CN108504617A - 一种高产l-赖氨酸的大肠杆菌重组菌及其构建方法 - Google Patents

一种高产l-赖氨酸的大肠杆菌重组菌及其构建方法 Download PDF

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    • C12Y104/01016—Diaminopimelate dehydrogenase (1.4.1.16)

Abstract

本发明公开了一种高产L‑赖氨酸的大肠杆菌重组菌及其构建方法，属于基因工程技术领域。本发明应用基因工程方法，替换大肠杆菌LATR11中DapD编码基因dapD为热纤维菌中DDH编码基因ddhCt，构建新的、高效的meso‑DAP合成途径并解决埃希氏属的L‑赖氨酸生产菌中异源的DDH热稳定性不足的缺点，增强重组菌株中meso‑DAP合成能力并提高菌株积累L‑赖氨酸的能力。重组菌经摇瓶发酵实验，L‑赖氨酸积累量达23.1g·L‑1，最大比生成速率为0.75g·L‑1·h‑1，高于出发菌株的17.6g·L‑1和0.44g·L‑1·h‑1。此发明成功改变了大肠杆菌中meso‑DAP合成途径，解决了外源DDH热稳定性不足的缺点，为选育L‑赖氨酸高产菌株提供崭新的思路。

Description

一种高产L-赖氨酸的大肠杆菌重组菌及其构建方法
技术领域
本发明涉及一种高产L-赖氨酸的大肠杆菌重组菌及其构建方法，属于基因工程技术领域。
背景技术
L-赖氨酸属于天冬氨酸家族氨基酸，是人类和动物所必需的、自身不能合成的八大必需氨基酸之一。由于L-赖氨酸具有多种生理功能，如平衡氨基酸组成、调节体内代谢平衡、提高机体对谷类蛋白质的吸收及利用率和促进机体生长发育等，因而被广泛应用于饲料工业、医药工业及食品工业中。微生物发酵法因其具有生产成本低、生产强度高、高特异性和对环境污染小等优点，而成为当今工业生产L-赖氨酸应用最广泛的方法。因此，选育具有自主知识产权的高L-赖氨酸合成、低副产物积累的生产菌株，实现企业可持续发展具有重要意义。
用于生产L-赖氨酸的微生物包括多种属，如棒状杆菌(如谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum和钝齿棒杆菌)及其亚种(如黄色短杆菌和乳酸发酵短杆菌)、埃希氏菌(如大肠杆菌Escherichia coli)和芽孢杆菌(如浸麻芽孢杆菌)、古生菌(如热变形菌)以及真菌中的酵母菌(如隐球酵母)等。目前，国内外用于工业化生产L-赖氨酸的菌株多为C.glutamicum及其亚种和E.coli的改造型菌株。在C.glutamicum和E.coli中，二氨基庚二酸(DAP)途径是其主要的L-赖氨酸生物合成途径。DAP途径是天冬氨酸族氨基酸合成途径中的一部分。以天冬氨酸为底物，DAP途径中有9个酶促反应涉及到L-赖氨酸的合成。DAP途径存在四种不同的变化形式用于合成meso-DAP，即(A)脱氢酶途径；(B)琥珀酰化酶途径；(C)乙酰化酶途径和(D)转氨酶途径(图1)。通常情况下，细菌中只存在四种DAP变化途径中的一种，如大肠杆菌只存在琥珀酰化酶途径。然而，一些革兰氏阳性菌，如谷氨酸棒杆菌同时存在脱氢酶途径和琥珀酰化酶途径。琥珀酰化酶途径经由四步酶促反应生成meso-DAP(即四氢吡啶二羧酸琥珀酰化酶DapD、琥珀酰-氨基-吡咯酮转氨酶DapC、琥珀酰-二氨基庚二酸脱琥珀酰酶DapE和二氨基庚二酸差向异构酶DapF)，然而脱氢酶途径只需经过一个酶促反应就可生成meso-DAP(即二氨基庚二酸脱氢酶DDH)。
二氨基庚二酸脱氢酶(meso-Diaminopimelate dehydrogenase,DDH)是唯一一种NAD(P)+-依赖的氨基酸脱氢酶，可逆的催化meso-DAP中D型结构的氨基酸残基氧化脱氨形成L-氨基酮庚二酸。DDH首次在球形芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌和短杆菌属微生物中发现。有活性的DDH由同型二聚体组成，单个亚基分子量约为35kDa，每个亚基由三个区域组成：①N端区域，含有二核苷酸结合区域或“Rossman”折叠(由中心6个β折叠和外围5个α螺旋组成)；②二聚体化功能域，含有两个α螺旋和三个β折叠；③C端区域，含有六个β折叠和五个α螺旋。DDH以meso-DAP为唯一底物，在L-赖氨酸生物合成途径中起到重要作用。然而，作为主要的L-赖氨酸生产菌株大肠杆菌却不存在该酶。基于此，有文献和专利指出在大肠杆菌中异源表达来自C.glutamicum、Brevibacterium lactofermentum或C.efficiens等棒杆菌微生物中DDH，改变大肠杆菌中meso-DAP合成途径，对合成L-赖氨酸是有效的。然而，前人研究并未考虑到来源于棒杆菌属微生物的DDH在高温下酶活力及稳定性受到影响等因素，因为棒杆菌属微生物和大肠杆菌的最适生长温度(30℃vs.37℃)和发酵温度(30～33℃vs.38～42℃)都存在明显差别。
发明内容
为解决上述问题，本发明首次将来源于嗜热微生物(如嗜热纤维梭菌Clostridiumthermocellum)中DDH引入到埃希氏属的L-赖氨酸生产菌中，解决了埃希氏属的L-赖氨酸生产菌中外源DDH热稳定性不足的缺点，增强了重组菌株中meso-DAP合成能力并提高了菌株积累L-赖氨酸的能力。本发明的目的是：在埃希氏属的L-赖氨酸生产菌中meso-DAP合成途径关键酶DapD编码基因dapD位点处插入来源于嗜热微生物(如C.thermocellum)中热稳定性的DDH编码基因表达框，在埃希氏属的L-赖氨酸生产菌中构建新的、高效的meso-DAP合成途径，提高菌株积累L-赖氨酸的能力。
本发明的技术方案：以基因工程为手段，通过异源表达来源于嗜热微生物中DDH，构建新的、高效的meso-DAP合成途径，解决新构建的meso-DAP合成途径中关键酶热稳定性不足，获得高产L-赖氨酸的重组菌株。
本发明的第一个目的是提供一种高产L-赖氨酸的大肠杆菌重组菌，所述重组菌异源表达了来源于嗜热微生物的二氨基庚二酸脱氢酶。
在本发明的一种实施方式中，所述二氨基庚二酸脱氢酶为以下任一：
(1)氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
(2)与SEQ ID NO.1所示氨基酸序列具有80％以上同源性，且具有二氨基庚二酸脱氢酶活性。
在本发明的一种实施方式中，所述嗜热微生物为嗜热纤维梭菌、嗜热球形脲芽孢杆菌、嗜热共生杆菌等嗜热微生物。
在本发明的一种实施方式中，所述重组菌是以生产L-赖氨酸的大肠杆菌为宿主。
在本发明的一种实施方式中，所述重组菌是以大肠杆菌LATR11为宿主。
在本发明的一种实施方式中，所述重组菌是以pKO3-Km作为表达载体。
本发明的第二个目的是提供所述重组菌的构建方法，所述方法具体是：
(1)重组表达载体pDXW-8/ddhCt的构建
将ddhCt片段与经相同限制性内切酶酶切后的C.glutamicum-E.coli穿梭表达质粒pDXW-8相连构建重组质粒pDXW-8/ddhCt；
(2)表达框Ptac-ddhCt-rrnBT1T2的获取
以pDXW-8/ddhCt为模板，进行PCR，获得Ptac-ddhCt-rrnBT1T2表达框；
(3)整合型载体pKO3-Km/ΔdapD::ddhCt的构建
以E.coli LATR11基因组为模板设计引物，进行PCR，获得分别在3’端和5’端有相同限制性内切酶的PCR产物，将以上述PCR产物分别与线性化pKO3-Km自杀型载体相连构建重组质粒pKO3-Km/ΔdapD；随后将将纯化后的PCR产物Ptac-ddhCt-rrnBT1T2与pKO3-Km/ΔdapD连接，获得重组质粒pKO3-Km/ΔdapD::ddhCt；
(4)重组菌株E.coli LATR11ΔdapD::ddhCt的构建
将质粒pKO3-Km/ΔdapD::ddhCt电击转化E.coli LATR11，筛选得到重组菌E.coliLATR11ΔdapD::ddhCt。
本发明的第三个目的是提供所述重组菌发酵生产L-赖氨酸的方法，所述方法是将所述重组菌单菌落接种至液体种子培养基，35-38℃，80-120r·min-1培养10-14h；以5-15％接种量将种子培养液转接至发酵培养基，35-38℃，80-120r·min-1培养30-50h。
在本发明的一种实施方式中，所述种子培养基为：葡萄糖15-25g·L-1，玉米浆5-15g·L-1，(NH4)2SO45-15g·L-1，KH2PO41-2g·L-1，MgSO4·7H2O 0.5-1.5g·L-1，FeSO4·7H2O0.05-0.15g·L-1，MnSO4·4H2O 0.05-0.15g·L-1，L-苏氨酸0.5-1.5g·L-1，生物素0.0004-0.0008g·L-1，CaCO315-25g·L-1。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基为：葡萄糖60-100g·L-1，玉米浆20-30g·L-1，(NH4)2SO420-40g·L-1，KH2PO41-2g·L-1，MgSO4·7H2O 0.5-1.5g·L-1，FeSO4·7H2O0.05-0.15g·L-1，MnSO4·4H2O 0.05-0.15g·L-1，L-苏氨酸0.5-1.5g·L-1，生物素0.0003-0.0005g·L-1，CaCO330-50g·L-1。
本发明的第四个目的是提供所述重组菌在饲料工业、医药工业或食品工业中的应用。
本发明的有益效果是：本发明通过在埃希氏属的L-赖氨酸生产菌中meso-DAP合成途径关键酶DapD编码基因dapD位点处插入来源于嗜热微生物(如C.thermocellum)中热稳定性的DDH编码基因表达框，在埃希氏属的L-赖氨酸生产菌中构建了新的、高效的meso-DAP合成途径，从而解决新构建的meso-DAP合成途径中关键酶热稳定性不足的缺点，获得了高产L-赖氨酸的重组菌株。
附图说明
图1不同微生物meso-DAP合成途径
注：A脱氢酶途径；B琥珀酰化酶途径；C乙酰酶途径；D转氨酶途径；①内消旋二氨基庚二酸脱氢酶；②四氢吡啶二羧酸琥珀酰化酶；③琥珀酰-氨基-吡咯酮转氨酶；④琥珀酰-二氨基庚二酸脱琥珀酰酶；⑤四氢吡啶二羧酸乙酰转移酶；⑥乙酰-氨基-吡咯酮转氨酶；⑦乙酰-二氨基庚二酸脱乙酰酶；⑧四氢吡啶二羧酸氨基转移酶；⑨二氨基庚二酸差向异构酶；⑩二氨基庚二酸脱羧酶；
图2不同菌株DDH和DapD酶活力测定；
图3不同菌株发酵生产L-赖氨酸过程曲线；其中：a-葡萄糖变化曲线和菌体生长曲线；b-L-赖氨酸产量和最大比生成速率。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
底物与产物的定性与定量分析以及菌体生长情况的监测：发酵液中葡萄糖和L-赖氨酸的实时检测通过SBA-40B生物传感分析仪测定。菌液浓度测定：吸取样品菌液，用蒸馏水稀释一定倍数，以蒸馏水作为空白对照，采用分光光度计于1cm光程测定OD600nm。
副产物的定性与定量分析：发酵液中副产物主要考查有机酸和氨基酸。对于有机酸的测定，采用高效液相色谱仪(HLPC)测定；对于氨基酸的测定，采用氨基酸测定仪测定。采用高效液相色谱仪或氨基酸测定仪分别测定标准样品和转化液各自的出峰时间和峰面积，即可以对转化液中待测物质进行定性与定量检测。
实施例1：C.thermocellum DDH编码基因ddhCg表达框的获得
根据NCBI中C.thermocellumATCC 27405全基因组核酸序列中的DDH基因序列(SEQID NO.1)，在其基因上下游分别加入限制性内切酶NheI和XhoI酶切位点序列并在上游加入大肠杆菌SD识别序列TCGATGAGGTCACAT，并将组合好的序列提交给通用生物系统(安徽)有限公司进行合成，获得含有目的基因的重组质粒pUC57/ddhCt。随后，采用限制性内切酶NheI和XhoI酶切重组质粒pUC57/ddhCt。随后采用胶回收试剂盒回收ddhCt片段。将ddhCt片段与经相同限制性内切酶酶切后的C.glutamicum-E.coli穿梭表达质粒pDXW-8相连构建重组质粒pDXW-8/ddhCt。最后，以pDXW-8/ddhCt为模板，以Ptac-F/Ptac-F为引物进行PCR(表1)，获得Ptac-ddhCt-rrnBT1T2表达框。
表1.PCR扩增所需引物序列(下划线为酶切位点)
实施例2：E.coli LATR11中DapD编码基因dapD替换为C.thermocellum DDH编码基因ddhCg
以E.coli LATR11基因组中DapD基因(SEQ ID NO.2)为模板，分别以dapD-L-F/dapD-L-R和dapD-R-F/dapD-R-R为引物PCR(表1)，获得分别在3’端和5’端有相同限制性内切酶的PCR产物。将以上述PCR产物分别与线性化pKO3-Km自杀型载体相连构建重组质粒pKO3-Km/ΔdapD；将纯化后的PCR产物Ptac-ddhCt-rrnBT1T2与pKO3-Km/ΔdapD连接，二者同时用BamHI酶切，酶切产物通过粘性末端连接，获得重组质粒pKO3-Km/ΔdapD::ddhCt。
将验证正确的质粒pKO3-Km/ΔdapD::ddhCt电击转化E.coli LATR11，经LB+Km固体培养基于43℃培养筛选，获得第一次同源重组转化子。再分别将目标转化子在含10％蔗糖的培养基于30℃中培养进行胁迫二次重组筛选，最终在LB平板上进行划线分离并挑取多个转化子。对发生第二次同源重组的菌株进行回复野生型/基因突变型的鉴定。提取转化子染色体，以目标基因dapD的上下游引物进行PCR并对PCR产物进行测序鉴定，最终获得目的重组菌株E.coli LATR11ΔdapD::ddhCt。
实施例3：CtDDH在E.coli LATR11中的表达
分别将出发菌株E.coli LATR11和重组菌株E.coli LATR11ΔdapD::ddhCt接种至液体LB，IPTG诱导后收集菌体经超声波破碎后，上清液SDS-PAGE，检测到一条分子量约30kDa的特异性条带，与报道的目标蛋白大小一致，说明来源于C.thermocellumATCC 27405中的DDH可以在大肠杆菌中正确表达。
实施例4：重组菌E.coli LATR11ΔdapD::ddhCt和出发菌株E.coli LATR11中DDH和DapD酶活力测定
DDH的测定：取冻管保藏的菌种接种含有LB培养基中，37℃振荡培养过夜，并于10000r·min-1离心收集菌体。随后，将菌体悬浮于200mmol·L-1Glycine-KOH缓冲液(pH10.5)中并于超声波破碎法制备粗酶液。粗酶液采用比色法进行酶活测定(A340nm)。酶反应体系：200mmol·L-1Glycine-KOH缓冲液(pH10.5)、100mmol·L-1(NH4)2SO4、5mmol·L-1四氢吡啶二羧酸、0.3mmol·L-1NADPH；反应温度：30℃；反应时间：≥300s。一个酶活力单位(U)定义为在测定条件下每分钟合成1μmol NADP+所需的酶量。经测定，重组菌具有DDH酶活力，而出发菌株不具有DDH酶活力，结果如图2所示。
DapD的测定：取冻管保藏的菌种接种含有LB培养基中，37℃振荡培养过夜，并于10000rmin-1离心收集菌体。随后，将菌体悬浮于100mmol·L-1Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)中并于超声波破碎法制备粗酶液。粗酶液采用比色法进行酶活测定(A412nm)。酶反应体系：100mmol·L-1Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)、10mmol·L-1L-2-氨基庚二酸、2mmol·L-1MgCl2、2mmol·L-1二硫二硝基苯甲酸、0.1mmol·L-1乙酰-CoA；反应温度：22℃；反应时间：≥300s。一个酶活力单位(U)定义为在测定条件下每分钟合成1μmol CoA所需的酶量。经测定，重组菌不再具有DapD酶活力，而出发菌株具有DapD酶活力，结果如图2所示。
实施例5：重组菌E.coli LATR11ΔdapD::ddhCt和出发菌株E.coli LATR11发酵产L-赖氨酸
培养基：①种子培养基(g·L-1)：葡萄糖20，玉米浆10，(NH4)2SO410，KH2PO41.5，MgSO4·7H2O 1，FeSO4·7H2O 0.1，MnSO4·4H2O 0.1，L-苏氨酸1，生物素0.0006，CaCO320，pH7.0，121℃灭菌20min；②发酵培养基(g·L-1)：葡萄糖80，玉米浆25，(NH4)2SO430，KH2PO41.5，MgSO4·7H2O 1，FeSO4·7H2O0.1，MnSO4·4H2O 0.1，L-苏氨酸1，生物素0.0004，CaCO340，pH 7.0，115℃灭菌10min。
将上述经验证的重组菌E.coli LATR11ΔdapD::ddhCt和出发菌株E.coli LATR11分别进行摇瓶发酵实验，从新鲜活化的斜面培养基中挑取一满环E.coli(对照菌及重组菌)于种子培养基中(25mL/250mL)，37℃，100r·min-1往复式摇床培养12h；以10％接种量，接种于发酵培养基中，37℃，100r·min-1往复式摇床培养40h，分时间区段测定L-赖氨酸、葡萄糖及生物量，结果与对照菌株E.coli LATR11相比，结果如图3a所示。
此外，分别采用高效液相色谱仪和氨基酸分析仪测定重组菌E.coli LATR11ΔdapD::ddhCt和出发菌株E.coli LATR11中副产物积累情况(包括有机酸和氨基酸)，结果如图3b所示。
重组菌经摇瓶发酵实验，L-赖氨酸积累量达23.1g·L-1，最大比生成速率为0.75g·L-1·h-1，高于出发菌株的17.6g·L-1和0.44g·L-1·h-1。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
序列表
<110> 江南大学
<120> 一种高产L-赖氨酸的大肠杆菌重组菌及其构建方法
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 990
<212> DNA
<213> Clostridium thermocellum
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<211> 825
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 2
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cgcggcaaag tcggcattaa cgaactgctg cgtaccatcg actaa 825
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 3
cgggatccgc tgtcctacgg ctgtgcag 28
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 4
cgggatccgc ctggcggcag tagcgcg 27
<210> 5
<211> 32
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 5
tccccccggg cgcatggata acatcgacga ag 32
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 6
cgggatccag tcggcgaatt tcatcggcac 30
<210> 7
<211> 27
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 7
cgggatcccg cgttccggcg gggtctg 27
<210> 8
<211> 29
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 8
acgcgtcgac cgcaaaccat acaaactgc 29
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 9
atgcagcagt tacagaac 18
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 10
ttagtcgatg gtacgcagc 19

Claims (10)

1.一种高产L-赖氨酸的大肠杆菌重组菌，其特征在于，所述重组菌异源表达了来源于嗜热微生物的二氨基庚二酸脱氢酶。
2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述二氨基庚二酸脱氢酶为以下任一：
(1)氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
(2)与SEQ ID NO.1所示氨基酸序列具有80％以上同源性，且具有二氨基庚二酸脱氢酶活性。
3.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述嗜热微生物为嗜热纤维梭菌、嗜热球形脲芽孢杆菌或嗜热共生杆菌。
4.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌是以生产L-赖氨酸的大肠杆菌为宿主。
5.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌是以pKO3-Km作为表达载体。
6.权利要求1～5任一所述重组菌的构建方法，其特征在于，所述方法具体是：
(1)重组表达载体pDXW-8/ddhCt的构建
将ddhCt片段与经相同限制性内切酶酶切后的C.glutamicum-E.coli穿梭表达质粒pDXW-8相连构建重组质粒pDXW-8/ddhCt；
(2)表达框Ptac-ddhCt-rrnBT1T2的获取
以pDXW-8/ddhCt为模板，进行PCR，获得Ptac-ddhCt-rrnBT1T2表达框；
(3)整合型载体pKO3-Km/ΔdapD::ddhCt的构建
以E.coli LATR11基因组为模板设计引物，进行PCR，获得分别在3’端和5’端有相同限制性内切酶的PCR产物，将以上述PCR产物分别与线性化pKO3-Km自杀型载体相连构建重组质粒pKO3-Km/ΔdapD；随后将将纯化后的PCR产物Ptac-ddhCt-rrnBT1T2与pKO3-Km/ΔdapD连接，获得重组质粒pKO3-Km/ΔdapD::ddhCt；
(4)重组菌株E.coli LATR11ΔdapD::ddhCt的构建
将质粒pKO3-Km/ΔdapD::ddhCt电击转化E.coli LATR11，筛选得到重组菌E.coliLATR11ΔdapD::ddhCt。
7.权利要求1～5任一所述重组菌发酵生产L-赖氨酸的方法，其特征在于，所述方法是将所述重组菌单菌落接种至液体种子培养基，35-38℃，80-120r·min-1培养10-14h；以5-15％接种量将种子培养液转接至发酵培养基，35-38℃，80-120r·min-1培养30-50h。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述种子培养基为：葡萄糖15-25g·L-1，玉米浆5-15g·L-1，(NH4)2SO45-15g·L-1，KH2PO41-2g·L-1，MgSO4·7H2O 0.5-1.5g·L-1，FeSO4·7H2O 0.05-0.15g·L-1，MnSO4·4H2O 0.05-0.15g·L-1，L-苏氨酸0.5-1.5g·L-1，生物素0.0004-0.0008g·L-1，CaCO315-25g·L-1。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基为：葡萄糖60-100g·L-1，玉米浆20-30g·L-1，(NH4)2SO420-40g·L-1，KH2PO41-2g·L-1，MgSO4·7H2O 0.5-1.5g·L-1，FeSO4·7H2O 0.05-0.15g·L-1，MnSO4·4H2O 0.05-0.15g·L-1，L-苏氨酸0.5-1.5g·L-1，生物素0.0003-0.0005g·L-1，CaCO330-50g·L-1。
10.权利要求1～5任一所述的重组菌在饲料工业、医药工业或食品工业中的应用。
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