JPS6034197A - チロシンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は遺伝子の組換えＤＮＡ手法によりチロシンを製
造する方法に関する。さらに詳細には本発明はチロシン
生成に関与する遺伝子を含むＤＮＡ断片とベクターＤＮ
Ａとの組換え体ＤＮＡを用いコリネバクテリウム属また
はブレビバクテリウム属に属する微生物から選ばれる宿
主菌株を形質転換して得られる形質転換株を培地に培養
し、培養物中にチロシンを生成蓄積せしめ、該培養物か
らチロシンを採取することを特徴とするチロシンの製造
法に関する。

Ｌ−チロシンの発酵法による直接的製造法としては、コ
リネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属などの細菌
のフェニールアラニン要求株、チロシン耐性株などの突
然変異株を用いる方法が知られている。（農芸化学会誌
５０ｆｔ）　Ｒ７９〜Ｒ８７゜（１９７６）） 本発明者らは先にコリネバクテリウム属またはブレビバ
クテリウム属に属する微生物中で自律複製し、選択可能
な表現型と適当なりローニング部位を有するプラスミド
ベクターを造成する一方効率の高い形質転換系を開発し
特許出願を行った（特開昭５７−１８３７９９．同５７
−１８６４９２゜同５７−１８６４８９）。また本発明
者らは該プラスミドベクターに既に知られているインビ
トロにおける組換えＤＮＡ技法（Ｕ、Ｓ、Ｐａｔｅｎｔ
　４．２３７，２２４）を用い、グルタミン酸、リジン
、トリプトファン。

ヒスチジン、フェニルアラニンなどのアミノ酸の生合成
に関与する外来性遺伝子を含むＤＮＡ断片を連結し、開
発した形質転換系を用いてコリネバクテリウム・グルタ
ミクムし一２２株またはその誘導株を形質転換したとこ
ろ、該外来性遺伝子が該宿主中で形質を発現され、該ア
ミノ酸の生産の増大に利用することができることを見出
し特許出願を行った（特開昭５８−１２６７８９．特願
昭５８−２５３９７．５８−２５３９８および同５８−
９４３９２）　。

さらに研究の結果、チロシンに薗しても同様の方法によ
って得られた菌株が著量のチーシンを培地に蓄積できる
ことを見出し本発明を完成するに至ったＱ 以下本発明の詳細な説明する。

本発明はチロシン生成に関与する遺伝子を含む１）　Ｎ
　Ａ断片とベクターＤＮＡとの組換え体ＤＮＡを用いコ
リネバクテリウム属またはプレビノイクテリウム屈に属
する微生物から選ばれる宿主菌株を形質転換して得られ
る形質転換株を培地に培養し、千ロジンを製造する方法
を提供する。

本発明に用いる遺伝子を含むＤＮＡ断片（目的遺伝子）
としては、原核化物、ウィルス、バクテリオファージま
たはプラスミドに由来しチロシン生成に関与する遺伝子
を含むＤＮＡ断片があげられる。

微生物における芳香族アミノ酸の生合成経路ならびにそ
の調節様式については、大腸菌、枯草菌。

コリネバクテリウム属やブレビバクテリウム属などのグ
ルタミン酸生産菌などにおいて詳細に研究されている〔
農芸化学会誌５０［１）、　Ｒ７９〜Ｒ８７゜（１９７
６）および八ｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ　４ど乙、５３３（１９７８）参照〕。本発明にお
けるチロシン生合成に係る遺伝子は、これら芳香族アミ
ノ酸の生合成に直接、間接に関与する酵素のうち少なく
とも１つの酵素の遺伝情報を担うＤＮＡである。とくに
生合成系上の調節部位とされる３−デオキシ−Ｄ−アラ
ビノ−へプツロソン酸　７−ホスフェート（３−ｄｅｏ
ｘｙ　−Ｄ　−ａｒａｂｉｎｏ　−ｈｅｐｔｕｌｏｓｏ
ｎａｔｅ７−　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　；以下ＤＡＨＰと
いう）合成酵素（以下ＤＡＨＰａ　ｓ　ｅという）、コ
リスミン酸ミュターゼ（以下ＣＭａｓｅという）、プレ
フェネート・デヒドロゲナーゼ（以下ＰＤＧａ　ｓ　ｃ
という）、プレチロシン・アミノトランスフェラーゼな
どの酵素の遺伝情報を担うＤＮＡが好適である。

さらに、これら遺伝子でフィードバンク阻害が外れてい
るもの（元来無い場合も含む）、レプレシ日ンがり１れ
ているものも用いることができる。

本発明の目的遺伝子としては、コリネバクテリウム属ま
たはブレビバクテリウム属に属する微生物中で発現され
、チロシン生合成系の少なくとも１つの酵素活性を強化
せしめるように働くものであればいずれも用いることが
できる。該遺伝子の給源としては、アミノ酸の発酵生産
、とくに芳香アミノ酸の発酵生産に用いられる菌種、芳
香族アミノ酸の生合成とその調節機構が解明されている
菌種、遺伝学的解明が十分になされている菌種などが好
適であるが、具体的にはエノシエリヒア属、コリネバク
テリウム属、ブレビバクテリウム属、ミクロバクテリウ
ム属、バチルス属、スタフィロコッカス属、ストレプト
コッカス属またはセラチア属に属する細菌の菌株に由来
する遺伝子で、チロシンの生成ならびにその生成に関与
する代謝系に係る遺伝子が好適にあげられる。本発明実
施（ｆ！ｌにおいてＩ：ｔ　、大腸菌ＪＡＩ９４株ＣＰ
ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　１４．４８７〜４９１　（１
９７７）　）を用いた。

本発明に用いるベクターとしては、宿主菌細胞内で自律
増殖できるものでなくてはならない。具体例としては本
発明者らがコリネバクテリウム属に属する微生物から採
取した、または採取したものから誘導して造成したｐｃ
ｃｉ　（特開昭５７−１３４５００）、ｐＣＧ２　（特
開昭５８−３５１９７　＞　。

ｐＣＧ４　（特開昭５’ｌ−１８３７９９）、ｐＣＥ５
１、ｐｃＥ５２　（特開昭５８−１２６７８９）。

ｐｃＥ５３　（特願昭５８−２５３９８）、ｐＣＥ５４
、ｐｃＧｌ、１．ｐｃＢｌｏｌなどがあげられる。

これらプラスミドを保有する菌株はそれぞれ下記の寄託
番号で工業技術院微生物工業技術研究所ならびに米国ア
メリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託さ
れている。

プラスミド　ＦＥＲＭ−Ｐ　ＡＴＣＣ ｐｃＧｌ　５８６５　３１８０８ ｐＣＧ２　５９５４　３１８３２ ｐＣＧ４　５９３９　３１８３０ ｐＣＥ５４　３９０１９ ｐｃＧ］１　３９０２２ ｐｃＢ］ｏ］　３９０２０ 好適にはプラスミドｐｃＥ５１が用いられる。

ｐｃＥ５１は次のように作成することが出来る。

まｆ、ｐｃＧｌをその保存菌コリネバクテリウム・グル
タミクム２２５−５７株（ＦＥＲＭ−Ｐ４Ｏ１０、ＡＴ
ＣＣ３１８０８）の培養菌体から前記の特許出願明細書
（特開昭５７−１３４５００）に開示した方法で、ｐＧ
Ａ２２をその保有大腸菌の培養菌体から通常用いられる
方法（Ａｎ、　Ｇ、　ｒＡａ＋、、　Ｊ、　ｎａｃｔｅ
ｒｉｏｌ、、　１４０．４００．　（１９７９）　）で
濃縮単離する。プラスミドｐｃｃｉを制限酵素Ｂｇｌ■
で直鎖状化し、これにｐＧＡ２２を制限酵素Ｂ　ａ　ｍ
　ＨＴで消化して得たカナマイシン耐性（）＜ｍＲ遺伝
子を含む方の断片を、両者の同一接着末端を利用して連
結する。このＤＮＡ混成物からのｐＣＥ５１の選択は［
）ＧＡ２２に由来するＫ　ｍ　Ｒのみを有するコリネバ
クテリウム属あるいはプレピノマクチリウム属菌種の形
質転換株を分離し、これら形質転換株の保有するプラス
ミドを解析することによって達成される。

ＤＮＡ混成物による形質転換は、本発明者らが先に特許
出願したコリネバクテリウム属およびブレビバクテリウ
ム属菌種のプロトプラストを使用する形質転換法（特開
昭５７−１８６４９２および特開昭５７−１８６／１８
９）により実施することができる。形質転換株の選択に
はカナマイシン（Ｋｍ）を用いる。形質転換株はＤＮＡ
無添加系で受容菌プロトプラストが正常細胞へ復帰増殖
できない濃度の薬剤（通常、Ｋｍ：１００−８００１’
　ｇ　／　ｍｌ）を含む高張寒天培地上で形成されるコ
ロニーを分離するか、あるいは、一旦非選択的に再生培
地上で正常細胞に復帰増殖させた後にかき集め、この懸
濁液を受容菌正常細胞が生育できない濃度の薬剤（通常
、Ｋｍ：　２−２５＃ｇ／ｍｌ）を含む寒天培地上で生
育するコロニーを分離することによって得られる。カナ
マイシン耐性により選択された形質転換株の中には、ｐ
ＧＡ２２由来の他の薬剤耐性形質をも同時に獲得してい
るものがあるが、これらは目的のプラスミドを含まない
と思われるので排除する。

こうして得られる形質転換株の保有するプラスミドＩ）
ＮＡは、本発明者らが特開昭５７−１３４５００および
特開昭５７−１８６４８９に開示した方法で培養菌体か
ら単離精製でき、さらに各種制限酵素で消化して生成す
るＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動で解析する常法
により構造を知ることができる。形質転換株の一株から
分離されたプラスミドがｐｃＥ５１である。

ｒ＋ｃＥ５１は大きさ約６Ｋｂのプラスミドで、制限部
位としてＨｉｎｃｌＴ、ＨｉｎｄｒＩＩ、ＳｍａＴ、Ｘ
ｈｏＩ、　ＥｃｏＲＴなどを有し、ＫｍＲの表現型を与
える。

プラスミド保育菌株からのプラスミドの採取は、たとえ
ば特開昭５７−１３４５００．同５７−１８３７９９お
よび特開昭５８−３５１９７に記載の方法に従って行え
ばよい。

遺伝子を含むＤＮＡ断片とベクターＤＮＡとの組−換え
体の作製は、公知の試験管内組■換えＤＮＡ技法を駆使
することにより実施できる。

試験管内のＤＮＡ組換えは、通常、目的の遣転子を含む
供与体ＤＮＡとベクターＤＮＡの切断と結合（リガーゼ
反応）により行われる（特開昭５８＝１２６７８９号、
Ｕ　ＳＰ　４，２３７，２２４参照）。

リガーゼ反応により目的の組換え体以外に他の１４１換
え体も生成するが、目的の組換え体を取得するにはこの
Ｄ　Ｎ　Ａ混成液を用いてコリネバクテリウノ・属また
はブレビバクテリウム属菌種を直接形１１転換し、目的
の遺伝子の遺伝情報に由来する遺伝形質を付与された形
質転換株を選択分離し、その培養菌体から抽出単離する
ことによって達成できる。コリネバクテリウム属または
プレビバクテリウノ、属菌様を直接形質転換しないで例
えば大腸菌のような他の微生物の宿主ベクター系にて目
的の遺伝子を一旦クローン化し、しかる後にコリネバク
テリウム属またはブレビバクテリウム属菌種のベクター
との組換え体を試験管内で作製し、てからコリネバクテ
リウノ・属またはブレビバクテリウム属菌種を形質転換
し前記と同様に形質転換株を選択分離しても組換え体を
取得できる組換え体製造のためには下記文献の記載が広
く応用できる。

Ｓ、Ｎ、Ｃｏｈｅｎ’、　、ｅｔ　ａｌ−、Ｕ、Ｓ、Ｐ
ａｔｅｎｔ　４．２３７，２２４．遺伝子操作実験法〔
高木康敬編著、講談社サイエンティフィック　（１９８
０）　）　ｒ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ
ｏｇｙ６Ｂ、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＤＮＡ、ｅｄｉ
ｔｅｄ　ｂｙ　Ｒａｙ　Ｍｕ、八ｃ、ａｄｅｍｉｃＰｒ
ｅｓｓ　１９７９．特願昭５８−１２６７８９゜本発明
の宿主微生物としては、コリネバクテリウム属またはブ
レビバクテリウム属に属しＤＮＡ取り込み能を有する菌
株ならばいかなる菌株を用いてもよい。好適には次の菌
株があげられる。

寄託番号 ＦＥＲＭ−Ｆ　ＡＴＣＣ コリネバクテリウム・グルタミクムｔ、−＋５　５９４
６　３１８３４コリネバクテリウム・グルタミクム　Ｋ
−３８７０８７コリネバクテリウム・グルタミクム　Ｋ
−４３７１６２コリネバクテリウム・ハーキュリス　１
３８６８コリネバクテリウム・ハーキュリス　Ｌ−１０
３５９４７３１８６６プレビバクテリウム・ディパリカ
ラム　Ｌ−２０４５９４８３１８６７プレビバクテリウ
ム・ラクトファーメンタム　１３８６９ブレビバクテリ
ウム・ラクトファーメンタムＬ−３１２５９４９３１８
６８ブレビバクテリウム・フラバム　１４０６７これら
菌株から変異誘導されたチロシン生産性菌株は、さらに
好ましい宿主として用いることができる。生産性変異株
は前述の如く、アミノ酸要求性、アミノ酸アナログ耐性
或いはこれを併有する菌株として取得することができる
。

宿主微生物の組■換え体ＤＮＡによる形質転換は１）培
養細胞からのプロトプラストの調製、２）プロトプラス
トの組−換え体ＤＮＡによる形質転換処理、３）プロト
プラストの正常細胞への復帰再生と形質転換株の選択、
からなる工程にて行われる。具体的方法は特開昭５７−
１８６４９２５７−１８６４８９．５８−１０５９９９
などに記載した方法に従えばよい。

かくして得られた形質転換株を、従来発酵法によるチロ
シン製造に用いられる培養方法により培養することによ
って、チロシンを製造することができろ。すなわち、該
形質転換株を炭素源、窒素源、無機物、アミノ酸、ビタ
ミンなどを含有する通常の培地中、好気的条件下、温度
、ｐＨなどを調節しつつ培養を行えば、培養物中にチロ
シンが生成渭積するので、これを採取する。

炭素源としてはグル：Ｉ−ス、フラクトース、シューク
ロース、マルトース、マンノース、ソルビトール、マニ
トールなどの炭水化物、糖アルコール、グリセロール、
澱粉、澱粉加水分解液、糖蜜などが使用でき、またピル
ビン酸、乳酸、酢酸。

フマール酸、グルコン酸などの各種有機酸、エタノール
など低級アルコールも使用可能である。

窒素源としてはアンモニアあるいは塩化アンモニウム、
硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム。

酢酸アンモニウムなどの各種無機および有機アンモニウ
ム塩類あるいは尿素および他の窒素含有物　。

質ならびにペプトン、ＮＺ−アミン、肉エキス。

酵母エキス、コーン・スチーブ・リカー、カゼイン加水
分解物、フィツシュミールあるいはその消化物、＠加水
分解物などの窒素性有機物など種々のものが使用可能で
ある。

さらに無機物としては、燐酸第一水素カリウム。

燐酸第二水素カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリ
ウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガンおよび炭酸カルシウム
などを使用する。微生物の生育に必要とするビタミン、
アミノ酸源などは、前記したような他の培地成分に従っ
て培地に供給されれば特に加えなくてもよい。

培養は振盪培養あるいは通気攪拌培養などの好気的条件
下に行う。培＃温度は一般に２０〜４０℃が好適である
。培養中の培地のｐｉ（は中性付近に維持することが望
ましい。培養期間は通常２〜５日間で培地中に著量のチ
ロシンが蓄積する。

培養終了後、菌体を除去して活性炭処理、イオン交換樹
脂処理などの公知の方法で培養液からチロシンが回収さ
れる。

グルタミン酸高生産能を有するいわゆるグルタミン酸生
産菌は、主な菌学的性質を同じくしているにもかかわら
ず、産業上の重要性から各研究者により、種々の菌名が
付されており属名までもコリネバクテリウム属あるいは
ブレビバクテリウム属などさまざまである。しかしなが
ら、これらの菌群は、細胞壁のアミノ酸構成やＤＮＡの
塩基組成が画一的であることから、同一の菌種であるこ
とが指摘されていた。さらに、最近、これらの菌種間に
は、７０〜８０％以上のＤＮＡの相同性があることが明
らかにされ、非常に近縁な微生物であることが明白であ
る［Ｋｏｍａｔｓｕ、　Ｙ、：　Ｒｅｐｏｒｔｏｆ　ｔ
ｈｅ　Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｖｅ　Ｒａ５ｅａｒｃｈ　
Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ、　Ｎｏ。

５５、１　（１９８０）　、および、　５ｕｚｕｋｉ、
　Ｋ、、　Ｋａｎｅｋｏ。

Ｔ、、　ａｎｄ　Ｋｏｍａｇａｔａ、　Ｋ、　：　Ｉｎ
ｔ、　Ｊ、　５ｙｓｔ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、。

３１、、１３＋　（＋９８＋）参照）。本発明の有用性
はコリネバクテリウム・グルタミクム誘導株を宿主とし
て示したが上記の事実を踏まえれば、グルタミン酸生産
菌全般にそのまま適用できることが容易に類推される。

組−換えＤＮＡがこれら菌種において安定に保持され、
発現されるためにはＤＮＡの相同性など宿主菌の性質に
おける若干の相違は問題でなく、これら菌種が当該プラ
スミドの自律複製と導入遺伝子の発現を可能ならしめる
機能を有していればよい。しかるに、これらの菌種がこ
の両機能を共有していることは、本発明者らが、先に特
許用＠（特開昭５７−１８３７９９）　したコリネバク
テリウム・グルタミクム２２５−２５０から分離され、
ストレプトマイシンおよび／またはスペクチノマイシン
耐性遺伝子を有するプラスミドｐＣＧ４がコリネバクテ
リウム属およびブレビバクテリウム属菌種など、グルタ
ミン酸生産菌内で同じく複製でき、また、その耐性遺伝
子が発現される（特開昭５ｌ−１８６４９２）ことから
あきらかである。また本発明者が申請した特許（特開昭
５８−１２６７８９）に示す如く、ヒスチジン生産性プ
ラスミドは、コリネバクテリウム・ハーキュリス、ブレ
ビバクテリうム・フラバム、ブレビバクテリウム・ラク
トファーメンタムにおいてその機能を発揮した。従って
、本発明を適用し得る宿主菌としては、コリネバクテリ
ウム・グルタミクムに限らず、コリネバクテリウム属お
よびブレビバクテリウム属菌種を含むグルタミン酸住産
菌全てが包括される。

以下に本発明の実施例を示す。

実施例１゜ （１１染色体ＤＮＡとプラスミツドＤＮＡの調製：大腸
菌（以下Ｅ、ｃｏ目という）ＪＡ１９４株（ｒ’ｒｏｃ
、Ｎａｔｌ、　Ａｃ、ａｄ、　Ｓｃｉ、、９４．４８７
−４９１　（１９７？）　）の染色体ＤＮＡを以下の方
法で調製した。

４００ｍ１のＬ−ｂｒｏｔｈ（バント・　トリプトトン
１０ｇ、バント・イースト・エキス５ｇ。

ＮａＣＡ’　５ｇを水１りに含み、ｐＨ７，０に調整し
た培地、（以下■、Ｂと呼ぶ）に種培養を接種して、３
７℃で振盪培養し、対数後期まで生育させた。培養液か
ら菌体を集菌し、集菌した菌体から奇勝らの方法（Ｓａ
ｉｔｏ、　Ｈ，ｅｔ　ａｌ、二Ｒｉｏｃｈｉｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ、　７２６１９　（＋９６
３）　）に従って高分子染色体ＤＮＡを単離した。

ベクターとして用いるｐＢＲ３２２は、次の方法でその
保有株Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＪＡ１９４株の培養菌体から単
離した。

アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含む４００　ｍ１ＬＢ
に種培養を接種し、３７℃で振盪培養し、対数後期まで
生育させた。培養液より集菌後、菌体を、田中らの方法
（Ｊ、　Ｒａｃｔｅｒｉｏｌ、１２１３５４−３６２（
＋９７５）　）に従い溶菌した。得られた溶菌液を、２
８．０００　ｒｐｒａ、　４℃で１時間遠心し、上滑を
採取シた。」二重音に、１１５容の５０％（Ｗ／Ｖ）ポ
リエチレングリコール（ＰＥＧ）６０００水溶液を加え
、ゆるやかに混合した後、４℃で一夜放置した。生じた
沈澱を、４℃、３０００ｒ　ｐ　ｍ、５分間の遠心で集
め、５ｍｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭＴｒ　ｉ　ｓ　−Ｈ
Ｃｌ、ＩｍＭ　ＥＤＴＡ−Ｎａ２　ｐＨ７，５）に溶解
し、１．５■／ＩＩＩＩ濃度のエチジウムブロマイド１
１を加え、さらにＴＥ緩衝液で正確に７．５ｍｌとした
。この溶液に、ＣｓＣ１７，８７５ｇを加え、完全に溶
解した後、１０５，０００　Ｘ　ｇ　、　２０℃、４０
時間遠心した。紫外線照射下検出されるプラスミソＦバ
ンドを、注射器でぬき取り、１５％のＴＲ（Ｖ／Ｖ）緩
衝液を含む１イソプロパツールで、エチジウムブロマイ
ドを３回抽出した後、４℃で一夜ＴＥ緩衝液に対して透
析し、透析液をプラスミツドＤＮＡとして用いた。

＋２１　ｌｌＡ１１Ｐａｓｅ、　ＣＭａｓｅ、　ＰＤＧ
ａｓｅをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片のクローン
化： 上記で調製したｐＢＲ３２２プラスミドＤＮＡ３μｇを
含む制限酵素ＨｉｎｄｎＴ反応液１００μｌに各々５単
位のＥｃｏＲＴ及びＨｉｎｄｌＴ［（宝酒造社製）を、
また染色体ＤＮＡ９μｇを含む制限酵素Ｈｉ　ｎ　ｄ　
ｉｌ１反応液１００μｌに各々５単位のＥｃｏＲＴ、Ｈ
ｉｎｄｌＴｌ　（宝酒造社製）を加ｔ、それぞれ３７℃
で６０分間反応後６５℃で１０分間加温して反応を停止
させた。両反応液を混合後、この混合物に＝ｒ　４リガ
ーゼ用緩衝液（トリス６６０ｍＭ、Ｍ（ＨＣｆｆ　２６
６ｍＭ、ジチオスレイトール１００ｍＭ、ｐｌ（７，ｆ
ｉ）４０μＬ　ＡＴＰ　（５ｍＭ）４０メツＬ”ｒ４リ
ガーゼ（宝酒造社製、１単位／／／ｆｆ１）０．４μβ
および８２０　１２０μｌを加え、１２℃で１６時間反
応させた。

このリガーゼ反応混合物を形質転換に供した。

形質転換に供する受容菌として、ＤＡＨＰａｓｅを欠損
したＥ、ｃｏｌｉ　ＡＢ３２４Ｂ株（Ｊ、　＋１ａｃｔ
。

！１１．３２３７〜２４４　（＋９６７）　）あるいは
ｔｙｒＡ遺伝子（ＣＭａｓｅ　）を欠損したＥ、　ｃｏ
ｌｉ　Ａｒ１２７３１ｒＡ：　（，１，Ｂａｃｔ、但１
／１９４　（＋９６６＞　）を用いた。種培養を、１、
Ｂに植菌し、Ｍ、　Ｄａｇｅｒｔらの方法（Ｇｅｎｅ。

６　２３〜２８　（１９７９）　）に従って、コンピテ
ントな細胞を調整した。

コンピテントな細胞１（］９／ｍ＋を含む液０．２ｍ！
にリガーセ反応ｌｔＵ合物５０μｌを加え、水冷下１０
分間放置した。次いで３７℃で５分間熱処理した後、１
．、８２　ｍｌを加え、３７℃で９０〜１２０分間静置
した。その後、菌体を生理食塩水で２回遠心洗７？＋後
、各々５０μｇ／ｍｌのヒスチジン、プロリン、アルギ
ニン、イソロイシン、バリンを含むＭ９平板培地ＣＮＨ
４Ｃｉ２　１　ｇ、　Ｎａ　２　ＨＰＯ４６ｇ、ＫＨ２
ＰＯ４３ｇ、Ｎａ（１！　５ｇ。

ＭｇＳＯ４・　７Ｈ２００，１ｇ、ＣａＣｆｆ１２　・
　２Ｈ２００，０５ｇ、グルコース３ｇ、ビタミ７Ｂ１
４■を水１１に含み、ｐ　Ｈ７，０に調整した培地に寒
天１．５％を加えたもの、Ｊ、　Ｂａｃｔ、＋２１３５
４〜３６２　（１９７５）　、）に塗布した。Ｍ９平板
培地に生育したコロニーを各々アンピシリン１００μｇ
／＋ｎ＋。

テトラサイクリン２０μｇ／ｍｌを含むＬＢ平板培地に
塗布し、アンピシリン含有培地で生育し、テトラサイク
リン含有培地で生育しないコロニーを選択した。

このようにして選択したヒスチジン、プロリン。

アルｆニン、イソロイシン、バリンヲ含むＭ９平板培地
で生育し、アンピシリン耐性、　テトラサイクリン感受
性の形質転換株より前記と同様にして、プラスミツドＤ
ＮＡを単離した。形質転換株の一株から得たプラスミツ
ドｐＥａｒｏＦ１を各種制限酵素で消化後、アガロース
ゲル電気泳動で解析した結果、ｐＢＲ３２２の大きい方
のＥｃｏｌｌＩ−）１ｉ１ｎｄ■切断断片に、約４．２
　Ｋ　ｂのＥｃｏＲＩ−旧ｎｄｌｌＴ切断ＤＮＡ断片が
挿入されたプラスミツドであることが判明した。

得られたｐＥａｒｏＦｌを用い、前記と同様の方法でＥ
、ｃｏｌｉ　ＡＢ３２４８およびＥ、　ｃｏｌｉ八Ｔ２
へ７３の雨林を形質転換したところ、両者ともヒスチジ
ン、プロリン、アルギニン、イソロイシン、バリンを含
むＭ９培地で生育し、同時にアンピシリン耐性となり、
それらは、Ｉ）　Ｅ　ａ　１・ＯＩパ１と同一のブラス
ミ・ノドを有してむ）ること力＜牢１ｊ明した。

ｋｌ　＋二の結果は、ｐ　Ｅ　ａ　ｒ　ｏ　Ｆ　１にク
ローン化された約４．２　Ｋ　ｂのｒ）Ｎへ断片上には
、ＤＡＨＰａｓｅ、ＣＭａｓｃ、ＰＤＧａｓｅをコード
する遺伝子が存在することを示している。

さらに、ｐＥａｒｏＦｌは、第１図に示す様なＥｃ　ｏ
　Ｉ？　Ｉ　、Ｂ　ａ　ｍ　ＨＴ　、　Ｈｉ　ｎ　ｄ　
Ｉｎなどの各種制限酵素の切断点を有し、Ｇ、　Ｚｕｒ
ａｗｓｋｉらの報告している（Ｉ’ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ
、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７５４２７１（１
９７８）　）プラスミツドｐ　Ｋ、Ｂ　４５との比較よ
り、ｐＥａｒｏＦＩに挿入されている約４．２　Ｋ　ｂ
のＤＮＡ断片−にには、Ｅ、　ｃｏｌｔのａｒｏＦ、ｔ
ｙｒＡ。

ｐｈａΔ遺伝子が存在することが判明した６ｆ３１　ａ
　ｒ　ｏ　Ｆ　ｔ　ｙ　ｒ　Ａ遺伝子のサブクローン化
：上記でｇ製したプラスミツドｐＥａｒｏＦＩＩＮＮへ
より、ａｒｏＦｔｙｒＡ逍伝子部分のＤ遺伝断片を取得
し、Ｅ、　ｃｏｌｔ　、コリネバクテリウム・グルタミ
クムの共用ベクターｐｃＥ５１に連結する。

ｐｃＥ５１は本発明者らが先に特許出願したコリネバク
テリウム・グルタミクムのプラスミツドｐｃＧｉ　（特
開昭５７−１３４５００）とＨ，ｃｏｌｔのプラスミツ
ドＩ）　ＧＡ　２２　（Ａ　ｎ、　Ｇ、　ｅｔ旦：Ｊ、
　ｆｌａｃｔｅｒｉｏｌ、　）　１４０．４００　（１
９７９）参照〕を和合連結せしめたプラスミツドである
。詳しくはｐｃＧｌ上に１カ所しかないＢｇβ■切断部
位とｐＧΔ２２のカナマイシン耐性遺伝子を含むＲａｍ
Ｈｒ断片とを両制限酵素の同一接着末端を利用して連結
したものである。

実際には、本発明者らが先に特許出願した方法（特開昭
５８−１０５９９９．同５８−１２６７８９）により作
成することができる。

プラスミツドｐＢａｒｏＦＩ　ＤＮＡ　３μｇを含む制
限酵素）（ｉｎｃＩＩ反応液１００μｐに５単位の）（
ｉｎｃＨ（宝酒造社製）を加え、３７℃６０分間反応さ
せた。また、ｐｃＥ５１を保有するＥ、　ｃｏｌｉ　Ｊ
Ａ　１９４株より前記と同様にして調製したプラスミツ
ドｐｃＩ７：５１　ＤＮＡ　３μｇを含む制函酵素ｆｆ
ｒｎｃＨ反応液１００ｔｔｌに０．３単位のＨ４ｎｃＵ
を加え、３７℃で６０分間反応させ、ｐｃＥ５１上に２
カ所ある１ｌｉｎｃＩＴ切断部位のうち、−カ所のみで
切断した。反応後、両反応液を混合後、この混合物にＴ
４リガーゼ用緩衝液（トリス６６０ｍＭ、ＭｇＣｊ＋２
６６　ｍＭ。

グチオスｌレイトールｌｏＯｍＭ、［）８　７．６）４
０１１ＣＡＴＰ　（５ｍＭ）４０ｔＪＩ！、Ｔ４リガー
ゼ（宝酒造社製、１単位／１１１１）０．４μβおよび
Ｈ２Ｏ１２０／７７！を加え、１２℃で１６時間反応さ
せた。反応後、６５℃で１０分間加温して反応をｒｆ’
　＋Ｉ：さセた。

このリガーゼ反応混合物を形質転換に供する。

形質転換に供する受容菌として、　［！、ｃｏｌｉ　Ａ
３３２４８株を用いる。前記と同様にして形質転換を行
い、ヒスチジン、プロリン、アルギニン、イソロイシン
、バリンを含むＭ９平板培地で生育するコロニーを得た
。得られたコロニーから、カナマイシン２０μｇ／ｍｌ
を含有するＬＢ平板培地で生育するコロニーを選択した
。

このようにして得た、ヒスチジン、プロリン。

アルギニン、イソロイシン、バリンを含むＭ９平板培地
で生育し、カナマイシン耐性の形質転換株より、前記と
同様に、プラスミツドＤＮＡを単離した。形質転換株の
１株から得られたプラスミツドｐ　Ｋ　ｍ　１　；ｌ　
ｒ　ｏ　Ｆ　１を各種制限酵素で消化後、アガロースゲ
ル電気泳動で解析した結果、ｐＣＥ５１の一方のＨｉ　
ｎ　ＣＩＩ切断部位に、約３．８　Ｋ　ｂのｐＥａｒｏ
ＦｌのａｒｏＦ、ｔｙｒＡを含む）１ｉｎｃｌＴ切断Ｄ
ＮＡ断片が挿入されたプラスミツドであることが判明し
た。

以上の様にして得られたプラスミツドｐ　Ｋ　ｍ　１ａ
ｒｏＦ１は、第２図の様な各種制限酵素の切断パターン
を有する。

（４１ｐＫｍｌａｒｏＦ１保有株からのチロシンおよび
チロシンアナログ耐性プラスミノＦｐＫｍｌａｒｏＦｌ
−ｍ−１８の取得： ｐＫｍｌａｒｏＦｌを保有するＡ３３２４８株を、カナ
マイシン２０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地で対数増殖の後
期まで増殖させた。菌体を５０ｍＭトリス・マレイン酸
緩衝液（ｐ　Ｈ６，０）で２同遠心洗浄後、Ｎ−メチル
−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン４００μｇ／
ｍｌを含む５０ｍＭトリス・マレイン酸緩衝液（ｐＨ６
，０）中で、室温で３０分間処理した。処理菌体を５０
ｍＭ１・リス・マレイン酸緩衝液（ｐＨ６，０）で２回
遠心洗浄後、洗浄菌体をカナマイシン２０μｇ／ｍ＋を
含むＬ　Ｂ　培地中、３０℃で１６時間培養し、前記と
同様の方法でプラスミドＤＮＡを単離した。

単離したプラスミドを用い、Ｅ、　ｃｏＨ八Ｂへ３２４
８株を前記と同様の方法で形質転換した。形質転換株の
選択は、チロシン０．２５■／ｍ＋、各々５０μｇ／ｌ
ＷＩのヒスチジン、プロリン、アルギニン、イソロイシ
ン、バリンを含むＭ９平板培地上で行った。

出現したコロニーから、チロシンの０．２５■、／ｍｌ
。

ヒスチジン、プロリン、アルギニン、イソロイシン、バ
リン各々５０μｇ／ｍ＋を含むＭ９平板培地およびカナ
マイシン２０Ｉノｇ／ｍ＋を含むＬ　Ｂ平板培地−ヒで
生育できるコロニーを選択した。

このようにして得たコロニーは、また同時にチロシンア
ナログである３−アミノチロシン（３ＡＴ）　（Ｓｉｇ
ｍａ社製）０．２ｍｇ／ｍｌおよびヒスチジン。

プロリン、アルギニン、イソロイシン、ツマリン各々５
０μｇ／ｍ＋を含むＭ９平板培地上で生育でき、３ＡＴ
耐性であることが判明した。

このようにして得た形質転換株から得たブラスミ、ドは
、細菌にチロシンまたはチロシンアナログ耐性を与える
ことができる。このようなプラスミツドの１つｐＫｍｌ
ａｒｏＦ−ｍ−１８を有するＥ、ｃｏ１ｉ八Ｐ、へ２４
８株は、チロシン１＝ｗ／ｍｌあるいは３　Ａ　Ｔ’０
．５　ｍｇ／　ｍｌと、５０．ｃｏｇ／ｍｌのヒスチジ
ン、プロリン、アルギニン、インロイシン。

バリンを含むＭ９平板培地で生育が可能である。

ｆ５１ｐＫｍｌａｒｏＦ１．ｐＫｍｌａｒｏＦＩ　−ｍ
−１８によるコリネバクテリウム・グルタミクムに４３
の形質転換： ５０ｇｇ／ｍＩのフェニルアラニンを含む半合成培地Ｓ
ＳＭ（グルコース２０ｇ、（ＮＨａ）２ｓｏ４１０ｇ、
尿素３ｇ、酵母エキスＩｆｆ。

ＫＨ２ＰＯａ　Ｉ　ｇ１ＭｇＣｊ！　２・６Ｈ２００，
４ｇ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２０１０ｍｇ、ＭｎＳＯ４・４
〜６Ｈ２００，２１Ｗ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２００，９＋
＋＋ｇ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２００，４＋ｗ、Ｎａ２Ｂ４
０７　・１０Ｈ２００，０９■、（ＮＨ４）６Ｍ０７０
謳・４Ｈ２０−０，０４■、ビオチン３０μｇ、サイア
ミン塩酸塩１■を水１１に含みｐＨ７，２に調整した培
地〕にコリネバクテリウム・グルタミクムＩ（４３（Ｆ
ＥＲＭ　Ｐ−７１６２）種培養を接種して３０℃で振盪
培養した。種培養はＮＢ培地（粉末ブイヨン２０ｇ、酵
母エキス５ｇを水１１に含みｐＨ１，２に調整した培地
）を用いた。東京光電比色針で６６０ｎｍにおける吸光
度（ＯＤ）を測定し、ＯＤ　０．２になった時点で培養
液中０．５単位／ｍｌの濃度となるようにペニシリンＧ
を添加した。さらに培養を継続しＯＤ約０．６になるま
で生育さゼた。

ＯＤ　０．６になった時点で集菌し、細胞をＲＣＧＰ培
地〔グルコース５ｇ、カザミノ酸５ｇ、酵母エキス２．
５ｇ、に２ＨＰ○ａ　３．５ｇ、ＫＨ２ＰＯ４１，５ｇ
、ＭｇＣｌ！２−６Ｈ２００，４１ｇ、Ｆｅ５ｏ４−７
Ｈ２０１０ＩＫｒ、Ｍｎ５Ｏａ　・４〜６Ｈ２０２ｍｇ
、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２００，９ｗ＋（ＮＨ，ｌｌ　）　
６　Ｍｏ　７０漠・４Ｈ２００，０４■。

ビオチン３０ｔｔｇ、　サイアミン塩酸塩２■、コノ１
り酸二ナトリウム１３５ｇ、ポリビニルピロリドン（分
子ｆｆ１１０．０００）　３０　ｇを水１１に含む培地
〕に１■／ｍ！のりゾチームを含む液（ｐＨ７，６）に
約１０３細胞／ｍ＋となるように懸濁し、Ｌ型試験管に
移して３０°Ｃで５時間緩やかに振盪反応してプロトプ
ラスト化した。

このプロトプラスト懸濁液０．５ｍｌを小試験管にとり
２５００×ｇで５分間遠心分離し、７３ＭＣ緩衝液（１
０ｍＭ塩化マグネシウム、３０ｍＭ塩化カルシウム、５
９ｍＭ）リス、４００ｍＭシヨ糖、ｐＨ７，５）１ｍｌ
に再懸濁して遠心洗浄後、ＴＳＭＣ緩衝液０．１ｍｌに
再懸濁し゛た。この懸濁液に２倍濃度の７３ＭＣ緩衝液
と上記プラスミ・ノドＤＮＡの１対１混合？＆　１００
μｌを加えて混和し、次いで７５ＭＣ緩衝液中に２０％
ＰＥＧ６．０００を含む液０．８ｍｌを添加して混合し
た。プラスミツドＤＮＡ　ｐＫｍＪａｒｏＦＩ、ｐＫｍ
ｌａｒ。

Ｆｌ−ｍ−１８は、これらを保有する大腸菌Ａ３３２４
８株より」二連の如＜ｍｗａした。３分後、ＲｃＧＰ培
地（ｐＨ７，２３２＋ｗｌを添加し、２．５００×ｇで
５分間遠心分離にかけて上清を除去し、沈降したプロト
プラストをＩＩＩＩｌのＲＣＧＰ培地に懸培養した。こ
のようにして、選択プレート上に生育したカナマイシン
耐性コロニーを得た。

（６）形質転換株によるチロシンの生産二上記のように
して得られたｐ　Ｋ　ｍ　Ｉ、　ａ　ｒ　ｏ　Ｆ　１　
＋ｐＫｍｌａｒｏＦ１−ｍ−１８を保有する形質転換株
は、微工研にＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕ
ｔａｍｔｃｕｍＫ４４．ＦＥＲＭ　Ｐ−７１６３および
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｊｃｕ
ｍ　Ｋ　４５　、Ｆ　Ｅ　ＲＭＰ−７１６４としてそれ
ぞれ寄託されている。

ｐＫｍｌａｒｏＦｌ、ｐＫｍｌａｒｏＦｌ　−ｍ−１８
保有株によるし一チロシン生産試験を下記のとおり行う
。

菌株をＮＢ液液体油地中３０℃、１６時間振盪培養した
菌液０．５　ｍｌを５ｍｌの生産培地Ｐ４（廃糖蜜１０
０ｇ／／、（ＮＨ４）２３０４　２０ｇ／ｊ！　、　Ｋ
　Ｈ２Ｐ　Ｏａ　０．５　ｇ　／　ｊ！　、Ｋ　２　Ｈ
Ｐ　Ｏ４０，５ｇ／Ｉｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，２
５ｇ／ｌ！　、Ｃａ　ＣＯ３２０ｇ　／　１　、ｐＨ１
，２）に０．２５％のＮＺアミンを添加した培地の入っ
た試験管に植宿し、３０℃で９６時間振盪培養した。

培養後、培養液１１に６’Ｎ　ＮａＯＨ溶液を５０７１
ρ加え、６５℃で５分間加熱し、析出しているチロシン
を完全に溶解させた後、培養濾液をペーパークロマトグ
ラフィーにかけ、ニンヒドリン発色後、比色定量して、
Ｌ−チロシンの生成量を測定した。

対照として、コリネバクテリウム・グルタミクムに４３
株を同様に処理した。

結果を第１表に示す。

第１表 に４４　５．３ に４５　７．７

【図面の簡単な説明】

第１図は、プラスミツドｐＥａｒｏＦ−１の制限酵素切
断パターンを示す。 第２図は、プラスミツドｐＫｍｌａｒｏＦ１の制限酵素
切断パターンを示す。 第１．２図中、横の矢印は遺伝子の転写される方翻ル妄
ｌプふス− 手続補正書 １．事件の表示 昭和−５８年特許願第１４２８０４号 ２、発明の名称 チロシンの製造法 ３、補正をする者 事件との関係−特許出願人 郵便番号　１００ 住　所　東京都千代田区大手町−丁目６番１号名　称　
（１０２）協和醗酵工業株式会社明細書の発明の詳細な
説明の欄および特許請求の範囲の欄 の後にｒ（ＦＥＲＭ　ＢＰ−４５７）Ｊを加入する。 （３）明細書第２８頁１２行目のｒＰ−７１６３Ｊの後
にｒ（ＦＥＲＭ　ＢＰ−４５８）Ｊを加入する。 （４）明細書第２８頁１４行目のｒＰ−７１６４Ｊの後
にｒ（ＦＥＲＭ　ＢＰ−４６０）Ｊを加入する。 （５）特許請求の範囲を別紙のとおり訂正する。 特許請求の範囲 （１）チロシンの生成に関与する遺伝子を含むＤＮＡ断
片とベクターＤＮＡとの組換え体ＤＮＡを用いコリネバ
クテリウム属またはブレビバクテリウム属に属する微生
物から選ばれる宿主菌株を形質転換して得られる形質転
換株を培地に培養し、培養物中にチロシンを生成蓄積せ
しめ、該培養物からチロシンを採取することを特徴とす
るチロシンの製造法。 （２）該遺伝子を含むＤＮＡ断片が、原核生物、ウィル
ス、バクテリオファージまたはプラスミド由来であるこ
とを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の方法。 （３）該原核生物が細菌であることを特徴とする特許請
求の範囲第２項記載の方法。 （４）該細菌がエッシエリヒア属、コリネバクテリウム
属、ブレビバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、バ
チルス属、スタフィロコッカス属。 ストレプトコツカス属およびセラチア属から選ばれるこ
とを特徴とする特許請求の範囲第３項記載の方法。 （５）該ＤＮＡ断片が３−デオキシ−２−ケトーＤ−ア
ラビノ−へブツロソン酸７−ホスフェート合成酵素、コ
リスミン酸ミュターゼ、プレフェネートデヒドロゲナー
ゼまたはプレチロシンアミノトランスフェラーゼの遺伝
子を含むことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の
方法。 （６）該ＤＮＡ断片が細菌にチロシンまたはチロシンア
ナログ耐性を与えることを特徴とする特許請求の範囲第
５項記載の方法。 （７）該チロシンアナログが３−アミノチロシンである
ことを特徴とする特許請求の範囲第６項記載の方法。 （８）該ベクターがコリネバクテリウム属またはブレビ
バクテリウム属細菌中で自律複製できる微生物由来のプ
ラスミド、ファージまたはその誘導体であることを特徴
とする特許請求の範囲第１項記載の方法。 （９）該プラスミドふよびその誘導体がコリネバクテリ
ウム属に属する微生物由来のｐｃＧｌ、ｐＣＧ２．ｐＣ
Ｇ４．ｐｃＥ５１．　ｐＣＥ５２゜ｐＣＥ５３．ｐＣＥ
５４．ｐｃＧｌｌまたはｐＣＢ　１０１と名付けたプラ
スミドであることを特徴とする特許請求の範囲第８項記
載の方法。 αＯ該宿主菌株がコリネバクテリウム属またはブレビバ
クテリウム属に属し、かつリゾチーム感受性であること
を特徴とする特許請求の範囲第１項記載の方法。 （１１）該宿主菌株がコリネバクテリウム・グルタミク
ム、コリネバクテリウム・ハーキニリス、ブレビバクテ
リウム・フラバム、ブレビバクテリウム・ラクトファー
メンタムまたはその誘導線であることを特徴とする特許
請求の範囲第１項記載の方法。 （１２）エッシエリヒア属、コリネバクテリウム属また
はブレビバクテリウム属に属する微生物由来のチロシン
生成に関与する遺伝子を含むＤＮＡ断片とベクターＤＮ
Ａとの組換え体を含むコリネバクテリウム属またはブレ
ビバクテリウム属に属する微生物。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１１チロシンの生成に関与する遺伝子を含むＤＮＡ断
   片とベクターＤＮＡとの矧換え体ＤＮＡを用いコリネバ
   クテリウム属またはブレビバクテリウム属に属する微生
   物から選ばれる宿主菌株を形質転換して得られる形質転
   換株を培地に培養し、培養物中にチロシンを生成蓄積せ
   しめ、該培養物からチロシンを採取することを特徴とす
   るチロシンの製造法。 （２）該遺伝子を含むＤＮＡ断片が、原核生物、ウィル
   ス、バタテリオファージまたはプラスミド由来であるこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の方法。 （３）該原核生物が細菌であることを特徴とする特許請
   求の範囲第２項記載の方法。 （４）　該細菌がエソシエリヒア属、コリネバクテリウ
   ム属、ブレビバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、
   バチルス属、スタフィロコッカス属。 ストレプトコツカス属およびセラチア属から選ばれるこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第３項記載の方法。 （５）該ＤＮＡ断片が３〜デオキシ〜２−ケトーＤ−ア
   ラビノ−へプッロソ７１−７−ホスフヱート合成酵素、
   コリスミン酸ミュターゼ、プレフェネートデヒドロゲナ
   ーゼまたはプレチロシンアミノトランスフェラーゼの遺
   伝子を含むことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載
   の方法。 （６）該ＤＮＡ断片が細菌にチロシンまたはチロシンア
   ナログ耐性を与えることを特徴とする特許請求の範囲第
   ５項記載の方法。 （７）　該チロシンアナログが３−アミノチロシンであ
   ることを特徴とする特許請求の範囲第６項記載の方法。 （８）該ベクターがコリネバクテリウム属またはブレビ
   バクテリウム属細菌中で自律複製できる微生物由来のプ
   ラスミド、ファージまたはその誘導体であることを特徴
   とする特許請求の範囲第１項記載の方法。 （９）　該プラスミドおよびその誘導体がコリネバクテ
   リウム属に属する微生物由来のｐｃＧｌ、ｐＣＧ２．ｐ
   ＣＧ４．ｐｃＥ５１．ｐＣＥ５２’。 ｐＣＥ５３．ｐＣＥ５４．ｐｃＧｌ、１またはｐｃＢｌ
   ｏｌと名付けたプラスミドであることを特徴とする特許
   請求の範囲第８項記載の方法。 （１功　該宿主菌株がコリネバクテリウム属またはブレ
   ビバクテリウム属に属し、かつリゾチーム感受性である
   ことを特徴とする特１！ｆｌｉｌ求の範囲第１項記載の
   方法。 ｒｌＤ　該宿主菌株がコリネバクテリウム・グルタミク
   ム、コリネバクテリウム・ハーキュリス、ブレビバクテ
   リウム・フラバム、ブレビバクテリウム・ラクトファー
   メンタムまたはその誘導株であることを特徴とする特許
   請求の範囲第１項記載の方法。 ０２１　コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウ
   ム属に属する微生物由来のチロシン生成に関与する遺伝
   子を含むＤＮＡ断片とベクターＤＮＡとの組換え体を含
   むコリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属に
   属する微生物。 ０で　コリネバクテリウム・グルタミクムに４４００　
   コリネバグチリウム・グルタミクムに４５