JPH07231789A - 枯草菌でのビオチンの生合成 - Google Patents
枯草菌でのビオチンの生合成Info
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- JPH07231789A JPH07231789A JP6143672A JP14367294A JPH07231789A JP H07231789 A JPH07231789 A JP H07231789A JP 6143672 A JP6143672 A JP 6143672A JP 14367294 A JP14367294 A JP 14367294A JP H07231789 A JPH07231789 A JP H07231789A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 商業的に使用しうる高力価ビオチンの効率的
な生産系を開発する。 【構成】 枯草菌またはそれに密接に関連した種のビオ
チン生合成酵素をコードする遺伝子のＤＮＡ配列、該Ｄ
ＮＡ配列を含むベクター、該ＤＮＡ配列または該ベクタ
ーを含む細胞、および該細胞によるビオチンの生産方法
を提供する。 【効果】 枯草菌の該ＤＮＡ配列を含む細胞は高レベル
のビオチンを産生させるのに有用であり、かかるビオチ
ンはヒトや動物の食品添加物として使用される。
な生産系を開発する。 【構成】 枯草菌またはそれに密接に関連した種のビオ
チン生合成酵素をコードする遺伝子のＤＮＡ配列、該Ｄ
ＮＡ配列を含むベクター、該ＤＮＡ配列または該ベクタ
ーを含む細胞、および該細胞によるビオチンの生産方法
を提供する。 【効果】 枯草菌の該ＤＮＡ配列を含む細胞は高レベル
のビオチンを産生させるのに有用であり、かかるビオチ
ンはヒトや動物の食品添加物として使用される。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、遺伝子工学的に操作さ
れた生物を使ってビオチンを生産することに関する。
れた生物を使ってビオチンを生産することに関する。
【０００２】
【従来の技術】ビオチン（ビタミンＢ8 またはビタミン
Ｈ）はカルボキシル化反応と脱炭酸反応の補酵素であっ
て、生細胞にとっては不可欠な代謝産物である。高等な
生物は外因生のビオチンを必要とするが、多くのバクテ
リアは自己のビオチンを合成する。
Ｈ）はカルボキシル化反応と脱炭酸反応の補酵素であっ
て、生細胞にとっては不可欠な代謝産物である。高等な
生物は外因生のビオチンを必要とするが、多くのバクテ
リアは自己のビオチンを合成する。
【０００３】ピメリル−ＣｏＡ（ＰｍＣｏＡ）からビオ
チンへのビオチン合成経路に関与する酵素的段階は大腸
菌 (Escherichia coli) とバシラス・スファエリカス
(Bacillus sphaericus)において解明されている〔図
１；Perkins and Pero, Bacillussubtilis and other G
ram-Positive Bacteria, Sonenshein, Hoch, and Losic
k編集, Amer. Soc. of Microbiology, pp. 325-329 (19
93)を参照〕。これらの段階は、１）７−ＫＡＰシンセ
ターゼ（bioF）によるピメリル−ＣｏＡの７−ケト−８
−アミノペラルゴン酸（７−ＫＡＰまたはＫＡＰＡ）へ
の転化；２）ＤＡＰＡアミノトランスフェラーゼ（bio
A）による７−ＫＡＰの７，８−ジアミノ−ペラルゴン
酸（ＤＡＰＡ）への転化；３）ＤＴＢシンセターゼ（bi
oD）によるＤＡＰＡのデスチオビオチン（ＤＴＢ）への
転化；および４）ビオチンシンセターゼ（bioB）による
ＤＴＢのビオチンへの転化を含んでいる。報告によれ
ば、ＰｍＣｏＡの合成は微生物ごとに異なる酵素的段階
を必要とする。ピメリル−ＣｏＡの合成に先行する段階
に関与する大腸菌遺伝子としては、bioC〔Otsuka et a
l., J. Biol. Chem. 263, 19577-19585 (1988) 〕とbio
H〔O'Regan et al., NucleicAcids Res. 17, 8004 (198
9)〕がある。B. sphaericus では、２つの異なる遺伝子
bioXとbioWがＰｍＣｏＡの合成に関与していると考えら
れる。bioXはピメレートの生合成に関与していると考え
られ〔Gloeckler et al., Gene 87, 63-70 (1990) 〕、
そしてbioWはピメリン酸（ＰｍＡ）をＰｍＣｏＡに転化
するピメリル−ＣｏＡシンセターゼをコードすることが
明らかにされた〔Ploux et al., Biochem. J. 287, 685
-690 (1992) 〕。B. sphaericus の遺伝子bioXとbioWは
どちらもヌクレオチドまたはタンパク質のレベルで大腸
菌のbioCおよびbioH遺伝子との有意な配列類似性を示さ
ない〔Gloeckler et al. (1990) 前掲〕。
チンへのビオチン合成経路に関与する酵素的段階は大腸
菌 (Escherichia coli) とバシラス・スファエリカス
(Bacillus sphaericus)において解明されている〔図
１；Perkins and Pero, Bacillussubtilis and other G
ram-Positive Bacteria, Sonenshein, Hoch, and Losic
k編集, Amer. Soc. of Microbiology, pp. 325-329 (19
93)を参照〕。これらの段階は、１）７−ＫＡＰシンセ
ターゼ（bioF）によるピメリル−ＣｏＡの７−ケト−８
−アミノペラルゴン酸（７−ＫＡＰまたはＫＡＰＡ）へ
の転化；２）ＤＡＰＡアミノトランスフェラーゼ（bio
A）による７−ＫＡＰの７，８−ジアミノ−ペラルゴン
酸（ＤＡＰＡ）への転化；３）ＤＴＢシンセターゼ（bi
oD）によるＤＡＰＡのデスチオビオチン（ＤＴＢ）への
転化；および４）ビオチンシンセターゼ（bioB）による
ＤＴＢのビオチンへの転化を含んでいる。報告によれ
ば、ＰｍＣｏＡの合成は微生物ごとに異なる酵素的段階
を必要とする。ピメリル−ＣｏＡの合成に先行する段階
に関与する大腸菌遺伝子としては、bioC〔Otsuka et a
l., J. Biol. Chem. 263, 19577-19585 (1988) 〕とbio
H〔O'Regan et al., NucleicAcids Res. 17, 8004 (198
9)〕がある。B. sphaericus では、２つの異なる遺伝子
bioXとbioWがＰｍＣｏＡの合成に関与していると考えら
れる。bioXはピメレートの生合成に関与していると考え
られ〔Gloeckler et al., Gene 87, 63-70 (1990) 〕、
そしてbioWはピメリン酸（ＰｍＡ）をＰｍＣｏＡに転化
するピメリル−ＣｏＡシンセターゼをコードすることが
明らかにされた〔Ploux et al., Biochem. J. 287, 685
-690 (1992) 〕。B. sphaericus の遺伝子bioXとbioWは
どちらもヌクレオチドまたはタンパク質のレベルで大腸
菌のbioCおよびbioH遺伝子との有意な配列類似性を示さ
ない〔Gloeckler et al. (1990) 前掲〕。
【０００４】大腸菌では、ビオチン生合成遺伝子が染色
体中に３つまたはそれ以上のオペロンとして存在してい
る。bioA遺伝子は１つのオペロンにあり、bioBFCD 遺伝
子群は第２の接近した連鎖オペロンにある。bioH遺伝子
は他のbio 遺伝子に連鎖していない（図２；Escherichi
a coli and Salmonella typhimurium: Cellular andMol
ecular Biology, vol. 1, Amer. Soc. Micro. Wash. D.
C. 中の Eisenberg,M.A. 1987 参照）。
体中に３つまたはそれ以上のオペロンとして存在してい
る。bioA遺伝子は１つのオペロンにあり、bioBFCD 遺伝
子群は第２の接近した連鎖オペロンにある。bioH遺伝子
は他のbio 遺伝子に連鎖していない（図２；Escherichi
a coli and Salmonella typhimurium: Cellular andMol
ecular Biology, vol. 1, Amer. Soc. Micro. Wash. D.
C. 中の Eisenberg,M.A. 1987 参照）。
【０００５】B. sphaericus では、bio 遺伝子の構成が
大腸菌のそれとは明らかに相違している。Gloeckler ら
〔(1990)前掲〕は B. sphaericusからbio 遺伝子をコー
ドする２つの非連鎖ＤＮＡ断片を単離し、それらの特性
を決定した。一方の断片はbioD, bioA, bioYおよびbioB
遺伝子をコードするオペロンを含み、他方の断片はbio
X, bioWおよびbioF遺伝子をコードするオペロンを含ん
でいる（図２）。bio 遺伝子の順序およびクラスター化
が大腸菌とB. sphaericus とでは相違している（図
２）。
大腸菌のそれとは明らかに相違している。Gloeckler ら
〔(1990)前掲〕は B. sphaericusからbio 遺伝子をコー
ドする２つの非連鎖ＤＮＡ断片を単離し、それらの特性
を決定した。一方の断片はbioD, bioA, bioYおよびbioB
遺伝子をコードするオペロンを含み、他方の断片はbio
X, bioWおよびbioF遺伝子をコードするオペロンを含ん
でいる（図２）。bio 遺伝子の順序およびクラスター化
が大腸菌とB. sphaericus とでは相違している（図
２）。
【０００６】Fisher（米国特許第5,110,731 号）は、大
腸菌のビオチンオペロンの遺伝子群を大腸菌の保持欠損
株に形質転換し、それを発現させるビオチン産生系をも
たらした。Gloeckler ら（米国特許第5,096,823 号）
は、B. sphaericus においてビオチンの生合成に関与す
る遺伝子：bioA, bioD, bioF, bioCおよびbioHを記載し
ている。bioAとbioDのB. sphaericus 遺伝子を大腸菌と
B. subtilis（枯草菌）の両方にクローニングした。bi
oAおよびbioD遺伝子をB. subtilis のBio- 栄養要求株
に安定した状態で組み込んで、原栄養株を選別した。
腸菌のビオチンオペロンの遺伝子群を大腸菌の保持欠損
株に形質転換し、それを発現させるビオチン産生系をも
たらした。Gloeckler ら（米国特許第5,096,823 号）
は、B. sphaericus においてビオチンの生合成に関与す
る遺伝子：bioA, bioD, bioF, bioCおよびbioHを記載し
ている。bioAとbioDのB. sphaericus 遺伝子を大腸菌と
B. subtilis（枯草菌）の両方にクローニングした。bi
oAおよびbioD遺伝子をB. subtilis のBio- 栄養要求株
に安定した状態で組み込んで、原栄養株を選別した。
【０００７】英国特許第2,216,530 号は、他の大腸菌遺
伝物質（例えば調節配列）から単離した大腸菌のbioA,
bioB, bioC, bioDおよびbioFの１以上の遺伝子を含むプ
ラスミドをもたらした。このプラスミドは大腸菌以外の
株（好ましくは酵母）内で複製する能力を有し、発現が
可能である。B. subtilis の３つのビオチン合成欠損変
異株（bioA、bioB、および大腸菌のbioFに類似している
らしいbio112と呼ばれる遺伝子）が報告されている〔Pa
i, Jour. Bact. 121, 1-8 (1975)およびGloeckler et a
l. (1990) 前掲〕。
伝物質（例えば調節配列）から単離した大腸菌のbioA,
bioB, bioC, bioDおよびbioFの１以上の遺伝子を含むプ
ラスミドをもたらした。このプラスミドは大腸菌以外の
株（好ましくは酵母）内で複製する能力を有し、発現が
可能である。B. subtilis の３つのビオチン合成欠損変
異株（bioA、bioB、および大腸菌のbioFに類似している
らしいbio112と呼ばれる遺伝子）が報告されている〔Pa
i, Jour. Bact. 121, 1-8 (1975)およびGloeckler et a
l. (1990) 前掲〕。
【０００８】日本ゼオン社（米国特許第4,563,426 号）
は、約２４時間培養した後でピメリン酸を添加すること
を含むビオチン発酵を開示している。Transgene ＳＡお
よび日本ゼオン社（ヨーロッパ特許出願公開第379,428
号）はビオチン発酵媒体にピメリン酸を添加することを
開示している。
は、約２４時間培養した後でピメリン酸を添加すること
を含むビオチン発酵を開示している。Transgene ＳＡお
よび日本ゼオン社（ヨーロッパ特許出願公開第379,428
号）はビオチン発酵媒体にピメリン酸を添加することを
開示している。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、ヒトや動物
用の食品添加物として有用なビオチンの高レベル生産に
用いるための枯草菌およびその密接に関連した種のビオ
チン生合成酵素をコードする遺伝子のＤＮＡ配列、該Ｄ
ＮＡ配列を含むベクター、該ＤＮＡ配列またはベクター
を含有する細胞、並びに該細胞によるビオチンの生産方
法を提供することを目的としている。
用の食品添加物として有用なビオチンの高レベル生産に
用いるための枯草菌およびその密接に関連した種のビオ
チン生合成酵素をコードする遺伝子のＤＮＡ配列、該Ｄ
ＮＡ配列を含むベクター、該ＤＮＡ配列またはベクター
を含有する細胞、並びに該細胞によるビオチンの生産方
法を提供することを目的としている。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明は、一般に、ビオ
チンの高レベル生産に用いるための枯草菌およびその密
接に関連した種のビオチン合成オペロンの遺伝子群を提
供する。本発明の特定の態様を以下に詳細に説明する。
本発明者らは、シトクロムＰ−４５０に類似した酵素を
コードする、これまでに知られていない遺伝子（bioI）
を同定し、クローニングし、そして遺伝子工学により操
作した。また、本発明者らは、２つのbio オペロン断片
を別々にクローニングし、in vitroでそれらを結合さ
せ、そして得られた連結構築物で宿主生物を形質転換す
ることにより、全枯草菌 bioオペロン（強力なプロモー
ターを用いて遺伝子操作すると、意外にも大腸菌には毒
性を示す）を過剰発現させるための戦略を開発した。２
つの断片のクローニングは、大腸菌内での毒性のため
に、該オペロンの５’末端を得るのに苦労したことによ
り容易ならざるものであった。本発明は、特に、上記戦
略により得られる全長オペロンを特徴としている。本発
明のこれらの特徴および他の特徴を以下に詳細に説明す
ることにする。
チンの高レベル生産に用いるための枯草菌およびその密
接に関連した種のビオチン合成オペロンの遺伝子群を提
供する。本発明の特定の態様を以下に詳細に説明する。
本発明者らは、シトクロムＰ−４５０に類似した酵素を
コードする、これまでに知られていない遺伝子（bioI）
を同定し、クローニングし、そして遺伝子工学により操
作した。また、本発明者らは、２つのbio オペロン断片
を別々にクローニングし、in vitroでそれらを結合さ
せ、そして得られた連結構築物で宿主生物を形質転換す
ることにより、全枯草菌 bioオペロン（強力なプロモー
ターを用いて遺伝子操作すると、意外にも大腸菌には毒
性を示す）を過剰発現させるための戦略を開発した。２
つの断片のクローニングは、大腸菌内での毒性のため
に、該オペロンの５’末端を得るのに苦労したことによ
り容易ならざるものであった。本発明は、特に、上記戦
略により得られる全長オペロンを特徴としている。本発
明のこれらの特徴および他の特徴を以下に詳細に説明す
ることにする。
【００１１】かくして、本発明は、１つの面において、
(a) 枯草菌または枯草菌に密接に関連した種のビオチン
生合成酵素をコードする遺伝子のＤＮＡ配列；(b) (a)
の生物学的に活性な断片をコードするＤＮＡ配列；およ
び(c) (a) または(b) に実質的に相同なＤＮＡ配列；よ
りなる群から選ばれるＤＮＡ配列を含むＤＮＡに特徴が
ある。ここで用いる枯草菌に「密接に関連した」種と
は、枯草菌により代表されるバシラス種のクラスターの
仲間である。該クラスターは例えば枯草菌 (B. subtili
s)、Ｂ．プミルス(B. pumilus)、Ｂ．リケニホルミス
(B. licheniformis)、Ｂ．アミロリクエファシエンス
(B. amyloliquefaciens)、Ｂ．メガテリウム(B. megate
rium) 、Ｂ．セレウス(B. cereus) およびＢ．チュリン
ジエンシス(B.thuringiensis)を含む。枯草菌クラスタ
ーの仲間はＢ．スファエリカス(B. sphaericus) および
Ｂ．ステアロテルモフィルス(B. stearothermophilus)
により代表されるクラスターの遠縁バシラス種から遺伝
的にそして代謝的に分岐したものである〔図３；Bacill
us subtilis and other Gram-Positive Bacteria, 前
掲,pp. 3-16中のPriest; Stackebrandt, et al., J. Ge
n. Micro. 133, 2523-2529(1987)〕。
(a) 枯草菌または枯草菌に密接に関連した種のビオチン
生合成酵素をコードする遺伝子のＤＮＡ配列；(b) (a)
の生物学的に活性な断片をコードするＤＮＡ配列；およ
び(c) (a) または(b) に実質的に相同なＤＮＡ配列；よ
りなる群から選ばれるＤＮＡ配列を含むＤＮＡに特徴が
ある。ここで用いる枯草菌に「密接に関連した」種と
は、枯草菌により代表されるバシラス種のクラスターの
仲間である。該クラスターは例えば枯草菌 (B. subtili
s)、Ｂ．プミルス(B. pumilus)、Ｂ．リケニホルミス
(B. licheniformis)、Ｂ．アミロリクエファシエンス
(B. amyloliquefaciens)、Ｂ．メガテリウム(B. megate
rium) 、Ｂ．セレウス(B. cereus) およびＢ．チュリン
ジエンシス(B.thuringiensis)を含む。枯草菌クラスタ
ーの仲間はＢ．スファエリカス(B. sphaericus) および
Ｂ．ステアロテルモフィルス(B. stearothermophilus)
により代表されるクラスターの遠縁バシラス種から遺伝
的にそして代謝的に分岐したものである〔図３；Bacill
us subtilis and other Gram-Positive Bacteria, 前
掲,pp. 3-16中のPriest; Stackebrandt, et al., J. Ge
n. Micro. 133, 2523-2529(1987)〕。
【００１２】上で述べたように、本発明者らは、枯草菌
またはその密接に関連した種に存在して、調節解除され
たビオチン産生に特に重要である新規な遺伝子（bioI）
を見いだした。該遺伝子は本発明の第１の面の好ましい
態様のＤＮＡ中に含まれる。また、好ましくは、少なく
ともbioAとbioBが第１の面のＤＮＡ中に含まれる。bio
D, bioF, bioWおよびORF2（β−ケトレダクターゼ様酵
素をコードする）も本発明のＤＮＡ中に含めるのが有利
である。上記遺伝子の少なくとも２つが該ＤＮＡ中に含
まれていてよい。該ＤＮＡ配列は転写プロモーター、例
えばＳＰ０１バクテリオファージ由来のプロモーターの
ような構成プロモーターに機能しうる状態で連結させて
もよい。枯草菌またはその密接に関連した種の全ビオチ
ンオペロンを単一の転写プロモーターに連結させること
もできる。さらに、本発明者らは第２のプロモーターを
含めることが特に有用であることに気づいた。すなわ
ち、１以上のＤＮＡ配列を第１の転写プロモーターに機
能しうる状態で連結させ、そして該遺伝子の少なくとも
１つのＤＮＡ配列を第２の転写プロモーターに機能しう
る状態で連結させる。第１のプロモーターは枯草菌また
はその密接に関連した種のbioA, bioB, bioD, bioFおよ
びbioWの１以上に機能しうる状態で連結させることがで
きる。他のプロモーターはbioI, bioA, bioBの１以上
に、あるいはこれらの組合せに機能しうる状態で連結さ
せることができる。特に好ましい態様では、第１のプロ
モーターが全オペロンの転写を制御し、そしてbioI（bi
oAおよび／またはbioBを含んでいてもよい）の転写が第
２のプロモーターによっても制御される。該ＤＮＡは枯
草菌またはその密接に関連した種のビオチンオペロンの
変異させた調節部位、例えばオペレーター、プロモータ
ー、転写終結部位、ｍＲＮＡプロセシング部位、リボソ
ーム結合部位または異化産物抑制部位を含んでいてもよ
い。変異とは、野生型の調節部位での挿入、置換または
欠失を意味する。
またはその密接に関連した種に存在して、調節解除され
たビオチン産生に特に重要である新規な遺伝子（bioI）
を見いだした。該遺伝子は本発明の第１の面の好ましい
態様のＤＮＡ中に含まれる。また、好ましくは、少なく
ともbioAとbioBが第１の面のＤＮＡ中に含まれる。bio
D, bioF, bioWおよびORF2（β−ケトレダクターゼ様酵
素をコードする）も本発明のＤＮＡ中に含めるのが有利
である。上記遺伝子の少なくとも２つが該ＤＮＡ中に含
まれていてよい。該ＤＮＡ配列は転写プロモーター、例
えばＳＰ０１バクテリオファージ由来のプロモーターの
ような構成プロモーターに機能しうる状態で連結させて
もよい。枯草菌またはその密接に関連した種の全ビオチ
ンオペロンを単一の転写プロモーターに連結させること
もできる。さらに、本発明者らは第２のプロモーターを
含めることが特に有用であることに気づいた。すなわ
ち、１以上のＤＮＡ配列を第１の転写プロモーターに機
能しうる状態で連結させ、そして該遺伝子の少なくとも
１つのＤＮＡ配列を第２の転写プロモーターに機能しう
る状態で連結させる。第１のプロモーターは枯草菌また
はその密接に関連した種のbioA, bioB, bioD, bioFおよ
びbioWの１以上に機能しうる状態で連結させることがで
きる。他のプロモーターはbioI, bioA, bioBの１以上
に、あるいはこれらの組合せに機能しうる状態で連結さ
せることができる。特に好ましい態様では、第１のプロ
モーターが全オペロンの転写を制御し、そしてbioI（bi
oAおよび／またはbioBを含んでいてもよい）の転写が第
２のプロモーターによっても制御される。該ＤＮＡは枯
草菌またはその密接に関連した種のビオチンオペロンの
変異させた調節部位、例えばオペレーター、プロモータ
ー、転写終結部位、ｍＲＮＡプロセシング部位、リボソ
ーム結合部位または異化産物抑制部位を含んでいてもよ
い。変異とは、野生型の調節部位での挿入、置換または
欠失を意味する。
【００１３】本発明の第２の面は、本発明者らが枯草菌
bioI を発見したことに関係している。この面は該遺伝
子または枯草菌 bioI に特異的にハイブリダイズする遺
伝子を特徴としている。また、それはこのような遺伝子
によりコードされるビオチン生合成酵素を特徴としてい
る。本発明は、また、上記のようなＤＮＡを含むベクタ
ー、並びに該ベクターまたは該ＤＮＡを含む細胞をも特
徴としている。好ましくは、該ＤＮＡはかかる細胞内で
高コピー数へと増幅される。さらに好ましくは、該ＤＮ
Ａは細胞の染色体に安定した状態で組み込まれる。該Ｄ
ＮＡは染色体の複数の部位（そのうちの少なくとも１つ
が bio遺伝子座である）に、各部位において高コピー数
で組み込まれてもよい。また好ましくは、該細胞は、該
ＤＮＡの存在に加えて、ビオチンまたはビオチン前駆体
の生産を調節解除する変異により特徴づけられる。かか
る変異細胞は該ＤＮＡを欠く野生型細胞と比較して増加
した量のビオチンを産生する。このような変異はアゼラ
イン酸耐性を付与する変異であっても、そして／またそ
れはbirAの変異であってもよい。
bioI を発見したことに関係している。この面は該遺伝
子または枯草菌 bioI に特異的にハイブリダイズする遺
伝子を特徴としている。また、それはこのような遺伝子
によりコードされるビオチン生合成酵素を特徴としてい
る。本発明は、また、上記のようなＤＮＡを含むベクタ
ー、並びに該ベクターまたは該ＤＮＡを含む細胞をも特
徴としている。好ましくは、該ＤＮＡはかかる細胞内で
高コピー数へと増幅される。さらに好ましくは、該ＤＮ
Ａは細胞の染色体に安定した状態で組み込まれる。該Ｄ
ＮＡは染色体の複数の部位（そのうちの少なくとも１つ
が bio遺伝子座である）に、各部位において高コピー数
で組み込まれてもよい。また好ましくは、該細胞は、該
ＤＮＡの存在に加えて、ビオチンまたはビオチン前駆体
の生産を調節解除する変異により特徴づけられる。かか
る変異細胞は該ＤＮＡを欠く野生型細胞と比較して増加
した量のビオチンを産生する。このような変異はアゼラ
イン酸耐性を付与する変異であっても、そして／またそ
れはbirAの変異であってもよい。
【００１４】上記の細胞は、ビオチンまたはその前駆体
の合成を可能にする時間および条件のもとで該細胞を培
養し、その後ビオチンまたはその前駆体を、好ましくは
該細胞の細胞外培地から、単離することを含むビオチン
またはその前駆体の生産方法において使用される。本発
明のさらに別の面は、上記のＤＮＡによりコードされる
組換えタンパク質、あるいは枯草菌またはその密接に関
連した種のビオチン生合成酵素のアミノ酸配列に実質的
に相同なアミノ酸配列からなる組換えビオチン生合成酵
素を特徴としている。
の合成を可能にする時間および条件のもとで該細胞を培
養し、その後ビオチンまたはその前駆体を、好ましくは
該細胞の細胞外培地から、単離することを含むビオチン
またはその前駆体の生産方法において使用される。本発
明のさらに別の面は、上記のＤＮＡによりコードされる
組換えタンパク質、あるいは枯草菌またはその密接に関
連した種のビオチン生合成酵素のアミノ酸配列に実質的
に相同なアミノ酸配列からなる組換えビオチン生合成酵
素を特徴としている。
【００１５】本発明の最後の面は、(a) 枯草菌細胞の個
体群を用意し；(b) アゼライン酸の存在下で該個体群を
生育させ；(c) アゼライン酸に対して耐性である細胞を
選別し；そして(d) 該細胞またはビオチン生産を調節解
除するようにさらに変異させた娘細胞をビオチンの過剰
生産能についてスクリーニングすることからなる、ビオ
チン生産の調節解除により特徴づけられる変異枯草菌細
胞の選別方法を特徴としている。
体群を用意し；(b) アゼライン酸の存在下で該個体群を
生育させ；(c) アゼライン酸に対して耐性である細胞を
選別し；そして(d) 該細胞またはビオチン生産を調節解
除するようにさらに変異させた娘細胞をビオチンの過剰
生産能についてスクリーニングすることからなる、ビオ
チン生産の調節解除により特徴づけられる変異枯草菌細
胞の選別方法を特徴としている。
【００１６】本発明の上述の記載は以下の定義および解
説を参照することによりさらに理解されるであろう。ベ
クターＤＮＡは枯草菌またはその密接に関連した種のビ
オチン生合成酵素をコードする遺伝子（または該遺伝子
の生物学的に活性な断片をコードするＤＮＡ配列）に実
質的に相同なＤＮＡ配列を含むことができる。該ＤＮＡ
配列は、それを細胞内で発現させるときにビオチンの合
成を増強する変異（例えば欠失、挿入または点突然変
異）を導入することによって野生型配列から誘導され
る。ビオチンオペロン遺伝子群のうちの少なくとも２、
３、４、５または６個、好ましくは全部を転写プロモー
ターに機能しうる状態で連結させるとメッセンジャーＲ
ＮＡが得られる。ここで用いる「オペロン」とは同一の
プロモーターから同時に転写される１またはそれ以上の
遺伝子を指す。「ビオチンオペロン」は遺伝子産物がビ
オチン生合成の一面に関与する遺伝子群を指す。「プロ
モーター」とは、該プロモーターの３’方向に位置する
遺伝子の転写を開始してメッセンジャーＲＮＡをもたら
すＲＮＡポリメラーゼ酵素により認識される核酸配列を
意味する。「転写プロモーターに機能しうる状態で連結
させた」とは、該プロモーターで開始されたＲＮＡ転写
物が該遺伝子に相補的なメッセンジャーＲＮＡを含むよ
うに、該遺伝子が該プロモーターに十分接近しているこ
とを意味する。転写プロモーターは構成プロモーター
（例えばＳＰ０１バクテリオファージ由来のプロモータ
ー）または誘導プロモーターのいずれであってもよい。
説を参照することによりさらに理解されるであろう。ベ
クターＤＮＡは枯草菌またはその密接に関連した種のビ
オチン生合成酵素をコードする遺伝子（または該遺伝子
の生物学的に活性な断片をコードするＤＮＡ配列）に実
質的に相同なＤＮＡ配列を含むことができる。該ＤＮＡ
配列は、それを細胞内で発現させるときにビオチンの合
成を増強する変異（例えば欠失、挿入または点突然変
異）を導入することによって野生型配列から誘導され
る。ビオチンオペロン遺伝子群のうちの少なくとも２、
３、４、５または６個、好ましくは全部を転写プロモー
ターに機能しうる状態で連結させるとメッセンジャーＲ
ＮＡが得られる。ここで用いる「オペロン」とは同一の
プロモーターから同時に転写される１またはそれ以上の
遺伝子を指す。「ビオチンオペロン」は遺伝子産物がビ
オチン生合成の一面に関与する遺伝子群を指す。「プロ
モーター」とは、該プロモーターの３’方向に位置する
遺伝子の転写を開始してメッセンジャーＲＮＡをもたら
すＲＮＡポリメラーゼ酵素により認識される核酸配列を
意味する。「転写プロモーターに機能しうる状態で連結
させた」とは、該プロモーターで開始されたＲＮＡ転写
物が該遺伝子に相補的なメッセンジャーＲＮＡを含むよ
うに、該遺伝子が該プロモーターに十分接近しているこ
とを意味する。転写プロモーターは構成プロモーター
（例えばＳＰ０１バクテリオファージ由来のプロモータ
ー）または誘導プロモーターのいずれであってもよい。
【００１７】オペロンの遺伝子はどれも、該ＤＮＡ配列
を細胞内で発現させるときにビオチンの合成を増強する
変異を含むことができる。関連した態様において、ビオ
チンオペロン中の、またはビオチンオペロンの遺伝子中
の調節部位も、細胞内で生産されるビオチンレベルを高
めるように、例えば変異によって変えることができる。
変更し得る調節部位としては、例えば転写終結部位、オ
ペレーター部位、ｍＲＮＡプロセシング部位、リボソー
ム結合部位または異化産物抑制部位がある。
を細胞内で発現させるときにビオチンの合成を増強する
変異を含むことができる。関連した態様において、ビオ
チンオペロン中の、またはビオチンオペロンの遺伝子中
の調節部位も、細胞内で生産されるビオチンレベルを高
めるように、例えば変異によって変えることができる。
変更し得る調節部位としては、例えば転写終結部位、オ
ペレーター部位、ｍＲＮＡプロセシング部位、リボソー
ム結合部位または異化産物抑制部位がある。
【００１８】本発明のベクターはどれも宿主細胞内に導
入することができる。好ましい宿主細胞は下記の理由の
ために枯草菌細胞である。しかし、本発明のベクターは
他のタイプの宿主細胞（例えば大腸菌細胞）やベクター
を維持しかつ／またベクターに含まれるビオチンオペロ
ンの遺伝子を発現させるのに必要な装置(apparatus)を
含む宿主細胞に挿入することもできる。宿主細胞を発現
のために使用する場合は、該宿主細胞は、枯草菌がそう
であるように、ビオチンを細胞外培地に分泌できるもの
で、ビオチン産物の回収を容易にするものが望ましい。
使用できるいくつかの宿主細胞として、グラム陽性菌、
例えば枯草菌１６８、Ｗ２３または納豆株のような枯草
菌細胞、Ｂ．リケニホルミス(B. licheniformis)、Ｂ．
アミロリクエファシエンス(B. amyloliquefaciens)、
Ｂ．プミルス(B. pumilus)、Ｂ．メガテリウム(B. mega
terium) またはＢ．セレウス(B. cereus) のような他の
バシラス株〔バシラス株については“Bacillus Genetic
Stock Center Catalogue ofStrains”、オハイオ州立
大学生化学部、オハイオ州コロンブス、D.H. Dean 編集
(1986) 第３版を参照〕、またはラクトコッカス(Lacto
coccus) 、ラクトバシラス(Lactobacillus) 、コリネバ
クテリウム(Corynebacterium) 、ブレビバクテリウム(B
revibacterium)、スタフィロコッカス(Staphylococcu
s)、ストレプトマイセス(Streptomyces)またはクロスト
リジウム(Clostridium) のような他のグラム陽性細胞；
グラム陰性菌、例えば大腸菌、サルモネラ(Salmonell
a)、セラチア(Serratia)またはクレブシェラ(Klebsiell
a)の菌株；あるいは真菌細胞、例えば酵母を挙げること
ができるが、これらに限らない。菌株およびグラム陽性
細胞に有用なベクターについては“Bacillus subtilis
and other Gram-Positive Bacteria”〔Sonenshein, Ho
ch, and Losick編集, Amer. Soc. of Microbiology (19
93) 〕を参照されたい。グラム陽性微生物由来のビオチ
ン遺伝子はグラム陰性菌内で発現させることができ（Gl
oeckler et al.前掲）、サッカロミセス・セレビシエ
(Saccharomyces cerevisiae) 由来の真菌遺伝子さえも
大腸菌内で発現させることができた〔Zhang et al., Ar
chives of Biochemistry and Biophysics 309, 29-35
(1994) 〕。
入することができる。好ましい宿主細胞は下記の理由の
ために枯草菌細胞である。しかし、本発明のベクターは
他のタイプの宿主細胞（例えば大腸菌細胞）やベクター
を維持しかつ／またベクターに含まれるビオチンオペロ
ンの遺伝子を発現させるのに必要な装置(apparatus)を
含む宿主細胞に挿入することもできる。宿主細胞を発現
のために使用する場合は、該宿主細胞は、枯草菌がそう
であるように、ビオチンを細胞外培地に分泌できるもの
で、ビオチン産物の回収を容易にするものが望ましい。
使用できるいくつかの宿主細胞として、グラム陽性菌、
例えば枯草菌１６８、Ｗ２３または納豆株のような枯草
菌細胞、Ｂ．リケニホルミス(B. licheniformis)、Ｂ．
アミロリクエファシエンス(B. amyloliquefaciens)、
Ｂ．プミルス(B. pumilus)、Ｂ．メガテリウム(B. mega
terium) またはＢ．セレウス(B. cereus) のような他の
バシラス株〔バシラス株については“Bacillus Genetic
Stock Center Catalogue ofStrains”、オハイオ州立
大学生化学部、オハイオ州コロンブス、D.H. Dean 編集
(1986) 第３版を参照〕、またはラクトコッカス(Lacto
coccus) 、ラクトバシラス(Lactobacillus) 、コリネバ
クテリウム(Corynebacterium) 、ブレビバクテリウム(B
revibacterium)、スタフィロコッカス(Staphylococcu
s)、ストレプトマイセス(Streptomyces)またはクロスト
リジウム(Clostridium) のような他のグラム陽性細胞；
グラム陰性菌、例えば大腸菌、サルモネラ(Salmonell
a)、セラチア(Serratia)またはクレブシェラ(Klebsiell
a)の菌株；あるいは真菌細胞、例えば酵母を挙げること
ができるが、これらに限らない。菌株およびグラム陽性
細胞に有用なベクターについては“Bacillus subtilis
and other Gram-Positive Bacteria”〔Sonenshein, Ho
ch, and Losick編集, Amer. Soc. of Microbiology (19
93) 〕を参照されたい。グラム陽性微生物由来のビオチ
ン遺伝子はグラム陰性菌内で発現させることができ（Gl
oeckler et al.前掲）、サッカロミセス・セレビシエ
(Saccharomyces cerevisiae) 由来の真菌遺伝子さえも
大腸菌内で発現させることができた〔Zhang et al., Ar
chives of Biochemistry and Biophysics 309, 29-35
(1994) 〕。
【００１９】ベクターが染色体外要素である場合は、そ
れを細胞内で高コピー数へと増幅させることが可能であ
る。これとは別に、ベクターが染色体外要素でない場合
は、該ベクターを細胞の染色体に安定した状態で組み込
むことができる。組み込まれたベクターも細胞内で高コ
ピー数へと増幅させることが可能であり、すなわち組込
みが複数の部位で起こるか、または各部位において高コ
ピー数で起こる。組込みは染色体のランダムな部位で起
こってもよいが、染色体の好ましい遺伝子座（例えば b
io遺伝子座）で起こるようにすることが好ましい。完全
なベクターを染色体に組み込んでも、ビオチン生合成配
列だけを非ビオチン生合成配列（例えばレプリコン配
列）の少なくとも一部を欠く染色体に組み込んでもよ
い。該ベクターまたはビオチンオペロン配列を含む細胞
はさらにビオチン生産について調節解除され得る。
れを細胞内で高コピー数へと増幅させることが可能であ
る。これとは別に、ベクターが染色体外要素でない場合
は、該ベクターを細胞の染色体に安定した状態で組み込
むことができる。組み込まれたベクターも細胞内で高コ
ピー数へと増幅させることが可能であり、すなわち組込
みが複数の部位で起こるか、または各部位において高コ
ピー数で起こる。組込みは染色体のランダムな部位で起
こってもよいが、染色体の好ましい遺伝子座（例えば b
io遺伝子座）で起こるようにすることが好ましい。完全
なベクターを染色体に組み込んでも、ビオチン生合成配
列だけを非ビオチン生合成配列（例えばレプリコン配
列）の少なくとも一部を欠く染色体に組み込んでもよ
い。該ベクターまたはビオチンオペロン配列を含む細胞
はさらにビオチン生産について調節解除され得る。
【００２０】「ビオチン生産について調節解除される」
とは、ビオチン生合成のレベルを制御する負の制限が細
胞から少なくとも部分的に除かれることを意味する。負
の制限には調節タンパク質（例えばリプレッサー）、調
節タンパク質の作用部位（例えばオペレーター）、抑制
因子、または低レベルの律速酵素が含まれるが、これら
に限らない。該細胞は大腸菌のbirA遺伝子座に対して相
補性を示す遺伝子座に変異を含むことができる。ビオチ
ン分泌の増加を引き起こす変異を含む枯草菌株としてＨ
Ｂ３、ＨＢ９、ＨＢ１５、ＨＢ４３、α−ＤＢ９、α−
ＤＢ１２、α−ＤＢ６およびα−ＤＢ１７株、または表
８、表９、表10に挙げた変異株もしくは遺伝子操作され
た菌株があるが、これらに限らない。ビオチンは少なく
とも０．１ｍｇ／ｌ、１ｍｇ／ｌ、１０ｍｇ／ｌ、１０
０ｍｇ／ｌ、３００ｍｇ／ｌ、５００ｍｇ／ｌ、７５０
ｍｇ／ｌ、または１．０ｇ／ｌの濃度となるように細胞
外培地に分泌されることが好ましい。宿主細胞は枯草菌
であることが望ましいが、それは上で挙げた宿主菌株の
いずれであってもよい。「ビタマー」または「ビオチン
ビタマー」とは、酵母への供給に使用し得るビオチン生
合成経路でビオチンに先行する化合物のことであり、例
えば図１に示した次の化合物：７−ＫＡＰ、ＤＡＰＡま
たはデスチオビオチンを指す。用語「ビオチン前駆体」
は上記のビオチンビタマーのそれぞれとＰｍＡおよびＰ
ｍＣｏＡを含む。「実質的に相同」とは、枯草菌を含む
クラスター内のバシラス種のＤＮＡへのハイブリダイゼ
ーションを可能にする条件であるが、ストリンジェント
であるために枯草菌に密接に関連した種のクラスター外
の生物のＤＮＡへのハイブリダイゼーションを不可能に
する条件下で、特異的ハイブリダイゼーションをもたら
すのに十分な相同性を有することを意味する。この目的
にかなうプローブは以下に提示する。適当なハイブリダ
イゼーションは比較的ストリンジェントな条件を用い
る。例えば、変性ＤＮＡを含むニトロセルロースフィル
ターを、５×ＳＳＣ（0.75M NaClおよび0.075Mクエン酸
Na, pH 7.0）、１０−５０％ホルムアミド、１×Denhar
dt溶液（0.02% ウシ血清アルブミン、0.02% フィコー
ル、0.02% ピロリドン）および１００μｇ／ｍｌ変性サ
ケ精子ＤＮＡの存在下に３７〜４２℃で放射性標識ＤＮ
ＡまたはＲＮＡプローブと共にインキュベートする。当
業者は、適当な特異性が得られる（つまり、非特異的結
合が減少または排除される）まで、例えばホルムアミド
の濃度や温度を上げることによってストリンジェンシー
を次第に高めることができることを理解するであろう。
とは、ビオチン生合成のレベルを制御する負の制限が細
胞から少なくとも部分的に除かれることを意味する。負
の制限には調節タンパク質（例えばリプレッサー）、調
節タンパク質の作用部位（例えばオペレーター）、抑制
因子、または低レベルの律速酵素が含まれるが、これら
に限らない。該細胞は大腸菌のbirA遺伝子座に対して相
補性を示す遺伝子座に変異を含むことができる。ビオチ
ン分泌の増加を引き起こす変異を含む枯草菌株としてＨ
Ｂ３、ＨＢ９、ＨＢ１５、ＨＢ４３、α−ＤＢ９、α−
ＤＢ１２、α−ＤＢ６およびα−ＤＢ１７株、または表
８、表９、表10に挙げた変異株もしくは遺伝子操作され
た菌株があるが、これらに限らない。ビオチンは少なく
とも０．１ｍｇ／ｌ、１ｍｇ／ｌ、１０ｍｇ／ｌ、１０
０ｍｇ／ｌ、３００ｍｇ／ｌ、５００ｍｇ／ｌ、７５０
ｍｇ／ｌ、または１．０ｇ／ｌの濃度となるように細胞
外培地に分泌されることが好ましい。宿主細胞は枯草菌
であることが望ましいが、それは上で挙げた宿主菌株の
いずれであってもよい。「ビタマー」または「ビオチン
ビタマー」とは、酵母への供給に使用し得るビオチン生
合成経路でビオチンに先行する化合物のことであり、例
えば図１に示した次の化合物：７−ＫＡＰ、ＤＡＰＡま
たはデスチオビオチンを指す。用語「ビオチン前駆体」
は上記のビオチンビタマーのそれぞれとＰｍＡおよびＰ
ｍＣｏＡを含む。「実質的に相同」とは、枯草菌を含む
クラスター内のバシラス種のＤＮＡへのハイブリダイゼ
ーションを可能にする条件であるが、ストリンジェント
であるために枯草菌に密接に関連した種のクラスター外
の生物のＤＮＡへのハイブリダイゼーションを不可能に
する条件下で、特異的ハイブリダイゼーションをもたら
すのに十分な相同性を有することを意味する。この目的
にかなうプローブは以下に提示する。適当なハイブリダ
イゼーションは比較的ストリンジェントな条件を用い
る。例えば、変性ＤＮＡを含むニトロセルロースフィル
ターを、５×ＳＳＣ（0.75M NaClおよび0.075Mクエン酸
Na, pH 7.0）、１０−５０％ホルムアミド、１×Denhar
dt溶液（0.02% ウシ血清アルブミン、0.02% フィコー
ル、0.02% ピロリドン）および１００μｇ／ｍｌ変性サ
ケ精子ＤＮＡの存在下に３７〜４２℃で放射性標識ＤＮ
ＡまたはＲＮＡプローブと共にインキュベートする。当
業者は、適当な特異性が得られる（つまり、非特異的結
合が減少または排除される）まで、例えばホルムアミド
の濃度や温度を上げることによってストリンジェンシー
を次第に高めることができることを理解するであろう。
【００２１】「ビオチン合成酵素」とは、図１に示した
またはここで論じたビオチン生合成経路を形成する酵素
のいずれか、並びにここで新たに開示した遺伝子（例え
ばbioIまたはORF2）によりコードされる酵素を意味す
る。用語「ビオチン生合成酵素」は枯草菌のビオチン生
合成酵素の生化学的作用を示す天然ビオチン生合成酵素
の一部または断片をも含むものである。このようなビオ
チン生合成酵素の一部または断片の大きさは、それが天
然酵素の生化学的活性を保持するという機能的要件によ
り決定される。関連遺伝子の加水分解切断または末端切
断によりポリペプチド鎖を短くした後に１以上の活性を
保持する酵素の例は文献に数多く載っている〔例えば、
Dautry-Varsat and Cohen, J. Biol. Chem. 252, 7685-
7689 (1977) を参照〕。
またはここで論じたビオチン生合成経路を形成する酵素
のいずれか、並びにここで新たに開示した遺伝子（例え
ばbioIまたはORF2）によりコードされる酵素を意味す
る。用語「ビオチン生合成酵素」は枯草菌のビオチン生
合成酵素の生化学的作用を示す天然ビオチン生合成酵素
の一部または断片をも含むものである。このようなビオ
チン生合成酵素の一部または断片の大きさは、それが天
然酵素の生化学的活性を保持するという機能的要件によ
り決定される。関連遺伝子の加水分解切断または末端切
断によりポリペプチド鎖を短くした後に１以上の活性を
保持する酵素の例は文献に数多く載っている〔例えば、
Dautry-Varsat and Cohen, J. Biol. Chem. 252, 7685-
7689 (1977) を参照〕。
【００２２】ここで用いる「断片」または「一部」とい
う用語はポリペプチドに適用され、鎖長が通常は少なく
とも約１０個の連続アミノ酸、一般には少なくとも約２
０個の連続アミノ酸、好ましくは少なくとも約３０個の
連続アミノ酸、より好ましくは少なくとも約５０個の連
続アミノ酸、そして最も好ましくは少なくとも約６０〜
８０個の連続アミノ酸である。同様に、核酸と関連させ
た用語「断片」は上で定義したポリペプチド断片をコー
ドするＤＮＡ配列を指す。対応する天然酵素の生物学的
活性を示す候補断片の能力は、次のプロトコールを含む
がこれらに限らない当業者に知られた方法により評価す
ることができる。ピメリル−ＣｏＡシンセターゼ（bio
W）、７−ＫＡＰシンセターゼ（bioF）、ＤＡＰＡアミ
ノトランスフェラーゼ（bioA）およびＤＴＢシンセター
ゼ（bioD）のアッセイはIzumi ら〔Methods in Enzy. 6
2, 326-338 (1979) 〕により記載されている。ビオチン
シンセターゼ（bioB）の無細胞アッセイはIfuku ら〔Bi
osci. Biotech. Biochem. 56, 1780-1785 (1992)〕によ
り記載されている。bioIの産物はOmura ら〔J. Biol.Ch
em. 239, 2310-2378 (1964)〕により記載される分光測
定によってシトクロムＰ−４５０と同定しうる。
う用語はポリペプチドに適用され、鎖長が通常は少なく
とも約１０個の連続アミノ酸、一般には少なくとも約２
０個の連続アミノ酸、好ましくは少なくとも約３０個の
連続アミノ酸、より好ましくは少なくとも約５０個の連
続アミノ酸、そして最も好ましくは少なくとも約６０〜
８０個の連続アミノ酸である。同様に、核酸と関連させ
た用語「断片」は上で定義したポリペプチド断片をコー
ドするＤＮＡ配列を指す。対応する天然酵素の生物学的
活性を示す候補断片の能力は、次のプロトコールを含む
がこれらに限らない当業者に知られた方法により評価す
ることができる。ピメリル−ＣｏＡシンセターゼ（bio
W）、７−ＫＡＰシンセターゼ（bioF）、ＤＡＰＡアミ
ノトランスフェラーゼ（bioA）およびＤＴＢシンセター
ゼ（bioD）のアッセイはIzumi ら〔Methods in Enzy. 6
2, 326-338 (1979) 〕により記載されている。ビオチン
シンセターゼ（bioB）の無細胞アッセイはIfuku ら〔Bi
osci. Biotech. Biochem. 56, 1780-1785 (1992)〕によ
り記載されている。bioIの産物はOmura ら〔J. Biol.Ch
em. 239, 2310-2378 (1964)〕により記載される分光測
定によってシトクロムＰ−４５０と同定しうる。
【００２３】「組換え」とは、該酵素をコードする遺伝
子が枯草菌染色体中の自然界で存在するその部位から取
り出されて、当業者に知られた遺伝子工学技術によりベ
クター中に永続的または一時的に挿入されることを意味
する。好ましくは、ベクターは挿入した遺伝子の発現を
可能にする配列を含む。ここで用いる「ベクター」と
は、例えばトランスフェクション、形質転換または形質
導入により細胞内に導入することができる核酸分子のこ
とである。ベクターにはプラスミド、バクテリオファー
ジ、ファージミド、コスミドおよびトランスポゾンが含
まれるが、これらに限らない。ここで用いるベクターの
例としてｐＢＲ３２２、ｐＣＬ１９２０、ｐＣＬ１９２
１、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９またはｐＳＣ１０１を挙げ
ることができるが、これらに限らない。これらのベクタ
ーは大腸菌や他のバクテリア内で複製するが、枯草菌内
では複製せず、かくして適当な選択マーカーの付加後に
は枯草菌への組込み型ベクターとして有用である。枯草
菌用の常用される他のベクターとしては、プラスミドｐ
ＵＢ１１０、ｐＥ１９４、ｐＣ１９４および枯草菌内で
複製するそれらの誘導体、または“Bacillus subtilis
and other Gram-Positive Bacteria”（前掲、pp. 585-
650）の第40-44章に記載される組込み型ベクター、プラ
スミド、テンペレートファージベクターまたはトランス
ポゾンが含まれる。多くの微生物用のベクターはさらに
“Cloning Vectors: A Laboratory Manual”〔Pouwels
et al. Elsevier (1985)、1986年と1988年に追加の改訂
版あり〕にも記載されている。組換え型の遺伝子操作し
た枯草菌ＤＮＡは、複製プラスミドベクターを使わずに
枯草菌の染色体に（相同組換えにより）挿入して、そこ
で増幅させることもできる。
子が枯草菌染色体中の自然界で存在するその部位から取
り出されて、当業者に知られた遺伝子工学技術によりベ
クター中に永続的または一時的に挿入されることを意味
する。好ましくは、ベクターは挿入した遺伝子の発現を
可能にする配列を含む。ここで用いる「ベクター」と
は、例えばトランスフェクション、形質転換または形質
導入により細胞内に導入することができる核酸分子のこ
とである。ベクターにはプラスミド、バクテリオファー
ジ、ファージミド、コスミドおよびトランスポゾンが含
まれるが、これらに限らない。ここで用いるベクターの
例としてｐＢＲ３２２、ｐＣＬ１９２０、ｐＣＬ１９２
１、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９またはｐＳＣ１０１を挙げ
ることができるが、これらに限らない。これらのベクタ
ーは大腸菌や他のバクテリア内で複製するが、枯草菌内
では複製せず、かくして適当な選択マーカーの付加後に
は枯草菌への組込み型ベクターとして有用である。枯草
菌用の常用される他のベクターとしては、プラスミドｐ
ＵＢ１１０、ｐＥ１９４、ｐＣ１９４および枯草菌内で
複製するそれらの誘導体、または“Bacillus subtilis
and other Gram-Positive Bacteria”（前掲、pp. 585-
650）の第40-44章に記載される組込み型ベクター、プラ
スミド、テンペレートファージベクターまたはトランス
ポゾンが含まれる。多くの微生物用のベクターはさらに
“Cloning Vectors: A Laboratory Manual”〔Pouwels
et al. Elsevier (1985)、1986年と1988年に追加の改訂
版あり〕にも記載されている。組換え型の遺伝子操作し
た枯草菌ＤＮＡは、複製プラスミドベクターを使わずに
枯草菌の染色体に（相同組換えにより）挿入して、そこ
で増幅させることもできる。
【００２４】ここで用いる「実質的に純粋な核酸」と
は、そのフランキング配列から天然に存在する状態で精
製または分離された核酸配列、セグメントまたは断片で
あって、例えば通常該断片をはさむ配列（例えば、ゲノ
ム中で該断片に隣接する配列）から分離されたＤＮＡ断
片を意味する。また、この用語はもともと細胞内で核酸
を伴っている他の成分から実質的に精製された核酸にも
適用される。好ましくは、「枯草菌のビオチン生合成酵
素をコードする配列」は精製された全核酸配列の主要成
分であり、例えば全核酸配列の少なくとも１％または１
０％を占める。
は、そのフランキング配列から天然に存在する状態で精
製または分離された核酸配列、セグメントまたは断片で
あって、例えば通常該断片をはさむ配列（例えば、ゲノ
ム中で該断片に隣接する配列）から分離されたＤＮＡ断
片を意味する。また、この用語はもともと細胞内で核酸
を伴っている他の成分から実質的に精製された核酸にも
適用される。好ましくは、「枯草菌のビオチン生合成酵
素をコードする配列」は精製された全核酸配列の主要成
分であり、例えば全核酸配列の少なくとも１％または１
０％を占める。
【００２５】ここで用いる「相同」は２つのポリマー分
子、例えば２つの核酸分子（例えば、２つのＤＮＡまた
はＲＮＡ分子）または２つのポリペプチド分子の間のサ
ブユニット配列の類似性を指す。２つの分子の両方にお
いてサブユニット位置が同一のモノマーサブユニットで
占められるとき、例えば２つのＤＮＡ分子のそれぞれに
おいてある位置がアデニンで占められるとき、それらは
該位置で相同となる。「ベスト−フィット(best-fit)」
相同は配列の整合 (alignment)を調整することにより達
成しうる。２つの配列間の相同性は合致する位置または
相同な位置の数の関数であり、例えば２つの化合物配列
の位置の半分（例えば、長さが１０サブユニットのポリ
マーにおいて５つの位置）が相同である場合、２つの配
列は５０％相同となり、２つの配列の位置の９０％（例
えば、１０のうちの９）が合致し相同である場合は、そ
の２つの配列は９０％の相同性を共有することになる。
相同配列中には非相同配列のギャップが存在してもよ
い。「実質的に相同」な配列とは保存的置換によっての
み一方が他方と相違する配列のことである。例えば、核
酸配列に置換が存在する場合、該置換はその位置でのア
ミノ酸を変化させないか、あるいは保存的アミノ酸置換
をもたらすものである。「保存的アミノ酸置換」は、例
えば１つのアミノ酸の同一クラスの別のアミノ酸による
置換（例えば、疎水性、電荷、ｐＫａまたは他の立体配
座特性や化学的性質の特徴を共有するアミノ酸同士の置
換、例えばバリンのロイシンによる、アルギニンのリシ
ンによる置換）、あるいは（上記のような）ポリペプチ
ドの生物学的活性を破壊しないアミノ酸配列の１以上の
位置に存在する非保存的アミノ酸の置換、欠失または挿
入である。アミノ酸配列が多重ドメイン酵素の１つのド
メインの生物学的活性を低下または変更させるが、該酵
素の第２ドメインの第２の生物学的活性を保存する修飾
によって相違する場合、それは本発明の範囲内に含まれ
る。一般に、ポリペプチドは、それが枯草菌のビオチン
生合成酵素の天然に存在するアミノ酸配列に対して７５
％以上、好ましくは８０％以上、最も好ましくは９０％
以上の相同性を示すならば、本発明の範囲内に入るとみ
なされる。核酸配列は、それが枯草菌のビオチン生合成
酵素をコードする天然に存在する核酸配列に対して７０
％以上、好ましくは８０％以上、最も好ましくは９０％
以上の相同性を示すならば、本発明の範囲内に入るとみ
なされる。
子、例えば２つの核酸分子（例えば、２つのＤＮＡまた
はＲＮＡ分子）または２つのポリペプチド分子の間のサ
ブユニット配列の類似性を指す。２つの分子の両方にお
いてサブユニット位置が同一のモノマーサブユニットで
占められるとき、例えば２つのＤＮＡ分子のそれぞれに
おいてある位置がアデニンで占められるとき、それらは
該位置で相同となる。「ベスト−フィット(best-fit)」
相同は配列の整合 (alignment)を調整することにより達
成しうる。２つの配列間の相同性は合致する位置または
相同な位置の数の関数であり、例えば２つの化合物配列
の位置の半分（例えば、長さが１０サブユニットのポリ
マーにおいて５つの位置）が相同である場合、２つの配
列は５０％相同となり、２つの配列の位置の９０％（例
えば、１０のうちの９）が合致し相同である場合は、そ
の２つの配列は９０％の相同性を共有することになる。
相同配列中には非相同配列のギャップが存在してもよ
い。「実質的に相同」な配列とは保存的置換によっての
み一方が他方と相違する配列のことである。例えば、核
酸配列に置換が存在する場合、該置換はその位置でのア
ミノ酸を変化させないか、あるいは保存的アミノ酸置換
をもたらすものである。「保存的アミノ酸置換」は、例
えば１つのアミノ酸の同一クラスの別のアミノ酸による
置換（例えば、疎水性、電荷、ｐＫａまたは他の立体配
座特性や化学的性質の特徴を共有するアミノ酸同士の置
換、例えばバリンのロイシンによる、アルギニンのリシ
ンによる置換）、あるいは（上記のような）ポリペプチ
ドの生物学的活性を破壊しないアミノ酸配列の１以上の
位置に存在する非保存的アミノ酸の置換、欠失または挿
入である。アミノ酸配列が多重ドメイン酵素の１つのド
メインの生物学的活性を低下または変更させるが、該酵
素の第２ドメインの第２の生物学的活性を保存する修飾
によって相違する場合、それは本発明の範囲内に含まれ
る。一般に、ポリペプチドは、それが枯草菌のビオチン
生合成酵素の天然に存在するアミノ酸配列に対して７５
％以上、好ましくは８０％以上、最も好ましくは９０％
以上の相同性を示すならば、本発明の範囲内に入るとみ
なされる。核酸配列は、それが枯草菌のビオチン生合成
酵素をコードする天然に存在する核酸配列に対して７０
％以上、好ましくは８０％以上、最も好ましくは９０％
以上の相同性を示すならば、本発明の範囲内に入るとみ
なされる。
【００２６】ここで提供される枯草菌の遺伝子またはＤ
ＮＡ配列を含むバクテリア株は高レベルのビオチンまた
はビオチン前駆体を産生させるのに有用であり、これら
の化合物はヒトや動物用の食品添加物として有用であ
る。例えば、ビオチンは動物用流通飼料への添加物とし
てウシ、ニワトリ、ブタなどの家畜に供給することがで
きる。さらに、ビオチンはヒト用のビタミン補給剤に加
えることができる。また、ビオチンは検査および診断方
法の試薬としても有用である。例えば、ビオチンはタン
パク質や核酸の非放射性標識として使用される。ビオチ
ン標識タンパク質はアビジン（卵白に存在するタンパク
質）またはストレプトアビジン（ストレプトマイシート
により産生されるビオチン結合タンパク質）へのビオチ
ン固有の結合能によって検出可能である。
ＮＡ配列を含むバクテリア株は高レベルのビオチンまた
はビオチン前駆体を産生させるのに有用であり、これら
の化合物はヒトや動物用の食品添加物として有用であ
る。例えば、ビオチンは動物用流通飼料への添加物とし
てウシ、ニワトリ、ブタなどの家畜に供給することがで
きる。さらに、ビオチンはヒト用のビタミン補給剤に加
えることができる。また、ビオチンは検査および診断方
法の試薬としても有用である。例えば、ビオチンはタン
パク質や核酸の非放射性標識として使用される。ビオチ
ン標識タンパク質はアビジン（卵白に存在するタンパク
質）またはストレプトアビジン（ストレプトマイシート
により産生されるビオチン結合タンパク質）へのビオチ
ン固有の結合能によって検出可能である。
【００２７】商業的プロセスで経済的に使用しうる高力
価ビオチンの効率的な生産系を開発することが非常に望
まれている。本発明者らは、改良されたビオチン生産系
が枯草菌を使うことにより開発可能であることに気づい
た。枯草菌は他の種を用いることに比べていくつかの利
点を有する。B. sphaericus と違って、枯草菌は遺伝子
工学のために非常に詳しく特性決定がなされており、
ａ）ビオチンの生産にとって最適な変異株を開発し、
ｂ）ビオチン生合成酵素をコードする遺伝子を担うベク
ターを遺伝子操作して構築するのが容易である。最も重
要な点は、本発明者らがここに開示するように、ビオチ
ン生合成酵素をコードする遺伝子の大部分または全部が
単一のオペロン上に存在することである。このことによ
り、オペロンの発現を全体的に調節し、そして発現され
る各酵素の量を同時に調節することが比較的簡単にな
る。さらに、枯草菌はビタマー生産に関与する特異なシ
トクロムＰ−４５０様酵素を含んでおり、ビタマー生産
を有意に高めるように操作することができる。この酵素
をコードする遺伝子（bioI）や他の生物からのその同族
体がビオチンまたはビオチンビタマーの合成においてあ
る役割を果たしているということは、これまでに報告さ
れていない。
価ビオチンの効率的な生産系を開発することが非常に望
まれている。本発明者らは、改良されたビオチン生産系
が枯草菌を使うことにより開発可能であることに気づい
た。枯草菌は他の種を用いることに比べていくつかの利
点を有する。B. sphaericus と違って、枯草菌は遺伝子
工学のために非常に詳しく特性決定がなされており、
ａ）ビオチンの生産にとって最適な変異株を開発し、
ｂ）ビオチン生合成酵素をコードする遺伝子を担うベク
ターを遺伝子操作して構築するのが容易である。最も重
要な点は、本発明者らがここに開示するように、ビオチ
ン生合成酵素をコードする遺伝子の大部分または全部が
単一のオペロン上に存在することである。このことによ
り、オペロンの発現を全体的に調節し、そして発現され
る各酵素の量を同時に調節することが比較的簡単にな
る。さらに、枯草菌はビタマー生産に関与する特異なシ
トクロムＰ−４５０様酵素を含んでおり、ビタマー生産
を有意に高めるように操作することができる。この酵素
をコードする遺伝子（bioI）や他の生物からのその同族
体がビオチンまたはビオチンビタマーの合成においてあ
る役割を果たしているということは、これまでに報告さ
れていない。
【００２８】枯草菌のビオチンオペロンの遺伝子を得る
ことは簡単な作業ではなかった。B.sphaericus への配
列類似性に基づいて該遺伝子を同定しようとしたが、失
敗した。その理由は、バシラス属としてのそれらの共通
した分類学上のグループ分けにもかかわらず、枯草菌と
B. sphaericus とがかなり分岐した種であることにあっ
た (Stackebrant et al.前掲) 。その結果、関係のある
B. sphaericus 遺伝子と対応する枯草菌遺伝子との配列
相同性があまりにも低すぎて、B. sphaericus遺伝子を
プローブとして用いて枯草菌遺伝子をクローニングする
ことができなかった。
ことは簡単な作業ではなかった。B.sphaericus への配
列類似性に基づいて該遺伝子を同定しようとしたが、失
敗した。その理由は、バシラス属としてのそれらの共通
した分類学上のグループ分けにもかかわらず、枯草菌と
B. sphaericus とがかなり分岐した種であることにあっ
た (Stackebrant et al.前掲) 。その結果、関係のある
B. sphaericus 遺伝子と対応する枯草菌遺伝子との配列
相同性があまりにも低すぎて、B. sphaericus遺伝子を
プローブとして用いて枯草菌遺伝子をクローニングする
ことができなかった。
【００２９】それ故、本発明者らはビオチン生合成に必
要な遺伝子（bio 遺伝子）をクローニングするために別
のもっと有利な戦略を採用した。このアプローチはbio
A, bioB, bioC, bioD, bioFおよびbioHの大腸菌変異株
を用いる相補性検定と、bioA,bioBおよびbioFの既知の
枯草菌ビオチン変異株を用いるマーカー救済および相補
性検定による更なる特性決定を含んでいた (Pai et al.
前掲) 。これらの検定から、枯草菌では６種類すべての
ビオチン生合成遺伝子が約８ｋｂの単一のＤＮＡ断片上
に含まれることがわかった。この断片の詳細な制限地図
が得られ、重複クローン、欠失変異株、サブクローンお
よびそれらの個々のヌクレオチド配列の解析により該遺
伝子を該ＤＮＡ断片上に次の順序で位置づけることがで
きた：右から左へ、bioW, bioA, bioF, bioD, bioB, bi
oIおよびORF2。これら７つの遺伝子はすべて同一方向に
転写され、それらが単一オペロンの一部であることと一
致する。
要な遺伝子（bio 遺伝子）をクローニングするために別
のもっと有利な戦略を採用した。このアプローチはbio
A, bioB, bioC, bioD, bioFおよびbioHの大腸菌変異株
を用いる相補性検定と、bioA,bioBおよびbioFの既知の
枯草菌ビオチン変異株を用いるマーカー救済および相補
性検定による更なる特性決定を含んでいた (Pai et al.
前掲) 。これらの検定から、枯草菌では６種類すべての
ビオチン生合成遺伝子が約８ｋｂの単一のＤＮＡ断片上
に含まれることがわかった。この断片の詳細な制限地図
が得られ、重複クローン、欠失変異株、サブクローンお
よびそれらの個々のヌクレオチド配列の解析により該遺
伝子を該ＤＮＡ断片上に次の順序で位置づけることがで
きた：右から左へ、bioW, bioA, bioF, bioD, bioB, bi
oIおよびORF2。これら７つの遺伝子はすべて同一方向に
転写され、それらが単一オペロンの一部であることと一
致する。
【００３０】その後、ビオチンを生産させるために、枯
草菌の単離したビオチンオペロンを微生物宿主に挿入し
た。該オペロンと微生物宿主はそれぞれに、または別々
に、最高レベルのビオチン生産を得るようにビオチン生
産を調節解除することができる。
草菌の単離したビオチンオペロンを微生物宿主に挿入し
た。該オペロンと微生物宿主はそれぞれに、または別々
に、最高レベルのビオチン生産を得るようにビオチン生
産を調節解除することができる。
【００３１】
【実施例】実施例Ｉ ． ビオチン生合成のための枯草菌遺伝子のク
ローニング ビオチン生合成に必要な枯草菌遺伝子（bio 遺伝子）を
クローニングし、特性決定を行った。これまでに枯草菌
のbio 遺伝子に関して知られていたことは、bioA, bioB
およびbioFの変異が存在し、これらが染色体上に連鎖し
ている (Pai etal.前掲) ということだけだったので、
これらの遺伝子をクローニングするために初めに２つの
異なるアプローチをとった。第１のアプローチは、保存
配列に従って設計した短い（約４５〜６０ｂｐ）プロー
ブと、B. sphaericus のbio 遺伝子からポリメラーゼ連
鎖反応（ＰＣＲ）により作製した大きいプローブ（約１
ｋｂ）を用いる試験を含んでいた。しかし、これらのプ
ローブは枯草菌ＤＮＡの染色体消化物と特異的にハイブ
リダイズすることができなかった。第２のアプローチ
は、大腸菌の bio遺伝子を相補する組換えクローンにつ
いて枯草菌ＤＮＡのライブラリーをスクリーニングする
ことを含んでいた。
ローニング ビオチン生合成に必要な枯草菌遺伝子（bio 遺伝子）を
クローニングし、特性決定を行った。これまでに枯草菌
のbio 遺伝子に関して知られていたことは、bioA, bioB
およびbioFの変異が存在し、これらが染色体上に連鎖し
ている (Pai etal.前掲) ということだけだったので、
これらの遺伝子をクローニングするために初めに２つの
異なるアプローチをとった。第１のアプローチは、保存
配列に従って設計した短い（約４５〜６０ｂｐ）プロー
ブと、B. sphaericus のbio 遺伝子からポリメラーゼ連
鎖反応（ＰＣＲ）により作製した大きいプローブ（約１
ｋｂ）を用いる試験を含んでいた。しかし、これらのプ
ローブは枯草菌ＤＮＡの染色体消化物と特異的にハイブ
リダイズすることができなかった。第２のアプローチ
は、大腸菌の bio遺伝子を相補する組換えクローンにつ
いて枯草菌ＤＮＡのライブラリーをスクリーニングする
ことを含んでいた。
【００３２】ＩＡ： B. sphaericus 配列とのＤＮＡハ
イブリダイゼーションにより bio 遺伝子をクローニング
する試み bio 遺伝子を含む枯草菌の制限断片を同定するために、
B. sphaericus のbioA, bioBおよびbioF遺伝子の内部領
域に対する短い（約４５〜６１ｂｐ）プローブを作製し
た。プローブの配列は大腸菌とB. sphaericus のbio Ｄ
ＮＡヌクレオチド配列から推定された保存アミノ酸に基
づいて選ばれた。
イブリダイゼーションにより bio 遺伝子をクローニング
する試み bio 遺伝子を含む枯草菌の制限断片を同定するために、
B. sphaericus のbioA, bioBおよびbioF遺伝子の内部領
域に対する短い（約４５〜６１ｂｐ）プローブを作製し
た。プローブの配列は大腸菌とB. sphaericus のbio Ｄ
ＮＡヌクレオチド配列から推定された保存アミノ酸に基
づいて選ばれた。
【００３３】これらのプローブの特徴は次のとおりであ
った：bioA, 60-merおよびbioB, 48-mer（それぞれB. s
phaericus 配列由来のヌクレオチド#1950-2009および#3
333-3380、GenBankTM受託#29292）；bioF, 45-mer（B.
sphaericus 配列由来のヌクレオチド#2877-2921、GenBa
nkTM受託#29291）。これらプローブのうち２つは、ハイ
ブリダイゼーション条件のストリンジェンシーを低くし
た（５×ＳＳＣ、１０％ホルムアミド、１×Denhardt溶
液、１００μｇ／ｍｌ一本鎖サケ精子ＤＮＡ、３７℃）
場合にも、枯草菌ＤＮＡの種々の染色体消化物にハイブ
リダイズしなかった（bioBプローブ）か、弱くハイブリ
ダイズしたにすぎなかった（bioFプローブ）。bioAプロ
ーブだけがハイブリダイズし得た。しかし、bioAハイブ
リダイゼーションにより同定された精製ＤＮＡ断片は枯
草菌のbioA変異株をマーカー救済することができず、こ
の断片はbioA遺伝子を含んでいないことが明らかになっ
た。さらに、このＤＮＡハイブリッドは不安定であっ
た。すなわち、中程度のストリンジェンシー条件（０．
２５〜０．１×ＳＳＣ、３７℃）のもとではフィルター
からプローブを洗い流すことができた。同様に、３つの
bio 遺伝子のより大きいＤＮＡプローブ（約１ｋｂ）を
B. sphaericus 染色体ＤＮＡのＰＣＲ増幅により作製し
たが、これらも枯草菌の染色体ＤＮＡと特異的にハイブ
リダイズすることができなかった。その結果、枯草菌の
bio 遺伝子を含む組換えクローンについて遺伝子バンク
をスクリーニングする際にこれらのプローブを使うわけ
にはいかなかった。
った：bioA, 60-merおよびbioB, 48-mer（それぞれB. s
phaericus 配列由来のヌクレオチド#1950-2009および#3
333-3380、GenBankTM受託#29292）；bioF, 45-mer（B.
sphaericus 配列由来のヌクレオチド#2877-2921、GenBa
nkTM受託#29291）。これらプローブのうち２つは、ハイ
ブリダイゼーション条件のストリンジェンシーを低くし
た（５×ＳＳＣ、１０％ホルムアミド、１×Denhardt溶
液、１００μｇ／ｍｌ一本鎖サケ精子ＤＮＡ、３７℃）
場合にも、枯草菌ＤＮＡの種々の染色体消化物にハイブ
リダイズしなかった（bioBプローブ）か、弱くハイブリ
ダイズしたにすぎなかった（bioFプローブ）。bioAプロ
ーブだけがハイブリダイズし得た。しかし、bioAハイブ
リダイゼーションにより同定された精製ＤＮＡ断片は枯
草菌のbioA変異株をマーカー救済することができず、こ
の断片はbioA遺伝子を含んでいないことが明らかになっ
た。さらに、このＤＮＡハイブリッドは不安定であっ
た。すなわち、中程度のストリンジェンシー条件（０．
２５〜０．１×ＳＳＣ、３７℃）のもとではフィルター
からプローブを洗い流すことができた。同様に、３つの
bio 遺伝子のより大きいＤＮＡプローブ（約１ｋｂ）を
B. sphaericus 染色体ＤＮＡのＰＣＲ増幅により作製し
たが、これらも枯草菌の染色体ＤＮＡと特異的にハイブ
リダイズすることができなかった。その結果、枯草菌の
bio 遺伝子を含む組換えクローンについて遺伝子バンク
をスクリーニングする際にこれらのプローブを使うわけ
にはいかなかった。
【００３４】ＩＢ： 大腸菌変異株の相補性によるbio
遺伝子のクローニング ランダムな枯草菌断片（約１０ｋｂ）のライブラリー
を、陽性選択ベクターｐＴＲ２６４〔Lauer et al., J.
Bact. 173, 5047-5053 (1991)〕を使って大腸菌ベクタ
ー中に構築した。ｐＴＲ２６４はアンピシリン耐性遺伝
子とλリプレッサー遺伝子とテトラサイクリン耐性遺伝
子をλリプレッサーにより調節を受ける調節配列の制御
下に含んでいるｐＢＲ３２２由来のベクターである。ｐ
ＴＲ２６４はｐＴＲ２６２のアンピシリン耐性遺伝子を
ＰｓｔＩ部位からの該遺伝子の５’末端を付加して再構
築することにより作製した。唯一のＢｃｌＩ部位がλリ
プレッサー遺伝子内に存在する。この部位にＤＮＡ断片
を挿入すると、リプレッサー機能が破壊され、その結果
ｔｅｔ遺伝子の抑制が解除される。挿入部を有するクロ
ーンは、形質転換体をテトラサイクリンプレートにまく
ことにより選択できる。
遺伝子のクローニング ランダムな枯草菌断片（約１０ｋｂ）のライブラリー
を、陽性選択ベクターｐＴＲ２６４〔Lauer et al., J.
Bact. 173, 5047-5053 (1991)〕を使って大腸菌ベクタ
ー中に構築した。ｐＴＲ２６４はアンピシリン耐性遺伝
子とλリプレッサー遺伝子とテトラサイクリン耐性遺伝
子をλリプレッサーにより調節を受ける調節配列の制御
下に含んでいるｐＢＲ３２２由来のベクターである。ｐ
ＴＲ２６４はｐＴＲ２６２のアンピシリン耐性遺伝子を
ＰｓｔＩ部位からの該遺伝子の５’末端を付加して再構
築することにより作製した。唯一のＢｃｌＩ部位がλリ
プレッサー遺伝子内に存在する。この部位にＤＮＡ断片
を挿入すると、リプレッサー機能が破壊され、その結果
ｔｅｔ遺伝子の抑制が解除される。挿入部を有するクロ
ーンは、形質転換体をテトラサイクリンプレートにまく
ことにより選択できる。
【００３５】dam- 大腸菌株から単離してＢｃｌＩで消
化したｐＴＲ２６４は、Ｓａｕ３Ａで部分消化してショ
糖勾配で分画化しておいた枯草菌染色体ＤＮＡ（８〜１
２ｋｂ断片）と連結させた。このライブラリー（ＢＳＢ
Ｉと記す）は既知のすべての大腸菌 bio点突然変異を相
補するＴｅｔr プラスミドを含んでいた。大腸菌ビオチ
ン変異株Ｒ８７９（bioA24）、Ｒ８７５（bioB17）、Ｒ
８７８（bioC23）、Ｒ８７７（bioD19）、Ｒ８７２（bi
oF3）およびＢＭ７０８６（ΔmalA-bioH）〔Cleary and
Campbell, J. Bact. 112, 830-839 (1972); Hatfield
et al., J. Bact. 98, 559-567 (1969) 〕をＢＳＢＩラ
イブラリーで形質転換した。それぞれのBio+ 形質転換
体からプラスミドを単離した。プラスミドｐＢＩＯ 100
およびｐＢＩＯ 101がＲ８７９（bioA）の相補性により
単離された。プラスミドｐＢＩＯ102およびｐＢＩＯ 10
3がＲ８７７（bioD）の相補性により、プラスミドｐＢ
ＩＯ 104がＲ８７２（bioF）の相補性により、プラスミ
ドｐＢＩＯ 109およびｐＢＩＯ 110がＢＭ７０８６（bi
oH）の相補性により、そしてプラスミドｐＢＩＯ 111お
よびｐＢＩＯ 112がＲ８７８（bioC）の相補性により単
離された（図７）。最後に、ＢＳＢＩライブラリーから
のＤＮＡを大腸菌 BM4062〔birA(ts)〕〔Barker and Ca
mpbell, J. Med. Biol. 146, 469-492 (1981)〕に形質
転換した。４２℃で成育させたコロニーからプラスミド
ｐＢＩＯ 113およびｐＢＩＯ 114が単離された。
化したｐＴＲ２６４は、Ｓａｕ３Ａで部分消化してショ
糖勾配で分画化しておいた枯草菌染色体ＤＮＡ（８〜１
２ｋｂ断片）と連結させた。このライブラリー（ＢＳＢ
Ｉと記す）は既知のすべての大腸菌 bio点突然変異を相
補するＴｅｔr プラスミドを含んでいた。大腸菌ビオチ
ン変異株Ｒ８７９（bioA24）、Ｒ８７５（bioB17）、Ｒ
８７８（bioC23）、Ｒ８７７（bioD19）、Ｒ８７２（bi
oF3）およびＢＭ７０８６（ΔmalA-bioH）〔Cleary and
Campbell, J. Bact. 112, 830-839 (1972); Hatfield
et al., J. Bact. 98, 559-567 (1969) 〕をＢＳＢＩラ
イブラリーで形質転換した。それぞれのBio+ 形質転換
体からプラスミドを単離した。プラスミドｐＢＩＯ 100
およびｐＢＩＯ 101がＲ８７９（bioA）の相補性により
単離された。プラスミドｐＢＩＯ102およびｐＢＩＯ 10
3がＲ８７７（bioD）の相補性により、プラスミドｐＢ
ＩＯ 104がＲ８７２（bioF）の相補性により、プラスミ
ドｐＢＩＯ 109およびｐＢＩＯ 110がＢＭ７０８６（bi
oH）の相補性により、そしてプラスミドｐＢＩＯ 111お
よびｐＢＩＯ 112がＲ８７８（bioC）の相補性により単
離された（図７）。最後に、ＢＳＢＩライブラリーから
のＤＮＡを大腸菌 BM4062〔birA(ts)〕〔Barker and Ca
mpbell, J. Med. Biol. 146, 469-492 (1981)〕に形質
転換した。４２℃で成育させたコロニーからプラスミド
ｐＢＩＯ 113およびｐＢＩＯ 114が単離された。
【００３６】単離したプラスミドの初期の制限分析はク
ローン化ＤＮＡ断片の著しい重複を示し、このことは５
つの遺伝子bioA, bioC, bioD, bioFおよびbioHが枯草菌
で単一のオペロンとして集まっていることを示唆する。
しかしながら、birAを相補するプラスミドｐＢＩＯ 113
およびｐＢＩＯ 114は他の５つの断片と重複していなか
った。
ローン化ＤＮＡ断片の著しい重複を示し、このことは５
つの遺伝子bioA, bioC, bioD, bioFおよびbioHが枯草菌
で単一のオペロンとして集まっていることを示唆する。
しかしながら、birAを相補するプラスミドｐＢＩＯ 113
およびｐＢＩＯ 114は他の５つの断片と重複していなか
った。
【００３７】ＩＣ： bio プラスミドの制限地図作成 唯一のＥｃｏＲＩからＢａｍＨＩ部位までのbio 遺伝子
座の制限地図を図７に示す。ｐＢＲ３２２の誘導体にク
ローン化したＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片はｐＢＩＯ 2
01と呼ばれた。ｐＢＩＯ 201中の９．９ｋｂ断片の詳細
な制限地図は標準的な一重および二重の酵素消化分析に
より得られた。
座の制限地図を図７に示す。ｐＢＲ３２２の誘導体にク
ローン化したＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片はｐＢＩＯ 2
01と呼ばれた。ｐＢＩＯ 201中の９．９ｋｂ断片の詳細
な制限地図は標準的な一重および二重の酵素消化分析に
より得られた。
【００３８】大腸菌の相補性により単離されたbio 遺伝
子の最初のクローンであるｐＢＩＯ100は、一端がＢａ
ｍＨＩ部位を越えてさらに３００ｂｐだけ延びていた。
大腸菌のbioH変異株の相補性により単離されたｐＢＩＯ
110は、他端がＥｃｏＲＩ部位を越えて約１１００塩基
対だけ延びていた。サザンハイブリダイゼーション実験
から、ｐＢＩＯ 100の挿入ＤＮＡは枯草菌の染色体の単
一連続セグメントから誘導されたものであることがわか
った。
子の最初のクローンであるｐＢＩＯ100は、一端がＢａ
ｍＨＩ部位を越えてさらに３００ｂｐだけ延びていた。
大腸菌のbioH変異株の相補性により単離されたｐＢＩＯ
110は、他端がＥｃｏＲＩ部位を越えて約１１００塩基
対だけ延びていた。サザンハイブリダイゼーション実験
から、ｐＢＩＯ 100の挿入ＤＮＡは枯草菌の染色体の単
一連続セグメントから誘導されたものであることがわか
った。
【００３９】ＩＤ： ｐＢＩＯプラスミドを用いる枯草
菌および大腸菌 bio変異株の相補性／マーカー救済 ｐＢＩＯ 100のクローン化ＤＮＡが枯草菌のbio 遺伝子
を含むことを検証するために、枯草菌のbio 変異株をマ
ーカー救済するｐＢＩＯ 100の能力について試験した。
該プラスミドはbioA, bioBおよびbioF変異株を高頻度で
ビオチン原栄養株へと復帰させた。このことから該クロ
ーン化ＤＮＡは枯草菌 bio遺伝子のそれぞれを全部また
は一部含むことがわかった。
菌および大腸菌 bio変異株の相補性／マーカー救済 ｐＢＩＯ 100のクローン化ＤＮＡが枯草菌のbio 遺伝子
を含むことを検証するために、枯草菌のbio 変異株をマ
ーカー救済するｐＢＩＯ 100の能力について試験した。
該プラスミドはbioA, bioBおよびbioF変異株を高頻度で
ビオチン原栄養株へと復帰させた。このことから該クロ
ーン化ＤＮＡは枯草菌 bio遺伝子のそれぞれを全部また
は一部含むことがわかった。
【００４０】また、ｐＢＩＯプラスミドは大腸菌 bio変
異株bioA, bioD, bioF, bioCおよびbioHを相補するそれ
らの能力についても調べた。ほとんどのプラスミドは２
以上の大腸菌ビオチン変異に対して相補性を示した。単
離物ｐＢＩＯ 112はbioA, bioB, bioC, bioD, bioFおよ
びbioHの大腸菌変異に対して相補性を示した（図７）。
ｐＢＩＯ 112は大腸菌 birA(ts) やΔ(gal-uvrB)変異に
対しては相補性を示さなかった。これらのデータは、既
知のビオチン遺伝子の大部分が枯草菌内で単一のクラス
ターとして存在していることを実証した。
異株bioA, bioD, bioF, bioCおよびbioHを相補するそれ
らの能力についても調べた。ほとんどのプラスミドは２
以上の大腸菌ビオチン変異に対して相補性を示した。単
離物ｐＢＩＯ 112はbioA, bioB, bioC, bioD, bioFおよ
びbioHの大腸菌変異に対して相補性を示した（図７）。
ｐＢＩＯ 112は大腸菌 birA(ts) やΔ(gal-uvrB)変異に
対しては相補性を示さなかった。これらのデータは、既
知のビオチン遺伝子の大部分が枯草菌内で単一のクラス
ターとして存在していることを実証した。
【００４１】ｐＢＩＯ 201のいくつかの欠失体を、２つ
の制限部位で切断し、必要ならば突出部を修復して連結
することにより作製した。欠失プラスミドの構造を確か
めた後、それぞれを種々の大腸菌 bio変異株に形質転換
し、相補性を評価した。結果を図８に要約して示す。欠
失誘導体ｐＢＩＯ 203は既知の大腸菌ビオチン遺伝子の
うち６つ (bioA, bioB, bioC, bioD, bioF, bioH) を相
補することがわかり、これら６つの遺伝子すべてはＢａ
ｍＨＩからＸｈｏＩまでの８ｋｂのＤＮＡ断片中に存在
することがはっきりした。この断片の左から３．８ｋｂ
を除去すると（ｐＢＩＯ 204）、bioCとbioH変異株を相
補する能力が失われた。ｐＢＩＯ 206はビオチンクラス
ターの右側の２．５ｋｂだけを含んでいたが、これはbi
oAとbioF変異株のみに対して相補性を示した。これらの
観察およびハイブリダイゼーションデータに基づいた順
序は次のとおりであった：bioC, bioH, (bioB, bioD),
bioF, bioA。
の制限部位で切断し、必要ならば突出部を修復して連結
することにより作製した。欠失プラスミドの構造を確か
めた後、それぞれを種々の大腸菌 bio変異株に形質転換
し、相補性を評価した。結果を図８に要約して示す。欠
失誘導体ｐＢＩＯ 203は既知の大腸菌ビオチン遺伝子の
うち６つ (bioA, bioB, bioC, bioD, bioF, bioH) を相
補することがわかり、これら６つの遺伝子すべてはＢａ
ｍＨＩからＸｈｏＩまでの８ｋｂのＤＮＡ断片中に存在
することがはっきりした。この断片の左から３．８ｋｂ
を除去すると（ｐＢＩＯ 204）、bioCとbioH変異株を相
補する能力が失われた。ｐＢＩＯ 206はビオチンクラス
ターの右側の２．５ｋｂだけを含んでいたが、これはbi
oAとbioF変異株のみに対して相補性を示した。これらの
観察およびハイブリダイゼーションデータに基づいた順
序は次のとおりであった：bioC, bioH, (bioB, bioD),
bioF, bioA。
【００４２】 ＩＥ： 完全なbioWを含む枯草菌断片のクローニング ＤＮＡの配列決定により（下記参照）、bio オペロンの
プロモーターは最初にクローン化されたＤＮＡ断片のい
ずれにも存在しないことが判明した。しかし、このプロ
モーター領域は染色体歩行 (chromosomal walking)によ
り回収された。大腸菌変異株の相補性により最初に単離
されたクローンはどれもｐＢＩＯ 100よりもさらに右方
向へ延びてはいなかった。これは、bioAがこれらクロー
ンの最右端にあり、かつ８〜１０ｋｂの範囲の断片がク
ローニングのために選ばれていたから、驚くべきことで
あった。しかし、ｐＢＩＯ 100のクローン化挿入部の最
右端のＤＮＡ配列は、B. sphaericus のbioWにやや類似
している約300 bpのオープン・リーディング・フレーム
を示した。bioAと隣接上流領域を含む断片を、プラスミ
ドのコピー数を減らすためにpcnB変異を有する大腸菌 b
ioA 細胞にクローニングした〔Lopilato et al., Mol.
Gen. Genet. 205, 285-290 (1986) 〕。かかる条件下
で、bioAの上流の別の２．７ｋｂのＤＮＡを含むＰｓｔ
Ｉ断片をクローニングし、bio オペロンの開始位置をＤ
ＮＡ配列決定により調べた。
プロモーターは最初にクローン化されたＤＮＡ断片のい
ずれにも存在しないことが判明した。しかし、このプロ
モーター領域は染色体歩行 (chromosomal walking)によ
り回収された。大腸菌変異株の相補性により最初に単離
されたクローンはどれもｐＢＩＯ 100よりもさらに右方
向へ延びてはいなかった。これは、bioAがこれらクロー
ンの最右端にあり、かつ８〜１０ｋｂの範囲の断片がク
ローニングのために選ばれていたから、驚くべきことで
あった。しかし、ｐＢＩＯ 100のクローン化挿入部の最
右端のＤＮＡ配列は、B. sphaericus のbioWにやや類似
している約300 bpのオープン・リーディング・フレーム
を示した。bioAと隣接上流領域を含む断片を、プラスミ
ドのコピー数を減らすためにpcnB変異を有する大腸菌 b
ioA 細胞にクローニングした〔Lopilato et al., Mol.
Gen. Genet. 205, 285-290 (1986) 〕。かかる条件下
で、bioAの上流の別の２．７ｋｂのＤＮＡを含むＰｓｔ
Ｉ断片をクローニングし、bio オペロンの開始位置をＤ
ＮＡ配列決定により調べた。
【００４３】大腸菌でのpcnB変異はｐＢＲ３２２および
ｐＵＣ誘導体を含むＣｏｌＥ１誘導プラスミドの低コピ
ー数維持をもたらす（Lopilato et al., 1986,前掲）。
bioAおよびpcnBの両方の変異を有する大腸菌 BI259株を
構築した。制限酵素、欠失およびサザン分析から、５．
５ｋｂのＰｓｔＩ断片は完全なbioA遺伝子を含むことが
わかった。枯草菌 GP275の染色体ＤＮＡをＰｓｔＩで消
化し、アガロースゲル電気泳動で大きさにより分画化し
た。４．４〜６．６ｋｂ断片のプールをｐＢＲ３２２誘
導プラスミドに連結し、大腸菌 BI259株を形質転換する
ために使用した。アンピシリン耐性とビオチン原栄養株
について選択した。５．５ｋｂの挿入部を含むプラスミ
ドｐＢＩＯ 116を回収した。このプラスミドはBI259 株
を高頻度でビオチン原栄養株へ形質転換することができ
たが、R879株（bioA, pcnB+）をビオチン原栄養株へも
アンピシリン耐性株へも形質転換することができなかっ
た。B. sphaericus のbioWにやや類似している300 bpを
含むプローブ（ｐＢＩＯ 100の600 bp PstI-BamHI 断
片）を用いたサザンハイブリダイゼーションにより、こ
のクローン化ＤＮＡがbioW相同体を含むことを確かめ
た。
ｐＵＣ誘導体を含むＣｏｌＥ１誘導プラスミドの低コピ
ー数維持をもたらす（Lopilato et al., 1986,前掲）。
bioAおよびpcnBの両方の変異を有する大腸菌 BI259株を
構築した。制限酵素、欠失およびサザン分析から、５．
５ｋｂのＰｓｔＩ断片は完全なbioA遺伝子を含むことが
わかった。枯草菌 GP275の染色体ＤＮＡをＰｓｔＩで消
化し、アガロースゲル電気泳動で大きさにより分画化し
た。４．４〜６．６ｋｂ断片のプールをｐＢＲ３２２誘
導プラスミドに連結し、大腸菌 BI259株を形質転換する
ために使用した。アンピシリン耐性とビオチン原栄養株
について選択した。５．５ｋｂの挿入部を含むプラスミ
ドｐＢＩＯ 116を回収した。このプラスミドはBI259 株
を高頻度でビオチン原栄養株へ形質転換することができ
たが、R879株（bioA, pcnB+）をビオチン原栄養株へも
アンピシリン耐性株へも形質転換することができなかっ
た。B. sphaericus のbioWにやや類似している300 bpを
含むプローブ（ｐＢＩＯ 100の600 bp PstI-BamHI 断
片）を用いたサザンハイブリダイゼーションにより、こ
のクローン化ＤＮＡがbioW相同体を含むことを確かめ
た。
【００４４】ｐＢＩＯ 116はpcnBバックグラウンドから
非常に限られた量でしか得ることができなかった。この
クローニング実験に用いたpcnB80対立遺伝子は、ｐＢＲ
３２２レプリコンのコピー数を野生型のレベルの約６％
に低下させると報じられている（Lopilato et al., 198
6,前掲）。プラスミドの安定性を損なうことなくプラス
ミド収量を向上させるために、このＤＮＡを低コピー数
プラスミドにクローニングした。bioWの３’末端内部の
唯一のＢａｍＨＩ部位を用いて、ｐＢＩＯ 116由来の
３．０ｋｂのＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ断片をｐＣＬ１９２
１にクローニングした。ｐＣＬ１９２１はｐＵＣ１９の
lacZ'／ポリリンカークローニング領域と選択可能なス
ペクチノマイシン／ストレプトマイシン耐性遺伝子を含
む低コピー数プラスミドｐＳＣ１０１の誘導体である
(Lerner and Inouye, Nuc. Acids. Res. 18:4631, 199
0)。ｐＣＬ１９２１は細胞あたりのコピー数が約５〜１
０コピーである。ｐＢＩＯ 116由来の精製した３．０ｋ
ｂのＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ断片をＢａｍＨＩとＰｓｔＩ
で切断したｐＣＬ１９２１のＤＮＡに連結し、この連結
ＤＮＡをpcnB+ 大腸菌 MM294株に形質転換し、スペクチ
ノマイシン耐性（１００μｇ／ｍｌ）について選択し
た。正しい３．０ｋｂのＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ断片を含
むプラスミドｐＢＩＯ 350を回収した。この菌株から回
収されたｐＢＩＯ 350の量はpcnB80株から単離されたｐ
ＢＩＯ 116と比べて著しく高く、プラスミドの安定性も
損なわれていなかった。
非常に限られた量でしか得ることができなかった。この
クローニング実験に用いたpcnB80対立遺伝子は、ｐＢＲ
３２２レプリコンのコピー数を野生型のレベルの約６％
に低下させると報じられている（Lopilato et al., 198
6,前掲）。プラスミドの安定性を損なうことなくプラス
ミド収量を向上させるために、このＤＮＡを低コピー数
プラスミドにクローニングした。bioWの３’末端内部の
唯一のＢａｍＨＩ部位を用いて、ｐＢＩＯ 116由来の
３．０ｋｂのＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ断片をｐＣＬ１９２
１にクローニングした。ｐＣＬ１９２１はｐＵＣ１９の
lacZ'／ポリリンカークローニング領域と選択可能なス
ペクチノマイシン／ストレプトマイシン耐性遺伝子を含
む低コピー数プラスミドｐＳＣ１０１の誘導体である
(Lerner and Inouye, Nuc. Acids. Res. 18:4631, 199
0)。ｐＣＬ１９２１は細胞あたりのコピー数が約５〜１
０コピーである。ｐＢＩＯ 116由来の精製した３．０ｋ
ｂのＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ断片をＢａｍＨＩとＰｓｔＩ
で切断したｐＣＬ１９２１のＤＮＡに連結し、この連結
ＤＮＡをpcnB+ 大腸菌 MM294株に形質転換し、スペクチ
ノマイシン耐性（１００μｇ／ｍｌ）について選択し
た。正しい３．０ｋｂのＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ断片を含
むプラスミドｐＢＩＯ 350を回収した。この菌株から回
収されたｐＢＩＯ 350の量はpcnB80株から単離されたｐ
ＢＩＯ 116と比べて著しく高く、プラスミドの安定性も
損なわれていなかった。
【００４５】実施例II. 枯草菌 bio遺伝子クラスター
のＤＮＡ配列決定 bio 生合成遺伝子をさらに同定し、その発現を制御する
調節装置を確認し、そして遺伝子操作に適する部位を定
めるために、クローンｐＢＩＯ 100およびｐＢＩＯ 350
に含まれる枯草菌 bio遺伝子の配列を、サンガーのジデ
オキシ配列決定法によりSequenaseTMキット、バージョ
ン２．０（United States Biochemicals社、米国オハイ
オ州クリーブランド）を用いてメーカーの指示どおりに
決定した。
のＤＮＡ配列決定 bio 生合成遺伝子をさらに同定し、その発現を制御する
調節装置を確認し、そして遺伝子操作に適する部位を定
めるために、クローンｐＢＩＯ 100およびｐＢＩＯ 350
に含まれる枯草菌 bio遺伝子の配列を、サンガーのジデ
オキシ配列決定法によりSequenaseTMキット、バージョ
ン２．０（United States Biochemicals社、米国オハイ
オ州クリーブランド）を用いてメーカーの指示どおりに
決定した。
【００４６】IIＡ： ＤＮＡ配列決定の戦略 枯草菌 bio遺伝子を含む８〜１０ｋｂ領域のＤＮＡ配列
を得るために採用した戦略は、ほぼ等しい大きさの４つ
のプラスミドサブクローンに該領域を分割し、その後各
サブクローンを通して前進する一組の繰り込まれた欠失
体 (nested deletions) をつくるというものであった。
繰り込まれた欠失体をつくるために、「エキソヌクレア
ーゼIII−エンドヌクレアーゼS1」法を採用し、試薬類
をキット（Promega 社、米国ウイスコンシン州マジソ
ン）として購入した。繰り込まれた欠失体は３つのサブ
クローンについては両末端から、４つ目のサブクローン
については一端から作製された。３つのサブクローンの
両組の繰り込まれた欠失体の配列決定は各サブクローン
の両鎖の配列を与えたが、これは完全に正確な配列を得
るために必要であった。ｐＢＩＯ 350については、一方
の鎖を同様に決定し、相対する鎖は約１５０ｂｐの間隔
で配列決定用プライマーを合成することにより決定し
た。非重複サブクローン間の接合部は、鋳型としてｐＢ
ＩＯ 201またはｐＢＩＯ 100（またはそのサブクロー
ン）を用いて合成プライマーから配列決定することによ
り確かめた。配列を整合させ、DNASTAR コンピュータプ
ログラム（DNASTAR 社、米国ウイスコンシン州マジソ
ン）と対比させた。
を得るために採用した戦略は、ほぼ等しい大きさの４つ
のプラスミドサブクローンに該領域を分割し、その後各
サブクローンを通して前進する一組の繰り込まれた欠失
体 (nested deletions) をつくるというものであった。
繰り込まれた欠失体をつくるために、「エキソヌクレア
ーゼIII−エンドヌクレアーゼS1」法を採用し、試薬類
をキット（Promega 社、米国ウイスコンシン州マジソ
ン）として購入した。繰り込まれた欠失体は３つのサブ
クローンについては両末端から、４つ目のサブクローン
については一端から作製された。３つのサブクローンの
両組の繰り込まれた欠失体の配列決定は各サブクローン
の両鎖の配列を与えたが、これは完全に正確な配列を得
るために必要であった。ｐＢＩＯ 350については、一方
の鎖を同様に決定し、相対する鎖は約１５０ｂｐの間隔
で配列決定用プライマーを合成することにより決定し
た。非重複サブクローン間の接合部は、鋳型としてｐＢ
ＩＯ 201またはｐＢＩＯ 100（またはそのサブクロー
ン）を用いて合成プライマーから配列決定することによ
り確かめた。配列を整合させ、DNASTAR コンピュータプ
ログラム（DNASTAR 社、米国ウイスコンシン州マジソ
ン）と対比させた。
【００４７】IIＢ： bio 特異的コード領域および転写
調節シグナルの同定および機構 ｐＢＩＯ 100およびｐＢＩＯ 350からの約８５００ｂｐ
のＤＮＡ配列の分析は７つのコード領域を含む単一のbi
o オペロンを示した（図５、図１６および配列番号：
１）。ｐＢＩＯ 350中のbio オペロンの５’末端から開
始して、ｐＢＩＯ100に続けて見ると、B. sphaericus b
io オペロンの「オペレーター」部位への強い配列相同
性により規定される転写調節部位の隣に枯草菌ＲＮＡポ
リメラーゼの増殖期形態（σA ）により認識される推定
上のプロモーター配列（Ｐbioと呼ぶ）を含む約１００
ｂｐ領域がまず見つかる。
調節シグナルの同定および機構 ｐＢＩＯ 100およびｐＢＩＯ 350からの約８５００ｂｐ
のＤＮＡ配列の分析は７つのコード領域を含む単一のbi
o オペロンを示した（図５、図１６および配列番号：
１）。ｐＢＩＯ 350中のbio オペロンの５’末端から開
始して、ｐＢＩＯ100に続けて見ると、B. sphaericus b
io オペロンの「オペレーター」部位への強い配列相同
性により規定される転写調節部位の隣に枯草菌ＲＮＡポ
リメラーゼの増殖期形態（σA ）により認識される推定
上のプロモーター配列（Ｐbioと呼ぶ）を含む約１００
ｂｐ領域がまず見つかる。
【００４８】この推定上のプロモーター領域のヌクレオ
チド配列を図４に示す。図４の記号は次のとおりであ
る：破線：２回対称の領域；太い下線：B. sphaericus
bioDAYB 調節部位への類似性；σA ：枯草菌ＲＮＡポリ
メラーゼの増殖期形態により認識されるプロモーター領
域；ＲＢＳ：リボソーム結合部位；＊：dam メチル化に
よりブロックされる制限部位。推定アミノ酸配列をヌク
レオチド配列の下に示す。Ｐbioの配列はTTGACA--17bp-
-TATATT（配列番号：２）であり、枯草菌のσAコンセン
サス配列TTGACA--17/18bp--TATAAT （配列番号：３）と
よく一致する。この領域のすぐ後にbioW（２５９アミノ
酸）への相同性を有する ORF（オープン・リーディング
・フレーム）が続き、その後にbioA（４４８アミノ
酸）、bioF（３８９アミノ酸）、bioD（２３１アミノ
酸）およびbioB（３３５アミノ酸）への相同性を有する
ORFが続く。次の２つのオープン・リーディング・フレ
ームORF1（bioI; ３９５アミノ酸）およびORF2（２５３
アミノ酸）は既知のbio 遺伝子のどれにも配列類似性を
示さなかった（図５）。プロモーター、遺伝子および推
定上の転写終結部位の位置を表１に示す。
チド配列を図４に示す。図４の記号は次のとおりであ
る：破線：２回対称の領域；太い下線：B. sphaericus
bioDAYB 調節部位への類似性；σA ：枯草菌ＲＮＡポリ
メラーゼの増殖期形態により認識されるプロモーター領
域；ＲＢＳ：リボソーム結合部位；＊：dam メチル化に
よりブロックされる制限部位。推定アミノ酸配列をヌク
レオチド配列の下に示す。Ｐbioの配列はTTGACA--17bp-
-TATATT（配列番号：２）であり、枯草菌のσAコンセン
サス配列TTGACA--17/18bp--TATAAT （配列番号：３）と
よく一致する。この領域のすぐ後にbioW（２５９アミノ
酸）への相同性を有する ORF（オープン・リーディング
・フレーム）が続き、その後にbioA（４４８アミノ
酸）、bioF（３８９アミノ酸）、bioD（２３１アミノ
酸）およびbioB（３３５アミノ酸）への相同性を有する
ORFが続く。次の２つのオープン・リーディング・フレ
ームORF1（bioI; ３９５アミノ酸）およびORF2（２５３
アミノ酸）は既知のbio 遺伝子のどれにも配列類似性を
示さなかった（図５）。プロモーター、遺伝子および推
定上の転写終結部位の位置を表１に示す。
【００４９】
【表１】
【００５０】プロモーター、転写終結部位およびリボソ
ーム結合部位の位置および方向はbio 遺伝子を含む単一
オペロンを示している。各遺伝子は強力なバシラスリボ
ソーム結合部位（ＲＢＳ）によって先行され、計算した
ΔＧは−１１．６〜−２０．４ｋｃａｌ／ｍｏｌの範囲
である。全遺伝子は同一の転写方向に（右から左へ）向
いている。さらに、bioA, bioF, bioDおよびbioBの５’
末端はそれぞれの前の遺伝子の３’末端と重複してお
り、このことはこれら遺伝子の発現が部分的に転写カッ
プリングにより調節されていることを示唆する。bioIと
ORF2はそれぞれ６８および６７塩基対のシストロン間領
域によって前の遺伝子から分離されており、このことは
それらが転写的に関連していないことを示す。bioW遺伝
子は上で論じた潜在的なＲＮＡポリメラーゼ（σA ）プ
ロモーター部位および推定上のオペレーター部位により
先行されているので該オペロンの最初の遺伝子であるよ
うだ。このプロモーター領域はbio オペロンの始まりを
表す。なんとなれば、rho 非依存性転写終結部位に似て
いるステム−ループ構造 (stem-loop structure)がそれ
から約５０ｂｐ上流に存在するからである。この推定上
の終結部位は、bio オペロンと同じ方向を向いているOR
F4-5と呼ばれる強力なバシラスリボソーム結合部位（Ｒ
ＢＳ；ΔＧ＝−１４．８ｋｃａｌ／ｍｏｌ）を有するコ
ード領域（２９９アミノ酸）により先行されるので、別
の転写単位の終結を表している（図９）。最後に、ORF4
-5のさらに上流に、反対の方向を向いて、強力なバシラ
スＲＢＳ（ΔＧ＝−１７．４ｋｃａｌ／ｍｏｌ）が存在
し、その後に別のオープン・リーディング・フレームOR
F6の最初の２６６アミノ酸が続く。ORF6の残部はＰｓｔ
Ｉ部位を越えて続いている。ORF6の推定アミノ酸配列は
lacIリプレッサーに関係した多くの調節タンパク質、す
なわち大腸菌 ebgR （機能が不明な潜在オペロンのリプ
レッサー）；大腸菌 purR （プリンヌクレオチド生合成
オペロンのリプレッサー）；および大腸菌 cytR （異化
酵素をコードするdeoCABD, udpおよびcdd 、並びに輸送
および孔形成タンパク質をコードするnupC, nupGおよび
tsx の多面的転写リプレッサー）に有意な類似性を示し
た。ORF4-5とORF6の転写は協調しているのかもしれな
い。なぜならば、ORF4-5とORF6の５’末端間の１７５ｂ
ｐ内には２つの重複するσA プロモーター配列（TTGTAA
--18bp--TAATAT（配列番号：４）→ORF6; TTGATA--17bp
--AAAAGT（配列番号：５）→ORF4-5）および一連の逆反
復配列が見いだされたからである。
ーム結合部位の位置および方向はbio 遺伝子を含む単一
オペロンを示している。各遺伝子は強力なバシラスリボ
ソーム結合部位（ＲＢＳ）によって先行され、計算した
ΔＧは−１１．６〜−２０．４ｋｃａｌ／ｍｏｌの範囲
である。全遺伝子は同一の転写方向に（右から左へ）向
いている。さらに、bioA, bioF, bioDおよびbioBの５’
末端はそれぞれの前の遺伝子の３’末端と重複してお
り、このことはこれら遺伝子の発現が部分的に転写カッ
プリングにより調節されていることを示唆する。bioIと
ORF2はそれぞれ６８および６７塩基対のシストロン間領
域によって前の遺伝子から分離されており、このことは
それらが転写的に関連していないことを示す。bioW遺伝
子は上で論じた潜在的なＲＮＡポリメラーゼ（σA ）プ
ロモーター部位および推定上のオペレーター部位により
先行されているので該オペロンの最初の遺伝子であるよ
うだ。このプロモーター領域はbio オペロンの始まりを
表す。なんとなれば、rho 非依存性転写終結部位に似て
いるステム−ループ構造 (stem-loop structure)がそれ
から約５０ｂｐ上流に存在するからである。この推定上
の終結部位は、bio オペロンと同じ方向を向いているOR
F4-5と呼ばれる強力なバシラスリボソーム結合部位（Ｒ
ＢＳ；ΔＧ＝−１４．８ｋｃａｌ／ｍｏｌ）を有するコ
ード領域（２９９アミノ酸）により先行されるので、別
の転写単位の終結を表している（図９）。最後に、ORF4
-5のさらに上流に、反対の方向を向いて、強力なバシラ
スＲＢＳ（ΔＧ＝−１７．４ｋｃａｌ／ｍｏｌ）が存在
し、その後に別のオープン・リーディング・フレームOR
F6の最初の２６６アミノ酸が続く。ORF6の残部はＰｓｔ
Ｉ部位を越えて続いている。ORF6の推定アミノ酸配列は
lacIリプレッサーに関係した多くの調節タンパク質、す
なわち大腸菌 ebgR （機能が不明な潜在オペロンのリプ
レッサー）；大腸菌 purR （プリンヌクレオチド生合成
オペロンのリプレッサー）；および大腸菌 cytR （異化
酵素をコードするdeoCABD, udpおよびcdd 、並びに輸送
および孔形成タンパク質をコードするnupC, nupGおよび
tsx の多面的転写リプレッサー）に有意な類似性を示し
た。ORF4-5とORF6の転写は協調しているのかもしれな
い。なぜならば、ORF4-5とORF6の５’末端間の１７５ｂ
ｐ内には２つの重複するσA プロモーター配列（TTGTAA
--18bp--TAATAT（配列番号：４）→ORF6; TTGATA--17bp
--AAAAGT（配列番号：５）→ORF4-5）および一連の逆反
復配列が見いだされたからである。
【００５１】ORF2はこのコード領域のすぐ終わりにrho
非依存性転写終結部位に似ている安定したステム−ルー
プ構造が存在することからbio オペロン中の最後の遺伝
子である。ターミネーター様特徴を有する第２のステム
−ループ構造がbioBとbioIとのシストロン間領域に同定
された。ｍＲＮＡのいくつかの二次構造が可能であり、
最も有利な構造は−１１ｋｃａｌ／ｍｏｌのΔＧを有
し、そして最も有利でない構造は−５．６ｋｃａｌ／ｍ
ｏｌのΔＧを有する。
非依存性転写終結部位に似ている安定したステム−ルー
プ構造が存在することからbio オペロン中の最後の遺伝
子である。ターミネーター様特徴を有する第２のステム
−ループ構造がbioBとbioIとのシストロン間領域に同定
された。ｍＲＮＡのいくつかの二次構造が可能であり、
最も有利な構造は−１１ｋｃａｌ／ｍｏｌのΔＧを有
し、そして最も有利でない構造は−５．６ｋｃａｌ／ｍ
ｏｌのΔＧを有する。
【００５２】ビオチンオペロンの最後から下流には強力
なＲＢＳ（ΔＧ＝−２０．０ｋｃａｌ／ｍｏｌ）と２６
０アミノ酸の別のコード領域ORF3が存在する。ORF3の残
部は配列決定された領域の最後を示すＢｓｔＸＩ部位を
越えて続いている。ORF3の推定アミノ酸配列は大腸菌の
多くの膜結合輸送タンパク質、すなわちグリセロール−
３−ホスフェートパーミアーゼ（ugpEおよびugpA）；マ
ルトースパーミアーゼ（malGおよびmalF）；およびモリ
ブデンパーミアーゼ（ch1）に対して有意な類似性を示
した。特に、部分ORF3ペプチドはすべての膜結合輸送タ
ンパク質に共通して見られる２０アミノ酸配列をＣＯＯ
Ｈ末端領域に含んでいる。ORF3はその９５ｂｐ上流の推
定上のσA プロモーター配列 TAGACA-N18-TACATT（配列
番号：１；図１６、＃７６００−７６２９）を用いてbi
o オペロンとは別個に転写される。
なＲＢＳ（ΔＧ＝−２０．０ｋｃａｌ／ｍｏｌ）と２６
０アミノ酸の別のコード領域ORF3が存在する。ORF3の残
部は配列決定された領域の最後を示すＢｓｔＸＩ部位を
越えて続いている。ORF3の推定アミノ酸配列は大腸菌の
多くの膜結合輸送タンパク質、すなわちグリセロール−
３−ホスフェートパーミアーゼ（ugpEおよびugpA）；マ
ルトースパーミアーゼ（malGおよびmalF）；およびモリ
ブデンパーミアーゼ（ch1）に対して有意な類似性を示
した。特に、部分ORF3ペプチドはすべての膜結合輸送タ
ンパク質に共通して見られる２０アミノ酸配列をＣＯＯ
Ｈ末端領域に含んでいる。ORF3はその９５ｂｐ上流の推
定上のσA プロモーター配列 TAGACA-N18-TACATT（配列
番号：１；図１６、＃７６００−７６２９）を用いてbi
o オペロンとは別個に転写される。
【００５３】遺伝子と酵素の関係、酵素の大きさ、およ
び他の生物からの同一酵素に対する相同パーセントを表
２にまとめてある。lac プロモーターの転写制御下にbi
oIまたはORF2のみを含むプラスミドサブクローンを用い
た相補性検定は、大腸菌のbioCまたはbioH変異を相補す
るにはbioIだけで十分であることを示した。bioIおよび
ORF2のコピーをＰＣＲで生成させた。それぞれの遺伝子
の５’末端にＨｉｎｄIII 部位を導入し、bioIの３’末
端にＢａｍＨＩ部位を、そしてORF2の３’末端にＡｓｐ
７１８１部位を導入した。ＰＣＲで作製した断片はそれ
ぞれ異なるコピー数をもつ３つのプラスミドにクローニ
ングした：低コピー数プラスミドｐＣＬ１９２１、中間
コピー数プラスミドｐＪＧＰ４４（ｐＢＲ３２２から誘
導されたもの）および高コピー数プラスミドｐＵＣ１
９。これら組換えプラスミドの２つでは、bioIおよびOR
F2の発現がlac プロモーターの制御下にある（ｐＣＬ１
９２１およびｐＵＣ１９）。
び他の生物からの同一酵素に対する相同パーセントを表
２にまとめてある。lac プロモーターの転写制御下にbi
oIまたはORF2のみを含むプラスミドサブクローンを用い
た相補性検定は、大腸菌のbioCまたはbioH変異を相補す
るにはbioIだけで十分であることを示した。bioIおよび
ORF2のコピーをＰＣＲで生成させた。それぞれの遺伝子
の５’末端にＨｉｎｄIII 部位を導入し、bioIの３’末
端にＢａｍＨＩ部位を、そしてORF2の３’末端にＡｓｐ
７１８１部位を導入した。ＰＣＲで作製した断片はそれ
ぞれ異なるコピー数をもつ３つのプラスミドにクローニ
ングした：低コピー数プラスミドｐＣＬ１９２１、中間
コピー数プラスミドｐＪＧＰ４４（ｐＢＲ３２２から誘
導されたもの）および高コピー数プラスミドｐＵＣ１
９。これら組換えプラスミドの２つでは、bioIおよびOR
F2の発現がlac プロモーターの制御下にある（ｐＣＬ１
９２１およびｐＵＣ１９）。
【００５４】bioIを含むプラスミドは大腸菌 BM7086 (
ΔbioH) と大腸菌 R878 (bioC)の両方に対して相補性を
示した。ORF2を含むプラスミドは大腸菌 BM7086 または
R878のいずれにも正常な相補性を付与しなかった。これ
らの検定から、枯草菌のbioIの産物は大腸菌のbioCまた
はbioH変異株には存在しない活性を代償し、あるいは打
ち消すビオチン合成に必要な活性を供給し得ることが明
らかである。
ΔbioH) と大腸菌 R878 (bioC)の両方に対して相補性を
示した。ORF2を含むプラスミドは大腸菌 BM7086 または
R878のいずれにも正常な相補性を付与しなかった。これ
らの検定から、枯草菌のbioIの産物は大腸菌のbioCまた
はbioH変異株には存在しない活性を代償し、あるいは打
ち消すビオチン合成に必要な活性を供給し得ることが明
らかである。
【００５５】ｐＣＬ１９２１（lerner and Inouye, 199
0,前掲）にクローン化した枯草菌 bioW 遺伝子とそのプ
ロモーターのみを含むプラスミド（ｐＢＩＯ 403）は、
培地にピメリン酸を約３０ｍｇ／ｌの濃度で加えたと
き、または加えたときだけ、大腸菌ΔbioHおよびbioC変
異株の両方に対して相補性を示した。この検定から、bi
oWが大腸菌においてbioHやbioCを迂回し得るピメリル−
ＣｏＡシンセターゼをコードしていることが確かめられ
た。
0,前掲）にクローン化した枯草菌 bioW 遺伝子とそのプ
ロモーターのみを含むプラスミド（ｐＢＩＯ 403）は、
培地にピメリン酸を約３０ｍｇ／ｌの濃度で加えたと
き、または加えたときだけ、大腸菌ΔbioHおよびbioC変
異株の両方に対して相補性を示した。この検定から、bi
oWが大腸菌においてbioHやbioCを迂回し得るピメリル−
ＣｏＡシンセターゼをコードしていることが確かめられ
た。
【００５６】
【表２】
【００５７】枯草菌bioIまたはORF2の推定アミノ酸配列
と、大腸菌 bioC またはbioH遺伝子もしくは他のbio 遺
伝子のタンパク質配列と、の間には有意な類似性が見い
だせなかった。しかし、その後GenBankTMのタンパク質
データベースに対比させたところ、Ｂ．メガテリウム
(B. megaterium, BM-1)、Ｓ．エリスラエア (S. erythr
aea, eryFおよびeryK) 、Ｓ．グリセオラス (S. griseo
lus, suaCおよびsubC)、Ｓ．種のＳＡ−ＣＯＯ菌株 (ch
oP) および他の生物由来の多くのシトクロムＰ−４５０
酵素に対して有意な類似性を示した。シトクロムＰ−４
５０は多くの異なる種類の基質（脂肪酸を含む）のヒド
ロキシル化を触媒することが知られているモノオキシゲ
ナーゼ類を含む酵素のクラスである。ビオチン前駆体の
ピメリン酸の合成は未同定脂肪酸のヒドロキシル化およ
び／または更なる酸化を必要とするので、bioIはビオチ
ン合成の初期段階に係わっているのかもしれない。bioC
および／またはbioH遺伝子は、bioCおよび／またはbioH
変異を相補するbioIの能力からすると、bioIと機能的に
等しいものである。同様の比較実験は、エリスロマイシ
ン生成の初期酵素段階に関与するポリケチドシンターゼ
II (ery AII)のβ−ケトレダクターゼドメインに対する
ORF2の弱い類似性を示した。
と、大腸菌 bioC またはbioH遺伝子もしくは他のbio 遺
伝子のタンパク質配列と、の間には有意な類似性が見い
だせなかった。しかし、その後GenBankTMのタンパク質
データベースに対比させたところ、Ｂ．メガテリウム
(B. megaterium, BM-1)、Ｓ．エリスラエア (S. erythr
aea, eryFおよびeryK) 、Ｓ．グリセオラス (S. griseo
lus, suaCおよびsubC)、Ｓ．種のＳＡ−ＣＯＯ菌株 (ch
oP) および他の生物由来の多くのシトクロムＰ−４５０
酵素に対して有意な類似性を示した。シトクロムＰ−４
５０は多くの異なる種類の基質（脂肪酸を含む）のヒド
ロキシル化を触媒することが知られているモノオキシゲ
ナーゼ類を含む酵素のクラスである。ビオチン前駆体の
ピメリン酸の合成は未同定脂肪酸のヒドロキシル化およ
び／または更なる酸化を必要とするので、bioIはビオチ
ン合成の初期段階に係わっているのかもしれない。bioC
および／またはbioH遺伝子は、bioCおよび／またはbioH
変異を相補するbioIの能力からすると、bioIと機能的に
等しいものである。同様の比較実験は、エリスロマイシ
ン生成の初期酵素段階に関与するポリケチドシンターゼ
II (ery AII)のβ−ケトレダクターゼドメインに対する
ORF2の弱い類似性を示した。
【００５８】実施例III. bio オペロンおよびフランキ
ングコード領域のcat 挿入変異誘発 ヌクレオチド配列から予測されたbio オペロンの境界を
確認し、これまでに同定されていないbio 遺伝子の役割
を確かめるために、cat カセットを用いてbioW, bioI,
ORF2, bio プロモーター領域, ORF3, ORF4-5およびORF6
（bio オペロンの予測された境界の外側にある）の挿入
体または欠失体を構築した。cat カセットはクロラムフ
ェニコール耐性遺伝子を含む。上記の構築物を作製する
ために、まず初めに、これらの変異を含むプラスミド誘
導体を大腸菌内に構築した。その後、標準方法によるＤ
ＮＡ形質転換を用いて枯草菌のbio 染色体遺伝子座にca
t挿入体を移入した。該挿入体または欠失体がビオチン
合成を不活性化したかどうかを調べるために、ビオチン
の存在下または非存在下でビオチン不含培地寒天プレー
ト上でこれらの変異を有するコロニーの増殖について評
価した（Bio 表現型）。
ングコード領域のcat 挿入変異誘発 ヌクレオチド配列から予測されたbio オペロンの境界を
確認し、これまでに同定されていないbio 遺伝子の役割
を確かめるために、cat カセットを用いてbioW, bioI,
ORF2, bio プロモーター領域, ORF3, ORF4-5およびORF6
（bio オペロンの予測された境界の外側にある）の挿入
体または欠失体を構築した。cat カセットはクロラムフ
ェニコール耐性遺伝子を含む。上記の構築物を作製する
ために、まず初めに、これらの変異を含むプラスミド誘
導体を大腸菌内に構築した。その後、標準方法によるＤ
ＮＡ形質転換を用いて枯草菌のbio 染色体遺伝子座にca
t挿入体を移入した。該挿入体または欠失体がビオチン
合成を不活性化したかどうかを調べるために、ビオチン
の存在下または非存在下でビオチン不含培地寒天プレー
ト上でこれらの変異を有するコロニーの増殖について評
価した（Bio 表現型）。
【００５９】図１０および図１１の上部に示すように、
cat カセットは連結によって、ＢａｍＨＩ部位を使って
bioWのコード領域に；ＸｍｎＩ部位を使ってORF3に；Ｅ
ｃｏＲＶ部位を使ってORF6に；ORF2の３’末端を欠く２
つのＳｓｔＩ部位の間に；またはORF4-5を欠く２つのＢ
ｓｔＢＩ部位の間に挿入した。また、cat カセットをＥ
ｃｏ47III 部位に連結することによりbio プロモーター
を破壊するために、あるいはそれをＨｐａＩ部位間に連
結することによりこのプロモーター領域を完全に置換す
るために、cat カセットを使用した。ORF2／ＳｓｔＩ、
ORF4-5／ＢｓｔＢＩおよび／Ｅｃｏ47III 構築物では、
cat 遺伝子が破壊されたコード領域またはプロモーター
領域と同じ方向でのみ挿入された。他のすべての構築物
では、cat カセットが両方の可能な方向に挿入された２
つの異なるプラスミド誘導体が作製された。次いで、ca
t 含有プラスミドをbio ＤＮＡの外側での制限酵素切断
により線状化し、この切断ＤＮＡをコンピテント枯草菌
原栄養株ＰＹ７９に形質転換し、そしてクロラムフェニ
コール耐性（Ｃｍr）について選択することにより、こ
れら変異の各々をbio 遺伝子座に組み込んだ。各変異株
のBio 表現型を図１０および図１１の下部に要約してあ
る。予測されたbio オペロンの外側に位置するコード領
域、ORF3、ORF4-5およびORF6内への挿入はＣｍr 原栄養
株コロニーをもたらし、これら変異がビオチン生産およ
び栄養要求性に関して表現型をもたないことを示してい
る。bio オペロン内部への挿入はヌクレオチド配列デー
タを大体において支持する複雑な結果をもたらした。ビ
オチンオペロンに対して反対方向に配置したcat 遺伝子
でbio プロモーター領域を中断させたり、bio オペロン
に対してそれぞれの方向に配置したcat 遺伝子でbioWを
中断させたりすると、明らかなBio- 表現型が得られ、b
io オペロン／プロモーター領域の５’末端でこれら配
列の位置を確認した。しかし、ビオチンオペロンと同じ
転写方向で挿入したcat 遺伝子でＰbio プロモーター領
域を置換すると、低頻度（０．１％）でBio+ バクテリ
アが得られた。バイオアッセイ実験から、バクテリアの
ビオチンビタマー生産は低濃度のクロラムフェニコール
の存在下で増加することがわかり、このことはビオチン
オペロンの転写が catプロモーターの制御下にあること
を示唆している。該オペロンの３’末端はこの遺伝子手
法では最終的に同定することができなかった。bioI内部
への挿入は、ビオチン生産が部分的に欠損しているＣｍ
r コロニーをもたらした。つまり、ビオチン不含培地で
はあまり増殖しないが、ビオチン（３３μｇ／ｍｌ）の
存在下では野生型レベルにまで増殖する。一方、ORF2::
cat 変異はBio+ コロニーをもたらした。これらの結果
から、bioIはビオチン生産にとって絶対に必要というわ
けではなく、またORF2遺伝子産物は外因性ビオチンの非
存在下での野生型の増殖には無くてもよいらしいことが
示唆される。ORF2::cat11 変異を有するbirA株（例えば
ＢＩ４２１；実施例ＸＢを参照）ではビオチン生産への
有意な作用がなにも見いだせなかった。それでもなお、
ORF2はビオチンの過剰生産には必要であるかもしれな
い。
cat カセットは連結によって、ＢａｍＨＩ部位を使って
bioWのコード領域に；ＸｍｎＩ部位を使ってORF3に；Ｅ
ｃｏＲＶ部位を使ってORF6に；ORF2の３’末端を欠く２
つのＳｓｔＩ部位の間に；またはORF4-5を欠く２つのＢ
ｓｔＢＩ部位の間に挿入した。また、cat カセットをＥ
ｃｏ47III 部位に連結することによりbio プロモーター
を破壊するために、あるいはそれをＨｐａＩ部位間に連
結することによりこのプロモーター領域を完全に置換す
るために、cat カセットを使用した。ORF2／ＳｓｔＩ、
ORF4-5／ＢｓｔＢＩおよび／Ｅｃｏ47III 構築物では、
cat 遺伝子が破壊されたコード領域またはプロモーター
領域と同じ方向でのみ挿入された。他のすべての構築物
では、cat カセットが両方の可能な方向に挿入された２
つの異なるプラスミド誘導体が作製された。次いで、ca
t 含有プラスミドをbio ＤＮＡの外側での制限酵素切断
により線状化し、この切断ＤＮＡをコンピテント枯草菌
原栄養株ＰＹ７９に形質転換し、そしてクロラムフェニ
コール耐性（Ｃｍr）について選択することにより、こ
れら変異の各々をbio 遺伝子座に組み込んだ。各変異株
のBio 表現型を図１０および図１１の下部に要約してあ
る。予測されたbio オペロンの外側に位置するコード領
域、ORF3、ORF4-5およびORF6内への挿入はＣｍr 原栄養
株コロニーをもたらし、これら変異がビオチン生産およ
び栄養要求性に関して表現型をもたないことを示してい
る。bio オペロン内部への挿入はヌクレオチド配列デー
タを大体において支持する複雑な結果をもたらした。ビ
オチンオペロンに対して反対方向に配置したcat 遺伝子
でbio プロモーター領域を中断させたり、bio オペロン
に対してそれぞれの方向に配置したcat 遺伝子でbioWを
中断させたりすると、明らかなBio- 表現型が得られ、b
io オペロン／プロモーター領域の５’末端でこれら配
列の位置を確認した。しかし、ビオチンオペロンと同じ
転写方向で挿入したcat 遺伝子でＰbio プロモーター領
域を置換すると、低頻度（０．１％）でBio+ バクテリ
アが得られた。バイオアッセイ実験から、バクテリアの
ビオチンビタマー生産は低濃度のクロラムフェニコール
の存在下で増加することがわかり、このことはビオチン
オペロンの転写が catプロモーターの制御下にあること
を示唆している。該オペロンの３’末端はこの遺伝子手
法では最終的に同定することができなかった。bioI内部
への挿入は、ビオチン生産が部分的に欠損しているＣｍ
r コロニーをもたらした。つまり、ビオチン不含培地で
はあまり増殖しないが、ビオチン（３３μｇ／ｍｌ）の
存在下では野生型レベルにまで増殖する。一方、ORF2::
cat 変異はBio+ コロニーをもたらした。これらの結果
から、bioIはビオチン生産にとって絶対に必要というわ
けではなく、またORF2遺伝子産物は外因性ビオチンの非
存在下での野生型の増殖には無くてもよいらしいことが
示唆される。ORF2::cat11 変異を有するbirA株（例えば
ＢＩ４２１；実施例ＸＢを参照）ではビオチン生産への
有意な作用がなにも見いだせなかった。それでもなお、
ORF2はビオチンの過剰生産には必要であるかもしれな
い。
【００６０】Bio+/- と称されるbioI::cat 変異により
生じる部分的ビオチン欠損表現型は極性効果というより
もむしろbioIの不活性化によって引き起こされるよう
だ。なぜならば、下流遺伝子ORF2またはORF3の内部の変
異がBio+ であるからである。Bio+/- 表現型が真正なも
のであるか否かを確かめるために、そしてbioI遺伝子産
物がピメリン酸の形成に関与することを証明するため
に、ピメリン酸を供給することによってbioI::cat 変異
を迂回させた。図１０にその要約を示すように、cat 遺
伝子のそれぞれの方向にこの変異を有するＰＹ７９株
は、ピメリン酸（３３μｇ／ｍｌ）を含有するビオチン
不含培地で野生型レベルにまで増殖した。これらの結果
から、bioI遺伝子産物は初期のビオチン生成に関与し、
この産物の不活性化は部分的にしかビオチン生産を破壊
しないことが確かめられた。
生じる部分的ビオチン欠損表現型は極性効果というより
もむしろbioIの不活性化によって引き起こされるよう
だ。なぜならば、下流遺伝子ORF2またはORF3の内部の変
異がBio+ であるからである。Bio+/- 表現型が真正なも
のであるか否かを確かめるために、そしてbioI遺伝子産
物がピメリン酸の形成に関与することを証明するため
に、ピメリン酸を供給することによってbioI::cat 変異
を迂回させた。図１０にその要約を示すように、cat 遺
伝子のそれぞれの方向にこの変異を有するＰＹ７９株
は、ピメリン酸（３３μｇ／ｍｌ）を含有するビオチン
不含培地で野生型レベルにまで増殖した。これらの結果
から、bioI遺伝子産物は初期のビオチン生成に関与し、
この産物の不活性化は部分的にしかビオチン生産を破壊
しないことが確かめられた。
【００６１】実施例ＩＶ： ビオチンオペロンの調節機構の分析 分かれて存在している大腸菌のｂｉｏオペロン、ｂｉｏ
ＡＢＦＣＤの転写は、ｂｉｒＡ遺伝子座によってコード
されたリプレッサーが関与する古典的なリプレッサー／
オペレーター機構によって調節されている［ Cronan, C
ell 58, 427-429 (1989)］。このリプレッサーは、ＣＯ
ＯＨ末端にホロ酵素シンセターゼ活性を有する二機能性
の分子で、この活性によって、ビオチンのアポカルボキ
シラーゼ酵素への転移に先立って、ビオチンがそのアデ
ニル化形態であるビオチノイル−ＡＭＰに転化される。
ビオチノイル−ＡＭＰは、コリプレッサーとしても機能
し、リプレッサー／ビオチノイル−ＡＭＰ複合体が、２
つの分かれて存在するプロモーターの−１０領域と重な
りあったオペレーター部位に結合することによって、転
写が阻止される。
ＡＢＦＣＤの転写は、ｂｉｒＡ遺伝子座によってコード
されたリプレッサーが関与する古典的なリプレッサー／
オペレーター機構によって調節されている［ Cronan, C
ell 58, 427-429 (1989)］。このリプレッサーは、ＣＯ
ＯＨ末端にホロ酵素シンセターゼ活性を有する二機能性
の分子で、この活性によって、ビオチンのアポカルボキ
シラーゼ酵素への転移に先立って、ビオチンがそのアデ
ニル化形態であるビオチノイル−ＡＭＰに転化される。
ビオチノイル−ＡＭＰは、コリプレッサーとしても機能
し、リプレッサー／ビオチノイル−ＡＭＰ複合体が、２
つの分かれて存在するプロモーターの−１０領域と重な
りあったオペレーター部位に結合することによって、転
写が阻止される。
【００６２】野生型のｂｉｏオペロンの５’プロモータ
ー／調節領域を、数種の強力で構成的な枯草菌のプロモ
ーターの１種で置き換える（実施例ＶＩＩ参照）ため
に、野生型のｂｉｏオペロンのこの領域の特性決定を行
った。枯草菌のｂｉｏオペロンの転写開始部位である可
能性が最も高いのは、オペロンの１つ目の遺伝子である
ｂｉｏＷの約８４ｂｐ上流に位置するσA プロモータ
ー、Ｐbio である（図４）。実際のｍＲＮＡの開始部位
は、「ＴＡＴＡＴＴ」ボックスの終わりから３−４ｂｐ
下流に位置する２つのアデノシンヌクレオチドの一方、
あるいは、「ＴＡＴＡＴＴ」ボックスから７ｂｐ下流に
位置するグアノシンである。ＲＮＡのリーダー配列は、
B. sphaericus のｂｉｏオペロンの「オペレーター」部
位と高い相同性を有する３３ｂｐのセグメントを含んで
いる。この領域のヌクレオチド配列と、B. sphaericus
のｂｉｏＤＡＹＢオペロンの５’非コード領域の比較を
図１２に示す。［図１２の記号は以下のとおり。上側の
配列（B. sphaericus のｂｉｏＤＡＹＢ調節領域）──
１５ｂｐの調節領域：二重の太線、二回対称の領域：破
線、プライマー伸長法を用いたマッピングによって決定
した転写開始部位：矢印、リボソーム結合部位：ＲＢ
Ｓ。なお、「Ｇ」および「Ｔ」のヌクレオチドは、上下
の配列を合わせるために、配列から外して表示してあ
る。下側の配列（枯草菌のｂｉｏプロモーター領域）─
─上側の配列に示すB. sphaericus の調節領域との類似
性に基づく１３ｂｐの推定上の調節領域：一重の太線、
推定上の転写開始部位：矢印、リボソーム結合部位：Ｒ
ＢＳ。なお、「Ｃ」のヌクレオチドは、上下の配列を合
わせるために、配列から外して表示してある。］保存さ
れているヌクレオチドの大半は、互いに９ｂｐのセグメ
ントによって隔てられた（１３ｂｐと１１ｂｐの）２つ
の部位にかたまっている。この知見から、枯草菌のｂｉ
ｏ遺伝子の転写がリプレッサー／オペレーター機構によ
って調節され、この機構には、ｔｒｐオペロンの近くに
位置するｂｉｒＡに類似した遺伝子が関与している可能
性があることが示唆される（実施例ＩＸ参照）。ｂｉｏ
Ｗの上流に位置するプロモーターの活性および調節につ
いては、ｌａｃＺとｂｉｏＷ（Ｐbio および推定上の調
節領域を含む）との翻訳融合物が、ビオチンによって調
節されたβ−ガラクトシダーゼの発現を示すことによっ
て確認した（実施例Ｖ参照）。
ー／調節領域を、数種の強力で構成的な枯草菌のプロモ
ーターの１種で置き換える（実施例ＶＩＩ参照）ため
に、野生型のｂｉｏオペロンのこの領域の特性決定を行
った。枯草菌のｂｉｏオペロンの転写開始部位である可
能性が最も高いのは、オペロンの１つ目の遺伝子である
ｂｉｏＷの約８４ｂｐ上流に位置するσA プロモータ
ー、Ｐbio である（図４）。実際のｍＲＮＡの開始部位
は、「ＴＡＴＡＴＴ」ボックスの終わりから３−４ｂｐ
下流に位置する２つのアデノシンヌクレオチドの一方、
あるいは、「ＴＡＴＡＴＴ」ボックスから７ｂｐ下流に
位置するグアノシンである。ＲＮＡのリーダー配列は、
B. sphaericus のｂｉｏオペロンの「オペレーター」部
位と高い相同性を有する３３ｂｐのセグメントを含んで
いる。この領域のヌクレオチド配列と、B. sphaericus
のｂｉｏＤＡＹＢオペロンの５’非コード領域の比較を
図１２に示す。［図１２の記号は以下のとおり。上側の
配列（B. sphaericus のｂｉｏＤＡＹＢ調節領域）──
１５ｂｐの調節領域：二重の太線、二回対称の領域：破
線、プライマー伸長法を用いたマッピングによって決定
した転写開始部位：矢印、リボソーム結合部位：ＲＢ
Ｓ。なお、「Ｇ」および「Ｔ」のヌクレオチドは、上下
の配列を合わせるために、配列から外して表示してあ
る。下側の配列（枯草菌のｂｉｏプロモーター領域）─
─上側の配列に示すB. sphaericus の調節領域との類似
性に基づく１３ｂｐの推定上の調節領域：一重の太線、
推定上の転写開始部位：矢印、リボソーム結合部位：Ｒ
ＢＳ。なお、「Ｃ」のヌクレオチドは、上下の配列を合
わせるために、配列から外して表示してある。］保存さ
れているヌクレオチドの大半は、互いに９ｂｐのセグメ
ントによって隔てられた（１３ｂｐと１１ｂｐの）２つ
の部位にかたまっている。この知見から、枯草菌のｂｉ
ｏ遺伝子の転写がリプレッサー／オペレーター機構によ
って調節され、この機構には、ｔｒｐオペロンの近くに
位置するｂｉｒＡに類似した遺伝子が関与している可能
性があることが示唆される（実施例ＩＸ参照）。ｂｉｏ
Ｗの上流に位置するプロモーターの活性および調節につ
いては、ｌａｃＺとｂｉｏＷ（Ｐbio および推定上の調
節領域を含む）との翻訳融合物が、ビオチンによって調
節されたβ−ガラクトシダーゼの発現を示すことによっ
て確認した（実施例Ｖ参照）。
【００６３】５’ＲＮＡリーダーは、オペレータ領域と
重なりあった、大型で安定した潜在的なステム−ループ
構造（ΔＧ＝−１４．０ｋｃａｌ／ｍｏｌ）を含んでい
る。ｂｉｏＷの上流にＰbio および調節部位が特定され
たことからして、枯草菌のｂｉｏ遺伝子は、約７２００
ｂｐの単一のポリシストロン性のメッセージとして転写
される。また、ｂｉｏオペロンの内側の領域には、二次
プロモーターである可能性のある部位も存在している。
たとえば、ｂｉｏＩには、コンセンサスσAプロモータ
ー配列と多少類似した、ＴＴＧＡＡＡ−−１７ｂｐ−−
ＴＣＴＴＡＴの配列（配列番号６および図１６、番号６
２５８−６２８６）が存在している（ｂｉｏＩの開始コ
ドンの約７７５ｂｐ下流）。こうした配列が内部プロモ
ーターとして機能しているのか否かは、ｂｉｏオペロン
の内側の部分から得た制限断片を使用して、ｌａｃＺと
の翻訳融合物を構築することによって決定することがで
きる（実施例Ｖ参照）。ビオチンの生産は、一次あるい
は二次プロモーターの１つ以上を修飾することによって
最適化することができる。
重なりあった、大型で安定した潜在的なステム−ループ
構造（ΔＧ＝−１４．０ｋｃａｌ／ｍｏｌ）を含んでい
る。ｂｉｏＷの上流にＰbio および調節部位が特定され
たことからして、枯草菌のｂｉｏ遺伝子は、約７２００
ｂｐの単一のポリシストロン性のメッセージとして転写
される。また、ｂｉｏオペロンの内側の領域には、二次
プロモーターである可能性のある部位も存在している。
たとえば、ｂｉｏＩには、コンセンサスσAプロモータ
ー配列と多少類似した、ＴＴＧＡＡＡ−−１７ｂｐ−−
ＴＣＴＴＡＴの配列（配列番号６および図１６、番号６
２５８−６２８６）が存在している（ｂｉｏＩの開始コ
ドンの約７７５ｂｐ下流）。こうした配列が内部プロモ
ーターとして機能しているのか否かは、ｂｉｏオペロン
の内側の部分から得た制限断片を使用して、ｌａｃＺと
の翻訳融合物を構築することによって決定することがで
きる（実施例Ｖ参照）。ビオチンの生産は、一次あるい
は二次プロモーターの１つ以上を修飾することによって
最適化することができる。
【００６４】ＩＶＡ． ｂｉｏ−ｌａｃＺ翻訳融合物の構築と分析 ｌａｃＺとの翻訳融合物を構築して、推定上のプロモー
ター／調節領域の活性ならびに調節を確認し、枯草菌の
ビオチンオペロンの各種条件での相対的な発現レベルを
評価した。この作業は、プロモーターを含まないｌａｃ
Ｚコード領域を含む３．１ｋｂのＢａｍＨＩ−ＢｇｌＩ
Ｉ断片を、ｐＢＩＯ３５０のＢａｍＨＩ部位に挿入し
て、ｐＢＩＯ３９７およびｐＢＩＯ３９８を得ることに
よって行った。これらの同一であることが推定される２
つのプラスミドは、ｂｉｏＷとｌａｃＺのイン・フレー
ムの「翻訳」融合物を、低コピー数のプラスミド上に含
んでいる。ｐＢＩＯ３９７とｐＢＩＯ３９８は、Ｘ−ｇ
ａｌ指示平板上でｌａｃＺ-大腸菌を淡青色とし、大腸
菌ではこの融合が比較的低レベルで発現することが示唆
された。
ター／調節領域の活性ならびに調節を確認し、枯草菌の
ビオチンオペロンの各種条件での相対的な発現レベルを
評価した。この作業は、プロモーターを含まないｌａｃ
Ｚコード領域を含む３．１ｋｂのＢａｍＨＩ−ＢｇｌＩ
Ｉ断片を、ｐＢＩＯ３５０のＢａｍＨＩ部位に挿入し
て、ｐＢＩＯ３９７およびｐＢＩＯ３９８を得ることに
よって行った。これらの同一であることが推定される２
つのプラスミドは、ｂｉｏＷとｌａｃＺのイン・フレー
ムの「翻訳」融合物を、低コピー数のプラスミド上に含
んでいる。ｐＢＩＯ３９７とｐＢＩＯ３９８は、Ｘ−ｇ
ａｌ指示平板上でｌａｃＺ-大腸菌を淡青色とし、大腸
菌ではこの融合が比較的低レベルで発現することが示唆
された。
【００６５】ｂｉｏＷ−ｌａｃＺ融合物の、枯草菌中で
のビオチン調節性の発現を調べるために、Ｂｉｏ+ 部分
二倍体を構築した。ｌａｃＺ遺伝子の下流に位置するポ
リリンカー領域内に位置する単一のＳｍａＩ部位を使用
して、ｐＢＩＯ３９７にｃａｔカセットをクローニング
した。ｃａｔ遺伝子が翻訳融合物と同一方向を向いてい
る組換えプラスミドの一つ、ｐＢＩＯ３９７ｃａｔを使
用して、Ｂｉｏ+ 部分二倍体を作製した。このｐＢＩＯ
３９７ｃａｔで、原栄養株の枯草菌ＰＹ７９株のコンピ
テントな細胞を形質転換し、Ｃｍr について選択した。
形質転換体が生じるのは、染色体への組換えが生じた場
合のみのはずである。この方法をとると、ｂｉｏオペロ
ンの無傷のコピーが残り、ビオチンを加えなくてもｌａ
ｃ融合物の活性を評価することが可能となる。
のビオチン調節性の発現を調べるために、Ｂｉｏ+ 部分
二倍体を構築した。ｌａｃＺ遺伝子の下流に位置するポ
リリンカー領域内に位置する単一のＳｍａＩ部位を使用
して、ｐＢＩＯ３９７にｃａｔカセットをクローニング
した。ｃａｔ遺伝子が翻訳融合物と同一方向を向いてい
る組換えプラスミドの一つ、ｐＢＩＯ３９７ｃａｔを使
用して、Ｂｉｏ+ 部分二倍体を作製した。このｐＢＩＯ
３９７ｃａｔで、原栄養株の枯草菌ＰＹ７９株のコンピ
テントな細胞を形質転換し、Ｃｍr について選択した。
形質転換体が生じるのは、染色体への組換えが生じた場
合のみのはずである。この方法をとると、ｂｉｏオペロ
ンの無傷のコピーが残り、ビオチンを加えなくてもｌａ
ｃ融合物の活性を評価することが可能となる。
【００６６】ｐＢＩＯ３５０にクローニングしたＢａｍ
ＨＩ−ＰｓｔＩ断片のプロモーターは、ビオチンによっ
て調節される。ｂｉｏＷ−ｌａｃＺ融合物を含むＣｍr
Ｂｉｏ+ 部分二倍体の２菌株のβ−ガラクトシダーゼ活
性を、ビオチンを含まない培地中で、ビオチン（１００
μｇ／リットル）の存在下ならびに不在下で調べた。液
状ＯＮＰＧ検定では、両菌株ともビオチンによって特異
的に調節された。β−ガラクトシダーゼのレベルは、ビ
オチンが存在すると抑制され、ビオチンが存在しないと
２４−８５倍の高い比活性が誘導された（表３）。ｂｉ
ｏオペロンにｂｉｏＷ：：ｌａｃＺ融合物を組込んだこ
の菌株は、新規なビオチン類似物耐性変異株（後述）を
Ｘ−ｇａｌ指示平板上で単離する際にも使用した。
ＨＩ−ＰｓｔＩ断片のプロモーターは、ビオチンによっ
て調節される。ｂｉｏＷ−ｌａｃＺ融合物を含むＣｍr
Ｂｉｏ+ 部分二倍体の２菌株のβ−ガラクトシダーゼ活
性を、ビオチンを含まない培地中で、ビオチン（１００
μｇ／リットル）の存在下ならびに不在下で調べた。液
状ＯＮＰＧ検定では、両菌株ともビオチンによって特異
的に調節された。β−ガラクトシダーゼのレベルは、ビ
オチンが存在すると抑制され、ビオチンが存在しないと
２４−８５倍の高い比活性が誘導された（表３）。ｂｉ
ｏオペロンにｂｉｏＷ：：ｌａｃＺ融合物を組込んだこ
の菌株は、新規なビオチン類似物耐性変異株（後述）を
Ｘ−ｇａｌ指示平板上で単離する際にも使用した。
【００６７】
【表３】
【００６８】ＩＶＢ． ＳＰβ担持ｂｉｏＷ−ｌａｃＺ
翻訳融合物の構築と分析 実施例ＩＶＡのｌａｃＺ融合株に加えて、他の菌株を構
築して、ビオチンの調節機構を解明することもできる。
一例を挙げると、本発明者らは、ｂｉｏＷ−ｌａｃＺ融
合物をプラスミドに担持させて染色体に挿入すると、組
込まれたプラスミドのコピー数が増幅するので技術的な
問題を生じることに気づいた。そこで、ｂｉｏＷ−ｌａ
ｃＺ融合物を修飾ＳＰβ特殊形質導入用ファージに導入
することによって、単一コピー数の該融合物をｂｉｏオ
ペロンとは異なった部位で発現させることを試みた［た
とえば、Zuber et al., J. Bacteriol. 169, 2223-2230
(1987) 参照］。
翻訳融合物の構築と分析 実施例ＩＶＡのｌａｃＺ融合株に加えて、他の菌株を構
築して、ビオチンの調節機構を解明することもできる。
一例を挙げると、本発明者らは、ｂｉｏＷ−ｌａｃＺ融
合物をプラスミドに担持させて染色体に挿入すると、組
込まれたプラスミドのコピー数が増幅するので技術的な
問題を生じることに気づいた。そこで、ｂｉｏＷ−ｌａ
ｃＺ融合物を修飾ＳＰβ特殊形質導入用ファージに導入
することによって、単一コピー数の該融合物をｂｉｏオ
ペロンとは異なった部位で発現させることを試みた［た
とえば、Zuber et al., J. Bacteriol. 169, 2223-2230
(1987) 参照］。
【００６９】ＰＹ７９（ＳＰβ：：ｂｉｏＷ−ｌａｃ
Ｚ）ならびにＢＩ４２１（ＳＰβ：：ｂｉｏＷ−ｌａｃ
Ｚ）の２つの単離物を、上述のようにしてβ−ガラクト
シダーゼ活性について検定した。結果を表３に示す。Ｂ
ｉｏ+ の菌株であるＰＹ７９では、ＳＰβ：：ｂｉｏＷ
−ｌａｃＺの発現は極めて低レベルであったが、ビオチ
ン特異的な調節を示した。β−ガラクトシダーゼはビオ
チンの存在下では抑制され、ビオチンの不在下では約９
−１５倍誘導された。２コピー以上のプラスミド上に担
持されたｂｉｏＷ−ｌａｃＺ融合物を含むＰＹ７９につ
いて行った上述の検定と比べると、単一コピーの融合物
によって生産されるβ−ガラクトシダーゼは、抑制成育
条件では３倍少なく、抑制解除成育条件では約２０倍少
ないことが示された。枯草菌のｂｉｒＡ株（ＢＩ４２
１、実施例ＸＢ参照）では、該融合物の構成的な発現が
低レベルであるのが観察された。ｂｉｒＡ株でのβ−ガ
ラクトシダーゼのレベルは、抑制解除成育条件で成育さ
せたＰＹ７９（ＳＰβ：：ｂｉｏＷ−ｌａｃＺ）で観察
されるレベルよりわずかに高い程度であった。ＢＩ４２
１（ＳＰβ：：ｂｉｏＷ−ｌａｃＺ）の単離物の一つで
は、ビオチンがβ−ガラクトシダーゼの発現をわずかに
抑制し、このｂｉｒＡ変異がビオチンによる該融合物の
調節を完全に解除するものでない可能性が示唆された。
こうした結果から、ｂｉｏＷの発現がビオチンによって
調節されていることが確認された。
Ｚ）ならびにＢＩ４２１（ＳＰβ：：ｂｉｏＷ−ｌａｃ
Ｚ）の２つの単離物を、上述のようにしてβ−ガラクト
シダーゼ活性について検定した。結果を表３に示す。Ｂ
ｉｏ+ の菌株であるＰＹ７９では、ＳＰβ：：ｂｉｏＷ
−ｌａｃＺの発現は極めて低レベルであったが、ビオチ
ン特異的な調節を示した。β−ガラクトシダーゼはビオ
チンの存在下では抑制され、ビオチンの不在下では約９
−１５倍誘導された。２コピー以上のプラスミド上に担
持されたｂｉｏＷ−ｌａｃＺ融合物を含むＰＹ７９につ
いて行った上述の検定と比べると、単一コピーの融合物
によって生産されるβ−ガラクトシダーゼは、抑制成育
条件では３倍少なく、抑制解除成育条件では約２０倍少
ないことが示された。枯草菌のｂｉｒＡ株（ＢＩ４２
１、実施例ＸＢ参照）では、該融合物の構成的な発現が
低レベルであるのが観察された。ｂｉｒＡ株でのβ−ガ
ラクトシダーゼのレベルは、抑制解除成育条件で成育さ
せたＰＹ７９（ＳＰβ：：ｂｉｏＷ−ｌａｃＺ）で観察
されるレベルよりわずかに高い程度であった。ＢＩ４２
１（ＳＰβ：：ｂｉｏＷ−ｌａｃＺ）の単離物の一つで
は、ビオチンがβ−ガラクトシダーゼの発現をわずかに
抑制し、このｂｉｒＡ変異がビオチンによる該融合物の
調節を完全に解除するものでない可能性が示唆された。
こうした結果から、ｂｉｏＷの発現がビオチンによって
調節されていることが確認された。
【００７０】ビオチンによる調節を、互いに独立に単離
した２種のビオチン類似物耐性変異株についても調べ
た。ＨＢ３は自発性のｂｉｒＡ変異を含んでおり、α−
ＤＢ９は、ｂｉｏともｂｉｒＡともリンクしていないα
−デヒドロビオチン耐性変異を含んでいる。これらの菌
株の形質導入、成育、検定を、α−ＤＢ９（ＳＰβ：：
ｂｉｏＷ−ｌａｃＺ）の検定を中間指数増殖期に行った
以外は上述の通りにして行った。表３に示すように、該
融合物を含むＨＢ３株は、低レベルの構成的なｌａｃＺ
の発現を示した。しかし、ｂｉｒＡ変異株の場合とは異
なり、α−ＤＢ９（ＳＰβ：：ｂｉｏＷ−ｌａｃＺ）
は、ビオチン調節性のｌａｃＺの発現を示した。
した２種のビオチン類似物耐性変異株についても調べ
た。ＨＢ３は自発性のｂｉｒＡ変異を含んでおり、α−
ＤＢ９は、ｂｉｏともｂｉｒＡともリンクしていないα
−デヒドロビオチン耐性変異を含んでいる。これらの菌
株の形質導入、成育、検定を、α−ＤＢ９（ＳＰβ：：
ｂｉｏＷ−ｌａｃＺ）の検定を中間指数増殖期に行った
以外は上述の通りにして行った。表３に示すように、該
融合物を含むＨＢ３株は、低レベルの構成的なｌａｃＺ
の発現を示した。しかし、ｂｉｒＡ変異株の場合とは異
なり、α−ＤＢ９（ＳＰβ：：ｂｉｏＷ−ｌａｃＺ）
は、ビオチン調節性のｌａｃＺの発現を示した。
【００７１】実施例Ｖ： 枯草菌のｂｉｏ遺伝子を含む
大腸菌株からのビオチンならびにビオチンビタマーの分
泌 本発明者らは、相補性検定の間に、ｐＢＩＯ２０１を含
む大腸菌のｂｉｏＡ変異株が、対照プラスミドであるｐ
ＢＲ３２２を含む同一菌株を栄養共生させうることを観
察した。このことは、ｐＢＩＯ２０１を含む菌株によっ
て合成されたビオチンが培地中に分泌され、Ｂｉｏ- 株
によって代謝されたことを実証するものである。そこで
本発明者らは、新たに構築した各種のプラスミドについ
て、ビオチンならびにビオチンビタマーを培地中に分泌
する能力を調べた。
大腸菌株からのビオチンならびにビオチンビタマーの分
泌 本発明者らは、相補性検定の間に、ｐＢＩＯ２０１を含
む大腸菌のｂｉｏＡ変異株が、対照プラスミドであるｐ
ＢＲ３２２を含む同一菌株を栄養共生させうることを観
察した。このことは、ｐＢＩＯ２０１を含む菌株によっ
て合成されたビオチンが培地中に分泌され、Ｂｉｏ- 株
によって代謝されたことを実証するものである。そこで
本発明者らは、新たに構築した各種のプラスミドについ
て、ビオチンならびにビオチンビタマーを培地中に分泌
する能力を調べた。
【００７２】大腸菌のＭＭ２９４株およびＪＭ１０９ｌ
ａｃＩQ 株（両菌株ともｂｉｏ遺伝子については野生
型）を、ｐＢＲ３２２、ｐＢＩＯ２０１、ｐＵＣ１９、
およびｐＢＩＯ２８９（下記の実施例ＶＩに記載）で形
質転換した。ｐＢＲ３２２およびｐＢＩＯ２０１による
形質転換体は、２％のグルコースを含む最少培地で成育
させた。ｐＵＣ１９およびｐＢＩＯ２８９による形質転
換体は、液体最少培地では十分に成育しなかったので、
２％のグリセロールを含む富栄養培地で成長させた。４
８時間後に、遠心分離によって細胞を除去し、残りの生
きた細胞はクロロホルムで死滅させた。上清を、０．５
％のグルコースおよび５ｍｇ／ｌのチアミンを加えたデ
ィフコ(Difco) 社製ビオチン検定用培地（Ｂｉｏｔｉｎ
Ａｓｓａｙ Ｍｅｄｉｕｍ）の１０倍希釈物を用いて
順次希釈し、後述する大腸菌Δ（ｍａｌ−ｂｉｏＨ）お
よび大腸菌Δ（ｂｉｏＡ−Ｄ）を成長させうるか否かに
ついて調べた。ビオチンならびにデスチオビオチンの連
続希釈液から、標準曲線を作成した。この検定は１μｇ
／リットルに対して感受性であった。
ａｃＩQ 株（両菌株ともｂｉｏ遺伝子については野生
型）を、ｐＢＲ３２２、ｐＢＩＯ２０１、ｐＵＣ１９、
およびｐＢＩＯ２８９（下記の実施例ＶＩに記載）で形
質転換した。ｐＢＲ３２２およびｐＢＩＯ２０１による
形質転換体は、２％のグルコースを含む最少培地で成育
させた。ｐＵＣ１９およびｐＢＩＯ２８９による形質転
換体は、液体最少培地では十分に成育しなかったので、
２％のグリセロールを含む富栄養培地で成長させた。４
８時間後に、遠心分離によって細胞を除去し、残りの生
きた細胞はクロロホルムで死滅させた。上清を、０．５
％のグルコースおよび５ｍｇ／ｌのチアミンを加えたデ
ィフコ(Difco) 社製ビオチン検定用培地（Ｂｉｏｔｉｎ
Ａｓｓａｙ Ｍｅｄｉｕｍ）の１０倍希釈物を用いて
順次希釈し、後述する大腸菌Δ（ｍａｌ−ｂｉｏＨ）お
よび大腸菌Δ（ｂｉｏＡ−Ｄ）を成長させうるか否かに
ついて調べた。ビオチンならびにデスチオビオチンの連
続希釈液から、標準曲線を作成した。この検定は１μｇ
／リットルに対して感受性であった。
【００７３】これらの検定の結果を表４に示す。枯草菌
のｂｉｏ遺伝子をコードするプラスミドを含む菌株がビ
オチンを分泌するのに対し、対照プラスミドを含む菌株
はビオチンを分泌しなかった。このことから、枯草菌の
ビオチンオペロン（ｐＢＩＯ２８９）を含む大腸菌の菌
株が、高レベルのビオチンおよびビオチン前駆体を分泌
しうることが実証された。
のｂｉｏ遺伝子をコードするプラスミドを含む菌株がビ
オチンを分泌するのに対し、対照プラスミドを含む菌株
はビオチンを分泌しなかった。このことから、枯草菌の
ビオチンオペロン（ｐＢＩＯ２８９）を含む大腸菌の菌
株が、高レベルのビオチンおよびビオチン前駆体を分泌
しうることが実証された。
【００７４】
【表４】 枯草菌のｂｉｏ遺伝子を含む大腸菌菌株による ビオチンおよびビオチンビタマー＊の生産 ビオチンとビオチ ビオチン ンビタマーの合計 菌株 プラスミド （μｇ／ｌ） 量（μｇ／ｌ） ＭＭ２９４ ｐＢＲ３２２ ０ ３ ｐＢＩＯ２０１ １０ １０ ＪＭ１０９ ｐＵＣ１９ ０ ０ ｐＢＩＯ２８９ １０ １０ ＭＭ２９４ ｐＵＣ１９ ０ １ ｐＢＩＯ２８９ １０ １００ ──────────────────────────────── ＊ビオチンビタマーは、デスチオビオチンの当量として
示してある。
示してある。
【００７５】この検定は、他の菌株、たとえば枯草菌の
菌株、あるいは他のプラスミドによって生産されるビオ
チンやビオチン前駆体のレベルを調べる際にも使用する
ことができる。候補の菌株は、機能的なビオチンオペロ
ンを有しているプラスミドを用いて形質転換してから調
べる。また、候補のプラスミドは、ビオチンを分泌する
ことがわかっている菌株で調べる。
菌株、あるいは他のプラスミドによって生産されるビオ
チンやビオチン前駆体のレベルを調べる際にも使用する
ことができる。候補の菌株は、機能的なビオチンオペロ
ンを有しているプラスミドを用いて形質転換してから調
べる。また、候補のプラスミドは、ビオチンを分泌する
ことがわかっている菌株で調べる。
【００７６】実施例ＶＩ： 「最小」ｂｉｏサブクローンの構築 最小サブクローンは、もともとの一次クローン（たとえ
ば、ｐＢＩＯ１００およびｐＢＩＯ２０１）が有してい
た関連機能のすべてをコードしている。「最小」サブク
ローンを構築したのは、欠失地図の作成ならびにＤＮＡ
の配列情報から導出したｂｉｏ遺伝子の位置を確認し、
転写ターミネーターの下流側からＥｃｏＲＶ部位の右側
までのオープン・リーディング・フレーム（図５参照）
がビオチンの生合成に際して不要であることを確認する
ためである。
ば、ｐＢＩＯ１００およびｐＢＩＯ２０１）が有してい
た関連機能のすべてをコードしている。「最小」サブク
ローンを構築したのは、欠失地図の作成ならびにＤＮＡ
の配列情報から導出したｂｉｏ遺伝子の位置を確認し、
転写ターミネーターの下流側からＥｃｏＲＶ部位の右側
までのオープン・リーディング・フレーム（図５参照）
がビオチンの生合成に際して不要であることを確認する
ためである。
【００７７】ｐＢＩＯ２０１（ｂｉｏＷ遺伝子以外のｂ
ｉｏ遺伝子であると考えられるオープン・リーディング
・フレームをすべて含む）のＥｃｏＲＶ（部分）からＢ
ａｍＨＩまでの断片を、ｐＵＣ９［Viera and Messing,
Gene 19, 259-268 (1982)］のＳｍａＩからＢａｍＨＩ
までの骨格に挿入して、ｐＢＩＯ２８９を構築した。ｐ
ＢＩＯ２８９のｂｉｏ遺伝子は、いずれもｐＵＣ９のｌ
ａｃプロモーターより下流に位置しており、ｐＵＣ９は
ｐＢＲ３２２（ｐＢＩＯ１００およびｐＢＩＯ２０１の
親）より高コピー数に保持されているので、ｐＢＩＯ２
８９は、大腸菌宿主中では、ｐＢＩＯ２０１およびｐＢ
ＩＯ１００より高レベルでｂｉｏ遺伝子を発現すると予
測される。一連の同遺伝子型の大腸菌のｂｉｏ変異株を
ｐＢＩＯ１００、２０１、および２８９ならびにｐＢＲ
３２２（対照）で形質転換した。各形質転換体につい
て、ビオチン欠乏培地での相補性を検定した。結果を表
５に示す。ｐＢＩＯ２８９は、単一のｂｉｏ遺伝子が欠
損したすべての変異株に対して相補性を示し、全ての関
連遺伝子が推定上のターミネーターの上流に位置してい
ることが確かめられた。ターミネーターより下流のオー
プン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ３）は、個々の
大腸菌のｂｉｏ変異株を相補する上で不必要である。
ｉｏ遺伝子であると考えられるオープン・リーディング
・フレームをすべて含む）のＥｃｏＲＶ（部分）からＢ
ａｍＨＩまでの断片を、ｐＵＣ９［Viera and Messing,
Gene 19, 259-268 (1982)］のＳｍａＩからＢａｍＨＩ
までの骨格に挿入して、ｐＢＩＯ２８９を構築した。ｐ
ＢＩＯ２８９のｂｉｏ遺伝子は、いずれもｐＵＣ９のｌ
ａｃプロモーターより下流に位置しており、ｐＵＣ９は
ｐＢＲ３２２（ｐＢＩＯ１００およびｐＢＩＯ２０１の
親）より高コピー数に保持されているので、ｐＢＩＯ２
８９は、大腸菌宿主中では、ｐＢＩＯ２０１およびｐＢ
ＩＯ１００より高レベルでｂｉｏ遺伝子を発現すると予
測される。一連の同遺伝子型の大腸菌のｂｉｏ変異株を
ｐＢＩＯ１００、２０１、および２８９ならびにｐＢＲ
３２２（対照）で形質転換した。各形質転換体につい
て、ビオチン欠乏培地での相補性を検定した。結果を表
５に示す。ｐＢＩＯ２８９は、単一のｂｉｏ遺伝子が欠
損したすべての変異株に対して相補性を示し、全ての関
連遺伝子が推定上のターミネーターの上流に位置してい
ることが確かめられた。ターミネーターより下流のオー
プン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ３）は、個々の
大腸菌のｂｉｏ変異株を相補する上で不必要である。
【００７８】
【表５】
【００７９】実施例ＶＩＩ． 全長の野生型ならびに遺
伝子操作型枯草菌ビオチンオペロンの構築 枯草菌の染色体中に組込んで増幅させるための遺伝子操
作型の全長のｂｉｏオペロンを構築する実験について以
下に説明する。
伝子操作型枯草菌ビオチンオペロンの構築 枯草菌の染色体中に組込んで増幅させるための遺伝子操
作型の全長のｂｉｏオペロンを構築する実験について以
下に説明する。
【００８０】ＶＩＩＡ： 全長の野生型ｂｉｏオペロンの再構築 大腸菌中で作動するためには、枯草菌のビオチンオペロ
ンの５’末端を低コピー数でクローニングする必要があ
ることがわかったので、枯草菌の染色体中に組込むため
の完全な遺伝子操作型ビオチンオペロンを構築するにあ
たっても、低コピー数のプラスミドを使用した。さきに
説明したように、枯草菌のビオチンオペロンの５’末端
を、１細胞当たり約５−１０コピーで存在する低コピー
数のプラスミドであるｐＣＬ１９２１（Lerner and Ino
uye, 1990, 前掲) 中に、３ｋｂのＰｓｔＩ−ＢａｍＨ
Ｉ断片としてクローニングして、ｐＢＩＯ３５０を得
た。
ンの５’末端を低コピー数でクローニングする必要があ
ることがわかったので、枯草菌の染色体中に組込むため
の完全な遺伝子操作型ビオチンオペロンを構築するにあ
たっても、低コピー数のプラスミドを使用した。さきに
説明したように、枯草菌のビオチンオペロンの５’末端
を、１細胞当たり約５−１０コピーで存在する低コピー
数のプラスミドであるｐＣＬ１９２１（Lerner and Ino
uye, 1990, 前掲) 中に、３ｋｂのＰｓｔＩ−ＢａｍＨ
Ｉ断片としてクローニングして、ｐＢＩＯ３５０を得
た。
【００８１】次に、ｐＢＩＯ２０１から得たｂｉｏオペ
ロンの３’部分をｐＢＩＯ３５０に付加することによっ
て、全長のビオチンオペロンを再構築した。ビオチンオ
ペロンの大半ならびに約３ｋｂの下流側のＤＮＡを含
む、ｐＢＩＯ２０１から得た１０ｋｂのＢａｍＨＩ−Ｅ
ｃｏＲＩ断片を、ＢａｍＨＩならびにＥｃｏＲＩで開裂
させておいたｐＢＩＯ３５０に連結した。得られた、正
しい予測通りの構造を有していた２種のプラスミドを、
ｐＢＩＯ４００ならびにｐＢＩＯ４０１と称した。ｐＢ
ＩＯ４０１は、ΔｂｉｏＡ−Ｄ変異株をはじめとするす
べての公知の大腸菌のｂｉｏ変異株に対して相補性を示
す。ｐＢＩＯ４０１をΔｂｉｏＡ−Ｄ株での相補性によ
って選択し、富栄養培地で生育させたところ、このプラ
スミドは十分に安定で、使用可能量のプラスミドＤＮＡ
を得ることができた。ｐＢＩＯ４０１が有しているスペ
クチノマイシン耐性遺伝子が枯草菌では発現されないの
で、ｐＢＩＯ４０１のＥｃｏＲＩ部位にｃａｔカセット
を加えて、当業者に公知の方法で枯草菌の野生型あるい
は調節解除型の菌株での選択、組込み、増幅を行うこと
ができるようにし、プラスミドｐＢＩＯ４０１ｃａｔs
を得た。
ロンの３’部分をｐＢＩＯ３５０に付加することによっ
て、全長のビオチンオペロンを再構築した。ビオチンオ
ペロンの大半ならびに約３ｋｂの下流側のＤＮＡを含
む、ｐＢＩＯ２０１から得た１０ｋｂのＢａｍＨＩ−Ｅ
ｃｏＲＩ断片を、ＢａｍＨＩならびにＥｃｏＲＩで開裂
させておいたｐＢＩＯ３５０に連結した。得られた、正
しい予測通りの構造を有していた２種のプラスミドを、
ｐＢＩＯ４００ならびにｐＢＩＯ４０１と称した。ｐＢ
ＩＯ４０１は、ΔｂｉｏＡ−Ｄ変異株をはじめとするす
べての公知の大腸菌のｂｉｏ変異株に対して相補性を示
す。ｐＢＩＯ４０１をΔｂｉｏＡ−Ｄ株での相補性によ
って選択し、富栄養培地で生育させたところ、このプラ
スミドは十分に安定で、使用可能量のプラスミドＤＮＡ
を得ることができた。ｐＢＩＯ４０１が有しているスペ
クチノマイシン耐性遺伝子が枯草菌では発現されないの
で、ｐＢＩＯ４０１のＥｃｏＲＩ部位にｃａｔカセット
を加えて、当業者に公知の方法で枯草菌の野生型あるい
は調節解除型の菌株での選択、組込み、増幅を行うこと
ができるようにし、プラスミドｐＢＩＯ４０１ｃａｔs
を得た。
【００８２】ｂｉｏコピー数の増大がビオチンの生産に
及ぼす影響を調べるために、単一コピーのｃａｔカセッ
ト（５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールに対して耐
性）と全ｂｉｏオペロンとを含むｐＢＩＯ４０１ｃａｔ
s を、枯草菌の野生型株ならびにビオチン調節解除型株
の染色体に組込んだ。プラスミドのコピー数は、６０μ
ｇ／ｍｌのクロラムフェニコール上で選択を行うことに
よって増幅させ、それによってビオチンの生産量を増大
させた。
及ぼす影響を調べるために、単一コピーのｃａｔカセッ
ト（５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールに対して耐
性）と全ｂｉｏオペロンとを含むｐＢＩＯ４０１ｃａｔ
s を、枯草菌の野生型株ならびにビオチン調節解除型株
の染色体に組込んだ。プラスミドのコピー数は、６０μ
ｇ／ｍｌのクロラムフェニコール上で選択を行うことに
よって増幅させ、それによってビオチンの生産量を増大
させた。
【００８３】ＶＩＩＢ： 遺伝子操作型ｂｉｏオペロンの構築 枯草菌の染色体に組込むための遺伝子操作型の調節解除
ビオチンオペロンを構築するにあたっては、唯一の制限
部位を、転写シグナル、調節部位、ならびにコード領域
の間に挿入して、種々の要素や対立遺伝子を交互にたや
すく導入できるようにしておくのが有利であった。ま
た、唯一の制限部位は、こうした構築物内で遺伝子操作
したビオチンオペロンを挟むためにも使用され、これに
より染色体への組込みに先立って、大腸菌由来のベクタ
ー配列を取り除くことができる。
ビオチンオペロンを構築するにあたっては、唯一の制限
部位を、転写シグナル、調節部位、ならびにコード領域
の間に挿入して、種々の要素や対立遺伝子を交互にたや
すく導入できるようにしておくのが有利であった。ま
た、唯一の制限部位は、こうした構築物内で遺伝子操作
したビオチンオペロンを挟むためにも使用され、これに
より染色体への組込みに先立って、大腸菌由来のベクタ
ー配列を取り除くことができる。
【００８４】本発明者らは、強力で構成的なプロモータ
ーを有する遺伝子操作による枯草菌のｂｉｏオペロンを
構築する作業が容易ならざる作業であることを見いだし
た。オペロンを強力で構成的なプロモーター、たとえば
ＳＰ０１−１５あるいはＳＰ０１−２６プロモーターに
よって転写する場合、枯草菌のビオチンオペロンの全体
を大腸菌の単一のプラスミド上に維持しておくことは、
たとえ低コピー数のプラスミドの場合であっても不可能
であった。もっと別の新規な戦略を開発して、遺伝子操
作によるｂｉｏオペロンの全体を含む増幅可能なＤＮＡ
断片を枯草菌の染色体に導入する必要があった。そこで
まず、クローニングと遺伝子操作の目的で、オペロンを
２つの別々の断片である５’カセットならびに３’カセ
ットとして操作した。次に、ＤＮＡの操作が終了した時
点で、適当な５’カセットならびに３’カセット由来の
関連ＤＮＡ断片を連結し、この連結したカセットで枯草
菌を直接形質転換した。連結は、得られた環状あるいは
コンカテマー状の分子が染色体中の相同な配列と組換わ
って、ベクター配列を伴う場合でも伴わない場合でも、
操作したＤＮＡが増幅可能なかたちで挿入されるように
行った。
ーを有する遺伝子操作による枯草菌のｂｉｏオペロンを
構築する作業が容易ならざる作業であることを見いだし
た。オペロンを強力で構成的なプロモーター、たとえば
ＳＰ０１−１５あるいはＳＰ０１−２６プロモーターに
よって転写する場合、枯草菌のビオチンオペロンの全体
を大腸菌の単一のプラスミド上に維持しておくことは、
たとえ低コピー数のプラスミドの場合であっても不可能
であった。もっと別の新規な戦略を開発して、遺伝子操
作によるｂｉｏオペロンの全体を含む増幅可能なＤＮＡ
断片を枯草菌の染色体に導入する必要があった。そこで
まず、クローニングと遺伝子操作の目的で、オペロンを
２つの別々の断片である５’カセットならびに３’カセ
ットとして操作した。次に、ＤＮＡの操作が終了した時
点で、適当な５’カセットならびに３’カセット由来の
関連ＤＮＡ断片を連結し、この連結したカセットで枯草
菌を直接形質転換した。連結は、得られた環状あるいは
コンカテマー状の分子が染色体中の相同な配列と組換わ
って、ベクター配列を伴う場合でも伴わない場合でも、
操作したＤＮＡが増幅可能なかたちで挿入されるように
行った。
【００８５】プラスミドは、遺伝子操作型のｂｉｏオペ
ロンを含む構築物を開発する際の骨格ベクターとして使
用するべく構築した。これらのプラスミドは、低コピー
数のプラスミドであるｐＣＬ１９２０（Lerner and Ino
uye, 1990, 前掲) に基づくものであった。ｐＣＬ１９
２０中のポリリンカーを、ＮｏｔＩ部位で挟んだポリリ
ンカーで置き換えた。ｐＣＬ１９２０中に存在するｌａ
ｃプロモーターも、単純化の目的で除去した。ｌａｃプ
ロモーターとポリリンカーを含む断片は、ＥｃｏＲＩを
用いて取り除いた。ｐＳＣ１０１の複製起点と、スペク
チノマイシンに対する耐性をコードしているオメガ断片
を含む骨格を、ＮｏｔＩリンカーの存在下で再度環状と
して、ｐＢＩＯ１２１を得た。プラスミドｐＪＧＰ４０
は、ＮｏｔＩ部位によって挟まれたポリリンカーにクロ
ーニングされたカナマイシン耐性遺伝子を含むｐＢＲ３
２２の誘導体である。このｐＪＧＰ４０から得たカナマ
イシン耐性をコードするＮｏｔＩ断片を、ｐＢＩＯ１２
１のＮｏｔＩ部位にクローニングして、ｐＢＩＯ１２４
を得た。２つの向きを「ａ」および「ｂ」で示す（図１
３）。双方のｐＢＩＯ１２４誘導体をＡｓｐ７１８Ｉで
消化し、再度連結したところ、カナマイシン耐性要素が
取り除かれて完全なポリリンカーが残り、プラスミドｐ
ＢＩＯ１２６ａならびにｐＢＩＯ１２６ｂが得られた。
ロンを含む構築物を開発する際の骨格ベクターとして使
用するべく構築した。これらのプラスミドは、低コピー
数のプラスミドであるｐＣＬ１９２０（Lerner and Ino
uye, 1990, 前掲) に基づくものであった。ｐＣＬ１９
２０中のポリリンカーを、ＮｏｔＩ部位で挟んだポリリ
ンカーで置き換えた。ｐＣＬ１９２０中に存在するｌａ
ｃプロモーターも、単純化の目的で除去した。ｌａｃプ
ロモーターとポリリンカーを含む断片は、ＥｃｏＲＩを
用いて取り除いた。ｐＳＣ１０１の複製起点と、スペク
チノマイシンに対する耐性をコードしているオメガ断片
を含む骨格を、ＮｏｔＩリンカーの存在下で再度環状と
して、ｐＢＩＯ１２１を得た。プラスミドｐＪＧＰ４０
は、ＮｏｔＩ部位によって挟まれたポリリンカーにクロ
ーニングされたカナマイシン耐性遺伝子を含むｐＢＲ３
２２の誘導体である。このｐＪＧＰ４０から得たカナマ
イシン耐性をコードするＮｏｔＩ断片を、ｐＢＩＯ１２
１のＮｏｔＩ部位にクローニングして、ｐＢＩＯ１２４
を得た。２つの向きを「ａ」および「ｂ」で示す（図１
３）。双方のｐＢＩＯ１２４誘導体をＡｓｐ７１８Ｉで
消化し、再度連結したところ、カナマイシン耐性要素が
取り除かれて完全なポリリンカーが残り、プラスミドｐ
ＢＩＯ１２６ａならびにｐＢＩＯ１２６ｂが得られた。
【００８６】ＶＩＩＢｉ： ５’カセットの遺伝子操作 ｂｉｏオペロンの５’末端のどの機能的要素を唯一の制
限部位によって分離するべきであるのかを考慮するにあ
たって、最も重要な要素は、１）推定上のビオチンプロ
モーターの上流に位置する推定上のステム−ループ終結
部位、２）推定上のプロモーター−オペレーター−リー
ダー領域、ならびに３）ｂｉｏＷのリボソーム結合部
位、開始コドン、および５’コード領域であった。図１
３に示すように、我々の戦略では、ＰＣＲによってビオ
チンプロモーターの上流のターミネーターから７０ｂｐ
上流に、ＨｉｎｄＩＩＩ部位とＳａｌＩ部位を導入し
た。ターミネーターをプロモーター−オペレーター領域
から分離するために、この領域のＣｌａＩ部位をＸｈｏ
Ｉ部位にかえた。ｂｉｏＷのリボソーム結合部位の上流
に位置するＥｃｏ４７ＩＩＩ部位をＸｂａＩ部位にかえ
て、プロモーター−オペレーター−リーダー領域が、リ
ボソーム結合部位−開始コドン断片から分離するように
した。図１４に、使用したすべてのＰＣＲプライマーと
その向きが記載してある。表６には、ＰＣＲによって作
製した断片が列挙してある。１）５’のＨｉｎｄＩＩＩ
−ＳａｌＩ部位を導入し、Ｅｃｏ４７ＩＩＩ部位をＸｂ
ａＩ部位にかえるＰＣＲ断片Ｅ、２）Ｅｃｏ４７ＩＩＩ
部位をＸｂａＩ部位にかえ、ｂｉｏＷのＢａｍＨＩ部位
まで伸長するＰＣＲ断片Ｂ、および３）ｐＢＩＯ１２６
ＡベクターのＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ消化物、との
３つの連結反応を行ったところ、プラスミドｐＢＩＯ１
３９が得られた。ＰＣＲ断片Ｃ、ＰＣＲ断片Ｄ、ならび
にＳａｌＩとＸｂａＩで消化したｐＢＩＯ１３９、との
第二の３つの連結反応によって、ＣｌａＩ部位がＸｈｏ
Ｉ部位となり、初期構築を完了し、プラスミドｐＢＩＯ
１４４を得た。ｐＢＩＯ１４４は、ｂｉｏオペロンの修
飾した野生型５’末端を含んでおり、プロモーター／オ
ペレーター領域の上流のＣｌａＩ部位が唯一のＸｈｏＩ
部位に、そしてこの領域のすぐ下流のＥｃｏ４７ＩＩＩ
部位が唯一のＸｂａＩ部位に置換されている（図１
４）。ＳａｌＩ部位からＢａｍＨＩ部位までのｐＢＩＯ
１４４の予測されるＤＮＡ配列を確認した。
限部位によって分離するべきであるのかを考慮するにあ
たって、最も重要な要素は、１）推定上のビオチンプロ
モーターの上流に位置する推定上のステム−ループ終結
部位、２）推定上のプロモーター−オペレーター−リー
ダー領域、ならびに３）ｂｉｏＷのリボソーム結合部
位、開始コドン、および５’コード領域であった。図１
３に示すように、我々の戦略では、ＰＣＲによってビオ
チンプロモーターの上流のターミネーターから７０ｂｐ
上流に、ＨｉｎｄＩＩＩ部位とＳａｌＩ部位を導入し
た。ターミネーターをプロモーター−オペレーター領域
から分離するために、この領域のＣｌａＩ部位をＸｈｏ
Ｉ部位にかえた。ｂｉｏＷのリボソーム結合部位の上流
に位置するＥｃｏ４７ＩＩＩ部位をＸｂａＩ部位にかえ
て、プロモーター−オペレーター−リーダー領域が、リ
ボソーム結合部位−開始コドン断片から分離するように
した。図１４に、使用したすべてのＰＣＲプライマーと
その向きが記載してある。表６には、ＰＣＲによって作
製した断片が列挙してある。１）５’のＨｉｎｄＩＩＩ
−ＳａｌＩ部位を導入し、Ｅｃｏ４７ＩＩＩ部位をＸｂ
ａＩ部位にかえるＰＣＲ断片Ｅ、２）Ｅｃｏ４７ＩＩＩ
部位をＸｂａＩ部位にかえ、ｂｉｏＷのＢａｍＨＩ部位
まで伸長するＰＣＲ断片Ｂ、および３）ｐＢＩＯ１２６
ＡベクターのＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ消化物、との
３つの連結反応を行ったところ、プラスミドｐＢＩＯ１
３９が得られた。ＰＣＲ断片Ｃ、ＰＣＲ断片Ｄ、ならび
にＳａｌＩとＸｂａＩで消化したｐＢＩＯ１３９、との
第二の３つの連結反応によって、ＣｌａＩ部位がＸｈｏ
Ｉ部位となり、初期構築を完了し、プラスミドｐＢＩＯ
１４４を得た。ｐＢＩＯ１４４は、ｂｉｏオペロンの修
飾した野生型５’末端を含んでおり、プロモーター／オ
ペレーター領域の上流のＣｌａＩ部位が唯一のＸｈｏＩ
部位に、そしてこの領域のすぐ下流のＥｃｏ４７ＩＩＩ
部位が唯一のＸｂａＩ部位に置換されている（図１
４）。ＳａｌＩ部位からＢａｍＨＩ部位までのｐＢＩＯ
１４４の予測されるＤＮＡ配列を確認した。
【００８７】ＶＩＩＢｉｉ： 遺伝子操作型３’ｂｉｏカセット ＮｏｔＩで挟まれたポリリンカーを有する低コピー数プ
ラスミドであるｐＢＩＯ１２６Ａで、３’カセットを構
築した。ｐＢＩＯ１２６Ａを、組込みならびに増幅用の
ベクターとして使用可能とするために、ｐＨＷ９［Hori
nouchi and Weisblum, J. Bacteriol. 150, 815-825
(1982) ］から得たｃａｔ遺伝子のＰＣＲ断片をＢｓｔ
ＢＩ部位に導入して、プラスミドｐＢＩＯ１４６Ａを得
た。このｐＢＩＯ１４６Ａのポリリンカーに、ｐＢＩＯ
２０１（実施例ＩＣ）およびｐＢＩＯ２８９（実施例Ｖ
Ｉ）から得たＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片をクローニン
グして、プラスミドｐＢＩＯ１５１およびｐＢＩＯ１５
２をそれぞれ得た。この２種のプラスミドは、ｂｉｏオ
ペロンに付随する３’フランキング配列の量が異なって
いる。
ラスミドであるｐＢＩＯ１２６Ａで、３’カセットを構
築した。ｐＢＩＯ１２６Ａを、組込みならびに増幅用の
ベクターとして使用可能とするために、ｐＨＷ９［Hori
nouchi and Weisblum, J. Bacteriol. 150, 815-825
(1982) ］から得たｃａｔ遺伝子のＰＣＲ断片をＢｓｔ
ＢＩ部位に導入して、プラスミドｐＢＩＯ１４６Ａを得
た。このｐＢＩＯ１４６Ａのポリリンカーに、ｐＢＩＯ
２０１（実施例ＩＣ）およびｐＢＩＯ２８９（実施例Ｖ
Ｉ）から得たＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片をクローニン
グして、プラスミドｐＢＩＯ１５１およびｐＢＩＯ１５
２をそれぞれ得た。この２種のプラスミドは、ｂｉｏオ
ペロンに付随する３’フランキング配列の量が異なって
いる。
【００８８】ＶＩＩＣ： 構成的なプロモーターによる
遺伝子操作型ｂｉｏオペロンの調節 各種の構成的なプロモーター、たとえばＳＰ０１バクテ
リオファージから得たプロモーター、具体的にはＳＰ０
１−２６あるいはＳＰ０１−１５［Lee and Pero, J. M
ol. Biol. 152, 247-265 (1981) ］を、ＸｈｏＩ部位と
ＸｂａＩ部位の間のｂｉｏプロモーター／オペレーター
領域のかわりに加えることができる。この場合、枯草菌
の染色体への組込みおよび増幅が行われると、ビオチン
オペロン全体の発現を構成的プロモーターから誘導しう
るベクターが得られることとなる。その結果、ビオチン
の生産が実質的に向上する。
遺伝子操作型ｂｉｏオペロンの調節 各種の構成的なプロモーター、たとえばＳＰ０１バクテ
リオファージから得たプロモーター、具体的にはＳＰ０
１−２６あるいはＳＰ０１−１５［Lee and Pero, J. M
ol. Biol. 152, 247-265 (1981) ］を、ＸｈｏＩ部位と
ＸｂａＩ部位の間のｂｉｏプロモーター／オペレーター
領域のかわりに加えることができる。この場合、枯草菌
の染色体への組込みおよび増幅が行われると、ビオチン
オペロン全体の発現を構成的プロモーターから誘導しう
るベクターが得られることとなる。その結果、ビオチン
の生産が実質的に向上する。
【００８９】
【表６】
【００９０】ＶＩＩＣｉ： ＳＰ０１−２６プロモータ
ーを有する５’カセットの構築 遺伝子操作による「野生型」プロモーターから得たＸｈ
ｏＩ−ＸｂａＩ断片を、ＳＰ０１−２６プロモーターを
含むＰＣＲ断片で置換することによって、ＳＰ０１−２
６プロモーターがビオチンオペロンに読み取られる５’
カセットを構築した。このＳＰ０１−２６プロモーター
を含むＰＣＲ断片は、クローニングしたＳＰ０１−２６
プロモーターのｐＵＣ８サブクローンであるｐＮＨ２０
１［Lee,G., Talkington, C., and Pero, J. Mol. Gen.
Genet. 180, 57-65 (1980)］から作製したものであ
る。使用したプライマー（ＸＨＯ２６ＡおよびＸＢＡ２
６Ｂ、表６Ａ）によって、プロモーターの上流側にＸｈ
ｏＩ部位が導入され、プロモーターの下流側にＸｂａＩ
部位が導入された。ＸｈｏＩ−ＸｂａＩで消化したＰＣ
Ｒ断片を、ＸｈｏＩ−ＸｂａＩで消化したｐＢＩＯ１４
４と連結し、この連結したＤＮＡで、大腸菌ＹＭＣ９を
形質転換した。Ｓｐｅｃr 形質転換体から得たプラスミ
ドのミニプレップを、ＳＰ０１−２６プロモーター領域
内に位置するＥｃｏＲＶ部位が獲得されているか否かに
ついてスクリーニングした。次に、予測されるＥｃｏＲ
Ｖ部位を示すプラスミドを、プライマーＸＨＯ２６Ａお
よびＢＩＯＷ１を使用してＰＣＲによってスクリーニン
グして、ＳＰ０１−２６プロモーターと５’ｂｉｏＷ断
片が並んでいることを確認した。正しい構造を有してい
た２つのプラスミドｐＢＩＯ１５８およびｐＢＩＯ１５
９は、いずれも予測される配列を有していた。
ーを有する５’カセットの構築 遺伝子操作による「野生型」プロモーターから得たＸｈ
ｏＩ−ＸｂａＩ断片を、ＳＰ０１−２６プロモーターを
含むＰＣＲ断片で置換することによって、ＳＰ０１−２
６プロモーターがビオチンオペロンに読み取られる５’
カセットを構築した。このＳＰ０１−２６プロモーター
を含むＰＣＲ断片は、クローニングしたＳＰ０１−２６
プロモーターのｐＵＣ８サブクローンであるｐＮＨ２０
１［Lee,G., Talkington, C., and Pero, J. Mol. Gen.
Genet. 180, 57-65 (1980)］から作製したものであ
る。使用したプライマー（ＸＨＯ２６ＡおよびＸＢＡ２
６Ｂ、表６Ａ）によって、プロモーターの上流側にＸｈ
ｏＩ部位が導入され、プロモーターの下流側にＸｂａＩ
部位が導入された。ＸｈｏＩ−ＸｂａＩで消化したＰＣ
Ｒ断片を、ＸｈｏＩ−ＸｂａＩで消化したｐＢＩＯ１４
４と連結し、この連結したＤＮＡで、大腸菌ＹＭＣ９を
形質転換した。Ｓｐｅｃr 形質転換体から得たプラスミ
ドのミニプレップを、ＳＰ０１−２６プロモーター領域
内に位置するＥｃｏＲＶ部位が獲得されているか否かに
ついてスクリーニングした。次に、予測されるＥｃｏＲ
Ｖ部位を示すプラスミドを、プライマーＸＨＯ２６Ａお
よびＢＩＯＷ１を使用してＰＣＲによってスクリーニン
グして、ＳＰ０１−２６プロモーターと５’ｂｉｏＷ断
片が並んでいることを確認した。正しい構造を有してい
た２つのプラスミドｐＢＩＯ１５８およびｐＢＩＯ１５
９は、いずれも予測される配列を有していた。
【００９１】ＶＩＩＣｉｉ： ＳＰ０１−１５プロモー
ターを有する５’カセットの構築 ｐＢＩＯ１４４にクローニングするのに適した末端を有
する、ＳＰ０１−１５プロモーター（Lee et al.、前
掲）を含むＤＮＡ断片も、ＰＣＲによって作製した。プ
ライマー（ＸＨＯ１５ＢおよびＸＢＡ１５Ｃ、表６Ａ）
を選択して、ＳＰ０１−１５プロモーターがＸｈｏＩ
（上流）とＸｂａＩ（下流）で挟まれた断片を作製し
た。ＳＰ０１−１５からの転写物のはじめの方にも、潜
在的なステム−ループ構造が存在している。下流のプラ
イマーも、ｂｉｏｍＲＮＡの新たな５’末端に位置する
潜在的なステム−ループ構造が伸長して、ＳＰ０１−１
５プロモーターによって開始される転写物の＋１塩基を
包含するよう設計した。ＳＰ０１−１５を含むＸｈｏＩ
−ＸｂａＩ断片を、ＸｈｏＩ−ＸｂａＩで消化したｐＢ
ＩＯ１４４に連結した。この連結ＤＮＡで大腸菌を形質
転換して、ｐＢＩＯ１６８およびｐＢＩＯ１６９を作製
した。ｐＢＩＯ１６８とｐＢＩＯ１６９は同一の単離物
で、ともにＳＰ０１−１５プロモーターを有する５’ｂ
ｉｏカセットを含んでいる。
ターを有する５’カセットの構築 ｐＢＩＯ１４４にクローニングするのに適した末端を有
する、ＳＰ０１−１５プロモーター（Lee et al.、前
掲）を含むＤＮＡ断片も、ＰＣＲによって作製した。プ
ライマー（ＸＨＯ１５ＢおよびＸＢＡ１５Ｃ、表６Ａ）
を選択して、ＳＰ０１−１５プロモーターがＸｈｏＩ
（上流）とＸｂａＩ（下流）で挟まれた断片を作製し
た。ＳＰ０１−１５からの転写物のはじめの方にも、潜
在的なステム−ループ構造が存在している。下流のプラ
イマーも、ｂｉｏｍＲＮＡの新たな５’末端に位置する
潜在的なステム−ループ構造が伸長して、ＳＰ０１−１
５プロモーターによって開始される転写物の＋１塩基を
包含するよう設計した。ＳＰ０１−１５を含むＸｈｏＩ
−ＸｂａＩ断片を、ＸｈｏＩ−ＸｂａＩで消化したｐＢ
ＩＯ１４４に連結した。この連結ＤＮＡで大腸菌を形質
転換して、ｐＢＩＯ１６８およびｐＢＩＯ１６９を作製
した。ｐＢＩＯ１６８とｐＢＩＯ１６９は同一の単離物
で、ともにＳＰ０１−１５プロモーターを有する５’ｂ
ｉｏカセットを含んでいる。
【００９２】
【００９３】ＶＩＩＣｉｉｉ： 全長遺伝子操作型「野
生型」ｂｉｏオペロンの構築と組込み 上述の各種の遺伝子操作型５’ｂｉｏカセットから得た
ＳａｌＩ−ＢａｍＨＩ断片を、ｂｉｏオペロンの３’末
端と選択可能なｃａｔ遺伝子とを含むｐＢＩＯ１５１お
よびｐＢＩＯ１５２（実施例ＶＩＩＩ（ｂ）（ｉｉ
ｉ）、上述）のＳａｌＩ部位とＢａｍＨＩ部位の間に導
入することによって、全長遺伝子操作型ビオチンオペロ
ンを構築した。大腸菌株ＲＹ６０７（Δｂｉｏ）をＢｉ
ｏ+ とする相補性によって、適当な形質転換体を選択し
た。たとえば、ｐＢＩＯ１４４の「野生型」の遺伝子操
作型５’ビオチンオペロンから得たＳａｌＩ−ＢａｍＨ
Ｉ断片をｐＢＩＯ１５１に導入すると、全長野生型ｂｉ
ｏオペロンを３’フランキング領域とともに含み、ビオ
チンオペロンと同一方向を向いたｃａｔ遺伝子を含むｐ
ＢＩＯ１５５が得られた。ｐＢＩＯ１４４から得た同じ
５’断片をｐＢＩＯ１５２に連結したところ、ｐＢＩＯ
１５５と同じ特徴を有するものの、ｂｉｏオペロンの下
流の３’フランキング領域を欠くｐＢＩＯ１５６が得ら
れた。
生型」ｂｉｏオペロンの構築と組込み 上述の各種の遺伝子操作型５’ｂｉｏカセットから得た
ＳａｌＩ−ＢａｍＨＩ断片を、ｂｉｏオペロンの３’末
端と選択可能なｃａｔ遺伝子とを含むｐＢＩＯ１５１お
よびｐＢＩＯ１５２（実施例ＶＩＩＩ（ｂ）（ｉｉ
ｉ）、上述）のＳａｌＩ部位とＢａｍＨＩ部位の間に導
入することによって、全長遺伝子操作型ビオチンオペロ
ンを構築した。大腸菌株ＲＹ６０７（Δｂｉｏ）をＢｉ
ｏ+ とする相補性によって、適当な形質転換体を選択し
た。たとえば、ｐＢＩＯ１４４の「野生型」の遺伝子操
作型５’ビオチンオペロンから得たＳａｌＩ−ＢａｍＨ
Ｉ断片をｐＢＩＯ１５１に導入すると、全長野生型ｂｉ
ｏオペロンを３’フランキング領域とともに含み、ビオ
チンオペロンと同一方向を向いたｃａｔ遺伝子を含むｐ
ＢＩＯ１５５が得られた。ｐＢＩＯ１４４から得た同じ
５’断片をｐＢＩＯ１５２に連結したところ、ｐＢＩＯ
１５５と同じ特徴を有するものの、ｂｉｏオペロンの下
流の３’フランキング領域を欠くｐＢＩＯ１５６が得ら
れた。
【００９４】プラスミドｐＢＩＯ１５５およびｐＢＩＯ
１５６を、プラスミド全体のまま、あるいは大腸菌のベ
クター配列を欠失させて、枯草菌に組込んだ（表７）。
枯草菌ＰＹ７９、ＢＩ４２１、およびＨＢ３株（ＢＩ４
２１とＨＢ３はｂｉｒＡ突然変異体、実施例Ｘ参照）
を、プラスミドｐＢＩＯ１５５およびｐＢＩＯ１５６で
形質転換し、クロラムフェニコール耐性のコロニーを選
択した。組込んたプラスミドの増幅は、クロラムフェニ
コールのレベルを段階的に上昇させた複数の平板上に各
菌株を線状に接種していくことによって行った（表７、
菌株ＢＩ２２８、２３０、２３５、２３７、２４３、お
よび２４５）。
１５６を、プラスミド全体のまま、あるいは大腸菌のベ
クター配列を欠失させて、枯草菌に組込んだ（表７）。
枯草菌ＰＹ７９、ＢＩ４２１、およびＨＢ３株（ＢＩ４
２１とＨＢ３はｂｉｒＡ突然変異体、実施例Ｘ参照）
を、プラスミドｐＢＩＯ１５５およびｐＢＩＯ１５６で
形質転換し、クロラムフェニコール耐性のコロニーを選
択した。組込んたプラスミドの増幅は、クロラムフェニ
コールのレベルを段階的に上昇させた複数の平板上に各
菌株を線状に接種していくことによって行った（表７、
菌株ＢＩ２２８、２３０、２３５、２３７、２４３、お
よび２４５）。
【００９５】野生型ビオチンオペロンの増幅されたコピ
ーを含むものの、大腸菌の配列は含まない菌株を構築す
るべく、プラスミドｐＢＩＯ１５５およびｐＢＩＯ１５
６をＮｏｔＩで消化した。それぞれの消化物の大きいほ
うの断片を環状として、枯草菌ＰＹ７９、ＢＩ４２１、
およびＨＢ３株の形質転換に使用した。カセットの増幅
は、クロラムフェニコールのレベルを段階的に上昇させ
た複数の平板上に線状に接種していくことによって行っ
た（表７、菌株ＢＩ２３２、２３４、２３９、２４１、
２４７、および２４９）。
ーを含むものの、大腸菌の配列は含まない菌株を構築す
るべく、プラスミドｐＢＩＯ１５５およびｐＢＩＯ１５
６をＮｏｔＩで消化した。それぞれの消化物の大きいほ
うの断片を環状として、枯草菌ＰＹ７９、ＢＩ４２１、
およびＨＢ３株の形質転換に使用した。カセットの増幅
は、クロラムフェニコールのレベルを段階的に上昇させ
た複数の平板上に線状に接種していくことによって行っ
た（表７、菌株ＢＩ２３２、２３４、２３９、２４１、
２４７、および２４９）。
【００９６】ＳＰ０１プロモーターによって誘導される
ｂｉｏオペロンの連結反応生成物で、枯草菌を直接形質
転換した。５’カセットから単離されたＮｏｔＩ−Ｂａ
ｍＨＩ断片（５’フランキング配列、プロモーター領
域、および５’ｂｉｏＷ）、ならびに３’カセットから
単離されたＢａｍＨＩ−ＮｏｔＩ断片（３’ｂｉｏＷ、
ｂｉｏＡ、ｂｉｏＦ、ｂｉｏＤ、ｂｉｏＢ、ｂｉｏＩ、
ＯＲＦ２、ターミネーター、３’フランキング配列、お
よびｃａｔ）を標準的な条件で連結して、各種の枯草菌
株を形質転換するのに使用した。５’のＮｏｔＩからＢ
ａｍＨＩまでのカセットは、ＳＰ０１−２６プロモータ
ーを含むｐＢＩＯ１５８、あるいはＳＰ０１−１５プロ
モーターを含むｐＢＩＯ１６８から得たものである。
３’カセットは、伸長した３’フランキング配列を含む
ｐＢＩＯ１５１、あるいは端が切り取られた３’フラン
キング配列を含むｐＢＩＯ１５２から得たものである
（表７、菌株ＢＩ２６７、２６８、２７４、２７６、２
７８、および２８２）。
ｂｉｏオペロンの連結反応生成物で、枯草菌を直接形質
転換した。５’カセットから単離されたＮｏｔＩ−Ｂａ
ｍＨＩ断片（５’フランキング配列、プロモーター領
域、および５’ｂｉｏＷ）、ならびに３’カセットから
単離されたＢａｍＨＩ−ＮｏｔＩ断片（３’ｂｉｏＷ、
ｂｉｏＡ、ｂｉｏＦ、ｂｉｏＤ、ｂｉｏＢ、ｂｉｏＩ、
ＯＲＦ２、ターミネーター、３’フランキング配列、お
よびｃａｔ）を標準的な条件で連結して、各種の枯草菌
株を形質転換するのに使用した。５’のＮｏｔＩからＢ
ａｍＨＩまでのカセットは、ＳＰ０１−２６プロモータ
ーを含むｐＢＩＯ１５８、あるいはＳＰ０１−１５プロ
モーターを含むｐＢＩＯ１６８から得たものである。
３’カセットは、伸長した３’フランキング配列を含む
ｐＢＩＯ１５１、あるいは端が切り取られた３’フラン
キング配列を含むｐＢＩＯ１５２から得たものである
（表７、菌株ＢＩ２６７、２６８、２７４、２７６、２
７８、および２８２）。
【００９７】これらの各ＤＮＡ連結反応生成物で、野生
型のＰＹ７９株を形質転換し、また場合によっては、ビ
オチン調節解除型のＢＩ４２１株（ｂｉｒＡ変異株、後
述の実施例ＸＢ参照）を形質転換した。各菌株のコンピ
テントな細胞は標準的な方法によって調製し、上述の各
種のｂｉｏ含有ＤＮＡ連結反応混合物で形質転換し、Ｃ
ｍr について選択した。これらのＤＮＡは枯草菌中では
複製できないので、Ｃｍr 形質転換体が生じるのは、染
色体ならびに形質転換用ＤＮＡ上に存在する互いに相同
な配列の間での組換えを介して、染色体のｂｉｏ遺伝子
座に連結ＤＮＡが組込まれることによるものである。各
実験で、１０−５０のＣｍr 形質転換体を選択して、性
質を調べた。形質転換体は、ＰＣＲによるスクリーニン
グを行って、ＳＰ０１プロモーターがｂｉｏＷと並んで
いることを確認した。
型のＰＹ７９株を形質転換し、また場合によっては、ビ
オチン調節解除型のＢＩ４２１株（ｂｉｒＡ変異株、後
述の実施例ＸＢ参照）を形質転換した。各菌株のコンピ
テントな細胞は標準的な方法によって調製し、上述の各
種のｂｉｏ含有ＤＮＡ連結反応混合物で形質転換し、Ｃ
ｍr について選択した。これらのＤＮＡは枯草菌中では
複製できないので、Ｃｍr 形質転換体が生じるのは、染
色体ならびに形質転換用ＤＮＡ上に存在する互いに相同
な配列の間での組換えを介して、染色体のｂｉｏ遺伝子
座に連結ＤＮＡが組込まれることによるものである。各
実験で、１０−５０のＣｍr 形質転換体を選択して、性
質を調べた。形質転換体は、ＰＣＲによるスクリーニン
グを行って、ＳＰ０１プロモーターがｂｉｏＷと並んで
いることを確認した。
【００９８】
【表７】
【００９９】実施例ＶＩＩＩ： 第一世代の枯草菌ビオ
チン産生株の特性解析 サザンブロット実験を使用して、組込んだカセットの構
造を解析し、遺伝子操作型菌株の代表的なサブセットの
増幅の程度を調べた。これらの実験から、ＳＰ０１プロ
モーターの存在が増幅の程度に有意な影響を及ぼしてい
ることが明らかとなった。野生型のｂｉｏプロモーター
を含む遺伝子操作型の全長ｂｉｏオペロンは、６０μｇ
／ｍｌのクロラムフェニコール上で成育させた菌株で、
他のオペロンが類似条件で示すレベルと類似したレベル
にまで増幅された（概算値、１５コピー／細胞）。しか
し、ＳＰ０１−１５プロモーターにより駆動されたｂｉ
ｏオペロンの増幅は、２倍少なく、ＳＰ０１−２６プロ
モーターにより駆動されたｂｉｏオペロンの増幅は、約
４倍少なかった。このように、枯草菌の細胞は、ｂｉｏ
オペロンによってコードされた産物の少なくとも１種に
ついて、限定された耐性を有している。
チン産生株の特性解析 サザンブロット実験を使用して、組込んだカセットの構
造を解析し、遺伝子操作型菌株の代表的なサブセットの
増幅の程度を調べた。これらの実験から、ＳＰ０１プロ
モーターの存在が増幅の程度に有意な影響を及ぼしてい
ることが明らかとなった。野生型のｂｉｏプロモーター
を含む遺伝子操作型の全長ｂｉｏオペロンは、６０μｇ
／ｍｌのクロラムフェニコール上で成育させた菌株で、
他のオペロンが類似条件で示すレベルと類似したレベル
にまで増幅された（概算値、１５コピー／細胞）。しか
し、ＳＰ０１−１５プロモーターにより駆動されたｂｉ
ｏオペロンの増幅は、２倍少なく、ＳＰ０１−２６プロ
モーターにより駆動されたｂｉｏオペロンの増幅は、約
４倍少なかった。このように、枯草菌の細胞は、ｂｉｏ
オペロンによってコードされた産物の少なくとも１種に
ついて、限定された耐性を有している。
【０１００】ＶＩＩＩＡ． 試験管培養におけるビオチ
ンおよびビオチン前駆体の産生の検定 複数コピーの野生型ｂｉｏオペロンあるいはＳＰ０１修
飾ｂｉｏオペロンがビオチンの産生に及ぼす影響を調べ
るために、これらの遺伝子操作型ｂｉｏオペロンが染色
体に組込まれ、増幅された野生型ならびにビオチン調節
解除型の枯草菌株のビオチンの産生について調べた。結
果を表８に示す。
ンおよびビオチン前駆体の産生の検定 複数コピーの野生型ｂｉｏオペロンあるいはＳＰ０１修
飾ｂｉｏオペロンがビオチンの産生に及ぼす影響を調べ
るために、これらの遺伝子操作型ｂｉｏオペロンが染色
体に組込まれ、増幅された野生型ならびにビオチン調節
解除型の枯草菌株のビオチンの産生について調べた。結
果を表８に示す。
【０１０１】いずれの菌株も、５ｍｌのＶＹ培地で３７
°で一晩成育させ、遠心分離を行い、上清液を５分間オ
ートクレーブにかけて、残りの細胞をすべて死滅させ
た。（ビオチンとデスチオビオチンは、オートクレーブ
処理に対して安定性である。）この上清液をビオチンを
含まない培地に希釈し、そして大腸菌株ＲＹ６０４（Δ
ｂｉｏＨ）およびＲＹ６０７（ΔｂｉｏＡＢＦＣＤ）を
接種した。ＲＹ６０４およびＲＹ６０７は、菌株ＢＭ７
０８６およびΔ（ｇａｌ−ｕｖｒＢ２１９）（Cleary a
nd Campbell 、前掲、Hatfield et al. 、前掲）の関連
領域をそれぞれＭＭ２９４に形質導入することによって
構築したものである。前者がビオチン上ならびにビオチ
ンビタマー上で成育するのに対し、後者はビオチン上で
のみ成育する。各種の枯草菌変異株によって産生された
ビオチンとビオチンビタマーは、ＯＤ600 での標準曲線
から計算した。
°で一晩成育させ、遠心分離を行い、上清液を５分間オ
ートクレーブにかけて、残りの細胞をすべて死滅させ
た。（ビオチンとデスチオビオチンは、オートクレーブ
処理に対して安定性である。）この上清液をビオチンを
含まない培地に希釈し、そして大腸菌株ＲＹ６０４（Δ
ｂｉｏＨ）およびＲＹ６０７（ΔｂｉｏＡＢＦＣＤ）を
接種した。ＲＹ６０４およびＲＹ６０７は、菌株ＢＭ７
０８６およびΔ（ｇａｌ−ｕｖｒＢ２１９）（Cleary a
nd Campbell 、前掲、Hatfield et al. 、前掲）の関連
領域をそれぞれＭＭ２９４に形質導入することによって
構築したものである。前者がビオチン上ならびにビオチ
ンビタマー上で成育するのに対し、後者はビオチン上で
のみ成育する。各種の枯草菌変異株によって産生された
ビオチンとビオチンビタマーは、ＯＤ600 での標準曲線
から計算した。
【０１０２】この検定では、野生型の枯草菌株であるＰ
Ｙ７９から、代表的には約６−１０μｇ／ｌのビオチン
が得られた（表８）。これらの実験で使用したＶＹ培地
は、細胞の成育以前に２０−４５μｇ／ｌのビオチンを
有していた。したがって、培地から供給されたビオチン
の大半が、野生型の細菌によって成育中に消費されたこ
とになる。
Ｙ７９から、代表的には約６−１０μｇ／ｌのビオチン
が得られた（表８）。これらの実験で使用したＶＹ培地
は、細胞の成育以前に２０−４５μｇ／ｌのビオチンを
有していた。したがって、培地から供給されたビオチン
の大半が、野生型の細菌によって成育中に消費されたこ
とになる。
【０１０３】数種のビオチン類似物耐性の変異株が、５
０−１００μｇ／ｌという、野生型株で見られたビオチ
ンの５−１０倍のビオチンを産生した。ｂｉｒＡに似た
変異を有する２種のビオチン類似物耐性株を使用した。
一方の変異株であるＨＢ３は、自然発生的ホモビオチン
耐性変異を含んでいる。もう一方の菌株であるＢＩ４２
１は、突然変異誘発を行っていないバックグラウンドに
交差させた、エチルメチルスルフェートによって生成し
たα−デヒドロビオチン耐性変異を含んでいる（実施例
Ｘ参照）。双方の菌株とも、これらの実験で５０−１０
０μｇ／ｌのビオチンが得られた（表８および９）。
０−１００μｇ／ｌという、野生型株で見られたビオチ
ンの５−１０倍のビオチンを産生した。ｂｉｒＡに似た
変異を有する２種のビオチン類似物耐性株を使用した。
一方の変異株であるＨＢ３は、自然発生的ホモビオチン
耐性変異を含んでいる。もう一方の菌株であるＢＩ４２
１は、突然変異誘発を行っていないバックグラウンドに
交差させた、エチルメチルスルフェートによって生成し
たα−デヒドロビオチン耐性変異を含んでいる（実施例
Ｘ参照）。双方の菌株とも、これらの実験で５０−１０
０μｇ／ｌのビオチンが得られた（表８および９）。
【０１０４】ｂｉｏオペロンの「野生型」のコピーを野
生型株ＰＹ７９に組込んで増幅させると、ビオチンの産
生量が、ＰＹ７９単独の場合に見られる量の１０−５０
倍に向上した（表８）。かかる菌株（ＢＩ２３０および
ＢＩ２３４）は、ＰＹ７９単独の場合に産生されるのが
６−１０μｇ／ｌであるのに対し、１５０−６００μｇ
／ｌを産生した。しかし、野生型のｂｉｏオペロンを組
込んで増幅させたコピーを含むｂｉｒＡ変異株を検定し
たところ、さらに劇的な結果が見られた。こうした検定
では、ビオチンの産生量がさらに５−１０倍向上し、ビ
オチンの収量が最高２，０００μｇ／ｌとなるのが観察
された（ＢＩ２４１、ＢＩ２３７、ＢＩ２４９、表８参
照）。
生型株ＰＹ７９に組込んで増幅させると、ビオチンの産
生量が、ＰＹ７９単独の場合に見られる量の１０−５０
倍に向上した（表８）。かかる菌株（ＢＩ２３０および
ＢＩ２３４）は、ＰＹ７９単独の場合に産生されるのが
６−１０μｇ／ｌであるのに対し、１５０−６００μｇ
／ｌを産生した。しかし、野生型のｂｉｏオペロンを組
込んで増幅させたコピーを含むｂｉｒＡ変異株を検定し
たところ、さらに劇的な結果が見られた。こうした検定
では、ビオチンの産生量がさらに５−１０倍向上し、ビ
オチンの収量が最高２，０００μｇ／ｌとなるのが観察
された（ＢＩ２４１、ＢＩ２３７、ＢＩ２４９、表８参
照）。
【０１０５】ＳＰ０１プロモーターを有する遺伝子操作
型のｂｉｏオペロンを含む野生型の枯草菌株を分析した
ところ、ビオチンの産生量が向上しており、ビオチンの
力価は、野生型のｂｉｏプロモーターを含むものが１５
０−６００μｇ／ｌであるのに対し、通常１０００−２
０００μｇ／ｌとなっていた（ＢＩ２６７、およびＢＩ
２７４、表９参照）。構成的なプロモーターを含む野生
型株とｂｉｒＡ変異株とでは、ビオチン産生量の劇的な
差異は見られなかった（表９）。
型のｂｉｏオペロンを含む野生型の枯草菌株を分析した
ところ、ビオチンの産生量が向上しており、ビオチンの
力価は、野生型のｂｉｏプロモーターを含むものが１５
０−６００μｇ／ｌであるのに対し、通常１０００−２
０００μｇ／ｌとなっていた（ＢＩ２６７、およびＢＩ
２７４、表９参照）。構成的なプロモーターを含む野生
型株とｂｉｒＡ変異株とでは、ビオチン産生量の劇的な
差異は見られなかった（表９）。
【０１０６】２種目の検定では、ビオチンのインディケ
ータとしてラクトバシラス・プランタラム（Lactobacil
lus plantarum ）を用い（Wright et al., Proc. Soc.
Exp.Biol. Med. 56: 95-98, 1944 ）、サッカロミセス
・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）をビオチン
ビタマーのインディケータとして用いた（Baldet eta
l., Eur. J. Biochem. 217: 479-485, 1993）。検定
は、検定用の培養物に抗生物質を加えて混入による干渉
を減らした以外は、記載のとおりにして行った。L.plan
tarum は抗生物質の大半に対して感受性であるので、自
然発生のストレプトマイシン耐性変異株であるL.planta
rum str3を選択し、５０μｇ／ｍｌの硫酸ストレプトマ
イシンの存在下でビオチンの検定に使用した。S.cerevi
siaeはもともと大抵の抗菌性化合物に対して耐性であ
り、この場合も、５０μｇ ／ｍｌの硫酸ストレプトマ
イシンの存在下で使用した。ビオチンに対するL.planta
rumの成育応答は（約５０倍の希釈範囲については）、
大腸菌の成育応答より穏やかに減少する。S.cerevisiae
は、大腸菌よりＤＡＰＡおよびＫＡＰＡに対する応答性
が高い。
ータとしてラクトバシラス・プランタラム（Lactobacil
lus plantarum ）を用い（Wright et al., Proc. Soc.
Exp.Biol. Med. 56: 95-98, 1944 ）、サッカロミセス
・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）をビオチン
ビタマーのインディケータとして用いた（Baldet eta
l., Eur. J. Biochem. 217: 479-485, 1993）。検定
は、検定用の培養物に抗生物質を加えて混入による干渉
を減らした以外は、記載のとおりにして行った。L.plan
tarum は抗生物質の大半に対して感受性であるので、自
然発生のストレプトマイシン耐性変異株であるL.planta
rum str3を選択し、５０μｇ／ｍｌの硫酸ストレプトマ
イシンの存在下でビオチンの検定に使用した。S.cerevi
siaeはもともと大抵の抗菌性化合物に対して耐性であ
り、この場合も、５０μｇ ／ｍｌの硫酸ストレプトマ
イシンの存在下で使用した。ビオチンに対するL.planta
rumの成育応答は（約５０倍の希釈範囲については）、
大腸菌の成育応答より穏やかに減少する。S.cerevisiae
は、大腸菌よりＤＡＰＡおよびＫＡＰＡに対する応答性
が高い。
【０１０７】ラクトバシラスをインディケータとして培
養物のビオチン産生量を検定すると、より正確なレベル
を測定することができた。こうした条件を使用したとこ
ろ、遺伝子操作型のＳＰ０１−ｂｉｏオペロンを有する
枯草菌株は、野生型のｂｉｏオペロンの増幅コピーを有
する調節解除型の枯草菌株のほぼ２倍ものビオチンを産
生していた（表１０）。
養物のビオチン産生量を検定すると、より正確なレベル
を測定することができた。こうした条件を使用したとこ
ろ、遺伝子操作型のＳＰ０１−ｂｉｏオペロンを有する
枯草菌株は、野生型のｂｉｏオペロンの増幅コピーを有
する調節解除型の枯草菌株のほぼ２倍ものビオチンを産
生していた（表１０）。
【０１０８】
【表８】
【０１０９】
【表９】
【０１１０】
【表１０】
【０１１１】ＶＩＩＩＢ： ビオチンならびにビオチン
前駆体の大量生産についての各種菌株の評価 遺伝子操作型のビオチン産生株のビオチンならびにビオ
チン前駆体の大量生産については、発酵技術を使用する
ことによって評価を行うことができる。発酵槽ならびに
培地条件は、一連の各種のものを用いることが可能であ
る。一例をあげると、以下の発酵はいずれも、コンピュ
ータ制御の１４リットルのチェマップ（Ｃｈｅｍａｐ）
発酵槽で、ＤＯ（溶存酸素）制御、グルコース制限、流
加培養発酵戦略を使用することによって実施した。ビオ
チンならびにビオチン前駆体の産生量の測定は、オート
クレーブ処理した無細胞ブロスの逐次希釈液に、上述の
Lactobacillus plantarum あるいはSaccharomyces cere
visiaeの適当な菌株を接種することによって行った。培
地の組成ならびに他の発酵条件を表１１に示す。
前駆体の大量生産についての各種菌株の評価 遺伝子操作型のビオチン産生株のビオチンならびにビオ
チン前駆体の大量生産については、発酵技術を使用する
ことによって評価を行うことができる。発酵槽ならびに
培地条件は、一連の各種のものを用いることが可能であ
る。一例をあげると、以下の発酵はいずれも、コンピュ
ータ制御の１４リットルのチェマップ（Ｃｈｅｍａｐ）
発酵槽で、ＤＯ（溶存酸素）制御、グルコース制限、流
加培養発酵戦略を使用することによって実施した。ビオ
チンならびにビオチン前駆体の産生量の測定は、オート
クレーブ処理した無細胞ブロスの逐次希釈液に、上述の
Lactobacillus plantarum あるいはSaccharomyces cere
visiaeの適当な菌株を接種することによって行った。培
地の組成ならびに他の発酵条件を表１１に示す。
【０１１２】各種の菌株によって産生されたビオチンな
らびにビオチン前駆体を表１２に示す。いずれの発酵に
おいても、初期バッチと供給溶液の双方に１ｇ／ｌのピ
メリン酸を加えた。ＢＩ２８２、ＢＩ２７８、およびＢ
Ｉ２７６が、ビオチンならびにビオチン前駆体を産生す
るうえで最適であった。
らびにビオチン前駆体を表１２に示す。いずれの発酵に
おいても、初期バッチと供給溶液の双方に１ｇ／ｌのピ
メリン酸を加えた。ＢＩ２８２、ＢＩ２７８、およびＢ
Ｉ２７６が、ビオチンならびにビオチン前駆体を産生す
るうえで最適であった。
【０１１３】
【表１１】
【０１１４】
【表１２】
【０１１５】
【表１３】
【０１１６】ＶＩＩＩＣ： バイオオートグラフィーに
よる発酵ブロスの分析 ビオチン産生株によって分泌されたビタマーのスペクト
ルは、バイオオートグラフィーの技法によって検定する
ことができる。本件では、発酵ブロスを遠心分離によっ
て透明とし、オートクレーブ滅菌した。１μｌの上清培
養液をベーカー−フレックス微晶質セルロ−ス薄層クロ
マトグラフィー（ＴＬＣ）板上にスポットし、溶媒とし
てｎ−ブタノールと１Ｎ塩酸（６：１ ｖ／ｖ）を用い
て化合物の分離を行った。乾燥後、クロマトグラフを、
２，３，５−トリフェニルテトラゾリウムクロリドとカ
ナマイシンを含有し、大腸菌株ＲＹ６０４（Δｂｉｏ
Ｈ）／ｐＯＫ１２（ＫａｎR ）を含浸させたビオチン不
含の寒天平板上で、表面を下向きとして１時間インキュ
ベートした。ＫａｎR のプラスミドであるｐＯＫ１２
［Viera and Messing, Gene 100, 189-194 (1991) ］を
ＲＹ６０４に加えたのは、単に抗生物質耐性を付与して
検定の際の混入を減らすためである。次に、ＴＬＣ板を
取り除き、寒天平板を３７°Ｃでインキュベートした。
２０時間経過後に、ＴＬＣ板上のビオチンとビタマーの
位置に対応する成育スポットが現れた。図１７に、ビオ
チンとビタマーの標品を、代表的な発酵のサンプルとと
もに示す。このクロマトグラフィー系で観察されたＲf
値を表１４に示す。この技法は、セルロースＴＬＣのか
わりにペーパークロマトグラフィーを使用した場合にも
用いることができる（表１４）。ビオチンとビオチンス
ルホキシドのみが検出されるＲＹ６３４（ΔｂｉｏＡ−
Ｄ：：ＫａｎR ，Ｂｉｓ+ ）を使用したバイオオートグ
ラフィーと比較したところ、発酵ブロス中に実質的な量
のデスチオビオチンとビオチンの双方が存在しているこ
とが示された。
よる発酵ブロスの分析 ビオチン産生株によって分泌されたビタマーのスペクト
ルは、バイオオートグラフィーの技法によって検定する
ことができる。本件では、発酵ブロスを遠心分離によっ
て透明とし、オートクレーブ滅菌した。１μｌの上清培
養液をベーカー−フレックス微晶質セルロ−ス薄層クロ
マトグラフィー（ＴＬＣ）板上にスポットし、溶媒とし
てｎ−ブタノールと１Ｎ塩酸（６：１ ｖ／ｖ）を用い
て化合物の分離を行った。乾燥後、クロマトグラフを、
２，３，５−トリフェニルテトラゾリウムクロリドとカ
ナマイシンを含有し、大腸菌株ＲＹ６０４（Δｂｉｏ
Ｈ）／ｐＯＫ１２（ＫａｎR ）を含浸させたビオチン不
含の寒天平板上で、表面を下向きとして１時間インキュ
ベートした。ＫａｎR のプラスミドであるｐＯＫ１２
［Viera and Messing, Gene 100, 189-194 (1991) ］を
ＲＹ６０４に加えたのは、単に抗生物質耐性を付与して
検定の際の混入を減らすためである。次に、ＴＬＣ板を
取り除き、寒天平板を３７°Ｃでインキュベートした。
２０時間経過後に、ＴＬＣ板上のビオチンとビタマーの
位置に対応する成育スポットが現れた。図１７に、ビオ
チンとビタマーの標品を、代表的な発酵のサンプルとと
もに示す。このクロマトグラフィー系で観察されたＲf
値を表１４に示す。この技法は、セルロースＴＬＣのか
わりにペーパークロマトグラフィーを使用した場合にも
用いることができる（表１４）。ビオチンとビオチンス
ルホキシドのみが検出されるＲＹ６３４（ΔｂｉｏＡ−
Ｄ：：ＫａｎR ，Ｂｉｓ+ ）を使用したバイオオートグ
ラフィーと比較したところ、発酵ブロス中に実質的な量
のデスチオビオチンとビオチンの双方が存在しているこ
とが示された。
【０１１７】発酵培地にピメリン酸塩を加えると、おそ
らくはＫＡＰＡであるビオチンビタマーのレベルが増大
した（図１７、レーンＤ）。このことは、ピメリン酸塩
を加えていない同様の発酵（図１７、レーンＢ）と比べ
て、ＫＡＰＡ／ＢＳＯスポットが増大していることによ
って示された。ビオチンとビオチンスルホキシドのみを
検出するＲＹ６３４（ΔｂｉｏＡ−Ｄ：：ＫａｎR ，Ｂ
ｉｓ+ ）を使用したバイオオートグラフィーでも、この
物質が検出されたので、この物質の一部はビオチンスル
ホキシドであることが立証された。しかし、ＲＹ６３４
を用いた際にＫＡＰＡ／ＢＳＯの位置に生成したスポッ
トの強度は、ＲＹ６０４／ｐＯＫ１２を用いた場合に検
出されるスポットの強度より有意に低かった。
らくはＫＡＰＡであるビオチンビタマーのレベルが増大
した（図１７、レーンＤ）。このことは、ピメリン酸塩
を加えていない同様の発酵（図１７、レーンＢ）と比べ
て、ＫＡＰＡ／ＢＳＯスポットが増大していることによ
って示された。ビオチンとビオチンスルホキシドのみを
検出するＲＹ６３４（ΔｂｉｏＡ−Ｄ：：ＫａｎR ，Ｂ
ｉｓ+ ）を使用したバイオオートグラフィーでも、この
物質が検出されたので、この物質の一部はビオチンスル
ホキシドであることが立証された。しかし、ＲＹ６３４
を用いた際にＫＡＰＡ／ＢＳＯの位置に生成したスポッ
トの強度は、ＲＹ６０４／ｐＯＫ１２を用いた場合に検
出されるスポットの強度より有意に低かった。
【０１１８】デスチオビオチンとＫＡＰＡが蓄積された
ことは、ｂｉｏＢとｂｉｏＡによってコードされる生合
成の各段階の制限を示唆するものである。こうした制限
は、これらの各遺伝子の発現を増大させたり、これらの
各段階の基質、補因子、あるいは共同タンパク質のプー
ルを増大させたりすることによって解消することができ
る。ｂｉｏＢあるいはｂｉｏＡの発現をそれぞれ別々に
増大させるには、個々の遺伝子のサブクローンあるいは
個々の遺伝子のＰＣＲで得たコピーを、強力なプロモー
ター（ＳＰ０１、ｖｅｇ等）を有する発現ベクターに挿
入し、ＤＮＡをプラスミド、たとえばｐＵＢ１１０、あ
るいはファージ、たとえばＳＰβを介して細胞に導入す
るか、あるいは染色体の非必須遺伝子、たとえばｂｐｒ
に直接組込めばよい。
ことは、ｂｉｏＢとｂｉｏＡによってコードされる生合
成の各段階の制限を示唆するものである。こうした制限
は、これらの各遺伝子の発現を増大させたり、これらの
各段階の基質、補因子、あるいは共同タンパク質のプー
ルを増大させたりすることによって解消することができ
る。ｂｉｏＢあるいはｂｉｏＡの発現をそれぞれ別々に
増大させるには、個々の遺伝子のサブクローンあるいは
個々の遺伝子のＰＣＲで得たコピーを、強力なプロモー
ター（ＳＰ０１、ｖｅｇ等）を有する発現ベクターに挿
入し、ＤＮＡをプラスミド、たとえばｐＵＢ１１０、あ
るいはファージ、たとえばＳＰβを介して細胞に導入す
るか、あるいは染色体の非必須遺伝子、たとえばｂｐｒ
に直接組込めばよい。
【０１１９】
【表１４】 セルロ−スクロマトグラフィーにおけるビオチンビタマーのＲf の観察値と 報告値 Ｒf ビオチン 観察値 文献a 値 ビタマー （ＴＬＣ） （ペーパー） ＤＡＰＡ ０．０９ ０．０９ ＫＡＰＡ ０．３５ ビオチンスルホキシド ０．５２ ビオチン ０．８６ ０．７６ デスチオビオチン ０．９４ ０．８２ ─────────────────────────────────a Agric. Biol. Chem. 39, 779-784 (1975)
【０１２０】ＶＩＩＩＤ： 遺伝子操作型の菌株におけ
るｂｉｏ特異的なｍＲＮＡの合成の分析 ノーザンブロット実験を選ばれた菌株について行って、
ｂｉｏオペロンの転写パターンと、各種の遺伝子操作型
の菌株に存在するｂｉｏ特異的なｍＲＮＡの量を調べ
た。予測された通り、操作型菌株のすべてで、ｂｉｏオ
ペロン全体をカバーする７ｋｂのＲＮＡ転写物が見られ
た。野生型ならびにｂｉｒＡ変異型の枯草菌株でも、操
作型菌株より量は少ないものの、この転写物が存在して
いた。また、全ての菌株が、ｂｉｏオペロンの最初の５
つの遺伝子をカバーする５ｋｂの転写物を、７ｋｂの転
写物より多量（約８倍）に含んでおり、有意量の転写物
が、ｂｉｏＢの後の潜在的な終結部位（図５）で終端し
ていることが示唆された。ｂｉｏＷ遺伝子の大半をカバ
ーする０．８ｋｂの小型転写物も有意量観察された。こ
の転写物は、異化産物抑制に関与する部位のコンセンサ
ス配列［ Chambliss,G. H., " Bacillus subtilis and
Other Gram-Positive Bacteria" Sonensheinet al. e
d., Am. Soc. Microbiology, pp. 213-219 (1993) ］と
類似性を有する配列の付近で終端していた。この３種の
転写物同士の相対的な比は、ビオチンの不在下で成育さ
せた野生型株でも、野生型のｂｉｏプロモーターあるい
はＳＰ０１プロモーターにより駆動されたｂｉｒＡ変異
株あるいは操作型株でも同一であった。これらの各種菌
株の間では、ｂｉｏ特異的なＲＮＡの総量の絶対量のみ
が劇的に異なっていた。野生型のプロモーターあるいは
ＳＰ０１−１５プロモーターを有する遺伝子操作型の第
一世代の産生株は、抑制解除型の野生型細胞のそれぞれ
約３０倍あるいは６０倍のｂｉｏ特異的ＲＮＡを産生し
た。ｂｉｒＡ変異株のｂｉｏ特異的ＲＮＡのレベルは、
抑制解除型の野生型細胞のＲＮＡレベルよりわずかに
（２−３倍）高いのみであり、ビオチン上で成育させて
も影響を受けなかった。
るｂｉｏ特異的なｍＲＮＡの合成の分析 ノーザンブロット実験を選ばれた菌株について行って、
ｂｉｏオペロンの転写パターンと、各種の遺伝子操作型
の菌株に存在するｂｉｏ特異的なｍＲＮＡの量を調べ
た。予測された通り、操作型菌株のすべてで、ｂｉｏオ
ペロン全体をカバーする７ｋｂのＲＮＡ転写物が見られ
た。野生型ならびにｂｉｒＡ変異型の枯草菌株でも、操
作型菌株より量は少ないものの、この転写物が存在して
いた。また、全ての菌株が、ｂｉｏオペロンの最初の５
つの遺伝子をカバーする５ｋｂの転写物を、７ｋｂの転
写物より多量（約８倍）に含んでおり、有意量の転写物
が、ｂｉｏＢの後の潜在的な終結部位（図５）で終端し
ていることが示唆された。ｂｉｏＷ遺伝子の大半をカバ
ーする０．８ｋｂの小型転写物も有意量観察された。こ
の転写物は、異化産物抑制に関与する部位のコンセンサ
ス配列［ Chambliss,G. H., " Bacillus subtilis and
Other Gram-Positive Bacteria" Sonensheinet al. e
d., Am. Soc. Microbiology, pp. 213-219 (1993) ］と
類似性を有する配列の付近で終端していた。この３種の
転写物同士の相対的な比は、ビオチンの不在下で成育さ
せた野生型株でも、野生型のｂｉｏプロモーターあるい
はＳＰ０１プロモーターにより駆動されたｂｉｒＡ変異
株あるいは操作型株でも同一であった。これらの各種菌
株の間では、ｂｉｏ特異的なＲＮＡの総量の絶対量のみ
が劇的に異なっていた。野生型のプロモーターあるいは
ＳＰ０１−１５プロモーターを有する遺伝子操作型の第
一世代の産生株は、抑制解除型の野生型細胞のそれぞれ
約３０倍あるいは６０倍のｂｉｏ特異的ＲＮＡを産生し
た。ｂｉｒＡ変異株のｂｉｏ特異的ＲＮＡのレベルは、
抑制解除型の野生型細胞のＲＮＡレベルよりわずかに
（２−３倍）高いのみであり、ビオチン上で成育させて
も影響を受けなかった。
【０１２１】こうした実験から、ＳＰ０１プロモーター
が、オペロン１個当たりについて、野生型のｂｉｏプロ
モーターの少なくとも４倍のＲＮＡの合成を支配してい
ることが示唆された。しかし、ＳＰ０１−ｂｉｏオペロ
ンのコピー数が少ない場合には、ｂｉｏ特異的なＲＮＡ
の総量は、十分に増幅された野生型オペロンの場合に観
察される量のせいぜい２倍にとどまった。ＲＮＡのレベ
ルはビオチンの産生レベルと相関しており、遺伝子操作
型の増幅されたＳＰ０１−ｂｉｏオペロンを有する菌株
は、増幅された野生型のオペロンを有するｂｉｒＡ変異
株の約２倍のビオチンを産生し、１つ以上のｂｉｏ遺伝
子の発現を増大させると、ビオチンの力価が増大するこ
とが確認された。
が、オペロン１個当たりについて、野生型のｂｉｏプロ
モーターの少なくとも４倍のＲＮＡの合成を支配してい
ることが示唆された。しかし、ＳＰ０１−ｂｉｏオペロ
ンのコピー数が少ない場合には、ｂｉｏ特異的なＲＮＡ
の総量は、十分に増幅された野生型オペロンの場合に観
察される量のせいぜい２倍にとどまった。ＲＮＡのレベ
ルはビオチンの産生レベルと相関しており、遺伝子操作
型の増幅されたＳＰ０１−ｂｉｏオペロンを有する菌株
は、増幅された野生型のオペロンを有するｂｉｒＡ変異
株の約２倍のビオチンを産生し、１つ以上のｂｉｏ遺伝
子の発現を増大させると、ビオチンの力価が増大するこ
とが確認された。
【０１２２】実施例IX . 枯草菌のbirA様遺伝子の遺伝子マッピング 枯草菌の bioオペロンを含有するＤＮＡクローンに加え
て、大腸菌（E.coli)のbirA調節遺伝子の高温感受性変
異を相補する、枯草菌の染色体ＤＮＡを含む、２つの組
換えプラスミド、ｐＢＩＯ１１３およびｐＢＩＯ１１４
が回収された。birA遺伝子産物は大腸菌のなかで、アポ
酵素にビオチンを付加する酵素として、またビオチン生
合成遺伝子の発現に対し負の調節を行う、リプレッサー
タンパク質として機能している。
て、大腸菌（E.coli)のbirA調節遺伝子の高温感受性変
異を相補する、枯草菌の染色体ＤＮＡを含む、２つの組
換えプラスミド、ｐＢＩＯ１１３およびｐＢＩＯ１１４
が回収された。birA遺伝子産物は大腸菌のなかで、アポ
酵素にビオチンを付加する酵素として、またビオチン生
合成遺伝子の発現に対し負の調節を行う、リプレッサー
タンパク質として機能している。
【０１２３】birA−相補性遺伝子の枯草菌染色体上の位
置を、ＰＢＳ１を用いた普遍的な形質導入によってマッ
ピングした。これを行うために、birA遺伝子座近傍に選
択可能な抗生物質耐性マーカー、cat をもつ枯草菌株を
作製した。次いで、染色体上の catの遺伝子座を決定す
ることによって、birA相補性ＤＮＡのマッピングを行っ
た。cat カセット（ｐＭＩ１１０１から得られた［Youn
gman et al. Plasmid12, 1-9 (1984)］) を含むｐＢＩ
Ｏ１１３の誘導体を構築し、この組込み型ベクターを枯
草菌の染色体に導入した。ｐＢＩＯ１１３のクローン化
した7.０kbの挿入物は、枯草菌染色体の対応するセグメ
ントと相同なので、Campbell組換え［Campbell, Adv. G
enet. 11, 101-145 (1962)］による cat含有ｐＢＩＯ１
１３の染色体への組込みによってbirAの近傍にcat 遺伝
子が導入された。標準のＰＢＳ１−形質導入マッピング
を用いて、 birA −相補性遺伝子は染色体の 202°領
域、trp 座に非常に近い位置（＞90％の連鎖) にマッピ
ングされた。
置を、ＰＢＳ１を用いた普遍的な形質導入によってマッ
ピングした。これを行うために、birA遺伝子座近傍に選
択可能な抗生物質耐性マーカー、cat をもつ枯草菌株を
作製した。次いで、染色体上の catの遺伝子座を決定す
ることによって、birA相補性ＤＮＡのマッピングを行っ
た。cat カセット（ｐＭＩ１１０１から得られた［Youn
gman et al. Plasmid12, 1-9 (1984)］) を含むｐＢＩ
Ｏ１１３の誘導体を構築し、この組込み型ベクターを枯
草菌の染色体に導入した。ｐＢＩＯ１１３のクローン化
した7.０kbの挿入物は、枯草菌染色体の対応するセグメ
ントと相同なので、Campbell組換え［Campbell, Adv. G
enet. 11, 101-145 (1962)］による cat含有ｐＢＩＯ１
１３の染色体への組込みによってbirAの近傍にcat 遺伝
子が導入された。標準のＰＢＳ１−形質導入マッピング
を用いて、 birA −相補性遺伝子は染色体の 202°領
域、trp 座に非常に近い位置（＞90％の連鎖) にマッピ
ングされた。
【０１２４】実施例Ｘ．ビオチン生産について調節解除
された枯草菌宿主株の構築 ＸＡ. ビオチン類似体耐性株 ビオチン生産について調節解除された株を選択するため
に、ビオチン類似体を用いた。探索した変異のなかに
は、大腸菌birA遺伝子と相同性をもつ可能性のある遺伝
子に生じた変異があった。しかし、ビオチン類似体に対
する耐性による選択はまた、birAのオペレーター部位に
変異をもつ株、または細胞内への類似体の輸送にかかわ
る機能をコードする遺伝子に変異をもつ株を生ずること
が期待される。類似体耐性変異株はまた、これだけに限
るものではないが、フィードバック阻害剤を含む阻害剤
に耐性の酵素をコードする一つまたは複数の遺伝子を含
む。ビオチン類似体 (ホモビオチン、α−デヒドロビオ
チン、５（２−チエニル) ペンタン酸）は日本ロッシュ
（日本、神奈川）から得た。突然変異を誘発した枯草菌
細胞は、各ビオチン類似体の結晶一個を含むＴＢＡＢ
(Difco Tryptose BloodAgar Base, カタログ番号 0232-
01-9) プレート上にまいた。
された枯草菌宿主株の構築 ＸＡ. ビオチン類似体耐性株 ビオチン生産について調節解除された株を選択するため
に、ビオチン類似体を用いた。探索した変異のなかに
は、大腸菌birA遺伝子と相同性をもつ可能性のある遺伝
子に生じた変異があった。しかし、ビオチン類似体に対
する耐性による選択はまた、birAのオペレーター部位に
変異をもつ株、または細胞内への類似体の輸送にかかわ
る機能をコードする遺伝子に変異をもつ株を生ずること
が期待される。類似体耐性変異株はまた、これだけに限
るものではないが、フィードバック阻害剤を含む阻害剤
に耐性の酵素をコードする一つまたは複数の遺伝子を含
む。ビオチン類似体 (ホモビオチン、α−デヒドロビオ
チン、５（２−チエニル) ペンタン酸）は日本ロッシュ
（日本、神奈川）から得た。突然変異を誘発した枯草菌
細胞は、各ビオチン類似体の結晶一個を含むＴＢＡＢ
(Difco Tryptose BloodAgar Base, カタログ番号 0232-
01-9) プレート上にまいた。
【０１２５】枯草菌ＰＹ７９ (S.A. Zahler 株 CU1769,
（met B5, glnA100, Youngman et al, 1984 前掲) から
誘導した、ＳＰβのキュアリングを行った原栄養株をエ
チルメタンスルホネート (ＥＭＳ）で致死率90％になる
ように突然変異を誘発した。生存細胞を一夜培養し、培
養液の0.１mlをＴＢＡＢプレートにまいた。２つのビオ
チン類似体の結晶をプレート上に置き、プレートを37℃
で一夜インキュベートした。α−デヒドロビオチンと５
（２−チエニル）ペンタン酸の結晶は枯草菌の増殖を阻
止し、結晶周辺に阻止ゾーンを形成した。阻止ゾーンの
なかにビオチン類似体耐性株である可能性をもつ、独立
のコロニーが出現した。
（met B5, glnA100, Youngman et al, 1984 前掲) から
誘導した、ＳＰβのキュアリングを行った原栄養株をエ
チルメタンスルホネート (ＥＭＳ）で致死率90％になる
ように突然変異を誘発した。生存細胞を一夜培養し、培
養液の0.１mlをＴＢＡＢプレートにまいた。２つのビオ
チン類似体の結晶をプレート上に置き、プレートを37℃
で一夜インキュベートした。α−デヒドロビオチンと５
（２−チエニル）ペンタン酸の結晶は枯草菌の増殖を阻
止し、結晶周辺に阻止ゾーンを形成した。阻止ゾーンの
なかにビオチン類似体耐性株である可能性をもつ、独立
のコロニーが出現した。
【０１２６】α−デヒドロビオチンと５（２−チエニ
ル）ペンタン酸のまわりの阻止ゾーンからとり出したコ
ロニーは、α−デヒドロビオチンのゾーンから選択した
ものについてはＤＢ−１からＤＢ−４まで、また５（２
−チエニル）ペンタン酸から選択したものについてはＴ
Ｐ−１からＴＰ−３までというように命名した。単離し
たコロニーは、各々の類似体のさまざまな量を含む最少
カザミノ酸プレートにストリーク (線状に塗布) した。
これらの株は野生株よりもそれぞれの類似体をもつプレ
ート上でよりよく成育した( すなわちより大きなコロニ
ーを形成した）。
ル）ペンタン酸のまわりの阻止ゾーンからとり出したコ
ロニーは、α−デヒドロビオチンのゾーンから選択した
ものについてはＤＢ−１からＤＢ−４まで、また５（２
−チエニル）ペンタン酸から選択したものについてはＴ
Ｐ−１からＴＰ−３までというように命名した。単離し
たコロニーは、各々の類似体のさまざまな量を含む最少
カザミノ酸プレートにストリーク (線状に塗布) した。
これらの株は野生株よりもそれぞれの類似体をもつプレ
ート上でよりよく成育した( すなわちより大きなコロニ
ーを形成した）。
【０１２７】さらに類似体ホモビオチン（ＨＢ）および
α−デヒドロビオチン（α−ＤＢ)に対する耐性につい
ての、同様のプレートスクリーニングによって、27の変
異株を選択した。この後者の選択においては、枯草菌Ｐ
Ｙ７９培養物のＥＭＳによる突然変異誘発は２つの独立
の実験によって行われた。最初の突然変異誘発ＥＭＳ１
の細菌に対する致死率は96％であったのに対し、第２の
ＥＭＳ２は82％であった。ＰＹ７９、ＥＭＳ１、ＥＭＳ
２の富栄養培地での一夜培養物をＴＢＡＢ (富栄養) 、
ＢＩＯＳ (ビオチン不含) またはＭＩＮ (グルコース最
少) プレートにまき、ホモビオチンまたはα−デヒドロ
ビオチンの結晶をそれぞれのプレート上に置いた。24時
間後、いくつかの耐性コロニーの増殖がみられる、阻止
ゾーンの形成が観察された。独立のコロニーをホモビオ
チンプレートまたはα−デヒドロビオチンプレートから
とりだし、α−デヒドロビオチンまたはホモビオチンを
含むＢＩＯＳプレート上に再びストリークした。
α−デヒドロビオチン（α−ＤＢ)に対する耐性につい
ての、同様のプレートスクリーニングによって、27の変
異株を選択した。この後者の選択においては、枯草菌Ｐ
Ｙ７９培養物のＥＭＳによる突然変異誘発は２つの独立
の実験によって行われた。最初の突然変異誘発ＥＭＳ１
の細菌に対する致死率は96％であったのに対し、第２の
ＥＭＳ２は82％であった。ＰＹ７９、ＥＭＳ１、ＥＭＳ
２の富栄養培地での一夜培養物をＴＢＡＢ (富栄養) 、
ＢＩＯＳ (ビオチン不含) またはＭＩＮ (グルコース最
少) プレートにまき、ホモビオチンまたはα−デヒドロ
ビオチンの結晶をそれぞれのプレート上に置いた。24時
間後、いくつかの耐性コロニーの増殖がみられる、阻止
ゾーンの形成が観察された。独立のコロニーをホモビオ
チンプレートまたはα−デヒドロビオチンプレートから
とりだし、α−デヒドロビオチンまたはホモビオチンを
含むＢＩＯＳプレート上に再びストリークした。
【０１２８】リプレッサーまたはオペレーター欠損変異
をもつ可能性のある変異株を、測定可能なレベルのビオ
チンを分泌する能力によってスクリーニングした。各変
異株を、ビオチンまたはビオチンビタマー産生能につい
て試験した。各株をＶＹ培地(５ml；20ｇ／ｌの Difco
子ウシ浸出肉汁および５ｇ／ｌ Difco酵母抽出液) で37
℃、18−24時間培養し、上清を滅菌的にろ過した。ろ過
して得た上清をビオチン不含培地で連続希釈し、この連
続希釈培地に大腸菌株ＲＹ６０４（ΔbioH) およびＲＹ
６０７（ΔbioABFCD) を植えつけた。前者の株はビオチ
ンとビオチンビタマーの両方で生育したが、後者はビオ
チンでだけしか生育しなかった。異なる枯草菌の変異株
で生産されるビオチンおよびビオチンビタマーはビオチ
ンおよびデスチオビオチンから得られた標準曲線から計
算した。コレクションのなかの、ホモビオチン耐性変異
株ＨＢ３, ＨＢ９，ＨＢ１５，およびα−デヒドロビオ
チン耐性変異株α−ＤＢ９，α−ＤＢ１６，α−ＤＢ１
７の６変異株は約 100μｇ／ｌの分泌されたビオチンを
産生した。他の変異株はビオチンをまったく産生しない
か、または産生しても10μｇ／ｌだった。上の方法で選
択された他の変異株は、75μｇ／ｌ、 150μｇ／ｌまた
はさらに 200μｇ／ｌ， 250μｇ／ｌまたは300μｇ／
ｌを産生することが期待されうる。
をもつ可能性のある変異株を、測定可能なレベルのビオ
チンを分泌する能力によってスクリーニングした。各変
異株を、ビオチンまたはビオチンビタマー産生能につい
て試験した。各株をＶＹ培地(５ml；20ｇ／ｌの Difco
子ウシ浸出肉汁および５ｇ／ｌ Difco酵母抽出液) で37
℃、18−24時間培養し、上清を滅菌的にろ過した。ろ過
して得た上清をビオチン不含培地で連続希釈し、この連
続希釈培地に大腸菌株ＲＹ６０４（ΔbioH) およびＲＹ
６０７（ΔbioABFCD) を植えつけた。前者の株はビオチ
ンとビオチンビタマーの両方で生育したが、後者はビオ
チンでだけしか生育しなかった。異なる枯草菌の変異株
で生産されるビオチンおよびビオチンビタマーはビオチ
ンおよびデスチオビオチンから得られた標準曲線から計
算した。コレクションのなかの、ホモビオチン耐性変異
株ＨＢ３, ＨＢ９，ＨＢ１５，およびα−デヒドロビオ
チン耐性変異株α−ＤＢ９，α−ＤＢ１６，α−ＤＢ１
７の６変異株は約 100μｇ／ｌの分泌されたビオチンを
産生した。他の変異株はビオチンをまったく産生しない
か、または産生しても10μｇ／ｌだった。上の方法で選
択された他の変異株は、75μｇ／ｌ、 150μｇ／ｌまた
はさらに 200μｇ／ｌ， 250μｇ／ｌまたは300μｇ／
ｌを産生することが期待されうる。
【０１２９】 ＸＢ．ビオチン類似体耐性変異のマッピング 実施例IXは枯草菌birA遺伝子がtrpC２の下流わずかの位
置にマッピングされることを示した。６株のビオチン分
泌、類似体耐性の変異株について、この変異がbirA様の
リプレッサーに位置するかどうかを決めるために、ファ
ージ形質導入を用いてtrpC２との連鎖をしらべた。各候
補を枯草菌168（trpC２）とかけ合わせ、Trp+ の導入体
をホモビオチンの存在または非存在下で最少培地にパッ
チした。その結果、６株の類似体耐性変異株のうちの５
株（ＨＢ３，ＨＢ９，ＨＢ１５，α−ＤＢ１６，αＤＢ
１７）はbirA座位に密接に連鎖している (Trp+ および
類似体耐性が90−95％の頻度で同時に形質導入された）
ことが示された。ＢＩ４２１はα−ＤＢ１６のbirA変異
をもつ変異株168 の、ホモビオチン耐性（ＨＢr)Trp+
導入体である。
置にマッピングされることを示した。６株のビオチン分
泌、類似体耐性の変異株について、この変異がbirA様の
リプレッサーに位置するかどうかを決めるために、ファ
ージ形質導入を用いてtrpC２との連鎖をしらべた。各候
補を枯草菌168（trpC２）とかけ合わせ、Trp+ の導入体
をホモビオチンの存在または非存在下で最少培地にパッ
チした。その結果、６株の類似体耐性変異株のうちの５
株（ＨＢ３，ＨＢ９，ＨＢ１５，α−ＤＢ１６，αＤＢ
１７）はbirA座位に密接に連鎖している (Trp+ および
類似体耐性が90−95％の頻度で同時に形質導入された）
ことが示された。ＢＩ４２１はα−ＤＢ１６のbirA変異
をもつ変異株168 の、ホモビオチン耐性（ＨＢr)Trp+
導入体である。
【０１３０】α−ＤＢ９に保持されている、類似体耐性
の６番目の変異はtrpCに連鎖しておらず、したがってbi
rAの単一の変異ではない。同様な形質導入マッピングの
実験（図１０参照）において、α−ＤＢ９からbioW::ca
t７株への形質導入によって、α−ＤＢ９の変異はビオ
チンオペロンに連鎖していないことが示された。したが
って、α−ＤＢ９の変異株の表現型は、birAとも、bioW
AFDBI とも異なる第３の部位の変異によるものか、また
は、類似体耐性の表現型を発現するのにそのすべてが必
要とされるような、二箇所以上の座位に生じた変異によ
るものである。α−ＤＢ９変異はビオチンパーミアー
ゼ、ビオチン輸出ポンプ、またはビオチン生合成に関係
する酵素に影響を与えうる。異なる座位に位置する、類
似体耐性変異（ＨＢ３やα−ＤＢ９などの変異）は、菌
株構築の標準的な技術によって単一の菌株に集めること
ができ、これによってビオチン分泌能の一段と高い株が
得られる。これら類似体耐性変異株または上の手順で単
離およびスクリーニングされた他の変異株は、ビオチン
の過剰生産のための宿主細胞として用いることができる
であろう。
の６番目の変異はtrpCに連鎖しておらず、したがってbi
rAの単一の変異ではない。同様な形質導入マッピングの
実験（図１０参照）において、α−ＤＢ９からbioW::ca
t７株への形質導入によって、α−ＤＢ９の変異はビオ
チンオペロンに連鎖していないことが示された。したが
って、α−ＤＢ９の変異株の表現型は、birAとも、bioW
AFDBI とも異なる第３の部位の変異によるものか、また
は、類似体耐性の表現型を発現するのにそのすべてが必
要とされるような、二箇所以上の座位に生じた変異によ
るものである。α−ＤＢ９変異はビオチンパーミアー
ゼ、ビオチン輸出ポンプ、またはビオチン生合成に関係
する酵素に影響を与えうる。異なる座位に位置する、類
似体耐性変異（ＨＢ３やα−ＤＢ９などの変異）は、菌
株構築の標準的な技術によって単一の菌株に集めること
ができ、これによってビオチン分泌能の一段と高い株が
得られる。これら類似体耐性変異株または上の手順で単
離およびスクリーニングされた他の変異株は、ビオチン
の過剰生産のための宿主細胞として用いることができる
であろう。
【０１３１】上に述べたように、α−デヒドロビオチン
に対する耐性として単離されたαＤＢ１２およびＰＹ７
９（ｐＢＩＯ３９７ cat）のホモビオチン耐性自然発生
突然変異株ＨＢ４３がもつさらに２つのビオチン類似体
耐性変異もまたbirA座位にマッピングされた。
に対する耐性として単離されたαＤＢ１２およびＰＹ７
９（ｐＢＩＯ３９７ cat）のホモビオチン耐性自然発生
突然変異株ＨＢ４３がもつさらに２つのビオチン類似体
耐性変異もまたbirA座位にマッピングされた。
【０１３２】ＸＣ. 枯草菌birA変異株のＤＮＡ塩基配列 アミノ酸の変化をひき起す変異は、ＨＢ３のようなホモ
ビオチン耐性株、およびα−ＤＢ１６のようなα−デヒ
ドロビオチン耐性株のbirA遺伝子に見出されうる。その
ような変異株を見つけるために、野生型の枯草菌birA遺
伝子と、ビオチン類似体耐性変異をもつ枯草菌birA遺伝
子を比較することができる。野生型の枯草菌birA遺伝子
の塩基配列は、ｐＢＩＯ１１３またはｐＢＩＯ１１４に
クローン化したbirA+ 遺伝子の塩基配列解析によって得
ることができる。変異型のbirA遺伝子の塩基配列はこの
遺伝子のＰＣＲコピーからもっとも容易に得ることがで
きる。各birA変異体から得たゲノムＤＮＡ鋳型とbirAの
コード領域をはさむことがわかっている一組のプライマ
ーを用いて、いくつかの独立のＰＣＲを実施することが
できる。独立の各ＰＣＲからＤＮＡ断片を単離し、これ
を大腸菌ｐＵＣ２１にクローン化することができる［Vi
era and Messing, Gene 100, 189-194 (1991) ］。２つ
の独立のＰＣＲのそれぞれからの単離物を、一連の内部
プライマーを用いて、両鎖について配列解析を行うこと
ができる。ＰＣＲによって導入されたいかなる人為的な
変異も、２つの独立のＰＣＲクローンのいずれか一方だ
けに出現する筈である一方、“真の”変異は独立の単離
物のいずれにも現われる筈である。
ビオチン耐性株、およびα−ＤＢ１６のようなα−デヒ
ドロビオチン耐性株のbirA遺伝子に見出されうる。その
ような変異株を見つけるために、野生型の枯草菌birA遺
伝子と、ビオチン類似体耐性変異をもつ枯草菌birA遺伝
子を比較することができる。野生型の枯草菌birA遺伝子
の塩基配列は、ｐＢＩＯ１１３またはｐＢＩＯ１１４に
クローン化したbirA+ 遺伝子の塩基配列解析によって得
ることができる。変異型のbirA遺伝子の塩基配列はこの
遺伝子のＰＣＲコピーからもっとも容易に得ることがで
きる。各birA変異体から得たゲノムＤＮＡ鋳型とbirAの
コード領域をはさむことがわかっている一組のプライマ
ーを用いて、いくつかの独立のＰＣＲを実施することが
できる。独立の各ＰＣＲからＤＮＡ断片を単離し、これ
を大腸菌ｐＵＣ２１にクローン化することができる［Vi
era and Messing, Gene 100, 189-194 (1991) ］。２つ
の独立のＰＣＲのそれぞれからの単離物を、一連の内部
プライマーを用いて、両鎖について配列解析を行うこと
ができる。ＰＣＲによって導入されたいかなる人為的な
変異も、２つの独立のＰＣＲクローンのいずれか一方だ
けに出現する筈である一方、“真の”変異は独立の単離
物のいずれにも現われる筈である。
【０１３３】三次元構造がわかっている大腸菌birAタン
パク質［Wilson et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8
9, 9257-9261 (1992)］との比較によって、変異の特性
を決定できる。たとえば、変異はＤＮＡ接触ヘリックス
の一つに位置しているかもしれない。この情報を用いて
bioオペロンの発現を調節する能力の低下した、枯草菌
のより進んだbirA変異株を構築することができる。たと
えば、塩基配列の決定された２つの変異を、よく知られ
た方法である特定部位の突然変異誘発 (site-directed
mutagenesis)を用いて、一つの遺伝子上に組合わせるこ
とができる。あるいは、birAのビオチンリガーゼ活性部
分ではなく、ＤＮＡ結合部分を除去する小さな欠失を構
築することができるであろう。
パク質［Wilson et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8
9, 9257-9261 (1992)］との比較によって、変異の特性
を決定できる。たとえば、変異はＤＮＡ接触ヘリックス
の一つに位置しているかもしれない。この情報を用いて
bioオペロンの発現を調節する能力の低下した、枯草菌
のより進んだbirA変異株を構築することができる。たと
えば、塩基配列の決定された２つの変異を、よく知られ
た方法である特定部位の突然変異誘発 (site-directed
mutagenesis)を用いて、一つの遺伝子上に組合わせるこ
とができる。あるいは、birAのビオチンリガーゼ活性部
分ではなく、ＤＮＡ結合部分を除去する小さな欠失を構
築することができるであろう。
【０１３４】実施例XI. 第二世代の遺伝子操作型枯草菌
ビオチン産生株 遺伝子操作による第一世代の枯草菌ビオチン産生株の構
築およびその性格の検討を行っている際、本発明者ら
は、ビオチン生産の調節系にはいくつかの制限段階があ
り、その改変によってビオチン産生を増強させることが
できることに気付いた。たとえば、サザンブロットのデ
ータからわかるように、ＳＰ０１プロモーター駆動ビオ
チンオペロンは、野生型のビオチンオペロンほどの高い
コピー数にまでは増幅されない。第一に、過剰生産され
た場合細胞にとって有害である遺伝子産物を同定し、こ
の遺伝子を増幅されるカセットから除去することによっ
てこの問題を回避することができる。第二に、ビオチン
オペロンには、部分的なｍＲＮＡ合成の完了前終結をも
たらす２つの部位がある。次の例は野生型のビオチンの
調節機構の理解を、ビオチン生産条件を至適化するため
にどのように用いることができるかを示す。
ビオチン産生株 遺伝子操作による第一世代の枯草菌ビオチン産生株の構
築およびその性格の検討を行っている際、本発明者ら
は、ビオチン生産の調節系にはいくつかの制限段階があ
り、その改変によってビオチン産生を増強させることが
できることに気付いた。たとえば、サザンブロットのデ
ータからわかるように、ＳＰ０１プロモーター駆動ビオ
チンオペロンは、野生型のビオチンオペロンほどの高い
コピー数にまでは増幅されない。第一に、過剰生産され
た場合細胞にとって有害である遺伝子産物を同定し、こ
の遺伝子を増幅されるカセットから除去することによっ
てこの問題を回避することができる。第二に、ビオチン
オペロンには、部分的なｍＲＮＡ合成の完了前終結をも
たらす２つの部位がある。次の例は野生型のビオチンの
調節機構の理解を、ビオチン生産条件を至適化するため
にどのように用いることができるかを示す。
【０１３５】XIＡ．ＳＰ０１プロモーター駆動 bioカセ
ットのコピー数を改善する構築物 上に示されように、ＳＰ０１によって駆動されるビオチ
ンオペロンは、野生株オペロンによる制御を受けるビオ
チンオペロンより、増幅の度合いが低い。本発明者ら
は、bio 遺伝子群の一つまたはそれ以上の遺伝子産物は
高レベルになると細菌に有毒であることを理解した。高
レベルの増幅はその特定の bio遺伝子を欠いたビオチン
オペロンを用いることによって可能となるであろう。ど
の遺伝子が高レベルで受入れがたいものとなるかを決定
するために、本発明者らは次のような実験を企画した。
ットのコピー数を改善する構築物 上に示されように、ＳＰ０１によって駆動されるビオチ
ンオペロンは、野生株オペロンによる制御を受けるビオ
チンオペロンより、増幅の度合いが低い。本発明者ら
は、bio 遺伝子群の一つまたはそれ以上の遺伝子産物は
高レベルになると細菌に有毒であることを理解した。高
レベルの増幅はその特定の bio遺伝子を欠いたビオチン
オペロンを用いることによって可能となるであろう。ど
の遺伝子が高レベルで受入れがたいものとなるかを決定
するために、本発明者らは次のような実験を企画した。
【０１３６】最初に、すべての bio遺伝子のあるレベル
の構成的な発現を確保するために、染色体のビオチンプ
ロモーターをＳＰ０１−１５プロモーターで置き換え
た。このために、上流の相同配列をＳＰ０１−１５プロ
モーターを含む５'カセット (ｐＢＩＯ１６８）に付加
した。この構築は５'ビオチンカセットのすぐ上流の配
列から得られた1.８kbのＰＣＲ断片を、ｐＢＩＯ１６８
の SalＩから NruＩ部位の隙間へと導入することにより
行った。1.8kb ＰＣＲ断片は、上流に NruＩ部位、下流
末端に SalＩ部位を導入するように設計したプライマー
を用いて得た。生じたプラスミドｐＢＩＯ１８０は、bi
o オペロン上流の1.８kbの相同配列と、プロモーター下
流の0.７kbによってはさまれたＳＰ０１−１５プロモー
ターを持っている。このプラスミドは、cat カセットに
よって置き換えられたビオチンオペロンのプロモーター
領域をもち、ビオチンに対する栄養要求性変異株であ
る、Δ::cat17（実施例III参照) を形質転換するために
用いた。続けて生じる二度の組換え過程を通じて、ＳＰ
０１−１５プロモーターは catカセットを置き換えるこ
とができ、この結果所望の原栄養株ＢＩ２９４CmS が得
られた。
の構成的な発現を確保するために、染色体のビオチンプ
ロモーターをＳＰ０１−１５プロモーターで置き換え
た。このために、上流の相同配列をＳＰ０１−１５プロ
モーターを含む５'カセット (ｐＢＩＯ１６８）に付加
した。この構築は５'ビオチンカセットのすぐ上流の配
列から得られた1.８kbのＰＣＲ断片を、ｐＢＩＯ１６８
の SalＩから NruＩ部位の隙間へと導入することにより
行った。1.8kb ＰＣＲ断片は、上流に NruＩ部位、下流
末端に SalＩ部位を導入するように設計したプライマー
を用いて得た。生じたプラスミドｐＢＩＯ１８０は、bi
o オペロン上流の1.８kbの相同配列と、プロモーター下
流の0.７kbによってはさまれたＳＰ０１−１５プロモー
ターを持っている。このプラスミドは、cat カセットに
よって置き換えられたビオチンオペロンのプロモーター
領域をもち、ビオチンに対する栄養要求性変異株であ
る、Δ::cat17（実施例III参照) を形質転換するために
用いた。続けて生じる二度の組換え過程を通じて、ＳＰ
０１−１５プロモーターは catカセットを置き換えるこ
とができ、この結果所望の原栄養株ＢＩ２９４CmS が得
られた。
【０１３７】各 bio遺伝子の欠失は標準の方法によって
生じさせることができる。以下はbioWに非極性の欠失変
異を構築した方法の一例である。bioWの欠失は５'カセ
ットｐＢＩＯ１６８を改変することによって得た。ＳＰ
０１−１５プロモーターと、BamHＩ部位が後につづく、
bioWの最初の３コドンをもつＰＣＲ断片（図16) を得
た。このＰＣＲ断片は、ｐＢＩＯ１６８の XhoＩからBa
mHＩまでの断片を置き換えたのちに、生じた５’カセッ
トのｐＢＩＯ１７８が、３'bioカセットとの連結によっ
て、イン−フレーム(in-frame)のbioW欠失を生じさせる
ような操作を行った (図16参照) 。この連結反応混合物
を用いて枯草菌ＢＩ２９４の形質転換 (既述) を行い、
Cmr の組込み体 (ＢＩ２９６）を選択することによっ
て、bioWの増幅を伴わずにビオチンオペロンの増幅が可
能となった。bioWの染色体上のコピーは依然としてＳＰ
０１−１５プロモーターから転写される。ＢＩ２９４に
組込まれた、完全なＳＰ０１−１５駆動ビオチンオペロ
ンをもつ対照株をも構築し、これをＢＩ２９５と名付け
た。オペロンのコピー数は、増幅されたＢＩ２４７ (実
施例VIIＣiii)にくらべると、いずれの場合も低下し
た。これら２株の増幅を比較すると、bioWはその産物が
過剰生産されたときに毒性を与える遺伝子ではないこと
が示唆される。
生じさせることができる。以下はbioWに非極性の欠失変
異を構築した方法の一例である。bioWの欠失は５'カセ
ットｐＢＩＯ１６８を改変することによって得た。ＳＰ
０１−１５プロモーターと、BamHＩ部位が後につづく、
bioWの最初の３コドンをもつＰＣＲ断片（図16) を得
た。このＰＣＲ断片は、ｐＢＩＯ１６８の XhoＩからBa
mHＩまでの断片を置き換えたのちに、生じた５’カセッ
トのｐＢＩＯ１７８が、３'bioカセットとの連結によっ
て、イン−フレーム(in-frame)のbioW欠失を生じさせる
ような操作を行った (図16参照) 。この連結反応混合物
を用いて枯草菌ＢＩ２９４の形質転換 (既述) を行い、
Cmr の組込み体 (ＢＩ２９６）を選択することによっ
て、bioWの増幅を伴わずにビオチンオペロンの増幅が可
能となった。bioWの染色体上のコピーは依然としてＳＰ
０１−１５プロモーターから転写される。ＢＩ２９４に
組込まれた、完全なＳＰ０１−１５駆動ビオチンオペロ
ンをもつ対照株をも構築し、これをＢＩ２９５と名付け
た。オペロンのコピー数は、増幅されたＢＩ２４７ (実
施例VIIＣiii)にくらべると、いずれの場合も低下し
た。これら２株の増幅を比較すると、bioWはその産物が
過剰生産されたときに毒性を与える遺伝子ではないこと
が示唆される。
【０１３８】過剰生産したときに有害となる遺伝子を同
定するために、この手順を各 bio遺伝子について順次く
り返すことができる。増幅したbioW遺伝子を欠くＢＩ２
９６によるビオチン産生と、増幅したbioW遺伝子をもつ
同遺伝子型の株ＢＩ２９５との比較分析によって、bioW
の産物はビオチンの生合成にとって律速的な酵素ではな
いことが示された (表15) 。ＢＩ２９６は bioカセット
の増幅なしに、親株ＢＩ２９４の10倍以上のビオチンを
産生した。さらに、ＢＩ２９６は完全なＳＰ０１− bio
オペロンをもつ同遺伝子型の対照株ＢＩ２９５とほぼ同
量のビオチンを生産した。このような実験を各 bio遺伝
子の内部の非極性欠失について繰り返すことによって、
枯草菌におけるビオチン生合成の律速遺伝子が同定され
るであろう。
定するために、この手順を各 bio遺伝子について順次く
り返すことができる。増幅したbioW遺伝子を欠くＢＩ２
９６によるビオチン産生と、増幅したbioW遺伝子をもつ
同遺伝子型の株ＢＩ２９５との比較分析によって、bioW
の産物はビオチンの生合成にとって律速的な酵素ではな
いことが示された (表15) 。ＢＩ２９６は bioカセット
の増幅なしに、親株ＢＩ２９４の10倍以上のビオチンを
産生した。さらに、ＢＩ２９６は完全なＳＰ０１− bio
オペロンをもつ同遺伝子型の対照株ＢＩ２９５とほぼ同
量のビオチンを生産した。このような実験を各 bio遺伝
子の内部の非極性欠失について繰り返すことによって、
枯草菌におけるビオチン生合成の律速遺伝子が同定され
るであろう。
【０１３９】
【表１５】
【０１４０】XIＢ．可能な転写終結部位の除去 ビオチンオペロンの内部には２か所の転写終結部位があ
る。約0.８kbのｍＲＮＡ断片がみつかり、これはプロモ
ーターから枯草菌の異化産物抑制配列 (ＣＲＳ) のコン
センサス配列とホモロジーを共有するbioWのある領域ま
での距離に相当する。ノーザンブロットでみられるおも
なビオチン転写物は5.２kbである。これはプロモーター
と、ステム−ループ構造のあとに一連のＴ残基がつづく
bioB−bioIの連結部との間の距離に相当する。ＣＲＳを
除去し、bioB−bioIの連結部のうしろからオペロンの末
端までの転写レベルを増大させるための構築を行った。
る。約0.８kbのｍＲＮＡ断片がみつかり、これはプロモ
ーターから枯草菌の異化産物抑制配列 (ＣＲＳ) のコン
センサス配列とホモロジーを共有するbioWのある領域ま
での距離に相当する。ノーザンブロットでみられるおも
なビオチン転写物は5.２kbである。これはプロモーター
と、ステム−ループ構造のあとに一連のＴ残基がつづく
bioB−bioIの連結部との間の距離に相当する。ＣＲＳを
除去し、bioB−bioIの連結部のうしろからオペロンの末
端までの転写レベルを増大させるための構築を行った。
【０１４１】XIＢi. 異化産物抑制配列の除去 枯草菌では、胞子形成およびある種の酵素の生合成には
異化産物抑制の支配をうける［Sonenshein et al. 編の
“Bacillus subtilis and Other Gram- Positive Bacte
ria," Amer. Soc. Microbiology, Washington D.C.中の
Chambliss, G.H., pp.213-219 (1993)］。
異化産物抑制の支配をうける［Sonenshein et al. 編の
“Bacillus subtilis and Other Gram- Positive Bacte
ria," Amer. Soc. Microbiology, Washington D.C.中の
Chambliss, G.H., pp.213-219 (1993)］。
【０１４２】２か所の異化産物抑制部位 (ＣＲＳ) の可
能性のある部位が、bio オペロンの内部または周辺に位
置している。一つはＯＲＦ３の推定上の５'リーダー領
域の内部に位置する。２番目の異化産物抑制様配列はbi
oWの３'末端部に位置する。この配列の位置は、ノーザ
ンブロットで検出される0.８kb−特異的転写産物の３'
末端と一致し、異化産物抑制が一部、bio オペロンの発
現を制御している可能性を示唆している。この異化産物
抑制様の配列には、短いAbrB調節配列もまた存在してい
る［Sonenshein et al. 編の“Bacillus subtilis and
Other Gram- Positive Bacteria," Amer. Soc. Microbi
ology, Washington D.C.中のShauch, M.A., pp.757-764
(1993) ］。
能性のある部位が、bio オペロンの内部または周辺に位
置している。一つはＯＲＦ３の推定上の５'リーダー領
域の内部に位置する。２番目の異化産物抑制様配列はbi
oWの３'末端部に位置する。この配列の位置は、ノーザ
ンブロットで検出される0.８kb−特異的転写産物の３'
末端と一致し、異化産物抑制が一部、bio オペロンの発
現を制御している可能性を示唆している。この異化産物
抑制様の配列には、短いAbrB調節配列もまた存在してい
る［Sonenshein et al. 編の“Bacillus subtilis and
Other Gram- Positive Bacteria," Amer. Soc. Microbi
ology, Washington D.C.中のShauch, M.A., pp.757-764
(1993) ］。
【０１４３】BamHＩ部位とＣＲＳをコードするbioWの一
部を図19に示した。ＣＲＳはBamHＩ部位の11bp下流から
出発する。ＣＲＳを含む配列中の４コドンは、アミノ酸
の配列を変えることなく３番目の位置を変化させて、別
のコドンに変えることができる。３番目の位置の変化は
ＣＲＳのもっともよく保存された配列（下線部分）４残
基のうちの３残基を変化させる（図19) 。
部を図19に示した。ＣＲＳはBamHＩ部位の11bp下流から
出発する。ＣＲＳを含む配列中の４コドンは、アミノ酸
の配列を変えることなく３番目の位置を変化させて、別
のコドンに変えることができる。３番目の位置の変化は
ＣＲＳのもっともよく保存された配列（下線部分）４残
基のうちの３残基を変化させる（図19) 。
【０１４４】図19に示されるように、bioWのなかのＣＲ
Ｓ部位はまた、AbrBコンセンサス結合部位とかなりの相
同性をもっている。ＣＲＳの配列を変更するときに払う
べき配慮は、AbrBに対する結合部位の配列が似ているの
で、ＣＲＳを破壊する際に強いAbrB結合部位を生じさせ
ることのないように注意しなければならないということ
である。しかし、ＣＲＳを破壊させるために導入した変
更はまた、AbrB部位に対する相同性をも低下させる。図
19に示した変化を導入するために、BamHＩ部位、所望の
変異をもつＣＲＳ領域、およびプライミングのための20
残基を含むＰＣＲプライマーを設計した。適切な下流プ
ライマーはBamHＩおよび Bst1107Ｉによって切断されう
る660bp の断片の生成を可能にする。BamHＩおよび Bst
1107Ｉの両制限酵素ともに、プラスミドｐＢＩＯ２８９
中にそれぞれ唯一の制限部位をもつ。BamHＩおよび Bst
1107Ｉで切ったＰＣＲ産物をBamHＩおよび Bst1107Ｉで
切ったｐＢＩＯ２８９にクローニングし、プラスミドｐ
ＢＩＯ１７９を得た。ｐＢＩＯ１７９からのBamHＩ−Ec
oRＩ断片を次いでｐＢＩＯ１４６Ａにクローニングし、
新しい３'カセットプラスミドｐＢＩＯ１８３を得た。b
ioWの染色体上のコピーの配列を変えるために、２段階
のプロトコルを用いた。最初に cat遺伝子をＢＩ２９４
( 実施例XIＡ) のbioWのBamHＩ部位に導入した (実施例
III)。これによって栄養要求株ＢＩ２９４::cat７が生
じた。この栄養要求株を直線化したｐＢＩＯ１７９によ
って形質転換を行い、 Bio+ の選択を行うことによっ
て、異化産物抑制配列を破壊するように変えられたbioW
の配列をもつ、ＳＰ０１−１５プロモーターによって駆
動される、単一のビオチンオペロンの染色体コピーをも
つＢＩ２９７株を得た。新しい３'カセットｐＢＩＯ１
８３を５'カセットすなわちｐＢＩＯ１６８とともに用
いて、ＢＩ２９７に組込み、増幅を行うことによって、
改変したbioWの増幅を確実にし、そして異化産物抑制に
よる完了前転写終結を解除できるかもしれない。この株
はＢＩ３０６である。この手続きで、異化産物抑制に対
してより感受性の低い可能性のある第二世代のビオチン
産生株が得られる。
Ｓ部位はまた、AbrBコンセンサス結合部位とかなりの相
同性をもっている。ＣＲＳの配列を変更するときに払う
べき配慮は、AbrBに対する結合部位の配列が似ているの
で、ＣＲＳを破壊する際に強いAbrB結合部位を生じさせ
ることのないように注意しなければならないということ
である。しかし、ＣＲＳを破壊させるために導入した変
更はまた、AbrB部位に対する相同性をも低下させる。図
19に示した変化を導入するために、BamHＩ部位、所望の
変異をもつＣＲＳ領域、およびプライミングのための20
残基を含むＰＣＲプライマーを設計した。適切な下流プ
ライマーはBamHＩおよび Bst1107Ｉによって切断されう
る660bp の断片の生成を可能にする。BamHＩおよび Bst
1107Ｉの両制限酵素ともに、プラスミドｐＢＩＯ２８９
中にそれぞれ唯一の制限部位をもつ。BamHＩおよび Bst
1107Ｉで切ったＰＣＲ産物をBamHＩおよび Bst1107Ｉで
切ったｐＢＩＯ２８９にクローニングし、プラスミドｐ
ＢＩＯ１７９を得た。ｐＢＩＯ１７９からのBamHＩ−Ec
oRＩ断片を次いでｐＢＩＯ１４６Ａにクローニングし、
新しい３'カセットプラスミドｐＢＩＯ１８３を得た。b
ioWの染色体上のコピーの配列を変えるために、２段階
のプロトコルを用いた。最初に cat遺伝子をＢＩ２９４
( 実施例XIＡ) のbioWのBamHＩ部位に導入した (実施例
III)。これによって栄養要求株ＢＩ２９４::cat７が生
じた。この栄養要求株を直線化したｐＢＩＯ１７９によ
って形質転換を行い、 Bio+ の選択を行うことによっ
て、異化産物抑制配列を破壊するように変えられたbioW
の配列をもつ、ＳＰ０１−１５プロモーターによって駆
動される、単一のビオチンオペロンの染色体コピーをも
つＢＩ２９７株を得た。新しい３'カセットｐＢＩＯ１
８３を５'カセットすなわちｐＢＩＯ１６８とともに用
いて、ＢＩ２９７に組込み、増幅を行うことによって、
改変したbioWの増幅を確実にし、そして異化産物抑制に
よる完了前転写終結を解除できるかもしれない。この株
はＢＩ３０６である。この手続きで、異化産物抑制に対
してより感受性の低い可能性のある第二世代のビオチン
産生株が得られる。
【０１４５】 XIＢii. bioB以後の終結部位の除去あるいは迂回路 転写終結の内部部位の下流にあるビオチン遺伝子の発現
の増大をはかるために二つの戦略をとった。最初の戦略
はターミネーターの除去を含むものである。第二の戦略
は、bioIおよびＯＲＦ２の強い転写をもたらすために、
BioIの前にＳＰ０１−１５プロモーターを挿入すること
である。
の増大をはかるために二つの戦略をとった。最初の戦略
はターミネーターの除去を含むものである。第二の戦略
は、bioIおよびＯＲＦ２の強い転写をもたらすために、
BioIの前にＳＰ０１−１５プロモーターを挿入すること
である。
【０１４６】シストロン間領域に位置するターミネータ
ーを除去するために（図20) 適当なＰＣＲプライマーを
設計した。一つのプライマーは唯一のBspEＩ部位から上
流のbioBとハイブリッド形成を行う。第二のプライマー
は、 PmlＩ部位、bioIのリボソーム結合部位、および51
bpとんでbioBの停止コドンと３'末端の23bpと相補的で
ある（図20) 。BspEＩと PmlＩによる消化で209bp の断
片が生じ、これを用いてｐＢＩＯ２８９のBspEＩ−PmlI
断片を置き換えてｐＢＩＯ１８１が得られた。このプラ
スミドを新しい3'カセットを得るために用い、BamHＩ−
EcoRＩ断片をｐＢＩＯ１４６Ａにクローニングし、ｐＢ
ＩＯ１８５が得られた。bioBからbioI間のターミネータ
ーを除去することによる、ＢＩ２９４の染色体ビオチン
オペロンの改変は二段階で行った。第一に、実施例III
で述べたと同様の方法を用いて、bioBの末端に cat遺伝
子を導入した。これによって Bio- , Cmr 株ＢＩ３００
が生じた。直線化したプラスミドｐＢＩＯ１８１を用い
てＢＩ３００の形質転換を行うと、 Bio+ 単離株は所望
のターミネーター欠失をもち、これはＢＩ３０３と名付
けられる。ターミネーター欠失を含む、組込まれた増幅
ビオチンオペロンは、ｐＢＩＯ１６８およびｐＢＩＯ１
８５に由来するBamHＩ− NotＩ断片の連結物によってＢ
Ｉ３０３を形質転換することを通じて構築し、これをＢ
Ｉ３０７と命名した。
ーを除去するために（図20) 適当なＰＣＲプライマーを
設計した。一つのプライマーは唯一のBspEＩ部位から上
流のbioBとハイブリッド形成を行う。第二のプライマー
は、 PmlＩ部位、bioIのリボソーム結合部位、および51
bpとんでbioBの停止コドンと３'末端の23bpと相補的で
ある（図20) 。BspEＩと PmlＩによる消化で209bp の断
片が生じ、これを用いてｐＢＩＯ２８９のBspEＩ−PmlI
断片を置き換えてｐＢＩＯ１８１が得られた。このプラ
スミドを新しい3'カセットを得るために用い、BamHＩ−
EcoRＩ断片をｐＢＩＯ１４６Ａにクローニングし、ｐＢ
ＩＯ１８５が得られた。bioBからbioI間のターミネータ
ーを除去することによる、ＢＩ２９４の染色体ビオチン
オペロンの改変は二段階で行った。第一に、実施例III
で述べたと同様の方法を用いて、bioBの末端に cat遺伝
子を導入した。これによって Bio- , Cmr 株ＢＩ３００
が生じた。直線化したプラスミドｐＢＩＯ１８１を用い
てＢＩ３００の形質転換を行うと、 Bio+ 単離株は所望
のターミネーター欠失をもち、これはＢＩ３０３と名付
けられる。ターミネーター欠失を含む、組込まれた増幅
ビオチンオペロンは、ｐＢＩＯ１６８およびｐＢＩＯ１
８５に由来するBamHＩ− NotＩ断片の連結物によってＢ
Ｉ３０３を形質転換することを通じて構築し、これをＢ
Ｉ３０７と命名した。
【０１４７】bioIおよびＯＲＦ２の最大の発現を確実に
するために、ＳＰ０１−１５プロモーターをbioIの前に
導入した。ｐＢＩＯ１６８からのＳＰ０１−１５プロモ
ーターはＰＣＲで増殖し、下流側にリボソーム結合部位
およびbioIの開始コドン／PmlI部位を、そして上流側に
stuI部位を導入した。用いたプライマーは、１）5'−Ｇ
ＧＣ ＣＡＴ ＴＣＴ ＡＣＡ ＣＧＴ ＧＡＴ ＴＴ
Ｔ ＣＴＣ ＣＴＴＴＣＴ ＧＴＣ ＴＡＧ ＡＡＣ
ＡＧＧ ＣＧＧ ＧＧＴ ＴＧＣおよび２）5'−ＧＧＣ
ＣＡＧ ＧＣＣ ＴＧＧ ＣＴＡ ＴＴＧ ＡＣＧ
ＡＣＡ ＧＣＴ ＡＴＧ ＣＴＴである。StuIおよびPm
lIによるＤＮＡの消化は平滑末端を生むので、ｐＢＩＯ
２８９のPmlIによる消化はStuI／PmlI消化ＰＣＲ断片の
導入を可能にする。一方の配向をとるとbioI開始コドン
にPmlI部位が再生され、ＳＰ０１−１５プロモーターは
bioIとＯＲＦ２の転写を発動させる。この方向性をもっ
たプラスミドをｐＢＩＯ１８２と名付けた。新しい3'カ
セット (ｐＢＩＯ１８４）はｐＢＩＯ１８２のBamHＩ−
EcoRＩ断片をｐＢＩＯ１４６Ａにクローニングすること
により構築した。この構築物は、bioBとbioIの間のター
ミネーターの除去によって生ずるものよりも、bioIおよ
びＯＲＦ２のより大きな転写を生ずることが期待され
る。
するために、ＳＰ０１−１５プロモーターをbioIの前に
導入した。ｐＢＩＯ１６８からのＳＰ０１−１５プロモ
ーターはＰＣＲで増殖し、下流側にリボソーム結合部位
およびbioIの開始コドン／PmlI部位を、そして上流側に
stuI部位を導入した。用いたプライマーは、１）5'−Ｇ
ＧＣ ＣＡＴ ＴＣＴ ＡＣＡ ＣＧＴ ＧＡＴ ＴＴ
Ｔ ＣＴＣ ＣＴＴＴＣＴ ＧＴＣ ＴＡＧ ＡＡＣ
ＡＧＧ ＣＧＧ ＧＧＴ ＴＧＣおよび２）5'−ＧＧＣ
ＣＡＧ ＧＣＣ ＴＧＧ ＣＴＡ ＴＴＧ ＡＣＧ
ＡＣＡ ＧＣＴ ＡＴＧ ＣＴＴである。StuIおよびPm
lIによるＤＮＡの消化は平滑末端を生むので、ｐＢＩＯ
２８９のPmlIによる消化はStuI／PmlI消化ＰＣＲ断片の
導入を可能にする。一方の配向をとるとbioI開始コドン
にPmlI部位が再生され、ＳＰ０１−１５プロモーターは
bioIとＯＲＦ２の転写を発動させる。この方向性をもっ
たプラスミドをｐＢＩＯ１８２と名付けた。新しい3'カ
セット (ｐＢＩＯ１８４）はｐＢＩＯ１８２のBamHＩ−
EcoRＩ断片をｐＢＩＯ１４６Ａにクローニングすること
により構築した。この構築物は、bioBとbioIの間のター
ミネーターの除去によって生ずるものよりも、bioIおよ
びＯＲＦ２のより大きな転写を生ずることが期待され
る。
【０１４８】ＳＰ０１−１５駆動bioI構築物のＢＩ２９
４の染色体コピーへの導入は、直線化したｐＢＩ０１８
２によるＢＩ３００の形質転換 (前述) に続いて Bio+
について選択し、ＢＩ３０４を得ることによって行われ
た。組込みと増幅によりＢＩ３０８が得られた。
４の染色体コピーへの導入は、直線化したｐＢＩ０１８
２によるＢＩ３００の形質転換 (前述) に続いて Bio+
について選択し、ＢＩ３０４を得ることによって行われ
た。組込みと増幅によりＢＩ３０８が得られた。
【０１４９】XIＢiii. 単一コピーターミネーター改変
株によるビオチン生産 ビオチンおよびビタマーは、ラクトバシラスとサッカロ
ミセスを用い、実施例VIIIＡに述べたように、試験管培
養によって定量した。bioBとbioIの間のターミネーター
を欠失したＢＩ３０３、およびbioIの前にＳＰ０１−１
５プロモーターを導入したＢＩ３０４に対する対照とし
てＢＩ２９４を用いた。表１６に示したように、ターミ
ネーターの欠失またはbioIの前へのＳＰ０１−15プロモ
ーターの導入は、ビオチンの力価にはほとんど影響を与
えないが、ビオチンビタマーの生産を劇的に上昇させ
る。
株によるビオチン生産 ビオチンおよびビタマーは、ラクトバシラスとサッカロ
ミセスを用い、実施例VIIIＡに述べたように、試験管培
養によって定量した。bioBとbioIの間のターミネーター
を欠失したＢＩ３０３、およびbioIの前にＳＰ０１−１
５プロモーターを導入したＢＩ３０４に対する対照とし
てＢＩ２９４を用いた。表１６に示したように、ターミ
ネーターの欠失またはbioIの前へのＳＰ０１−15プロモ
ーターの導入は、ビオチンの力価にはほとんど影響を与
えないが、ビオチンビタマーの生産を劇的に上昇させ
る。
【０１５０】
【表１６】
【０１５１】 XIＣ. bio 遺伝子リボソーム結合部位の改変 bio オペロンの遺伝子の翻訳は、リボソーム結合部位
を、配列５'ＡＧＡＡＡＧＧＡＧＧＴＧＡ３'をもつ標準
的な枯草菌のリボソーム結合部位に近いものに一致させ
ることによって改善できる。このような変更は、適当な
制限部位をコードし、改変したリボソーム結合部位、お
よびＰＣＲ反応のプライミングを確保するために必要な
十分な下流ＤＮＡをコードするＤＮＡプライマーの合成
によって導入することができる。適当な第２のプライマ
ーを選ぶことによって、当業者は、改変されたリボソー
ム結合部位を含むＰＣＲ産物を合成することができる。
この改変したリボソーム結合部位をもつＰＣＲ断片は、
次に実施例XIＢi で述べた、改変したＣＲＳ配列を導入
するのに用いたと同じ方法によって、操作される bioオ
ペロンへと導入することができる。
を、配列５'ＡＧＡＡＡＧＧＡＧＧＴＧＡ３'をもつ標準
的な枯草菌のリボソーム結合部位に近いものに一致させ
ることによって改善できる。このような変更は、適当な
制限部位をコードし、改変したリボソーム結合部位、お
よびＰＣＲ反応のプライミングを確保するために必要な
十分な下流ＤＮＡをコードするＤＮＡプライマーの合成
によって導入することができる。適当な第２のプライマ
ーを選ぶことによって、当業者は、改変されたリボソー
ム結合部位を含むＰＣＲ産物を合成することができる。
この改変したリボソーム結合部位をもつＰＣＲ断片は、
次に実施例XIＢi で述べた、改変したＣＲＳ配列を導入
するのに用いたと同じ方法によって、操作される bioオ
ペロンへと導入することができる。
【０１５２】実施例XII. 枯草菌のアゼライン酸耐性
( Azlr ) 変異株 直鎖Ｃ9 ジカルボン酸であるアゼライン酸は、ピメリン
酸の同族体であり、オレイン酸からピメリン酸への転化
の中間体であると考えられている (Ohsugi andInoue.,
Agric. Biol. Chem. 45, 2355-2356 (1981)参照) 。１
ｇ／ｌのピメリン酸は枯草菌におけるビオチンビタマー
の生産を促進し、30mg／ｌのピメリン酸は野生株の増殖
をＰＹ７９ bioＩ:: cat9 栄養緩慢株（bradytroph）へ
と回復させる。 (実施例III参照) 30mg／ｌのアゼライ
ン酸は、ＰＹ７９ bioＩ:: cat9の増殖を支持する上
で、ピメリン酸の代わりに使用できない。実際、30mg／
ｌのアゼライン酸はＰＹ７９ bioＩ:: cat9 の増殖を著
しく阻害する。より高濃度のアゼライン酸は野生株の枯
草菌の増殖を阻害し、この阻害は１μｇ／ｌのビオチン
の添加によって打ち消される。これらの結果から、本発
明者らは枯草菌においてアゼライン酸はビオチン生合成
の特異的な阻害剤であると考えた。
( Azlr ) 変異株 直鎖Ｃ9 ジカルボン酸であるアゼライン酸は、ピメリン
酸の同族体であり、オレイン酸からピメリン酸への転化
の中間体であると考えられている (Ohsugi andInoue.,
Agric. Biol. Chem. 45, 2355-2356 (1981)参照) 。１
ｇ／ｌのピメリン酸は枯草菌におけるビオチンビタマー
の生産を促進し、30mg／ｌのピメリン酸は野生株の増殖
をＰＹ７９ bioＩ:: cat9 栄養緩慢株（bradytroph）へ
と回復させる。 (実施例III参照) 30mg／ｌのアゼライ
ン酸は、ＰＹ７９ bioＩ:: cat9の増殖を支持する上
で、ピメリン酸の代わりに使用できない。実際、30mg／
ｌのアゼライン酸はＰＹ７９ bioＩ:: cat9 の増殖を著
しく阻害する。より高濃度のアゼライン酸は野生株の枯
草菌の増殖を阻害し、この阻害は１μｇ／ｌのビオチン
の添加によって打ち消される。これらの結果から、本発
明者らは枯草菌においてアゼライン酸はビオチン生合成
の特異的な阻害剤であると考えた。
【０１５３】野生型の大腸菌株ＭＭ２９４は比較的アゼ
ライン酸に耐性である。枯草菌由来のbioW遺伝子のみを
含むｐＢＩＯ４０３をもつ、大腸菌ＰＹ６０４ (Δbio
H) はビオチンに対する栄養要求性をもつが、この要求
性は30mg／ｌのピメリン酸によって満足される。しか
し、過剰のピメリン酸 (80mg／ｌ) の存在下で増殖した
ＲＹ６０４／ｐＢＩＯ４０３は、アゼライン酸による阻
害に感受性をもつ。したがって、本発明者らは、アゼラ
イン酸は、ピメリン酸の拮抗阻害剤として、あるいはビ
オチン類似体または他の毒性の中間体にとり込まれるこ
とによって、ピメリル CoAシンセターゼ (bioW) のレベ
ルで作用すると結論した。
ライン酸に耐性である。枯草菌由来のbioW遺伝子のみを
含むｐＢＩＯ４０３をもつ、大腸菌ＰＹ６０４ (Δbio
H) はビオチンに対する栄養要求性をもつが、この要求
性は30mg／ｌのピメリン酸によって満足される。しか
し、過剰のピメリン酸 (80mg／ｌ) の存在下で増殖した
ＲＹ６０４／ｐＢＩＯ４０３は、アゼライン酸による阻
害に感受性をもつ。したがって、本発明者らは、アゼラ
イン酸は、ピメリン酸の拮抗阻害剤として、あるいはビ
オチン類似体または他の毒性の中間体にとり込まれるこ
とによって、ピメリル CoAシンセターゼ (bioW) のレベ
ルで作用すると結論した。
【０１５４】 XIIＡ. 枯草菌のアゼライン酸耐性変異株の単離 最少寒天培地上、２ｇ／ｌ (約10-2Ｍ) のアゼライン酸
は、殺菌的に作用したり、増殖を完全に妨げたりはしな
いが、ＰＹ７９の増殖を著しく阻害する。２ｇ／ｌのア
ゼライン酸の存在下で、ＰＹ７９のバックグラウンドよ
りも増殖をみせる７つの自然発生突然変異体を分離し
た。アゼライン酸に対する耐性は一つの場合 (下記参
照) を除く、すべての場合に安定した形質のようであっ
た。７株の変異株を暫定的にＰＡ１−ＰＡ７（PY79アゼ
ライン酸耐性) と命名した。ＰＡ１からＰＡ７までをＶ
Ｙ培地を用いて試験管中で培養し、指示大腸菌を用いて
ビオチン生産を定量した (表15) 。変異株は二つのクラ
スに類別される。ＰＹ７９よりも大量にビオチンを生産
する株（ＰＡ５，ＰＡ６）および生産量がＰＹ７９と同
程度の株（ＰＡ１，２，３および７）である。ＰＡ４の
性質は不安定または真の変異株ではないように見られた
ので、その後の検討は行わなかった。本発明者らはま
た、変異株が２ｇ／ｌのアゼライン酸を含む最少寒天培
地上のコロニーの大きさに関して２つのクラスに類別さ
れること、およびこの２つのクラスがビオチン生産につ
いて類別したクラスと一致していることを認めた（表1
1）。培養液上清中にビオチンを最も多量にもつ変異株
（ＰＡ５およびＰＡ６）は小さいコロニーを、ビオチン
非分泌型のＰＡ１，２，３および７は大きなコロニーを
形成する。ＰＡ１およびＰＡ３はＰＹ７９を栄養共生さ
せる（すなわち、ＰＹ７９にたいするアゼライン酸の阻
害効果を打ち消す）化合物を、２ｇ／ｌのアゼライン酸
を含む最少培地上に分泌する。
は、殺菌的に作用したり、増殖を完全に妨げたりはしな
いが、ＰＹ７９の増殖を著しく阻害する。２ｇ／ｌのア
ゼライン酸の存在下で、ＰＹ７９のバックグラウンドよ
りも増殖をみせる７つの自然発生突然変異体を分離し
た。アゼライン酸に対する耐性は一つの場合 (下記参
照) を除く、すべての場合に安定した形質のようであっ
た。７株の変異株を暫定的にＰＡ１−ＰＡ７（PY79アゼ
ライン酸耐性) と命名した。ＰＡ１からＰＡ７までをＶ
Ｙ培地を用いて試験管中で培養し、指示大腸菌を用いて
ビオチン生産を定量した (表15) 。変異株は二つのクラ
スに類別される。ＰＹ７９よりも大量にビオチンを生産
する株（ＰＡ５，ＰＡ６）および生産量がＰＹ７９と同
程度の株（ＰＡ１，２，３および７）である。ＰＡ４の
性質は不安定または真の変異株ではないように見られた
ので、その後の検討は行わなかった。本発明者らはま
た、変異株が２ｇ／ｌのアゼライン酸を含む最少寒天培
地上のコロニーの大きさに関して２つのクラスに類別さ
れること、およびこの２つのクラスがビオチン生産につ
いて類別したクラスと一致していることを認めた（表1
1）。培養液上清中にビオチンを最も多量にもつ変異株
（ＰＡ５およびＰＡ６）は小さいコロニーを、ビオチン
非分泌型のＰＡ１，２，３および７は大きなコロニーを
形成する。ＰＡ１およびＰＡ３はＰＹ７９を栄養共生さ
せる（すなわち、ＰＹ７９にたいするアゼライン酸の阻
害効果を打ち消す）化合物を、２ｇ／ｌのアゼライン酸
を含む最少培地上に分泌する。
【０１５５】２つのクラスのアゼライン酸耐性変異株の
代表として、ＰＡ３およびＰＡ６を選び、さらに性質を
検討した。アゼライン酸の連続希釈を含む液体最少培地
中で、ＰＡ３およびＰＡ６は、親株ＰＹ７９と比較して
明らかなアゼライン酸に対する耐性を示す（図21）。し
かし、ＰＡ３およびＰＡ６の用量反応曲線は互いにはっ
きりと異なっている。ＰＡ３はＰＡ６よりも大きな耐性
を示し、低濃度のアゼライン酸の存在下では、ＰＡ６は
ＰＡ３またはＰＹ７９と同じ細胞濃度までは増殖できな
い。
代表として、ＰＡ３およびＰＡ６を選び、さらに性質を
検討した。アゼライン酸の連続希釈を含む液体最少培地
中で、ＰＡ３およびＰＡ６は、親株ＰＹ７９と比較して
明らかなアゼライン酸に対する耐性を示す（図21）。し
かし、ＰＡ３およびＰＡ６の用量反応曲線は互いにはっ
きりと異なっている。ＰＡ３はＰＡ６よりも大きな耐性
を示し、低濃度のアゼライン酸の存在下では、ＰＡ６は
ＰＡ３またはＰＹ７９と同じ細胞濃度までは増殖できな
い。
【０１５６】 XIIＢ. アゼライン酸耐性変異株のマッピング ＰＡ３およびＰＡ６におけるアゼライン酸耐性変異をマ
ッピングするために、本発明者らはそれぞれの変異がbi
rAまたはビオチンオペロンに位置するかどうかを調べ
た。最初のケースでは、ＰＡ３およびＰＡ６から得たＰ
ＢＳ１形質導入溶菌液を、ＲＬ１（trpC２）に対して用
い Trp+ 形質導入体を選択した。trpC２およびbirA座位
は形質導入により約90％の連鎖をもつ。 Trp+ 形質導入
体は次いで２ｇ／ｌのアゼライン酸を含む最少寒天培地
上にパッチを行い、アゼライン酸耐性をスクリーニング
した。どの Trp+ 形質導入体もアゼライン酸耐性ではな
く、どちらの変異もtrpC２に連鎖しておらず、したがっ
てまたどちらもbirA変異ではないことが示された。ＰＡ
３変異は二つの形質導入（一つはＰＹ７９Ｐbio ::cat1
7 への、他はＰＹ７９bioW::cat７への）で bioに対す
る強い連鎖を示したが、ＰＡ６変異ではそのような連鎖
を示さなかった。
ッピングするために、本発明者らはそれぞれの変異がbi
rAまたはビオチンオペロンに位置するかどうかを調べ
た。最初のケースでは、ＰＡ３およびＰＡ６から得たＰ
ＢＳ１形質導入溶菌液を、ＲＬ１（trpC２）に対して用
い Trp+ 形質導入体を選択した。trpC２およびbirA座位
は形質導入により約90％の連鎖をもつ。 Trp+ 形質導入
体は次いで２ｇ／ｌのアゼライン酸を含む最少寒天培地
上にパッチを行い、アゼライン酸耐性をスクリーニング
した。どの Trp+ 形質導入体もアゼライン酸耐性ではな
く、どちらの変異もtrpC２に連鎖しておらず、したがっ
てまたどちらもbirA変異ではないことが示された。ＰＡ
３変異は二つの形質導入（一つはＰＹ７９Ｐbio ::cat1
7 への、他はＰＹ７９bioW::cat７への）で bioに対す
る強い連鎖を示したが、ＰＡ６変異ではそのような連鎖
を示さなかった。
【０１５７】 XIIＣ. ビオチン生産へのアゼライン酸耐性変異の影響 ビオチン生産の調節を変えるもう一つの方法はアゼライ
ン酸耐性変異のいずれかをbirA変異と結びつけることで
ある。ＨＢ３またはα−ＤＢ１６からのbirA変異をＰＡ
３またはＰＡ６のいずれかへ２段階の形質導入過程を経
て導入した。最初にＰＡ３およびＰＡ６を trpE ::Tn91
7 lac ［Perleins and Youngman, Proc. Natl. Acad. S
ci. USA 83, 140-143(1986)］による形質導入を行いエ
リスロマイシン耐性で選択することによって Trp- とし
た。birA変異はＨＢ３またはα−ＤＢ１６から Trp+ を
選択することによって導入された。親株および Trp+ 形
質導入体をホモビオチン耐性およびアゼライン酸耐性に
ついてスクリーニングした。ＰＡ６はホモビオチン感受
性であり、そのため、２重変異株は Trp+ 形質導入体の
なかから、ホモビオチン耐性のコロニーをスクリーニン
グすることによって同定できた。 Trp+ 形質導入体のう
ちの約60％だけがホモビオチン耐性でもあった (これは
形質導入によると通常90％連鎖であるbirAとtrpEとの間
のマップ距離がTn917 によって乱されたためであろ
う）。ＰＡ３はホモビオチンに耐性であり、このため２
重変異株の直接の同定は可能ではなかった。しかし、以
下に述べるようにビオチン分泌の増大から判断して、形
質導入体の60％が２重変異株であった。
ン酸耐性変異のいずれかをbirA変異と結びつけることで
ある。ＨＢ３またはα−ＤＢ１６からのbirA変異をＰＡ
３またはＰＡ６のいずれかへ２段階の形質導入過程を経
て導入した。最初にＰＡ３およびＰＡ６を trpE ::Tn91
7 lac ［Perleins and Youngman, Proc. Natl. Acad. S
ci. USA 83, 140-143(1986)］による形質導入を行いエ
リスロマイシン耐性で選択することによって Trp- とし
た。birA変異はＨＢ３またはα−ＤＢ１６から Trp+ を
選択することによって導入された。親株および Trp+ 形
質導入体をホモビオチン耐性およびアゼライン酸耐性に
ついてスクリーニングした。ＰＡ６はホモビオチン感受
性であり、そのため、２重変異株は Trp+ 形質導入体の
なかから、ホモビオチン耐性のコロニーをスクリーニン
グすることによって同定できた。 Trp+ 形質導入体のう
ちの約60％だけがホモビオチン耐性でもあった (これは
形質導入によると通常90％連鎖であるbirAとtrpEとの間
のマップ距離がTn917 によって乱されたためであろ
う）。ＰＡ３はホモビオチンに耐性であり、このため２
重変異株の直接の同定は可能ではなかった。しかし、以
下に述べるようにビオチン分泌の増大から判断して、形
質導入体の60％が２重変異株であった。
【０１５８】親株、ＰＡ３ birＡ２重変異の候補株、お
よび実際のＰＡ６ birA 変異株について、ＶＹ試験管培
養を用いたビオチンおよびビタマー生産の試験を行っ
た。表18に示すように、ＰＡ３由来の２重変異株はbirA
親株に比較して４から６倍多量のビタマーおよび２倍多
量のビオチンを生産した。ＰＡ６に由来する２重変異株
はbirA親株に比較して、同程度またはほんのわずかに多
いビオチンおよびビタマーを生産した。明らかに、ＰＡ
３変異は調節解除された株におけるビオチン生産を助け
ている。
よび実際のＰＡ６ birA 変異株について、ＶＹ試験管培
養を用いたビオチンおよびビタマー生産の試験を行っ
た。表18に示すように、ＰＡ３由来の２重変異株はbirA
親株に比較して４から６倍多量のビタマーおよび２倍多
量のビオチンを生産した。ＰＡ６に由来する２重変異株
はbirA親株に比較して、同程度またはほんのわずかに多
いビオチンおよびビタマーを生産した。明らかに、ＰＡ
３変異は調節解除された株におけるビオチン生産を助け
ている。
【０１５９】XIIＤ. 他のアゼライン酸耐性変異株 ＰＡ３およびＰＡ６によっで代表されるタイプのアゼラ
イン酸耐性変異株に加えて、少なくとも２つの新たなク
ラスに類別されるいくつかのアゼライン酸耐性変異株
が、ＰＹ７９株のバックグラウンドからの自然発生突然
変異体として単離された。
イン酸耐性変異株に加えて、少なくとも２つの新たなク
ラスに類別されるいくつかのアゼライン酸耐性変異株
が、ＰＹ７９株のバックグラウンドからの自然発生突然
変異体として単離された。
【０１６０】アゼライン酸耐性変異がbirAまたは bioオ
ペロンと連鎖しているかどうかを決定するために、上に
述べた形質導入によってさらに11の変異株を部分的にマ
ッピングした。どれもがtrpC２とは連鎖しておらず、従
ってどの変異もbirA座位には位置しないことになる。し
かし、調べた11の変異のなかで８つが bioオペロンと連
鎖していた。これら８変異のうち２つがＰＡ３がそうで
あったように bioプロモーターと密接に連鎖していた一
方、６つは bioプロモーターとの連鎖が 100％よりは実
質的に小さく、変異は bioプロモーターよりもたしかに
下流のbio オペロンにあることを示唆している。このよ
うにこの後者の６変異株のグループは、ＰＡ３とＰＡ６
とも異なる、別のクラスのアゼライン酸耐性変異を提示
するものである。このグループはＢＩ５１４，ＢＩ５２
１，ＢＩ５３２，ＢＩ５３５，ＢＩ５３７およびＢＩ５
４５を含む。このグループの変異株は、たとえばbioIま
たはbioW変異株のように、ピメリン酸の生産または利用
能力の増大した変異株を含む可能性がある。
ペロンと連鎖しているかどうかを決定するために、上に
述べた形質導入によってさらに11の変異株を部分的にマ
ッピングした。どれもがtrpC２とは連鎖しておらず、従
ってどの変異もbirA座位には位置しないことになる。し
かし、調べた11の変異のなかで８つが bioオペロンと連
鎖していた。これら８変異のうち２つがＰＡ３がそうで
あったように bioプロモーターと密接に連鎖していた一
方、６つは bioプロモーターとの連鎖が 100％よりは実
質的に小さく、変異は bioプロモーターよりもたしかに
下流のbio オペロンにあることを示唆している。このよ
うにこの後者の６変異株のグループは、ＰＡ３とＰＡ６
とも異なる、別のクラスのアゼライン酸耐性変異を提示
するものである。このグループはＢＩ５１４，ＢＩ５２
１，ＢＩ５３２，ＢＩ５３５，ＢＩ５３７およびＢＩ５
４５を含む。このグループの変異株は、たとえばbioIま
たはbioW変異株のように、ピメリン酸の生産または利用
能力の増大した変異株を含む可能性がある。
【０１６１】新しい変異株のうちの３株はbirAにも bio
オペロンにもマッピングされなかった。このグループは
ＢＩ５２３，ＢＩ５４４，およびＢＩ５４９を含み、ピ
メリン酸の前駆体の生産量が増大しているか、またはさ
まざまなビオチン前駆体をより効率よくビオチンに転化
する変異株を含む可能性がある。これらのグループのい
ずれもＰＡ６とは同じ性質を示さなかった。なぜならば
ＰＡ６とはちがって、これらはすべてアゼライン酸を欠
く最少培地中でＰＹ７９（野生株）と同じ細胞濃度にま
で増殖するからである。
オペロンにもマッピングされなかった。このグループは
ＢＩ５２３，ＢＩ５４４，およびＢＩ５４９を含み、ピ
メリン酸の前駆体の生産量が増大しているか、またはさ
まざまなビオチン前駆体をより効率よくビオチンに転化
する変異株を含む可能性がある。これらのグループのい
ずれもＰＡ６とは同じ性質を示さなかった。なぜならば
ＰＡ６とはちがって、これらはすべてアゼライン酸を欠
く最少培地中でＰＹ７９（野生株）と同じ細胞濃度にま
で増殖するからである。
【０１６２】新しい変異株を表19にまとめた。いずれも
それ自身でビオチン生産の有意な増大をもたらさない
が、これらの変異は、ＰＡ３の場合がそうであるよう
に、他のビオチン（生産）調節解除変異と結びついたと
きにビオチン生産が増大する可能性がある。本発明者ら
は1994年５月４日、ブダペスト条約の条項と規約のもと
で、菌株ＰＡ３，ＨＢ４３，ＨＢ３，ＢＩ５４４，ＢＩ
５３５，ＢＩ４２１，ＢＩ３０４，ＢＩ２８２およびＢ
Ｉ２７４を米国メリーランド州ロックヴィルの America
n Type Culture Collection (ATCC)に寄託し、それぞれ
に対し受託番号ATCC 55567,55568, 55569, 55570, 5557
1, 55572, 55573, 55574 および55575 を受取った。
それ自身でビオチン生産の有意な増大をもたらさない
が、これらの変異は、ＰＡ３の場合がそうであるよう
に、他のビオチン（生産）調節解除変異と結びついたと
きにビオチン生産が増大する可能性がある。本発明者ら
は1994年５月４日、ブダペスト条約の条項と規約のもと
で、菌株ＰＡ３，ＨＢ４３，ＨＢ３，ＢＩ５４４，ＢＩ
５３５，ＢＩ４２１，ＢＩ３０４，ＢＩ２８２およびＢ
Ｉ２７４を米国メリーランド州ロックヴィルの America
n Type Culture Collection (ATCC)に寄託し、それぞれ
に対し受託番号ATCC 55567,55568, 55569, 55570, 5557
1, 55572, 55573, 55574 および55575 を受取った。
【０１６３】
【表17】
【０１６４】
【表18】
【０１６５】
【表19】
【０１６６】
配列番号：１ 配列の長さ：8478 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列
【０１６７】
【化１】
【０１６８】
【０１６９】
【０１７０】
【０１７１】
【０１７２】配列番号：２ 配列の長さ：29 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列
【０１７３】
【化２】
【０１７４】配列番号：３ 配列の長さ：29 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列
【０１７５】
【化３】
【０１７６】配列番号：４ 配列の長さ：30 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列
【０１７７】
【化４】
【０１７８】配列番号：５ 配列の長さ：29 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列
【０１７９】
【化５】
【０１８０】配列番号：６ 配列の長さ：29 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列
【０１８１】
【化６】
【０１８２】配列番号：７ 配列の長さ：300 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列
【０１８３】
【化７】
【０１８４】配列番号：８ 配列の長さ：36 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列
【０１８５】
【化８】
【０１８６】配列番号：９ 配列の長さ：40 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列
【０１８７】
【化９】
【０１８８】配列番号：10 配列の長さ：38 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列
【０１８９】
【化10】
【０１９０】配列番号：11 配列の長さ：24 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列
【０１９１】
【化11】
【０１９２】配列番号：12 配列の長さ：35 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列
【０１９３】
【化12】
【０１９４】配列番号：13 配列の長さ：24 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列
【０１９５】
【化13】
【０１９６】配列番号：14 配列の長さ：28 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列
【０１９７】
【化14】
【０１９８】配列番号：15 配列の長さ：28 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列
【０１９９】
【化15】
【０２００】配列番号：16 配列の長さ：9 配列の型：アミノ酸 鎖の数： トポロジー：直鎖状 配列
【０２０１】
【化16】
【０２０２】配列番号：17 配列の長さ：21 配列の型：アミノ酸 鎖の数： トポロジー：直鎖状 配列
【０２０３】
【化17】
【図１】B. sphaericus のビオチン合成経路の説明図で
ある。
ある。
【図２】大腸菌、B. sphaericus 、およびB. subtilis
のビオチン遺伝子の構成を示す模式図である。
のビオチン遺伝子の構成を示す模式図である。
【図３】バシラス属に関係した系統発生的一貫性のなさ
を示す図である。
を示す図である。
【図４】ORF4-5リーディング・フレームの終結のアミノ
酸翻訳（配列番号：16）およびbioWリーディング・フレ
ームの開始のアミノ酸翻訳（配列番号：17）を含むB. s
ubtilis bio プロモーター領域のヌクレオチド配列（配
列番号：７）を示す図である。
酸翻訳（配列番号：16）およびbioWリーディング・フレ
ームの開始のアミノ酸翻訳（配列番号：17）を含むB. s
ubtilis bio プロモーター領域のヌクレオチド配列（配
列番号：７）を示す図である。
【図５】B. subtilis ビオチンオペロンの物理的地図で
ある。
ある。
【図６】B. subtilis ビオチンオペロンの転写を示す地
図である。
図である。
【図７】ｐＢＩＯプラスミドについての制限酵素部位お
よび相補性の結果を示す図である。
よび相補性の結果を示す図である。
【図８】ｐＢＩＯ 201の欠失体およびサブクローンを用
いた相補性の結果を示す図である。
いた相補性の結果を示す図である。
【図９】B. subtilis bio プロモーター領域の物理的地
図である。
図である。
【図10】B. subtilis bioW、ORF2およびORF3の内部の c
at（クロラムフェニコール−アセチルトランスフェラー
ゼ）挿入変異の位置およびBio 表現型を示す図である。
at（クロラムフェニコール−アセチルトランスフェラー
ゼ）挿入変異の位置およびBio 表現型を示す図である。
【図11】B. subtilis bio プロモーター領域、ORF4-5お
よびORF6の内部の cat挿入変異の位置およびBio 表現型
を示す図である。
よびORF6の内部の cat挿入変異の位置およびBio 表現型
を示す図である。
【図12】B. sphaericus bioDAYB 調節領域（配列番号：
８）とB. subtilis bio プロモーター領域（配列番号：
９）のヌクレオチド配列の比較を示す図である。
８）とB. subtilis bio プロモーター領域（配列番号：
９）のヌクレオチド配列の比較を示す図である。
【図13】５’−ビオチンオペロンカセットのために導入
された制限部位を示す図である。１．上流の相同領域、
ターミネーター；２．プロモーター、オペレーター、リ
ーダー；３．リボソーム結合部位、開始コドン、5'-bio
W 。
された制限部位を示す図である。１．上流の相同領域、
ターミネーター；２．プロモーター、オペレーター、リ
ーダー；３．リボソーム結合部位、開始コドン、5'-bio
W 。
【図14】５’−bio カセットのための次のＰＣＲプライ
マーの向きおよび配列を示す図である：ORF4.1（配列番
号：10）、BIOL5'（配列番号：11）、Leader1 （配列番
号：12）、ANEB1224（配列番号：13）、BIOL3 （配列番
号：14）、およびBIOL4（配列番号：15）。
マーの向きおよび配列を示す図である：ORF4.1（配列番
号：10）、BIOL5'（配列番号：11）、Leader1 （配列番
号：12）、ANEB1224（配列番号：13）、BIOL3 （配列番
号：14）、およびBIOL4（配列番号：15）。
【図15】ｐＢＩＯ 144の構築の説明図である。
【図16】B. subtilis ビオチンオペロンのＤＮＡ配列お
よびそのフランキング配列（配列番号：１）を示す図で
ある。
よびそのフランキング配列（配列番号：１）を示す図で
ある。
【図17】種々の発酵ブロスのビタマースペクトルを示す
図である。
図である。
【図18】bioWのイン−フレーム (in-frame) 欠失を示す
図である。
図である。
【図19】bioWの異化産物抑制配列の要素を示す図であ
る。
る。
【図20】bioBとbioIの間で欠失されたターミネーター領
域を示す図である。
域を示す図である。
【図21】菌株ＰＡ３およびＰＡ６のアゼライン酸耐性を
示すグラフである。
示すグラフである。
【図22】菌株BI535 およびBI544 のアゼライン酸耐性を
示すグラフである。
示すグラフである。
【手続補正書】
【提出日】平成６年１１月９日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図１７
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１７】 種々の発酵ブロスのビタマースペクトルを
示す電気泳動の写真である。
示す電気泳動の写真である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:125） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 17/18 Ｃ１２Ｒ 1:125） (Ｃ１２Ｐ 17/18 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 ジョン ビー．パーキンス アメリカ合衆国 01867 マサチューセッ ツ州 リーディング， ホプキンス スト リート 66 (72)発明者 ジャニス ジー．ペロ アメリカ合衆国 02173 マサチューセッ ツ州 レキシントン， ソロモン ピアー ス ロード 20 (72)発明者 アール．ロジャース ヨカム アメリカ合衆国 02173 マサチューセッ ツ州 レキシントン， オーチャード レ ーン ４
Claims (30)
- 【請求項１】 次の群： (a) 枯草菌または枯草菌に密接に関連した種のビオチン
生合成酵素をコードする遺伝子のＤＮＡ配列； (b) (a) の生物学的に活性な断片をコードするＤＮＡ配
列；および (c) (a) または(b) に実質的に相同なＤＮＡ配列；から
選ばれるＤＮＡ配列を含むＤＮＡ。 - 【請求項２】 前記の遺伝子が bioA, bioB, bioD, bio
F, bioW, bioI および ORF2 よりなる群から選ばれる、
請求項１記載のＤＮＡ。 - 【請求項３】 前記の遺伝子が枯草菌またはその密接に
関連した種の bioAである、請求項１記載のＤＮＡ。 - 【請求項４】 前記の遺伝子が枯草菌またはその密接に
関連した種の bioBである、請求項１記載のＤＮＡ。 - 【請求項５】 前記の遺伝子が枯草菌またはその密接に
関連した種の bioIである、請求項１記載のＤＮＡ。 - 【請求項６】 前記のＤＮＡ配列が転写プロモーターに
機能しうる状態で連結されている、請求項１〜５のいず
れか１つに記載のＤＮＡ。 - 【請求項７】 少なくとも２つの前記のＤＮＡ配列を含
む、請求項１〜６のいずれか１つに記載のＤＮＡ。 - 【請求項８】 前記のＤＮＡ配列の第１のものが第１の
転写プロモーターに機能しうる状態で連結されており、
前記のＤＮＡ配列の第２のものが第２の転写プロモータ
ーに機能しうる状態で連結されている、請求項７記載の
ＤＮＡ。 - 【請求項９】 前記プロモーターの少なくとも１つが構
成プロモーターである、請求項８記載のＤＮＡ。 - 【請求項10】 前記の構成プロモーターがＳＰ０１バク
テリオファージに由来するものである、請求項９記載の
ＤＮＡ。 - 【請求項11】 前記の第１ＤＮＡ配列が枯草菌またはそ
の密接に関連した種の bioA, bioB, bioD, bioF および
bioW よりなる群から選ばれる遺伝子のＤＮＡ配列であ
り、前記の第２ＤＮＡ配列が枯草菌またはその密接に関
連した種の bioI のＤＮＡ配列である、請求項８記載の
ＤＮＡ。 - 【請求項12】 少なくとも次のＤＮＡ配列、すなわちbi
oA、bioB、または bioA と bioB の両方が前記の第２プ
ロモーターに機能しうる状態で連結されている、請求項
８または11記載のＤＮＡ。 - 【請求項13】 前記の転写プロモーターに機能しうる状
態で連結された、枯草菌またはその密接に関連した種の
ビオチンオペロンのＤＮＡ配列を含む、請求項６記載の
ＤＮＡ。 - 【請求項14】 枯草菌またはその密接に関連した種のビ
オチンオペロンの調節部位を含み、該調節部位を野生型
ＤＮＡに対して変異させてあり、該調節部位がオペレー
ター、プロモーター、転写終結部位、ｍＲＮＡプロセシ
ング部位、リボソーム結合部位および異化産物抑制部位
よりなる群から選ばれ、該変異が挿入、置換または欠失
のいずれかである、請求項１〜13のいずれか１つに記載
のＤＮＡ。 - 【請求項15】 請求項１〜14のいずれか１つに記載のＤ
ＮＡを含むベクター。 - 【請求項16】 請求項15のベクターまたは請求項１〜14
のいずれか１つに記載のＤＮＡを含む細胞。 - 【請求項17】 前記の細胞内で前記ＤＮＡが高コピー数
に増幅される、請求項16記載の細胞。 - 【請求項18】 前記ＤＮＡが前記細胞の染色体に安定し
た状態で組み込まれている、請求項16記載の細胞。 - 【請求項19】 前記ＤＮＡが前記細胞の染色体において
高コピー数に増幅される、請求項18記載の細胞。 - 【請求項20】 前記ＤＮＡが前記染色体の bio遺伝子座
に組み込まれている、請求項18または19記載の細胞。 - 【請求項21】 前記ＤＮＡが前記染色体の２以上の部位
に組み込まれている、請求項18〜20のいずれか１つに記
載の細胞。 - 【請求項22】 前記ＤＮＡの存在に加えて、ビオチンま
たはビオチン前駆体の生産を調節解除する変異により特
徴づけられる、請求項16〜21のいずれか１つに記載の細
胞。 - 【請求項23】 前記ＤＮＡを欠く野生型細胞と比較して
増加した量のビオチンを産生する、請求項16〜22のいず
れか１つに記載の細胞。 - 【請求項24】 アゼライン酸耐性を付与する変異を含
む、請求項22記載の細胞。 - 【請求項25】 bioAにおいて変異させてある、請求項22
記載の細胞。 - 【請求項26】 枯草菌またはその密接に関連した種であ
る、請求項16〜25のいずれか１つに記載の細胞。 - 【請求項27】 大腸菌である、請求項16〜25のいずれか
１つに記載の細胞。 - 【請求項28】 請求項１〜５のいずれか１つに記載のＤ
ＮＡによりコードされる組換えタンパク質。 - 【請求項29】 次の段階： (a) 請求項16〜27のいずれか１つに記載の細胞を用意す
ること； (b) ビオチンまたはその前駆体の合成を可能にする時間
および条件のもとで該細胞を培養すること；そして (c) ビオチンまたはその前駆体を単離すること；を含む
ビオチンまたはその前駆体の生産方法。 - 【請求項30】 ビオチンまたはその前駆体が前記の宿主
細胞から分泌され、該宿主細胞の細胞外培地より単離さ
れる、請求項29記載の方法。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US8470993A | 1993-06-25 | 1993-06-25 | |
| US84709 | 1993-06-25 | ||
| US23943094A | 1994-05-06 | 1994-05-06 | |
| US239430 | 1994-05-06 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07231789A true JPH07231789A (ja) | 1995-09-05 |
| JP3593146B2 JP3593146B2 (ja) | 2004-11-24 |
Family
ID=26771329
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP14367294A Expired - Fee Related JP3593146B2 (ja) | 1993-06-25 | 1994-06-24 | 枯草菌でのビオチンの生合成 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US6057136A (ja) |
| EP (1) | EP0635572A3 (ja) |
| JP (1) | JP3593146B2 (ja) |
| CN (1) | CN100366745C (ja) |
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