CN106190997A - 一种nadh依赖性的二氨基庚二酸脱氢酶及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种NADH依赖性的二氨基庚二酸脱氢酶及其应用，本发明的二氨基庚二酸脱氢酶来源于Pseudothermotoga thermarum，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码其的基因序列如SEQ ID NO.2所示。本发明的二氨基庚二酸脱氢酶催化L‑2‑氨基‑6‑酮庚二酸的氨基化具有很高的活性，其能同时利用NADH和NADPH作为辅因子，且其对NADH的利用效率要远高于NADPH，通过在谷氨酸棒杆菌或大肠杆菌中过表达本发明所提供的二氨基庚二酸脱氢酶基因可以显著的提高赖氨酸的产量，具有广阔的应用前景。

Description

一种NADH依赖性的二氨基庚二酸脱氢酶及其应用
技术领域
本发明属于基因工程和生物发酵技术领域，具体地说，涉及一种NADH依赖性的二氨基庚二酸脱氢酶及其应用。
背景技术
赖氨酸是一种及其重要的氨基酸，广泛应用于饲料添加剂、保健及医药领域。目前，赖氨酸的工业生产主要通过微生物发酵法进行，工业常用的菌种包括谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌。在赖氨酸的生物合成过程中，二氨基庚二酸脱氢酶催化L-2-氨基-6-酮庚二酸的氨基化反应生成内消旋的2,6-二氨基庚二酸，后者在二氨基庚二酸脱羧酶的作用下生成赖氨酸。因此，二氨基庚二酸脱氢酶是赖氨酸合成的关键酶，通过在谷氨酸棒杆菌(中国专利CN 200980103315.6)或者大肠杆菌中(中国专利CN 200880100226.1)过表达来源于谷氨酸棒杆菌的二氨基庚二酸脱氢酶可以显著的提高赖氨酸的产量。
目前所有已知的二氨基庚二酸脱氢酶是辅酶NADPH-特异性的，即该酶仅能利用NADPH为底物，而不能利用NADH作为底物。但是在细胞内，NADH的浓度远远大于NADPH，因此如果能够找到或者构建一种NADH-依赖性的二氨基庚二酸脱氢酶，其有可能更高效的促进2,6-二氨基庚二酸的合成，提高赖氨酸的产量。
发明内容
本发明的目的是提供一种NADH依赖性的二氨基庚二酸脱氢酶及其应用。
本发明提供的NADH依赖性的二氨基庚二酸脱氢酶，其来源于Pseudothermotogathermarum，其含有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列或SEQ ID No.1所示氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸而不影响其生物活性的氨基酸序列。
经密码子优化改造，本发明提供了编码上述NADH依赖性的二氨基庚二酸脱氢酶的基因，其核苷酸序列含有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列或SEQ ID No.2所示核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个核苷酸。
本发明提供了含有上述基因的生物材料，所述生物材料为载体、重组菌、细胞系或表达盒。
优选地，所述重组菌为重组谷氨酸棒杆菌或重组大肠杆菌。
在本发明的实施例中，在大肠杆菌中表达本发明上述来源于Pseudothermotogathermarum的二氨基庚二酸脱氢酶的基因，检测其催化活性和对辅酶NADH、NADPH的特异性，发现以NADH为底物其催化酶活达到116.9U/mg；能够同时利用NADH、NADPH；在本发明的另一个实施例中，在谷氨酸棒杆菌中过表达本发明的二氨基庚二酸脱氢酶基因，发现赖氨酸产量达到22.2g/L，显著高于过表达NADPH依赖性二氨基庚二酸脱氢酶的谷氨酸棒杆菌；在大肠杆菌中过表达不同来源的二氨基庚二酸脱氢酶基因，发现本发明二氨基庚二酸脱氢酶对赖氨酸产量有明显的提高作用。
因此，本发明提供了上述NADH依赖性的二氨基庚二酸脱氢酶或其编码基因或含有其编码基因的生物材料在催化L-2-氨基-6-酮庚二酸的氨基化反应中的应用。
本发明提供了上述NADH依赖性的二氨基庚二酸脱氢酶或其编码基因或含有其编码基因的生物材料在制备内消旋的2,6-二氨基庚二酸中的应用。
本发明提供了上述NADH依赖性的二氨基庚二酸脱氢酶或其编码基因或含有其编码基因的生物材料在制备赖氨酸中的应用。
本发明提供了上述NADH依赖性的二氨基庚二酸脱氢酶或其编码基因或含有其编码基因的生物材料在提高赖氨酸产量中的应用。
本发明提供了上述NADH依赖性的二氨基庚二酸脱氢酶或其编码基因或含有其编码基因的生物材料在制备饲料添加剂中的应用。
本发明提供了上述NADH依赖性的二氨基庚二酸脱氢酶或其编码基因或含有其编码基因的生物材料在制备药物中的应用。
本发明提供的NADH依赖性的二氨基庚二酸脱氢酶对催化L-2-氨基-6-酮庚二酸的氨基化具有很高的活性，其能同时利用NADH和NADPH作为辅因子，且其对NADH的利用效率要远高于NADPH，通过在谷氨酸棒杆菌或者大肠杆菌中过表达本发明所提供的二氨基庚二酸脱氢酶基因可以显著的提高赖氨酸的产量，且其效果要优于NADPH-依赖性的二氨基庚二酸脱氢酶。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1 NADH-依赖型的二氨基庚二酸脱氢酶的表达及其催化性能验证。
本发明通过大量的生物信息学分析发现，来源于Pseudothermotoga thermarum的二氨基庚二酸脱氢酶具有可能的NADH结合位点，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1所示。基于SEQ ID NO.1的氨基酸序列，本发明设计了相应的密码子优化的二氨基庚二酸脱氢酶基因，如SEQ ID NO.2序列所示。将序列SEQ ID NO.2合成后直接插入到pET-28a的NdeI和EcoRI双酶切位点，所获得的质粒命名为pET-PTddh。以谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)的基因组为模板，以引物ddh-F(AAGCTTGTCGACGGAGCTCGAATTCttaGACGTCGCGTGCGATCAG)和ddh-R(CTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGatgACCAACATCCGCGTAGC)为引物进行PCR，获得CGddh基因约1.0kb并进行PCR产物纯化。将表达质粒pET-28a利用NdeI和EcoRI双酶切，再利用GibsonAssembly试剂盒(NEB)将CGddh片段连接到pET-28a上，获得的重组质粒命名为pET-CGddh。将上述2个质粒利用化学转化法转入到大肠杆菌BL21(DE3)中，在含50mg/L的卡那霉素LB平板上筛选获得重组菌，分别命名为BL21/pET-PTddh和BL21/pET-CGddh。
将BL21/pET-CGddh、BL21/pET-PTddh在含50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中培养至OD600达到0.6(37℃，150rpm)，添加0.5mM的IPTG并继续培养12h以诱导蛋白的表达。将菌体离心分离，并用100ml 100mM的Tris-HCl(pH8.0)洗涤两次，最后将菌体重悬于5ml的100mM的甘氨酸-NaOH缓冲液(pH10.5)。将所述重悬液利用超声进行破碎，并离心获得上清液(12000rpm，30分钟)。利用蛋白纯化试剂盒HisTrap(GE)分离纯化二氨基庚二酸脱氢脱水酶。
利用上述纯化的二氨基庚二酸脱氢酶进行酶动力学分析。二氨基庚二酸脱氢酶的活性是通过反应产生的NAD(P)H在340nm的吸光值进行测定，反应体系包括：100mM的甘氨酸-NaOH(pH10.5)，2mM的辅酶NAD或者NADP，4mM的内消旋-二氨基庚二酸盐，100μg的酶。反应在30℃反应5min，测定其在340nm下的吸光值变化。酶活定义为每分钟产生1μM的NAD(P)H所需要的酶量(U)。实验结果如表1所示。
表1不同来源的二氨基庚二酸脱氢酶的酶活对比(单位U/mg)。
Corynebacterium glutamicum Pseudothermotoga thermarum
以NADH为底物 0.9 116.9
以NADPH为底物 94.2 19.7
由表1可以看出，两种不同来源的二氨基庚二酸脱氢酶都能够催化L-2-氨基-6-酮庚二酸的氨基化，但其辅酶特异性不同。来自谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)的二氨基庚二酸脱氢酶是一个严格的NADPH-依赖型的二氨基庚二酸脱氢酶，基本不能利用NADH。来源于Pseudothermotoga thermarum的二氨基庚二酸脱氢酶能够同时利用NADH和NADPH，且利用NADH的催化活力大于NADPH的催化活力。
实施例2利用NADH-依赖型的二氨基庚二酸脱氢酶提高谷氨酸棒杆菌赖氨酸的产量
将pET-PTddh和pET-CGddh分别用NdeI和EcoRI进行双酶切后连接到质粒pEC-K18(从Addgene购买)上，所获得的质粒命名为pEC-PTddh和pEC-CGddh。将这两个质粒分别电转化到谷氨酸棒杆菌LC298中(电转条件为电压1.8KV，1mm电转杯)，含50mg/L的卡那霉素LB平板上筛选获得重组菌，分别命名为LC/pEC-PTddh和LC/pEC-CGddh。
将谷氨酸棒杆菌LC298以及上述两株重组菌株分别在发酵培养基中培养72(30℃，200rpm)，检测赖氨酸的产量。
发酵培养基的成分为(g/L)：葡萄糖100g，玉米浆10g，尿素4.5g，硫酸铵45g，磷酸二氢钾0.5g，七水硫酸镁0.5g，七水硫酸亚铁10mg，四水硫酸锰10mg，β-丙氨酸5mg，烟酸5mg，硫胺素-盐酸5mg，生物素0.3mg，碳酸钙30g。
发酵结果，谷氨酸棒杆菌LC298的赖氨酸的产量为16.2/L，重组菌LC/pEC-CGddh的赖氨酸产量为18.4g/L，重组菌LC/pEC-PTddh的赖氨酸产量为22.2g/L，说明过表达来源Pseudothermotoga thermarum的NADH-依赖型二氨基庚二酸脱氢酶可以显著提高赖氨酸的产量，且其效果优于来源于Corynebacterium glutamicum的NADPH-依赖型二氨基庚二酸脱氢酶。
实施例3利用NADH-依赖型的二氨基庚二酸脱氢酶提高大肠杆菌赖氨酸的产量
分别以pET-PTddh、pET-CGddh为模板，用引物S1-F(CCTGCAGGTCGACTCTAGAGGCTCGAGTGCGGCCGCAA)和S1-R
(CAGCTATGACCATGATTACGCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATGG)为引物进行PCR，获得约1.0kb PCR产物并进行纯化。将pSTV28(TAKARA)EcoRI和BamHI进行双酶切后利用，用Gibson Assembly试剂盒(NEB)将上述片段分别连接到pSTV28上，获得的重组质粒分别命名为pSTV-PTddh和pSTV-CGddh。将这两个质粒分别电转化到大肠杆菌EC224中(电转条件为电压1.8KV，1mm电转杯)，含50mg/L的氯霉素LB平板上筛选获得重组菌，分别命名为EC/pSTV-PTddh和EC/pSTV-CGddh。
将大肠杆菌EC224以及两株重组菌株分别在发酵培养基中培养72(32℃，200rpm)，检测赖氨酸的产量。发酵培养基的成分为(g/L)：葡萄糖100g，酵母粉10g，硫酸铵42g，磷酸二氢钾15g，七水硫酸镁1.0g，七水硫酸亚铁10mg，四水硫酸锰10mg，碳酸钙30g。
发酵结果，大肠杆菌EC224的赖氨酸的产量为22.4/L，重组菌EC/pSTV-CGddh的赖氨酸产量为24.8g/L，重组菌EC/pSTV-PTddh的赖氨酸产量为27.5g/L，说明过表达来源Pseudothermotoga thermarum的NADH-依赖型二氨基庚二酸脱氢酶可以显著提高赖氨酸的产量，且其效果优于来源于Corynebacterium glutamicum的NADPH-依赖型二氨基庚二酸脱氢酶。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种NADH依赖性的二氨基庚二酸脱氢酶，其含有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列或SEQ ID No.1所示氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸而不影响其生物活性的氨基酸序列。
2.编码权利要求1所述NADH依赖性的二氨基庚二酸脱氢酶的基因，其特征在于，其核苷酸序列含有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列或SEQ ID No.2所示核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个核苷酸。
3.含有权利要求2所述基因的生物材料，所述生物材料为载体、重组菌、细胞系或表达盒。
4.如权利要求3所述的生物材料，所述重组菌为重组谷氨酸棒杆菌或重组大肠杆菌。
5.权利要求1所述的NADH依赖性的二氨基庚二酸脱氢酶或其编码基因或权利要求3所述的生物材料在催化L-2-氨基-6-酮庚二酸的氨基化反应中的应用。
6.权利要求1所述的NADH依赖性的二氨基庚二酸脱氢酶或其编码基因或权利要求3所述的生物材料在制备内消旋的2,6-二氨基庚二酸中的应用。
7.权利要求1所述的NADH依赖性的二氨基庚二酸脱氢酶或其编码基因或权利要求3所述的生物材料在制备赖氨酸中的应用。
8.权利要求1所述的NADH依赖性的二氨基庚二酸脱氢酶或其编码基因或权利要求3所述的生物材料在提高赖氨酸产量中的应用。
9.权利要求1所述的NADH依赖性的二氨基庚二酸脱氢酶或其编码基因或权利要求3所述的生物材料在制备饲料添加剂中的应用。
10.权利要求1所述的NADH依赖性的二氨基庚二酸脱氢酶或其编码基因或权利要求3所述的生物材料在制备药物中的应用。
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