CN109182283A - Nadh依赖性的氨基酸脱氢酶及其在提高赖氨酸产量中的应用 - Google Patents

Nadh依赖性的氨基酸脱氢酶及其在提高赖氨酸产量中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了NADH依赖性的氨基酸脱氢酶在提高赖氨酸产量中的应用，所述氨基酸脱氢酶分别为来源于Pseudomonas aeruginos的天冬氨酸脱氢酶，来源于Tistrella mobilis的天冬氨酸半醛脱氢酶，来源于Mycobacterium tuberculosis的二氢吡啶二羧酸还原酶，来源于Tepidanaerobacter acetatoxydans的二氨基庚二酸脱氢酶，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1、3、5、7所示。本发明的氨基酸脱氢酶能利用NADH或同时利用NADH和NADPH作为辅因子合成赖氨酸从而减少细胞对NADPH的需求，进而显著的提高赖氨酸或者戊二胺的产量。

Description

NADH依赖性的氨基酸脱氢酶及其在提高赖氨酸产量中的应用
技术领域
本发明属于基因工程和生物发酵技术领域，具体地说，涉及一种NADH依赖性的氨基酸脱氢酶及其应用。
背景技术
赖氨酸是一种极其重要的氨基酸，广泛应用于饲料添加剂、保健及医药领域。目前，赖氨酸的工业生产主要通过微生物发酵法进行，工业常用的菌种包括谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌。在赖氨酸的生物合成过程中，有四步酶促反应过程需要消耗NADPH用于合成赖氨酸。因此，传统的方法都是通过强化NADPH的供应，例如提高戊糖磷酸循环途径的代谢通量，或者表达NADPH依赖型的甘油醛3-磷酸脱氢酶，用于平衡赖氨酸合成过程中的辅酶需求，从而提高赖氨酸的产量。在戊二胺的生产过程中同样存在高度依赖NADPH的问题，戊二胺是通过在赖氨酸生产菌株中表达赖氨酸脱羧酶脱而获得。在微生物细胞内，NADH的浓度一般远大于NADPH，且NADH的稳定性比NADPH更高，价格更加便宜，因此直接利用胞内的NADH合成赖氨酸或戊二胺具有极大的应用潜力。
发明内容
本发明的目的是提供一种NADH依赖性的氨基酸脱氢酶及其应用。
赖氨酸和戊二胺合成途径中有四步反应消耗NADPH：(1)草酰乙酸的氨基化生成天冬氨酸；(2)磷酸天冬氨酸还原生成天冬氨酸半醛；(3)二氢吡啶二羧酸还原生成哌啶二羧酸；(4)哌啶二羧酸还原生成二氨基庚二酸。目前大部分微生物体内发现的催化上述步骤的酶都是严格依赖于NADPH。本发明通过大量的生物信息学分析和反复对比实验，在大肠杆菌中表达不同来源的氨基酸脱氢酶的基因，检测其催化活性，及对辅酶NADH、NADPH的特异性进行检测发现，来源于Pseudomonas aeruginos的天冬氨酸脱氢酶(其氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示)，来源于Tistrella mobilis的天冬氨酸半醛脱氢酶(其氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示)，来源于Mycobacterium tuberculosis的二氢吡啶二羧酸还原酶(其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示)，来源于Tepidanaerobacter acetatoxydans的二氨基庚二酸脱氢酶(其氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示)可以利用NADH催化上述四步反应。
因此，本发明提供了NADH依赖性的氨基酸脱氢酶，所述氨基酸脱氢酶为：
来源于Pseudomonas aeruginos的天冬氨酸脱氢酶；
来源于Tistrella mobilis的天冬氨酸半醛脱氢酶；
来源于Mycobacterium tuberculosis的二氢吡啶二羧酸还原酶；和/或来源于Tepidanaerobacter acetatoxydans的二氨基庚二酸脱氢酶；
其氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1、3、5、7所示或如SEQ ID No.1、3、5、7所示氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸而不影响其生物活性的氨基酸序列。
经过密码子优化，本发明提供了编码上述述NADH依赖性的氨基酸脱氢酶的基因，其核苷酸序列分别含有如SEQ ID NO.2、4、6、8所示的核苷酸序列或SEQ ID No.2、4、6、8所示核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个碱基的具有90％以上同源性的、编码相同功能氨基酸脱氢酶的核苷酸序列。
本发明提供了含有上述基因的生物材料，所述生物材料为载体、重组菌、细胞系或表达盒。
优选地，所述重组菌为可以发酵生产赖氨酸或戊二胺的菌株中含有或过表达本发明所述的NADH依赖性的氨基酸脱氢酶。
所述可以发酵生产赖氨酸或戊二胺的菌株为谷氨酸棒杆菌或大肠杆菌。
更优选地，所述重组菌为可以发酵生产赖氨酸或戊二胺的菌株中含有或过表达来源于Pseudomonas aeruginos的天冬氨酸脱氢酶和来源于Tistrella mobilis的天冬氨酸半醛脱氢酶；或
含有来源于Pseudomonas aeruginos的天冬氨酸脱氢酶、来源于Tistrellamobilis的天冬氨酸半醛脱氢酶和来源于Mycobacterium tuberculosis的二氢吡啶二羧酸还原酶；或
含有来源于Pseudomonas aeruginos的天冬氨酸脱氢酶、来源于Tistrellamobilis的天冬氨酸半醛脱氢酶、来源于Mycobacterium tuberculosis的二氢吡啶二羧酸还原酶和来源于Tepidanaerobacter acetatoxydans的二氨基庚二酸脱氢酶。
最优选地，所述重组菌为可以发酵生产赖氨酸或戊二胺的菌株中NADPH-依赖性的氨基酸脱氢酶被本发明所述的NADH依赖性的氨基酸脱氢酶所替代。
在本发明的一个实施例中，重组菌AM3为谷氨酸棒杆菌ATCC21543内源的天冬氨酸转氨酶被替换成NADH依赖性的天冬氨酸脱氢酶(氨基酸序列SEQ ID NO.1)、内源的NADPH-依赖型的天冬氨酸半醛转氨酶被替换成NADH-依赖型的天冬氨酸半醛脱氢酶(氨基酸序列SEQ ID NO.3)，以及内源的NADPH-依赖型的二氢吡啶二羧酸还原酶被替换成NADH-依赖型的二氢吡啶二羧酸还原酶(氨基酸序列SEQ ID NO.5)，该重组菌发酵发酵培养基能够显著提高赖氨酸的产量，达到27.7g/L。
另外，本发明实施例中的重组菌AM2和AM4也取得优异的提高赖氨酸产量的效果，分别达到25.8g/L和25.6g/L。所述重组菌AM2是谷氨酸棒杆菌ATCC21543内源的天冬氨酸转氨酶被替换成NADH依赖性的天冬氨酸脱氢酶(氨基酸序列SEQ ID NO.1)、内源的NADPH-依赖型的天冬氨酸半醛转氨酶被替换成NADH-依赖型的天冬氨酸半醛脱氢酶(氨基酸序列SEQID NO.3)。
所述重组菌AM4是谷氨酸棒杆菌ATCC21543内源的天冬氨酸转氨酶被替换成NADH依赖性的天冬氨酸脱氢酶(氨基酸序列SEQ ID NO.1)、内源的NADPH-依赖型的天冬氨酸半醛转氨酶被替换成NADH-依赖型的天冬氨酸半醛脱氢酶(氨基酸序列SEQ ID NO.3)，内源的NADPH-依赖型的二氢吡啶二羧酸还原酶被替换成NADH-依赖型的二氢吡啶二羧酸还原酶(氨基酸序列SEQ ID NO.5)，以及内源的NADPH-依赖型的二氨基庚二酸脱氢酶被替换成NADH-依赖型的二氨基庚二酸脱氢酶。
所述发酵培养基(g/L)为：葡萄糖80g，玉米浆10g，尿素4.5g，硫酸铵45g，磷酸二氢钾0.5g，七水硫酸镁0.5g，七水硫酸亚铁10mg，四水硫酸锰10mg，β-丙氨酸5mg，烟酸5mg，硫胺素-盐酸5mg，生物素0.3mg，碳酸钙30g，苏氨酸0.2g，亮氨酸0.2g，加水至1L。
进一步地，本发明提供了上述NADH依赖性的氨基酸脱氢酶或其编码基因或上述含有其编码基因的生物材料在制备赖氨酸或戊二胺中的应用。
本发明提供了上述NADH依赖性的氨基酸脱氢酶或其编码基因或上述含有其编码基因的生物材料在提高赖氨酸产量或提高戊二胺产量中的应用。
在发酵生产戊二胺时，发酵菌株中内源的lysE基因被大肠杆菌的赖氨酸脱羧酶基因cadA所替换，可以显著提高戊二胺的产量。
本发明提供了上述NADH依赖性的氨基酸脱氢酶或其编码基因或上述含有其编码基因的生物材料在制备饲料添加剂中的应用。
本发明提供了上述NADH依赖性的氨基酸脱氢酶或其编码基因或上述含有其编码基因的生物材料在制备药物中的应用。
本发明提供的NADH-依赖性的氨基酸脱氢酶可以用于取代谷氨酸棒杆菌自身的NADPH-依赖性的氨基酸脱氢酶，本发明所筛选的这类特殊的氨基酸脱氢酶能直接利用NADH作为辅因子或者同时利用NADH和NADPH，在赖氨酸或者戊二胺生产菌株中直接表达这类NADH-依赖性的氨基酸脱氢酶或者用NADH-依赖性的氨基酸脱氢酶替代对应的NADPH-依赖性的氨基酸脱氢酶可以使细胞利用胞内丰富的NADH作为辅因子合成赖氨酸从而减少细胞对NADPH的需求，进而显著的提高赖氨酸或者戊二胺的产量。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1 NADH-依赖型的氨基酸脱氢酶的表达及其催化性能验证
本发明通过大量的生物信息学分析和反复对比实验，在大肠杆菌中表达不同来源的氨基酸脱氢酶的基因，检测其催化活性，及对辅酶NADH、NADPH的特异性进行检测发现，来源于Pseudomonas aeruginos的天冬氨酸脱氢酶(其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示)，来源于Tistrella mobilis的天冬氨酸半醛脱氢酶(其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示)，来源于Mycobacterium tuberculosis的二氢吡啶二羧酸还原酶(其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示)，来源于Tepidanaerobacter acetatoxydans的二氨基庚二酸脱氢酶(其氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示)可以催化上述四步反应。
基于上述酶的氨基酸序列，本发明设计并基因合成了相应的密码子优化的基因序列，如序列SEQ ID NO.2、4、6、8所示。将合成后的基因片段直接插入到pET-28a的EcoRI和SalI双酶切位点，所获得的质粒分别命名为pET-adh，pET-asd，pET-dapB，pET-ddh。将上述质粒利用化学转化法转入到大肠杆菌BL21(DE3)中，在含50mg/L的卡那霉素LB平板上筛选获得重组菌，分别命名为BL21/pET-adh，BL21/pET-asd，BL21/pET-dapB，BL21/pET-ddh。
将上述BL21菌株在含50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中培养至OD600达到0.6(37℃，150rpm)，添加0.1mM的IPTG并继续培养12h以诱导蛋白的表达(20℃，150rpm)。将菌体离心分离，并用100ml 100mM的PBS缓冲液(pH7.0)洗涤两次，最后将菌体重悬于5ml的100mM的PBS缓冲液(pH7.0)中。将所述重悬液利用超声进行破碎，并离心获得上清液(12000rpm，30分钟)。利用蛋白纯化试剂盒HisTrap(GE)分离纯化酶，用于酶活检测。
天冬氨酸脱氢酶的活性检测体系包括：100mM的Tris-HCl缓冲液(pH8.2)，0.2mM的辅酶NADH或者NADPH，4mM的草酰乙酸，100mM的氯化铵，和适量的酶。反应在37℃进行，测定其在340nm下的吸光值变化。酶活定义为每分钟消耗1μM的NAD(P)H所需要的酶量(U)。实验结果如表1所示。
天冬氨酸半醛脱氢酶的活性检测体系包括：200mM的CHES缓冲液(pH9.0)，50mM的KPi，0.5mM的辅酶NAD或者NADP，2mM的天冬氨酸半醛，和适量的酶。反应在25℃进行，测定其在340nm下的吸光值变化。酶活定义为每分钟产生1μM的NAD(P)H所需要的酶量(U)。实验结果如表1所示。
二氢吡啶二羧酸还原酶的活性检测体系包括：100mM的HEPES缓冲液(pH7.5)，0.2mM的辅酶NADH或者NADPH，4mM的草酰乙酸，1mM的丙酮酸，0.1mM的天冬氨酸半醛，25ug/ml的二氢吡啶二羧酸合成酶，和适量的酶。反应在25℃进行，测定其在340nm下的吸光值变化。酶活定义为每分钟消耗1μM的NAD(P)H所需要的酶量(U)。实验结果如表1所示。
二氨基庚二酸脱氢酶的活性检测体系包括：100mM的甘氨酸-KOH缓冲液(pH10.0)，0.5mM的辅酶NAD或者NADP，5mM的二氨基庚二酸，和适量的酶。反应在30℃进行，测定其在340nm下的吸光值变化。酶活定义为每分钟产生1μM的NAD(P)H所需要的酶量(U)。实验结果如表1所示。
表1.不同来源的氨基酸脱氢酶的酶活(单位U/mg)
由表1可以看出，本发明所筛选获得的四种酶都可以高效的利用NADH作为辅因子来催化目标反应，而来自谷氨酸棒杆菌的酶基本不能利用NADH。
实施例2、过表达NADH-依赖型的氨基酸脱氢酶提高谷氨酸棒杆菌赖氨酸的产量
本实施例在一株谷氨酸棒杆菌LC298(Applied and environmentalmicrobiology,2011，02912-10)中分别表达本发明所筛选的NADH-依赖性的氨基酸脱氢酶，同时也表达谷氨酸棒杆菌自身所对应的NADPH-依赖型的氨基酸脱氢酶作为对照，比较不同辅酶特异性的酶对于促进赖氨酸合成的影响。
以pET-adh为模板以分别以acagctatgacatgattacgaaggagatatacatatgctgaacattgtgatgatcgg和tgcatgcctgcaggtcgactttagattgaaatggcatgggca为引物克隆NADH-依赖型的天冬氨酸脱氢酶基因片段，利用Gibson组装试剂盒将该片段连接到质粒pEC-K18mob2(从Addgene购买)的EcoRI和XbaI位点内，所获得的质粒命名为pEC-adh_pa。将pEC-adh_pa电转化到谷氨酸棒杆菌LC298中(电转条件为电压2.5KV，200Ω，2mm电转杯)，含50mg/L的卡那霉素LB平板上筛选获得重组菌，分别命名为LC/pEC-adh_pa。同时以谷氨酸棒杆菌LC298为模板，以acagctatgacatgattacgaaggagatatacatatgagttcagtttcgctgcagga和tgcatgcctgcaggtcgactttagttagcgtaatgctccgctgc为引物克隆谷氨酸棒杆菌自身的天冬氨酸氨基转移酶基因片段，利用Gibson组装试剂盒将该片段连接到质粒pEC-K18mob2(从Addgene购买)的EcoRI和XbaI位点内，所获得的质粒命名为pEC-aspC_cg。将pEC-aspC_cg电转化到谷氨酸棒杆菌LC298中(电转条件为电压2.5KV，200Ω，2mm电转杯)，含50mg/L的卡那霉素LB平板上筛选获得重组菌，分别命名为LC/pEC-aspC_cg。
以pET-asd为模板以分别以acagctatgacatgattacgaaggagatatacatatgcgtatcgggattgttgga和tgcatgcctgcaggtcgactttacaccagtaactctgcgatttgc为引物克隆NADH-依赖型的天冬氨酸半醛脱氢酶基因片段，利用Gibson组装试剂盒将该片段连接到质粒pEC-K18mob2(从Addgene购买)的EcoRI和XbaI位点内，所获得的质粒命名为pEC-asd_tm。将pEC-asd_tm电转化到谷氨酸棒杆菌LC298中(电转条件为电压2.5KV，200Ω，2mm电转杯)，含50mg/L的卡那霉素LB平板上筛选获得重组菌，分别命名为LC/pEC-asd_tm。同时以谷氨酸棒杆菌LC298为模板，以acagctatgacatgattacgaaggagatatacatatgaccaccatcgcagttgtt和tgcatgcctgcaggtcgactttacttaaccagcagctcag为引物克隆谷氨酸棒杆菌自身的天冬氨酸半醛脱氢酶基因片段，利用Gibson组装试剂盒将该片段连接到质粒pEC-K18mob2(从Addgene购买)的EcoRI和XbaI位点内，所获得的质粒命名为pEC-asd_cg。将pEC-asd_cg电转化到谷氨酸棒杆菌LC298中(电转条件为电压2.5KV，200Ω，2mm电转杯)，含50mg/L的卡那霉素LB平板上筛选获得重组菌，分别命名为LC/pEC-asd_cg。
以pET-dapB为模板以分别以acagctatgacatgattacgaaggagatatacatatgcgggtaggcgtccttgg和tgcatgcctgcaggtcgactttacaaatttcagtgcagatcgagtagggg为引物克隆NADH-依赖型的二氢吡啶二羧酸还原酶基因片段，利用Gibson组装试剂盒将该片段连接到质粒pEC-K18mob2(从Addgene购买)的EcoRI和XbaI位点内，所获得的质粒命名为pEC-dapB_mt。将pEC-dapB_mt电转化到谷氨酸棒杆菌LC298中(电转条件为电压2.5KV，200Ω，2mm电转杯)，含50mg/L的卡那霉素LB平板上筛选获得重组菌，分别命名为LC/pEC-dapB_mt。同时以谷氨酸棒杆菌LC298为模板，以acagctatgacatgattacgaaggagatatacatatgggaatcaaggttggcgt和tgcatgcctgcaggtcgactttacaggcctaggtaatgctca为引物克隆谷氨酸棒杆菌自身的二氢吡啶二羧酸还原酶基因片段，利用Gibson组装试剂盒将该片段连接到质粒pEC-K18mob2(从Addgene购买)的EcoRI和XbaI位点内，所获得的质粒命名为pEC-pEC-dapB_cg。将pEC-dapB_cg电转化到谷氨酸棒杆菌LC298中(电转条件为电压2.5KV，200Ω，2mm电转杯)，含50mg/L的卡那霉素LB平板上筛选获得重组菌，分别命名为LC/pEC-dapB_cg。
以pET-ddh为模板以分别以acagctatgacatgattacgaaggagatatacatatgccaaagaccaaagtgct和tgcatgcctgcaggtcgactttagaccagacgacaaattaattgttctaagtcg为引物克隆NADH-依赖型的二氨基庚二酸脱氢酶基因片段，利用Gibson组装试剂盒将该片段连接到质粒pEC-K18mob2(从Addgene购买)的EcoRI和XbaI位点内，所获得的质粒命名为pEC-ddh_ta。将pEC-ddh_ta电转化到谷氨酸棒杆菌LC298中(电转条件为电压2.5KV，200Ω，2mm电转杯)，含50mg/L的卡那霉素LB平板上筛选获得重组菌，分别命名为LC/pEC-ddh_ta。同时以谷氨酸棒杆菌LC298为模板，以acagctatgacatgattacgaaggagatatacatatgaccaacatccgcgtagcta和tgcatgcctgcaggtcgactttagacgtcgcgtgcgatca为引物克隆谷氨酸棒杆菌自身的二氨基庚二酸脱氢酶基因片段，利用Gibson组装试剂盒将该片段连接到质粒pEC-K18mob2(从Addgene购买)的EcoRI和XbaI位点内，所获得的质粒命名为pEC-ddh_cg。将pEC-ddh_cg电转化到谷氨酸棒杆菌LC298中(电转条件为电压2.5KV，200Ω，2mm电转杯)，含50mg/L的卡那霉素LB平板上筛选获得重组菌，分别命名为LC/pEC-ddh_cg。
将空质粒pEC-K18mob2电转化到谷氨酸棒杆菌LC298中(电转条件为电压2.5KV，200Ω，2mm电转杯)，含50mg/L的卡那霉素LB平板上筛选获得重组菌，分别命名为LC/pEC-K18作为对照菌株。
将上述所获得的谷氨酸棒杆菌LC298的衍生菌株分别在发酵培养基中培养72h(30℃，200rpm)，检测赖氨酸的产量。发酵培养基的成分为(g/L)：葡萄糖80g，玉米浆10g，尿素4.5g，硫酸铵45g，磷酸二氢钾0.5g，七水硫酸镁0.5g，七水硫酸亚铁10mg，四水硫酸锰10mg，β-丙氨酸5mg，烟酸5mg，硫胺素-盐酸5mg，生物素0.3mg，碳酸钙30g，卡那霉素25mg。
其中对照菌株LC/pEC-K18赖氨酸的产量为14.01g/L,其他菌株的发酵结果如表2所示，说明过表达NADH-依赖型的氨基酸脱氢酶可以显著提高赖氨酸的产量，并且效果优于来源于谷氨酸棒杆菌自身的NADPH-依赖型氨基酸脱氢酶。
表2.表达不同辅酶特异性的氨基酸脱氢酶菌株的赖氨酸产量(单位g/L)
实施例3利用NADH-依赖型的氨基酸脱氢酶替换NADPH-依赖型的氨基酸脱氢酶提高赖氨酸的产量
除了可以直接过表达NADH-依赖型的氨基酸脱氢酶提高赖氨酸产量以外，还可以直接用NADH-依赖型的氨基酸脱氢酶替换谷氨酸棒杆菌中对应的NADPH-依赖型的氨基酸脱氢酶以提高赖氨酸的产量。本实施例在一株谷氨酸棒杆菌ATCC 21543中利用同源重组的方法分别将细胞自身NADPH-依赖型的氨基酸脱氢酶逐一替换为表达本发明所筛选的NADH-依赖性的氨基酸脱氢酶，考察其对于促进赖氨酸合成的影响。
以pET-adh为模板以分别以gtacgcagttatgctgaacattgtgatgatcggatg和gctgtattcacttttagattgaaatggcatgggcatgattt为引物克隆NADH-依赖型的天冬氨酸脱氢酶基因片段adh，以ATCC 21543的基因组为模板分别以acagctatgacatgattacggagttctttcttcagcgctgcg和tgttcagcataactgcgtacctccgcatgtg为引物克隆基因片段adh-up，以ATCC 21543的基因组为模板分别以atttcaatctaaaagtgaatacagcggagacagc和tgcatgcctgcaggtcgactctcttcaacgattttcagcaaggc为引物克隆基因片段adh-down，利用Gibson组装试剂盒将这三个片段连接到质粒pK18-mobsacB(从Addgene购买)的EcoRI和XbaI位点内，所获得的质粒命名为pK18-adh。将pK18-adh电转化到谷氨酸棒杆菌ATCC 21543中(电转条件为电压2.5KV，200Ω，2mm电转杯)，通过两次筛选获得重组菌。一次重组菌在含25mg/L的卡那霉素LB平板上筛选。该重组菌进一步在液体LB培养基里过夜培养，之后在含有100g/L的蔗糖LB平板上进行二次筛选，获得正确重组菌株命名为AM1：aspC，该菌株的主要特征是内源的天冬氨酸转氨酶被替换成NADH-依赖型的天冬氨酸脱氢酶。
以pET-asd为模板以分别以tagttttacaatgcgtatcgggattgttggag和atggcgggtttttacaccagtaactctgcgatttgcac为引物克隆NADH-依赖型的天冬氨酸半醛脱氢酶基因片段asd，以ATCC 21543的基因组为模板分别以acagctatgacatgattacgagcccaatctttcacgggc和cgatacgcattgtaaaactactcctttaaaactttagcgtccg为引物克隆基因片段asd，以ATCC 21543的基因组为模板分别以tactggtgtaaaaacccgccattaaaaactccg和tgcatgcctgcaggtcgactatttgtggtcattatctcggaaaaatgcg为引物克隆基因片段asd-down，利用Gibson组装试剂盒将这三个片段连接到质粒pK18-mobsacB(从Addgene购买)的EcoRI和XbaI位点内，所获得的质粒命名为pK18-asd。将pK18-asd电转化到谷氨酸棒杆菌ATCC 21543中(电转条件为电压2.5KV，200Ω，2mm电转杯)，通过两次筛选获得重组菌。一次重组菌在含25mg/L的卡那霉素LB平板上筛选。该重组菌进一步在液体LB培养基里过夜培养，之后在含有100g/L的蔗糖LB平板上进行二次筛选，获得正确重组菌株命名为AM1：asd，该菌株的主要特征是内源的NADPH-依赖型的天冬氨酸半醛转氨酶被替换成NADH-依赖型的天冬氨酸半醛脱氢酶。
以pET-dapB为模板以分别以aaggagcataatgcatgatgcaaacatccgc和tgaaatgagcctttacaaattattgagatcaagtacatctcgcatatcaaaaag为引物克隆NADH-依赖型的二氢吡啶二羧酸还原酶基因片段dapB，以ATCC 21543的基因组为模板分别以acagctatgacatgattacgctagatcgggctagatcgggctaa和catcatgcattatgctccttcattttcgtggggc为引物克隆基因片段dapB-up，以ATCC 21543的基因组为模板分别以aataatttgtaaaggctcatttcagcagcgg和tgcatgcctgcaggtcgactttaaaagtccatgacatacgggcttgt为引物克隆基因片段dapB-down，利用Gibson组装试剂盒将这三个片段连接到质粒pK18-mobsacB(从Addgene购买)的EcoRI和XbaI位点内，所获得的质粒命名为pK18-dapB。将pK18-dapB电转化到谷氨酸棒杆菌ATCC21543中(电转条件为电压2.5KV，200Ω，2mm电转杯)，通过两次筛选获得重组菌。一次重组菌在含25mg/L的卡那霉素LB平板上筛选。该重组菌进一步在液体LB培养基里过夜培养，之后在含有100g/L的蔗糖LB平板上进行二次筛选，获得正确重组菌株命名为AM1：dapB，该菌株的主要特征是内源的NADPH-依赖型的二氢吡啶二羧酸还原酶被替换成NADH-依赖型的二氢吡啶二羧酸还原酶。
以pET-ddh为模板以分别以ttacaagaacatgccaaagaccaaagtgctg和tcgagctaaattagaccagacgacaaattaattgttctaagtcg为引物克隆NADH-依赖型的二氨基庚二酸脱氢酶基因片段ddh，以ATCC 21543的基因组为模板分别以acagctatgacatgattacgatcgctcaaggctgctgctg和tctttggcatgttcttgtaatcctccaaaattgtggtgg为引物克隆基因片段ddh-up，以ATCC21543的基因组为模板分别以tctggtctaatttagctcgaggggcaaggaa和tgcatgcctgcaggtcgactcttcccccgcaagacgatg为引物克隆基因片段ddh-down，利用Gibson组装试剂盒将这三个片段连接到质粒pK18-mobsacB(从Addgene购买)的EcoRI和XbaI位点内，所获得的质粒命名为pK18-ddh。将pK18-ddh电转化到谷氨酸棒杆菌ATCC 21543中(电转条件为电压2.5KV，200Ω，2mm电转杯)，通过两次筛选获得重组菌。一次重组菌在含25mg/L的卡那霉素LB平板上筛选。该重组菌进一步在液体LB培养基里过夜培养，之后在含有100g/L的蔗糖LB平板上进行二次筛选，获得正确重组菌株命名为AM1：ddh，该菌株的主要特征是内源的NADPH-依赖型的二氨基庚二酸脱氢酶被替换成NADH-依赖型的二氨基庚二酸脱氢酶。
将pK18-asd电转化到谷氨酸棒杆菌AM1：aspC中(电转条件为电压2.5KV，200Ω，2mm电转杯)，通过两次筛选获得重组菌。一次重组菌在含25mg/L的卡那霉素LB平板上筛选。该重组菌进一步在液体LB培养基里过夜培养，之后在含有100g/L的蔗糖LB平板上进行二次筛选，获得正确重组菌株命名为AM2，该菌株的主要特征是内源的天冬氨酸转氨酶被替换成NADH-依赖型的天冬氨酸脱氢酶，以及内源的NADPH-依赖型的天冬氨酸半醛转氨酶被替换成NADH-依赖型的天冬氨酸半醛脱氢酶。
将pK18-dapB电转化到谷氨酸棒杆菌AM2中(电转条件为电压2.5KV，200Ω，2mm电转杯)，通过两次筛选获得重组菌。一次重组菌在含25mg/L的卡那霉素LB平板上筛选。该重组菌进一步在液体LB培养基里过夜培养，之后在含有100g/L的蔗糖LB平板上进行二次筛选，获得正确重组菌株命名为AM3，该菌株的主要特征是内源的天冬氨酸转氨酶被替换成NADH-依赖型的天冬氨酸脱氢酶，以及内源的NADPH-依赖型的天冬氨酸半醛转氨酶被替换成NADH-依赖型的天冬氨酸半醛脱氢酶，以及内源的NADPH-依赖型的二氢吡啶二羧酸还原酶被替换成NADH-依赖型的二氢吡啶二羧酸还原酶。
将pK18-ddh电转化到谷氨酸棒杆菌AM3中(电转条件为电压2.5KV，200Ω，2mm电转杯)，通过两次筛选获得重组菌。一次重组菌在含25mg/L的卡那霉素LB平板上筛选。该重组菌进一步在液体LB培养基里过夜培养，之后在含有100g/L的蔗糖LB平板上进行二次筛选，获得正确重组菌株命名为AM4，该菌株的主要特征是内源的天冬氨酸转氨酶被替换成NADH-依赖型的天冬氨酸脱氢酶，以及内源的NADPH-依赖型的天冬氨酸半醛转氨酶被替换成NADH-依赖型的天冬氨酸半醛脱氢酶，以及内源的NADPH-依赖型的二氢吡啶二羧酸还原酶被替换成NADH-依赖型的二氢吡啶二羧酸还原酶，以及内源的NADPH-依赖型的二氨基庚二酸脱氢酶被替换成NADH-依赖型的二氨基庚二酸脱氢酶。
将上述所获得的谷氨酸棒杆菌ATCC 21543的衍生菌株分别在发酵培养基中培养72h(30℃，200rpm)，检测赖氨酸的产量。发酵培养基的成分为(g/L)：葡萄糖80g，玉米浆10g，尿素4.5g，硫酸铵45g，磷酸二氢钾0.5g，七水硫酸镁0.5g，七水硫酸亚铁10mg，四水硫酸锰10mg，β-丙氨酸5mg，烟酸5mg，硫胺素-盐酸5mg，生物素0.3mg，碳酸钙30g，苏氨酸0.2g，亮氨酸0.2g。各菌株的发酵结果如表3所示，说明利用本发明所筛选的NADH-依赖型的氨基酸脱氢酶单独或者组合替换谷氨酸棒杆菌自身的NADPH-依赖型的氨基酸脱氢酶可以显著提高赖氨酸的产量。
表3.替换氨基酸脱氢酶重组菌株的赖氨酸产量(单位g/L)
ATCC 21543 AM1:aspC AM1:asd AM1:dapB AM1:ddh AM2 AM3 AM4
21.2 23.8 24.1 23.7 22.6 25.8 27.7 25.6
实施例4利用包含NADH-依赖型的氨基酸脱氢酶的谷氨酸棒杆菌提高戊二胺的产量
在上述表达NADH依赖型的菌株中表达赖氨酸脱羧酶可以实现戊二胺的直接生物合成。本实施例在实施例3所获得的菌株的基础上，利用同源重组的方法将赖氨酸的外排基因lysE替换为来源于大肠杆菌的谷氨酸脱羧酶基因cadA，实现从葡萄糖到戊二胺的直接生产，考察NADH依赖型的氨基酸脱氢酶对于促进戊二胺合成的影响。
以大肠杆菌MG1655为模板分别以TTCGTGGTGTTGCCCGTGGCCCGGTTGGTTGGGCAGGAGTATATTGGGATCCatgAACGTTATTGCAATATTGAATC和catcaacatcagttaTTTTTTGCTTTCTTCTTTCAATAC为引物克隆赖氨酸脱羧酶基因片段cadA，以ATCC 21543的基因组为模板分别以acagctatgacatgattacgcgggcgaagaagtgaaaaacc和GCCACGGGCAACACCACGAATGCGCTACCTTAACCGAAAAGTTACTTTcgtgacctatggaagtacttaa为引物克隆基因片段cadA-up，以ATCC21543的基因组为模板分别以GCAAAAAAtaactgatgttgatgggttagttttcgc和tgcatgcctgcaggtcgactttcaacgcagcgcagcatta为引物克隆基因片段cadA-down，利用Gibson组装试剂盒将这三个片段连接到质粒pK18-mobsacB(从Addgene购买)的EcoRI和XbaI位点内，所获得的质粒命名为pK18-cadA。将pK18-cadA分别电转化到谷氨酸棒杆菌ATCC 21543，AM1：aspC，AM1：asd，AM1：dapB，AM1：ddh，AM2，AM3，AM4中(电转条件为电压2.5KV，200Ω，2mm电转杯)，通过两次筛选获得重组菌。一次重组菌在含25mg/L的卡那霉素LB平板上筛选。该重组菌进一步在液体LB培养基里过夜培养，之后在含有100g/L的蔗糖LB平板上进行二次筛选，获得正确重组菌株分别命名为ATCC 21543-cadA，AM1：aspC-cadA，AM1：asd-cadA，AM1：dapB-cadA，AM1：ddh-cadA，AM2-cadA，AM3-cadA，AM4-cadA。这些菌株的特征是其内源的lysE基因被大肠杆菌的赖氨酸脱羧酶基因cadA所替换。
将上述所获得的谷氨酸棒杆菌菌株分别在发酵培养基中培养72h(30℃，200rpm)，检测赖氨酸的产量。发酵培养基的成分为(g/L)：葡萄糖80g，玉米浆10g，尿素4.5g，硫酸铵45g，磷酸二氢钾0.5g，七水硫酸镁0.5g，七水硫酸亚铁10mg，四水硫酸锰10mg，β-丙氨酸5mg，烟酸5mg，硫胺素-盐酸5mg，生物素0.3mg，碳酸钙30g，苏氨酸0.2g，亮氨酸0.2g。各菌株的发酵结果如表4所示，说明利用本发明所筛选的NADH-依赖型的氨基酸脱氢酶单独或者组合替换谷氨酸棒杆菌自身的NADPH-依赖型的氨基酸脱氢酶可以显著提高戊二胺的产量。
表4.替换氨基酸脱氢酶重组菌株的戊二胺产量(单位g/L)
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 清华大学
<120> NADH依赖性的氨基酸脱氢酶及其在提高赖氨酸产量中的应用
<130> KHP181115897.1
<160> 54
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 267
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Leu Asn Ile Val Met Ile Gly Cys Gly Ala Ile Gly Ala Gly Val
1 5 10 15
Leu Glu Leu Leu Glu Asn Asp Pro Gln Leu Arg Val Asp Ala Val Ile
20 25 30
Val Pro Arg Asp Ser Glu Thr Gln Val Arg His Arg Leu Ala Ser Leu
35 40 45
Arg Arg Pro Pro Arg Val Leu Ser Ala Leu Pro Ala Gly Glu Arg Pro
50 55 60
Asp Leu Leu Val Glu Cys Ala Gly His Arg Ala Ile Glu Gln His Val
65 70 75 80
Leu Pro Ala Leu Ala Gln Gly Ile Pro Cys Leu Val Val Ser Val Gly
85 90 95
Ala Leu Ser Glu Pro Gly Leu Val Glu Arg Leu Glu Ala Ala Ala Gln
100 105 110
Ala Gly Gly Ser Arg Ile Glu Leu Leu Pro Gly Ala Ile Gly Ala Ile
115 120 125
Asp Ala Leu Ser Ala Ala Arg Val Gly Gly Leu Glu Ser Val Arg Tyr
130 135 140
Thr Gly Arg Lys Pro Ala Ser Ala Trp Leu Gly Thr Pro Gly Glu Thr
145 150 155 160
Val Cys Asp Leu Gln Arg Leu Glu Lys Ala Arg Val Ile Phe Asp Gly
165 170 175
Ser Ala Arg Glu Ala Ala Arg Leu Tyr Pro Lys Asn Ala Asn Val Ala
180 185 190
Ala Thr Leu Ser Leu Ala Gly Leu Gly Leu Asp Arg Thr Gln Val Arg
195 200 205
Leu Ile Ala Asp Pro Glu Ser Cys Glu Asn Val His Gln Val Glu Ala
210 215 220
Ser Gly Ala Phe Gly Gly Phe Glu Leu Thr Leu Arg Gly Lys Pro Leu
225 230 235 240
Ala Ala Asn Pro Lys Thr Ser Ala Leu Thr Val Tyr Ser Val Val Arg
245 250 255
Ala Leu Gly Asn His Ala His Ala Ile Ser Ile
260 265
<210> 2
<211> 804
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgctgaaca ttgtgatgat cggatgtgga gcaattggtg cgggagttct ggagcttctt 60
gaaaacgacc ctcagcttcg tgttgatgca gtaatcgtcc cgcgcgactc tgaaacacag 120
gtacgccatc gtttggcatc cctgcgtcgt ccacctcgcg tattatcggc cttgcctgcg 180
ggtgagcgcc cggacctgtt agtggagtgt gcaggacatc gcgctattga gcaacacgtc 240
ctgcctgcat tggctcaggg catcccctgc ctggtggtgt ctgtgggtgc gttatcggaa 300
ccgggattgg tagaacgttt agaagctgcg gcccaagctg gaggcagccg cattgaatta 360
ctgcccggtg caatcggagc aattgatgca ctgagtgccg cacgtgttgg gggattggaa 420
tccgtgcgtt acactggtcg caaacccgct tcggcatggc ttggcacgcc tggggaaacg 480
gtgtgcgact tacagcgttt ggaaaaagca cgcgttatct ttgacggcag cgcacgcgaa 540
gccgcccgct tatatcctaa aaatgccaac gtggcggcaa ccctttcttt agccggactt 600
gggcttgatc gcacacaagt acgcttaatt gcggaccccg agtcctgtga gaacgtacac 660
caggtggagg cttcaggcgc ttttggcggg ttcgagctta ccttgcgtgg caaaccatta 720
gcagcgaacc cgaaaacgtc ggctttaaca gtgtactcag tggtccgtgc tttaggaaat 780
catgcccatg ccatttcaat ctaa 804
<210> 3
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Met Arg Ile Gly Ile Val Gly Ala Thr Gly Ala Val Gly Gln Glu Thr
1 5 10 15
Ile Gln Val Leu Lys Asp Arg Gly Phe Pro Val Thr Glu Leu His Leu
20 25 30
Phe Ala Ser Glu Arg Ser Ala Gly Lys Thr Thr Glu Thr Ala Phe Gly
35 40 45
Thr Ile Thr Ile Glu Pro Phe Ser Val Asp Ala Ala Arg Gly Met Asp
50 55 60
Ile Val Phe Leu Ala Val Ser Gly Asp Phe Ala Lys Glu Tyr Ala Pro
65 70 75 80
Gln Ile Ala Ala Glu Gly Gly Ala Val Val Ile Asp Asn Ser Ser Ala
85 90 95
Phe Arg Tyr Asp Asp Ala Val Pro Leu Val Val Pro Glu Ile Asn Gly
100 105 110
Arg Arg Ala Leu Gly Gln Lys Leu Ile Ala Asn Pro Asn Cys Thr Thr
115 120 125
Ala Ile Leu Leu Met Ala Leu Ala Pro Leu His Glu Ala Phe Gly Val
130 135 140
Lys Arg Ala Ile Val Ser Thr Tyr Gln Ala Ala Ser Gly Ala Gly Ala
145 150 155 160
Glu Gly Met Thr Glu Leu Glu Gln Gly Ala Arg Gln Tyr Leu Ala Gly
165 170 175
Glu Pro Val Thr Ala Ser Lys Phe Ala His Pro Leu Ala Phe Asn Leu
180 185 190
Ile Pro His Ile Asp Ser Phe Gln Asp Asn Gly Tyr Thr Arg Glu Glu
195 200 205
Met Lys Val Leu Trp Glu Thr Arg Lys Ile Met Glu Ala Pro Glu Val
210 215 220
Leu Leu Ser Cys Thr Ala Val Arg Val Pro Thr Met Arg Ala His Ala
225 230 235 240
Glu Ala Val Thr Ile Glu Thr Arg His Pro Val Thr Pro Ala Ala Ala
245 250 255
Arg Glu Val Leu Ala Lys Ala Gln Gly Val Thr Leu Ala Asp Asp Pro
260 265 270
Ala Asn Lys Leu Tyr Pro Met Pro Leu Thr Ala Ser Ser Lys Tyr Asp
275 280 285
Val Glu Val Gly Arg Ile Arg Glu Ser Leu Val Phe Gly Glu Thr Gly
290 295 300
Leu Asp Phe Phe Val Cys Gly Asp Gln Leu Leu Lys Gly Ala Ala Leu
305 310 315 320
Asn Thr Val Gln Ile Ala Glu Leu Leu Val
325 330
<210> 4
<211> 993
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atgcgtatcg ggattgttgg agctacaggc gctgtgggcc aggagactat ccaagttctg 60
aaggaccgtg gcttccctgt cactgaactg catttgtttg ctagtgaacg ttccgcagga 120
aagactacag aaacagcctt cggaacaatt acaatcgaac cattctctgt ggacgcggct 180
cgtggcatgg acatcgtttt cttagcagtc agcggagact tcgccaaaga atatgcgcct 240
caaattgctg cggaaggagg agcagtggta attgataata gttccgcctt tcgctacgac 300
gacgcggtac cgctggtggt accggaaatt aatggacgcc gtgcgttggg tcagaaactg 360
atcgcgaacc ccaattgtac aacggctatc ctgcttatgg cacttgcacc gttgcatgaa 420
gcatttggag taaaacgcgc tattgtttcg acctaccaag cagcttcagg cgcgggtgcg 480
gaaggaatga ccgaattgga gcaaggggcc cgccaatatc ttgccggtga acctgttacg 540
gcgtctaagt tcgctcatcc gctggcattt aatcttattc cccacattga tagttttcaa 600
gataacggtt acacacgcga agagatgaaa gtgttgtggg aaacacgtaa gatcatggaa 660
gcacccgaag ttcttttatc atgcaccgcc gttcgtgtac ccaccatgcg cgctcacgcc 720
gaggcggtaa cgattgagac gcgccaccct gttactcctg ccgctgcacg cgaggtgtta 780
gctaaggctc aaggcgtgac acttgcggac gatccagcta ataaattgta cccaatgccc 840
ctgaccgcat ctagcaagta cgacgtagaa gtgggacgta ttcgtgaatc gctggtgttt 900
ggcgaaacgg gcctggactt cttcgtgtgc ggggatcaac tgctgaaggg tgcggcatta 960
aataccgtgc aaatcgcaga gttactggtg taa 993
<210> 5
<211> 245
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Met Arg Val Gly Val Leu Gly Ala Lys Gly Lys Val Gly Ala Thr Met
1 5 10 15
Val Arg Ala Val Ala Ala Ala Asp Asp Leu Thr Leu Ser Ala Glu Leu
20 25 30
Asp Ala Gly Asp Pro Leu Ser Leu Leu Thr Asp Gly Asn Thr Glu Val
35 40 45
Val Ile Asp Phe Thr His Pro Asp Val Val Met Gly Asn Leu Glu Phe
50 55 60
Leu Ile Asp Asn Gly Ile His Ala Val Val Gly Thr Thr Gly Phe Thr
65 70 75 80
Ala Glu Arg Phe Gln Gln Val Glu Ser Trp Leu Val Ala Lys Pro Asn
85 90 95
Thr Ser Val Leu Ile Ala Pro Asn Phe Ala Ile Gly Ala Val Leu Ser
100 105 110
Met His Phe Ala Lys Gln Ala Ala Arg Phe Phe Asp Ser Ala Glu Val
115 120 125
Ile Glu Leu His His Pro His Lys Ala Asp Ala Pro Ser Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Arg Thr Ala Lys Leu Ile Ala Glu Ala Arg Lys Gly Leu Pro Pro
145 150 155 160
Asn Pro Asp Ala Thr Ser Thr Ser Leu Pro Gly Ala Arg Gly Ala Asp
165 170 175
Val Asp Gly Ile Pro Val His Ala Val Arg Leu Ala Gly Leu Val Ala
180 185 190
His Gln Glu Val Leu Phe Gly Thr Glu Gly Glu Thr Leu Thr Ile Arg
195 200 205
His Asp Ser Leu Asp Arg Thr Ser Phe Val Pro Gly Val Leu Leu Ala
210 215 220
Val Arg Arg Ile Ala Glu Arg Pro Gly Leu Thr Val Gly Leu Glu Pro
225 230 235 240
Leu Leu Asp Leu His
245
<210> 6
<211> 738
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atgcgggtag gcgtccttgg agccaaaggc aaggtcggaa cgacaatggt gcgggcggtg 60
gccgccgccg acgacctgac cctatccgcc gagctggatg ccggcgatcc gctgagcctg 120
ctaacggacg gtaacaccga ggtcgtcatc gacttcaccc acccggacgt ggtgatgggc 180
aatctggagt tcctcatcga caacggaatt cacgccgtgg tcggtaccac ggggttcacc 240
gccgagcggt ttcaacaagt cgaatcgtgg ctcgtcgcaa aacccaacac atcggtgttg 300
atagcgccaa acttcgcgat cggagcggtg ctgtccatgc atttcgccaa gcaggccgca 360
cggtttttcg actcggccga ggtcattgag ctgcatcatc cgcacaaggc tgacgcgccg 420
tcaggcacgg ccgcgcgtac cgcgaagctg atcgccgagg cccgaaaagg cttgccgccc 480
aatcccgatg ccaccagtac cagcctgccg ggcgcgcgtg gtgccgacgt cgacggcata 540
ccggtgcacg cggtgcggct ggccggactg gtcgcccacc aggaagtgct gttcgggacc 600
gagggggaga ctctgaccat ccgccacgat agcctcgatc gcacatcgtt tgtgcccggt 660
gtgctgttgg cggtgcgccg catcgccgaa cgccctggtc tcaccgtagg tcttgagccc 720
ctactcgatc tgcactga 738
<210> 7
<211> 300
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Met Gln Arg Val Lys Val Ala Ile Ile Gly Phe Gly Asn Val Gly Lys
1 5 10 15
Glu Val Met Gly Ala Val Ile Glu Ser Pro Asp Met Glu Val Ala Gly
20 25 30
Ile Val Glu Val Pro Lys Lys Val Glu Cys Met Lys Gly Lys Phe His
35 40 45
Asn Phe Pro Val Thr Ser Asn Val Glu Lys Leu Asp Lys Val Asp Ile
50 55 60
Ala Ile Leu Ala Val Asp Ser Arg Cys Val Pro Gln Ile Ala Pro Tyr
65 70 75 80
Tyr Leu Glu Arg Gly Ile Asn Thr Val Asp Ala Phe Asp Ile His Gly
85 90 95
Asp Ser Ile Ile Arg Leu Arg Glu Glu Leu Thr Leu Val Ala Lys Ala
100 105 110
His Asp Ala Val Ala Ile Ile Ser Ala Gly Trp Asp Pro Gly Thr Asn
115 120 125
Ser Val Val Arg Thr Ile Met Gln Thr Ile Ala Pro Lys Gly Ile Thr
130 135 140
Tyr Thr Asn Tyr Gly Pro Gly Met Ser Met Gly His Thr Val Ala Ala
145 150 155 160
Lys Ala Val Glu Gly Val Ala Asp Ala Val Ser Leu Thr Ile Pro Glu
165 170 175
Gly Asn Gly Ile His Lys Arg Leu Val Tyr Val Lys Ile Lys Pro Asp
180 185 190
Tyr Asp Phe Lys Lys Ile Glu Glu Ala Ile Lys Asn Asp Ser Tyr Phe
195 200 205
Lys His Asp Thr Thr Ile Val Tyr Asn Val Asp Asp Ile Glu Asn Leu
210 215 220
Ile Asp Met Gly His Gly Val His Ile Glu Arg Lys Gly Val Ser Gly
225 230 235 240
Arg Thr His Asn Gln Arg Met Glu Phe Ile Met Gln Val Thr Asn Pro
245 250 255
Ala Ala Thr Ala Gln Val Met Val Ser Ala Ala Arg Ala Ser Leu Lys
260 265 270
Gln Lys Pro Gly Ala Tyr Thr Leu Ala Glu Ile Pro Pro Ile Asp Tyr
275 280 285
Leu His Gly Lys Lys Glu Glu Ile Ile Leu Lys Leu
290 295 300
<210> 8
<211> 906
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
atgcagcgtg ttaaggtggc tattatcggt tttggcaacg taggaaagga agtgatgggc 60
gccgttatcg agtcccctga catggaagtt gcaggcattg tagaagtccc taaaaaagtg 120
gagtgtatga aaggaaagtt tcacaacttt ccggtaacgt ccaatgtgga gaaacttgac 180
aaggtggata tcgctatcct cgctgtagat tcacgttgtg tgcctcagat cgcaccttat 240
tatcttgaac gcggcatcaa cacggtggat gcttttgaca ttcacggtga ttcgattatc 300
cggctgcggg aggaactgac ccttgttgcc aaagcgcacg acgcagttgc gatcatctcg 360
gcgggttggg acccaggaac taattccgta gtgcgtacta ttatgcaaac gattgcgccc 420
aagggaatca cttacactaa ctacggaccg ggtatgagca tgggacacac ggtagccgct 480
aaagctgttg agggtgtggc tgacgcggtc tcactcacca ttccggaagg caatggcatc 540
cacaagcgcc tcgtctacgt gaaaatcaag cccgactacg atttcaaaaa gattgaggaa 600
gctattaaga acgactctta ttttaagcat gatacgacga tcgtgtacaa cgtggatgat 660
atcgagaacc ttatcgacat gggacacgga gtacatattg agcgcaaagg cgttagcgga 720
cgtacccata accaacgcat ggagttcatc atgcaagtca ctaaccccgc tgccaccgca 780
caggtaatgg tctcggcggc acgggcaagc ctgaaacaaa agcccggagc gtacacgctc 840
gcggaaatcc ctcctattga ttaccttcac ggcaaaaagg aagagatcat tctcaaactg 900
ctgtaa 906
<210> 9
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
acagctatga catgattacg aaggagatat acatatgctg aacattgtga tgatcgg 57
<210> 10
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tgcatgcctg caggtcgact ttagattgaa atggcatggg ca 42
<210> 11
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
acagctatga catgattacg aaggagatat acatatgagt tcagtttcgc tgcagga 57
<210> 12
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tgcatgcctg caggtcgact ttagttagcg taatgctccg ctgc 44
<210> 13
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
acagctatga catgattacg aaggagatat acatatgcgt atcgggattg ttgga 55
<210> 14
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
tgcatgcctg caggtcgact ttacaccagt aactctgcga tttgc 45
<210> 15
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
acagctatga catgattacg aaggagatat acatatgacc accatcgcag ttgtt 55
<210> 16
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
tgcatgcctg caggtcgact ttacttaacc agcagctcag 40
<210> 17
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
acagctatga catgattacg aaggagatat acatatgcgg gtaggcgtcc ttgg 54
<210> 18
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
tgcatgcctg caggtcgact ttacaaattt cagtgcagat cgagtagggg 50
<210> 19
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
acagctatga catgattacg aaggagatat acatatggga atcaaggttg gcgt 54
<210> 20
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
tgcatgcctg caggtcgact ttacaggcct aggtaatgct ca 42
<210> 21
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
acagctatga catgattacg aaggagatat acatatgcca aagaccaaag tgc 53
<210> 22
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
tgcatgcctg caggtcgact ttagaccaga cgacaaatta attgttctaa gtcg 54
<210> 23
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
acagctatga catgattacg aaggagatat acatatgacc aacatccgcg tagcta 56
<210> 24
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
tgcatgcctg caggtcgact ttagacgtcg cgtgcgatca 40
<210> 25
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
gtacgcagtt atgctgaaca ttgtgatgat cggatg 36
<210> 26
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
gctgtattca cttttagatt gaaatggcat gggcatgatt t 41
<210> 27
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
acagctatga catgattacg gagttctttc ttcagcgctg cg 42
<210> 28
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
tgttcagcat aactgcgtac ctccgcatgt g 31
<210> 29
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
atttcaatct aaaagtgaat acagcggaga cagc 34
<210> 30
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
tgcatgcctg caggtcgact ctcttcaacg attttcagca aggc 44
<210> 31
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
tagttttaca atgcgtatcg ggattgttgg ag 32
<210> 32
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
atggcgggtt tttacaccag taactctgcg atttgcac 38
<210> 33
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
acagctatga catgattacg agcccaatct ttcacgggc 39
<210> 34
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
cgatacgcat tgtaaaacta ctcctttaaa actttagcgt ccg 43
<210> 35
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
tactggtgta aaaacccgcc attaaaaact ccg 33
<210> 36
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
tgcatgcctg caggtcgact atttgtggtc attatctcgg aaaaatgcg 49
<210> 37
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
aaggagcata atgcatgatg caaacatccg c 31
<210> 38
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
tgaaatgagc ctttacaaat tattgagatc aagtacatct cgcatatcaa aaag 54
<210> 39
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
acagctatga catgattacg ctagatcggg ctagatcggg ctaa 44
<210> 40
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
catcatgcat tatgctcctt cattttcgtg gggc 34
<210> 41
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
aataatttgt aaaggctcat ttcagcagcg g 31
<210> 42
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
tgcatgcctg caggtcgact ttaaaagtcc atgacatacg ggcttgt 47
<210> 43
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
ttacaagaac atgccaaaga ccaaagtgct g 31
<210> 44
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
tcgagctaaa ttagaccaga cgacaaatta attgttctaa gtcg 44
<210> 45
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
acagctatga catgattacg atcgctcaag gctgctgctg 40
<210> 46
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
tctttggcat gttcttgtaa tcctccaaaa ttgtggtgg 39
<210> 47
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
tctggtctaa tttagctcga ggggcaagga a 31
<210> 48
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
tgcatgcctg caggtcgact cttcccccgc aagacgatg 39
<210> 49
<211> 77
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
ttcgtggtgt tgcccgtggc ccggttggtt gggcaggagt atattgggat ccatgaacgt 60
tattgcaata ttgaatc 77
<210> 50
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
catcaacatc agttattttt tgctttcttc tttcaatac 39
<210> 51
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
acagctatga catgattacg cgggcgaaga agtgaaaaac c 41
<210> 52
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
gccacgggca acaccacgaa tgcgctacct taaccgaaaa gttactttcg tgacctatgg 60
aagtacttaa 70
<210> 53
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
gcaaaaaata actgatgttg atgggttagt tttcgc 36
<210> 54
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
tgcatgcctg caggtcgact ttcaacgcag cgcagcatta 40

Claims (10)

1.NADH依赖性的氨基酸脱氢酶，所述氨基酸脱氢酶为：
来源于Pseudomonas aeruginos的天冬氨酸脱氢酶；
来源于Tistrella mobilis的天冬氨酸半醛脱氢酶；
来源于Mycobacterium tuberculosis的二氢吡啶二羧酸还原酶；和/或
来源于Tepidanaerobacter acetatoxydans的二氨基庚二酸脱氢酶；
其氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1、3、5、7所示或如SEQ ID No.1、3、5、7所示氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸而不影响其生物活性的氨基酸序列。
2.编码权利要求1所述NADH依赖性的氨基酸脱氢酶的基因，其特征在于，其核苷酸序列分别含有如SEQ ID NO.2、4、6、8所示的核苷酸序列或SEQ ID No.2、4、6、8所示核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个碱基的具有90％以上同源性的、编码相同功能氨基酸脱氢酶的核苷酸序列。
3.含有权利要求2所述基因的生物材料，其特征在于，所述生物材料为载体、重组菌、细胞系或表达盒。
4.如权利要求3所述的生物材料，其特征在于，所述重组菌为可以发酵生产赖氨酸或戊二胺的菌株中含有或过表达权利要求1所述的NADH依赖性的氨基酸脱氢酶。
5.如权利要求4所述的生物材料，其特征在于，所述重组菌为可以发酵生产赖氨酸或戊二胺的菌株中含有或过表达来源于Pseudomonas aeruginos的天冬氨酸脱氢酶和来源于Tistrella mobilis的天冬氨酸半醛脱氢酶；或
含有或过表达来源于Pseudomonas aeruginos的天冬氨酸脱氢酶、来源于Tistrellamobilis的天冬氨酸半醛脱氢酶和来源于Mycobacterium tuberculosis的二氢吡啶二羧酸还原酶；或
含有或过表达来源于Pseudomonas aeruginos的天冬氨酸脱氢酶、来源于Tistrellamobilis的天冬氨酸半醛脱氢酶、来源于Mycobacterium tuberculosis的二氢吡啶二羧酸还原酶和来源于Tepidanaerobacter acetatoxydans的二氨基庚二酸脱氢酶。
6.如权利要求3-5任一所述的生物材料，其特征在于，所述重组菌为可以发酵生产赖氨酸或戊二胺的菌株中NADPH-依赖性的氨基酸脱氢酶被权利要求1所述的NADH依赖性的氨基酸脱氢酶所替代。
7.权利要求1所述的NADH依赖性的氨基酸脱氢酶或其编码基因或权利要求3-6任一所述的生物材料在制备赖氨酸或戊二胺中的应用。
8.权利要求1所述的NADH依赖性的氨基酸脱氢酶或其编码基因或权利要求3-6任一所述的生物材料在提高赖氨酸产量或提高戊二胺产量中的应用。
9.如权利要求7或8所述的应用，其特征在于，发酵生产戊二胺时，发酵菌株中内源的lysE基因被大肠杆菌的赖氨酸脱羧酶基因cadA所替换。
10.权利要求1所述的NADH依赖性的氨基酸脱氢酶或其编码基因或权利要求3-6任一所述的生物材料在制备药物或饲料添加剂中的应用。
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