JP2000287695A - シキミ酸の製造法 - Google Patents
シキミ酸の製造法Info
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- JP2000287695A JP2000287695A JP2000079001A JP2000079001A JP2000287695A JP 2000287695 A JP2000287695 A JP 2000287695A JP 2000079001 A JP2000079001 A JP 2000079001A JP 2000079001 A JP2000079001 A JP 2000079001A JP 2000287695 A JP2000287695 A JP 2000287695A
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- shikimic acid
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- bacillus
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- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
- C12P7/42—Hydroxy-carboxylic acids
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 直接発酵法によるシキミ酸を製造する方法及
び同方法に用いる微生物を提供する。 【解決手段】シキミ酸キナーゼ活性を欠損し、さらに細
胞中の３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソン酸−
７−リン酸合成酵素が増強され、かつ、シキミ酸生産能
を有するバチルス属細菌を培地で培養し、シキミ酸を培
地中に生成蓄積させ、該培地よりシキミ酸を採取するこ
とにより、シキミ酸を製造する。
び同方法に用いる微生物を提供する。 【解決手段】シキミ酸キナーゼ活性を欠損し、さらに細
胞中の３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソン酸−
７−リン酸合成酵素が増強され、かつ、シキミ酸生産能
を有するバチルス属細菌を培地で培養し、シキミ酸を培
地中に生成蓄積させ、該培地よりシキミ酸を採取するこ
とにより、シキミ酸を製造する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、シキミ酸の製造法
に関する。シキミ酸は、フェニルアラニン、チロシン、
トリプトファン、ｐ−アミノ安息香酸、ｐ−ヒドロキシ
安息香酸等の芳香族化合物合成の中間体等として有用で
ある。また、シキミ酸は廃棄物処理材の成分等として用
いられている。
に関する。シキミ酸は、フェニルアラニン、チロシン、
トリプトファン、ｐ−アミノ安息香酸、ｐ−ヒドロキシ
安息香酸等の芳香族化合物合成の中間体等として有用で
ある。また、シキミ酸は廃棄物処理材の成分等として用
いられている。
【０００２】
【従来の技術】芳香族中間体であるシキミ酸は、ホスホ
エノールピルビン酸とエリスロース−４−リン酸から、
４つの酵素反応を経て合成される。これら４つの酵素
は、バチルス・ズブチリスではａｒｏＡ、ａｒｏＢ、ａ
ｒｏＣおよびａｒｏＤによって、コードされている。シ
キミ酸は、さらにａｒｏＩ、ａｒｏＥおよびａｒｏＦに
よってコードされる３つの酵素による反応でコリスミン
酸に変換される。このホスホエノールピルビン酸及びエ
リスロース−４−リン酸からコリスミン酸に至る経路は
シキミ酸経路と呼ばれている。シキミ酸経路は、芳香族
アミノ酸であるＬ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラ
ニン及びＬ−チロシンの生合成の共通経路として知られ
ている。
エノールピルビン酸とエリスロース−４−リン酸から、
４つの酵素反応を経て合成される。これら４つの酵素
は、バチルス・ズブチリスではａｒｏＡ、ａｒｏＢ、ａ
ｒｏＣおよびａｒｏＤによって、コードされている。シ
キミ酸は、さらにａｒｏＩ、ａｒｏＥおよびａｒｏＦに
よってコードされる３つの酵素による反応でコリスミン
酸に変換される。このホスホエノールピルビン酸及びエ
リスロース−４−リン酸からコリスミン酸に至る経路は
シキミ酸経路と呼ばれている。シキミ酸経路は、芳香族
アミノ酸であるＬ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラ
ニン及びＬ−チロシンの生合成の共通経路として知られ
ている。
【０００３】シキミ酸は、従来植物から得られており、
微生物の直接発酵によっては製造されていない。ところ
で、アミラーゼ欠損株として知られていたバチルス・ズ
ブチリス１−１１８株（ａｒｏＩ１１６，ａｍｙ４）
は、ａｒｏＩ遺伝子に変異を有することが知られている
（Yuki, S., Japan. J. Genetics, 50 (2), 155-157 (1
975)）が、この株がシキミ酸を産生することは知られて
いない。また、バチルス・ズブチリスＳＢ１３０株（ａ
ｒｏＥ１３０，ｈｉｓＨ３２）は、５−エノールピルビ
ルシキミ酸−３−リン酸合成酵素（EC:2.5.1.19）をコ
ードするａｒｏＥ遺伝子に変異を有することが知られて
いるが、同株がシキミ酸を産生することは知られていな
い。
微生物の直接発酵によっては製造されていない。ところ
で、アミラーゼ欠損株として知られていたバチルス・ズ
ブチリス１−１１８株（ａｒｏＩ１１６，ａｍｙ４）
は、ａｒｏＩ遺伝子に変異を有することが知られている
（Yuki, S., Japan. J. Genetics, 50 (2), 155-157 (1
975)）が、この株がシキミ酸を産生することは知られて
いない。また、バチルス・ズブチリスＳＢ１３０株（ａ
ｒｏＥ１３０，ｈｉｓＨ３２）は、５−エノールピルビ
ルシキミ酸−３−リン酸合成酵素（EC:2.5.1.19）をコ
ードするａｒｏＥ遺伝子に変異を有することが知られて
いるが、同株がシキミ酸を産生することは知られていな
い。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、直接発酵法
によるシキミ酸を製造する方法及び同方法に用いる微生
物を提供することを課題とする。
によるシキミ酸を製造する方法及び同方法に用いる微生
物を提供することを課題とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題を
解決するために鋭意研究を行った結果、欠陥のあるシキ
ミ酸キナーゼを保持するバチルス・ズブチリスは、シキ
ミ酸を蓄積することを明らかにした。そして、３−デオ
キシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソン酸−７−リン酸合成
酵素（以下、「ＤＡＨＰ合成酵素」ともいう）の活性、
及びシキミ酸脱水素酵素活性を増強することにより、同
細菌のシキミ酸生産性を改善することに成功した。ま
た、活性なシキミ酸キナーゼを保持するバチルス・ズブ
チリスであっても、ａｒｏＥ産物である５−エノールピ
ルビルシキミ酸−３−リン酸合成酵素の活性を欠損する
ことによってシキミ酸生産能を示すこと、及び、さらに
シキミ酸脱水素酵素の活性を増強することによって、そ
のシキミ酸生産能が向上することを見出した。すなわち
本発明は、以下のとおりである。
解決するために鋭意研究を行った結果、欠陥のあるシキ
ミ酸キナーゼを保持するバチルス・ズブチリスは、シキ
ミ酸を蓄積することを明らかにした。そして、３−デオ
キシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソン酸−７−リン酸合成
酵素（以下、「ＤＡＨＰ合成酵素」ともいう）の活性、
及びシキミ酸脱水素酵素活性を増強することにより、同
細菌のシキミ酸生産性を改善することに成功した。ま
た、活性なシキミ酸キナーゼを保持するバチルス・ズブ
チリスであっても、ａｒｏＥ産物である５−エノールピ
ルビルシキミ酸−３−リン酸合成酵素の活性を欠損する
ことによってシキミ酸生産能を示すこと、及び、さらに
シキミ酸脱水素酵素の活性を増強することによって、そ
のシキミ酸生産能が向上することを見出した。すなわち
本発明は、以下のとおりである。
【０００６】（１）シキミ酸キナーゼ活性を欠損し、シ
キミ酸生産能を有するバチルス属細菌を培地で培養し、
シキミ酸を培地中に生成蓄積させ、該培地よりシキミ酸
を採取することを特徴とするシキミ酸の製造法。 （２）前記細菌がバチルス・ズブチリスである（１）記
載の方法。 （３）前記細菌は、細胞中のシキミ酸脱水素酵素活性が
増強されていることを特徴とする（１）記載の方法。 （４）前記シキミ酸脱水素酵素活性の増強が、シキミ酸
脱水素酵素をコードする遺伝子のコピー数を高めるこ
と、同遺伝子の発現調節配列の強化、又は同遺伝子の染
色体ＤＮＡへの組み込みによるものである（３）記載の
方法。 （５）固有のプロモーターが他の遺伝子のプロモーター
に置換されるか、又は、他の遺伝子のプロモーターが追
加されたシキミ酸脱水素酵素遺伝子が染色体ＤＮＡに組
み込まれた（４）記載の方法。 （６）前記細菌は、さらに細胞中の３−デオキシ−Ｄ−
アラビノ−ヘプツロソン酸−７−リン酸合成酵素が増強
されていることを特徴とする（３）記載の方法。
キミ酸生産能を有するバチルス属細菌を培地で培養し、
シキミ酸を培地中に生成蓄積させ、該培地よりシキミ酸
を採取することを特徴とするシキミ酸の製造法。 （２）前記細菌がバチルス・ズブチリスである（１）記
載の方法。 （３）前記細菌は、細胞中のシキミ酸脱水素酵素活性が
増強されていることを特徴とする（１）記載の方法。 （４）前記シキミ酸脱水素酵素活性の増強が、シキミ酸
脱水素酵素をコードする遺伝子のコピー数を高めるこ
と、同遺伝子の発現調節配列の強化、又は同遺伝子の染
色体ＤＮＡへの組み込みによるものである（３）記載の
方法。 （５）固有のプロモーターが他の遺伝子のプロモーター
に置換されるか、又は、他の遺伝子のプロモーターが追
加されたシキミ酸脱水素酵素遺伝子が染色体ＤＮＡに組
み込まれた（４）記載の方法。 （６）前記細菌は、さらに細胞中の３−デオキシ−Ｄ−
アラビノ−ヘプツロソン酸−７−リン酸合成酵素が増強
されていることを特徴とする（３）記載の方法。
【０００７】（７）前記３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−
ヘプツロソン酸−７−リン酸合成酵素活性の増強が、３
−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソン酸−７−リン
酸合成酵素をコードする遺伝子のコピー数を高めるこ
と、同遺伝子の発現調節配列の強化、又は同遺伝子の染
色体ＤＮＡへの組み込みによるものである（６）記載の
方法。 （８）シキミ酸キナーゼ活性を欠損し、かつ、細胞中の
シキミ酸脱水素酵素活性が増強され、シキミ酸生産能を
有するバチルス属細菌。 （９）さらに、細胞中の３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−
ヘプツロソン酸−７−リン酸合成酵素活性が増強された
（８）記載の細菌。 （１０）細胞中の５−エノールピルビルシキミ酸−３−
リン酸合成酵素活性を欠損し、かつ、シキミ酸生産能を
有するバチルス属細菌を培地で培養し、シキミ酸を培地
中に生成蓄積させ、該培地よりシキミ酸を採取すること
を特徴とするシキミ酸の製造法。 （１１）前記細菌がバチルス・ズブチリスである（１
０）記載の方法。 （１２）前記細菌は、さらに、シキミ酸脱水素酵素活性
が増強されていることを特徴とする（１０）記載の方
法。 （１３）前記シキミ酸脱水素酵素活性の増強が、シキミ
酸脱水素酵素をコードする遺伝子のコピー数を高めるこ
と、同遺伝子の発現調節配列の強化、又は同遺伝子の染
色体ＤＮＡへの組み込みによるものである（１２）記載
の方法。 （１４）細胞中の５−エノールピルビルシキミ酸−３−
リン酸合成酵素活性を欠損し、かつ、シキミ酸脱水素酵
素活性が増強され、シキミ酸生産能を有するバチルス属
細菌。 本発明において、「シキミ酸生産能を有する」とは、本
発明のバチルス属細菌を培地に培養したときに、培地中
にシキミ酸を蓄積する能力を有することをいう。
ヘプツロソン酸−７−リン酸合成酵素活性の増強が、３
−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソン酸−７−リン
酸合成酵素をコードする遺伝子のコピー数を高めるこ
と、同遺伝子の発現調節配列の強化、又は同遺伝子の染
色体ＤＮＡへの組み込みによるものである（６）記載の
方法。 （８）シキミ酸キナーゼ活性を欠損し、かつ、細胞中の
シキミ酸脱水素酵素活性が増強され、シキミ酸生産能を
有するバチルス属細菌。 （９）さらに、細胞中の３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−
ヘプツロソン酸−７−リン酸合成酵素活性が増強された
（８）記載の細菌。 （１０）細胞中の５−エノールピルビルシキミ酸−３−
リン酸合成酵素活性を欠損し、かつ、シキミ酸生産能を
有するバチルス属細菌を培地で培養し、シキミ酸を培地
中に生成蓄積させ、該培地よりシキミ酸を採取すること
を特徴とするシキミ酸の製造法。 （１１）前記細菌がバチルス・ズブチリスである（１
０）記載の方法。 （１２）前記細菌は、さらに、シキミ酸脱水素酵素活性
が増強されていることを特徴とする（１０）記載の方
法。 （１３）前記シキミ酸脱水素酵素活性の増強が、シキミ
酸脱水素酵素をコードする遺伝子のコピー数を高めるこ
と、同遺伝子の発現調節配列の強化、又は同遺伝子の染
色体ＤＮＡへの組み込みによるものである（１２）記載
の方法。 （１４）細胞中の５−エノールピルビルシキミ酸−３−
リン酸合成酵素活性を欠損し、かつ、シキミ酸脱水素酵
素活性が増強され、シキミ酸生産能を有するバチルス属
細菌。 本発明において、「シキミ酸生産能を有する」とは、本
発明のバチルス属細菌を培地に培養したときに、培地中
にシキミ酸を蓄積する能力を有することをいう。
【０００８】
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のシキミ酸の製造法に用いるバチルス属細菌の第
一の態様は、シキミ酸キナーゼ活性を欠損したバチルス
属細菌である。バチルス属細菌としては、バチルス・ズ
ブチリス、バチルス・アミロリケファシエンス等が挙げ
られる。
本発明のシキミ酸の製造法に用いるバチルス属細菌の第
一の態様は、シキミ酸キナーゼ活性を欠損したバチルス
属細菌である。バチルス属細菌としては、バチルス・ズ
ブチリス、バチルス・アミロリケファシエンス等が挙げ
られる。
【０００９】シキミ酸キナーゼ活性を欠損したバチルス
属細菌としては、シキミ酸キナーゼの活性を実質的に完
全に欠損した変異株、又は野生株に比べてシキミ酸キナ
ーゼの活性が有意に低下した変異株が挙げられる。ま
た、染色体上のシキミ酸キナーゼをコードする遺伝子
（ａｒｏＩ）が相同組換えにより破壊されたものであっ
てもよい。バチルス属細菌のシキミ酸キナーゼを欠損さ
せるには、バチルス属細菌を従来知られている方法によ
って変異処理し、同酵素をコードする遺伝子（aroI）に
変異を有する変異株を選択すればよい。変異処理として
は、バチルス属細菌を紫外線照射またはN−メチル−N'
−ニトロ−N−ニトロソグアニジン（NTG）もしくは亜硝
酸等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処
理する方法が挙げられる。
属細菌としては、シキミ酸キナーゼの活性を実質的に完
全に欠損した変異株、又は野生株に比べてシキミ酸キナ
ーゼの活性が有意に低下した変異株が挙げられる。ま
た、染色体上のシキミ酸キナーゼをコードする遺伝子
（ａｒｏＩ）が相同組換えにより破壊されたものであっ
てもよい。バチルス属細菌のシキミ酸キナーゼを欠損さ
せるには、バチルス属細菌を従来知られている方法によ
って変異処理し、同酵素をコードする遺伝子（aroI）に
変異を有する変異株を選択すればよい。変異処理として
は、バチルス属細菌を紫外線照射またはN−メチル−N'
−ニトロ−N−ニトロソグアニジン（NTG）もしくは亜硝
酸等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処
理する方法が挙げられる。
【００１０】また、バチルス属細菌のaroI変異株は、す
でに取得されているバチルス属細菌のaroI変異株を用い
た遺伝子変換（gene conversion）により、取得するこ
とができる。すなわち、aroI遺伝子に変異を有する変異
株と、クローン化された野生型aroI遺伝子を含むプラス
ミドを用いた遺伝子変換により、前記プラスミド上の野
生型aroI遺伝子を変異型aroI遺伝子に変換する。次に、
得られたプラスミドを用いた遺伝子変換により、変異を
導入しようとするバチルス属細菌の野生型aroI遺伝子を
変異型aroI遺伝子に変換する。
でに取得されているバチルス属細菌のaroI変異株を用い
た遺伝子変換（gene conversion）により、取得するこ
とができる。すなわち、aroI遺伝子に変異を有する変異
株と、クローン化された野生型aroI遺伝子を含むプラス
ミドを用いた遺伝子変換により、前記プラスミド上の野
生型aroI遺伝子を変異型aroI遺伝子に変換する。次に、
得られたプラスミドを用いた遺伝子変換により、変異を
導入しようとするバチルス属細菌の野生型aroI遺伝子を
変異型aroI遺伝子に変換する。
【００１１】シキミ酸キナーゼ活性を欠損したバチルス
属細菌として具体的には、ａｒｏＩに変異を有するバチ
ルス・ズブチリス１−１１８株（ａｒｏＩ１１６，ａｍ
ｙ４）、及び同株から誘導されたａｒｏＩ１１６株（後
記実施例１参照）等が挙げられる。１−１１８株は、Yu
ki, S., Japan J. Genetics, 50 (2), 155-157 (1975)
に記載されている。
属細菌として具体的には、ａｒｏＩに変異を有するバチ
ルス・ズブチリス１−１１８株（ａｒｏＩ１１６，ａｍ
ｙ４）、及び同株から誘導されたａｒｏＩ１１６株（後
記実施例１参照）等が挙げられる。１−１１８株は、Yu
ki, S., Japan J. Genetics, 50 (2), 155-157 (1975)
に記載されている。
【００１２】本発明において、シキミ酸キナーゼ活性を
欠損したバチルス属細菌は、細胞内のシキミ酸脱水素酵
素活性が増強されていることが好ましい。それに加え
て、細胞内のＤＡＨＰ合成酵素活性が増強されているこ
とがより好ましい。細胞内のシキミ酸脱水素酵素活性又
はＤＡＨＰ合成酵素活性の増強は、例えば、これらの酵
素をコードする遺伝子のコピー数を高めること、同遺伝
子の発現調節配列を強化すること、又は同遺伝子を染色
体ＤＮＡへ組み込むことによって行うことができる。
欠損したバチルス属細菌は、細胞内のシキミ酸脱水素酵
素活性が増強されていることが好ましい。それに加え
て、細胞内のＤＡＨＰ合成酵素活性が増強されているこ
とがより好ましい。細胞内のシキミ酸脱水素酵素活性又
はＤＡＨＰ合成酵素活性の増強は、例えば、これらの酵
素をコードする遺伝子のコピー数を高めること、同遺伝
子の発現調節配列を強化すること、又は同遺伝子を染色
体ＤＮＡへ組み込むことによって行うことができる。
【００１３】具体的には、細胞中のシキミ酸脱水素酵素
活性を増強するには、シキミ酸脱水素酵素をコードする
遺伝子断片を、バチルス属細菌で機能するベクターと連
結して組み換えＤＮＡを作製し、これをバチルス属細菌
の宿主に導入して形質転換すればよい。シキミ酸脱水素
酵素は、ａｒｏＤ遺伝子にコードされている。
活性を増強するには、シキミ酸脱水素酵素をコードする
遺伝子断片を、バチルス属細菌で機能するベクターと連
結して組み換えＤＮＡを作製し、これをバチルス属細菌
の宿主に導入して形質転換すればよい。シキミ酸脱水素
酵素は、ａｒｏＤ遺伝子にコードされている。
【００１４】ａｒｏＤ遺伝子は、バチルス属細菌の遺伝
子を用いることも、他の生物由来の遺伝子を用いること
も可能である。ａｒｏＤ遺伝子源となるバチルス属細菌
としては、バチルス・ズブチリス、バチルス・アミロリ
ケファシエンス等が挙げられる。
子を用いることも、他の生物由来の遺伝子を用いること
も可能である。ａｒｏＤ遺伝子源となるバチルス属細菌
としては、バチルス・ズブチリス、バチルス・アミロリ
ケファシエンス等が挙げられる。
【００１５】ａｒｏＤ遺伝子をバチルス属細菌に導入す
るためのベクターとしては、バチルス属細菌において複
製可能なものであればよく、具体的には、pUB110、pC19
4、pE194、pSM19035、pMX30、pMX39、pCB20、pCB30およ
びpCA1等が挙げられる。また、バチルス属細菌では、ベ
クターを用いずに直鎖状のＤＮＡを用いて染色体ＤＮＡ
へ組み込むことによっても、形質転換を行うことができ
る。
るためのベクターとしては、バチルス属細菌において複
製可能なものであればよく、具体的には、pUB110、pC19
4、pE194、pSM19035、pMX30、pMX39、pCB20、pCB30およ
びpCA1等が挙げられる。また、バチルス属細菌では、ベ
クターを用いずに直鎖状のＤＮＡを用いて染色体ＤＮＡ
へ組み込むことによっても、形質転換を行うことができ
る。
【００１６】シキミ酸脱水素酵素をコードするａｒｏＤ
遺伝子とバチルス属細菌で機能するベクターを連結して
組み換えＤＮＡを調製するには、ａｒｏＤ遺伝子を含む
ＤＮＡ断片と、このＤＮＡ断片の末端に合うような制限
酵素で切断したベクターとを連結する。ベクターとの連
結は、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ等のリガーゼを用いて行うの
が普通である。
遺伝子とバチルス属細菌で機能するベクターを連結して
組み換えＤＮＡを調製するには、ａｒｏＤ遺伝子を含む
ＤＮＡ断片と、このＤＮＡ断片の末端に合うような制限
酵素で切断したベクターとを連結する。ベクターとの連
結は、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ等のリガーゼを用いて行うの
が普通である。
【００１７】上記のように調製した組換えＤＮＡ又は直
鎖状ＤＮＡをバチルス属細菌に導入するには、これまで
に報告されている形質転換法に従って行えばよい。例え
ば、増殖段階の細胞からコンピテントセルを調製してＤ
ＮＡを導入する方法（Duncan,C.H.,Wilson,G.A.and You
ng,F.E., Gene, 1, 153 (1977)）がある。あるいは、Ｄ
ＮＡ受容菌の細胞を、組換えＤＮＡを容易に取り込むプ
ロトプラストの状態にして組換えＤＮＡをＤＮＡ受容菌
に導入する方法（Chang,S.and Choen,S.N.,Molec. Gen.
Genet., 168, 111 (1979);Bibb,M.J.,Ward,J.M.and Ho
pwood,O.A.,Nature, 274, 398 (1978);Hinnen,A.,Hick
s,J.B.and Fink,G.R.,Proc. Natl. Acad.Sci. USA, 75
1929 (1978)）も応用できる。また、バチルス属細菌の
染色体ＤＮＡ上にａｒｏＤ遺伝子を組み込むには、直鎖
状ＤＮＡを用い、二つの配列をランダムに染色体ＤＮＡ
に組み込む会合法（congression method）（Erickson,
R.T. et al., Genetics, 73(1), 13 (1973); Nester,
E.W. et al., Genetics, 48, 529 (1963)）により行う
ことができる。
鎖状ＤＮＡをバチルス属細菌に導入するには、これまで
に報告されている形質転換法に従って行えばよい。例え
ば、増殖段階の細胞からコンピテントセルを調製してＤ
ＮＡを導入する方法（Duncan,C.H.,Wilson,G.A.and You
ng,F.E., Gene, 1, 153 (1977)）がある。あるいは、Ｄ
ＮＡ受容菌の細胞を、組換えＤＮＡを容易に取り込むプ
ロトプラストの状態にして組換えＤＮＡをＤＮＡ受容菌
に導入する方法（Chang,S.and Choen,S.N.,Molec. Gen.
Genet., 168, 111 (1979);Bibb,M.J.,Ward,J.M.and Ho
pwood,O.A.,Nature, 274, 398 (1978);Hinnen,A.,Hick
s,J.B.and Fink,G.R.,Proc. Natl. Acad.Sci. USA, 75
1929 (1978)）も応用できる。また、バチルス属細菌の
染色体ＤＮＡ上にａｒｏＤ遺伝子を組み込むには、直鎖
状ＤＮＡを用い、二つの配列をランダムに染色体ＤＮＡ
に組み込む会合法（congression method）（Erickson,
R.T. et al., Genetics, 73(1), 13 (1973); Nester,
E.W. et al., Genetics, 48, 529 (1963)）により行う
ことができる。
【００１８】シキミ酸脱水素酵素活性の増強は、上記の
遺伝子増幅による以外に、プラスミド上又は染色体上の
ａｒｏＤ遺伝子のプロモーター等の発現調節配列を強力
なものに置換することによっても達成される。強力なプ
ロモーターをａｒｏＤ遺伝子の構造遺伝子に連結した組
換え遺伝子をバチルス属細菌の細胞に導入することによ
って、ａｒｏＤ遺伝子の発現を強化することができる。
また、染色体ＤＮＡ上のａｒｏＤ遺伝子の発現調節配列
の置換は、特開平１−２１５２８０号公報記載の方法に
よって行うことができる。たとえば、バチルス・アミロ
リケファシエンスのリボソームタンパク質遺伝子ｒｐｍ
ＡのプロモーターＰｒ(rpmA)等が、バチルス属細菌の強
力なプロモーターとして知られている。ａｒｏＤ遺伝子
固有のプロモーターをこれらのプロモーターに置換する
ことによって、ａｒｏＤ遺伝子の発現が増強され、それ
によってシキミ酸脱水素酵素の活性が増強される。発現
調節配列の増強は、ａｒｏＤ遺伝子のコピー数を高める
ことと組み合わせてもよい。
遺伝子増幅による以外に、プラスミド上又は染色体上の
ａｒｏＤ遺伝子のプロモーター等の発現調節配列を強力
なものに置換することによっても達成される。強力なプ
ロモーターをａｒｏＤ遺伝子の構造遺伝子に連結した組
換え遺伝子をバチルス属細菌の細胞に導入することによ
って、ａｒｏＤ遺伝子の発現を強化することができる。
また、染色体ＤＮＡ上のａｒｏＤ遺伝子の発現調節配列
の置換は、特開平１−２１５２８０号公報記載の方法に
よって行うことができる。たとえば、バチルス・アミロ
リケファシエンスのリボソームタンパク質遺伝子ｒｐｍ
ＡのプロモーターＰｒ(rpmA)等が、バチルス属細菌の強
力なプロモーターとして知られている。ａｒｏＤ遺伝子
固有のプロモーターをこれらのプロモーターに置換する
ことによって、ａｒｏＤ遺伝子の発現が増強され、それ
によってシキミ酸脱水素酵素の活性が増強される。発現
調節配列の増強は、ａｒｏＤ遺伝子のコピー数を高める
ことと組み合わせてもよい。
【００１９】上記の方法において、ａｒｏＤ遺伝子の代
わりにＤＡＨＰ合成酵素をコードする遺伝子（ａｒｏＡ
遺伝子）を用いることによって、ＤＡＨＰ合成酵素活性
を増強することができる。本発明のシキミ酸の製造法に
用いるバチルス属細菌の第二の態様は、５−エノールピ
ルビルシキミ酸−３−リン酸合成酵素活性を欠損したバ
チルス属細菌である。バチルス属細菌としては、バチル
ス・ズブチリス、バチルス・アミロリケファシエンス等
が挙げられる。
わりにＤＡＨＰ合成酵素をコードする遺伝子（ａｒｏＡ
遺伝子）を用いることによって、ＤＡＨＰ合成酵素活性
を増強することができる。本発明のシキミ酸の製造法に
用いるバチルス属細菌の第二の態様は、５−エノールピ
ルビルシキミ酸−３−リン酸合成酵素活性を欠損したバ
チルス属細菌である。バチルス属細菌としては、バチル
ス・ズブチリス、バチルス・アミロリケファシエンス等
が挙げられる。
【００２０】５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン
酸合成酵素活性を欠損したバチルス属細菌としては、同
酵素の活性を実質的に完全に欠損した変異株、又は野生
株に比べて同酵素の活性が有意に低下した変異株が挙げ
られる。また、染色体上の同酵素をコードする遺伝子
（ａｒｏＥ）が相同組換えにより破壊されたものであっ
てもよい。
酸合成酵素活性を欠損したバチルス属細菌としては、同
酵素の活性を実質的に完全に欠損した変異株、又は野生
株に比べて同酵素の活性が有意に低下した変異株が挙げ
られる。また、染色体上の同酵素をコードする遺伝子
（ａｒｏＥ）が相同組換えにより破壊されたものであっ
てもよい。
【００２１】バチルス属細菌の５−エノールピルビルシ
キミ酸−３−リン酸合成酵素活性を欠損させるには、バ
チルス属細菌を従来知られている方法によって変異処理
し、同酵素をコードする遺伝子（aroE）に変異を有する
変異株を選択すればよい。変異処理としては、バチルス
属細菌を紫外線照射またはN−メチル−N'−ニトロ−N−
ニトロソグアニジン（NTG）もしくは亜硝酸等の通常変
異処理に用いられている変異剤によって処理する方法が
挙げられる。
キミ酸−３−リン酸合成酵素活性を欠損させるには、バ
チルス属細菌を従来知られている方法によって変異処理
し、同酵素をコードする遺伝子（aroE）に変異を有する
変異株を選択すればよい。変異処理としては、バチルス
属細菌を紫外線照射またはN−メチル−N'−ニトロ−N−
ニトロソグアニジン（NTG）もしくは亜硝酸等の通常変
異処理に用いられている変異剤によって処理する方法が
挙げられる。
【００２２】また、バチルス属細菌のaroE変異株は、す
でに取得されているバチルス属細菌のaroE変異株を用い
た遺伝子変換（gene conversion）により、取得するこ
とができる。すなわち、aroE遺伝子に変異を有する変異
株と、クローン化された野生型aroE遺伝子を含むプラス
ミドを用いた遺伝子変換により、前記プラスミド上の野
生型aroE遺伝子を変異型aroE遺伝子に変換する。次に、
得られたプラスミドを用いた遺伝子変換により、変異を
導入しようとするバチルス属細菌の野生型aroE遺伝子を
変異型aroE遺伝子に変換する。aroE変異株として具体的
には、バチルス・ズブチリスSB130 （aroE130 hisH32）
株が挙げられる。
でに取得されているバチルス属細菌のaroE変異株を用い
た遺伝子変換（gene conversion）により、取得するこ
とができる。すなわち、aroE遺伝子に変異を有する変異
株と、クローン化された野生型aroE遺伝子を含むプラス
ミドを用いた遺伝子変換により、前記プラスミド上の野
生型aroE遺伝子を変異型aroE遺伝子に変換する。次に、
得られたプラスミドを用いた遺伝子変換により、変異を
導入しようとするバチルス属細菌の野生型aroE遺伝子を
変異型aroE遺伝子に変換する。aroE変異株として具体的
には、バチルス・ズブチリスSB130 （aroE130 hisH32）
株が挙げられる。
【００２３】本発明において、５−エノールピルビルシ
キミ酸−３−リン酸合成酵素活性を欠損したバチルス属
細菌は、細胞内のシキミ酸脱水素酵素活性が増強されて
いることが好ましい。それに加えて、細胞内のＤＡＨＰ
合成酵素活性が増強されていることがより好ましい。こ
れらの酵素活性の増強は、前記本発明に用いるバチルス
属細菌の第一の態様と同様に、行うことができる。細菌
中において、シキミ酸は、ａｒｏＩ産物であるシキミ酸
キナーゼの作用により、シキミ酸３−リン酸に変換され
る。また、シキミ酸は、エシェリヒア・コリ（E.coli）
細胞と同様に、バチルス・ズブチリス中のシキミ酸脱水
素酵素（シキミ酸５−デヒドロゲナーゼ）の生産物阻害
物質であることがわかっている。一方、シキミ酸３−リ
ン酸は、シキミ酸５−デヒドロゲナーゼを阻害しない。
シキミ酸キナーゼは、シキミ酸の細胞内濃度を下げるた
め、シキミ酸キナーゼ活性を増大させることによって、
シキミ酸によるシキミ酸５−デヒドロゲナーゼのフィー
ドバック阻害を回避することができると本発明者は考え
た。
キミ酸−３−リン酸合成酵素活性を欠損したバチルス属
細菌は、細胞内のシキミ酸脱水素酵素活性が増強されて
いることが好ましい。それに加えて、細胞内のＤＡＨＰ
合成酵素活性が増強されていることがより好ましい。こ
れらの酵素活性の増強は、前記本発明に用いるバチルス
属細菌の第一の態様と同様に、行うことができる。細菌
中において、シキミ酸は、ａｒｏＩ産物であるシキミ酸
キナーゼの作用により、シキミ酸３−リン酸に変換され
る。また、シキミ酸は、エシェリヒア・コリ（E.coli）
細胞と同様に、バチルス・ズブチリス中のシキミ酸脱水
素酵素（シキミ酸５−デヒドロゲナーゼ）の生産物阻害
物質であることがわかっている。一方、シキミ酸３−リ
ン酸は、シキミ酸５−デヒドロゲナーゼを阻害しない。
シキミ酸キナーゼは、シキミ酸の細胞内濃度を下げるた
め、シキミ酸キナーゼ活性を増大させることによって、
シキミ酸によるシキミ酸５−デヒドロゲナーゼのフィー
ドバック阻害を回避することができると本発明者は考え
た。
【００２４】そして、本発明者は、活性なシキミ酸キナ
ーゼ遺伝子を保持するシキミ酸生産菌を構築できるか調
べた。その結果、活性なaroIを保持するバチルス・ズブ
チリスは、５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸
合成酵素の活性を欠損することによってシキミ酸生産能
を示すこと、及び、さらにａｒｏＤ産物であるシキミ酸
脱水素酵素の活性を増強することによって、そのシキミ
酸生産能が向上することを見出した。すなわち、シキミ
酸キナーゼによって蓄積したシキミ酸−５−リン酸は、
ホスファターゼの作用によって容易に脱リン酸され、生
成したシキミ酸は細胞から排出される。
ーゼ遺伝子を保持するシキミ酸生産菌を構築できるか調
べた。その結果、活性なaroIを保持するバチルス・ズブ
チリスは、５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸
合成酵素の活性を欠損することによってシキミ酸生産能
を示すこと、及び、さらにａｒｏＤ産物であるシキミ酸
脱水素酵素の活性を増強することによって、そのシキミ
酸生産能が向上することを見出した。すなわち、シキミ
酸キナーゼによって蓄積したシキミ酸−５−リン酸は、
ホスファターゼの作用によって容易に脱リン酸され、生
成したシキミ酸は細胞から排出される。
【００２５】上記のようにして得られるシキミ酸生産能
を有するバチルス属細菌を培地で培養し、シキミ酸を培
地中に生成蓄積させ、該培地よりシキミ酸を採取するこ
とにより、シキミ酸の製造することができる。
を有するバチルス属細菌を培地で培養し、シキミ酸を培
地中に生成蓄積させ、該培地よりシキミ酸を採取するこ
とにより、シキミ酸の製造することができる。
【００２６】培養に使用する培地は、炭素源、窒素源、
無機イオン及び必要に応じその他の有機成分を含有する
通常の培地である。炭素源としては、グルコース、ガラ
クトース、フラクトースもしくはでんぷんの加水分解物
などの糖類、グリセロールもしくはソルビトールなどの
アルコール類、またはフマール酸、クエン酸もしくはコ
ハク酸等の有機酸類を用いることができる。
無機イオン及び必要に応じその他の有機成分を含有する
通常の培地である。炭素源としては、グルコース、ガラ
クトース、フラクトースもしくはでんぷんの加水分解物
などの糖類、グリセロールもしくはソルビトールなどの
アルコール類、またはフマール酸、クエン酸もしくはコ
ハク酸等の有機酸類を用いることができる。
【００２７】窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化
アンモニウムもしくはリン酸アンモニウム等の無機アン
モニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニ
アガス、またはアンモニア水等を用いることができる。
アンモニウムもしくはリン酸アンモニウム等の無機アン
モニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニ
アガス、またはアンモニア水等を用いることができる。
【００２８】有機微量栄養源としては、ビタミンＢ1、
Ｌ−イソロイシンなどの要求物質または酵母エキス等を
適量含有させることが望ましい。これらの他に、必要に
応じて、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄イオ
ン、マンガンイオン等が少量添加される。
Ｌ−イソロイシンなどの要求物質または酵母エキス等を
適量含有させることが望ましい。これらの他に、必要に
応じて、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄イオ
ン、マンガンイオン等が少量添加される。
【００２９】培養は、好気的条件下で１６〜７２時間実
施するのがよく、培養温度は２５℃〜４５℃に、培養中
ｐＨは５〜８に制御する。尚、ｐＨ調整には無機あるい
は有機の酸性あるいはアルカリ性物質、更にアンモニア
ガス等を使用することができる。
施するのがよく、培養温度は２５℃〜４５℃に、培養中
ｐＨは５〜８に制御する。尚、ｐＨ調整には無機あるい
は有機の酸性あるいはアルカリ性物質、更にアンモニア
ガス等を使用することができる。
【００３０】発酵液からのシキミ酸の採取は、通常イオ
ン交換樹脂法、沈澱法等を組み合わせることにより実施
できる。
ン交換樹脂法、沈澱法等を組み合わせることにより実施
できる。
【００３１】
【実施例】以下、本発明を実施例によりさらに具体的に
説明する。
説明する。
【００３２】＜１＞発酵液中のシキミ酸及びデヒドロシ
キミ酸の分析 以下の実施例において、発酵液中のシキミ酸及びデヒド
ロシキミ酸は、以下のようにして分析した。
キミ酸の分析 以下の実施例において、発酵液中のシキミ酸及びデヒド
ロシキミ酸は、以下のようにして分析した。
【００３３】（１）サンプル調製 発酵液のサンプルは、細胞と残渣を除去するために５４
１５Ｃ型マイクロフュージ（エッペンドルフ製、ドイ
ツ）で５分遠心分離した。上清は、水で３０倍に水釈さ
れ、さらなる精製なしにＨＰＬＣ分析に使用された。
１５Ｃ型マイクロフュージ（エッペンドルフ製、ドイ
ツ）で５分遠心分離した。上清は、水で３０倍に水釈さ
れ、さらなる精製なしにＨＰＬＣ分析に使用された。
【００３４】（２）逆相分離 分析は、５１０型ポンプ、ＩＢＭ−ＰＣを基礎とするデ
ータステーションを有する９９０型ダイオードアレイ検
出器（いずれもウォーターズ製、ミルフォード、アメリ
カ）、および１μｌの内部ループを有する７０１０型イ
ンジェクターからなるイソクラティックシステム（レオ
ダイン製、コタチ、アメリカ）を用いて行なった。すべ
ての分離は、室温で、５μｍのセパロンＣ１８吸着剤
（テッセック製、Ｃｈｅｈ共和国）を充填した１５０×
３．３ｍｍ（内径）の逆相（Ｃ１８）カラムで実施され
た。
ータステーションを有する９９０型ダイオードアレイ検
出器（いずれもウォーターズ製、ミルフォード、アメリ
カ）、および１μｌの内部ループを有する７０１０型イ
ンジェクターからなるイソクラティックシステム（レオ
ダイン製、コタチ、アメリカ）を用いて行なった。すべ
ての分離は、室温で、５μｍのセパロンＣ１８吸着剤
（テッセック製、Ｃｈｅｈ共和国）を充填した１５０×
３．３ｍｍ（内径）の逆相（Ｃ１８）カラムで実施され
た。
【００３５】０．５％酢酸と０．７％トリエリルアミン
を含む溶出液（ｐＨ６）は、超音波浴槽で脱気された。
代表的な溶出速度は、０．３ｍｌ／分であった。上記条
件で、シキミ酸はデヒドロシキミ酸より速く溶出され
る。一回の分析時間は約７分であった。
を含む溶出液（ｐＨ６）は、超音波浴槽で脱気された。
代表的な溶出速度は、０．３ｍｌ／分であった。上記条
件で、シキミ酸はデヒドロシキミ酸より速く溶出され
る。一回の分析時間は約７分であった。
【００３６】（３）アミノ相分離 全分析は、５１０型ポンプ、９９０ソフトウェアを備え
た９９０型ダイオートアレイ検出器（いずれもウォータ
ーズ製、アメリカ）、および１μｌの内部ループを有す
る７０１０型インジェクター（レオダイン製、アメリ
カ）を含有する上記と同じイソクラティックＨＰＬＣシ
ステムを用いて実施された。
た９９０型ダイオートアレイ検出器（いずれもウォータ
ーズ製、アメリカ）、および１μｌの内部ループを有す
る７０１０型インジェクター（レオダイン製、アメリ
カ）を含有する上記と同じイソクラティックＨＰＬＣシ
ステムを用いて実施された。
【００３７】自家製の水循環ジャケットを付けた、５μ
ｍのＮＨ2吸収剤（テッセック製、Ｃｈｅｈ共和国）を
充填した１５０×３．３ｍｍ（内径）のガラスカラムを
用いた。分析は、以下の条件で行った。
ｍのＮＨ2吸収剤（テッセック製、Ｃｈｅｈ共和国）を
充填した１５０×３．３ｍｍ（内径）のガラスカラムを
用いた。分析は、以下の条件で行った。
【００３８】カラム温度：５０℃ 溶出液：６０％アセトニトリルおよび６ｇ／Ｌ酢酸アン
モニウムを含む 流速：０．５ｍｌ／分 上記条件で、シキミ酸はデヒドロシキミ酸より速く溶出
される。一回の分析時間は約７分であった。
モニウムを含む 流速：０．５ｍｌ／分 上記条件で、シキミ酸はデヒドロシキミ酸より速く溶出
される。一回の分析時間は約７分であった。
【００３９】＜２＞ジャーファーメンターによる培養 以下の実施例において、バチルス・ズブチリスの菌株の
培養は、以下の条件で行った。
培養は、以下の条件で行った。
【００４０】（１）種培養 菌株は、１０ｍｇ／Ｌのエリスロマイシンを含むＬＢ培
地寒天のプレートまたは斜面上で３７℃２４時間生育さ
せた。次に、種培地として使用した７００ｍｌ容量のフ
ラスコ中でＬＢ培地３０ｍｌ中で菌体をインキュベート
した。種培養は３７℃、６〜７時間ロータリーシェーカ
ーでインキュベートした。
地寒天のプレートまたは斜面上で３７℃２４時間生育さ
せた。次に、種培地として使用した７００ｍｌ容量のフ
ラスコ中でＬＢ培地３０ｍｌ中で菌体をインキュベート
した。種培養は３７℃、６〜７時間ロータリーシェーカ
ーでインキュベートした。
【００４１】（２）ジャーファーメンターでの培養 シキミ酸生産菌の培養は、「マルビシ」研究用ファーメ
ンター（Ｖ〜１−１．２Ｌ）中で実施された。酵母エキ
スに含まれているため、下記培地には芳香族アミノ酸
（フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシ
ン）を加えなかった。
ンター（Ｖ〜１−１．２Ｌ）中で実施された。酵母エキ
スに含まれているため、下記培地には芳香族アミノ酸
（フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシ
ン）を加えなかった。
【００４２】初期培養培地の構成（ｉｎ ｇ／Ｌ）： グルコース ：１００（１Ｌにつき〜１５０ｇが
フィード溶液として加えられる） （ＮＨ4）2ＳＯ4 ：２ ＮＨ4Ｃｌ ：３ ＫＨ2ＰＯ4 ：３ ＭｇＳＯ4 ：０．４ ＦｅＳＯ4 ：０．０２ 酵母エキス ：１５ （「シグマ」Ｙ４０００） エリスロマイシン ：１０ｍｇ／Ｌ ｐＨ７．０ ファーメンター中の培地の初期容量：５００ｍｌ 接種サイズ：６％（Ｅｍ１０ｍｇ／Ｌを含むＬＢ培地３
０ｍｌ中の６時間培養） フィード溶液（２００〜２５０ｍｌ）は濃度７００ｇ／
Ｌのグルコースを含有する。
フィード溶液として加えられる） （ＮＨ4）2ＳＯ4 ：２ ＮＨ4Ｃｌ ：３ ＫＨ2ＰＯ4 ：３ ＭｇＳＯ4 ：０．４ ＦｅＳＯ4 ：０．０２ 酵母エキス ：１５ （「シグマ」Ｙ４０００） エリスロマイシン ：１０ｍｇ／Ｌ ｐＨ７．０ ファーメンター中の培地の初期容量：５００ｍｌ 接種サイズ：６％（Ｅｍ１０ｍｇ／Ｌを含むＬＢ培地３
０ｍｌ中の６時間培養） フィード溶液（２００〜２５０ｍｌ）は濃度７００ｇ／
Ｌのグルコースを含有する。
【００４３】供給率： 培養初期から１９時間まで：３〜３．２ｍｌ／Ｌ・時間 １９時間後：４．５ｍｌ／Ｌ・時間 温度：３７℃、 アジテーション：１０００〜１１００r.p.m.、 エアー：０．６Ｌ／分
【００４４】
【実施例１】 バチルス・アミロリケファシエンスのシ
キミ酸脱水素酵素遺伝子ａｒｏＤを保持するバチルス・
ズブチリスの構築 ＜１＞バチルス・アミロリケファシエンスのシキミ酸脱
水素酵素遺伝子ａｒｏＤのクローニング シキミ酸脱水素酵素をコードする遺伝子（aroD）は、バ
チルス・アミロリケファシエンスの菌株から、プラスミ
ド・ベクター上にクローン化された。このクローン化に
は、エリスロマイシン耐性遺伝子であるermを保持する
プラスミドpMX39を使用した。pMX39(22.4kbp)は、バチ
ルス・ズブチリスとエシェリヒア・コリにおいて複製す
ることができる二機能のプラスミドである（図２）。こ
のプラスミドは、pBR322 (bla, tet)とpMX30 (erm)の二
つのゲノムから成り、これらのゲノムは、EcoRI部位で
接続されている。プラスミドpMX30(18kbp)は、ストレプ
トコッカス・ピオジェネスの菌株から分離されたpSM190
35の欠失誘導体である（Rabinovich, P.M. et al., "Cl
oning of genetic material in Bacilli" In: "Genetic
s and biotechnology of Bacilli" Ganesan and J.A.
Hoch eds., AcademicPress., USA (1984) p.297-30
8）。pSM19035、pMX30およびpMX39のプラスミドは、バ
チルス属の菌株中で複製し、染色体に対して約２から３
のコピー数を有している。pCB20、pCB30およびpCA1など
の小さな欠失誘導体は、コピー数が染色体に対して30か
ら50に増大している。
キミ酸脱水素酵素遺伝子ａｒｏＤを保持するバチルス・
ズブチリスの構築 ＜１＞バチルス・アミロリケファシエンスのシキミ酸脱
水素酵素遺伝子ａｒｏＤのクローニング シキミ酸脱水素酵素をコードする遺伝子（aroD）は、バ
チルス・アミロリケファシエンスの菌株から、プラスミ
ド・ベクター上にクローン化された。このクローン化に
は、エリスロマイシン耐性遺伝子であるermを保持する
プラスミドpMX39を使用した。pMX39(22.4kbp)は、バチ
ルス・ズブチリスとエシェリヒア・コリにおいて複製す
ることができる二機能のプラスミドである（図２）。こ
のプラスミドは、pBR322 (bla, tet)とpMX30 (erm)の二
つのゲノムから成り、これらのゲノムは、EcoRI部位で
接続されている。プラスミドpMX30(18kbp)は、ストレプ
トコッカス・ピオジェネスの菌株から分離されたpSM190
35の欠失誘導体である（Rabinovich, P.M. et al., "Cl
oning of genetic material in Bacilli" In: "Genetic
s and biotechnology of Bacilli" Ganesan and J.A.
Hoch eds., AcademicPress., USA (1984) p.297-30
8）。pSM19035、pMX30およびpMX39のプラスミドは、バ
チルス属の菌株中で複製し、染色体に対して約２から３
のコピー数を有している。pCB20、pCB30およびpCA1など
の小さな欠失誘導体は、コピー数が染色体に対して30か
ら50に増大している。
【００４５】aroD遺伝子をクローニングするために、バ
チルス・アミロリケファシエンスの染色体DNAをEcoRIで
切断し、pMX39プラスミドのEcoRI断片に連結した（図
３）。このDNAを用いて、バチルス・ズブチリスaroD12
0, lys1, trpC2, recE4レシピエントストレイン（ルシ
アン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリ
アル・マイクロオーガニズムス（VKPM）・デポジタリー
GNIIgenetika（Russian National Collection of Indu
strial Microorganisms（VKPM）Depositary, GNIIgenet
ika）（住所：1, Dorozhny Proezd., 1, 113545, Mosco
w, Russia）に、VKPM B-1403の登録番号で寄託されてい
る。また、バチルス・ジェネティック・ストックセンタ
ー（Bacillus Genetic Stock Center, The Ohio State
University,Department of Biochemistry（484 West Tw
elfth Avenue, Columbus, Ohio 43210 USA)）にBGSC 1A
8の登録番号で寄託されている。）を形質転換し、EmR,
AroD+のクローンが選択された。分離された組換えプラ
スミドは、pAD2と命名された（図３）。このpAD2 (er
m，aroD+) プラスミドのサイズは30kbpであり、バチル
ス・アミロリケファシエンスのaroD遺伝子を含むバチル
ス・アミロリケファシエンスの12kbpのDNAを挿入物を保
持している。
チルス・アミロリケファシエンスの染色体DNAをEcoRIで
切断し、pMX39プラスミドのEcoRI断片に連結した（図
３）。このDNAを用いて、バチルス・ズブチリスaroD12
0, lys1, trpC2, recE4レシピエントストレイン（ルシ
アン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリ
アル・マイクロオーガニズムス（VKPM）・デポジタリー
GNIIgenetika（Russian National Collection of Indu
strial Microorganisms（VKPM）Depositary, GNIIgenet
ika）（住所：1, Dorozhny Proezd., 1, 113545, Mosco
w, Russia）に、VKPM B-1403の登録番号で寄託されてい
る。また、バチルス・ジェネティック・ストックセンタ
ー（Bacillus Genetic Stock Center, The Ohio State
University,Department of Biochemistry（484 West Tw
elfth Avenue, Columbus, Ohio 43210 USA)）にBGSC 1A
8の登録番号で寄託されている。）を形質転換し、EmR,
AroD+のクローンが選択された。分離された組換えプラ
スミドは、pAD2と命名された（図３）。このpAD2 (er
m，aroD+) プラスミドのサイズは30kbpであり、バチル
ス・アミロリケファシエンスのaroD遺伝子を含むバチル
ス・アミロリケファシエンスの12kbpのDNAを挿入物を保
持している。
【００４６】aroD遺伝子を含む長いDNA断片は、種々の
制限酵素で切断し、小さなマルチコピー・ベクターにサ
ブクローンすることによって最小化した（図４）。最初
のステップは、pAD2 DNAをPaeI(SphI)で切断することに
より行った。pAD2上にクローン化されたバチルス・アミ
ロリケファシエンスのDNA断片は、８つ以上のPael部位
を有していたが、プラスミドのベクター部分はPaeI部位
を有していない。従って、PaeIによる切断とプラスミド
pAD2のセルフライゲーションにより、クローン化された
DNA 断片のサイズを縮小することができる。断片を縮小
化するために、PaeI DNA断片の連結混合物で、バチルス
・ズブチリスaroD120, lys1, trpC2, recE4レシピエン
トストレインを形質転換した。AroD+，EmRクローンを選
択し、プラスミドDNAを分離した。得られたプラスミドp
AD2derlPae3 (erm, aroD+)は、aroD遺伝子を含む7 kbp
のDNA断片を保持する。
制限酵素で切断し、小さなマルチコピー・ベクターにサ
ブクローンすることによって最小化した（図４）。最初
のステップは、pAD2 DNAをPaeI(SphI)で切断することに
より行った。pAD2上にクローン化されたバチルス・アミ
ロリケファシエンスのDNA断片は、８つ以上のPael部位
を有していたが、プラスミドのベクター部分はPaeI部位
を有していない。従って、PaeIによる切断とプラスミド
pAD2のセルフライゲーションにより、クローン化された
DNA 断片のサイズを縮小することができる。断片を縮小
化するために、PaeI DNA断片の連結混合物で、バチルス
・ズブチリスaroD120, lys1, trpC2, recE4レシピエン
トストレインを形質転換した。AroD+，EmRクローンを選
択し、プラスミドDNAを分離した。得られたプラスミドp
AD2derlPae3 (erm, aroD+)は、aroD遺伝子を含む7 kbp
のDNA断片を保持する。
【００４７】7 kbp EcoRI DNA断片は、pAD2delPae3プラ
スミドから、クロラムフェニコール耐性の遺伝子catを
保持するマルチコピー(〜30)のプラスミドベクター pCA
1（図５）にサブクローニングされた。得られたプラス
ミドはpADP4 (cat, aroD+)と命名された。pADP4のDNAは
単一のBglII部位を有し、バチルス・アミロリケファシ
エンスからクローン化された DNA断片はBglIIによって
半分に分割される。
スミドから、クロラムフェニコール耐性の遺伝子catを
保持するマルチコピー(〜30)のプラスミドベクター pCA
1（図５）にサブクローニングされた。得られたプラス
ミドはpADP4 (cat, aroD+)と命名された。pADP4のDNAは
単一のBglII部位を有し、バチルス・アミロリケファシ
エンスからクローン化された DNA断片はBglIIによって
半分に分割される。
【００４８】プラスミドpADP4を保持するバチルス・ズ
ブチリスaroD120, lys1, trpC2, recE4は、1998年12月3
日に、ルシアン・ナショナル・コレクション・オブ・イ
ンダストリアル・マイクロオーガニズムス（VKPM）・デ
ポジタリー GNIIgenetika（Russian National Collecti
on of Industrial Microorganisms（VKPM）Depositary,
GNIIgenetika）（住所：1, Dorozhny Proezd., 1, 113
545, Moscow, Russia）に、登録番号VKPM B-7692のもと
に寄託されている。
ブチリスaroD120, lys1, trpC2, recE4は、1998年12月3
日に、ルシアン・ナショナル・コレクション・オブ・イ
ンダストリアル・マイクロオーガニズムス（VKPM）・デ
ポジタリー GNIIgenetika（Russian National Collecti
on of Industrial Microorganisms（VKPM）Depositary,
GNIIgenetika）（住所：1, Dorozhny Proezd., 1, 113
545, Moscow, Russia）に、登録番号VKPM B-7692のもと
に寄託されている。
【００４９】pADP4プラスミドの4 kbpの BglII-PstI DN
A断片は、バチルス・アミロリケファシエンスのaroD遺
伝子を保持する。この断片は、新たなプラスミドを構築
するために用いられ、そしてaroD遺伝子をバチルス・ズ
ブチリスのクロモゾームに組み込むために用いられた
(後述)。
A断片は、バチルス・アミロリケファシエンスのaroD遺
伝子を保持する。この断片は、新たなプラスミドを構築
するために用いられ、そしてaroD遺伝子をバチルス・ズ
ブチリスのクロモゾームに組み込むために用いられた
(後述)。
【００５０】pADP4プラスミドからaroD遺伝子を含んで
いない部分を削除するために、同DNAをBglIIおよびBamH
Iで線状化し、DNAリガーゼによって連結し、E. coli TG
1株を形質転換した。アンピシリン耐性のクローンを選
択した。その結果、pADP43(aroD+) プラスミドは、複製
可能であり、バチルス・ズブチリスのaroD120変異を相
補することができた。このプラスミドは薬剤耐性マーカ
ーを有していないが、バチルス属菌株中で増幅するのに
必要なpSM19035プラスミドのレプリコンを有している。
いない部分を削除するために、同DNAをBglIIおよびBamH
Iで線状化し、DNAリガーゼによって連結し、E. coli TG
1株を形質転換した。アンピシリン耐性のクローンを選
択した。その結果、pADP43(aroD+) プラスミドは、複製
可能であり、バチルス・ズブチリスのaroD120変異を相
補することができた。このプラスミドは薬剤耐性マーカ
ーを有していないが、バチルス属菌株中で増幅するのに
必要なpSM19035プラスミドのレプリコンを有している。
【００５１】次の段階で、pADP43から、pCA1に由来する
pUC18プラスミドのDNAテンプレートを削除し、クロラム
フェニコール耐性遺伝子であるcatをマーカーとして付
与した。そのために、対象なポリリンカーを両側に有す
るスタフィロコッカス・アウレウスのcat遺伝子を含有
するpUC7（CmR）プラスミド（BRL社から購入）を使用し
た。pADP43プラスミドDNAおよびpUC7プラスミドDNAをPs
tIで切断し、連結した。この連結混合物で、バチルス・
ズブチリスaroD, lys1, trpC2, recE4株を形質転換し
た。AroD+, CmRの形質転換体を選択し、新規な組換えプ
ラスミドpDP4(cat, aroD+)を得た。pDP4中のバチルス・
アミロリケファシエンスのＤＮＡ断片は3.5kbに最小化
されている（図６）。
pUC18プラスミドのDNAテンプレートを削除し、クロラム
フェニコール耐性遺伝子であるcatをマーカーとして付
与した。そのために、対象なポリリンカーを両側に有す
るスタフィロコッカス・アウレウスのcat遺伝子を含有
するpUC7（CmR）プラスミド（BRL社から購入）を使用し
た。pADP43プラスミドDNAおよびpUC7プラスミドDNAをPs
tIで切断し、連結した。この連結混合物で、バチルス・
ズブチリスaroD, lys1, trpC2, recE4株を形質転換し
た。AroD+, CmRの形質転換体を選択し、新規な組換えプ
ラスミドpDP4(cat, aroD+)を得た。pDP4中のバチルス・
アミロリケファシエンスのＤＮＡ断片は3.5kbに最小化
されている（図６）。
【００５２】＜２＞ａｒｏＤを保持するバチルス・ズブ
チリスによるシキミ酸および前駆体デヒドロシキミ酸の
産生 バチルス・ズブチリス1-118（aroI116,amy4）からrecE-
株を誘導し、バチルス・ズブチリスaroI116株と命名し
た。バチルス・ズブチリスaroI116をpDP4、及びバチル
ス・ズブチリス168株のaroA遺伝子を含むプラスミドpBA
G7で形質転換し、aroI116(pDP4)及びaroI116(pBAG7)を
得た。pBAG7の構築過程を図１に示す。バチルス・ズブ
チリス aroI116(pBAG7)は、1999年3月1日に、ルシアン
・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル
・マイクロオーガニズムス（VKPM）・デポジタリー GNI
Igenetika（Russian National Collection of Industri
al Microorganisms（VKPM）Depositary, GNIIgenetik
a）（住所：1, Dorozhny Proezd., 1, 113545, Moscow,
Russia）に、登録番号VKPM B-7756のもとに寄託されて
いる。バチルス・ズブチリスaroI116、aroI116(pDP4)、
及びaroI116(aroI116,amy4)(pBAG7)の各菌株を培養し、
発酵液中のシキミ酸（SH）とデヒドロシキミ酸(DHSH)を
前記のようにして分析した。結果を表１に示す。また、
バチルス・ズブチリスATCC6051 Marburg（aroD120,lys
1,trpC2,recE4)(野生株）、aroI116、a5 (2468,aroI11
6)、aroD120,lys1,trpC2, recE4 (pDP4)、及びaroI116
(pDP4)の培養菌体の粗抽出物について、たシキミ酸脱水
素酵素活性を逆反応を用いて測定した結果を、表２に示
す。
チリスによるシキミ酸および前駆体デヒドロシキミ酸の
産生 バチルス・ズブチリス1-118（aroI116,amy4）からrecE-
株を誘導し、バチルス・ズブチリスaroI116株と命名し
た。バチルス・ズブチリスaroI116をpDP4、及びバチル
ス・ズブチリス168株のaroA遺伝子を含むプラスミドpBA
G7で形質転換し、aroI116(pDP4)及びaroI116(pBAG7)を
得た。pBAG7の構築過程を図１に示す。バチルス・ズブ
チリス aroI116(pBAG7)は、1999年3月1日に、ルシアン
・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル
・マイクロオーガニズムス（VKPM）・デポジタリー GNI
Igenetika（Russian National Collection of Industri
al Microorganisms（VKPM）Depositary, GNIIgenetik
a）（住所：1, Dorozhny Proezd., 1, 113545, Moscow,
Russia）に、登録番号VKPM B-7756のもとに寄託されて
いる。バチルス・ズブチリスaroI116、aroI116(pDP4)、
及びaroI116(aroI116,amy4)(pBAG7)の各菌株を培養し、
発酵液中のシキミ酸（SH）とデヒドロシキミ酸(DHSH)を
前記のようにして分析した。結果を表１に示す。また、
バチルス・ズブチリスATCC6051 Marburg（aroD120,lys
1,trpC2,recE4)(野生株）、aroI116、a5 (2468,aroI11
6)、aroD120,lys1,trpC2, recE4 (pDP4)、及びaroI116
(pDP4)の培養菌体の粗抽出物について、たシキミ酸脱水
素酵素活性を逆反応を用いて測定した結果を、表２に示
す。
【００５３】
【表１】 表１ ────────────────────────────────── 菌株 時間 ＯＤ シキミ酸 デヒドロシキミ酸 比率 hr 540nm g/l g/l DHSH/SH ────────────────────────────────── aroI116 24 68.8 3.1 4.8 1.5 45 53.4 5.9 8.0 1.3 70 45.2 8.5 9.5 1.1 aroI116 24 62.0 6.5 1.9 0.29 (pDP4) 45 43.0 14.0 3.6 0.25 70 36.4 14.0 6.8 0.48 aroI116 24 77.6 4.9 14 2.8 (pBAG7) 45 76.8 8.0 24 3.0 70 65.6 7.2 20 2.7 ──────────────────────────────────
【００５４】
【表２】
【００５５】
【実施例２】ａｒｏＤ遺伝子染色体組込み株の構築 ＜１＞ａｒｏＤ遺伝子のバチルス・ズブチリスａｒｏＩ
１１６染色体への組込み 上記のように、ｐＤＰ４プラスミドを有するバチルス・
ズブチリスａｒｏＩ１１６シキミ酸生産菌は、シキミ酸
を１４ｇ／Ｌ程度生産し、プラスミドを有しない株より
も、前駆体であるデヒドロシキミ酸は２倍以下であり、
シキミ酸デヒドロゲナーゼ活性は５０倍高かった。しか
しながら、ｐＤＰ４プラスミドは、分離的（segregatio
nally）には不安定であった。２４時間の培養後、細胞
の９０％はプラスミドを失っていた。そこで、バチルス
・アミロリケファシエンスのａｒｏＤ遺伝子をバチルス
・ズブチリス ａｒｏＩ１１６シキミ酸生産菌のクロモ
ゾームに組込んだ。
１１６染色体への組込み 上記のように、ｐＤＰ４プラスミドを有するバチルス・
ズブチリスａｒｏＩ１１６シキミ酸生産菌は、シキミ酸
を１４ｇ／Ｌ程度生産し、プラスミドを有しない株より
も、前駆体であるデヒドロシキミ酸は２倍以下であり、
シキミ酸デヒドロゲナーゼ活性は５０倍高かった。しか
しながら、ｐＤＰ４プラスミドは、分離的（segregatio
nally）には不安定であった。２４時間の培養後、細胞
の９０％はプラスミドを失っていた。そこで、バチルス
・アミロリケファシエンスのａｒｏＤ遺伝子をバチルス
・ズブチリス ａｒｏＩ１１６シキミ酸生産菌のクロモ
ゾームに組込んだ。
【００５６】クロモゾームへのａｒｏＤ遺伝子組込みの
ための標的タイプ組込み法の開発をした。この方法は、
以下のステップを含む（図７）。
ための標的タイプ組込み法の開発をした。この方法は、
以下のステップを含む（図７）。
【００５７】（１）バチルス・ズブチリスのアルファア
ミラーゼ遺伝子は、ｐＡＡ１プラスミド（ＣｍR，Ｋ
ｍR，Ａｍｙ+）上でクローン化された。ｐＡＡ１を保持
するバチルス・ズブチリス２１，ａｍｙ４，ｒｅｃＥ４
は、1998年12月3日に、ルシアン・ナショナル・コレク
ション・オブ・インダストリアル・マイクロオーガニズ
ムス（VKPM）・デポジタリー GNIIgenetika（Russian N
ational Collection of Industrial Microorganisms（V
KPM）Depositary, GNIIgenetika）（住所：1, Dorozhny
Proezd., 1, 113545, Moscow, Russia）に、登録番号V
KPM B-7693のもとに寄託されている。
ミラーゼ遺伝子は、ｐＡＡ１プラスミド（ＣｍR，Ｋ
ｍR，Ａｍｙ+）上でクローン化された。ｐＡＡ１を保持
するバチルス・ズブチリス２１，ａｍｙ４，ｒｅｃＥ４
は、1998年12月3日に、ルシアン・ナショナル・コレク
ション・オブ・インダストリアル・マイクロオーガニズ
ムス（VKPM）・デポジタリー GNIIgenetika（Russian N
ational Collection of Industrial Microorganisms（V
KPM）Depositary, GNIIgenetika）（住所：1, Dorozhny
Proezd., 1, 113545, Moscow, Russia）に、登録番号V
KPM B-7693のもとに寄託されている。
【００５８】（２）バチルス・アミロリケファシエンス
のプレフェン酸デヒドラターゼ遺伝子ｐｈｅＡは、プラ
スミドｐＨＥＡ３２（ＰｈｅＡ+，ＥｍR）上でクローン
化された。
のプレフェン酸デヒドラターゼ遺伝子ｐｈｅＡは、プラ
スミドｐＨＥＡ３２（ＰｈｅＡ+，ＥｍR）上でクローン
化された。
【００５９】（３）ｐＨＥＡ３２プラスミドが改変され
た。プレフェン酸デヒドラターゼ遺伝子ｐｈｅＡは、プ
ラスミドｐＨＥＡ３２３上でバチルス・アミロリケファ
シエンスのリボソームタンパク質遺伝子ｒｐｍＡの強力
なプロモーターＰｒ(rpmA)下にクローン化された。ｐＨ
ＥＡ３２３を保持するバチルス・ズブチリスＳＢ１１
２，ｔｒｐＣ２，ｐｈｅＡ１１２は、1998年12月3日
に、ルシアン・ナショナル・コレクション・オブ・イン
ダストリアル・マイクロオーガニズムス（VKPM）・デポ
ジタリー GNIIgenetika（Russian National Collection
of Industrial Microorganisms（VKPM）Depositary, G
NIIgenetika）（住所：1, Dorozhny Proezd.,1, 11354
5, Moscow, Russia）に、登録番号VKPM B-7694のもとに
寄託されている。
た。プレフェン酸デヒドラターゼ遺伝子ｐｈｅＡは、プ
ラスミドｐＨＥＡ３２３上でバチルス・アミロリケファ
シエンスのリボソームタンパク質遺伝子ｒｐｍＡの強力
なプロモーターＰｒ(rpmA)下にクローン化された。ｐＨ
ＥＡ３２３を保持するバチルス・ズブチリスＳＢ１１
２，ｔｒｐＣ２，ｐｈｅＡ１１２は、1998年12月3日
に、ルシアン・ナショナル・コレクション・オブ・イン
ダストリアル・マイクロオーガニズムス（VKPM）・デポ
ジタリー GNIIgenetika（Russian National Collection
of Industrial Microorganisms（VKPM）Depositary, G
NIIgenetika）（住所：1, Dorozhny Proezd.,1, 11354
5, Moscow, Russia）に、登録番号VKPM B-7694のもとに
寄託されている。
【００６０】（４）強力なプロモーターＰｒ(rpmA)とプ
レフェン酸デヒドラターゼ遺伝子ｐｈｅＡを有するＤＮ
Ａ断片は、プラスミドｐＡＡ１上のバチルス・ズブチリ
スのアルファアミラーゼ遺伝子に挿入された。得られた
プラスミドは線状化され、バチルス・ズブチリスｐｈｅ
Ａ１１２株に導入された。
レフェン酸デヒドラターゼ遺伝子ｐｈｅＡを有するＤＮ
Ａ断片は、プラスミドｐＡＡ１上のバチルス・ズブチリ
スのアルファアミラーゼ遺伝子に挿入された。得られた
プラスミドは線状化され、バチルス・ズブチリスｐｈｅ
Ａ１１２株に導入された。
【００６１】（５）バチルス・アミロリケファシエンス
のＰｒ(rpmA)−ｐｈｅＡ ＤＮＡ断片は、プラスミドと
クロモゾーム上のアミラーゼ遺伝子間の相同組換えによ
ってバチルス・ズブチリスＳＢ１１２，ｔｒｐＣ２，ｐ
ｈｅＡ１１２（ルシアン・ナショナル・コレクション・
オブ・インダストリアル・マイクロオーガニズムス（VK
PM）・デポジタリー GNIIgenetika（Russian National
Collection of Industrial Microorganisms（VKPM）Dep
ositary, GNIIgenetika）（住所：1, Dorozhny Proez
d., 1, 113545, Moscow, Russia）に、VKPM B-1734の登
録番号で寄託されている。また、バチルス・ジェネティ
ック・ストックセンター（Bacillus GeneticStock Cent
er, The Ohio State University, Department of Bioch
emistry（484 West Twelfth Avenue, Columbus, Ohio 4
3210 USA)）にBGSC 1A227の登録番号で寄託されてい
る。）のクロモゾーム上のアミラーゼ遺伝子に組込まれ
た。
のＰｒ(rpmA)−ｐｈｅＡ ＤＮＡ断片は、プラスミドと
クロモゾーム上のアミラーゼ遺伝子間の相同組換えによ
ってバチルス・ズブチリスＳＢ１１２，ｔｒｐＣ２，ｐ
ｈｅＡ１１２（ルシアン・ナショナル・コレクション・
オブ・インダストリアル・マイクロオーガニズムス（VK
PM）・デポジタリー GNIIgenetika（Russian National
Collection of Industrial Microorganisms（VKPM）Dep
ositary, GNIIgenetika）（住所：1, Dorozhny Proez
d., 1, 113545, Moscow, Russia）に、VKPM B-1734の登
録番号で寄託されている。また、バチルス・ジェネティ
ック・ストックセンター（Bacillus GeneticStock Cent
er, The Ohio State University, Department of Bioch
emistry（484 West Twelfth Avenue, Columbus, Ohio 4
3210 USA)）にBGSC 1A227の登録番号で寄託されてい
る。）のクロモゾーム上のアミラーゼ遺伝子に組込まれ
た。
【００６２】組込み体は、ｐｈｅＡ変異の相補性により
選択された。構築されたバチルス・ズブチリスＡ１０
（ｔｒｐＣ２，ｐｈｅＡ１１２，ａｍｙ：：Ｐｒ(rpmA)
−ｐｈｅＡ）はクロモゾーム中に、強力なプロモーター
とバチルス・アミロリケファシエンスのプレフェン酸デ
ヒドラターゼ遺伝子からなる挿入物を有する。組込まれ
たＤＮＡ断片は、前記菌株のｐｈｅＡ１１２変異を相補
した。同菌株は、Ｐｈｅ +プラス表現型を有したが、Ａ
ｍｙ-とＴｒｙ-マイナス表現型であった。
選択された。構築されたバチルス・ズブチリスＡ１０
（ｔｒｐＣ２，ｐｈｅＡ１１２，ａｍｙ：：Ｐｒ(rpmA)
−ｐｈｅＡ）はクロモゾーム中に、強力なプロモーター
とバチルス・アミロリケファシエンスのプレフェン酸デ
ヒドラターゼ遺伝子からなる挿入物を有する。組込まれ
たＤＮＡ断片は、前記菌株のｐｈｅＡ１１２変異を相補
した。同菌株は、Ｐｈｅ +プラス表現型を有したが、Ａ
ｍｙ-とＴｒｙ-マイナス表現型であった。
【００６３】チロシン要求性は、細菌中の全プレフェン
酸の資化とチロシン生合成へのプレフェン酸の欠乏によ
り引き起こされた。これは、細菌中における、強力なＰ
ｒ(r pmA)プロモーター下でのｐｈｅＡ遺伝子発現と、非
常に高いプレフェン酸デヒドラターゼ酵素の活性による
結果であった（酵素活性は５０００倍以上に上昇し
た）。
酸の資化とチロシン生合成へのプレフェン酸の欠乏によ
り引き起こされた。これは、細菌中における、強力なＰ
ｒ(r pmA)プロモーター下でのｐｈｅＡ遺伝子発現と、非
常に高いプレフェン酸デヒドラターゼ酵素の活性による
結果であった（酵素活性は５０００倍以上に上昇し
た）。
【００６４】さらに、Ｐｒ(rpmA)−ｐｈｅＡ挿入物は、
バチルス・アミロリケファシエンスのａｒｏＤ遺伝子の
挿入のたたき台として使用された。
バチルス・アミロリケファシエンスのａｒｏＤ遺伝子の
挿入のたたき台として使用された。
【００６５】（６）組込まれたＤＮＡ断片（ａｍｙ：：
Ｐｒ(rpmA)−ｐｈｅＡ）は、高濃度のクロモゾームＤＮ
Ａによる形質転換における会合法（congression metho
d）（ＪErickson, R.T. et al., Genetics, 73(1), 13,
(1973); Nester, E.W. et al.,Genetics, 48, 529 (19
63)）を用いることにより、バチルス・ズブチリスＡ１
０株からバチルス・ズブチリスａｒｏＤ１２０，ｌｙｓ
１，ｔｒｐＣ２のクロモゾーム中へ転移された。
Ｐｒ(rpmA)−ｐｈｅＡ）は、高濃度のクロモゾームＤＮ
Ａによる形質転換における会合法（congression metho
d）（ＪErickson, R.T. et al., Genetics, 73(1), 13,
(1973); Nester, E.W. et al.,Genetics, 48, 529 (19
63)）を用いることにより、バチルス・ズブチリスＡ１
０株からバチルス・ズブチリスａｒｏＤ１２０，ｌｙｓ
１，ｔｒｐＣ２のクロモゾーム中へ転移された。
【００６６】構築されたバチルス・ズブチリスＡ１０−
ａｒｏＤ１２０株は、ａｍｙ：：Ｐｒ(rpmA)−ｐｈｅ
Ａ，ｔｒｐＣ２，ＡｒｏＤ１２０遺伝子型とＡｍｙ-、
Ｔｒｙ-、及びＡｒｏ-（マイナス）表現型を有してい
た。
ａｒｏＤ１２０株は、ａｍｙ：：Ｐｒ(rpmA)−ｐｈｅ
Ａ，ｔｒｐＣ２，ＡｒｏＤ１２０遺伝子型とＡｍｙ-、
Ｔｒｙ-、及びＡｒｏ-（マイナス）表現型を有してい
た。
【００６７】（７）次に、ａｒｏＤ遺伝子がクロモゾー
ムへ組込まれた（図８）。バチルス・アミロリケファシ
エンスのａｒｏＤ遺伝子を有するＤＮＡ断片は、Ｐｒ
(rpmA)プロモーターとｐｈｅＡ遺伝子間に組込まれた。
Ｐｒ(rpmA)−ａｒｏＤ(+)−ｐｈｅＡの構造は、インビ
トロでプラスミドｐＨＥＡ３２３とｐＡＤＰ４のＤＮＡ
を連結することにより構築された。生じたＤＮＡ連結混
合物は、栄養要求性バチルス・ズブチリスＡ１０−ａｒ
ｏＤ１２０（ａｍｙ：：Ｐｒ(rpmA)−ｐｈｅＡ，ｔｒｐ
Ｃ２，ａｒｏＤ１２０）株に形質転換された。ＡｒｏＤ
+（プラス）、Ｔｙｒ+（プラス）、およびＡｍｙ-（マ
イナス）原栄養体クローンが選択された。二重交差組換
えの結果、ａｒｏＤ遺伝子を有するＤＮＡ断片は、Ｐｒ
(rpmA)プロモーターとｐｈｅＡ遺伝子間でクロモゾーム
に組込まれ、Ｐｒ(rpmA)−ａｒｏＤ(+ )−ｐｈｅＡ構造
が形成された。得られた菌株バチルス・ズブチリスｄ３
は、ａｒｏＤ１２０，ｔｒｐＣ２，ａｍｙ：：Ｐｒ
(rpmA)−ａｒｏＤ(+)−ｐｈｅＡの遺伝子型を有した。
さらに、この挿入物はシキミ酸生産菌に形質導入され
た。
ムへ組込まれた（図８）。バチルス・アミロリケファシ
エンスのａｒｏＤ遺伝子を有するＤＮＡ断片は、Ｐｒ
(rpmA)プロモーターとｐｈｅＡ遺伝子間に組込まれた。
Ｐｒ(rpmA)−ａｒｏＤ(+)−ｐｈｅＡの構造は、インビ
トロでプラスミドｐＨＥＡ３２３とｐＡＤＰ４のＤＮＡ
を連結することにより構築された。生じたＤＮＡ連結混
合物は、栄養要求性バチルス・ズブチリスＡ１０−ａｒ
ｏＤ１２０（ａｍｙ：：Ｐｒ(rpmA)−ｐｈｅＡ，ｔｒｐ
Ｃ２，ａｒｏＤ１２０）株に形質転換された。ＡｒｏＤ
+（プラス）、Ｔｙｒ+（プラス）、およびＡｍｙ-（マ
イナス）原栄養体クローンが選択された。二重交差組換
えの結果、ａｒｏＤ遺伝子を有するＤＮＡ断片は、Ｐｒ
(rpmA)プロモーターとｐｈｅＡ遺伝子間でクロモゾーム
に組込まれ、Ｐｒ(rpmA)−ａｒｏＤ(+ )−ｐｈｅＡ構造
が形成された。得られた菌株バチルス・ズブチリスｄ３
は、ａｒｏＤ１２０，ｔｒｐＣ２，ａｍｙ：：Ｐｒ
(rpmA)−ａｒｏＤ(+)−ｐｈｅＡの遺伝子型を有した。
さらに、この挿入物はシキミ酸生産菌に形質導入され
た。
【００６８】＜２＞クロモゾームへ組込まれたプロモー
ターＰｒ(rpmA)とａｒｏＤ遺伝子のシキミ酸生産菌への
転移。 バチルス・ズブチリスｄ３株中に組込まれた遺伝子は抗
生物質耐性マーカー（ＥｍR，ＣｍR）でマークされ、形
質導入ファージＡＲ９を用いて、複合体の全てをバチル
ス・ズブチリスａｒｏＩ１１６シキミ酸生産菌に転移し
た。そのために、バチルス・ズブチリスｄ３株のクロモ
ゾームに組み込めるようなプラスミドｐＡＥ７を構築し
た。プラスミドｐＡＥ７は、アミラーゼ遺伝子、ｃａｔ
遺伝子（クロラフェニコールアセチルトランスフェラー
ゼ）（ＣｍR）、ｅｍｒ遺伝子（ＲＮＡメチラーゼ）
（ＥｍR）およびｐＵＣ１９（ＡｐR）レプリコンの各ク
ローン化断片を有する。ｐＡＥ７プラスミド（ＡｐR，
ＥｍR，ＣｍR，ａｍｙ-）は、バチルス・ズブチリス中
では複製しないが、形質転換後は、キャンベル型組換え
による単交差組換えによってバチルス・ズブチリスのク
ロモゾームのアミラーゼ遺伝子中に組込まれることがで
きる。
ターＰｒ(rpmA)とａｒｏＤ遺伝子のシキミ酸生産菌への
転移。 バチルス・ズブチリスｄ３株中に組込まれた遺伝子は抗
生物質耐性マーカー（ＥｍR，ＣｍR）でマークされ、形
質導入ファージＡＲ９を用いて、複合体の全てをバチル
ス・ズブチリスａｒｏＩ１１６シキミ酸生産菌に転移し
た。そのために、バチルス・ズブチリスｄ３株のクロモ
ゾームに組み込めるようなプラスミドｐＡＥ７を構築し
た。プラスミドｐＡＥ７は、アミラーゼ遺伝子、ｃａｔ
遺伝子（クロラフェニコールアセチルトランスフェラー
ゼ）（ＣｍR）、ｅｍｒ遺伝子（ＲＮＡメチラーゼ）
（ＥｍR）およびｐＵＣ１９（ＡｐR）レプリコンの各ク
ローン化断片を有する。ｐＡＥ７プラスミド（ＡｐR，
ＥｍR，ＣｍR，ａｍｙ-）は、バチルス・ズブチリス中
では複製しないが、形質転換後は、キャンベル型組換え
による単交差組換えによってバチルス・ズブチリスのク
ロモゾームのアミラーゼ遺伝子中に組込まれることがで
きる。
【００６９】このようにして、バチルス・ズブチリスｄ
３株はマークされた。得られた株は、バチルス・ズブチ
リスｄ３−ｐＡＥ７（ｔｒｐＣ２，ａｒｏＤ１２０，ａ
ｍｙ：：Ｐｒ(rpmA)−ａｒｏＤ(+)−ｐｈｅＡ；ａｍ
ｙ：：ｐＡＥ７，ＣｍR，ＥｍR）と命名された。同株
は、互いに近接する２つの組込物を保持する（図９）。
形質導入ファージＡＲ９の形質導入は、これら２つの組
込構造物をバチルス・ズブチリスｄ３−ｐＡＥ７株から
シキミ酸生産菌のバチルス・ズブチリスａｒｏＩ１１６
のクロモゾームに転移するために使用された。ＥｍRと
ＣｍRマーカーが、形質導入体の選択に使用された。
３株はマークされた。得られた株は、バチルス・ズブチ
リスｄ３−ｐＡＥ７（ｔｒｐＣ２，ａｒｏＤ１２０，ａ
ｍｙ：：Ｐｒ(rpmA)−ａｒｏＤ(+)−ｐｈｅＡ；ａｍ
ｙ：：ｐＡＥ７，ＣｍR，ＥｍR）と命名された。同株
は、互いに近接する２つの組込物を保持する（図９）。
形質導入ファージＡＲ９の形質導入は、これら２つの組
込構造物をバチルス・ズブチリスｄ３−ｐＡＥ７株から
シキミ酸生産菌のバチルス・ズブチリスａｒｏＩ１１６
のクロモゾームに転移するために使用された。ＥｍRと
ＣｍRマーカーが、形質導入体の選択に使用された。
【００７０】このようにして、更なる遺伝子が組み込ま
れた新規なシキミ酸生産菌バチルス・ズブチリスｄ３−
ｐＡＥ７−ａｒｏＩ１１６（ａｒｏＩ１１６，ａｍｙ
４，ａｍｙ：：Ｐｒ(rpmA)−ａｒｏＤ(+)−ｐｈｅＡ；
ａｍｙ：：ｐＡＥ７，ＣｍR，ＥｍR）が構築された。組
込まれたｐＡＥ７プラスミドは、抗生物質を含まない培
地で前記菌株を生育させることにより除去された。その
結果、新規なシキミ酸生産菌バチルス・ズブチリスＩＤ
３（ａｒｏＩ１１６，ａｍｙ４，ａｍｙ：：Ｐｒ (rpmA)
−ａｒｏＤ(+)−ｐｈｅＡ）が得られた。このシキミ酸
生産菌は、クロモゾーム中にａｒｏＤ遺伝子の２つのコ
ピーを含有している。ひとつは親株由来の遺伝子であ
り、もう一つは組込まれた遺伝子である（図９）。バチ
ルス・ズブチリスＩＤ３株は、バチルス・ズブチリスａ
ｒｏＩ１１６に比べて８倍以上のシキミ酸デヒドロゲナ
ーゼ活性を有する（後述表５）。研究用ファーメンター
で、バチルス・ズブチリスＩＤ３株は１１〜１２ｇ／Ｌ
のシキミ酸を生産した。バチルス・ズブチリスＩＤ３株
は、1999年3月1日に、ルシアン・ナショナル・コレクシ
ョン・オブ・インダストリアル・マイクロオーガニズム
ス（VKPM）・デポジタリー GNIIgenetika（Russian Nat
ional Collection of Industrial Microorganisms（VKP
M）Depositary, GNIIgenetika）（住所：1, Dorozhny P
roezd., 1, 113545, Moscow, Russia）に、登録番号VKP
M B-7755のもとに寄託されている。
れた新規なシキミ酸生産菌バチルス・ズブチリスｄ３−
ｐＡＥ７−ａｒｏＩ１１６（ａｒｏＩ１１６，ａｍｙ
４，ａｍｙ：：Ｐｒ(rpmA)−ａｒｏＤ(+)−ｐｈｅＡ；
ａｍｙ：：ｐＡＥ７，ＣｍR，ＥｍR）が構築された。組
込まれたｐＡＥ７プラスミドは、抗生物質を含まない培
地で前記菌株を生育させることにより除去された。その
結果、新規なシキミ酸生産菌バチルス・ズブチリスＩＤ
３（ａｒｏＩ１１６，ａｍｙ４，ａｍｙ：：Ｐｒ (rpmA)
−ａｒｏＤ(+)−ｐｈｅＡ）が得られた。このシキミ酸
生産菌は、クロモゾーム中にａｒｏＤ遺伝子の２つのコ
ピーを含有している。ひとつは親株由来の遺伝子であ
り、もう一つは組込まれた遺伝子である（図９）。バチ
ルス・ズブチリスＩＤ３株は、バチルス・ズブチリスａ
ｒｏＩ１１６に比べて８倍以上のシキミ酸デヒドロゲナ
ーゼ活性を有する（後述表５）。研究用ファーメンター
で、バチルス・ズブチリスＩＤ３株は１１〜１２ｇ／Ｌ
のシキミ酸を生産した。バチルス・ズブチリスＩＤ３株
は、1999年3月1日に、ルシアン・ナショナル・コレクシ
ョン・オブ・インダストリアル・マイクロオーガニズム
ス（VKPM）・デポジタリー GNIIgenetika（Russian Nat
ional Collection of Industrial Microorganisms（VKP
M）Depositary, GNIIgenetika）（住所：1, Dorozhny P
roezd., 1, 113545, Moscow, Russia）に、登録番号VKP
M B-7755のもとに寄託されている。
【００７１】＜３＞ａｒｏＤ組込み株へのａｒｏＡ遺伝
子の導入 ａｒｏＡ遺伝子は、芳香族化合物生合成の最初の酵素で
あるＤＡＨＰシンターゼをコードしている。バチルス・
アミロリケファシエンスＡ５０株のａｒｏＡ遺伝子を有
する３．５ｋｂＤＮＡ断片は、バチルス・ズブチリスＷ
Ｂ２２８１ ａｒｏＡ６レシピエント中の低コピーベク
ターｐＭＸ３９（ＥｍR）上でクローニングされた（図
１０）。生じた組換えプラスミドｐＡＡＰ６（ＡｒｏＡ
+，ＥｍR）は安定であり、抗生物質エリスロマイシン非
存在下の培地中での生育の間、バチルス・ズブチリス細
胞から分離しなかった。
子の導入 ａｒｏＡ遺伝子は、芳香族化合物生合成の最初の酵素で
あるＤＡＨＰシンターゼをコードしている。バチルス・
アミロリケファシエンスＡ５０株のａｒｏＡ遺伝子を有
する３．５ｋｂＤＮＡ断片は、バチルス・ズブチリスＷ
Ｂ２２８１ ａｒｏＡ６レシピエント中の低コピーベク
ターｐＭＸ３９（ＥｍR）上でクローニングされた（図
１０）。生じた組換えプラスミドｐＡＡＰ６（ＡｒｏＡ
+，ＥｍR）は安定であり、抗生物質エリスロマイシン非
存在下の培地中での生育の間、バチルス・ズブチリス細
胞から分離しなかった。
【００７２】ｐＡＡＰ６を保持するバチルス・ズブチリ
スａｒｏＡ６は、1998年12月3日に、（ルシアン・ナシ
ョナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイ
クロオーガニズムス（VKPM）・デポジタリー GNIIgenet
ika（Russian National Collection of Industrial Mic
roorganisms（VKPM）Depositary, GNIIgenetika）（住
所：1, Dorozhny Proezd., 1, 113545, Moscow, Russi
a）に、登録番号VKPM B-7698のもとに寄託されている。
スａｒｏＡ６は、1998年12月3日に、（ルシアン・ナシ
ョナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイ
クロオーガニズムス（VKPM）・デポジタリー GNIIgenet
ika（Russian National Collection of Industrial Mic
roorganisms（VKPM）Depositary, GNIIgenetika）（住
所：1, Dorozhny Proezd., 1, 113545, Moscow, Russi
a）に、登録番号VKPM B-7698のもとに寄託されている。
【００７３】プラスミドｐＡＡＰ６はシキミ酸生産菌で
あるバチルス・ズブチリスＩＤ３へ転移された。生じた
株は、バチルス・ズブチリスＩＤ３６（ＩＤ３／ｐＡＡ
Ｐ６）と命名された。その遺伝子型は、ａｒｏＩ１１６
ａｍｙ４ａｍｙ：：Ｐｒ(r pmA)−ａｒｏＤ(+)−ｐｈ
ｅＡ／ｐＡＡＰ６（ｅｒｍ, ａｒｏＡ(+)）である。Ｉ
Ｄ３６株は、ａｒｏＩ１１６変異であるため芳香族アミ
ノ酸要求株であり、エリスロマイシン（１０ｍｌ／Ｌ）
に耐性である。
あるバチルス・ズブチリスＩＤ３へ転移された。生じた
株は、バチルス・ズブチリスＩＤ３６（ＩＤ３／ｐＡＡ
Ｐ６）と命名された。その遺伝子型は、ａｒｏＩ１１６
ａｍｙ４ａｍｙ：：Ｐｒ(r pmA)−ａｒｏＤ(+)−ｐｈ
ｅＡ／ｐＡＡＰ６（ｅｒｍ, ａｒｏＡ(+)）である。Ｉ
Ｄ３６株は、ａｒｏＩ１１６変異であるため芳香族アミ
ノ酸要求株であり、エリスロマイシン（１０ｍｌ／Ｌ）
に耐性である。
【００７４】バチルス・ズブチリスＩＤ３６株は、最終
的な最適条件ではないが、研究用のファーメンターで１
８−１９ｇ／Ｌのシキミ酸を生産した（表３）。グルコ
ース供給率はシキミ酸生産に影響を与えることがわかっ
た。初発培養培地が１００ｇ／Ｌ又はそれ以下の濃度の
グルコースを含む場合、３ｇ／Ｌ・時間の供給率が上記
条件では最適であった。供給率がそれよりも低くても高
くても生産性は減少した。さらに、初発発酵培地がグル
コースを含まない場合、生産量は２０ｇ／Ｌまで上昇し
た。
的な最適条件ではないが、研究用のファーメンターで１
８−１９ｇ／Ｌのシキミ酸を生産した（表３）。グルコ
ース供給率はシキミ酸生産に影響を与えることがわかっ
た。初発培養培地が１００ｇ／Ｌ又はそれ以下の濃度の
グルコースを含む場合、３ｇ／Ｌ・時間の供給率が上記
条件では最適であった。供給率がそれよりも低くても高
くても生産性は減少した。さらに、初発発酵培地がグル
コースを含まない場合、生産量は２０ｇ／Ｌまで上昇し
た。
【００７５】
【表３】 表３ 研究用ファーメンター（１Ｌ）中でのバチルス・ズブチリス ＩＤ３６株によるシキミ酸生産 ──────────────────────────────────── 菌株 付加遺伝子 時間ＯＤ シキミ酸 テ゛ヒト゛ロシキミ酸 比率 h 560nm g/L g/L DHSH/SH ──────────────────────────────────── ID36 aroD クロモソ゛ーム中 28 56 4.4 6.0 1.4 (ID3/pAAP6) aroA フ゜ラスミト゛上 52 60 13.9 9.7 0.7 66 64 16.7 10.9 0.65 73 64 18.6 10.3 0.55 90 62 19.7 9.8 0.5 ────────────────────────────────────
【００７６】ｐＡＡＰ６プラスミドを有する各菌株につ
いて、ＤＡＨＰシンターゼ活性を測定した。これらの菌
株のＤＡＨＰシンターゼ活性は、プラスミドを有しない
株よりも５倍高かった（表４）。
いて、ＤＡＨＰシンターゼ活性を測定した。これらの菌
株のＤＡＨＰシンターゼ活性は、プラスミドを有しない
株よりも５倍高かった（表４）。
【００７７】
【表４】 表４ バチルス・ズブチリス シキミ酸生産菌中の ＤＡＨＰシンターゼ活性 ───────────────────────────── 菌株 付加遺伝子 DAHPシンターゼ活性 （nm/分・mg） ───────────────────────────── aroI116 なし 13 ───────────────────────────── ID3 aroD クロモゾーム中 13 ───────────────────────────── ID36 aroD クロモゾーム中 67 (ID3/pAAP6) aroA プラスミドpAAP6上 ─────────────────────────────
【００７８】
【実施例３】シキミ酸デヒドロゲナーゼをコードするａ
ｒｏＤ遺伝子の発現の最適化 バチルス・ズブチリスＩＤ３株をｐＤＰ４プラスミドＤ
ＮＡで形質転換し、ａｒｏＤ遺伝子の量（dose）とシキ
ミ酸デヒドロゲナーゼ活性を上昇させた。温度シフトと
抗生物質濃度により、いくつかの新規な菌株が構築され
た。
ｒｏＤ遺伝子の発現の最適化 バチルス・ズブチリスＩＤ３株をｐＤＰ４プラスミドＤ
ＮＡで形質転換し、ａｒｏＤ遺伝子の量（dose）とシキ
ミ酸デヒドロゲナーゼ活性を上昇させた。温度シフトと
抗生物質濃度により、いくつかの新規な菌株が構築され
た。
【００７９】バチルス・ズブチリスＩＤ３４−３７−５
は、ＩＤ３株をｐＤＰ４で形質転換し、３７℃で５ｍｇ
／ＬのＣｍを含む培地上での培養により選択することに
より、構築された。
は、ＩＤ３株をｐＤＰ４で形質転換し、３７℃で５ｍｇ
／ＬのＣｍを含む培地上での培養により選択することに
より、構築された。
【００８０】バチルス・ズブチリスＩＤ３４．５０．５
は、ＩＤ３株をｐＤＰ４で形質転換し、５０℃で５ｍｇ
／ＬのＣｍを含む培地上での培養により選択し、さらに
３７℃、５ｍｇ／Ｌ Ｃｍで生育させることにより、構
築された。プラスミドｐＤＰ４とバチルス・ズブチリス
ＩＤ３株のクロモゾームに保持されるバチルス・アミロ
リケファシエンスのａｒｏＤ遺伝子は相同性を有してい
る。前記プラスミドは、細菌中で、複製可能でない温度
である５０℃では自律複製できないが、ａｒｏＤ遺伝子
の相同性を利用することによりクロモゾームに組込むこ
とができる。したがって、５０℃で培養することによ
り、組込まれたプラスミドを持つクローンが選択され
る。
は、ＩＤ３株をｐＤＰ４で形質転換し、５０℃で５ｍｇ
／ＬのＣｍを含む培地上での培養により選択し、さらに
３７℃、５ｍｇ／Ｌ Ｃｍで生育させることにより、構
築された。プラスミドｐＤＰ４とバチルス・ズブチリス
ＩＤ３株のクロモゾームに保持されるバチルス・アミロ
リケファシエンスのａｒｏＤ遺伝子は相同性を有してい
る。前記プラスミドは、細菌中で、複製可能でない温度
である５０℃では自律複製できないが、ａｒｏＤ遺伝子
の相同性を利用することによりクロモゾームに組込むこ
とができる。したがって、５０℃で培養することによ
り、組込まれたプラスミドを持つクローンが選択され
る。
【００８１】バチルス・ズブチリスＩＤ３４．５０．１
００は、バチルス・ズブチリスＩＤ３４．５０．５を３
７℃で１００ｍｇ／ＬのＣｍを含む培地上で生育させる
ことにより構築された。ＩＤ３４．５０．５．のクロモ
ゾーム中に組込まれた２つのａｒｏＤコピーは、ダイレ
クトリピートとその間にあるｃａｔ遺伝子の構造を形成
する。ＩＤ３４．５０．５は、高濃度のクロロフェニコ
ール中で生育させることによりａｒｏＤとｃａｔ遺伝子
の増幅を引き起こすために使用された。
００は、バチルス・ズブチリスＩＤ３４．５０．５を３
７℃で１００ｍｇ／ＬのＣｍを含む培地上で生育させる
ことにより構築された。ＩＤ３４．５０．５．のクロモ
ゾーム中に組込まれた２つのａｒｏＤコピーは、ダイレ
クトリピートとその間にあるｃａｔ遺伝子の構造を形成
する。ＩＤ３４．５０．５は、高濃度のクロロフェニコ
ール中で生育させることによりａｒｏＤとｃａｔ遺伝子
の増幅を引き起こすために使用された。
【００８２】ｐＤＰ４プラスミドを有するバチルス・ズ
ブチリスＩＤ３生産菌のシキミ酸デヒドロゲナーゼ活性
は、非常に高く、１５０〜２００倍まで上昇した（表
５）。しかしながら、ｐＤＰ４プラスミドは、分離的に
は不安定であった。この問題は安定なベクターとクロモ
ゾームへのａｒｏＤ遺伝子マルチ組込みを利用すること
で解決されるであろう。
ブチリスＩＤ３生産菌のシキミ酸デヒドロゲナーゼ活性
は、非常に高く、１５０〜２００倍まで上昇した（表
５）。しかしながら、ｐＤＰ４プラスミドは、分離的に
は不安定であった。この問題は安定なベクターとクロモ
ゾームへのａｒｏＤ遺伝子マルチ組込みを利用すること
で解決されるであろう。
【００８３】
【表５】 表５ バチルス・ズブチリス シキミ酸生産菌の粗抽出液中の シキミ酸デヒドロゲナーゼ活性 ─────────────────────────────── 菌株 付加遺伝子 シキミ酸デヒドロゲナーゼ 活性（nm/分・mg） ─────────────────────────────── aroI116 なし 5 ─────────────────────────────── ID3 aroDクロモゾーム中 43 ─────────────────────────────── ID36 aroDクロモゾーム中 42 (ID3/pAAP6) aroAプラスミドpAAP6上 ─────────────────────────────── ID34.37.5 aroDクロモゾーム中 560 (ID3/pDP4) aroDプラスミドpDP4上 ─────────────────────────────── ID34.50.5 aroDクロモゾーム中 710 (ID3/pDP4) aroDプラスミドpDP4上 ─────────────────────────────── ID34.50.100 aroDクロモゾーム中 1090 (ID3/pDP4) aroDプラスミドpDP4上 ───────────────────────────────
【００８４】
【実施例４】 バチルス・ズブチリスＩＤ３株染色体へ
のａｒｏＡ遺伝子の組み込み ａｒｏＡ遺伝子を、ＩＤ３株の染色体上のリボフラビン
合成系オペロンに組み込んだ（図１１）。バチルス・ズ
ブチリスのリボフラビン合成系オペロン（ribオペロ
ン）を含むプラスミドpLP95をEcoRIで切断して、ribオ
ペロンを含むＤＮＡ断片を得た。同断片をPstIで切断し
て得られる２つのEcoRI-PstI断片と、ｐＡＡＰ６（Ａｒ
ｏＡ +，ＥｍR ）をPstIで切断して得られるaroA遺伝子
を含む断片を連結し、バチルス・ズブチリスＷＢ２２８
１ ａｒｏＡ６を形質転換した。ＡｒｏＡ(+)及びＲｉ
ｂ(-)の形質を有する形質転換株バチルス・ズブチリス
Ｆ８株は、染色体上のrib-オペロンの内部にａｒｏＡ
(+)遺伝子が組み込まれている。
のａｒｏＡ遺伝子の組み込み ａｒｏＡ遺伝子を、ＩＤ３株の染色体上のリボフラビン
合成系オペロンに組み込んだ（図１１）。バチルス・ズ
ブチリスのリボフラビン合成系オペロン（ribオペロ
ン）を含むプラスミドpLP95をEcoRIで切断して、ribオ
ペロンを含むＤＮＡ断片を得た。同断片をPstIで切断し
て得られる２つのEcoRI-PstI断片と、ｐＡＡＰ６（Ａｒ
ｏＡ +，ＥｍR ）をPstIで切断して得られるaroA遺伝子
を含む断片を連結し、バチルス・ズブチリスＷＢ２２８
１ ａｒｏＡ６を形質転換した。ＡｒｏＡ(+)及びＲｉ
ｂ(-)の形質を有する形質転換株バチルス・ズブチリス
Ｆ８株は、染色体上のrib-オペロンの内部にａｒｏＡ
(+)遺伝子が組み込まれている。
【００８５】次に、Ｆ８株から染色体ＤＮＡを単離し、
ヘルパープラスミドpMX39(EmR)と混合し、バチルス・ズ
ブチリスＩＤ３株を形質転換した。Rib(-)、Aro(-)、Am
y(-)及びEmRのクローンを選択し、ＩＤ４株と名付け
た。得られた株ＩＤ４（ribG::aroA(+)）は、ＩＤ３株
の３倍のDAHP合成酵素活性を有していた（表６）。ま
た、ＩＤ３株及びＩＤ４株を研究用ファーメンターで培
養したときのシキミ酸及びデヒドロシキミ酸生成量を経
時的に測定した結果を表７に示す。
ヘルパープラスミドpMX39(EmR)と混合し、バチルス・ズ
ブチリスＩＤ３株を形質転換した。Rib(-)、Aro(-)、Am
y(-)及びEmRのクローンを選択し、ＩＤ４株と名付け
た。得られた株ＩＤ４（ribG::aroA(+)）は、ＩＤ３株
の３倍のDAHP合成酵素活性を有していた（表６）。ま
た、ＩＤ３株及びＩＤ４株を研究用ファーメンターで培
養したときのシキミ酸及びデヒドロシキミ酸生成量を経
時的に測定した結果を表７に示す。
【００８６】
【表６】 表６バチルス・ズブチリスシキミ酸生産菌の 粗抽出物中のDAHP合成酵素活性 ─────────────────────────── 株 ハ゛チルス・アミロリケファシエンス DAHP合成酵素活性 の組込み遺伝子 （nm/分・mg） ─────────────────────────── ID3 染色体上aroD 7 ─────────────────────────── ID4 染色体上aroD, 24 染色体上aroA ───────────────────────────
【００８７】
【表７】 表７バチルス・ズブチリスID3とID4株における 研究用ファーメンター内でのシキミ産生酸 ─────────────────────────────────── 株 染色体に組込んだハ゛チルス・ 時間 OD シキミ酸 テ゛ヒト゛ロシキミ酸 アミロリケファシエンス遺伝子と特徴 (h) 560nm (g/L) (g/L) ─────────────────────────────────── ID3 染色体上aroD(+)遺伝子 23 43 4.8 0.8 Amy(-)マイナス 43 53 12.1 2.6 Aro(-)マイナス 51 53 14.8 3.7 66 54 16.5 4.4 90 47 17.3 4.5 ─────────────────────────────────── ID4 染色体上 23 43 4.1 0.9 aroD(+)とaroA(+)遺伝子 43 45 9.6 2.5 Amy(-)マイナス 51 38 10.6 2.2 Aro(-)マイナス 66 30 10.6 1.8 Rib(-)マイナス 90 29 11.3 2.1 ───────────────────────────────────
【００８８】
【実施例５】 ＩＤ４株のリボフラビン原栄養株の構築 ＩＤ４株のリボフラビン栄養要求性を相補するために、
バチルス・アミロリケファシエンスのribG遺伝子をＩＤ
４株の染色体に組み込んだ。得られた菌株は、ＩＤ５株
（ribG::aroA(+),xyz::ribG(B. am)）と命名された。Ｉ
Ｄ３、ＩＤ４及びＩＤ５株の試験管内最小OSM100培地で
のシキミ酸及びデヒドロシキミ酸の生産量を表８に示
す。
バチルス・アミロリケファシエンスのribG遺伝子をＩＤ
４株の染色体に組み込んだ。得られた菌株は、ＩＤ５株
（ribG::aroA(+),xyz::ribG(B. am)）と命名された。Ｉ
Ｄ３、ＩＤ４及びＩＤ５株の試験管内最小OSM100培地で
のシキミ酸及びデヒドロシキミ酸の生産量を表８に示
す。
【００８９】
【表８】 表８ バチルス・ズブチリスID3、ID4、ID5株による 試験管内最小OSM100培地でのシキミ酸生産 ──────────────────────────────────── 株 ID3 ID4 ID5 ──────────────────────────────────── 染色体中の標的と amy::aroD(+) amy::aroD(+), amy::aroD(+), ハ゛チルス・アミロリケファシエンスの rib::aroA(+) rib::aroA(+), 組込み遺伝子 xyz::ribG(+) ──────────────────────────────────── シキミ酸 (g/L) 6.3 5.7 5.1 ──────────────────────────────────── テ゛ヒト゛ロシキミ酸 (g/L) 0.8 0.9 0.6 ────────────────────────────────────
【００９０】（試験管内発酵用の最小培地「OSM100」の
組成） K2HPO4・3H2O 1.83% KH2PO4 0.6% 尿素 0.6%マルトース 4%シュークロース 8% MgSO4・7H20 0.1% FeSO4 0.001% MnSO4 0.001% L-trp 0.01% L-tyr 0.01% L-phe 0.01%
組成） K2HPO4・3H2O 1.83% KH2PO4 0.6% 尿素 0.6%マルトース 4%シュークロース 8% MgSO4・7H20 0.1% FeSO4 0.001% MnSO4 0.001% L-trp 0.01% L-tyr 0.01% L-phe 0.01%
【００９１】
【実施例６】５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン
酸合成酵素をコードするａｒｏＥ遺伝子を欠損し、か
つ、シキミ酸キナーゼを保持するシキミ酸生産の構築 本発明者は、研究室菌株であるバチルス・ズブチリスSB
130 (aroE130 hisH32)株を分析した。バチルス・ズブチ
リスSB130 (aroE130 hisH32)は、Russian National Col
lection of Industrial Microorganisms (VKPM) Deposi
tary, GNIIgenetika（住所：1, Dorozhny Proezd., 1,1
13545, Moscow, Russia）にVKPM B-1730の受託番号で寄
託されている。また、バチルス・ジェネティック・スト
ックセンター（Bacillus Genetic Stock Center, The O
hio State University, Department of Biochemistry
（484 West Twelfth Avenue, Columbus, Ohio 43210 US
A)）にBGSC 1A133の登録番号で寄託されている。SB130
株を、試験管中、37℃、90時間、OSM100培地で培養し
た。ＨＰＬＣ分析で、この菌株がシキミ酸1.1g/Lとデヒ
ドロシキミ酸0.16g/Lを蓄積したことが示された（表
９）。理論的には、この菌株はシキミ酸３−リン酸を蓄
積し得るはずであるが、シキミ酸を蓄積することが見い
出された。バチルス・ズブチリスのホスファターゼは、
シキミ酸３−リン酸からリン酸を切り離し、シキミ酸を
生成する可能性がある。
酸合成酵素をコードするａｒｏＥ遺伝子を欠損し、か
つ、シキミ酸キナーゼを保持するシキミ酸生産の構築 本発明者は、研究室菌株であるバチルス・ズブチリスSB
130 (aroE130 hisH32)株を分析した。バチルス・ズブチ
リスSB130 (aroE130 hisH32)は、Russian National Col
lection of Industrial Microorganisms (VKPM) Deposi
tary, GNIIgenetika（住所：1, Dorozhny Proezd., 1,1
13545, Moscow, Russia）にVKPM B-1730の受託番号で寄
託されている。また、バチルス・ジェネティック・スト
ックセンター（Bacillus Genetic Stock Center, The O
hio State University, Department of Biochemistry
（484 West Twelfth Avenue, Columbus, Ohio 43210 US
A)）にBGSC 1A133の登録番号で寄託されている。SB130
株を、試験管中、37℃、90時間、OSM100培地で培養し
た。ＨＰＬＣ分析で、この菌株がシキミ酸1.1g/Lとデヒ
ドロシキミ酸0.16g/Lを蓄積したことが示された（表
９）。理論的には、この菌株はシキミ酸３−リン酸を蓄
積し得るはずであるが、シキミ酸を蓄積することが見い
出された。バチルス・ズブチリスのホスファターゼは、
シキミ酸３−リン酸からリン酸を切り離し、シキミ酸を
生成する可能性がある。
【００９２】上記のように、本発明者は、シキミ酸は、
バチルス・ズブチリスのaroI116変異だけでなく、aroE1
30変異によっても産生されることを見いだした。そこ
で、シキミ酸生産菌であるバチルス・ズブチリスID3を
基に、EPSP合成酵素をコードする遺伝子中にaroE130変
異を有し、かつ、シキミ酸キナーゼ遺伝子中にaroI116
変異を有しない、新規のシキミ酸生産株を構築した。同
株は、ID3株から以下の３工程で構築された。
バチルス・ズブチリスのaroI116変異だけでなく、aroE1
30変異によっても産生されることを見いだした。そこ
で、シキミ酸生産菌であるバチルス・ズブチリスID3を
基に、EPSP合成酵素をコードする遺伝子中にaroE130変
異を有し、かつ、シキミ酸キナーゼ遺伝子中にaroI116
変異を有しない、新規のシキミ酸生産株を構築した。同
株は、ID3株から以下の３工程で構築された。
【００９３】（１）aroI116（Aro-）変異を有するバチ
ルス・ズブチリスID3を、バチルス・ズブチリス168のク
ローニングされたaroI遺伝子を含む1050bpの直鎖型Hind
III ＤＮＡ断片を用いて形質転換し、原栄養形質（Ar
o+）を得た。バチルス・ズブチリスのaroI遺伝子は、す
でにクローニングされ、配列決定されている（データベ
ース"SWISS-PROT:P37944"; Nakane A. et al., J. Ferm
ent. Bioeng., 77 (2), 312-314, (1994)）。ここで
は、E. coliベクターpTZ19RJL1を基に構築されたプラス
ミドpGI502のＤＮＡを用いた。最小培地上のAro+形質転
換体を選別し、得られた株をバチルス・ズブチリスD4と
命名した。その遺伝子型は、amy4, amy::Pr(rpmA)-aroD
(+)-pheAであり、表現型はAro+及びAmy-である。D4株
は、シキミ酸を産生しなかった。
ルス・ズブチリスID3を、バチルス・ズブチリス168のク
ローニングされたaroI遺伝子を含む1050bpの直鎖型Hind
III ＤＮＡ断片を用いて形質転換し、原栄養形質（Ar
o+）を得た。バチルス・ズブチリスのaroI遺伝子は、す
でにクローニングされ、配列決定されている（データベ
ース"SWISS-PROT:P37944"; Nakane A. et al., J. Ferm
ent. Bioeng., 77 (2), 312-314, (1994)）。ここで
は、E. coliベクターpTZ19RJL1を基に構築されたプラス
ミドpGI502のＤＮＡを用いた。最小培地上のAro+形質転
換体を選別し、得られた株をバチルス・ズブチリスD4と
命名した。その遺伝子型は、amy4, amy::Pr(rpmA)-aroD
(+)-pheAであり、表現型はAro+及びAmy-である。D4株
は、シキミ酸を産生しなかった。
【００９４】（２）クローニングされたaroE変異を有す
るaroE遺伝子を含むプラスミドを用いて、aroE130変異
を、「遺伝子変換（gene conversion）」法（Iglesias
A. andTrautner T.A., Mol. Gen. Genet., 189:73-76
(1983)）を利用してバチルス・ズブチリスD4株に導入し
た。バチルス・ズブチリスaroE(+)遺伝子は、すでにpTP
72プラスミド上にクローニングされている。aroE(+)遺
伝子をクローニングするために、バチルス・ズブチリス
の染色体ＤＮＡを、EcoRIで切断し、pCB20（先述）のEc
oRI断片とライゲーションした。このＤＮＡでバチルス
・ズブチリス trpE1733 recE4 受容菌を形質転換し、Em
R、Trp+のクローンを選択した。単離された組換えプラ
イマーをpTP72と命名した。このプラスミドpTP72で、tr
pE1733, trpE8, trpD10, trpC2, trpF5, trpB3, trpA17
22, trpA4, hisH32, tyrA and aroE130の変異を有する
バチルス・ズブチリス原栄養株を形質転換した。このプ
ラスミドpTP72（26.4 kbp）は、pCB20ベクター上にクロ
ーニングされたバチルス・ズブチリスの全トリプトファ
ンオペロン遺伝子、hisH、tyrA、及びaroE遺伝子を、19
kbpの単一のEcoRI断片上に有している。pTP72プラスミ
ドで、バチルス・ズブチリスSB130 aroE130 hisH32を形
質転換した。EmR形質転換体を選別し、Aro-表現型の有
無をテストした。aroE130変異は、「遺伝子変換」によ
り染色体からプラスミドへ導入された。同じ遺伝子の２
つの異なる対立遺伝子aroE130//aroE+は、４％の頻度で
単一のaroE130に変換された。プラスミド上のaroE+遺伝
子がaroE130に変換されたプラスミドを、pTP72 aroE130
と呼ぶ。
るaroE遺伝子を含むプラスミドを用いて、aroE130変異
を、「遺伝子変換（gene conversion）」法（Iglesias
A. andTrautner T.A., Mol. Gen. Genet., 189:73-76
(1983)）を利用してバチルス・ズブチリスD4株に導入し
た。バチルス・ズブチリスaroE(+)遺伝子は、すでにpTP
72プラスミド上にクローニングされている。aroE(+)遺
伝子をクローニングするために、バチルス・ズブチリス
の染色体ＤＮＡを、EcoRIで切断し、pCB20（先述）のEc
oRI断片とライゲーションした。このＤＮＡでバチルス
・ズブチリス trpE1733 recE4 受容菌を形質転換し、Em
R、Trp+のクローンを選択した。単離された組換えプラ
イマーをpTP72と命名した。このプラスミドpTP72で、tr
pE1733, trpE8, trpD10, trpC2, trpF5, trpB3, trpA17
22, trpA4, hisH32, tyrA and aroE130の変異を有する
バチルス・ズブチリス原栄養株を形質転換した。このプ
ラスミドpTP72（26.4 kbp）は、pCB20ベクター上にクロ
ーニングされたバチルス・ズブチリスの全トリプトファ
ンオペロン遺伝子、hisH、tyrA、及びaroE遺伝子を、19
kbpの単一のEcoRI断片上に有している。pTP72プラスミ
ドで、バチルス・ズブチリスSB130 aroE130 hisH32を形
質転換した。EmR形質転換体を選別し、Aro-表現型の有
無をテストした。aroE130変異は、「遺伝子変換」によ
り染色体からプラスミドへ導入された。同じ遺伝子の２
つの異なる対立遺伝子aroE130//aroE+は、４％の頻度で
単一のaroE130に変換された。プラスミド上のaroE+遺伝
子がaroE130に変換されたプラスミドを、pTP72 aroE130
と呼ぶ。
【００９５】（３）pTP72 aroE130プラスミドで、バチ
ルス・ズブチリスD4株を形質転換した。Aro-クローン
を、EmR形質転換体の中から選別した。aroE130変異は、
「遺伝子変換」により、pTP72 aroE130プラスミドから
バチルス・ズブチリスD4染色体へ４％の頻度で導入され
た。得られた菌株、バチルス・ズブチリスD4 aroE/pTP7
2aroE130は、染色体中とaroE遺伝子のプラスミド上に、
aroE130変異を有する。このプラスミドは、50℃で同菌
株から除去された。この菌株を、バチルス・ズブチリス
DE1株と命名した。その遺伝子型はaroE130, amy4, am
y::Pr(rpmA)-aroD(+)-pheAであり、表現型はAro-、Amy-
である。DE1株は、５−エノールピルビルシキミ酸−３
−リン酸合成酵素をコードするaroE遺伝子中にマイナス
変異を有する。バチルス・ズブチリスDE1(aroE130)株
は、37℃、90時間、試験管内のOSM100培地中で、シキミ
酸2.8g/L及びデヒドロシキミ酸0.18g/Lを産生した（表
９）。
ルス・ズブチリスD4株を形質転換した。Aro-クローン
を、EmR形質転換体の中から選別した。aroE130変異は、
「遺伝子変換」により、pTP72 aroE130プラスミドから
バチルス・ズブチリスD4染色体へ４％の頻度で導入され
た。得られた菌株、バチルス・ズブチリスD4 aroE/pTP7
2aroE130は、染色体中とaroE遺伝子のプラスミド上に、
aroE130変異を有する。このプラスミドは、50℃で同菌
株から除去された。この菌株を、バチルス・ズブチリス
DE1株と命名した。その遺伝子型はaroE130, amy4, am
y::Pr(rpmA)-aroD(+)-pheAであり、表現型はAro-、Amy-
である。DE1株は、５−エノールピルビルシキミ酸−３
−リン酸合成酵素をコードするaroE遺伝子中にマイナス
変異を有する。バチルス・ズブチリスDE1(aroE130)株
は、37℃、90時間、試験管内のOSM100培地中で、シキミ
酸2.8g/L及びデヒドロシキミ酸0.18g/Lを産生した（表
９）。
【００９６】
【表９】 表９ ──────────────────────────────────── 菌株 Ｄ４ ＳＢ１３０ ＤＥ１ ＩＤ３ ──────────────────────────────────── 栄養要求性変異 原栄養株 aroE130 aroE130 aroI116 hisH32 ──────────────────────────────────── 染色体中の標的と amy::aroD(+) − amy::aroD(+) amy::aroD(+) 組込まれたハ゛チルス・アミロリケファシエンス の 遺伝子 ──────────────────────────────────── シキミ酸(g/L) 0 1.1 2.8 6 ────────────────────────────────────テ゛ヒト゛ロシキミ 酸(g/L) 0 0.16 0.18 0.8 ────────────────────────────────────
【００９７】
【発明の効果】本発明により、シキミ酸を発酵法により
効率よく製造することができる。
効率よく製造することができる。
【図１】 aroA遺伝子を含むプラスミドpBAG7の構築過
程を示す図。
程を示す図。
【図２】 バチルス・ズブチリスとエシェリヒア・コリ
において複製することができる二機能のプラスミドpMX3
9の構造を示す図。
において複製することができる二機能のプラスミドpMX3
9の構造を示す図。
【図３】 aroD遺伝子のクローニング及び同遺伝子を含
むプラスミドpAD2の構造を示す図。
むプラスミドpAD2の構造を示す図。
【図４】 aroD遺伝子を含むプラスミドpAD2の最小化の
工程を示す図。
工程を示す図。
【図５】 プラスミドpCA1の構造を示す図。
【図６】 aroD遺伝子を含むプラスミドpDP4の構造を示
す図。
す図。
【図７】 Ｐｒ(rpmA)−ｐｈｅＡ ＤＮＡ断片をバチル
ス・ズブチリスSB112,trpC2,pheA112のクロモゾームに
組み込み、A10株を得る工程を示す図。
ス・ズブチリスSB112,trpC2,pheA112のクロモゾームに
組み込み、A10株を得る工程を示す図。
【図８】 aroD遺伝子をバチルス・ズブチリスA10のク
ロモゾームに組み込み、バチルス・ズブチリスd3を得る
工程を示す図。
ロモゾームに組み込み、バチルス・ズブチリスd3を得る
工程を示す図。
【図９】 aroD遺伝子が組み込まれたバチルス・ズブチ
リスID3のクロモゾーム断片の構造を示す図。
リスID3のクロモゾーム断片の構造を示す図。
【図１０】 aroA遺伝子を含むプラスミドpAAP6の構造
を示す図。
を示す図。
【図１１】 バチルス・サブチリスID3の染色体上のリ
ボフラビン合成系オペロンへのaroA遺伝子の組み込みの
過程を示す図。
ボフラビン合成系オペロンへのaroA遺伝子の組み込みの
過程を示す図。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:125） (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:125） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:125） (Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｒ 1:125） (72)発明者 エレナ・ゲオルギエヴナ・アバルキナ ロシア連邦，113545，モスクワ，１，ドロ ズニィ プロエズド，１ アジノモト−ジ ェネティカ リサーチ インスティテュー ト内 (72)発明者 ボリス・ミロノヴィッチ・ポラヌエル ロシア連邦，113545，モスクワ，１，ドロ ズニィ プロエズド，１ アジノモト−ジ ェネティカ リサーチ インスティテュー ト内 (72)発明者 タチアナ・アブラモヴナ・ヤンポリスカヤ ロシア連邦，113545，モスクワ，１，ドロ ズニィ プロエズド，１ アジノモト−ジ ェネティカ リサーチ インスティテュー ト内 (72)発明者 タチアナ・アレクサンドロヴナ・バーチナ ロシア連邦，113545，モスクワ，１，ドロ ズニィ プロエズド，１ アジノモト−ジ ェネティカ リサーチ インスティテュー ト内 (72)発明者 ユーリ・イヴァノヴィッチ・コズロフ ロシア連邦，113545，モスクワ，１，ドロ ズニィ プロエズド，１ アジノモト−ジ ェネティカ リサーチ インスティテュー ト内
Claims (14)
- 【請求項１】 シキミ酸キナーゼ活性を欠損し、シキミ
酸生産能を有するバチルス属細菌を培地で培養し、シキ
ミ酸を培地中に生成蓄積させ、該培地よりシキミ酸を採
取することを特徴とするシキミ酸の製造法。 - 【請求項２】 前記細菌がバチルス・ズブチリスである
請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 前記細菌は、細胞中のシキミ酸脱水素酵
素活性が増強されていることを特徴とする請求項１記載
の方法。 - 【請求項４】 前記シキミ酸脱水素酵素活性の増強が、
シキミ酸脱水素酵素をコードする遺伝子のコピー数を高
めること、同遺伝子の発現調節配列の強化、又は同遺伝
子の染色体ＤＮＡへの組み込みによるものである請求項
３記載の方法。 - 【請求項５】 固有のプロモーターが他の遺伝子のプロ
モーターに置換されるか、又は、他の遺伝子のプロモー
ターが追加されたシキミ酸脱水素酵素遺伝子が染色体Ｄ
ＮＡに組み込まれた請求項４記載の方法。 - 【請求項６】 前記細菌は、さらに細胞中の３−デオキ
シ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソン酸−７−リン酸合成酵
素が増強されていることを特徴とする請求項３記載の方
法。 - 【請求項７】 前記３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプ
ツロソン酸−７−リン酸合成酵素活性の増強が、３−デ
オキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソン酸−７−リン酸合
成酵素をコードする遺伝子のコピー数を高めること、同
遺伝子の発現調節配列の強化、又は同遺伝子の染色体Ｄ
ＮＡへの組み込みによるものである請求項６記載の方
法。 - 【請求項８】 シキミ酸キナーゼ活性を欠損し、かつ、
細胞中のシキミ酸脱水素酵素活性が増強され、シキミ酸
生産能を有するバチルス属細菌。 - 【請求項９】 さらに、細胞中の３−デオキシ−Ｄ−ア
ラビノ−ヘプツロソン酸−７−リン酸合成酵素活性が増
強された請求項８記載の細菌。 - 【請求項１０】 細胞中の５−エノールピルビルシキミ
酸−３−リン酸合成酵素活性を欠損し、かつ、シキミ酸
生産能を有するバチルス属細菌を培地で培養し、シキミ
酸を培地中に生成蓄積させ、該培地よりシキミ酸を採取
することを特徴とするシキミ酸の製造法。 - 【請求項１１】 前記細菌がバチルス・ズブチリスであ
る請求項１０記載の方法。 - 【請求項１２】 前記細菌は、さらに、シキミ酸脱水素
酵素活性が増強されていることを特徴とする請求項１０
記載の方法。 - 【請求項１３】 前記シキミ酸脱水素酵素活性の増強
が、シキミ酸脱水素酵素をコードする遺伝子のコピー数
を高めること、同遺伝子の発現調節配列の強化、又は同
遺伝子の染色体ＤＮＡへの組み込みによるものである請
求項１２記載の方法。 - 【請求項１４】 細胞中の５−エノールピルビルシキミ
酸−３−リン酸合成酵素活性を欠損し、かつ、シキミ酸
脱水素酵素活性が増強され、シキミ酸生産能を有するバ
チルス属細菌。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU99105931/13A RU99105931A (ru) | 1999-03-25 | Способ получения шикимовой кислоты | |
| RU99122932 | 1999-11-03 | ||
| RU99122932A RU2206612C2 (ru) | 1999-11-03 | 1999-11-03 | Способ получения шикимовой кислоты (варианты), штамм бактерий bacillus subtilis - продуцент шикимовой кислоты (варианты) |
| RU99105931 | 1999-11-03 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000079001A Pending JP2000287695A (ja) | 1999-03-25 | 2000-03-21 | シキミ酸の製造法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
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| RU2261273C2 (ru) * | 2002-11-15 | 2005-09-27 | Федеральное Государственное Унитарное Предприятие "Государственный Научно-Исследовательский Институт Генетики И Селекции Промышленных Микроорганизмов" (Фгуп Госнии Генетика) | Способ получения рибофлавина, штамм bacillus subtilis - продуцент рибофлавина (варианты) |
| WO2005030949A1 (en) * | 2003-09-24 | 2005-04-07 | Board Of Trustees Operating Michigan State University | Methods and materials for the production of shikimic acid |
| US20070134282A1 (en) * | 2005-12-09 | 2007-06-14 | Stephen F. Austin State University | Methods for inhibiting fungal pathogen infestation and propogation |
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| RU2006129690A (ru) | 2006-08-16 | 2008-02-27 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИЙ СЕМЕЙСТВА Enterobacteriaceae, В КОТОРОЙ ОСЛАБЛЕНА ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА ydiN, ГЕНА ydiB ИЛИ ИХ КОМБИНАЦИИ |
| WO2008027570A2 (en) * | 2006-08-30 | 2008-03-06 | The State Of Oregon Acting By And Through The State Board Of Higher Education On Behalf Of Oregon State University | Method of isolating shikimic acid from a plant |
| EP2145010A1 (en) * | 2007-04-13 | 2010-01-20 | Monsanto Technology, LLC | Use of glyphosate to produce shikimic acid in microorganisms |
| WO2009052303A2 (en) * | 2007-10-16 | 2009-04-23 | Monsanto Technology Llc | Processes for producing and recovering shikimic acid |
| CN102304539B (zh) * | 2011-08-26 | 2013-05-01 | 河南孟成生物药业股份有限公司 | 一种莽草酸生产用基因工程菌株的构建方法 |
| CN102816078B (zh) * | 2012-07-31 | 2014-11-26 | 中科院广州化学有限公司 | 一种制备n-(5-甲氧羰基-2-羟基苯基)氨基酸酯类化合物的方法 |
| CN104120119B (zh) * | 2013-04-28 | 2016-04-20 | 上海医药工业研究院 | 一种3-脱氢奎尼酸合成酶突变体及其基因和应用 |
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| CN107904197A (zh) * | 2017-09-13 | 2018-04-13 | 湖北大学 | 一种提高地衣芽胞杆菌发酵生产莽草酸的方法及工程菌 |
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Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20080909 |
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| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20090303 |