CN112176010B - 一种促进生物素合成的方法、促进生物素合成的重组细胞和基因工程菌 - Google Patents

一种促进生物素合成的方法、促进生物素合成的重组细胞和基因工程菌 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种促进生物素合成的方法，促进生物素合成的重组细胞和基因工程菌，该方法通过引入枯草芽孢杆菌168(Bacillus subtilis 168)来源的编码庚二酸辅酶A合成酶基因bioW和能够裂解长链脂肪酰基‑ACP的P450氧化酶基因bioI来强化生物素前体庚二酸硫酯的供应，促进下游生物素合成基因bioAFDB对生物素的合成。通过本发明，获得的工程菌生物素合成能力得到了极大的提升，在添加少量庚二酸的情况下，上罐分批发酵产生了80mg/L生物素，其产量是野生型易变假单胞菌的8000倍。

Description

一种促进生物素合成的方法、促进生物素合成的重组细胞和 基因工程菌
技术领域
本发明属于基因工程领域，涉及通过微生物发酵促进生物素生产的方法，相关的DNA序列及用这种方法的质粒。
背景技术
D-生物素(维生素H)作为涉及细胞中心代谢路径最重要的辅酶之一，在脂质生成、氨基酸代谢和糖质新生过程中发挥重要作用，是动物、植物和微生物生长的必需维生素，其在生物医药、化妆品、食品、饲料等方面具有极大的市场应用前景。
生物素合成可分为生物合成法和化学合成法，化学合成法是目前工业上主要采用的生物素合成方法。化学合成法的缺点主要为成本高、工艺复杂、环境负担过重。我国虽已能利用化学合成制备生物素，但由于生物素产品纯度低、价格高，不得不从美国、日本等国家进口。采用生物法制备生物素可解决化学法制备带来的环境污染问题，符合可持续发展原则，且其生产工艺较化学法更简洁。
已有许多关于生物素发酵生产的研究。例如，球形芽孢杆菌(Bacillussphaericus)(Agr Biol Chem,1983,47(5):1011-1016)、大肠杆菌(Escherichia coli)(Biosci Biotech Bioch,1993,57(5):760-765)、沙雷氏菌(Serratia marcescens)(ApplEnviron Microbiol,1993,59:2857-2863)和库特氏菌(Kurthia sp.)(United StatesPatent 5,922,581)经诱变和生物素类似物筛选，分别能够产生9.5mg/L、11.1mg/L、20mg/L和126mg/L生物素。
近年来，生物素生物合成路径中从庚二酸-ACP(或庚二酸-辅酶A)到生物素合成的各酶促反应步骤在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中进行了广泛研究，这些途径在所有生物素自养型微生物中都是比较保守的。这些步骤包括如下的转变过程：(1)庚二酸-ACP(或庚二酸-辅酶A)经7-酮基-8-氨基壬酸合成酶(BioF)被转化成7-酮基-8-氨基壬酸(AON)。(2)AON经7，8-二氨基壬酸转氨酶(BioA)被转化成7，8-二氨基壬酸(DAN)。(3)DAN经脱硫生物素合成酶(BioD)被转化成脱硫生物素(DTB)。(4)DTB经生物素合成酶(BioB)被转化成生物素。庚二酸-ACP(或庚二酸-辅酶A)的合成至少有两条不同的路径，目前研究地比较清楚的是大肠杆菌的BioC-BioH路径和枯草芽孢杆菌的BioI-BioW的路径。BioC-BioH路径借用脂肪酸合成路径中的多种脂肪酸合成酶生成庚二酸硫酯，BioI-BioW路径通过游离的庚二酸或脂肪酸长链-ACP裂解生成庚二酸硫酯。
随着基因工程技术的发展，直接通过基因工程策略来提高生物素产量的方法也被采用。例如，Streit等人将大肠杆菌的生物素操纵子bioABFCD导入到苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)中，生物素产量达到了1mg/L(Appl.Environ.Microb.,1996,62(9):3333-3338)；Saito等人将鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas paucimobilis)生物素操纵子bioABFCD导入到一株生物素高产的野生型鞘氨醇单胞菌中，通过分批补料发酵产生了66mg/L生物素(Biochem.Eng.J.,2000,5(2):129-136)；Shaw等人将大肠杆菌的生物素基因簇bioABFCD导入根瘤菌(Agrobacterium/Rhizobium)中，经20天发酵生物素水平达到了110mg/L。
目前利用微生物发酵生产生物素存在庚二酸硫酯供应不足的问题，以大肠杆菌为代表的革兰氏阴性菌的BioC-BioH路径需要经过多达十步的脂肪酸合成反应才能生成庚二酸硫酯，前体提供应效率极低，并且过表达bioC会过度扰动脂肪酸合成路径从而造成细胞毒性，严重抑制细胞生长。因此，如何提高庚二酸硫酯的供应，进一步在添加外源庚二酸情况下提高其转化利用率是今后需要解决的重要问题。
发明内容
本发明的第一个目的在于针对微生物发酵生产生物素过程中前体供应不足的问题，提供一种通过强化微生物发酵过程中生物素前体供应的促进生物素合成的方法。本发明采用的技术方案是：
一种促进生物素合成的方法，其特征在于，通过引入枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis 168)来源的编码庚二酸辅酶A合成酶基因bioW SEQ ID NO.1和能够裂解长链脂肪酰基-ACP的P450氧化酶基因bioI SEQ ID NO.2来强化生物素前体庚二酸硫酯的供应，促进下游生物素合成基因bioAFDB SEQ ID NO.3对生物素的合成。
BioW提高了微生物对外源庚二酸的利用率，BioI增强了生物素前体庚二酸-ACP的供应，通过过表达这两个基因来增强生物素前体庚二酸硫酯的供应从而促进下游生物素的合成。
进一步，通过质粒过表达基因bioI和bioW，同时以基因簇的形式过表达下游生物素合成基因bioAFDB，实现生物素的高效合成。
进一步，该方法可以采用步骤为：
(1)克隆枯草芽孢杆菌168的bioI和bioW，构建广宿主表达质粒pBBR1M-bioWI。
(2)克隆枯草芽孢杆菌的生物素合成簇基因bioAFDB，进一步构建表达质粒pBBR1M-bioWIAFDB，其为能促进生物素有效合成的重组表达质粒。
(3)将上述构建成功的生物素合成基因簇质粒通过电转化方法导入宿主细胞中，宿主细胞可以是恶臭假单胞菌和易变假单胞菌。
进一步，通过构建含有枯草芽孢杆菌的bioI和bioW以及下游的bioAFDB生物素合成簇基因的重组细胞，来促进生物素的高效合成。
本发明另一个方面是还提供了一种能够高效合成生物素的重组细胞，该细胞包含枯草芽孢杆菌来源的bioI和bioW以及下游的生物素合成基因bioA、bioF、bioD和bioB。
本发明第三个方面是提供了一种高效合成生物素的基因工程菌，包含SEQ 1～3所示的DNA序列。
本发明第三个方面是提供了一种高效合成生物素的重组细胞，包含SEQ 1～3所示的DNA序列。
本发明的有益效果主要体现在：通过本发明可以极大地增强生物素前体庚二酸硫酯的供应，从而有效促进生物素的合成。通过本发明的基因工程菌具有高效合成生物素的能力，在添加外源庚二酸的情况下，摇瓶发酵生物素产量可达22mg/L，是初始野生型菌株(10μg/L)的2200倍。
附图说明：
图1是重组质粒pBBR1M-bioWI PCR验证核酸电泳图。
图2是重组质粒pBBR1M-bioWIAFDB PCR验证核酸电泳图。
图3是微生物平板法测定生物素标准曲线绘制方法。
图4是工程菌株PM/WI和PM/WIAFDB摇瓶发酵结果。
图5是工程菌株PM/WIAFDB上罐分批发酵结果。
具体实施方案
通过以下实施例更好地说明本发明内容，但本发明不限于下述实施例。
实施例中各成分分析检测方法的建立
微生物平板法测定生物素方法的建立：
在MRS平板上挑取植物乳杆菌ATCC8014单菌落，接种到含50mL MRS液体培养基摇瓶，37℃200rpm过夜培养，吸取1mL菌液离心弃上清，使用PBS溶液洗涤菌体三遍，最后用100μL PBS重悬。将菌体加入到含有未凝固的生物素测定培养基的锥形瓶中，混匀后立即倒入干净的的培养皿。随后，吸取适量的生物素标准品和发酵液样品，点加在滤纸片上，待滤纸片干燥后，用镊子转移至混有植物乳杆菌的生物素测定平板上，37℃恒温培养箱培养16～20h。根据不同生物素浓度所产生的菌圈直径，绘制生物素标准曲线，具体见图1。根据该标准曲线菌圈直径和生物素浓度的函数关系，从样品形成的菌圈直径可计算出样品中的生物素浓度。
甘油浓度的测定：取梯度稀释的甘油标准品各100μL，分别转移至1.5mL离心管，加入100μL 0.015M高碘酸钠，混匀，室温静置反应10min；依次加入200μL 0.1％鼠李糖溶液，400μL Nash试剂(乙酸铵150g，冰醋酸2mL，乙酰丙酮2mL，去离子水定容至1L)，混匀，53℃水浴15min；以空白作参比，测定412nm波长下的OD值，绘制甘油浓度和吸光度值之间的标准曲线。同时将发酵液离心，取上清，稀释至适当浓度后，按照标准曲线绘制方法进行测定，以试剂空白作参比。甘油(g/L)＝(OD412÷斜率)×稀释倍数。
细胞密度测定：取1mL细菌菌液，经适当稀释，以未接种的相应培养基作为背景OD，测定其在波长600nm下的吸光度值(OD600控制在0.2～0.8)，测定值乘以稀释倍数即为细胞密度。
实施例1：表达质粒pBBR1M-bioWI的构建
质粒构建所需引物见表1。使用引物对bioW-F/bioW-R和bioI-F/bioI-R扩增枯草芽孢杆菌基因组(Genbank GI:2627063)上的bioW和bioI，使用引物对pBBR1M-Pnpt2-F/pBBR1M-Pnpt2-R扩增启动子Pnpt2，使用引物对pBBR1M-F/pBBR1M-R扩增质粒骨架，使用Gibison方法进行四片段重组，重组产物经大肠杆菌JM109感受态细胞转化，涂布在卡纳抗性LB平板上，37℃过夜培养后，挑取转化子进行菌落pcr验证，PCR验证结果见图2。挑取正确的转化子培养后提取质粒并送测序，测序正确的即为构建成功的表达质粒pBBR1M-bioWI。
实施例2：表达质粒pBBR1M-bioWIAFDB
质粒构建所需引物见表1。使用引物对bioA-F/bioA-R扩增大肠杆菌基因组上的bioA，使用引物对bioF-F/bioF-R、bioD-F/bioD-R和bioB-F/bioB-R分别扩增枯草芽孢杆菌生物素合成基因bioF、bioD和bioB，使用限制性内切酶XbaI酶切已构的表达质粒pBBR1M-bioWI，将以上五片段进行Gibison重组，重组产物经大肠杆菌转化，涂布培养后挑取单菌落经PCR验证，PCR验证结果见图3。挑取正确的转化子提取质粒并送测序，测序正确的即为构建成功的表达质粒pBBR1M-bioWIAFDB。
表1为构建表达质粒pBBR1M-bioWI和pBBR1M-bioWIAFDB所需引物
Figure BDA0002114428400000051
Figure BDA0002114428400000061
实施例3：生物素生产菌株的获得
易变假单胞菌感受态细胞的制备和转化方法参考模式菌株恶臭假单胞菌KT2440电转化方法。分别将表达质粒pBBR1M-bioWI和pBBR1M-bioWIAFDB导入易变假单胞菌感受态细胞，使用相应引物进行PCR验证，获得的菌株分别命名为PM/WI和PM/WIAFDB。
实施例4：工程菌株的摇瓶发酵
种子培养基的配置(％)：葡萄糖2.0，胰蛋白胨2.0，酵母提取物1.0，Na2HPO4·12H2O1.8，KH2PO4 0.405，(NH4)2SO4 0.2，MgSO4·7H2O 0.08，pH 7.1。
发酵培养基的配置(％)：甘油2.0，胰蛋白胨2.0，(NH4)2SO4 0.2，Na2HPO4·12H2O1.8，KH2PO4 0.405，MgSO4·7H2O 0.08，FeSO4·7H2O 0.0012，庚二酸0.1，pH 7.0。
从LB固体平板上挑取工程菌PM/WI和PM/WIAFDB分别接种到种子培养基，过夜培养(28℃，200rpm)，分别转接1％种子液(OD～2.0)到含有50mL发酵培养基的摇瓶(250mL)，28℃，200rpm培养，取样时间为第5天，发酵液经12000rpm离心2min，取上清，使用微生物平板法测定发酵液中生物素含量。工程菌PM/WI和PM/WIAFDB经5天发酵分别产生了10mg/L和22mg/L生物素，具体情况如图4所示。
实施例5：工程菌株的上罐批示发酵
从LB固体平板上挑取工程菌PM/WI和PM/WIAFDB接种到种子培养基，过夜培养(28℃，200rpm)，转接5％种子液(OD～2.0)到含有2L工作容积的发酵罐，温度控制在28℃，溶氧控制在20％以上，转速控制在200-800rpm，每隔3-12h取样，同时测定发酵液中的各组分的含量，pH自然，OD600值在50h培养后达到最大值78，而生物素产量继续上升并在在68h左右达到最大值80mg/L，发酵情况见图5。
Figure BDA0002114428400000081
Figure BDA0002114428400000091
Figure BDA0002114428400000101
Figure BDA0002114428400000111
Figure BDA0002114428400000121
Figure IDA0003742688730000011
Figure IDA0003742688730000021
Figure IDA0003742688730000031

Claims (4)

1.一种促进生物素合成的方法，其特征在于，通过引入枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis 168）来源的编码庚二酸辅酶A合成酶基因bioW和能够裂解长链脂肪酰基-ACP的P450氧化酶基因bioI来强化生物素前体庚二酸硫酯的供应，促进下游生物素合成基因bioAFDB对生物素的合成；所述bioW的序列为SEQ ID NO.1所示，所述bioI 的序列为SEQ IDNO.2所示，所述bioAFDB 的序列为SEQ ID NO.3所示。
2.一种促进生物素合成的重组细胞，其特征在于，该含生物素合成基因bioA、bioF、bioD和bioB的细胞含有枯草芽孢杆菌来源的编码庚二酸辅酶A合成酶基因bioW和能够裂解长链脂肪酰基-ACP的P450氧化酶基因bioI；所述bioW的序列为SEQ ID NO.1所示，所述bioI的序列为SEQ ID NO.2所示。
3.一种高效合成生物素的基因工程菌，其特征在于，含有SEQ ID NO.1~3所示DNA序列。
4.一种高效合成生物素的重组细胞，其特征在于，含有SEQ ID NO.1~3所示DNA序列。
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