JPS6394985A - Ｌ−チロシンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、Ｌ−）’Ｊブトファンを生産する能力を有す
るコリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属に
属する微生物に、３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−へプツ
ロソネートー７−ホスフェートシンターゼ（以下ＤＳと
略す）およびコリスメートムターゼ（以下ＣＭと略す）
の合成に関与する遺伝子を含むＤＮＡ断片とベクターＤ
ＮＡとの組換え体ＤＮＡを保有させ、該微生物を培地で
培養し、培養物中にＬ−チロシンを蓄積させ、該培養物
からＬ−チロシンを採取することを特徴とするＬ−チロ
シンの製造法に関する。従って本発明はバイオインダス
トリーの産業分野に関し、特に医薬において有用なＬ−
チロシンの製造分野に関する。

従来の技術 ］リネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属に属
する微生物を用いた発酵法によるＬ−チロシンの製造法
としては、アミノ酸の栄養要求性変異やアミノ酸のアナ
ログに対する耐性変異あるいはそれらの変異を併有する
菌株を用いる方法が知られている〔農芸化学会誌、堕（
１）　　ｐ、Ｒ７９（１９７６））。一方、組換えＤＮ
Ａ技術によるＬ−チロシンの生産菌も作成されており、
たとえばＤＳＳＣＭおよびプレフェネートデヒドロゲナ
ーゼまたはプレチロシンアミノトランスフェラーゼの合
成に関与する遺伝子を含む組換え体ＤＮＡを保有したＬ
−チロシン生産菌などが知られている（特開昭６Ｏ−３
４１９７）。

発明が解決しようとする問題点および解決のための手段 近年、Ｌ−チロシンの需要が増大するにつれてその製造
法の改善が強く望まれている。本発明者は、このような
状況を考慮し、組換えＤＮＡ技術を有効に活用し、すぐ
れたし−チロシン生産菌を造成するため鋭意研究を重ね
た。その結果、Ｌ−トリプトファンを生産する能力を有
するコリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属
菌種に微生物のＤＳおよびＣＭの遺伝情報を担うＤＮＡ
断片を含む組換え体ＤＮＡを導入することにより、Ｌ−
チロシンの生産性が改良されることを見出し、本発明を
完成するに至った。微生物のアミノ酸生合成に関与する
遺伝子を含む組換え体プラスミドＤＮ’Ａを用いるＬ−
チロシン生産菌としては、前記のようにコリネバクテリ
ウム属またはブレビバクテリウム属菌種の野生株または
Ｌ−チロシン生産性菌株にＤＳ、％ＣＭおよびプレフェ
ネートデヒドロゲナーゼまたはプレチロシンアミノトラ
ンスフェラーゼを導入した例は知られている（特開昭６
Ｏ−３４１９７）が、Ｌ−）リプトフ１ン生産性菌株に
ＤＳおよびＣＭをコードする遺伝子を含む組換え体ＤＮ
Ａを導入した例は知られておらず、Ｌ−トリプトファン
生産性菌株に膝組換え体ＤＮＡを導入することにより、
著量のＬ−チロシンが生産できることは本発明により初
めて見出されたものである。

以下、本発明の詳細な説明する。

本発明は、Ｌ−トリプトファンを生産する能力を有する
コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属に属
する微生物に、微生物の３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−
ヘプツロソネート−７−ホスフェートシンターゼおよび
コリスメートムターゼの合成に関与する遺伝情報を担う
ＤＮＡ断片とベクターＤＮＡとの組換え体ＤＮＡを導入
し、得られる形質転換株を培地に培養し、培養物中にＬ
−チロシンを生成蓄積させ、該培養物からＬ−チロシン
を採取することを特徴とするＬ−チロシンの製造法を提
供する。

該ＤＮＡ断片としては、エシェリシア属、コリネバクテ
リウム属またはブレビバクテリウム属に属する微生物に
由来するものがあげられる。

ＤＳおよびＣＭをコードする各遺伝子（以下ＤＳ遺伝子
およびＣＭ遺伝子と称することもある）の供給源となる
微生物としては、芳香族アミノ酸の生合成において自己
栄養性の微生物であればいかなる微生物でもよい。とり
わけ、原咳生物である細菌、たとえばエシェリシア属、
コリネバクテリウム属またはプレビバクテリウム属に属
する微生物のＤＳおよびＣＭをコードする遺伝子が望ま
しく、とくにこれらの細菌から誘導された芳香族アミノ
酸の生産性変異株由来の遺伝子が好適である。

宿主微生物として用いるＬ−）ＩＪブトファン生産能を
有するコリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム
属に属する微生物としては、コリネ型グルタミン酸生産
菌として知られているＬ−）ＩＪブトファン生産性微生
物は全て用いることができる。好適には下記の菌株から
誘導されたＬ−）ＩＪブトファン生産性変異株が用いら
れる。

コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラムＡＴＣＣ１
３８７０ コリネバクテリウム・ハーキユリス　ＡＴＣＣ１３８６
Ｂコリネバクテリウム・リリウム　ＡＴＣＣ１５９９０
ブレビバクテリウム・ディバリカラム　ＡＴＣＣ１４０
２０ブレビバクテリウム・フラブム　ＡＴＣＣ１４０６
７プレビバクテリウム・イマリオフィラム　ＡＴＣＣ１
４０６８ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム八
ＴＣＣ１３８６９ ブレビバクテリウム・チオゲニタリス　ＡＴＣＣ１９２
４０Ｌ−）’Ｊブトファン生産性変異株はアミノ酸要求
性、アミノ酸アナログ耐性あるいはこれらを併有する菌
株として取得することができる〔農芸化学会誌、並（１
）　ｐ、Ｒ７９（１９７６）　〕。

ＤＳおよびＣＭをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を
組み込むためのベクターとしては、コリネバクテリウム
属またはブレビバクテリウム属菌種中で自律複製できる
ものであれば特に限定されないが、たとえばｐｃＧｌ（
特開昭５７−１３４５００）、ｐＣＧ２　（特開昭５８
−３５１９７）、ｐＣＧ４、ｐｃＧｌｌ（いずれも特開
昭５７−１８３７９９）　、ｐ　ＣＥ　５４、ｐ　ＣＢ
ＩＯＩくいずれも特開昭５８−１０５９９９）、ｐＣＥ
５１（特開昭６Ｏ−３４１９７）およびｐＣＥ５２、ｐ
ＣＥ５３　（いずれもモレキユラー・アンド・ジェネラ
ル　・ジェネティクス（Ｍｏｌ。

Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、）　１９６　、１７５　（１９
８４））などのプラスミドを使用することができる。

ＤＳをコードする遺伝子を含む供与体ＤＮＡとベクター
ＤＮＡとの組換え体ＤＮＡは、試験管内で両ＤＮＡを制
限酵素で切断した後、ＤＮＡリガーゼで処理するか、ま
たはその切断末端をターミナルトランスフェラーゼやＤ
ＮＡポリメラーゼなどで処理した後、ＤＮＡ’Ｊガーゼ
を作用させて結合する常法〔メソッヅ・イン・エンチモ
ロジイ（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　［ｉｎｚｙｍｏｌｏｇ
ｙ＞　６８（１９７９））により種々の組換え体混成物
とともに生成させることができる。この混成物を用いて
、ＤＳ遺伝子の欠失したコリネバクテリウム属またはブ
レビバクテリウム属の変異株を形質転換し、欠損形質が
相補された形質転換株を選択し、この形質転換株の有す
るプラスミドを単離することによって、ＤＳをコードす
る遺伝子を含む組換え体ＤＮＡを取得できる。コリネバ
クテリウム属またはブレビバクテリウム属微生物の形質
転換法としては、プロトプラストを用いる方法（特開昭
５７−１８６４９２および特開昭５７−１８６４８９）
により実施することができる。

同様にして、ＣＭをコードする遺伝子を含む供与体ＤＮ
ＡとベクターＤＮＡとの組換え体ＤＮＡを得ることがで
きる。すなわち、染色体ＤＮＡとベクターＤＮＡの組換
え体混成物を用いて、コリネバクテリウム属またはブレ
ビバクテリウム属のＣＭ遺伝子が欠損したフェニルアラ
ニンおよびチロシン要求性変異株を形質転換し、フェニ
ルアラニンおよびチロシン非要求性となった形質転換株
からＣＭをコードする遺伝子を含む組換え体ＤＮＡを取
得できる。

以上のようにして取得したＤＳ遺伝子を含むＤＮＡ断片
とＣＭ遺伝子を含むＤＮＡ断片とをさらに組み換えて２
種の該遺伝子を同時に含む組換え体ＤＮＡを得ることが
できる。この組換え体ＤＮＡを宿主微生物に導入するこ
とにより、２種の遺伝子を増幅することができる。細胞
内で共存できる別個のベクターＤＮＡに各々の遺伝子を
組み換え、それらの組換え体ＤＮＡを宿主微生物に共有
させても２種の遺伝子を増幅でき、Ｌ−チロシンを著量
蓄積する同様な菌株を得ることができる。

上記の工程において、コリネバクテリウム属またはブレ
ビバクテリウム属菌種の野生株の染色体ＤＮＡを供与源
とした場合には、野生型のＤＳおよびＣＭの各遺伝子を
含む組換え体ＯＮ＾としてコリネバクテリウム属または
ブレビバクテリウム属微生物に導入できる。しかしなが
ら、コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属
菌種において、ＤＳおよびＣＭはフェニルアラニンおよ
びチロシンでフィードバック阻害を受けることが知られ
ている〔アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル
・ケミストリー（＾ｇｒｉｃ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ
、）　３９．３５１（１９７５）　）　。従って、この
阻害から解除された変異型のＤＳおよびＣＭをコードす
る遺伝子を有する組換え体ＤＮＡを用いる方が、コリネ
バクテリウム属またはブレビバクテリウム属菌種に高い
Ｌ−チロシン生産能を付与できるので好ましい。変異型
のＤＳおよびＣＭ遺伝子を導入するには、所望の変異を
受けたＤＳおよびＣＭ遺伝子を有するコリネバクテリウ
ム属またはブレビバクテリウム属の変異株の染色体ＤＮ
Ａを供与源として、野生型のＤＳおよびＣＭ遺伝子を得
たのと同様な方法で組換え体プラスミドを作製すること
により果たされる。あるいは上記変異株の染色体ＤＮＡ
とベクターＤＮＡとの組換え体プラスミドを用いて、野
生型ＤＳおよびＣＭを有するコリネバクテリウム属また
はブレビバクテリウム属微生物を形質転換し、フェニル
アラニンのアナログ、例えばパラ−フルオロフェニルア
ラニン（以下、ＰＰＰと略す）に耐性となった形質転換
株を選択し、この形質転換株の有するプラスミドを単離
することによっても、変異型のＯ３またはＣＭ遺伝子を
含む組換え体プラスミドを取得できる。あるいは野生型
のＤＳおよびＣＭ遺伝子を含む組換え体プラスミドを保
有する微生物を常法通り変異処理し、フェニルアラニン
またはチロシンアナログ耐性を付与するか、組換え体プ
ラスミドＤＮＡを例えばヒドロキシルアミン処理により
ｉｎ　ｖｉｔｒｏで変異を誘起し形質転換して変異型の
ＤＳおよびＣＭ遺伝子を含む組換え体プラスミドを作成
し、これを使用することもできる。

野生型または変異型のＤＳおよびＣＭ遺伝子を含む組換
え体プラスミドは、前記のようなプロトプラストを用い
る形質転換法によりコリネバクテリウム属またはブレビ
バクテリウム属微生物に導入できる。

これらの組換え体プラスミド保有株によるＬ−チロシン
の生産は、従来の発酵法によるアミノ酸の製造に用いら
れる培養方法により行うことができる。すなわち、該形
質転換株を炭素源、窒素源、無機物、アミノ酸、ビタミ
ンなどを含有する通常の培地中、好気的条件下、温度、
ｐＨなどを調節しつつ培養を行えば、培養物中にＬ−チ
ロシンが生成蓄積するのでこれを採取する。

炭素源としてはグルコース、グリセロール、フラクトー
ス、シュークロース、マルトース、マンノース、澱粉、
澱粉加水分解液、糖蜜などの炭水化物、ポリアルコーノ
ベピルビン酸、フマール酸、乳酸、酢酸などの各種有機
酸が使用できる。さらに微生物の資化性によって、炭化
水素、アルコール類なども用いられる。特に廃糖蜜は好
適に用いられる。

窒素源としてはアンモニアまたは塩化アンモニウム、硫
酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウム
などの各種無機ふよび有機アンモニウム塩類あるいは尿
素および他の窒素含有物質ならびにペプトン、ＮＺ−ア
ミン、肉エキス、酵母エキス、コーン・スチープ・リカ
ー、カゼイン加水分解物、フィツシュミールまたはその
消化物、蛸加水分解物などの窒素含有有機物など種々の
ものが使用可能である。

さらに無機物としては、リン酸第−水素カリウム、リン
酸第二水素カリウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニ
ウム、硫酸マグネシウム、塩化す）　ＩＪウム、硫酸第
一鉄、硫酸マンガンおよび炭酸カルシウムなどを使用す
る。微生物の生育に必要とするビタミン、アミノ酸源な
どは、前記したような他の培地成分によって培地に供給
されれば特に加えなくてもよい。

培養は振盪培養または通気攪拌培養などの好気的条件下
に行う。培養温度は一般に２０〜４０℃が好適である。

培地のｐＨは中性付近に維持することが望ましい。培養
期間は通常１〜５日間で培地中にＬ−チロシンが蓄積す
る。培養終了後、菌体を除去して活性炭処理、イオン交
換樹脂処理などの公知の方法で培養液からＬ−チロシン
を回収する。

このようにしてＬ−）リブトファンを生産する能力を有
するコリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属
菌株にＤＳおよびＣＭをコードする遺伝子を含む組換え
体ＤＮＡを保有させた変異株を用いることにより、高い
収率でＬ−チロシンを生産することができる。

本明細書ではＬ−トリプトファンを生産する能力を有す
るコリネバクテリウム・グルタミクムにＤＳおよびＣＭ
遺伝子を含む組換え体ＤＮＡを導入することによるＬ−
チロシンの製造法について例示したが、代わりに他の＞
）ＩＪブトファン生産能を有するコリネ型グルタミン酸
生産菌を用いても目的は達成される。

グルタミン酸高生産能を有するいわゆるコリネ型グルタ
ミン酸生産菌は、主な菌学的性質を同じくしているにも
かかわらず、産業上の重要性から、各研究者により、種
々の菌名が付されており、属名までも、コリネバクテリ
ウム属またはブレビバクテリウム属など種々である。し
かしながら、これらの菌群は、細胞壁のアミノ酸構成や
ＤＮＡの塩基組成が画一的であることから、同一の菌種
であることが指摘されていた。

さらに、最近、これらの菌種間には、７０〜８０％以上
のＤＮＡの相同性があることが明らかにされ、非常に近
縁な微生物であることが明白である。（、コマ７　　＋
フイ（Ｋｏｍａｔｓｕ　Ｙ、）　ニレポート　オン　ザ
　ファーメンテイティブ　リサーチインスティチュート
（Ｒｅｐｏｒｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｆｅｒ−ｍｅｎｔａｔ
ｉｖｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ）　、
Ｎｏ、５５．１（１９８０）およびスズキ、ケイ１．カ
ネコ　ティ、。

コマガク　ケイ（Ｓｕｚｕｋｉ、　Ｋ、、　Ｋａｎｅｋ
ｏ、　Ｔ、　ａｎｄＫｏｍａｇａｔａ、　Ｋ、）　：イ
ンターナショナル　ジャーナル　オン　システマティッ
ク　バクテリオロジイ　（Ｉｎｔ、　　Ｊ、　　５ｙｓ
ｔ、　　Ｂａｃｔａｒｉｏｌ、）、　　３１．　１３１
（１９８１）参照〕。上記の事実を踏まえればコリネ型
グルタミン酸生産菌全般での効果が容易に類推される。

その効果の有無は組換え体ＤＮＡがコリネ型グルタミン
酸生産菌全般で自律的に複製し、ＤＳおよびＣＭ遺伝子
が形質発現できるか否かに係わり、コリネ型グルタミン
酸生産菌間のＤＮＡ相同性などにおける若干の相違は何
ら関係ない。しかるにこれらの菌種がプラスミドの複製
と遺伝子発現に係わる機能を等しく保持していることは
、特開昭５７−１８３７９９に開示したコリネバクテリ
ウム・グルタミクム２２５−２５０株から分離され、ス
ペクチノマイシンおよび／またはストレプトマイシン耐
性遺伝子を有するプラスミドｐＣＧ４がコリネバクテリ
ウム属およびブレビバクテリウム属菌種などのコリネ型
グルタミン酸生１童菌内で同じく複製でき、またその耐
性遺伝子が発現される（特開昭５７−１８６４９２）　
　ことから明らかである。従って、本発明のＤＳおよび
ＣＭ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡを導入することによる
Ｌ−チロシン生産菌の作製法を適用し得る菌種は、コリ
ネバクテリウム・グルタミクムに限らずコリネバクテリ
ウム属およびブレビバクテリウム属菌種を含むコリネ型
グルタミン酸生産菌全てが含まれる。

以下に本発胡の実施例を示す。

実施例 コリネバクテリウム・グルタミクムに３８のＤＳおよび
ＣＭ遺伝子を有する組換え体プラスミドを保有する菌株
によるチロシンの生産（１）　　コリネバクテリウム・
グルタミクムに３８（ＦＥＲＭ　ＢＦ−４５４）の染色
体ＤＮＡ、プラスミドｐＣ３−ＣＭ２およびベクターｐ
ＣＥ５３とｐｃＧ１１５の調製 ＮＢ培地（粉末ブイヨン２０ｇ１酵母エキス５ｇを水１
ｆ！に含み、ｐ　Ｈ７，２に調整した培地）で増殖した
コリネバクテリウム・グルクミクムＫ　３８　（ＦＥＲ
Ｍ　ＢＰ−４５４）　［Ｐ　Ｆ　Ｐおよびパラ−アミノ
フェニルアラニンの耐性形質を有している〕の種培１２
０ｍ１を４０　Ｑｍｌの半合成培地ＳＳＭＣグルコース
２０ｇ、（Ｎ）Ｉ−）　ａｓ０４１０ｇ１尿素３ｇ、酵
母エキス１　ｇ　、　ＫＨ，ＰＯ。

Ｉｇ、ＭｇＣｊ！２・６Ｌ０　０．４ｇＳ　Ｆｅ５Ｌ・
７Ｌ０１Ｑｍｇ、　　Ｍｎ５Ｏ，・４〜６８２００．２
ｍｇ、　　Ｚｎ５Ｏ，・７８２ＣＩＱ、　９　ｍｇ、　
　Ｃｕ５Ｏ＜　ｌ　５Ｈ２００，４＋１１ｇ５　　Ｎａ
２Ｂ４０．　・１０８２００、０９ｍｇ、（Ｎｉｌｓ）
ｓＭｏｔＯｉ＜　−４８２００、０４ｍｇ、ビオチン３
０ｇおよびサイアミン塩酸塩１ｍｇを水１βに含み、ｐ
　Ｈ７，２に調整した培地〕に接種して３０℃で振盪培
養した。

東京光電比色計で６６０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ）を
測定（以下特記しないかぎり吸光度は６６０ｎｍで測定
）し、ＯＤが０．２になった時点で培養液へ０．５単位
／’ｍｌの濃度となるようにペニシリンＧを添加した。

さらに培養を継続し、ＯＤが０．６になるまで生育させ
た。

培養液から菌体を集菌し、ＴＢＳ緩衝液（０，０３Ｍ）
リス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（以下トリスと
略す）、０．００５Ｍエチレンジアミン四酢酸二ナトリ
ウム（以下、ＥＤＴＡと略す）、０．０５Ｍ　　ＮａＣ
ＣｐＨ８，０〕で洗浄後、リゾチーム溶液（２５％ンヨ
糖、０．ＩＭ　　ＮａＣＣ０，０５Ｍ）リス、０、８　
ｍｇ　７ｍｌリゾチーム、ｐＨ８，０）　１０ｍｇに懸
濁し、３７℃で４時間反応を行った。集菌した菌体から
斎藤−三浦の方法（Ｓａｉｔｏ、　Ｈ。

ａｎｄ　Ｍｉｕｒａ、　Ｋ、　：バイオキミカ・工・バ
イオロジカル ７２、６１９（１９６３）　：ｌに従って高分子染色体
ＤＮＡを単離した。

プラスミドｐｃｓ−ＣＭ２は、特開昭６０−２４１９２
に開示されたコリネバクテリウム・グルタミクムＫＹ９
４５６　（ＣＭおよびブレフェネートデヒドラクーゼの
両酵素活性を欠損しており、フェニルアラニンおよびチ
ロシンの要求性を有している）〔アグリカルチュラル・
アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Ａｇｒｉｃ、
　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）　３９．３３１　（１９７５
）］の欠損形質を相補するコリネバクテリウム・グルタ
ミクムに３ｇのＢａｍ旧切断ＤＮＡ断片をコリネバクテ
リウム・グルタミクムのプラスミドｐｃＧ１１のＢｇＮ
　Ｉ［切断部位に挿入させたプラスミドである。

ベクターとして用いるｐＣＥ５３は、コリ２・バクテリ
ウム・グルタミクムのプラスミドｐｃＧ１（特開昭５７
−１３４５００）　　とエシェリシア・コリのプラスミ
ドｐＧＡ　２２　ＣＧ、　Ａｎ。

ｆＪ、ｍ：　ジャーナル・オン・バタテリオロジイ（Ｊ
、　Ｂａｃｔｅｒｉｏ＋、）旦（１，４００＜１９７９
）参照〕を和合連結させたプラスミドである。詳しくは
ｐｃＧｌ上のＢｇβ■切断部位とｐ　Ｇ　Ａ２２上に２
カ所あるＢａｍ）（Ｉ切断部位のうちテトラサイクリン
耐性遺伝子内でないＢａｍＨＩ切断部位とで、両制限酵
素の同一接着末端を利用して連結したものである。ｐＣ
Ｅ５３はｐＧＡ２２由来のカナマインン耐性遺伝子など
の選択マーカーを有し、制限酵素５ａＡＩに対する切断
部位は１カ所である。

同じく、ベクターとして用いるｐｃＧ１１５は、プラス
ミドｐｃｃｏ　　（特開昭５７−１３４５００）上のＢ
ｇβ■およびＰｓｔＩ切断部位にＭ１３ｍｐｌ　８ＲＦ
ＤＮＡ　（全酒造社製）をＢａｍＨｌおよびＰｓｔＩで
切断したリンカ−を両者の同一接着末端を利用して結合
させたプラスミドである。ｐｃＧ１１５は分子量約６．
４キロベース（Ｋｂ　）のプラスミドで、単一の制限酵
素切断部位としてＸｂａ　Ｉ、５ａｆｆ　ＩおよびＰｓ
ｔＩを有し、ストレプトマイシンおよび／またはスペク
チノマイシン耐性の表現型を与える（第１図参照）。

ｐＣ３−ＣＭ２はコリネバクテリウム・グルタミクムに
３９（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−４５９＞の培養菌体から、ｐ
ＣＥ５３およびｐｃＧ１１５は各々保有するコリネバク
テリウム・グルタミクムＡＴＣＣ３９０１９（ＡＴＣＣ
３１８３３から誘導したりゾチーム感受性変異を有する
菌株）の培養菌体から次の方法でそれぞれ単離した。

コリネバクテリウム・グルタミクムに３９は、４００ｍ
ｌＳＳＭ培地で３０℃にて振盪培養し、上記と同様にし
て、ペニシリンＧ処理した後、ＯＤが０．６になるまで
生育させた。また、ｐＣＥ５３またはｐｃＧ１１５を保
有するコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ３９
０１９は、４００ｍ１ＮＢ培地で、３０℃にて振盪培養
し、ＯＤが約０．７になるまで生育させた。菌体を集菌
しＴＢＳ緩衝液で洗浄後、リゾチーム溶液ＩＱｍｌに懸
濁し、３７℃で２時間反応させた。反応液に５Ｍ　Ｎａ
Ｃｌ２．４ｍｌ、０．５Ｍ　　ＥＤＴＡ　（ｐＨ８，５
）０．６ｍｌ、４％ラウリル硫酸ナトリウムと０．７Ｍ
ＮａＣｊ２からなる溶液４．４ｍｌを順次添加し、緩や
かに混和してから氷水上に１５時間装いた。溶菌物を遠
心管に移し、４℃で６０分間６９、４００　Ｘ　ｇの遠
心分離にかけ上澄液を回収した。これに重量百分率１０
％相当のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）　６．００
０　（牛丼化学薬品社製）を加え、静かに混和して溶解
後、氷水上に置いた。１０時間後、１．５００　Ｘ　ｇ
で１０分間遠心分離してペレットを回収した。

ＴＢＳ緩衝緩衝液５奢ｌえてベレットを静かに再溶解し
てから１．５　ｍｇ　／ｍｌエチジウムブロマイド２．
Ｑｍｌを添加し、これに塩化セシウムを加えて静かに溶
解し、密度を１．５８０に合わせた。

この溶液を１０５，０００ｘｇ、　　１８℃で４８時間
超遠心分離にかけ、紫外線照射下に検知される遠心チュ
ーブ下方の密度の高い位置のバンドを遠心チューブの側
面から注射器で抜きとることによってｐＣ３−ＣＭ２、
ｐＣＥ５３およびｐｃＧ１１５プラスミドＤＮＡをそれ
ぞれ分離した。この分画液を等容量のイソプロピルアル
コール液〔容量百分率９０％イソプロピルアルコール、
１０％Ｔ　Ｅ　Ｓ　緩衝液（この混液中に飽和溶解量の
塩化セシウムを含む）〕で５回処理してエチジウムブロ
マイドを抽出除去し、しかる後にＴＢＳ緩衝液に対して
透析した。

（２）ＤＳ遺伝子を含むＤＮＡ断片のクローニング 上記で調製したｐＣＥ５３プラスミド［１ＮＡ３■を含
む制限酵素５ａＡＩ用反応液（トリス１０ｍＭＳＭｇＣ
Ｌ　６ｍＭ５ＮａＣｊ！　１５０ｍＭ。

ｐＨ７，５）６０ｍに６単位の５ａｆｌ（宝酒造社製、
以下特記しないかぎり制限酵素は宝酒造社製）を添加し
、３７℃で６０分間反応後、６５℃で１０分間加温して
反応を停止させた。一方、コリネバクテリウム・グルタ
ミクムに３８　（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−４５４）の染色体
ＤＮΔ３μｇを含むＳａｆ　Ｉ用反応液１４０ρに６単
位のＳａβＩを添加し、３７℃で６０分間反応後、６５
℃で１０分間加温して反応を停止させた。

両反応物を混合し、１０倍濃度のＴ　４１Ｊガーゼ用緩
（析液（トリス６６０ｍｌＪＳＭ　ｇ　Ｃｊｌ！２５５
ｍＭ−、ジチオスレイトールｌ　ＯＯｍＭ、　ｐ　Ｈ７
，６）４０ｍ、５ｍＭ　　ＡＴＰ　　４０ｍ、Ｔ４リガ
ーゼ（宝酒造社製、１単位／μＲ）０．３ｍおよび水１
２０ρを加え、１２℃で１６時間反応させた。

このリガーゼ反応混合物をコリネバクテリウム・グルタ
ミクムＡＴＣＣ３９０１９（八ＴＣＣ３１８３３から誘
導したリゾチーム感受性変異を有する菌株）の形質転換
に供した。コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ
３９０１９の種培養４ｍｌをＮＢ培地４Ｑｍｌに植菌し
、３０℃で振盪培養した。ＯＤが０．６になった時点で
集菌し、該細胞をＲＣＧＰ培地〔グルコース５ｇ、カザ
ミノ酸５ｇ、酵母エキス２．５ｇ。

Ｋ２ＨＰＯ，３，５ｇ　５Ｋ）Ｉ２Ｐ０．　１．５　ｇ
　、　　ＭｇＣβ２・６Ｈ２００，４１ｇ、　　Ｆｅ５
Ｏｓ　・７Ｌ０　１０　ｍｇ。

Ｍｎ５Ｏ＜　・４〜６Ｈ２０２ｍｇＳＺｎＳＯ＜　・７
Ｈ２００−９ｍｇｓ　（Ｎ）Ｉ＜）ＪＯＪ２４・４Ｈ２
００，０４ｍｇ、ビオチン３０■、サイアミン塩酸塩２
ｍｇ、コノ１り酸二ナトリウム１３５ｇ、ポリビニルピ
ロリドン（分子量１０，０００）３０ｇを水１βに含む
培地〕に１ｍｇ／ｍｌのりゾチームを含む溶液（ｐＨ７
，６）　１０ｍｌに約１０９細胞／ｍｌとなるように懸
濁し、Ｌ型試験管に移して３０℃で５時間緩やかに振盪
反応してプロトプラスト化した。

このプロトプラスト菌液Ｑ、５ｍｌを小試験管にとり、
２．５００Ｘｇで５分間遠心分離し、Ｔ　Ｓ　Ｍ　Ｃ緩
衝液（ＭｇＣｊｈ　　１０ｍＭ５ＣａＣｊ’ｚ３Ｑｍｌ
Ｊ、）リス５３ｍＭ、　　ショ糖４００ｍＭ５ｐＨ７，
５）１ｍｌに再懸濁して遠心洗浄後、ＴＳＭＣ緩衝液Ｑ
、１ｍｌに再懸濁した。この菌液に２倍高濃度のＴＳＭ
Ｃ緩衝液と上記リガーゼ反応液の１対１混合液１００．
ｄを加えて混和し、次いでＴＳＭＣ緩（析液中に２０％
Ｐ　Ｅ　Ｇ６．０００を含む液０．３ｍｌを添加して混
合した。３分後、ＲＣＧＰ培地（ｐＨ７，２＞２ｍｌを
添加し、２．５００Ｘｇで５分間遠心分離にかげて上澄
液を除去し、沈降したプロトプラストを１ｍｌのＲＣＧ
Ｐ培地に懸濁してから、この菌液０．２ｍｌをカナマイ
シン２００ｘｒ／ｍ＋を含むＲＣＧＰ寒天培地（ＲＣＧ
Ｐ培地に１．４％寒天を含む培地、ｐＨ７，２）に塗布
し、３０℃で７日間培養した。

寒天培地上に生育したコロニーをかき集め、生理食塩水
で２回遠心洗浄後、生理食塩水１ｍｌに懸濁した。この
菌液をＰ　Ｆ　Ｐ　８００Ｊｔｇ／ｍｌおよびカナマイ
シン１０ｘｒ／ｍｌを含有する最少寒天培地Ｍ１　〔グ
ルコースＬｏｇ、　（Ｎ１１４）ｌ１２ＰＯ４１ｇＳＫ
ＣＩ　　Ｏ，２ｇ、Ｍｇ５Ｌ・７Ｈ２００，２ｇ５Ｆｅ
ＳＯ４・７ｔｌｚＯ１０ｍｇ、　ＭｎＳＯ４・４〜６Ｌ
ＯＯ，２ｍｇ、　Ｚｎ５Ｏｎ　・７Ｈ，００，９ｍｇ、
　Ｃｕ５Ｏ。

・５Ｈｚ００．４ｍｇ、　Ｎａ２Ｂ、０７・１０ＨＪ　
０．０９ｍｇ。

（ＮＩ１４）　６Ｍｏｔ０２４　・４　Ｈ２Ｏ０，０４
ｍｇ％ビオチン５０河、ｐ−アミノ安息香酸２．５　ｍ
ｇ、サイアミン塩酸塩１ｍｇおよび寒天１６ｇを水１β
中に含み、ｐ　Ｈ７，２に調整した培地〕上に再塗布し
て３０℃で５日間培養し、ＰＰＰおよびカナマイシンに
耐性となった形質転換株を選択した。

これらの形質転換株をＮＢ培地で培養し、集菌した培養
菌体から、上記（１）でｐＣＥ５３を単離したのと同様
な方法でプラスミドＤＮＡを単離した。形質転換株の一
株から得られ、ｐｃｐｓ　１と命名したプラスミドは、
各種制限酵素による切断産物をアガロースゲル電気泳動
法で解析した結果、ｐＣＥ５３のＳａｆ　Ｉ切断部位に
約６．７ＫｂのＳａｊ！ＩＤＮΔ断片が挿入された構造
を有していることがわかったく第１図参照）。

コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ３９０１９
およびｐＣＤＳ　１を保有する形質転換株について、Ｄ
Ｓ活性をＰ、Ｒ，５ｐｒｉｎａｖａｓａｎとり、　Ｂ、
　５ｐｒｉｎｓｏｎ　らの方法〔ジャーナル・オン・バ
イオロジカル・ケミストリー（Ｊ。

Ｂｉａｓ、　Ｃｈｅｍ、）　２３４　、７１６（１９５
９）Ｅに従って測定した。ＡＴＣＣ３９０１９株のＤＳ
活性を１としたときのｐＣＤＳ　１を保有する形質転換
株のＯ３活性は８〜１０倍に増加しており、また、フェ
ニルアラニンおよびチロシンによる阻害を受けないこと
から、ｐＣＤＳ　１に挿入されている約６．７ＫｂのＤ
ＮＡ断片上には、コリネバクテリウム・グルタミクムに
３ｇ株由来のＯ５遺伝子が存在することが判明した。

（３）ＣＭ遺伝子を含むＤＮＡ断片のサブクローニング 上記（１）で調製したｐｃｓ−ＣＭ２プラスミドＤＮＡ
３■を含む制限酵素Ｓａβ■用反応液１００〃に５単位
のＳａβ■を加え、３７℃で６０分間反応後、６５℃で
１０分間加温して反応を停止させた。また、ｐＣＥ５３
プラスミドＤＮＡ３μｇを含む制限酵素Ｓａｄ　ｒ用反
応液１００μＱに５単位のＳａβ■を加え、３７℃で６
０分間反応後、６５℃で１０分間加温して反応を停止さ
せた。

両反応物を混合し、１０倍濃度のＴ４’Ｊガーゼ用緩衝
液４０ｍ、５ｍＭ　　ＡＴＰ　　４０薦、Ｔ４１Ｊガー
ゼ（宝酒造社製、１単位／ρ）０．３ρおよび水１２０
ρを加え、１２℃で１６時間反応させた。

このリガーゼ反応混合物をコリネバクテリウム・グルタ
ミクムＫＹ９４５７（ＣＭ活性を欠損しており、フェニ
ルアラニンおよびチロジンの要求性を有している）〔ア
グリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミスト
　リー（Ａｇｒｉｃ、　　Ｂｉｏｌ、　　Ｃｈｅｍ、）
　　３９　．３３Ｈ１９７５））〔昭和６１年８月７日
付で工業技術院微生物工業技術研究所（微工研）にＦＥ
ＲＭ　　ＢＰ−１１２３として寄託〕の形質転換に供し
た。

形質転換には次のようにして調製したプロトプラストを
用いた。ＫＹ９４５７株の種培養４ｍｌをフェニルアラ
ニンおよびチロシン各１００ｘｒ／ｍｌを含むＳＳＭ培
地４Ｑｍｌに植菌して３０℃で振盪培養した。ＯＤが０
．２になった時点でペニシリンＧを０．５単位／ｍｌと
なるように添加し、培養を継続した。ＯＤが０．６にな
った時点で集菌し、該細胞を上記（２）と同様な方法に
よりリゾチーム処理してプロトプラスト化した。プロト
プラストを上記リガーゼ反応混合物を用いて上記（２）
と同様な方法により形質転換した。カナマイシン２００
■／ｍｌを含むＲＣＧＰ寒天培寒天−地上したカナマイ
ンン耐性コロニーをかき集め、生理食塩水で２回遠心洗
浄後、生理食塩水１ｍｌにｊ１％ｆｉした。この菌液を
カナマイシン１０■／ｍｌ　ヲ含有する最少寒天培地Ｍ
１上に再塗布して３０℃で３日間培養し、カナマイシン
耐性で、フェニルアラニンおよびチロシン非要求性とな
った形質転換株を選択した。これらの形質転換株を３３
Ｍ培地で培養し、上記と同様にして、ペニシリンＧ処理
をした後、集菌した培養菌体から、上記（１）でｐＣＥ
５３を単離したのと同様な方法でプラスミドＤＮＡを単
離した。

形質転換株の一株から得られ、ｐＣＣＭｌと命名したプ
ラスミドは、各種制限酵素による切断産物をアガロース
ゲル電気泳動で解析した結果、ｐＣＥ５３のＳａβＩ切
断部位に約１．９Ｋｂの５ａｆＩ−ＤＮＡ断片が挿入さ
れた構造を有していることがわかった（第１図参照）。

（４）ＤＳおよびＣＭ遺伝子を併せ持つ組換え体プラス
ミドの作成 ｐｃＤｓｌよりＤＳ遺伝子を含むＤＮＡ断片を、一方ｐ
ｃｃＭ１よりＣＭ遺伝子を含むＤＮＡ断片を取得し、両
ＤＮＡ断片をｐＣＧ１１５に連結する。

ｐＣＤＳ　１、ｐＣＣＭｌ、またはｐｃＧ１１５プラス
ミドＤＮＡをそれぞれ３Ｎずつ含む５ａｆｌＩ用反応液
１００艷にそれぞれ５単位のＳａ、ｆｆ　Ｉを加え、３
７℃で６０分間反応後、６５℃で１０分間加温して反応
を停止させた。

３種の反応液を混合し、１０倍濃度のＴ４リガーゼ用緩
衝液４０ｇ、５ｍＭ　　ＡＴＰ４０ｍ、Ｔ４リガーゼ（
宝酒造社製１単位／ｄ）１μｇおよび水２０ρを加え、
１２℃で１６時間反応させた。

このリガーゼ反応混合物を用い、ＣＭ活性を欠損したコ
リネバクテリウム・グルタミクムＫＹ９４５７　（ＦＥ
ＲＭ　　ＢＰ−１１２３）を上記（３）と同様な方法に
より形質転換した。

スベクチノマイシン４００■／ｍｌを含むＲＣＧＰ寒天
培寒天−地上したスペクチノマイシン耐性コロニーをか
き集め、生理食塩水で２回遠心洗浄後、生理食塩水１ｍ
ｌに懸濁した。この菌液をＰ　Ｐ　Ｐ　３　ｍｇ／ｍｌ
およびスペクチノマイシン１００■／ｍｌを含有する最
少寒天培地Ｍｌ上に再塗布して３０℃で５日間培養し、
スペクチノマイシンおよびＰＰＰ耐性で、フェニルアラ
ニンおよびチロシン非要求性となった形質転換株を選択
した。これらの形質転換株から上記（３）と同様な方法
でプラスミドＤＮＡを単離した。形質転換株の一株から
得られ、ｐｃＤｓ−ＣＭ　１と命名したプラスミドは、
各種制限酵素による切断産物をアガロースゲル電気泳動
で解析した結果、ｐｃＧ１１５の５ａＪ２　Ｉ切断部位
に約６．７ＫｂのＤＳ遺伝子を含む５ａＩＩ−ＤＮＡ断
片および約１．９ＫｂのＣＭ遺伝子を含むＳ　ａ　ｊ２
　ｌ−ＤＮＡ断片が挿入された構造を有していることが
わかった（第１図参照）。

（５）　　ｐｃＤｓｌ、ｐｃｃＭｌあるいはｐＣＤＳ−
ＣＭＩを保有する菌株による千ロジンの生産 ｐｃｏｓ　１、ｐｃｃＭｌあるいはｐＣＤＳ−ＣＭ　１
を用い、Ｌ−）ＩＪブトファン生産性菌株コリネバクテ
リウム・グルタミクムに−５５（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−８
６４）Ｃフェニルアラニンおよびチロシン要求性で、５
−メチルトリプトファン、トリプトファンハイドロキサ
メート、６−フルオロトリプトファン、４−メチルトリ
プトファン、バラ−フルオロフェニルアラニン、パラ−
アミノフェニルアラニン、チロシンハイドロキサメート
およびフェニルアラニンハイドロキサメートの耐性形質
を有している〕を上記（３）と同様な方法により形質転
換した。カナマイシンまたはスベクチノマイシン耐性の
形質転換株から上記（３）と同様な方法によりプラスミ
ドＤＮＡを単離した。これらのプラスミドの各種制限酵
素での切断解析により、形質転換株がｐｃＤｓｌ、ｐＣ
ＣＭｌあるいはｐｃＤｓ−ＣＭＩを保有することを確３
忍した。このよう１こしてｉ等られたｐＣＤＳ−ＣＭｌ
を保有する形質転換株は昭和６１年８月７日付でコリネ
バクテリウム・グルタミクムに−６８（ＦＥＲＭ　　Ｂ
Ｐ−１１２２）として微工研に寄託されている。

形質転換株と各々の親株のチロシン、フェニルアラニン
およびトリプトファン生産試験を次のように行った。

ＮＢ培地中で３０℃、１６時間振盪培養した種培養Ｑ、
５ｍｌを５ｍｌの生産培地〔廃糖蜜２００　ｇ、　（Ｎ
Ｈ４）２Ｓ０４　２０　ｇ、　Ｋ）１２ＰＯ，０，５ｇ
　、　Ｋ２ＨＰＯ４０，５ｇ　、　ＭｇＳＯ４・７８２
０　０．２５ｇ、ＮＺアミン　２．５　ｇ、　ＣａＣＯ
５２０ｇを水１βに含み、ｐＨ７，２に調整した培地〕
の入った試験管に接種し、３０℃で９６時間振盪培養し
た。培養後、培養液１ｍｌに６Ｎ　　ＮａＯＨ溶液を５
０４加え、６５℃で５分間加熱し、析出しているチロシ
ンを完全に溶解させた後、培養Ｐ液をペーパークロマト
グラフィーにかけ、ニンヒドリン発色後、比色定量して
Ｌ−チロシン、Ｌ−フェニルアラニンおよびＬ−トリプ
トファンの生成壷を測定した。

結果を第１表に示す。

第　　　　１　　　　表 本発胡によれば、Ｌ−）ＩＪブトファン生産能を有する
コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属菌種
に微生物のＤＳおよびＣＭをコードする遺伝子を含む組
換え体ＤＮＡあるいはそれらの遺伝情報が別個に担われ
ている複数の組換え体ＤＮＡを保有させることにより、
Ｌ−トリプトファンの生産がＬ−チロシンの生産へ代謝
転換され、Ｌ−チロシンを著量生成蓄積する菌株を得る
ことができる。

【図面の簡単な説明】

第１図はｐｃＤｓ−ＣＭＩの制限酵素切断地図とその作
製工程を示す。太い実線部分の染色体ＤＮＡ断片上には
ＤＳ遺伝子が、また斜線部分の染色体ＤＮＡ断片上には
ＣＭ遺伝子が含まれている。プラスミドの大きさはキロ
ベース（Ｋｂ）で表示されている。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）Ｌ−トリプトファンを生産する能力を有するコリ
   ネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属に属する
   微生物に、微生物の３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプ
   ツロソネート−７−ホスフェートシンターゼおよびコリ
   スメ−トムターゼの合成に関与する遺伝情報を担うＤＮ
   Ａ断片とベクターＤＮＡとの組換え体ＤＮＡを導入し、
   得られる形質転換株を培地に培養し、培養物中にＬ−チ
   ロシンを生成蓄積させ、該培養物からＬ−チロシンを採
   取することを特徴とするＬ−チロシンの製造法。
2. （２）該ＤＮＡ断片がエシェリシア属、コリネバクテリ
   ウム属またはブレビバクテリウム属に属する微生物に由
   来することを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の方
   法。
3. （３）コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属ま
   たはエシェリシア属に属する微生物由来の３−デオキシ
   −Ｄ−アラビノ−ヘプツロソネート−７−ホスフェート
   シンターゼおよびコリスメートムターゼの合成に関与す
   る遺伝情報を担い、コリネバクテリウム属またはブレビ
   バクテリウム属に属する微生物にフェニルアラニンまた
   はチロシンのアナログに対する耐性を付与することがで
   きるＤＮＡ断片とベクターＤＮＡが結合した組換え体Ｄ
   ＮＡ。
4. （４）コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属ま
   たはエシェリシア属に属する微生物由来の３−デオキシ
   −Ｄ−アラビノ−ヘプツロソネート−７−ホスフェート
   シンターゼおよびコリスメートムターゼの合成に関与す
   る遺伝情報を担うＤＮＡ断片とベクターＤＮＡとの組換
   え体ＤＮＡを保有するコリネバクテリウム属またはブレ
   ビバクテリウム属に属する微生物。