CN1986784A - 天冬氨酸转氨酶突变酶及其制备方法和应用 - Google Patents

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许琳
严明
林涛
张宏志
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Abstract

本发明公开了天冬氨酸转氨酶突变酶及其制备方法和应用。该天冬氨酸转氨酶突变酶的氨基酸序列为SEQ IN No.2中第221位由Leu替换为Asn或者是第338位由Phe突变为Lys。该天冬氨酸转氨酶突变酶生物学功能有所提高，可用于L－苯丙氨酸生产。

Description

天冬氨酸转氨酶突变酶及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及天冬氨酸转氨酶，特别是涉及天冬氨酸转氨酶的突变酶，本发明还涉及该突变酶的制备方法和应用。
背景技术
合理设计技术是根据蛋白质结构和功能的关系，设计新的氨基酸序列，然后采用重组DNA技术改变蛋白质一级序列，按照实际需要改造天然蛋白质或设计制造新的蛋白质的过程。这些研究根据催化化学和结构化学的知识，对蛋白质的精细结构和功能关系进行深入的了解，然后再运用基因工程的原理和技术，开展蛋白质的改造工作。
在酶的合理设计中，需要以酶分子特征、空间结构、结构和功能之间关系等方面的信息为依据，对需改造的酶分子进行设计。因此获取酶结构和功能的背景知识显得十分重要。这些信息通常通过实验手段获得，例如利用各种生物化学、晶体学、光谱学等技术手段对天然酶或其突变体进行测定。实验获得的结构信息需经分析、处理、加工输入网上数据库中。目前从网络上这类公共数据库中，可以方便地获得相关酶蛋白的结构和功能数据。其中常用的核酸序列数据库包括GenBank、EMBL、DDBJ、BioSino等，常用的蛋白质氨基酸序列数据库包括SWISS-PROT、PIR、TrEMBL等，常用的蛋白质结构数据库有PDB，MMDB，CSD，BMRB等。这些公共数据库已成为获取蛋白质结构和功能背景知识必不可少的信息来源[1]。
在获取必需的蛋白质结构和功能的背景知识后，对这些信息进行分析，最常用的方法包括序列分析及结构分析。通过蛋白质序列比较、序列分析、结构分析和分子模拟的方法，对酶活性部位保守残基的作用进行细致研究，动态地了解酶的作用机制，为酶的改造工作提供必要的技术手段。
根据上述分析方法的结果，可合理地选择需要改变的位点，采用定点突变的方法来完成这些设计。这种方法是通过PCR等技术手段可以在基因组上，也可以是在质粒中的目的DNA片段上引入碱基的突变，包括碱基的点突变，密码子的添加或删除等。它能迅速、高效地改变DNA的序列，从而获得改造的目的基因。然后通过分子克隆技术可以得到改造后的酶蛋白。
天冬氨酸转氨酶(Aspartate aminotransferase，EC2.6.1.1，以下简称为AspAT)是一类广泛存在于生物细胞内的转氨酶，在氮代谢中起到非常重要的作用[2]。它可以将天冬氨酸(Asp)的氨基转移到各种酮酸底物上，生成对应的氨基酸，例如L.酪氨酸(L-Tyr)、L-苯丙氨酸(L-Phe)和L-色氨酸(L-Trp)。利用该酶转移氨基的反应，可以由低附加值的氨基酸L-Asp生产其它高附加值的氨基酸。
天冬氨酸转氨酶结构与功能关系的研究已较深入。到目前为止，科学家们已获得了来源于猪[2]、鸡线粒体[3，4]、大肠杆菌[5，6]，以及一些嗜热菌[7]中AspAT的晶体结构。这些晶体结构数据为AspAT的改造工作提供了必要的背景知识。
自从获得AspAT的晶体结构以来，通过定点突变的方法获得酶的突变体来研究酶结构变化对酶-辅酶结合和底物-酶反应的影响。这些研究对指导AspAT的合理设计工作提供了必要的背景知识。
(1)活性中心残基突变后的AspAT催化活性的改变
酶的催化作用主要是通过活性中心的残基与底物之间的相互作用完成。因此，对活性中心残基进行突变，可以改变天冬氨酸转氨酶的酶学性质。
残基K258在酶结构中和辅助因子PLP形成席夫碱，突变这个残基应点将使酶催化活性大大下降。K258A突变酶的活性还不到野生型酶的10-6倍[8]。K258H突变酶对底物Asp、Glu的活性比野生型酶下降了3个数量级，对底物α-酮戊二酸的活性比野生型酶则下降了5个数量级[9]。
残基D222具有高度的保守性。它位于可以与PLP或PMP辅酶上的N(1)发生强烈的离子作用的距离内。通过D222E的突变，突变酶对底物Asp仍然保持了较高的活性。但是D222A或D222N的突变酶对底物Asp的催化活性分别下降了8,000和20,000倍，对α-酮戊二酸的活性只有野生型酶的2％-10％[10]。这些结果表明，残基D222的负电荷残基对于氨基酸底物α-质子的消除有重大影响，同时它还加强了辅酶的亲电能力。
Hayashi[11]等对大肠杆菌天冬氨酸转氨酶(eAspAT)的V39F突变酶在结构和动力学上进行了分析。Val39位于两个domain的界面上，并且处于活性中心入口处。用较大的残基Phe代替Val以后，发现同野生型酶相比V39F突变酶显示出更“开放”的构象，并且醛亚胺的pKa下降了0.7个单位。然而，当残基Asn194突变为Ala后，V39F再突变没有降低醛亚胺pKa值，表明domain的旋转通过Arg386-Asn194-PLP连接体系控制了醛亚胺的pKa值。
(2)定点突变用于改造AspAT的底物特异性
定点突变在改变转氨酶的底物特异性方面已取得了很好的效果。定点突变能提高将E.coil AspAT对带正电氨基酸的亲和能力，例如R292D的突变酶在Arg与Asp中优先选择Arg作为底物[12]，R292hoGlu的突变酶对阳离子底物的活性增加了6.8×104倍[13]。野生型酶中Arg292主要通过其带正电的胍基来识别底物的末端羧基，在这个位置突变成一个带负电荷的氨基酸残基，将提高酶对阳离子氨基酸底物的识别能力。类似地，R292V和R292L的突变酶将这个位置的氨基酸残基突变成疏水性的氨酸酸，故酶对芳香族氨基酸转氨速率上升了1个数量级，而对阴离子氨基酸的转氨速率则下降了五个数量级[14]。另一个对酶底物特异性有重要影响的残基是R386，它主要和酮酸底物的羧基氧形成氢键和盐键来识别底物。Danishefsky等[15]分别把活性中心的Arg386突变为Tyr和Phe。结果表明，与野生型酶相比，这些突变后使速率常数下降了5个数量级。对突变酶的晶体结构和野生酶的结构进行比较发现，突变酶的“open”构象(指未结合底物的构象)，在整体结构上和野生酶相似，只是Phe386的侧链位置相对于野生型酶中的Arg386有些移位，与邻近的残基形成了新的接触。Mizuguchi等[16]通过对E.coil AspAT的R386残基发生突变的酶的结构进行了研究，发现对这个Arg残基进行突变，会部分地破坏PLP-N194-R386氢键连接体系，从而影响Lys258与PLP形成的Schiff碱的pKa值，改变了酶活性中心的结构。主要原因可能是PLP-Lys258的扭角变动，它是控制醛亚胺pKa的主要因素。
随着对酶催化机理的深入研究，人们逐渐认识到酶非活性中心的保守残基在催化过程中也起着重要的作用。这些保守残基定点突变后，也会导致酶底物特异性的变化。非活性中心保守残基的定点突变后，酶功能变化的关系总结见表1。
(3)定点突变用于改造AspAT的热稳定性
定点突变对天冬氨酸转氨酶热稳定性改造的研究较少，唯一报道的例子是Jeffery等[17]将E.coli中的5个Cys残基突变为Ala，结果发现酶突变体的热稳定性有所降低，最适温度降低了4℃左右。
                     表1对非活性中心残基突变对酶功能的影响
  突变点 对酶功能的影响 文献
1   T109S/N297S/V39L/K41Y/T47I/N69L 突变酶对Phe的活性增加了三个数量级，而对Asp的高转氨活性并不降低。 [18]
2 T109S，N297S，V39LK41Y，T47I，N69L 研究了不同点突变对phe的底物特异性的变化，其中T109S和N297S的突变提高了酶对非极性底物的亲和能力，而后4个点突变降低了酶对非极性配体和草酰乙酸的解离常数，稳定了酶结合草酰乙酸的结构。 [19]
3 W140H，I17H和V37H 芳香族氨基酸的转氨活性大约降低了10-100倍，然而，对二羧基氨基酸底物的活性分别降低了20％到60％。 [20]
  4   W140/F/G 对二羧基底物的活性大大降低。 [21]
  5   C191S 对Asp的kcat/Km值与野生型酶很接近。 [22]
  6   C191F，C191Y，C191W 对Asp的kcat/Km值比野生型低了2.2-4倍。 [22]
7 V39F，V39F/N194A V39F比野生型的醛亚胺的pKa上升了0.7个单位。V39F/N194A的醛亚胺pKa值未改变，表明Arg386-Asn194-PLP连接体系控制醛亚胺的pKa值。 [11]
天冬氨酸转氨酶催化氨基酸底物的反应被用于L-Phe等芳香族氨基酸的生产。L-Phe是氨基酸输液和氨基酸饮膳所必须的成分，是合成一些抗癌药物的中间体，还是甜味剂阿斯巴甜的合成前体，具有巨大市场应用价值。目前已经开发了一系列合成L-Phe的生产工艺，包括游离细胞[23]和固定化细胞[24]等工艺路线。南京工业大学经过几年的研究，开发了化学酶法合成L-Phe的生产工艺(如图1-7所示)[23]，并于2000年通过国家科技部的专家的鉴定验收，实现了工业化生产。以上工艺路线中AspAT时底物及产物具有较好的耐受性，反应条件温和，在形成主产物L-Phe的同时，还可生成非常有用的副产物丙酮酸。在该工艺路线中，AspAT催化苯丙酮酸(Phenylpyruvate acid，简写为PPA)生成L-Phe的反应是整个工艺路线的关键。优化天冬氨酸转氨酶的性能对于苯丙氨酸生产工艺的优化具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供天冬氨酸转氨酶的突变酶。
本发明的另一个目的是提供上述天冬氨酸转氨酶突变酶的制备方法。
本发明的还有一个目的是提供上述天冬氨酸转氨酶突变酶在在L-苯丙氨酸生产中的应用。
本发明的目的是通过下列措施来实现的：
天冬氨酸转氨酶突变酶，其氨基酸序列是将SEQ IN No.2中第221位由Leu替换为Asn或者是将第338位由Phe突变为Lys。
所述天冬氨酸转氨酶突变酶的制备方法，该方法采用蛋白质合理设计的方法确定出大肠杆菌天冬氨酸转氨酶分子表面上影响酶的活性、底物特异性或热稳定性功能的氨基酸残基位点，再通过定点突变的方法获得突变酶。
所述的方法，该方法包括如下步骤：
a.采用蛋白质合理设计的方法，通过计算机软件分析大肠杆菌天冬氨酸转氨酶的三维结构，并比较了该酶和嗜热菌天冬氨酸转氨酶中氨基酸序列的差异，从而确定出SEQIN No.2第221位的氨基酸残基Leu和酶的热稳定性相关，第338位的氨基酸残基phe和酶的活性和底物特异性相关；
b.用设计的定点突变引物片段SEQ.IN No.3使SEQ IN No.1第1012-1014处的碱基TTC替换为AAA，用定点突变试剂盒获得设计的突变酶，对应在SEQ IN No.2上产生F338K的突变；或者，用设计的定点突变引物片段SEQ IN No.4使SEQ IN No.1第661-663处的碱基CTG替换为AAC，用定点突变试剂盒获得设计的突变酶，对应在SEQ IN No.2上产生L221N的突变。
(这里所述“采用定点突变试剂盒获得设计的突变酶”包括了基因工程的常用方法，如制备重组质粒、转染宿主菌、培养宿主菌、表达突变酶、收集纯化突变酶、鉴定确认等。)
所述的方法，其中合理设计相关的分析软件是序列分析软件Clustal W、结构分析软件Rasmol和/或蛋白质结构预测软件DeepView。
所述的天冬氨酸转氨酶突变酶在L-苯丙氨酸生产中的应用。
本发明的有益效果：
1、采用本发明的方法可以获得生物学功能较高的蛋白质(如提高天冬氨酸转氨酶的活性和底物特异性，见实施例1；提高天冬氨酸转氨酶的热稳定性，见实施例2)；
2、获得的天冬氨酸转氨酶突变酶可用于苯丙氨酸生产工艺的优化；
3、该方法工艺简单、生产成本低、实用、效果好。这种方法可以根据现对现有的蛋白质结构及结构和功能相关知识的认识，通过少量的筛选工作即可提高蛋白质的生物学功能。
附图说明
图1构建重组质粒的路线图。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。
一般性说明：
实施例中未注明具体条件的基因工程实验方法，基本上按照Sambrook，J等人编著的《分子克隆实验指南(第3版)》(Molecular Cloning：A Laboratory Manual，3rded.黄培堂等译，科学出版社.2002.8)中所述的条件及方法或按照材料提供商所建议的条件及方法进行，其它没有详细描述的技术相应于本领域人员来说是熟知的标准方法。
本发明的材料：本申请中提及的微生物、宿主细胞、质粒或其他生物材料以及培养基均有商品供应或以别的途径能为公众所得，它们仅作举例，对本发明不是唯一的，可分别用其它适合的工具和生物材料来代替。
另外，根据本发明提供的两种突变酶的氨基酸序列，本领域普通技术人员可以采用基因工程技术制备出这两种突变酶而无需采用实施例中举例的蛋白质合理设计的方法再次确定出大肠杆菌天冬氨酸转氨酶分子表面上影响酶的活性、底物特异性或热稳定性功能的氨基酸残基位点。
定点突变的引物采用软件DNA Star设计，由上海申能博彩公司合成。对应引物序列如下：
引物序列DM1：5’-GCAAACCGCGAC AAAAGCTTTATCATC-3’(SEQ IN No.3)
引物序列DM2：5’-GTTTTGCCCGTGGT AACGAAGAAGATGCTG-3’(SEQ INNo.4)
用引物DM1上划线的碱基AAA对aspC基因(SEQ IN No.1)上第1012-1014处的碱基TTC进行替换，对应在酶上产生F338K的突变；采用引物DM2上划线的碱基AAC对aspC基因(SEQ IN No.1)上第661-663处的碱基CTG进行替换，对应在酶上产生L221N的突变。
实施例1：天冬氨酸转氨酶活性和底物特异性的提高
1、确定突变位点：采用合理设计的方法，通过序列分析软件(Clustal W)、结构分析软件(Rasmol)将大肠杆菌天冬氨酸转氨酶(eAspAT)的三维结构和一维结构联系起来，根据该酶和嗜热菌天冬氨酸转氨酶中氨基酸序列的比较以及两种酶底物特异性的比较(大肠杆菌和嗜热菌中酶的底物特异性也不相同)采用软件DeepView选择了突变的位点和替换的氨基酸残基，确定大肠杆菌天冬氨酸转氨酶序列(SEQ IN No.2)中第338位的氨基酸残基phe与酶的活性和底物特异性密切相关，将此位置的氨基酸残基替换成Lys残基，可提高酶对底物苯丙酮酸的底物特异性。
2、突变酶的获得包括以下步骤：
(1)将大肠杆菌天冬氨酸转氨酶基因(SEQ IN No.1)插入pUC18而构建重组质粒，其对应的基因工程菌命名为A2，构建的路线图如图1所示。
(2)含突变位点引物的引入：以构建的重组质粒为模板，加入含突变位点引物(SEQIN No.3)进行PCR扩增，使功能区相应的碱基发生改变(在酶基因序列SEQ IN No.1第1012-1014的碱基位置上发生了TTC到AAA碱基替换)，采用PCR反应延伸获得突变质粒；
(3)转化含突变基因的质粒到宿主菌(E.coli BL21)中构建突变菌库；
3、挑取菌株送交上海申能博彩生物科技公司进行测序。测序结果证明，菌株中所含突变质粒发生了对应的碱基替换，在SEQ IN No.1第1012-1014碱基位置上发生了TTC到AAA碱基替换，其对应的基因工程菌命名为Strain K338；
4、Strain K338采用96孔微培养板、酶标仪、多孔道移液器等对构建的突变菌StrainK338进行表达条件的优化(在菌体生长2小时后，加入IPTG终浓度为0.1mmol/L，再诱导表达12h后，收获菌体，此时酶活性表达最高)，表达的突变酶命名为Enz K338。
天冬氨酸转氨酶活性测定方法如下：
运用试剂盒的测定原理为：样品中的天冬氨酸转氨酶催化L-天冬氨酸和α-氧代戊二酸氨基转换，生成草酰乙酸和L-谷氨酸；在NADH和苹果酸脱氢酶(MDH)存在下，草酰乙酸被还原为L-苹果酸，NADH被氧化为NAD+，从而使340nm处的光吸收值下降，可以测定AST的活力。
试剂盒组成：
乳酸脱氢酶(LDH)                    ＞1500U/L
NADH                               0.26mmol/L
L-天冬氨酸                         220mmol/L
苹果酸脱氢酶                       ＞150U/L
α-氧代戊二酸                      13mmol/L
Tris缓冲液                         88mmol
EDTA                               5.0mmol/L
pH 7.8±0.1
剂型：干粉(上面试剂盒组成成分是制成干粉使用的，用前加50mL水。)
优化结果显示Strain K338突变菌在37℃下培养2小时后，加入终浓度为0.1mmol/L的IPTG诱导表达，生长12h后，突变菌表达的酶活性最高。在同样的培养条件下，突变菌Strain K338表达的突变酶活性比工程菌A2表达的大肠杆菌天冬氨酸转氨酶的活性提高了3.4倍，由570U(工程菌A2)提高到1930U(Strain K338)。
5、鉴定突变酶对底物苯丙酮酸的米氏常数显示，该酶对苯丙酮酸的米氏常数由突变前的39.1mmol/L减少到20.5mmol/L，说明对苯丙酮酸的底物特异性比大肠杆菌天冬氨酸转氨酶也明显增强。
米氏常数采用双倒数做图法计算酶的反应动力学参数，计算过程参见文献[26]。采用检测方法如下，条件为：37℃，pH8.0。
根据苯丙酮酸在240nm到365nm之间的吸收峰来测定苯丙酮酸的浓度[27]。具体过程为：在100mmol/L Tris·HCl(pH8.0)的缓冲液中，在350nm波长下采用酶标仪检测样品的光吸收值来检测苯丙酮酸的浓度。
根据实验建立的标准曲线，由OD值计算苯丙酮酸(PPA)的浓度(CPPA)的方程如下(相关系数R＝0.9995)：
CPPA＝2.43×OD-0.0288                                      (1)
酶活性(单位“U”)定义在37℃，pH8.5的反应条件下，1L样品反应1分钟后消耗的底物量(μmol·L-1·min-1)，则其计算公式如下：
E＝(CPPA0-CPPA1)×106/204                                  (2)
6、采用突变菌Strain K338表达的天冬氨酸转氨酶突变酶的纯化蛋白在37℃下进行转化苯丙酮酸生产L-苯丙氨酸，其L-苯丙氨酸的得率为89.8％，而对照基因工程菌A2表达的天冬氨酸转氨酶的纯化蛋白在相同条件下L-苯丙氨酸的得率为85.2％。
实施例2：天冬氨酸转氨酶热稳定性的提高
1、采用合理设计的方法，通过序列分析软件(Clustal W)、结构分析软件(Rasmol)将大肠杆菌天冬氨酸转氨酶的三维结构和一维结构联系起来，采用软件DeepView确定大肠杆菌天冬氨酸转氨酶序列中第221位的氨基酸残基Leu和酶的稳定性密切相关，将此位置的氨基酸残基替换成Asn残基，可提高酶的热稳定性。
2、突变基因文库的建立包括以下步骤：
(1)将大肠杆菌天冬氨酸转氨酶基因插入pUC18而构建重组质粒，其对应的基因工程菌命名为A2，构建的路线图如图1所示。
(2)含突变位点引物的引入：以重组质粒为模板，加入含突变位点引物(SEQ INNo.4)进行PCR扩增，使功能区相应的碱基发生改变(在酶基因序列SEQ IN No.1第661-663的碱基位置上发生CTG到AAC的碱基替换)，采用PCR反应延伸获得突变质粒；
(3)转化含突变基因的质粒到宿主菌(E.coli BL21)中构建突变菌库
3、挑取菌株送交上海申能博彩生物科技公司进行测序。测序结果证明，菌株中所含突变质粒发生了对应的碱基替换，在SEQ IN No.1第661-663碱基位置上发生CTG到AAC的碱基替换，其对应的基因工程菌命名为Strain N221；
4、采用96孔微培养板、酶标仪、多孔道移液器等仪器对构建的突变菌Strain N221进行表达条件的优化(在菌体生长2小时后，加入IPTG终浓度为0.1mmol/L，再诱导表达12h后，收获菌体，此时酶活性表达最高)和突变酶性质的鉴定，表达的突变酶命名为Enz N221，天冬氨酸转氨酶活性测定方法同实施例1中采用转氨酶试剂盒测定的方法。结果如下：Strain N221在37℃下培养2小时后，加入终浓度为0.1mmol/L的IPTG诱导表达，再生长12h后，菌表达的酶活性最高。在同样的培养条件下，突变菌Strain N221表达的突变酶活性比工程菌A2表达的大肠杆菌天冬氨酸转氨酶的活性提高了4.3倍，由570U(工程菌A2)提高到2470U(Strain K338)。
5、将菌液离心收集菌体沉淀部分，加入原体积的pH8.0 50mmol/L Tris·HCl溶解。超声破碎后，离心取上清液部分测定酶的热稳定性。根据酶液在55℃下放置不同时间后所做的失活曲线计算不同酶的半衰期。结果显示工程菌A2表达的大肠杆菌天冬氨酸转氨酶半衰期为140min，突变菌Strain N221表达的突变酶的半衰期延长为180min，比突变前半衰期延长了40min，热稳定性提高了。
6、采用突变菌Strain N221表达的天冬氨酸转氨酶突变酶的纯化蛋白在55℃下进行转化苯丙酮酸生产L-苯丙氨酸，其L-苯丙氨酸的得率为65.7％，而对照基因工程菌A2表达的天冬氨酸转氨酶的纯化蛋白在相同条件下L-苯丙氨酸的得率为51.4％。
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<120>天冬氨酸转氨酶突变酶及其制备方法和应用
<160>4
<210>1
<211>1191
<212>DNA
<213>天然序列，来源于大肠杆菌(Escherichia coli)
<220>
<221>CDS
<222>(1)...(1 191)
<223>
<400>1
atg ttt gag aac att acc gcc gct cct gcc gac ccg att ctg ggc 45
Met Phe Glu Asn Ile Thr Ala Ala Pro Ala Asp Pro Ile Leu Gly
1                5                  10                  15
ctg gcc gat ctg ttt cgt gcc gat gaa cgt ccc ggc aaa att aac 90
Leu Ala Asp Leu Phe Arg Ala Asp Glu Arg Pro Gly Lys Ile Asn
                20                  25                  30
ctc ggg att ggt gtc tat aaa gat gag acg ggc aaa acc ccg gta 135
Leu Gly Ile Gly Val Tyr Lys Asp Glu Thr Gly Lys Thr Pro Val
                35                  40                  45
ctg acc agc gtg aaa aag gct gaa cag tat ctg ctc gaa aat gaa 180
Leu Thr Ser Val Lys Lys Ala Glu Gln Tyr Leu Leu Glu Asn Glu
                50                  55                  60
acc acc aaa aat tac ctc ggc att gac ggc atc cct gaa ttt ggt 225
Thr Thr Lys Asn Tyr Leu Gly Ile Asp Gly Ile Pro Glu Phe Gly
                65                  70                  75
cgc tgc act cag gaa ctg ctg ttt ggt aaa ggt agc gcc ctg atc 270
Arg Cys Thr Gln Glu Leu Leu Phe Gly Lys Gly Ser Ala Leu Ile
                80                  85                  90
aat gac aaa cgt gct cgc acg gca cag act ccg ggg ggc act ggc 315
Asn Asp Lys Arg Ala Arg Thr Ala Gln Thr Pro Gly Gly Thr Gly
                95                  100                 105
gca cta cgc gtg gct gcc gat ttc ctg gca aaa aat acc agc gtt 360
Ala Leu Arg Val Ala Ala Asp Phe Leu Ala Lys Asn Thr Ser Val
                110                 115                 120
aag cgt gtg tgg gtg agc aac cca agc tgg ccg acc cat aag agc 405
Lys Arg Val Trp Val Ser Asn Pro Ser Trp Pro Asn His Lys Ser
                125                 130                 135
gtc ttt aac tct gca ggt ctg gaa gtt cgt gaa tac gct tat tat 450
Val Phe Asn Ser Ala Gly Leu Glu Val Arg Glu Tyr Ala Tyr Tyr
                140                 145                 150
gat gcg gaa aat cac act ctt gac ttc gat gca ctg att aac agc 495
Asp Ala Glu Asn His Thr Leu Asp Phe Asp Ala Leu Ile Asn Ser
                155                 160                 165
ctg aat gaa gct cag gct ggc gac gta gtg ctg ttc cat ggc tgc 540
Leu Asn Glu Ala Gln Ala Gly Asp Val Val Leu Phe His Gly Cys
                170                 175                 180
tgc cat aac cca acc ggt atc gac cct acg ctg gaa caa tgg caa 585
Cys His Asn Pro Thr Gly Ile Asp Pro Thr Leu Glu Gln Trp Gln
                185                 190                 195
aea ctg gca caa ctc tcc gtt gag aaa ggc tgg tta ccg ctg ttt 630
Thr Leu Ala Gln Leu Ser Val Glu Lys Gly Trp Leu Pro Leu Phe
                200                 205                 210
gac ttc gct tac cag ggt ttt gcc cgt ggt ctg gaa gaa gat gct 675
Asp Phe Ala Tyr Gln Gly Phe Ala Arg Gly Leu Glu Glu Asp Ala
                215                 220                 225
gaa gga ctg cgc gct ttc gcg gct atg cat aaa gag ctg att gtt 720
Glu Gly Leu Arg Ala Phe Ala Ala Met His Lys Glu Leu Ile Val
                230                 235                 240
gcc agt tcc tac tct aaa aac ttt ggc ctg tac aac gag cgt gtt 765
Ala Ser Ser Tyr Ser Lys Asn Phe Gly Leu Tyr Asn Glu Arg Val
                245                 250                 255
ggc gct tgt act ctg gtt gct gcc gac agt gaa acc gtt gat cgc 810
Gly Ala Cys Thr Leu Val Ala Ala Asp Ser Glu Thr Val Asp Arg
                260                 265                 270
gca ttc agc caa atg aaa gcg gcg att cgc gct aac tac tct aac 855
Ala Phe Ser Gln Met Lys Ala Ala Ile Arg Ala Asn Tyr Ser Asn
                275                 280                 285
cca cca gca cac ggc gct tct gtt gtt gcc acc atc ctg agc aac 900
Pro Pro Ala His Gly Ala Ser Val Val Ala Thr Ile Leu Ser Asn
                290                 295                 300
gat gcg tta cgt gcg att tgg gaa caa gag ctg act gat atg cgc 945
Asp Ala Leu Arg Ala Ile Trp Glu Gln Glu Leu Thr Asp Met Arg
                305                 310                 315
cag cgt att cag cgt atg cgt cag ttg ttc gtc aat acg ctg cag 990
Gln Arg Ile Gln Arg Met Arg Gln Leu Phe Val Asn Thr Leu Gln
                320                 325                 330
gaa aaa ggc gca aac cgc gac ttc agc ttt atc atc aaa cag aac 1035
Glu Lys Gly Ala Asn Arg Asp Phe Ser Phe Ile Ile Lys Gln Asn
                335                 340                 345
ggc atg ttc tcc ttc agt ggc ctg aca aaa gaa caa gtg ctg cgt 1080
Gly Met Phe Ser Phe Ser Gly Leu Thr Lys Glu Gln Val Leu Arg
                350                 355                 360
ctg cgc gaa gag ttt ggc gta tat gcg gtt gct tct ggt cgc gta 1125
Leu Arg Glu Glu Phe Gly Val Tyr Ala Val Ala Ser Gly Arg Val
                365                 370                 375
aat gtg gcc ggg atg aca cca gat aac atg gct ccg ctg tgc gaa 1170
Asn Val Ala Gly Met Thr Pro Asp Asn Met Ala Pro Leu Cys Glu
                380                 385                 390
gcg att gtg gca gtg ctg taa  1191
Ala Ile Val Ala Val Leu
                395
<210>2
<211>396
<212>PRT
<213>天然序列，来源于大肠杆菌
<400>2
Met Phe Glu Asn Ile Thr Ala Ala Pro Ala Asp Pro Ile Leu Gly
1                5                  10                  15
Leu Ala Asp Leu Phe Arg Ala Asp Glu Arg Pro Gly Lys Ile Asn
                20                  25                  30
Leu Gly Ile Gly Val Tyr Lys Asp Glu Thr Gly Lys Thr Pro Val
                35                  40                  45
Leu Thr Ser Val Lys Lys Ala Glu Gln Tyr Leu Leu Glu Asn Glu
                50                  55                  60
Thr Thr Lys Asn Tyr Leu Gly Ile Asp Gly Ile Pro Glu Phe Gly
                65                  70                  75
Arg Cys Thr Gln Glu Leu Leu Phe Gly Lys Gly Ser Ala Leu Ile
                80                  85                  90
Asn Asp Lys Arg Ala Arg Thr Ala Gln Thr Pro Gly Gly Thr Gly
                95                  100                 105
Ala Leu Arg Val Ala Ala Asp Phe Leu Ala Lys Asn Thr Ser Val
                110                 115                 120
Lys Arg Val Trp Val Ser Asn Pro Ser Trp Pro Asn His Lys Ser
                125                 130                 135
Val Phe Asn Ser Ala Gly Leu Glu Val Arg Glu Tyr Ala Tyr Tyr
                140                 145                 150
Asp Ala Glu Asn His Thr Leu Asp Phe Asp Ala Leu Ile Asn Ser
                155                 160                 165
Leu Asn Glu Ala Gln Ala Gly Asp Val Val Leu Phe His Gly Cys
                170                 175                 180
Cys His Asn Pro Thr Gly Ile Asp Pro Thr Leu Glu Gln Trp Gln
                185                 190                 195
Thr Leu Ala Gln Leu Ser Val Glu Lys Gly Trp Leu Pro Leu Phe
                200                 205                 210
Asp Phe Ala Tyr Gln Gly Phe Ala Arg Gly Leu Glu Glu Asp Ala
                215                 220                 225
Glu Gly Leu Arg Ala Phe Ala Ala Met His Lys Glu Leu Ile Val
                230                 235                 240
Ala Ser Ser Tyr Ser Lys Asn Phe Gly Leu Tyr Asn Glu Arg Val
                245                 250                 255
Gly Ala Cys Thr Leu Val Ala Ala Asp Ser Glu Thr Val Asp Arg
                260                 265                 270
Ala Phe Ser Gln Met Lys Ala Ala Ile Arg Ala Asn Tyr Ser Asn
                275                 280                 285
Pro Pro Ala His Gly Ala Ser Val Val Ala Thr Ile Leu Ser Asn
                290                 295                 300
Asp Ala Leu Arg Ala Ile Trp Glu Gln Glu Leu Thr Asp Met Arg
                305                 310                 315
Gln Arg Ile Gln Arg Met Arg Gln Leu Phe Val Asn Thr Leu Gln
                320                 325                 330
Glu Lys Gly Ala Asn Arg Asp Phe Ser Phe Ile Ile Lys Gln Asn
                335                 340                 345
Gly Met Phe Ser Phe Ser Gly Leu Thr Lys Glu Gln Val Leu Arg
                350                 355                 360
Leu Arg Glu Glu Phe Gly Val Tyr Ala Val Ala Ser Gly Arg Val
                365                 370                 375
Asn Val Ala Gly Met Thr Pro Asp Asn Met Ala Pro Leu Cys Glu
                380                 385                 390
Ala Ile Val Ala Val Leu
                395
<210>3
<211>17
<212>DNA
<213>人工设计的引物序列
<400>3
gcaaaccgcg acaa aagctt tatcatc 17
<210>4
<211>30
<212>DNA
<213>人工设计的引物序列
<400>4
gttttgcccg tggtaacgaa gaagatgctg 30

Claims (5)

1、天冬氨酸转氨酶突变酶，其氨基酸序列是将SEQ IN No.2中第221位由Leu替换为Asn或者是将第338位由Phe突变为Lys。
2、权利要求1所述天冬氨酸转氨酶突变酶的制备方法，其特征在于采用蛋白质合理设计的方法确定出大肠杆菌天冬氨酸转氨酶分子表面上影响酶活性、底物特异性或热稳定性功能的氨基酸残基位点，再通过定点突变的方法获得突变酶。
3、根据权利要求2所述的方法，其特征在于该方法包括如下步骤：
a.采用蛋白质合理设计的方法，通过计算机软件分析大肠杆菌天冬氨酸转氨酶的三维结构，并比较了该酶和嗜热菌天冬氨酸转氨酶中氨基酸序列的差异，从而确定出SEQIN No.2第221位的氨基酸残基Leu和酶的热稳定性相关，第338位的氨基酸残基phe和酶的活性和底物特异性相关；
b.用设计的定点突变引物片段SEQ IN No.3使SEQ IN No.1第1012-1014处的碱基TTC替换为AAA，用定点突变试剂盒获得设计的突变酶，对应在SEQ IN No.2上产生F338K的突变；或者，用设计的定点突变引物片段SEQ IN No.4使SEQ IN No.1第661-663处的碱基CTG替换为AAC，用定点突变试剂盒获得发计的突变酶，对应在SEQ IN No.2上产生L221N的突变。
4、根据权利要求3所述的方法，其特征在于合理设计相关的分析软件是序列分析软件Clustal W、结构分析软件Rasmol和/或蛋白质结构预测软件DeepView。
5、如权利要求1所述的天冬氨酸转氨酶突变酶在L-苯丙氨酸生产中的应用。
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