ′リネバクテリウム・アセトアシド
フィラムＡＴＣＣ１３８７０の染色体ＤＮＡ３．を含む
制限酵素ｓｐｈ　Ｉ用反応液（６ｍＭ　　）リス、１２
５ｍＭ　　ＮａＣｊ！、６ｍＭ　　ＭｇＣｌ２．６ｍＭ
　　β−メルカ　ブトエタノール、０．０１％　トリト
ン　Ｘ−１００、ｐＨ７，５）　２００ｍに１０単位の
５ｐｈｌ（ベーリンガーマンハイム社製）を添加し、３
７℃で６０分間反応後６５℃で３０分間加温して反応を
停止した。該反応消化物に１０倍濃度のＴ４１Ｊガーゼ
用＄ｌ衝液（６６０ｍＭ　　）リス、６６ｍＭＭｇＣ１
ｘ　、１００ｍＭ　ジチオスレイトーノぺｐＨ７，６）
　４０ＡＩ！、１００ｍＭ　　ＡＴＰ　　４ｍ、８．０
１６０４およびＴ４リガーゼ（宝酒造社製）３００単　
位を加え、１２℃で１６時間反応させた。
このリガーゼ反応混合物を上記（２）で造成した大腸菌
に１２株亜株ＥＡ−２１（アルギニン、メチオニン要求
性）の形質転換に供した。ＥＡ−２１株のコンピテント
・セルはダジェルトらの方法〔ジーン（Ｇｅｎｅ）　６
　、２３（１９７９）　）で調製した。
すなわち、Ｌ培地（バクトドリブトン１０ｇ１酵母工キ
ス５ｇ１グルコース１ｇおよびＮａＣｊ！５ｇを水１ｊ
２に含み、ｐ　Ｈ７，２に調整した培地）５０ｍｌにＥ
Ａ−２１株を植菌し、ＯＤが０．５になるまで３７℃で
培養した。培養液を氷水中で１０分間冷却してから遠心
した。冷却した０、ＩＭＣａ　Ｃ１２２０ｍｌに菌体を
再懸濁し、０℃に２０分間装いた。菌体を再遠心し、０
．ＩＭ　ＣａＣ１２Ｑ、　５ｍｌに懸濁し、０℃で１８
時間装いた。Ｃａ　Ｃｊ’　２処理した菌液１５０誠に
前記リガーゼ反応混合物５０屑を添加混合し、０℃に１
０分間装いてから３７℃で５分間加温した。次いでＬ培
地２ｍｌを添加し、３７℃で２時間振盪培養した。
生理食塩水で２回遠心洗浄後、メチオニン３０■／ｍｌ
およびアンピシリン５０■／ｍｌを添加したデービス最
少寒天平板培地〔グルコース２ｇ１（ＮＨ＜）２ｓＯ＜
　　Ｉｇ、ＫＪＰＯ＜７ｇ、ＫＨｉＰＯ，２ｇ。
ＭｇＳＯ４・７１（２００，１ｇ、クエン酸３ナトリウ
ム塩　０．５ｇ、サイアミン塩酸塩　４ｍｇおよび寒天
１６ｇを水１１に含み、ｐＨ７，２に調整した培地〕に
塗布し、３０℃で４日間培養した。出現した形質転換株
の培養菌体からアンらの方法〔ジャーナル・オブ・バク
テリオロジイ　（Ｊ。
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、）　、１４０　、４００（１９７
９）　）によりプラスミドＤＮＡを単離した。
形質転換株の一株から得られｐＣａｒｇ　ｌと命名した
プラスミドは、各種制限酵素での消化とアガロースゲル
電気泳動による解析の結果、ｐＢＲ３２２の唯一のｓｐ
ｈ　Ｔ切断部位に７キロベースの５ｐｈＩＤＮＡ断片が
挿入した構造を有していることがわかった。
ｐｃａｒｇｌを用い、ＥＡ−２１株を前記と同様に形質
転換しアンピシリン耐性で選択された形質転換株は、同
時にアルギニン非要求性を示し、それから単離されたプ
ラスミドはｐｃａｒｇｌと同一の構造を有していた。こ
のことから、大腸菌のＡＧＫ欠損変異株のアルギニン要
求性を回復させる活性を有する酵素の合成に関与するコ
リネバクテリウム・アセトアシドフィラムＡＴＣＣ１３
８７０の遺伝子がｐｃａｒｇｌ上にクローニングされて
いることが明らかになった。
またｐｃａｒｇｌを用い、前記（２）で取得した大腸菌
に１２株亜株であるＡＧＳ欠損変異株ＥＡ−１およびＡ
ＯＤ欠損変異株ＥＡ−４（以上いずれもアルギニン、メ
チオニン要求性）を前記と同様に形質転換し、アンピシ
リン耐性で選択された形質転換株は同時にアルギニン非
要求性を示した。すなわちｐＣａ　ｒ　ｇ　ｌ上には大
腸菌のＡＧＳ欠損変異株のアルギニン要求性を回復させ
る活性を有する酵素および大腸菌のＡＯＤ欠損変異株の
アルギニン要求性を回復させる活性を有する酵素の遺伝
子もコードされていることが示された。
またＢａｕｍｂｅｒｇ　らの方法〔ジャーナルーオブ・
ジェネラル・ミクロバイオロジイ（Ｊ、Ｇｅｎ、１４ｉ
ｃｒｏｂｉｏ＋、）　６９．３６５（１９７１）　）に
従いＡＧＫ活性を、Ｖｏｇｅｌ　らの方法〔メソッヅ・
イン・エンザイモロジイ（ｔＪｅｔｈｏｄｓ　ｉｎεｎ
ｚｙｍｏｌｏｇｙ）　１７　ｐａｒｔＡ２５５（１９７
０）　）に従いＡＧＰＲ活性を、Ｖｏｇｅｌらの方法〔
メソッヅ・イン・エンザイモロジイ（Ｍｅｔｈｏｄｓ　
ｉｎ　［ｉｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）　１７　ｐａｒｔＡ　
２６０（１９７０））に従いＡＯＡＴ活性を、ＰｒｅＳ
ＣＯｔｔらの方法〔アナリティカル・バイオケミストリ
イ（Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　）３２、４０８（
１９６９）　）に従いＯＣＴ活性をそれぞれｐｃａｒｇ
ｌを保有するＷＡ８０２株と保有しない該菌株について
測定したところ、保有株では非保有株に比べ、いずれの
酵素活性も３倍以上高まっていることが示された。すな
わちｐｃａｒｇｌにはＡＧＫ、ＡＧＰＲＳＡＯＡＴおよ
びＯＣＴの遺伝子がコードされていることが明らかにな
った。
以上の結果よりｐＣａｒｇｌにはコリネバクテリウム・
アセトアシドフィラム＾ＴＣＣ１３８７０由来のＡＧＫ
、ＡＣＰＲ，ＡＯＡＴＳＯＣＴ、大腸菌のＡＧＳ欠損変
異株のアルギニン要求性を回復させる活性を有する酵素
および大腸菌のＡＯＤ欠損変異株のアルギニン要求性を
回復させる活性を有する酵素の遺伝子が存在することが
示された。
（４）プラスミドｐｃａｒｇｔｔの作製上記ｐｃａｒｇ
ｌをコリネ型グルタミン酸生産菌のベクタープラスミド
ｐＣ（１，１１と組み換え、大腸菌とコリネ型グルタミ
ン酸生産菌双方で複製可能なシャトルベクターｐｃａｒ
ｇｌｌを作製した。
ｐｃＧｌｌは本発明者が先に発明した、コリネバクテリ
ウム属およびブレビバクテリウム属のプラスミドベクタ
ーでストレプトマイシンおよびスペクチノマイシン耐住
の表現型を与える。
ｐｃａｒｇｌｌの作製は以下の工程によって行った。
ｐｃＧｌｌは、それを保有するコリネバクテリウム・グ
ルタミクムＡＴＣＣ３１８３３株から先に本発明者が特
開昭５７−１３４５００に記載した方法に従って単離し
た。ｐＣＧ　１１　ＤＮＡ２■を含む制限酵素Ｂｇｉ用
反応液（１０ｍＭ　）リス、１００ｍＭ　ＮａＣＪ、　
１０ｍ！ＪＩＭｇＣ１２、ｐＨ７，５）１００薦に６単
位のＢｇｊ！ＩＩ（全酒造社製）を添加し、３７℃で２
時間反応後、６５℃で３０分間加温して反応を停止した
。一方ｐｃａｒｇｌＤＮＡ２ｇを含む制限酵素ＢａｍＨ
Ｉ用反応液（１０ｍｌｌリス、１００ｍＭ　　ＮａＣｊ
！、１ｈ＋Ｍ　　ＭｇＣＬ　、ｐＨ７，５）　１００．
ｄに６単位のＢａｍＨＩ　（全酒造社製）を添加し、３
７℃で２時間反応後、６５℃で３０分間加温して反応を
停止した。雨滴化物を混合し、１０倍濃度の７４１Ｊガ
ーゼ用緩衝液４０４．１００ｍＭ　　ＡＴＰ４ｍ、Ｈ，
０１５０ｄおよびＴ４１Ｊガーゼ（全酒造社製）３００
単位を加え、１２℃で１６時間反応させた。該リガーゼ
反応混合物を用い、大腸菌に１２株亜株ＥＡ−２１を上
記（３）に示した方法により形質転換し、メチオニン３
０ｘｒ／ｍｌおよびスペクチノマイシン１０　Ｌｃｇ／
ｍｌを含むデービス最少寒天平板培地上に塗布した。こ
の寒天平板上に出現したスベクチノマイシン耐性かつア
ルギニン非要求性の形質転換株の１株よりアンらの方法
〔ジャーナル・オブ・バタテリオロジイ（Ｊ、　Ｂａｃ
ｔｅｒｉｏｌ、）１４０　、４００（１９７９）　）に
従ってプラスミドＤＮＡを単離した。このプラスミドＤ
ＮＡの構造を制限酵素切断とアガロースゲル電気泳動に
より解析したところ、このプラスミドはｐｃＧｌｌの唯
一のＢｇ、ｅＩＩ切断部位とｐＣａ　ｒ　ｇ　１の唯一
のＢａｍＨＩ切断部位とが互いに結合した構造を有して
いた（第１図参照）。このプラスミドをｐｃａｒｇｌｌ
と命名した。
ｐｃａｒｇｌｌを用いて前記の大腸菌に１２株亜株ＥＡ
−１、ＥＡ−２１、ＥＡ−４を形質転換したところ、各
スベクチノマイシン耐性形質転換株は同時にアルギニン
非要求性も有していることが示された。
またｐｃａｒｇｌｌ保有株のＡＧＫ、ＡＧＰＲ。
ＡＯＡＴ、ＯＣＴ活性を上記（３）と同様の方法により
測定したところ、いずれの酵素活性についても保有株は
非保有株に比べ、活性が３倍以上高まっていることが示
された。以上よりｐｃａｒｇｌｌにもＡＧＫＳＡＧＰＲ
ＳＡＯＡＴ、ＯＣＴ、大腸菌のＡＧＳ欠損変異株のアル
ギニン要求性を回復させる活性を有する酵素および大腸
菌のΔＯＤ欠損変異株のアルギニン要求性を回復させる
活性を有する酵素の遺伝子が存在していることが示され
た。
このｐｃａｒｇｌｌを用いてコリネバクテリウム・グル
タミクムＡＴＣＣ３１８３３を特開昭５７−１８６４９
２および特開昭５７−１８６４８９に従って形質転換し
た。すなわち、該菌株をＮＢ培地にて培養し、しかる後
にその種培養０．４ｍｌを４　Ｑｍｌの３３Ｍ培地に接
種し、３０℃で振盪培養した。
ＯＤが０．１５になった時点で０．５単位／ｍｌになる
ようにペニシリンＧを添加した。さらに培養を続け、Ｏ
Ｄが約０．６になったところで細胞を集菌、ＲＣＧＰ培
地〔グルコース　５ｇ、カザミノ酸５ｇ、酵母エキス２
．５　ｇ、　Ｋ２ＨＰ　０４３．５ｇ５ＫＨ２ＰＯ４１
，５ｇ５ＭｇＣ１２・６Ｈ２００，４１ｇ、　Ｆ　ｅ　
５０４　　・７　Ｈｚｏ　　１０ｍｇ。
Ｍ　ｎ　ＳＣ２・４〜６Ｈ２０２ｍｇＳＺｎ３０４・７
８２０　０．９　ｍｇ、　　（Ｎ　Ｈａ）ｓ　　Ｍ　Ｏ
ｑ○２４・４８２００．０４ｍｇ、ピオチン３０ｇ、サ
イアミン塩酸塩　２ｔｎｇｓコハク酸二ナトリウム１３
５ｇ１ポリビニルピロリドン（分子１ｔｌＯ，ＯＯＯ）
３０ｇを水１βに含む培地〕に１■／ｍｌのりゾチーム
を含む液５ｍ１（ｐＨ７，６）に約１０’細胞／ｍｌと
なるように懸濁し、Ｌ型試験管に移して３０℃で１５時
間後やかに振盪反応してプロトプラスト化した。このプ
ロトプラスト菌液Ｑ、５ｍｌを小試験管にとり、２．５
００ｘｇで５分間遠心分離し、７５ＭＣ緩衝液（１０ｍ
Ｍ　　Ｍ　ｇ　ＣＩ！ｘ　、３０ｍＭＣａ　ＣＬ、５０
ｍＭ　　）リス、４００ｍＭショ糖、ｐＨ７，５）１ｍ
ｌに懸濁して遠心洗浄後、ＴＳＭＣ緩衡液Ｑ、１ｍｌに
再懸濁した。この菌液に２倍濃の７５ＭＣ緩衝液とｐＣ
ａｒｇ　　１１プラスミドＤＮＡ溶液との１対１混合液
１００ｇを加えて混和し、次いでＴＳＭＣ緩衝液中に２
０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）　６，０００　
（牛丼化学薬品社製）を含む液１．Ｑｍｌを添加して混
合した。３分後２．５００ｘｇで５分間遠心分離にかけ
て上澄み液を除去し、沈降したプロトプラストを１ｍｌ
のＲＣＧＰ培地（ｐＨ７，４）に懸濁してから３０℃で
２時間緩やかにｆ！！した。ついでこのプロトプラスト
懸濁液の０．３ｍｌをスベクチノマイシン４００ＩＬｇ
／ｍｌを含むＲＣＧＰ寒天培地（ＲＣＧＰ培地に１．６
％寒天を含む培地、ｐＨ７，４）に塗抹し、３０℃で８
日間培養した。
出現したスペクチノマイシン耐性形質転換株を４００ｍ
ｌＳＳＭ培地で振盪培養し、ＯＤが０．１５になったと
ころで０．５単位／ｍｌとなるようにペニシリンＧを添
加し、さらにＯＤが０．６５になるまで培養した。培養
液から菌体を集菌し、ＴＥＳ榎衝液で洗浄後、リゾチー
ム溶液１０ｍ１に懸濁し、３７℃で４時間反応させた。
反応液に５Ｍ　　ＮａＣｊ！　　２．４ｍｌ、　０．５
Ｍ　　ＥＤＴＡ（ｐＨ８，０）　０．６ｍｌ、および４
％ラウリル硫酸ナトリウムと０．７Ｍ　　Ｎ　ａ　Ｃ１
からなる溶液４．４ｍｌを順次添加し、緩やかに混和し
てから氷水中に１５時間装いた。溶解物全量を遠心管に
移し、４℃で６０分間６９．４００　ｘ　ｇの遠心分離
にかけ上澄液を回収した。これに重量百分率１０％相当
のＰＥＧ６，０００（牛丼化学薬品社製）を加え、静か
に混和して溶解後、氷水中に置いた。１０時間後、１，
５００Ｘｇで１０分間遠心分離してペレットを回収した
。ＴＢＳ緩衝緩衝液５壱ｌえてペレットを静かに再溶解
してから１．５ｍｇ／ｍｌエチジウムブロマイド２．０
ｍｌを添加し、これに塩化セシウムを加えて静かに溶解
し、密度を１．５８０に合わせた。この溶液を１０５，
０００　ｘｇ、１８℃で４８時間超遠心分離にかけた。
この密度勾配遠心により共有結合で閉じられた環状のＤ
ＮＡは、紫外線照射することによって遠心チューブ中下
方の密度の高いバンドとして見出された。このバンドを
注射器で遠心チューブの側面から抜きとることによって
プラスミドが分離された。ついで分離液を等容量のイソ
プロピルアルコール液〔容量百分率９０％イソプロピル
アルコール、１０％ＴＥＳ緩衝液（この混液中に飽和溶
解量の塩化セシウムを含む）〕で５回処理してエチジウ
ムブロマイドを抽出除去シ、しかる後にＴＥＳ緩衝液に
対して透析した。こうしてプラスミドＤＮＡを得た。
これらのプラスミドを制限酵素消化とアガロースゲル電
気泳動で解析した結果、各種制限酵素切断様式で特徴付
けられるｐｃａｒｇｌｌと同一の構造を有するものであ
ることがわかった。
ｐｃａｒｇｌｌ中の遺伝子がコリネバクテリウム属菌種
中でも発現しうることをＡＧＫおよびＡＯＡＴの遺伝子
について以下のように確認した。
ｐｃａｒｇｌｌを保有するコリネバクテリウム・グルタ
ミクムΔＴＣＣ３１８３３株および保有しない該株のＡ
ＧＫおよび八〇ＡＴの発現量をみるため、両殊について
その粗酵素抽出液を調製した。すなわち、両法の種培養
１０ｍ１を３００ｍ１の３３Ｍ培地（ｐｃａｒｇｌｌ保
有株にはスペクチノマイシン１００鴻／ｍｌを添加）に
接種して３０℃で振盪培養し、ＯＤが約３になるまで生
育させた。培養液から菌体を集菌し、媛衡液Ａ（１０ｍ
Ｍ）リス、１ｍＭジチオスレイトール、ｐＨ７．２）で
洗浄後、緩衝液Ａ１０ｍ１に再懸濁した。
その懸濁液をソニケーター（Ｔ　Ｏ！、ｌ　Ｙ精工社製
）により強度７で２０分間超音波振動をかけ、懸濁液中
の細胞を破砕した。破砕液を１６．００Ｏｒｐｍ　。
４０分（日立製作新製、ＲＰＲ２０−２０−ター使用）
の遠心処理をし、上清を回収した。得られた上清につい
て、緩衝液Ａｌｆに対して４℃、６時間の透析を２回行
い、上清中の低分子物質を除去した。
このようにして得られた側枕の粗酵素抽出液を用い、Ａ
ＧＫについてはＢａｕｍｂｅｒｇ　らの方法〔ジャーナ
ル・オブ・ジェネラル・ミクロバイオロジイ（Ｊ、Ｇｅ
ｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、）６９．３６５（１９７１
）　〕ＡＯＡＴについてはＶｏｇｅｌらの方法〔メソッ
ヅ・イン・エンザイモロジイ（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　
Ｂｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）１７　ｐａｒｔ＾、２６０＜１
９７０）　］に従い、各々の酵素活性を測定した。その
結果ＡＣ，ＫＳＡＯＡＴいずれの酵素についても、ｐｃ
ａｒｇｌｌを保有するＡＴＣＣ３１８３３株より得られ
た抽出液は、ｐｃａｒｇｌｌを保有しない菌株より得ら
れた抽出液に比べＡ　Ｇ　Ｋで３０倍、ＡＯＡＴで１０
倍の比活性の上昇を示し、ｐｃａｒｇｌｌ中の遺伝子が
コリネ型グルタミン酸生産菌中で発現することが確かめ
られた。
以上のようにして得られたｐｃａｒｇｌｌを保有する形
質転換株はコリネバクテリウム・グルタミクムに６４（
ＦＥＲＭ　　ＢＰ−１１１４）として微工研に寄託され
ている。
（５）宿主菌のアルギニン生産性を増大させる変異型プ
ラスミドの作製 ｐＣａ　ｒ　ｇｌｌＤＮＡをヒドロキシルアミンで直接
処理する方法〔モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジ
ェネティクス（Ｍｏｌ、　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、）１
４５　、１０１（１９７８）　）で、Ｌ−アルギニン生
産性を一段と向上できる変異型父ラスミドを以下のよう
に取得した。
ｐｃａｒｇｌｌはコリネバクテリウム・グルタミクムに
６４　（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−１１１４）株より前記（４
）に示した方法に従い単離した。そのｐｃａｒｇｌｌ　
　２Ａｇを含む変異処理液（５０ｍＭＮａＨｚＰＣＬ　
、４００ｍＭ　ヒドロキシルアミン塩酸塩、０．５ｍＭ
　　ＥＤＴＡ、　ｐＨ６，０）　３００ｔｄｌを７５℃
で６０分間反応し、その後にＴＢＳ緩衝液に対して透析
した。この反応液１００薦を用いてコリネバクテリウム
・グルタミクムＡＴＣＣ３１８３３を前記（４）と同様
に形質転換した。得られたスベクチノマイシン耐性株に
ついて、以下のようにそのアルギニン生産試験を行った
。ＮＢ培地で３０℃、２４時間培養した種培養Ｑ、５ｍ
ｌを生産培地５１Ｔ１１〔廃糖蜜８０ｇ（グルコース換
算）、（ＮＨ＜）＊ＳＯ＊　４０ｇ、　ＫＨ２ＰＯ４０
，５ｇ、　Ｋ２１（ＰＯ４０，５ｇ５ＣａＣＯｓ　　２
０ｇを水１１に含み、ｐＨ７，０に調整した培地〕の入
った試験管に接種し、３０℃で７２時間振盪培養した。
培養後、培養ｐ液をペーパークロマトグラフィーにかけ
ニンヒドリン発色後比色定量してＬ−アルギニン生成量
を測定し、未変異のｐｃａｒｇｌｌを保持したコリネバ
クテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ３，１８３３株に比
べてＬ−アルギニン生成量が顕著に増大した株を選択し
た。これらの株よりプラスミドＤＮＡを前記〔４〕と同
様の方法で単離した。
Ｌ−アルギニン生産性の増大した株から得られたプラス
ミドＤＮＡを各種制限酵素による消化とアガロースゲル
電気泳動にて構造を解析した結果、これらプラスミドは
未変異のｐｃａｒｇｌｌと同一の制限酵素切断地図を有
することが確認された。このうち最も高いＬ−アルギニ
ン生産性を示した菌株より得たプラスミドをｐｃａｒｇ
ｌｌＯと命名した。＄）ＣａｒｇｌｌＯを保有する菌株
はコリネバクテリウム・グルタミクムに６５（ＦＥＲＭ
Ｂ　Ｐ　−１１１５）　　として微工研に寄託されてい
る。
ｐｃａｒｇｌおよびｐｃａｒｇｌｌの作製過程を第１図
に示す。又ｐｃａｒｇｌｌまたはｐｃａｒｇｌｌＯ保有
株および（４〕に記載した方法と同様にして導入したｐ
Ｅａｒｇｌ保有株（特開昭６Ｏ−６６９８９）によるＬ
−アルギニン生産試験の結果を第１表に示す。
第　　　１　　　表 菌　　　　　　　　株　　　　　　　　　　　し−アル
ギニン　生産量　（ｇ／ｆ）コリネバクテリウム・グル
タミクム　ＡＴＣＣ３１８３３０コリネバクテリウム・
グルタミクム　ＡＴＣＣ３１８３３／ｐＥａｒｇ１　　
　　　　　　　　　　　　１．６（６）　　ｐｃａｒｇ
ｌｌおよびｐｃａｒｇｌｌｏ導入株によるアルギニン生
産 コリネバクテリウム・ハーキュリスＡＴＣＣ１３８６８
およびブレビバクテリウム・フラブムΔＴＣＣ１４０６
７をｐｃａｒｇｌｌおよびｐｃａｒｇｔｌｏを用いて形
質転換した。形質転換は第（４）項と同様の方法で行っ
た。スペクチノマイシン耐性形質転換株から第（４）項
と同様の方法でプラスミドを単離し、各種制限酵素での
消化とアガロースゲル電気泳動によりその構造を解析し
たところ、形質転換株がｐｃａｒｇｌｌあるいはｐｃａ
ｒｇｌｌＯを保有することを確認した。
ｐｃａｒｇｌｌ、ｐｃａｒｇｌｌｏ　またはｐＥａｒｇ
ｌ（特開昭６Ｏ−６６９８９）保有株およびプラスミド
非保有株のＬ−アルギニン生産試験は前記（５）と同様
の方法で行った。
結果を第２表に示す。
第　　　　２　　　　表 コリネバクテリウム・ハーキユリス　ＡＴＣＣ１３８６
８０コリネバクテリウム・ハーキュリス　＾ＴＣＣ１３
８６８／ｐｃａｒｇｌｌ　　　　　　　　　　　　　　
０．２コリネバクテリウム・八−キエリス　＾ＴＣＣ１
３８６８／ｐｃａｒｇｌｌｏ　　　　　　　　　　　　
　２．５コリネバクテリウム−ｎ−キｌリス　ＡＴＣＣ
１３８６ｇ／ｐＢａｒｇ１　　　　　　　　　　　　　
　１．８ブレビバクテリウム・フラブム　ＡＴＣＣ１４
０６７０ブレビバクテリウム・フラブム　ＡＴＣＣ１４
０６７／ｐｃａ、ｒｇｌｌ　　　　　　　　　　　　　
　　　Ｏ，１ブレビバクテリウム・フラブム　＾ＴＣＣ
１４０６７／ｐｃａｒｇ１１０　　　　　　　　　　　
　　　２．０発明の効果 本発明によれば、コリネバクテリウム属またはブレビバ
クテリウム属に属する微生物のアルギニン生合成に係わ
る酵素、特にＡＧＫ、＾ＧＰＲ。
ＡＯＡＴ、ＯＣＴ、大腸菌（７）ＡＧＳまたＩｔ　Ａ　
ＯＤ欠損変異株のアルギニン要求性を非要求性に回復さ
せる活性を有する酵素から選ばれる少なくとも１つ以上
の合成に関与する遺伝子を含む組換え体プラスミドを保
有させることにより、コリネバクテリウム属またはブレ
ビバクテリウム属に属する微生物におけるＬ−アルギニ
ンの生産性を向上させることができる。
【図面の簡単な説明】 第１図はｐＣａ　ｒ　ｇ　ｌおよびｐｃａｒｇｌｌの制
限酵素ｓｐｈ　Ｉ、ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、Ｂｇｉ、
Ｓａｊ！　Ｉによる切断点地図とその作製工程を示す。 図中ＥはＥｃｏＲＩ、Ｓｐはｓｐｈ　Ｉ、　Ｓａは５ａ
ｆｌＳＢはＢａｍＨＩ。 ＢｇはＢｇβ■による切断点を表す。プラスミドの大き
さはキロベース（Ｋｂ）で表示されている。 ｐＣａ　ｒｇ　１およびｐｃａｒｇｌｌの太い実線部分
に、コリネバクテリウム・アセトアシドフィラムＡＴＣ
Ｃ１３８７０の染色体ＤＮＡに由来するアルギニン生合
成酵素群の遺伝子が含まれている。

Claims (4)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム
    属に属する微生物のＬ−アルギニン生合成酵素の合成に
    関与する遺伝情報を含むＤＮＡ断片とベクターＤＮＡと
    の組換え体ＤＮＡを保有するコリネバクテリウム属また
    はブレビバクテリウム属に属する微生物を培地に培養し
    、培養物中にＬ−アルギニンを生成蓄積させ、該培養物
    からＬ−アルギニンを採取することを特徴とするＬ−ア
    ルギニンの製造法。
  2. （２）該遺伝情報がＮ−アセチルグルタミン酸キナーゼ
    、Ｎ−アセチル−γ−グルタミルリン酸レダクターゼ、
    Ｎ−アセチルオルニチン−δ−アミノトランスフェラー
    ゼ、オルニチンカルバミルトランスフェラーゼ、大腸菌
    のＮ−アセチルグルタミン酸シンテターゼ欠損変異株の
    アルギニン要求性を非要求性に回復させる活性を有する
    酵素および大腸菌のＮ−アセチルオルニチンデアセチラ
    ーゼ欠損変異株のアルギニン要求性を非要求性に回復さ
    せる活性を有する酵素から選ばれる少なくとも１つ以上
    の酵素の合成に関与するものであることを特徴とする特
    許請求の範囲第１項記載の方法。
  3. （３）コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム
    属に属する微生物由来で、Ｎ−アセチルグルタミン酸キ
    ナーゼ、Ｎ−アセチル−γ−グルタミルリン酸レダクタ
    ーゼ、Ｎ−アセチルオルニチン−δ−アミノトランスフ
    ェラーゼ、オルニチンカルバミルトランスフェラーゼ、
    大腸菌のＮ−アセチルグルタミン酸シンテターゼ欠損変
    異株のアルギニン要求性を非要求性に回復させる活性を
    有する酵素および大腸菌のＮ−アセチルオルニチンデア
    セチラーゼ欠損変異株のアルギニン要求性を非要求性に
    回復させる活性を有する酵素から選ばれる少なくとも１
    つ以上の酵素の合成に関与する遺伝情報を含むＤＮＡ断
    片とベクターＤＮＡとの組換え体ＤＮＡ。
  4. （４）コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム
    属に属する微生物由来で、Ｎ−アセチルグルタミン酸キ
    ナーゼ、Ｎ−アセチル−γ−グルタミルリン酸レダクタ
    ーゼ、Ｎ−アセチルオルニチン−δ−アミノトランスフ
    ェラーゼ、オルニチンカルバミルトランスフェラーゼ、
    大腸菌のＮ−アセチルグルタミン酸シンテターゼ欠損変
    異株のアルギニン要求性を非要求性に回復させる活性を
    有する酵素および大腸菌のＮ−アセチルオルニチンデア
    セチラーゼ欠損変異株のアルギニン要求性を非要求性に
    回復させる活性を有する酵素から選ばれる少なくとも１
    つ以上の酵素の合成に関与する遺伝情報を含むＤＮＡ断
    片とベクターＤＮＡとの組換え体ＤＮＡを保有するコリ
    ネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属に属する
    微生物。
JP61224189A 1986-09-22 1986-09-22 Ｌ−アルギニンの製造法 Expired - Lifetime JPH0728749B2 (ja)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP61224189A JPH0728749B2 (ja) 1986-09-22 1986-09-22 Ｌ−アルギニンの製造法
DE87113780T DE3785530T2 (de) 1986-09-22 1987-09-21 Verfahren zur Herstellung von L-Arginin.
KR1019870010471A KR900004425B1 (ko) 1986-09-22 1987-09-21 L-아르기닌의 제조방법
EP87113780A EP0261627B1 (en) 1986-09-22 1987-09-21 Process for producing l-arginine
US07/099,798 US5017482A (en) 1986-09-22 1987-09-22 Process for producing L-arginine

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP61224189A JPH0728749B2 (ja) 1986-09-22 1986-09-22 Ｌ−アルギニンの製造法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPS6379597A true JPS6379597A (ja) 1988-04-09
JPH0728749B2 JPH0728749B2 (ja) 1995-04-05

Family

ID=16809916

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP61224189A Expired - Lifetime JPH0728749B2 (ja) 1986-09-22 1986-09-22 Ｌ−アルギニンの製造法

Country Status (5)

Country Link
US (1) US5017482A (ja)
EP (1) EP0261627B1 (ja)
JP (1) JPH0728749B2 (ja)
KR (1) KR900004425B1 (ja)
DE (1) DE3785530T2 (ja)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006035831A1 (ja) * 2004-09-28 2006-04-06 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Ｌ－アルギニン、ｌ－オルニチンまたはｌ－シトルリンの製造法
JP2017518760A (ja) * 2014-10-13 2017-07-13 シージェイ チェイルジェダング コーポレイション Ｌ−アルギニンを生産するコリネバクテリウム属の微生物及びそれを用いたｌ−アルギニンの製造方法

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5187268A (en) * 1988-08-20 1993-02-16 United States Of America Gene encoding an anti-complement protein from vaccinia
US5284757A (en) * 1989-01-12 1994-02-08 Ajinomoto Company, Inc. Process for producing l-arginine by fermentation with brevibacterium or corynebacterium
JP3078312B2 (ja) * 1990-11-22 2000-08-21 協和醗酵工業株式会社 物質の製造法
DE69126141T2 (de) * 1991-08-26 1997-08-28 Kyowa Hakko Kogyo Kk Verfahren zur herstellung von 4-hydroxy-l-prolin
US5487986A (en) * 1994-03-10 1996-01-30 Genzyme Corporation Method for increasing plasmid yield
JP3047832U (ja) * 1997-10-08 1998-04-28 有限会社エイ・エヌ・シー ハンドフリー型通話装置
US6242256B1 (en) * 1998-07-17 2001-06-05 E. I. Du Pont De Nemours And Company Ornithine biosynthesis enzymes
JP2000197490A (ja) * 1998-11-02 2000-07-18 Ajinomoto Co Inc Ｌ―アルギニンの製造法
US6255086B1 (en) 1999-02-01 2001-07-03 Ajinomoto Co., Inc. Carbamoyl-phosphate synthetase gene of coryneform bacteria and method for producing L-arginine
US20030124685A1 (en) * 1999-02-01 2003-07-03 Yoko Kuwabara Carbamoyl-phosphate synthetase gene of coryneform bacteria and method for producing l-arginine
DE60034843T2 (de) * 1999-06-03 2008-01-17 Ajinomoto Co., Inc. Verfahren zur Herstellung von L-arginin
US7160705B2 (en) * 2000-04-28 2007-01-09 Ajinomoto Co., Inc. Arginine repressor deficient strain of coryneform bacterium and method for producing L-arginine
RU2208640C2 (ru) * 2000-07-06 2003-07-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АРГИНИНА, ШТАММ Escherichia coli - ПРОДУЦЕНТ L-АРГИНИНА
KR101481782B1 (ko) * 2012-12-28 2015-01-13 대상 주식회사 Gogat의 불활성화에 의한 아미노산 고생산능 변이 균주

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS55148093A (en) * 1979-05-02 1980-11-18 Ajinomoto Co Inc Preparation of l-arginine
JPS6066989A (ja) * 1983-09-24 1985-04-17 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd Ｌ−アルギニンの製造法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS575693A (en) * 1980-06-13 1982-01-12 Ajinomoto Co Inc Production of l-arginine through fermentation process
JPS5867699A (ja) * 1981-10-16 1983-04-22 Ajinomoto Co Inc プラスミド
EP0332234B1 (en) * 1983-02-17 1993-07-28 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for preparing l-tyrosine

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS55148093A (en) * 1979-05-02 1980-11-18 Ajinomoto Co Inc Preparation of l-arginine
JPS6066989A (ja) * 1983-09-24 1985-04-17 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd Ｌ−アルギニンの製造法

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006035831A1 (ja) * 2004-09-28 2006-04-06 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Ｌ－アルギニン、ｌ－オルニチンまたはｌ－シトルリンの製造法
US7741081B2 (en) 2004-09-28 2010-06-22 Kyowa Hakko Bio Co., Ltd. Process for producing L-arginine, L-ornithine or L-citrulline
JP2017518760A (ja) * 2014-10-13 2017-07-13 シージェイ チェイルジェダング コーポレイション Ｌ−アルギニンを生産するコリネバクテリウム属の微生物及びそれを用いたｌ−アルギニンの製造方法
US10626426B2 (en) 2014-10-13 2020-04-21 Cj Cheiljedang Corporation Microorganism of genus Corynebacterium having an ability to produce L-arginine and a method for producing L-arginine using the same

Also Published As

Publication number Publication date
US5017482A (en) 1991-05-21
EP0261627A3 (en) 1989-10-04
DE3785530T2 (de) 1993-11-18
KR880004091A (ko) 1988-06-01
DE3785530D1 (de) 1993-05-27
KR900004425B1 (ko) 1990-06-25
EP0261627A2 (en) 1988-03-30
EP0261627B1 (en) 1993-04-21
JPH0728749B2 (ja) 1995-04-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US4954441A (en) Process for producing L-lysine
EP0143195B1 (en) Recombinant dna having a phosphoenol pyruvate carboxylase gene inserted therein, bacteria carrying said recombinant dna and a process for producing amino acids using said bacteria
EP0136359B1 (en) Process for preparing l-histidine
JPS6279788A (ja) アミノ酸の製造法
EP0063763A1 (en) Novel plasmids
JPS6379597A (ja) Ｌ−アルギニンの製造法
JPS6394985A (ja) Ｌ−チロシンの製造法
JPH06169785A (ja) 芳香族アミノ酸の製造法
JPS63119688A (ja) Ｌ−グルタミン酸およびｌ−プロリンの製造法
US4775623A (en) Process for producing L-arginine
US4946781A (en) Recombinant DNA, bacteria carrying said recombinant DNA and a process for producing L-threonine or L-isoleucine using said bacteria
US5563052A (en) Process for producing L-tryptophan
CA1306963C (en) Process for producing l-threonine and l-isoleucine
JPH037591A (ja) Ｌ―トリプトファンの製造法
US4968609A (en) Coryneform bacteria carrying recombinant DNA and a process for producing aromatic amino acids using said bacteria
US5426050A (en) Plasmid vectors for expression of genes in coryneform bacteria
EP0259858B1 (en) Process for producing amino acids
US5595894A (en) Process for stably maintaining recombinant plasmids in serine auxotrophic microorganisms belonging to the genus Corynebacterium or Brevibacterium
JPS62186795A (ja) アミノ酸の製造法
CA1228038A (en) Process for producing tyrosine
CA1228039A (en) Process for producing l-isoleucine
EP0183006B1 (en) A recombinant dna-molecule, coryneform bacteria carrying recombinant dna and process for producing an aromatic amino acid by using the same
JPS6070093A (ja) 発酵法によるｌ−チロシンの製造法
JPS63105688A (ja) Ｌ−フエニルアラニンの製造法
JPS6140797A (ja) Ｌ−トリプトフアンの製造法

Legal Events

Date Code Title Description
EXPY Cancellation because of completion of term