CN111518820B

CN111518820B - 用于发酵生产l-赖氨酸的重组dna、菌株及其应用

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Publication number: CN111518820B
Application number: CN201910104805.3A
Authority: CN
Inventors: 雷云凤; 周豪宏; 陈玲; 刘修才
Original assignee: Cathay R&D Center Co Ltd; CIBT America Inc
Current assignee: Cathay R&D Center Co Ltd; CIBT America Inc
Priority date: 2019-02-01
Filing date: 2019-02-01
Publication date: 2021-05-04
Anticipated expiration: 2039-02-01
Also published as: CN111518820A

Abstract

本发明公开了用于发酵生产L‑赖氨酸的重组DNA、菌株及其应用。本发明通过增加微生物体内8‑氨基‑7‑氧代壬酸化物合酶的含量，加速催化生物素合成第一步，从而提高生物素的合成速率，进而提高代谢产物的产量。进一步地，通过在诱变获得的L‑赖氨酸生产水平提高的突变株中，利用强启动子或高拷贝质粒表达ppc或ddh基因及8‑氨基‑7‑氧代壬酸化物合酶编码基因bioF，加速催化生物素合成第一步，从而提高生物素的合成速率，进而提高L‑赖氨酸的产量。

Description

用于发酵生产L-赖氨酸的重组DNA、菌株及其应用

技术领域

本发明属于微生物工程技术领域，具体地说，涉及一种用于发酵生产L-赖氨酸的重组DNA、菌株及其应用。

背景技术

通过DNA重组技术改造具有生产L-赖氨酸能力的棒杆菌属和埃希杆菌属的细菌，现已实现工业化的生产。这些细菌的L-赖氨酸生产率的提高是通过过表达L-赖氨酸合成途径的相关基因和反馈抑制脱敏的相关基因，或者从葡萄糖代谢开始的能量供应途径的强化而实现的。在大肠杆菌中，ppc基因编码的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvatecarboxylase，PPC)为催化磷酸烯醇式丙酮酸与二氧化碳反应生成草酰乙酸呈不可逆反应的酶。

除了不断加强生成赖氨酸的代谢途径，打开非赖氨酸代谢的其他旁路的发酵方法，也值得我们去深入挖掘。细菌，植物和一些真菌自身能够合成生物素，比较熟知的是维生素H或维生素B7；它是一些中心代谢途径，例如脂肪酸代谢和氨基酸代谢等过程中的关键酶类的必要辅因子。生物素合成途径包括4个催化过程，大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中的生物素操纵子包括5个基因，分别为(bioF,bioB,bioC,bioD和bioA)和(bioW,bioB,bioF,bioD和bioA)。细菌中由bioF基因编码的8-氨基-7-氧代壬酸化物合酶(8-amino-7-oxononanoatesynthase)，依赖于PLP(磷酸吡哆醛)，是一个十分保守的酶，其催化生物素合成途径的第一步。

目前，尚未见通过过表达8-氨基-7-氧代壬酸化物合酶基因获得L-赖氨酸生产菌的相关报道。

发明内容

本发明的目的是提供8-氨基-7-氧代壬酸化物合酶基因在氨基酸或多肽发酵生产中的应用。

本发明的另一目的是提供用于发酵生产L-赖氨酸的重组DNA、菌株及其应用。

本发明构思如下：通过增加微生物体内8-氨基-7-氧代壬酸化物合酶的含量，加速催化生物素合成第一步，从而提高生物素的合成速率，进而提高代谢产物的产量。进一步地，通过在诱变获得的L-赖氨酸生产水平提高的突变株中，利用强启动子或高拷贝质粒表达ppc或ddh基因及8-氨基-7-氧代壬酸化物合酶编码基因bioF，加速催化生物素合成第一步，从而提高生物素的合成速率，进而提高L-赖氨酸的产量。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供8-氨基-7-氧代壬酸化物合酶基因在氨基酸或多肽发酵生产中的应用。

所述8-氨基-7-氧代壬酸化物合酶基因，通过质粒导入产氨基酸或多肽的微生物中或通过基因工程手段整合到微生物染色体上。

优选地，所述8-氨基-7-氧代壬酸化物合酶基因来自于大肠杆菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、草生欧文氏菌(Erwinia herbicola)、球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus)、粘质沙雷菌(Serratia marcescens)或耐盐短杆菌(Brevibacterium halotolerans)等。几种8-氨基-7-氧代壬酸化物合酶的氨基酸序列相似性比对结果见图1。

第二方面，本发明提供用于发酵生产L-赖氨酸的重组DNA，所述重组DNA至少包括8-氨基-7-氧代壬酸化物合酶基因，以及L-赖氨酸生物合成途径的相关基因和/或反馈抑制脱敏的相关基因。所述基因可以由相同质粒或不同质粒携带。某些基因可以由相同质粒携带。当使用两种或两种以上质粒时，优选使用具有稳定的分配系统的质粒，该系统使得这些质粒能在细胞中稳定的共存。导入所述基因的顺序没有特别限制。

进一步地，所述重组DNA至少包括8-氨基-7-氧代壬酸化物合酶基因以及磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因和/或二氨基庚二酸脱氢酶基因；所述8-氨基-7-氧代壬酸化物合酶还可以是上述来源的8-氨基-7-氧代壬酸化物合酶的突变体(包括天然突变体和人工重组突变体)或者活性片段。大肠杆菌的8-氨基-7-氧代壬酸化物合酶bioF的氨基酸序列见SEQ IDNO:2。

优选地，所述8-氨基-7-氧代壬酸化物合酶基因是来自大肠杆菌的bioF基因(SEQID NO:1)或bioF基因的片段，所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因是来自大肠杆菌的ppc基因，所述二氨基庚二酸脱氢酶基因是来自大肠杆菌的ddh基因。

第三方面，本发明提供含有所述重组DNA的生物材料，所述生物材料为表达盒、转座子、质粒载体、噬菌体载体、病毒载体或工程菌等。

进一步地，本发明提供一种重组表达质粒，包括重组表达质粒的目的基因和骨架质粒，其骨架质粒是在宿主细胞中可复制的骨架质粒，优选pUC、pBR322、pACYC质粒和它们的衍生质粒中的一种。

第四方面，本发明提供高产L-赖氨酸的工程菌，所述工程菌的构建方法如下：

A、弱化原始菌株中与L-赖氨酸代谢途径相关的基因，获得基因弱化菌株；

所述弱化包括敲除或降低基因的表达；

所述弱化的基因可选自cadA、ldcC、gltI、thrC、cynT、thrL和maeB等中的至少一个；

B、增强原始菌株中与L-赖氨酸生物合成途径相关的基因和/或反馈抑制脱敏相关的基因，或者增强步骤A基因弱化菌株中与L-赖氨酸生物合成途径相关的基因和/或反馈抑制脱敏相关的基因，获得基因增强菌株；

所述增强的途径可选自以下1)～6)，或任选的组合：

1)通过导入具有所述基因的质粒而增强；

2)通过增加染色体上所述基因的拷贝数而增强；

3)通过改变染色体上所述基因的启动子序列而增强；

4)通过将强启动子与所述基因可操作地连接而增强；

5)通过导入增强子而增强；

6)通过使用具有编码高活性的相应酶或蛋白质的基因或等位基因而增强；

所述与L-赖氨酸生物合成途径相关的基因可选自dapA、lysC、dapB、ddh、ppc、lysA和asd等中的至少一个；

C、构建携带8-氨基-7-氧代壬酸化物合酶基因的质粒；

D、将步骤C中所述携带8-氨基-7-氧代壬酸化物合酶基因的质粒导入步骤A中所述基因弱化菌株和/或步骤B中所述基因增强菌株中，获得高产L-赖氨酸的工程菌。

所述原始菌株可选自埃希氏菌属(Escherichia)、棒杆菌属(Corynebacterium)、短杆菌属(Brevibacterium)、哈夫尼菌属(Hafnia)等中的菌种；优选地，所述原始菌株选自大肠杆菌(Escherichia coli)、嗜热菌(Thermus thermophilus)、蜂房哈夫尼菌(Hafniaalvei)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)等，或经过诱变或随机突变之后的菌株或基因工程菌。

第五方面，本发明提供高产L-赖氨酸的工程菌，所述工程菌为保藏编号CCTCC NO:M 2018456的大肠杆菌(Escherichia coli)M11-A3，其包含上述重组DNA。

其中，大肠杆菌M11-A3是以大肠杆菌MG1655(E.coli MG1655K12)为出发菌株，通过ARTP物理诱变获得的L-赖氨酸生产水平提高的突变株。根据布达佩斯条约，大肠杆菌(Escherichia coli)M11-A3现已保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉，武汉大学，邮编430072，保藏编号CCTCC NO:M 2018456，保藏日期2018年7月6日。

所述工程菌中包含：启动子-ppc-启动子-bioF或启动子-ddh-启动子-bioF的DNA序列。

其中，所述启动子选自plac、trp、tac、trc、PL等。

优选地，所述工程菌中包含：plac-ppc-plac-bioF或plac-ddh-plac-bioF的DNA序列。

第六方面，本发明提供所述工程菌在发酵生产L-赖氨酸中的应用。

前述应用包括步骤：(1)培养所述高产L-赖氨酸的工程菌；(2)从步骤(1)得到的菌液或菌体中收集L-赖氨酸。

第七方面，本发明提供产1,5-戊二胺的大肠杆菌工程菌，所述工程菌携带有表达8-氨基-7-氧代壬酸化物合酶基因，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因和/或二氨基庚二酸脱氢酶基因，以及赖氨酸脱羧酶基因的质粒。

优选地，所述8-氨基-7-氧代壬酸化物合酶基因、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因、二氨基庚二酸脱氢酶基因和赖氨酸脱羧酶基因为宿主同源基因。

更优选地，出发菌株为保藏编号CCTCC NO:M 2018456的大肠杆菌(Escherichiacoli)M11-A3。

第八方面，本发明提供1,5-戊二胺的生产方法，包括在发酵培养基中对所述大肠杆菌工程菌进行培养以生产1,5-戊二胺。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

(一)本发明提供了一种高效生产氨基酸(特别是L-赖氨酸)或多肽的方法，通过表达8-氨基-7-氧代壬酸化物合酶改善工程菌生物素合成第一步，提高生物素的合成速率，进而提高氨基酸或多肽的产量。

(二)本发明通过8-氨基-7-氧代壬酸化物合酶基因过表达不仅可用于L-赖氨酸生产菌的基因工程改造，还可以用于其他L-氨基酸或多肽的生产。例如，利用改造的基因工程菌进行1,5-戊二胺(尸胺)的生产。1,5-戊二胺的用途相当广泛，例如可以和二元酸进行聚合反应合成新型尼龙，在工业生产中具有很高的应用价值。

附图说明

图1为不同微生物物种来源的几种8-氨基-7-氧代壬酸化物合酶的氨基酸序列相似性比对结果。

图2为本发明实施例2中ddh基因经密码子优化后的结果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

本发明中涉及的术语：过表达是指微生物中由相应的DNA编码的一或多种酶的胞内活性的提高，例如通过提高基因的拷贝数，或使用强启动子或编码高活性相应酶的基因，及任选地组合使用这些方法。

本发明中涉及到的百分号“％”，若未特别说明，是指质量百分比；但溶液的百分比，除另有规定外，是指100mL溶液中含有溶质的克数。

实施例1诱变获得的L-赖氨酸生产水平提高的突变株

从大肠杆菌MG1655(E.coli MG1655K12，购自北京天恩泽基因科技有限公司)出发，通过ARTP物理诱变的方法，以及L-赖氨酸类似物添加平板进行筛选。

接种MG1655菌株至50mL的LB培养基，待菌体浓度到OD₆₀₀＝0.6时，收集菌体。将菌体转移至ARTP仪器(无锡源清天木生物科技有限公司)，选取70秒进行诱变处理(致死率达到98％)，收集诱变后的菌体，稀释10²和10³倍后，全部涂板M9培养基(其中培养基中添加4mg/L的L-赖氨酸类似物AEC)。在未添加AEC的平板上分别涂布未诱变菌(稀释10⁵倍的菌液)，以及诱变处理后的菌体(稀释10³倍的菌液)。37℃培养两天后，共获得L-赖氨酸类似物耐受能力提高的菌株36株。挑取单菌落至30μL无菌生理盐水中，从筛选平板上蘸取菌体获得浑浊的菌液。取3μL划线至不同浓度的AEC平板进行复筛。通过使用不断增加浓度的L-赖氨酸类似物的添加平板继续重复筛选。最后确认M11菌株耐受能力最强。

从新突变株M11出发，通过ARTP物理诱变和高浓度L-赖氨酸类似物添加平板进行筛选，共获得24株新的突变菌株。将获得的24个新突变株和出发株M11，分别接种于不含抗生素的5ml种子培养基((含有4％葡萄糖,0.1％KH₂PO₄,0.1％MgSO₄,1.6％(NH₄)₂SO₄,0.001％FeSO₄,0.001％MnSO₄,0.2％酵母提取物(购自英格兰OXOIDLTD.)，0.01％L-苏氨酸,0.005％L-异亮氨酸)进行培养，37℃、225rpm过夜。第二天，每个菌株再分别转接至50ml新鲜的含有30g/L葡萄糖、0.7％Ca(HCO₃)₂和100μg/mL氨苄青霉素的发酵培养基中，于37℃、170rpm继续培养72h，利用核磁检测并计算各培养基中的赖氨酸含量(表1)。

表1核磁检测24株新突变株与出发菌株M11相比的赖氨酸产量及OD₆₀₀

注：d25表示发酵液稀释25倍之后的测定结果。

如表1所示，发酵72h后，突变株M11-A3的赖氨酸产量为3.57g/kg，相比于出发株M11的L-赖氨酸产量提升26％，且突变株与对照相比生长无显著差异。为提高筛选条件，将发酵时间缩短为48h。三次重复发酵出发株和该突变株，确认突变株M11-A3的产量为3.00g/kg，相对L-赖氨酸产量提升维持在24～26％。M11-A3菌株保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:M 2018456。

实施例2构建表达载体pUC18-plac-ppc，pUC18-plac-ddh，pUC18-plac-ppc-plac-bioF和pUC18-plac-ddh-plac-bioF

首先，构建重组表达质粒pUC18-plac-ppc和pUC18-plac-ddh。根据多片段一步法克隆试剂盒(购自南京诺唯赞生物科技有限公司)产品说明书设计引物，在ppc基因序列的两端引入与载体SacI/XbaI双酶切后重合20～30bp的DNA序列(Seq ID No：3)和(Seq IDNo：4)，获得引物对ppc-F/R(SEQ ID NO：5和6)；在ddh基因序列的两端引入与载体SacI/XbaI双酶切后重合20～30bp的DNA序列(Seq ID No：7)和(Seq ID No：8)，获得引物对ddh-F/R(SEQ ID NO：9和10)。以大肠杆菌MG1655基因组DNA作为模板，使用引物对ppc-F/R(SEQID NO：5和6)，通过PCR扩增获得ppc基因片段(SEQ ID NO：11)；以生工生物工程(上海)股份有限公司合成的pUC57-ddh的质粒DNA作为模板，使用引物对ddh-F/R(SEQ ID NO:9和10)，通过PCR扩增获得含有ddh基因的DNA片段(SEQ ID NO:12，其中ddh基因经密码子优化，如图2所示，下方序列为优化的碱基序列)。将ppc、ddh基因片段分别和SacI/XbaI酶切后的pUC18(购自宝生物工程(大连)有限公司)载体进行切胶回收纯化，使用多片段一步法克隆试剂盒将上述两个基因片段分别与酶切后的载体进行重组。重组后的混合物全部转化至E.coliJM109(购自宝生物工程(大连)有限公司)感受态细胞中，在含有氨苄青霉素的LB平板上进行筛选，获得多个单菌落。通过菌落PCR和测序验证证实ppc和ddh基因已插入到质粒载体pUC18的SacI/XbaI位点，得到正确的表达载体pUC18-plac-ppc和pUC18-plac-ddh。

然后，构建重组表达质粒pUC18-plac-ppc-plac-bioF和pUC18-plac-ddh-plac-bioF。根据多片段一步法克隆试剂盒(购自南京诺唯赞生物科技有限公司)产品说明书设计引物，在plac序列的左侧引入pUC18-plac-ppc-plac-bioF和pUC18-plac-ddh-plac-bioF载体XbaI单酶切后上游重合20～30bp的DNA序列(Seq ID No：13和14)，分别获得引物plac-F1和plac-F2(Seq ID No：15和16)。在bioF基因序列的两端引入与plac序列及载体XbaI单酶切后下游重合20～30bp的DNA序列(Seq ID No：18)和(Seq ID No：19)获得引物对bioF-F/R(SEQ ID NO：20和21)。以pUC18质粒DNA作为模板，使用引物对plac-F1/R(SEQ ID NO：15和17)，通过PCR扩增获得plac片段1(SEQ ID NO：22)；使用引物对plac-F2/R(SEQ ID NO：16和17)，通过PCR扩增获得plac片段2(SEQ ID NO：23)。以大肠杆菌MG1655基因组DNA作为模板，使用引物对bioF-F/R(SEQ ID NO：20和21)，通过PCR扩增获得bioF片段(SEQ ID NO：24)。将plac和bioF片段与XbaI单酶切后的pUC18-plac-ppc和pUC18-plac-ddh载体进行切胶回收纯化，使用多片段一步法克隆试剂盒将上述两个片段和一个载体分别进行重组。重组后的混合物全部转化至E.coli JM109(购自宝生物工程(大连)有限公司)感受态细胞中，在含有氨苄青霉素的LB平板上进行筛选，获得多个单菌落。通过菌落PCR和测序验证证实plac-bioF表达序列已插入到质粒载体pUC18-plac-ppc和pUC18-plac-ddh的XbaI位点，得到正确的表达载体pUC18-plac-ppc-plac-bioF和pUC18-plac-ddh-plac-bioF。

实施例3制备L-赖氨酸生产菌株和生产L-赖氨酸

首先，制备L-赖氨酸生产菌株。使用实施例1筛选获得的M11-A3突变株，制备感受态，将实施例2构建得到的表达载体pUC18-plac-ppc、pUC18-plac-ddh、pUC18-plac-ppc-plac-bioF和pUC18-plac-ddh-plac-bioF分别转入受体菌M11-A3突变株中。涂布在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB抗性平板中进行筛选。分别挑取12个单菌落至添加有氨苄青霉素的600μl LB培养基中，37℃培养3h后，取1μl菌体作为模板进行PCR验证筛选正确的突变株，并甘油保种。

然后，选取实施例1中获得的3个pUC18-plac-ppc转化子、3个pUC18-plac-ddh转化子、3个pUC18-plac-ppc-plac-bioF转化子和3个pUC18-plac-ddh-plac-bioF转化子及出发株M11-A3，分别涂布于含有100μg/ml氨苄青霉素和不含抗生素的种子培养基(含有4％葡萄糖,0.1％KH₂PO₄,0.1％MgSO₄,1.6％(NH₄)₂SO₄,0.001％FeSO₄,0.001％MnSO₄，0.2％酵母提取物(购自英格兰OXOID LTD.)，0.05％L-蛋氨酸,0.01％L-苏氨酸,0.005％L-异亮氨酸)平板上进行筛选。进一步分别各挑取3个单克隆，利用5ml种子培养基进行培养，37℃，225rpm(仪器购自上海世平实验设备有限公司，超凡型小容量全温度恒温培养振荡器，型号SPH-200B)过夜(16h)。第二天，每个菌株再分别转接至50ml新鲜的含有30g/L葡萄糖,0.7％(质量百分数)Ca(HCO₃)₂和100μg/mL氨苄青霉素的发酵培养基中于37℃，170rpm(仪器购自上海世平实验设备有限公司，标准型大容量恒温培养摇床，型号SPH-211B)继续培养48小时，利用核磁检测并计算各培养基中的赖氨酸的含量(表2)。

表2核磁检测过表达突变株与出发菌株相比的赖氨酸产量及OD₆₀₀

如表2所示，含有质粒pUC18-plac-ppc或pUC18-plac-ddh的突变株的赖氨酸的产量分别为3.72和3.81g/kg。该两种突变株的赖氨酸相对产量分别是对照M11-A3菌株的124％和126％，且突变株与对照相比生长速率有一定程度的提升。含有质粒pUC18-plac-ppc-plac-bioF和pUC18-plac-ddh-plac-bioF的突变株的赖氨酸的产量分别为4.41和4.56g/kg。上述两种突变株的赖氨酸相对产量分别是对照M11-A3菌株的147％和152％，且突变株与对照相比生长速率均提高20％。由此分析是由于bioF和ppc或bioF和ddh基因同时过表达导致赖氨酸生产水平提高，从而引起了突变株M11-A3/pUC18-plac-ppc-plac-bioF和M11-A3/pUC18-plac-ddh-plac-bioF细胞内赖氨酸转化率的提升。以上结果表明，bioF基因的过表达能够促进菌体生长和提高L-赖氨酸的产量。

实施例4制备1,5-戊二胺生产菌株和生产1,5-戊二胺

首先，构建重组表达质粒pUC18-plac-ppc-plac-bioF-plac-cadA和pUC18-plac-ddh-plac-bioF-plac-cadA。根据多片段一步法克隆试剂盒(购自南京诺唯赞生物科技有限公司)产品说明书设计引物，在plac序列的左侧引入与pUC18-plac-ppc-plac-bioF和pUC18-plac-ddh-plac-bioF-plac-cadA载体HindIII单酶切后上游重合20～30bp的DNA序列(Seq ID No：25)获得引物plac-F3(Seq ID No：26)。在cadA基因序列的两端引入与plac序列及载体HindIII单酶切后下游重合20～30bp的DNA序列(Seq ID No：28)和(Seq ID No：29)获得引物对cadA-F/R(SEQ ID NO：30和31)。以pUC18质粒DNA作为模板，使用引物对plac-F3/R3(Seq ID No：26和27)，通过PCR扩增获得plac片段3(SEQ ID NO：32)。以MG1655的基因组DNA作为模板，使用引物对cadA-F/R，通过PCR扩增获得cadA片段(SEQ ID NO：33)。将plac，cadA片段和HindIII单酶切后的pUC18-plac-ppc-plac-bioF载体进行切胶回收纯化，使用多片断一步法克隆试剂盒将上述两个片段和载体进行重组。重组后的混合物全部转化至E.coli JM109(购自宝生物工程(大连)有限公司)感受态细胞中，在含有氨苄青霉素的LB平板上进行筛选，获得多个单菌落。通过菌落PCR和测序验证证实plac-cadA表达序列已插入到质粒载体pUC18-plac-ppc-plac-bioF和pUC18-plac-ddh-plac-bioF的HindIII位点，得到正确的表达载体pUC18-plac-ppc-plac-bioF-plac-cadA和pUC18-plac-ddh-plac-bioF-plac-cadA。

然后，使用实施例1筛选获得的M11-A3突变株，制备感受态。将表达载体pUC18-plac-ppc-plac-bioF-plac-cadA和pUC18-plac-ddh-plac-bioF-plac-cadA。转入受体菌M11-A3突变株中。涂布在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB抗性平板中进行筛选。挑取12个单菌落至添加有氨苄青霉素的600μl LB培养基中，37℃培养3h后，取1μl菌体作为模板进行PCR验证筛选正确的突变株，并甘油保种。

选取上述3个转化子和出发株M11-A3，分别涂布于含有100μg/ml氨苄青霉素和不含抗生素的种子培养基(含有4％葡萄糖,0.1％KH₂PO₄,0.1％MgSO₄,1.6％(NH₄)₂SO₄,0.001％FeSO₄,0.001％MnSO₄,0.2％酵母提取物(购自英格兰OXOIDLTD.)，0.05％L-蛋氨酸,0.01％L-苏氨酸,0.005％L-异亮氨酸)平板上进行筛选。进一步，分别各挑取3个单克隆，利用5ml种子培养基进行培养，37℃、225rpm过夜。第二天，每个菌株再分别转接至50ml新鲜的含有30g/L葡萄糖、0.7％Ca(HCO₃)₂和100μg/mL氨苄青霉素的发酵培养基中于37℃、170rpm继续培养48小时，利用核磁检测并计算各培养基中的戊二胺的含量(表3)。

表3核磁检测过表达突变株与出发菌株相比的戊二胺产量及OD₆₀₀

如表3所示，含有质粒pUC18-plac-ppc-plac-bioF-plac-cadA和pUC18-plac-ddh-plac-bioF-plac-cadA的转化株的戊二胺的产量分别为2.22和2.35g/kg。两个转化株的L-赖氨酸转化率分别为85.0％和87％，且转化株与对照相比生长无显著差异。由此分析bioF和cadA基因与ppc或ddh基因同时过表达能够将L-赖氨酸高效转化为戊二胺，突变株M11-A3/pUC18-plac-ppc-plac-bioF-plac-cadA和M11-A3/pUC18-plac-ddh-plac-bioF-plac-cadA能够应用于戊二胺的生产。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 上海凯赛生物技术研发中心有限公司 CIBT美国公司

<120> 用于发酵生产L-赖氨酸的重组DNA、菌株及其应用

<130> KHP181116617.2

<160> 33

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1155

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 1

atgagctggc aggagaaaat caacgcggcg ctcgatgcgc ggcgtgctgc cgatgccctg 60

cgtcgccgtt atccggtggc gcaaggagcc ggacgctggc tggtggcgga tgatcgccag 120

tatctgaact tttccagtaa cgattattta ggtttaagcc atcatccgca aattatccgt 180

gcctggcagc agggggcgga gcaatttggc atcggtagcg gcggctccgg tcacgtcagc 240

ggttatagcg tggtgcatca ggcactggaa gaagagctgg ccgagtggct tggctattcg 300

cgggcactgc tgtttatctc tggtttcgcc gctaatcagg cagttattgc cgcgatgatg 360

gcgaaagagg accgtattgc tgccgaccgg cttagccatg cctcattgct ggaagctgcc 420

agtttaagcc cgtcgcagct tcgccgtttt gctcataacg atgtcactca tttggcgcga 480

ttgcttgctt ccccctgtcc ggggcagcaa atggtggtga cagaaggcgt gttcagcatg 540

gacggcgata gtgcgccact ggcggaaatc cagcaggtaa cgcaacagca caatggctgg 600

ttgatggtcg atgatgccca cggcacgggc gttatcgggg agcaggggcg cggcagctgc 660

tggctgcaaa aggtaaaacc agaattgctg gtagtgactt ttggcaaagg atttggcgtc 720

agcggggcag cggtgctttg ctccagtacg gtggcggatt atctgctgca attcgcccgc 780

caccttatct acagcaccag tatgccgccc gctcaggcgc aggcattacg tgcgtcgctg 840

gcggtcattc gcagtgatga gggtgatgca cggcgcgaaa aactggcggc actcattacg 900

cgttttcgtg ccggagtaca ggatttgccg tttacgcttg ctgattcatg cagcgccatc 960

cagccattga ttgtcggtga taacagccgt gcgttacaac tggcagaaaa actgcgtcag 1020

caaggctgct gggtcacggc gattcgcccg ccaaccgtac ccgctggtac tgcgcgactg 1080

cgcttaacgc taaccgctgc gcatgaaatg caggatatcg accgtctgct ggaggtgctg 1140

catggcaacg gttaa 1155

<210> 2

<211> 384

<212> PRT

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 2

Met Ser Trp Gln Glu Lys Ile Asn Ala Ala Leu Asp Ala Arg Arg Ala

1 5 10 15

Ala Asp Ala Leu Arg Arg Arg Tyr Pro Val Ala Gln Gly Ala Gly Arg

20 25 30

Trp Leu Val Ala Asp Asp Arg Gln Tyr Leu Asn Phe Ser Ser Asn Asp

35 40 45

Tyr Leu Gly Leu Ser His His Pro Gln Ile Ile Arg Ala Trp Gln Gln

50 55 60

Gly Ala Glu Gln Phe Gly Ile Gly Ser Gly Gly Ser Gly His Val Ser

65 70 75 80

Gly Tyr Ser Val Val His Gln Ala Leu Glu Glu Glu Leu Ala Glu Trp

85 90 95

Leu Gly Tyr Ser Arg Ala Leu Leu Phe Ile Ser Gly Phe Ala Ala Asn

100 105 110

Gln Ala Val Ile Ala Ala Met Met Ala Lys Glu Asp Arg Ile Ala Ala

115 120 125

Asp Arg Leu Ser His Ala Ser Leu Leu Glu Ala Ala Ser Leu Ser Pro

130 135 140

Ser Gln Leu Arg Arg Phe Ala His Asn Asp Val Thr His Leu Ala Arg

145 150 155 160

Leu Leu Ala Ser Pro Cys Pro Gly Gln Gln Met Val Val Thr Glu Gly

165 170 175

Val Phe Ser Met Asp Gly Asp Ser Ala Pro Leu Ala Glu Ile Gln Gln

180 185 190

Val Thr Gln Gln His Asn Gly Trp Leu Met Val Asp Asp Ala His Gly

195 200 205

Thr Gly Val Ile Gly Glu Gln Gly Arg Gly Ser Cys Trp Leu Gln Lys

210 215 220

Val Lys Pro Glu Leu Leu Val Val Thr Phe Gly Lys Gly Phe Gly Val

225 230 235 240

Ser Gly Ala Ala Val Leu Cys Ser Ser Thr Val Ala Asp Tyr Leu Leu

245 250 255

Gln Phe Ala Arg His Leu Ile Tyr Ser Thr Ser Met Pro Pro Ala Gln

260 265 270

Ala Gln Ala Leu Arg Ala Ser Leu Ala Val Ile Arg Ser Asp Glu Gly

275 280 285

Asp Ala Arg Arg Glu Lys Leu Ala Ala Leu Ile Thr Arg Phe Arg Ala

290 295 300

Gly Val Gln Asp Leu Pro Phe Thr Leu Ala Asp Ser Cys Ser Ala Ile

305 310 315 320

Gln Pro Leu Ile Val Gly Asp Asn Ser Arg Ala Leu Gln Leu Ala Glu

325 330 335

Lys Leu Arg Gln Gln Gly Cys Trp Val Thr Ala Ile Arg Pro Pro Thr

340 345 350

Val Pro Ala Gly Thr Ala Arg Leu Arg Leu Thr Leu Thr Ala Ala His

355 360 365

Glu Met Gln Asp Ile Asp Arg Leu Leu Glu Val Leu His Gly Asn Gly

370 375 380

<210> 3

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggag gagctc 36

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tctagagtcg acctgcaggc atgcaagctt 30

<210> 5

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggag gagctcatga acgaacaata ttccgcat 58

<210> 6

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aagcttgcat gcctgcaggt cgactctaga ttagccggta ttacgcatac ctgc 54

<210> 7

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gtgagcggat aacaatttca cacaggagga gctc 34

<210> 8

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tctagagtcg acctgcaggc atgcaagc 28

<210> 9

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gtgagcggat aacaatttca cacaggagga gctcatgacc aatattcgtg ttgccatt 58

<210> 10

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gcttgcatgc ctgcaggtcg actctagatt aaacatcacg ggcaatcaga tcatccag 58

<210> 11

<211> 2718

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 11

ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggag gagctcatga acgaacaata ttccgcattg 60

cgtagtaatg tcagtatgct cggcaaagtg ctgggagaaa ccatcaagga tgcgttggga 120

gaacacattc ttgaacgcgt agaaactatc cgtaagttgt cgaaatcttc acgcgctggc 180

aatgatgcta accgccagga gttgctcacc accttacaaa atttgtcgaa cgacgagctg 240

ctgcccgttg cgcgtgcgtt tagtcagttc ctgaacctgg ccaacaccgc cgagcaatac 300

cacagcattt cgccgaaagg cgaagctgcc agcaacccgg aagtgatcgc ccgcaccctg 360

cgtaaactga aaaaccagcc ggaactgagc gaagacacca tcaaaaaagc agtggaatcg 420

ctgtcgctgg aactggtcct cacggctcac ccaaccgaaa ttacccgtcg tacactgatc 480

cacaaaatgg tggaagtgaa cgcctgttta aaacagctcg ataacaaaga tatcgctgac 540

tacgaacaca accagctgat gcgtcgcctg cgccagttga tcgcccagtc atggcatacc 600

gatgaaatcc gtaagctgcg tccaagcccg gtagatgaag ccaaatgggg ctttgccgta 660

gtggaaaaca gcctgtggca aggcgtacca aattacctgc gcgaactgaa cgaacaactg 720

gaagagaacc tcggctacaa actgcccgtc gaatttgttc cggtccgttt tacttcgtgg 780

atgggcggcg accgcgacgg caacccgaac gtcactgccg atatcacccg ccacgtcctg 840

ctactcagcc gctggaaagc caccgatttg ttcctgaaag atattcaggt gctggtttct 900

gaactgtcga tggttgaagc gacccctgaa ctgctggcgc tggttggcga agaaggtgcc 960

gcagaaccgt atcgctatct gatgaaaaac ctgcgttctc gcctgatggc gacacaggca 1020

tggctggaag cgcgcctgaa aggcgaagaa ctgccaaaac cagaaggcct gctgacacaa 1080

aacgaagaac tgtgggaacc gctctacgct tgctaccagt cacttcaggc gtgtggcatg 1140

ggtattatcg ccaacggcga tctgctcgac accctgcgcc gcgtgaaatg tttcggcgta 1200

ccgctggtcc gtattgatat ccgtcaggag agcacgcgtc ataccgaagc gctgggcgag 1260

ctgacccgct acctcggtat cggcgactac gaaagctggt cagaggccga caaacaggcg 1320

ttcctgatcc gcgaactgaa ctccaaacgt ccgcttctgc cgcgcaactg gcaaccaagc 1380

gccgaaacgc gcgaagtgct cgatacctgc caggtgattg ccgaagcacc gcaaggctcc 1440

attgccgcct acgtgatctc gatggcgaaa acgccgtccg acgtactggc tgtccacctg 1500

ctgctgaaag aagcgggtat cgggtttgcg atgccggttg ctccgctgtt tgaaaccctc 1560

gatgatctga acaacgccaa cgatgtcatg acccagctgc tcaatattga ctggtatcgt 1620

ggcctgattc agggcaaaca gatggtgatg attggctatt ccgactcagc aaaagatgcg 1680

ggagtgatgg cagcttcctg ggcgcaatat caggcacagg atgcattaat caaaacctgc 1740

gaaaaagcgg gtattgagct gacgttgttc cacggtcgcg gcggttccat tggtcgcggc 1800

ggcgcacctg ctcatgcggc gctgctgtca caaccgccag gaagcctgaa aggcggcctg 1860

cgcgtaaccg aacagggcga gatgatccgc tttaaatatg gtctgccaga aatcaccgtc 1920

agcagcctgt cgctttatac cggggcgatt ctggaagcca acctgctgcc accgccggag 1980

ccgaaagaga gctggcgtcg cattatggat gaactgtcag tcatctcctg cgatgtctac 2040

cgcggctacg tacgtgaaaa caaagatttt gtgccttact tccgctccgc tacgccggaa 2100

caagaactgg gcaaactgcc gttgggttca cgtccggcga aacgtcgccc aaccggcggc 2160

gtcgagtcac tacgcgccat tccgtggatc ttcgcctgga cgcaaaaccg tctgatgctc 2220

cccgcctggc tgggtgcagg tacggcgctg caaaaagtgg tcgaagacgg caaacagagc 2280

gagctggagg ctatgtgccg cgattggcca ttcttctcga cgcgtctcgg catgctggag 2340

atggtcttcg ccaaagcaga cctgtggctg gcggaatact atgaccaacg cctggtagac 2400

aaagcactgt ggccgttagg taaagagtta cgcaacctgc aagaagaaga catcaaagtg 2460

gtgctggcga ttgccaacga ttcccatctg atggccgatc tgccgtggat tgcagagtct 2520

attcagctac ggaatattta caccgacccg ctgaacgtat tgcaggccga gttgctgcac 2580

cgctcccgcc aggcagaaaa agaaggccag gaaccggatc ctcgcgtcga acaagcgtta 2640

atggtcacta ttgccgggat tgcggcaggt atgcgtaata ccggctaatc tagagtcgac 2700

ctgcaggcat gcaagctt 2718

<210> 12

<211> 1025

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gtgagcggat aacaatttca cacaggagga gctcatgacc aatattcgtg ttgccattgt 60

tggttatggt aatctgggtc gtagcgttga aaaactgatt gccaaacagc cggatatgga 120

tctggttggt atttttagcc gtcgtgccac cctggatacc aaaaccccgg tttttgatgt 180

ggccgatgtt gataaacatg cagatgatgt ggatgttctg tttctgtgca tgggtagcgc 240

aaccgatatt ccggaacagg caccgaaatt tgcccagttt gcctgtaccg ttgataccta 300

tgataatcat cgtgatattc cgcgtcatcg tcaggttatg aatgaagccg caaccgcagc 360

aggtaatgtg gccctggtga gcaccggttg ggatccgggt atgtttagca ttaatcgtgt 420

ttatgcggca gccgttctgg cagaacatca gcagcatacc ttttggggtc cgggtctgag 480

ccagggtcat agcgatgcgc tgcgtcgtat tccgggtgtt cagaaagcag ttcagtatac 540

cctgccgagc gaagatgccc tggaaaaagc acgtcgtggt gaagcaggtg atctgaccgg 600

taaacagacc cataaacgtc agtgttttgt tgttgcagat gcagcagatc atgaacgtat 660

tgaaaatgat attcgtacca tgccggatta ttttgtgggt tatgaagttg aagttaattt 720

tattgatgaa gcaacctttg atagcgaaca taccggtatg ccgcatggtg gccatgttat 780

taccaccggt gataccggtg gttttaatca taccgttgaa tatattctga aactggatcg 840

taatccggat tttaccgcca gcagccagat tgcctttggt cgtgcagccc atcgtatgaa 900

acagcagggt cagagcggtg cctttaccgt tctggaagtt gcaccgtatc tgctgagccc 960

ggaaaatctg gatgatctga ttgcccgtga tgtttaatct agagtcgacc tgcaggcatg 1020

caagc 1025

<210> 13

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gcaggtatgc gtaataccgg ctaatctaga 30

<210> 14

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gatctgattg cccgtgatgt ttaatctaga 30

<210> 15

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

gcaggtatgc gtaataccgg ctaatctaga ggataaccgt attaccgcct tt 52

<210> 16

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

gatctgattg cccgtgatgt ttaatctaga ggataaccgt attaccgcct tt 52

<210> 17

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

gagctcctcc tgtgtgaaat tgtt 24

<210> 18

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

gcggataaca atttcacaca ggaggagctc 30

<210> 19

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

tctagagtcg acctgcaggc atgcaagctt 30

<210> 20

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

gcggataaca atttcacaca ggaggagctc atgagctggc aggagaaaat c 51

<210> 21

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

aagcttgcat gcctgcaggt cgactctaga ttaaccgttg ccatgcagc 49

<210> 22

<211> 338

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

gcaggtatgc gtaataccgg ctaatctaga ggataaccgt attaccgcct ttgagtgagc 60

tgataccgct cgccgcagcc gaacgaccga gcgcagcgag tcagtgagcg aggaagcgga 120

agagcgccca atacgcaaac cgcctctccc cgcgcgttgg ccgattcatt aatgcagctg 180

gcacgacagg tttcccgact ggaaagcggg cagtgagcgc aacgcaatta atgtgagtta 240

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aattgtgagc ggataacaat ttcacacagg aggagctc 338

<210> 23

<211> 338

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

gatctgattg cccgtgatgt ttaatctaga ggataaccgt attaccgcct ttgagtgagc 60

tgataccgct cgccgcagcc gaacgaccga gcgcagcgag tcagtgagcg aggaagcgga 120

agagcgccca atacgcaaac cgcctctccc cgcgcgttgg ccgattcatt aatgcagctg 180

gcacgacagg tttcccgact ggaaagcggg cagtgagcgc aacgcaatta atgtgagtta 240

gctcactcat taggcacccc aggctttaca ctttatgctt ccggctcgta tgttgtgtgg 300

aattgtgagc ggataacaat ttcacacagg aggagctc 338

<210> 24

<211> 1215

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 24

gcggataaca atttcacaca ggaggagctc atgagctggc aggagaaaat caacgcggcg 60

ctcgatgcgc ggcgtgctgc cgatgccctg cgtcgccgtt atccggtggc gcaaggagcc 120

ggacgctggc tggtggcgga tgatcgccag tatctgaact tttccagtaa cgattattta 180

ggtttaagcc atcatccgca aattatccgt gcctggcagc agggggcgga gcaatttggc 240

atcggtagcg gcggctccgg tcacgtcagc ggttatagcg tggtgcatca ggcactggaa 300

gaagagctgg ccgagtggct tggctattcg cgggcactgc tgtttatctc tggtttcgcc 360

gctaatcagg cagttattgc cgcgatgatg gcgaaagagg accgtattgc tgccgaccgg 420

cttagccatg cctcattgct ggaagctgcc agtttaagcc cgtcgcagct tcgccgtttt 480

gctcataacg atgtcactca tttggcgcga ttgcttgctt ccccctgtcc ggggcagcaa 540

atggtggtga cagaaggcgt gttcagcatg gacggcgata gtgcgccact ggcggaaatc 600

cagcaggtaa cgcaacagca caatggctgg ttgatggtcg atgatgccca cggcacgggc 660

gttatcgggg agcaggggcg cggcagctgc tggctgcaaa aggtaaaacc agaattgctg 720

gtagtgactt ttggcaaagg atttggcgtc agcggggcag cggtgctttg ctccagtacg 780

gtggcggatt atctgctgca attcgcccgc caccttatct acagcaccag tatgccgccc 840

gctcaggcgc aggcattacg tgcgtcgctg gcggtcattc gcagtgatga gggtgatgca 900

cggcgcgaaa aactggcggc actcattacg cgttttcgtg ccggagtaca ggatttgccg 960

tttacgcttg ctgattcatg cagcgccatc cagccattga ttgtcggtga taacagccgt 1020

gcgttacaac tggcagaaaa actgcgtcag caaggctgct gggtcacggc gattcgcccg 1080

ccaaccgtac ccgctggtac tgcgcgactg cgcttaacgc taaccgctgc gcatgaaatg 1140

caggatatcg accgtctgct ggaggtgctg catggcaacg gttaatctag agtcgacctg 1200

caggcatgca agctt 1215

<210> 25

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

tctagagtcg acctgcaggc atgcaagctt 30

<210> 26

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

tctagagtcg acctgcaggc atgcaagctt ggataaccgt attaccgcct tt 52

<210> 27

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

agctgtttcc tgtgtgaaat tgtt 24

<210> 28

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

gcggataaca atttcacaca ggaaacagct 30

<210> 29

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

aagcttggca ctggccgtcg ttttacaacg 30

<210> 30

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

gcggataaca atttcacaca ggaaacagct atgggtggtt tcaccgaaaa acag 54

<210> 31

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

cgttgtaaaa cgacggccag tgccaagctt ccacttccct tgtacgagct aattatttt 59

<210> 32

<211> 338

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

tctagagtcg acctgcaggc atgcaagctt ggataaccgt attaccgcct ttgagtgagc 60

tgataccgct cgccgcagcc gaacgaccga gcgcagcgag tcagtgagcg aggaagcgga 120

agagcgccca atacgcaaac cgcctctccc cgcgcgttgg ccgattcatt aatgcagctg 180

gcacgacagg tttcccgact ggaaagcggg cagtgagcgc aacgcaatta atgtgagtta 240

gctcactcat taggcacccc aggctttaca ctttatgctt ccggctcgta tgttgtgtgg 300

aattgtgagc ggataacaat ttcacacagg aaacagct 338

<210> 33

<211> 2230

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 33

gcggataaca atttcacaca ggaaacagct atgaacgtta ttgcaatatt gaatcacatg 60

ggggtttatt ttaaagaaga acccatccgt gaacttcatc gcgcgcttga acgtctgaac 120

ttccagattg tttacccgaa cgaccgtgac gacttattaa aactgatcga aaacaatgcg 180

cgtctgtgcg gcgttatttt tgactgggat aaatataatc tcgagctgtg cgaagaaatt 240

agcaaaatga acgagaacct gccgttgtac gcgttcgcta atacgtattc cactctcgat 300

gtaagcctga atgacctgcg tttacagatt agcttctttg aatatgcgct gggtgctgct 360

gaagatattg ctaataagat caagcagacc actgacgaat atatcaacac tattctgcct 420

ccgctgacta aagcactgtt taaatatgtt cgtgaaggta aatatacttt ctgtactcct 480

ggtcacatgg gcggtactgc attccagaaa agcccggtag gtagcctgtt ctatgatttc 540

tttggtccga ataccatgaa atctgatatt tccatttcag tatctgaact gggttctctg 600

ctggatcaca gtggtccaca caaagaagca gaacagtata tcgctcgcgt ctttaacgca 660

gaccgcagct acatggtgac caacggtact tccactgcga acaaaattgt tggtatgtac 720

tctgctccag caggcagcac cattctgatt gaccgtaact gccacaaatc gctgacccac 780

ctgatgatga tgagcgatgt tacgccaatc tatttccgcc cgacccgtaa cgcttacggt 840

attcttggtg gtatcccaca gagtgaattc cagcacgcta ccattgctaa gcgcgtgaaa 900

gaaacaccaa acgcaacctg gccggtacat gctgtaatta ccaactctac ctatgatggt 960

ctgctgtaca acaccgactt catcaagaaa acactggatg tgaaatccat ccactttgac 1020

tccgcgtggg tgccttacac caacttctca ccgatttacg aaggtaaatg cggtatgagc 1080

ggtggccgtg tagaagggaa agtgatttac gaaacccagt ccactcacaa actgctggcg 1140

gcgttctctc aggcttccat gatccacgtt aaaggtgacg taaacgaaga aacctttaac 1200

gaagcctaca tgatgcacac caccacttct ccgcactacg gtatcgtggc gtccactgaa 1260

accgctgcgg cgatgatgaa aggcaatgca ggtaagcgtc tgatcaacgg ttctattgaa 1320

cgtgcgatca aattccgtaa agagatcaaa cgtctgagaa cggaatctga tggctggttc 1380

tttgatgtat ggcagccgga tcatatcgat acgactgaat gctggccgct gcgttctgac 1440

agcacctggc acggcttcaa aaacatcgat aacgagcaca tgtatcttga cccgatcaaa 1500

gtcaccctgc tgactccggg gatggaaaaa gacggcacca tgagcgactt tggtattccg 1560

gccagcatcg tggcgaaata cctcgacgaa catggcatcg ttgttgagaa aaccggtccg 1620

tataacctgc tgttcctgtt cagcatcggt atcgataaga ccaaagcact gagcctgctg 1680

cgtgctctga ctgactttaa acgtgcgttc gacctgaacc tgcgtgtgaa aaacatgctg 1740

ccgtctctgt atcgtgaaga tcctgaattc tatgaaaaca tgcgtattca ggaactggct 1800

cagaatatcc acaaactgat tgttcaccac aatctgccgg atctgatgta tcgcgcattt 1860

gaagtgctgc cgacgatggt aatgactccg tatgctgcat tccagaaaga gctgcacggt 1920

atgaccgaag aagtttacct cgacgaaatg gtaggtcgta ttaacgccaa tatgatcctt 1980

ccgtacccgc cgggagttcc tctggtaatg ccgggtgaaa tgatcaccga agaaagccgt 2040

ccggttctgg agttcctgca gatgctgtgt gaaatcggcg ctcactatcc gggctttgaa 2100

accgatattc acggtgcata ccgtcaggct gatggccgct ataccgttaa ggtattgaaa 2160

gaagaaagca aaaaataatt agctcgtaca agggaagtgg aagcttggca ctggccgtcg 2220

ttttacaacg 2230

Claims

1.用于生产L-赖氨酸的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体是将大肠杆菌bioF基因和ppc基因构建到表达载体上得到的，或者所述重组表达载体是将大肠杆菌bioF基因和ddh基因构建到表达载体上得到的，或者所述重组表达载体是将大肠杆菌bioF基因、ppc基因和ddh基因构建到表达载体上得到的；

其中，大肠杆菌bioF基因、ppc基因和ddh基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1、SEQID NO:11和SEQ ID NO:12所示。

2.用于生产1,5-戊二胺的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体是将大肠杆菌bioF基因、ppc基因和cadA基因构建到表达载体上得到的，或者所述重组表达载体是将大肠杆菌bioF基因、ddh基因和cadA基因构建到表达载体上得到的，或者所述重组表达载体是将大肠杆菌bioF基因、ppc基因、ddh基因和cadA基因构建到表达载体上得到的；

其中，大肠杆菌bioF基因、ppc基因、ddh基因和cadA基因的核苷酸序列分别如SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:33所示。

3.含有权利要求1或2所述重组表达载体的工程菌。

4.含有权利要求1所述重组表达载体的工程菌在发酵生产L-赖氨酸中的应用。

5.含有权利要求2所述重组表达载体的工程菌在发酵生产1,5-戊二胺中的应用。

6.1,5-戊二胺的生产方法，其特征在于，包括在发酵培养基中对含有权利要求2所述重组表达载体的工程菌进行培养以生产1,5-戊二胺。