CN108546698A

CN108546698A - 一种天冬氨酸酶突变体

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Publication number: CN108546698A
Application number: CN201810377591.2A
Authority: CN
Inventors: 范文超; 王金刚
Original assignee: Zhejiang Huari Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Zhejiang Huari Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2018-04-25
Filing date: 2018-04-25
Publication date: 2018-09-18
Anticipated expiration: 2038-04-25
Also published as: CN108546698B

Abstract

本发明通过定向进化的方法获得了一种高酶活力的天冬氨酸酶突变体，其能高效催化富马酸加氨反应生成天冬氨酸，通过反应工艺的优化，作为底物的富马酸浓度可以达到400g/L，在pH8.5‑9.0，温度40‑45℃下反应，24小时转化率最高可以达到98.5％以上，具有工业应用前景。

Description

一种天冬氨酸酶突变体

技术领域

本发明属于生物催化领域，具体地说，涉及一种天冬氨酸酶突变体，并且涉及该天冬氨酸酶突变体或者其表达微生物在生产天冬氨酸中的用途。

背景技术

L-天冬氨酸(L-Aspartic acid缩写Asp)，又名α-氨基丁二酸，在医药，食品和化工领域有着广泛的用途。在医药方面，天冬氨酸可以用于治疗心脏病、肝脏病、高血压症，具有防止和恢复疲劳的作用，可与多种氨基酸一起制成氨基酸输液，用作氨解毒剂、肝功能促进剂和疲劳恢复剂；在食品工业方面，是一种良好的营养增补剂，添加于各种清凉饮料，也是甜味素(阿斯巴甜)-天冬酰苯丙氨酸甲酯的主要原料；在化工方面，可以作为制造合成树脂的原料，亦可作为化妆品的营养性添加剂等。目前，L-天门冬氨酸作为最主要的氨基酸之一，国内生产规模已经达到20000吨/年。

L-天冬氨酸的工业化生产始于1974年的日本，我国在20世纪80年代后期也进行了工业化生产。目前，L-天门冬氨酸的制备主要是用生物酶法(固定化酶法和游离整体细胞法)，即利用L-天冬氨酸酶催化氨与富马酸发生加成反应而得。游离整体细胞法与固定化细胞法相比，具有酶活力高、工艺简单、设备投资少等优势，具有很强的市场竞争力。游离整体细胞法合成L-天冬氨酸主要通过高产天门冬氨酸酶菌种的筛选、提高天冬氨酸酶活和酶的分子生物学等几个方面来提高酶转化效率。

天冬氨酸酶(EC4.3.1.1，Aspartase，缩写ASPase)还可逆催化L-天冬氨酸转化为富马酸和NH₄。大肠杆菌来源的L-天冬氨酸酶是由4个相同亚基组成，并呈点对称P212121排列，单亚基无催化功能，每个亚基由3个结构域组成(D1、D2和D3)呈S形，中央结构域(D2)含有一半以上的氨基酸残基，它是天冬氨酸酶-富马酸酶族最保守的结构域。由于亚基间相互作用，来自4个亚基的D25个螺旋束形成一个稳定的20螺旋簇，从而构成四聚体(J Med M olBiol 2004,1(6):327-333.)。

由于天冬氨酸具有广阔的用途，如何提高天冬氨酸的生产率从而降低生产成本一直是研究热点，而开发高催化活性的天冬氨酸酶ASPase始终是科研人员追求的目标。

发明内容

为了获得具有高催化活性的天冬氨酸酶，本发明以大肠杆菌来源的天冬氨酸酶基因作为基础，通过易错PCR的方法建立ASPase基因突变库，再通过筛选基因突变库获得活力明显提高的天冬氨酸酶。

因此，本发明的第一个目的在于提供一种天冬氨酸酶，其氨基酸序列为SEQ IDNO:1：MSNNIRIEEDLLGTREVPADAYYGVHTLRAIENFYISNNKISDIPEFVRGMVMVKKAAAMANKELQTIPKSVANAIIAACDEVLNNGKCMDQFPVDVYQGGAGTSVNMNTNEVLANIGLELMGHQKGEYQYLNPNDHVNKCQSTNDAYPTGFRIAVYSSLIKLVDAINQLREGFERKAVEFQDILKMGRCQLQDAVPMTLGQEFRAFSILLKEEVKNIQRTAELLLEVNLGARAIGTGLNTPKEYSPLAVKKLAEVTGFPCVPAEDLIEATSDCGAYVMVHGALKRLAVKMSKICNDLRLLSSGPRAGLNEINLPELQAGSSIIPALVAPVVPEVVNQVCFKVIGNDTTVTMAAEAGQLQLNVMEPVIGQAMFESVHILTNACYNLLEKCINGITANKEVCEGYVYNSIGIVTYLNPFIGHHNGDIVGKICAETGKSVREVVLERGLLTEAELDDIFSVQNLMHPAYKAKRYTDESEQ(SEQ ID NO:1)。

本发明的第二个目的在于提供编码上述天冬氨酸酶的基因。

优选地，上述基因的碱基序列为SEQ ID NO:2：

atgtcaaacaacattcgtatcgaagaagatctgttgggtaccagggaagttccagctgatgcctactatggtgttcacactctgagagcgattgaaaacttctatatcagcaacaacaaaatcagtgatattcctgaatttgttcgcggtatggtaatggttaaaaaagccgcagctatggcaaacaaagagctgcaaaccattcctaaaagtgtagcgaatgccatcattgccgcatgtgatgaagtcctgaacaacggaaaatgcatggatcagttcccggtagacgtctaccagggcggcgcaggtacttccgtaaacatgaacaccaacgaagtgctggccaatatcggtctggaactgatgggtcaccagaaaggtgaatatcagtacctgaacccgaacgaccatgttaacaaatgtcagtccactaacgacgcctacccgaccggtttccgtatcgcagtttactcttctctgattaagctggtagatgcgattaaccaactgcgtgaaggctttgaacgtaaagctgtcgaattccaggacatcctgaaaatgggtcgttgtcagctgcaggacgcagtaccgatgaccctcggtcaggaattccgcgctttcagcatcctgctgaaagaagaagtgaaaaatatccaacgtaccgctgaactgctgctggaagttaaccttggcgcacgtgcaatcggtactggtctgaacacgccgaaagagtactctccgctggcagtgaaaaaactggctgaagtcactggcttcccatgcgtaccggctgaagacctgatcgaagcgacctctgactgcggcgcttatgtaatggttcacggcgcgctgaaacgcctggctgtgaagatgtccaaaatctgtaacgacctgcgcttgctctcttctggcccacgtgccggcctgaacgagatcaacctgccggaactgcaggcgggctcttccatcatcccagctctcgtagctccggttgttccggaagtggttaaccaggtatgcttcaaagtcatcggtaacgacaccactgttaccatggcagcagaagcaggtcagctgcagttgaacgttatggagccggtcattggccaggccatgtttgaatccgttcacattctgaccaacgcttgctacaacctgctggaaaaatgcattaacggcatcactgctaacaaagaagtgtgcgaaggttacgtttacaactctatcggtatcgttacttacctgaacccgttcatcggtcaccacaacggtgacatcgtgggtaaaatctgtgccgaaaccggtaagagtgtacgtgaagtcgttctggaacgcggtctgttgactgaagcggaacttgacgatattttctccgtacagaatctgatgcacccggcttacaaagcaaaacgctatactgatgaaagcgaacagtaa(SEQ ID NO:2)。

本发明的第三个目的在于提供包含上述基因的质粒。

本发明的第四个目的在于提供转化了上述质粒的微生物。

优选地，上述微生物选自大肠杆菌、酵母、枯草杆菌。更优选大肠杆菌BL21(DE3)。

本发明的第五个目的在于提供上述天冬氨酸酶或表达微生物在生产L-天冬氨酸中的用途。

在一种实施方式中，上述用途是以富马酸为底物原料，通过与氨发生加成反应来生产天冬氨酸。

优选地，上述加成反应在pH8.5-9.0，温度40-45℃下进行。

本发明用ASPase突变体的基因转化E.coli BL21(DE3)，构建出高表达天冬氨酸酶的重组菌，使用该重组菌进行了50L规模化生产天冬氨酸的实验，发现底物富马酸的浓度可以达到400g/L，在pH8.5-9.0，温度40-45℃下反应，24小时转化率最高可以达到98.5％以上，证明具有工业化应用前景。

附图说明

图1是天冬氨酸酶SEQ ID NO:1的最适反应pH值曲线图；

图2是天冬氨酸酶SEQ ID NO:1的最适反应温度曲线图。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

本文中涉及到多种物质的添加量、含量及浓度，其中所述的百分含量，除特别说明外，皆指质量百分含量。

本文的实施例中，如果对于反应温度或操作温度没有做出具体说明，则该温度通常指室温(15-25℃)。

作为构建天冬氨酸酶突变体的基础模板，来源于大肠杆菌Escherichia coliPCN033的基因序列为GenBank:CP006632.1

atgtcaaacaacattcgtatcgaagaagatctgttgggtaccagggaagttccagctgatgcctactatggtgttcacactctgagagcgattgaaaacttctatatcagcaacaacaaaatcagtgatattcctgaatttgttcgcggtatggtaatggttaaaaaagccgcagctatggcaaacaaagagctgcaaaccattcctaaaagtgtagcgaatgccatcattgccgcatgtgatgaagtcctgaacaacggaaaatgcatggatcagttcccggtagacgtctaccagggcggcgcaggtacttccgtaaacatgaacaccaacgaagtgctggccaatatcggtctggaactgatgggtcaccagaaaggtgaatatcagtacctgaacccgaacgaccatgttaacaaatgtcagtccactaacgacgcctacccgaccggtttccgtatcgcagtttactcttctctgattaagctggtagatgcgattaaccaactgcgtgaaggctttgaacgtaaagctgtcgaattccaggacatcctgaaaatgggtcgtacccagctgcaggacgcagtaccgatgaccctcggtcaggaattccgcgctttcagcatcctgctgaaagaagaagtgaaaaatatccaacgtaccgctgaactgctgctggaagttaaccttggcgcaacagcaatcggtactggtctgaacacgccgaaagagtactctccgctggcagtgaaaaaactggctgaagtcactggcttcccatgcgtaccggctgaagacctgatcgaagcgacctctgactgcggcgcttatgtaatggttcacggcgcgctgaaacgcctggctgtgaagatgtccaaaatctgtaacgacctgcgcttgctctcttctggcccacgtgccggcctgaacgagatcaacctgccggaactgcaggcgggctcttccatcatgccagctaaagtaaacccggttgttccggaagtggttaaccaggtatgcttcaaagtcatcggtaacgacaccactgttaccatggcagcagaagcaggtcagctgcagttgaacgttatggagccggtcattggccaggccatgtttgaatccgttcacattctgaccaacgcttgctacaacctgctggaaaaatgcattaacggcatcactgctaacaaagaagtgtgcgaaggttacgtttacaactctatcggtatcgttacttacctgaacccgttcatcggtcaccacaacggtgacatcgtgggtaaaatctgtgccgaaaccggtaagagtgtacgtgaagtcgttctggaacgcggtctgttgactgaagcggaacttgacgatattttctccgtacagaatctgatgcacccggcttacaaagcaaaacgctatactgatgaaagcgaacagtaa(SEQ ID NO:3)。

其编码的野生型天冬氨酸酶(ASPase)的氨基酸序列为GenBank:AKK51077.1：

MSNNIRIEEDLLGTREVPADAYYGVHTLRAIENFYISNNKISDIPEFVRGMVMVKKAAAMANKELQTIPKSVANAIIAACDEVLNNGKCMDQFPVDVYQGGAGTSVNMNTNEVLANIGLELMGHQKGEYQYLNPNDHVNKCQSTNDAYPTGFRIAVYSSLIKLVDAINQLREGFERKAVEFQDILKMGRTQLQDAVPMTLGQEFRAFSILLKEEVKNIQRTAELLLEVNLGATAIGTGLNTPKEYSPLAVKKLAEVTGFPCVPAEDLIEATSDCGAYVMVHGALKRLAVKMSKICNDLRLLSSGPRAGLNEINLPELQAGSSIMPAKVNPVVPEVVNQVCFKVIGNDTTVTMAAEAGQLQLNVMEPVIGQAMFESVHILTNACYNLLEKCINGITANKEVCEGYVYNSIGIVTYLNPFIGHHNGDIVGKICAETGKSVREVVLERGLLTEAELDDIFSVQNLMHPAYKAKRYTDESEQ(SEQ ID NO:4)。

为了获得酶活性更高的天冬氨酸酶突变体，本发明对野生型天冬氨酸酶的基因序列SEQ ID NO:3进行点突变。通过易错PCR技术获得一个或多个氨基酸位点取代的突变体氨基酸序列，筛选出6个可提高天冬氨酸酶的酶活力的位点，然后以定点组合突变的方式，获得一株酶活力明显提高的突变体。

在本文中，“L-天冬氨酸”可简称为“天冬氨酸”、“天门冬氨酸”或者“Asp”。

在本文中，术语“野生(型)”、“野生酶”、“野生型酶”表示相同的意义，都是指未经基因工程改造的天冬氨酸酶SEQ ID NO:4。

本发明的天冬氨酸酶突变体由于氨基酸序列明确，因此本领域技术人员很容易获得其编码基因、包含这些基因的表达盒和质粒、以及包含该质粒的转化体。这些基因、表达盒、质粒、转化体可以通过本领域技术人员所熟知的基因工程构建方式获得。

上述转化体宿主可以是任何适合表达天冬氨酸酶突变体的微生物，括细菌和真菌。优选微生物是大肠杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母、或者枯草杆菌，优选大肠杆菌，更优选大肠杆菌BL21(DE3)。

当作为生物催化剂用于生产天冬氨酸时，本发明的天冬氨酸酶可以呈现酶的形式或者菌体的形式。所述酶的形式包括游离酶、固定化酶，包括纯化酶、粗酶、发酵液、载体固定的酶等；所述菌体的形式包括存活菌体和死亡菌体。

本发明的天冬氨酸酶的分离纯化、包括固定化酶制备技术也是本领域技术人员所熟知的。

实施例

材料和方法

本文中的全基因合成由苏州金唯智生物科技有限公司完成；表达载体由浙江华睿生物技术有限公司亚克隆制备。引物合成及测序皆由生工生物工程上海股份有限公司完成。

本文中的分子生物学实验包括质粒构建、酶切、连接、感受态细胞制备、转化、培养基配制等等，主要参照《分子克隆实验指南》(第三版)，J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔(美)编著，黄培堂等译，科学出版社，北京，2002)进行。必要时可以通过简单试验确定具体实验条件。

PCR扩增实验根据质粒或DNA模板供应商提供的反应条件或试剂盒说明书进行。必要时可以通过简单试验予以调整。

1.天冬氨酸酶(ASPase)活力测定

天冬氨酸酶酶活测定底物溶液配制：称取富马酸100g，硫酸镁0.12g，加入适量蒸馏水搅拌均匀，缓慢加入浓氨水，调节pH8.5后定容至500mL，既得20％的富马酸铵溶液。将0.1-0.5g湿重的大肠杆菌菌体加入到20％富马酸铵底物溶液(内含2mM Mg²⁺)中，45℃，250rpm，反应2小时。利用高锰酸钾滴定法(取反应液0.1mL，加入15mL 98％浓硫酸，加热到60～70℃，用0.1M的KMnO₄滴定，30s不褪色为滴定终点)，测定反应体系中富马酸量，计算酶活。

酶活定义：在45℃，pH8.5条件下，每分钟转化1μmol富马酸底物的酶量定义为一个酶活力单位U。

2.天冬氨酸的HPLC测定

色谱条件：安捷伦1260高效液相，waters Symmetry(250×4.6mm，5μm)色谱柱，流速1mL/min，波长：338nm，柱温：35℃，进样量20μL，流动相A：B(40:60)。

流动相A相：称取2.72g CH₃COONa·3H₂O，加1000mL超纯水溶解后，加180μL三乙胺，用乙酸调pH至7.20，加3mL四氢呋喃。

流动相B相：200mL乙腈和200mL甲醇，加入到100mL的流动相A中。

柱前衍生剂：取270mg邻苯二甲醛+5mL无水乙醇+200μL 2-巯基乙醇，用0.4M、pH9.5的硼酸缓冲液定容至50mL。此溶液要求现配现用。

衍生样品溶液：精密量取适量反应液0.5mL至10mL容量瓶中，纯化水定容至刻度。精确移取0.5mL上述溶液于50mL棕色容量瓶中，依次加入10mL 0.4M、pH9.5的硼酸缓冲液和10mL柱前衍生剂，快速摇动，1min后加入0.4M、pH9.5的硼酸缓冲液至刻度，过滤进液相进行分析。以外标法计算天冬氨酸含量(g/L)。

3.培养基

发酵培养基：蛋白胨20g/L，酵母浸粉5g/L，甘油4.0mL/L，反丁烯二酸(富马酸)2g/L，磷酸二氢钾1g/L，NH₄NO₃ 8g/L，氨水调节pH至7.5，121℃灭菌20min。

LB培养基：10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/L氯化钠，pH7.2，121℃高温高压灭菌20min。

实施例1天冬氨酸酶基因工程菌构建

1.1通过全基因序列合成序列SEQ ID NO:3，两端设计酶切位点NdeI和BamHI，克隆到pSH质粒上相应位点，得到重组质粒pSH-ASPase，然后用氯化钙法转化入大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)感受态细胞中，涂含卡那霉素的LB培养基平板，37℃培养过夜，挑选单菌落，接种到含有LB培养基的试管中，培养过夜，离心收集菌体，抽提质粒，基因测序确定正确，得到表达野生型ASPase的重组基因工程菌株BL21(DE3)/pSH-ASPase。

氨基酸序列测定为SEQ ID NO:4。

1.2从含有ASPase工程菌种的平板挑选单克隆，接种到5mL LB培养基中，37℃培养过；1％v/v接种到含有100mL发酵培养基的1000mL摇瓶中培养4-6小时，OD₆₀₀达到1.2-1.5，加入0.2mM的IPTG诱导，降温到25℃培养10-16小时，离心获得菌体，-80℃冻存24小时备用。

实施例2易错PCR法构建天冬氨酸酶随机突变点库

以SEQ ID NO:3为模板，应用易错PCR技术构建随机突变体库。

正向引物：5’-ATGTACCTGCGCACCATCCTCGGAAG-3’，

反向引物：5’-CTCGAGCTAAATGCTTCTCGACGTCAAAAGC-3’。

50μL易错PCR反应体系包括：50ng质粒模板pSH-ASPase，30pmol引物对，1X Taqbuffer，0.2mM dGTP，0.2mM dATP，1mM dCTP，1mM dTTP，7mM MgCl₂，(0mM、0.05mM、0.1mM、0.15mM、0.2mM)MnCl₂，2.5个单位的Taq酶(fermentas)。PCR反应条件为：95℃ 5min；94℃30s，55℃ 30s，72℃ 2min/kbp；30个循环；72℃ 10min。胶回收2.0kb随机突变片段作为大引物，用KOD-plus DNA聚合酶做MegaPrimer PCR：94℃ 5min，；98℃ 10s，60℃ 30s，68℃2min/kbp，25个循环；68℃ 10min。DpnI消化质粒模板，电转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，得到超过10⁴个克隆的随机突变库。

实施例3突变体库的高通量筛选

3.1选取突变体库中的转化子接种到含600μL LB培养基的96孔深孔培养板中，培养基中含100μg/mL卡那霉素和0.1mM IPTG，37℃培养6h后，降温至25℃，培养过夜。5000rpm离心10min，弃上清，置于-70℃冷冻1h，室温融化30min。

3.2试剂配制：

反应母液：200g富马酸，加入约800ml水，搅拌均匀后，用浓氨水调节PH至8.5，然后加入终浓度为2mM的硫酸镁，搅拌均匀后，定容至1L。

终止反应液：2M盐酸。

3.3反应过程：在冻融菌体中加入600μL反应母液，45℃的条件下反应60min，加入等体积的终止液终止反应，然后5000rpm离心10min，取200μL上清，检测240nm下的吸光值。

3.4高酶活突变体的测定和筛选

按照前述方法，对各个天冬氨酸酶突变体的酶活力，进行重复筛选和测定。

在随机突变库，通过对约10000个突变体克隆筛选，筛选出6个可提高天冬氨酸酶的酶活力的位点，结果如表1所示。

表1.部分天冬氨酸酶突变体的酶活力比较

天冬氨酸酶编号	突变氨基酸	酶比活力(％)*
			野生ASPase	--	100
ASPase-368	T190C,T233R	447
			ASPase-2547	V367G,K327M	257
ASPase-3248	N329C	395
			ASPase-3661	T190C,T233R,M324I,K327L,N329A	1075
ASPase-5348	T233R,K327L,N329C	547
			ASPase-6572	M324I	436
ASPase-7136	T190C,K327L	635
			ASPase-7617	T233R,K327L,N329A	867

*酶比活力：以野生酶的酶活力(U/ml)与菌体浓度OD(OD/ml)的比值为100％。

其中编号为ASPase-3661的突变体(T190C,T233R,M324I,K327L,N329A)的酶活力相对于野生型ASPase提高了约10倍。

ASPase-3661的突变体氨基酸序列为SEQ ID NO:1。

实施例4高酶活基因工程菌的构建

将突变体ASPase-3661的编码基因SEQ ID NO:2按照实施例1中的方法克隆到pSH质粒中，得到重组质粒pSH-ASPase-3661，然后用氯化钙法转化入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，涂含卡那霉素的LB培养基平板，37℃培养过夜，挑选10个单菌落，接种到含有LB培养基的试管中，培养过夜，离心收集菌体，抽提质粒，基因测序确定突变正确，得到重组菌株。

本领域技术人员应当理解，包括SEQ ID NO:2在内的突变体ASPase-3661编码基因、也可在枯草芽孢杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母中表达，表达宿主不限于大肠杆菌。

实施例5野生型ASPase和突变体ASPase-3661菌株的发酵

分别从表达野生型ASPase和表达突变体ASPase-3661的基因工程菌种的平板上挑选单克隆，接种到5mL LB培养基中，37℃培养过；5％v/v接种到含有3L发酵培养基的5L发酵罐(上海保兴生物设备工程有限公司)中培养4-6小时，OD₆₀₀达到1.2-1.5，加入0.2mM的IPTG诱导，降温到25℃培养10-16小时，离心获得菌体，-80℃冻存24小时备用。

实施例6突变体ASPase-3661的反应特点考察

6.1测定天冬氨酸酶ASPase-3661的最适pH值。天冬氨酸酶酶活测定底物溶液配制：称取富马酸10g，硫酸镁0.012g，加入适量蒸馏水搅拌均匀，缓慢加入浓氨水，分别调节溶液pH为7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5和10.0，定容至50mL，即得20％的富马酸铵溶液。将0.1-0.5g湿重的大肠杆菌菌体加入到20％富马酸铵底物溶液(内含2mM Mg²⁺)中，于45℃，250rpm下反应2小时。利用高锰酸钾滴定法(取反应液0.1mL，加入15mL 98％浓度的浓硫酸，加热到60～70℃，然后用0.1M KMnO₄滴定，30s不褪色为滴定终点)，测定反应体系中富马酸量，计算酶活。将统计结果绘制成曲线，得到如图1所示的最适反应pH值曲线图。由该曲线可知，天冬氨酸酶SEQ ID NO:1的最适反应pH值为pH8.5-9.0。

6.2测定天冬氨酸酶ASPase-3661的最适反应温度。天冬氨酸酶酶活测定底物溶液配制：称取富马酸10g，硫酸镁0.012g，加入适量蒸馏水搅拌均匀，缓慢加入浓氨水，调整至pH 8.5，定容至50mL，既得20％的富马酸铵溶液。将0.1-0.5g湿重的大肠杆菌菌体加入到20％富马酸铵底物溶液(内含2mM Mg²⁺)中，分别控制反应温度30℃、35℃、40℃、45℃、50℃和55℃，在pH8.5，250rpm下反应2小时。利用高锰酸钾滴定法(取反应液0.1mL，加入15mL98％浓度的浓硫酸，加热到60～70℃，然后用0.1M KMnO₄滴定，30s不褪色为滴定终点)，测定反应体系中富马酸量，计算酶活。将统计结果绘制成曲线，得到如图2所示的最适反应温度曲线图。由该曲线可知，天冬氨酸酶SEQ ID NO:1的最适反应温度为40-45℃。

实施例7突变体ASPase-3661催化富马酸加氨反应制备L-天冬氨酸

7.1不同酶量ASPase-3661催化富马酸加氨反应制备L-天冬氨酸

反应体系200mL，底物富马酸浓度为400g/L(内含2mM Mg²⁺)，用浓氨水调节至pH8.5，加酶量分别为1000、2000、4000、8000、10000U/g底物，于45℃、pH8.5、250rpm下反应20-24h，测定L-天冬氨酸，计算底物最高转化率，结果见表2。

表2：不同酶量ASPase-3661催化富马酸反应制备L-天冬氨酸

7.3规模化生产L-天冬氨酸

反应体系50L，称取底物富马酸20kg，硫酸镁24g，加入适量蒸馏水搅拌均匀，缓慢加入浓氨水，调整至pH8.5，加酶量为4000U/g底物，定容至50L。于45℃下搅拌反应24h，检测体系中产物L-天冬氨酸生成量。确定最后反应体系的底物转化率超过98.5％。

上述实施例对本发明的天冬氨酸酶突变体生产L-天冬氨酸的工艺进行了验证，相关的工艺条件可以进一步优化。本领域的技术人员应理解，在不违背本发明的思想下，本领域技术人员可以在此基础上做出各种改动或者修改，所做的各种变形或者修改的等价形式，同样应属于本发明的范围。

另外，需说明的是，本说明书中对先前公开的文献的列举和论述不应视为承认该文献是现有技术或者是公知常识。

序列表

<110> 浙江华睿生物技术有限公司

<120> 一种天冬氨酸酶突变体

<130> SHPI1810346

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 478

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 1

Met Ser Asn Asn Ile Arg Ile Glu Glu Asp Leu Leu Gly Thr Arg Glu

1 5 10 15

Val Pro Ala Asp Ala Tyr Tyr Gly Val His Thr Leu Arg Ala Ile Glu

20 25 30

Asn Phe Tyr Ile Ser Asn Asn Lys Ile Ser Asp Ile Pro Glu Phe Val

35 40 45

Arg Gly Met Val Met Val Lys Lys Ala Ala Ala Met Ala Asn Lys Glu

50 55 60

Leu Gln Thr Ile Pro Lys Ser Val Ala Asn Ala Ile Ile Ala Ala Cys

65 70 75 80

Asp Glu Val Leu Asn Asn Gly Lys Cys Met Asp Gln Phe Pro Val Asp

85 90 95

Val Tyr Gln Gly Gly Ala Gly Thr Ser Val Asn Met Asn Thr Asn Glu

100 105 110

Val Leu Ala Asn Ile Gly Leu Glu Leu Met Gly His Gln Lys Gly Glu

115 120 125

Tyr Gln Tyr Leu Asn Pro Asn Asp His Val Asn Lys Cys Gln Ser Thr

130 135 140

Asn Asp Ala Tyr Pro Thr Gly Phe Arg Ile Ala Val Tyr Ser Ser Leu

145 150 155 160

Ile Lys Leu Val Asp Ala Ile Asn Gln Leu Arg Glu Gly Phe Glu Arg

165 170 175

Lys Ala Val Glu Phe Gln Asp Ile Leu Lys Met Gly Arg Cys Gln Leu

180 185 190

Gln Asp Ala Val Pro Met Thr Leu Gly Gln Glu Phe Arg Ala Phe Ser

195 200 205

Ile Leu Leu Lys Glu Glu Val Lys Asn Ile Gln Arg Thr Ala Glu Leu

210 215 220

Leu Leu Glu Val Asn Leu Gly Ala Arg Ala Ile Gly Thr Gly Leu Asn

225 230 235 240

Thr Pro Lys Glu Tyr Ser Pro Leu Ala Val Lys Lys Leu Ala Glu Val

245 250 255

Thr Gly Phe Pro Cys Val Pro Ala Glu Asp Leu Ile Glu Ala Thr Ser

260 265 270

Asp Cys Gly Ala Tyr Val Met Val His Gly Ala Leu Lys Arg Leu Ala

275 280 285

Val Lys Met Ser Lys Ile Cys Asn Asp Leu Arg Leu Leu Ser Ser Gly

290 295 300

Pro Arg Ala Gly Leu Asn Glu Ile Asn Leu Pro Glu Leu Gln Ala Gly

305 310 315 320

Ser Ser Ile Ile Pro Ala Leu Val Ala Pro Val Val Pro Glu Val Val

325 330 335

Asn Gln Val Cys Phe Lys Val Ile Gly Asn Asp Thr Thr Val Thr Met

340 345 350

Ala Ala Glu Ala Gly Gln Leu Gln Leu Asn Val Met Glu Pro Val Ile

355 360 365

Gly Gln Ala Met Phe Glu Ser Val His Ile Leu Thr Asn Ala Cys Tyr

370 375 380

Asn Leu Leu Glu Lys Cys Ile Asn Gly Ile Thr Ala Asn Lys Glu Val

385 390 395 400

Cys Glu Gly Tyr Val Tyr Asn Ser Ile Gly Ile Val Thr Tyr Leu Asn

405 410 415

Pro Phe Ile Gly His His Asn Gly Asp Ile Val Gly Lys Ile Cys Ala

420 425 430

Glu Thr Gly Lys Ser Val Arg Glu Val Val Leu Glu Arg Gly Leu Leu

435 440 445

Thr Glu Ala Glu Leu Asp Asp Ile Phe Ser Val Gln Asn Leu Met His

450 455 460

Pro Ala Tyr Lys Ala Lys Arg Tyr Thr Asp Glu Ser Glu Gln

465 470 475

<210> 2

<211> 1437

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

atgtcaaaca acattcgtat cgaagaagat ctgttgggta ccagggaagt tccagctgat 60

gcctactatg gtgttcacac tctgagagcg attgaaaact tctatatcag caacaacaaa 120

atcagtgata ttcctgaatt tgttcgcggt atggtaatgg ttaaaaaagc cgcagctatg 180

gcaaacaaag agctgcaaac cattcctaaa agtgtagcga atgccatcat tgccgcatgt 240

gatgaagtcc tgaacaacgg aaaatgcatg gatcagttcc cggtagacgt ctaccagggc 300

ggcgcaggta cttccgtaaa catgaacacc aacgaagtgc tggccaatat cggtctggaa 360

ctgatgggtc accagaaagg tgaatatcag tacctgaacc cgaacgacca tgttaacaaa 420

tgtcagtcca ctaacgacgc ctacccgacc ggtttccgta tcgcagttta ctcttctctg 480

attaagctgg tagatgcgat taaccaactg cgtgaaggct ttgaacgtaa agctgtcgaa 540

ttccaggaca tcctgaaaat gggtcgttgt cagctgcagg acgcagtacc gatgaccctc 600

ggtcaggaat tccgcgcttt cagcatcctg ctgaaagaag aagtgaaaaa tatccaacgt 660

accgctgaac tgctgctgga agttaacctt ggcgcacgtg caatcggtac tggtctgaac 720

acgccgaaag agtactctcc gctggcagtg aaaaaactgg ctgaagtcac tggcttccca 780

tgcgtaccgg ctgaagacct gatcgaagcg acctctgact gcggcgctta tgtaatggtt 840

cacggcgcgc tgaaacgcct ggctgtgaag atgtccaaaa tctgtaacga cctgcgcttg 900

ctctcttctg gcccacgtgc cggcctgaac gagatcaacc tgccggaact gcaggcgggc 960

tcttccatca tcccagctct cgtagctccg gttgttccgg aagtggttaa ccaggtatgc 1020

ttcaaagtca tcggtaacga caccactgtt accatggcag cagaagcagg tcagctgcag 1080

ttgaacgtta tggagccggt cattggccag gccatgtttg aatccgttca cattctgacc 1140

aacgcttgct acaacctgct ggaaaaatgc attaacggca tcactgctaa caaagaagtg 1200

tgcgaaggtt acgtttacaa ctctatcggt atcgttactt acctgaaccc gttcatcggt 1260

caccacaacg gtgacatcgt gggtaaaatc tgtgccgaaa ccggtaagag tgtacgtgaa 1320

gtcgttctgg aacgcggtct gttgactgaa gcggaacttg acgatatttt ctccgtacag 1380

aatctgatgc acccggctta caaagcaaaa cgctatactg atgaaagcga acagtaa 1437

<210> 3

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Met Ser Asn Asn Ile Arg Ile Glu Glu Asp Leu Leu Gly Thr Arg Glu

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Val Pro Ala Asp Ala Tyr Tyr Gly Val His Thr Leu Arg Ala Ile Glu

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130 135 140

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145 150 155 160

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165 170 175

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180 185 190

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210 215 220

Leu Leu Glu Val Asn Leu Gly Ala Thr Ala Ile Gly Thr Gly Leu Asn

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260 265 270

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275 280 285

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370 375 380

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450 455 460

Pro Ala Tyr Lys Ala Lys Arg Tyr Thr Asp Glu Ser Glu Gln

465 470 475

Claims

1.一种天冬氨酸酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1。

2.编码如权利要求1所述天冬氨酸酶的基因。

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，碱基序列为SEQ ID NO:2。

4.包含如权利要求2或3所述基因的质粒。

5.转化了如权利要求4所述质粒的微生物。

6.如权利要求5所述的微生物，所述微生物选自大肠杆菌、酵母、枯草杆菌。

7.如权利要求6所述的微生物，其为大肠杆菌BL21(DE3)。

8.如权利要求1所述天冬氨酸酶或者如权利要求6所述微生物在生产天冬氨酸中的用途。

9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，以富马酸为底物原料，通过与氨发生加成反应来生产天冬氨酸。

10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，在pH8.5-9.0，温度40-45℃下反应。