CN101466830A - 用于生成莫纳甜异构体及其前体的多肽和生物合成途径 - Google Patents

用于生成莫纳甜异构体及其前体的多肽和生物合成途径 Download PDF

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Abstract

利用多肽和生物合成途径生成莫纳甜和某些莫纳甜异构体，如R，R莫纳甜和S，R莫纳甜，和它们的盐。这些多肽和生物合成途径也可用于在某些莫纳甜合成途径包括生物合成途径中形成的中间物R－2－羟基－2－(吲哚－3－基甲基)－4－酮戊二酸的制备。

Description

用于生成莫纳甜异构体及其前体的多肽和生物合成途径
发明背景
发明领域
本发明提供了可用于生成D-色氨酸，吲哚-3-丙酮酸，R-2-羟基-2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸(R-MP)和某些莫纳甜(monatin)异构体，如R，R和S，R莫纳甜及其盐的多肽和生物合成途径。
背景技术
莫纳甜是一种高强度甜味剂，其具有如下化学结构式：
Figure A200680055015D00081
莫纳甜含有两个手性中心导致其具有四种可能的立体异构构型。R，R构型(“R，R立体异构体”或“R，R莫纳甜”)；S，S构型(“S，S立体异构体”或“S，S莫纳甜”)；R，S构型(“R，S立体异构体”或“R，S莫纳甜”)；和S，R构型(“S，R立体异构体”或“S，R莫纳甜”)。在本文中，除非另有规定，所用的术语“莫纳甜”是指包括所有四种莫纳甜立体异构体的组合物，含有任何莫纳甜立体异构体组合(例如仅含有莫纳甜的R，R和S，S异构体)，以及单种异构体形式的组合物。
为清楚说明，按以上所示将莫纳甜的碳骨架编号，与醇基直接共价连接的碳被称为2位碳而与氨基直接共价连接的碳被称为4位碳。因此，除非另有说明，本文所涉及的R，R莫纳甜，S，S莫纳甜，R，S莫纳甜，和S，R莫纳甜分别是指：2R，4R莫纳甜，2S，4S莫纳甜，2R，4S莫纳甜，和2S，4R莫纳甜。
应注意的是，在文献中，还采用了另一习惯对莫纳甜碳骨架编号，与醇基相连的碳是4位碳，而与氨基相连的碳是2位碳。因此，例如，在本文中所涉及的2S，4R莫纳甜与采用另一编号习惯的文献中所涉及的2R，4S莫纳甜是一样的。
而且，由于各种命名习惯，莫纳甜具有多个可供选择的化学名称，包括：2-羟基-2-(吲哚-3-基甲基)-4-氨基戊二酸；4-氨基-2-羟基-2-(1H-吲哚-3-甲基)-戊二酸；4-羟基-4-(3-吲哚基甲基)谷氨酸；和3-(1-氨基-1，3-二羧基-3-羟基-4-丁基)吲哚。
在南非德兰士瓦地区的南非灌木似冬青叶硬木朔(Schlerochitonilicifolius)植物的根皮中可发现某些莫纳甜的异构体形式。美国专利申请No.10/422,366(′366申请＂)，10/979,821(′821申请＂)，和11/114,922(′922申请)中特别公开了用于体内和体外生成莫纳甜的多肽，途径和微生物，这些文献被引入本文作为参考。
发明简述
本发明特别提供了可用于生成D-色氨酸，吲哚-3-丙酮酸，R-2-羟基-2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸(也被称为R-α酮酸莫纳甜，R-莫纳甜前体，R-MP，和莫纳甜的α酮形式)和某些莫纳甜立体异构体，如R，R和S，R莫纳甜，和其盐的多肽和生物合成途径。该方法包括采用一种或多种多肽，尤其是酶，例如消旋酶(如：谷氨酸消旋酶，天冬氨酸消旋酶和丙氨酸消旋酶)，宽特异性D-氨基转移酶(也称为D-丙氨酸氨基转移酶，D-氨基酸氨基转移酶和D-天冬氨酸氨基转移酶)，L-氨基转移酶(包括L-色氨酸氨基转移酶，L-芳族氨基转移酶，L-天冬氨酸氨基转移酶和L-丙氨酸氨基转移酶)，醛缩酶(如，R-特异性醛缩酶)，D-苯基甘氨酸氨基转移酶(也称为D-4-羟苯基甘氨酸氨基转移酶)，D-甲硫氨酸氨基转移酶，谷氨酸脱羧酶，天冬氨酸脱羧酶和天冬氨酸-4-脱羧酶来生成富含4R异构体形式的莫纳甜组合物和/或不使用化学计量的D-氨基酸底物作为MP胺化的氨基酸来源以生成R，R莫纳甜。
为力求简练，在说明书和权利要求中鉴定形成了中间物/产物(如莫纳甜或莫纳甜前体)时，术语“和/或其盐”应理解成包括在可适用情况。换句话说，例如，短语“吲哚-3-丙酮酸被转化成MP”应理解成“吲哚-3-丙酮酸被转化成MP和/或其盐”。事实上，普通技术人员应明白在所示的反应条件下中间物/产物的盐类实际上是存在的或同时存在的。
根据某些实施方式，所述方法生成莫纳甜组合物，其中组合物中莫纳甜成分仅包括莫纳甜的R，R和S，R形式。当使用术语“仅”表示仅形成特定的异构体时，除非另有规定，如果不发生外消旋作用，该途径仅生成鉴定的异构体。因此，术语“仅”不应用于表示缺乏其它异构体，而是普通技术人员应理解成其它异构体形式可能以相对小量存在，因为可能发生外消旋作用。根据某些实施方式，所述方法生成莫纳甜组合物，其中组合物中莫纳甜成分仅包含莫纳甜的R，R形式(这意味着除非发生外消旋作用才导致形成其它异构体形式)。
在本文中，短语“莫纳甜组合物”是指含有一种或多种莫纳甜异构体的组合物；该术语还可以表示仅含有单种莫纳甜异构体形式而不含其它(取决于上下文)的组合物。
根据本发明，在某些实施方式中，提供了一种生成莫纳甜组合物的方法，其包括由L-色氨酸生成吲哚-3-丙酮酸，由吲哚-3-丙酮酸生成2-羟基-2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸(“莫纳甜前体”或“MP”)，和由MP生产莫纳甜。由L-色氨酸生成吲哚-3-丙酮酸的反应是经酶促进的，该酶以L-色氨酸作为底物比R-MP，R，R莫纳甜，或两者时具有更强的特异性，更高的活性。根据特定的实施方式，吲哚-3-丙酮酸的反应是由具有R特异性醛缩酶活性的酶所促进的，从而生成R-MP。根据特定实施方式，提供了一种消旋酶，其可促进在L-色氨酸转氨基反应中形成的副产物氨基酸(或其是由色氨酸反应的副产物另一种氨基酸所形成)的由一种异构体形式至另一种异构体形式的差向立体异构反应。
在本发明的某些实施方式中，提供了一种生成莫纳甜组合物的方法，其包括由L-色氨酸生成吲哚-3-丙酮酸，由吲哚-3-丙酮酸生成2-羟基-2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸(“莫纳甜前体”或“MP”)，和由MP生产莫纳甜。由L-色氨酸生成吲哚-3-丙酮酸的反应是经酶促进的，该酶以L-色氨酸作为底物比R-MP，R，R莫纳甜，或两者时具有更强的特异性，更高的活性，而由MP形成莫纳甜的反应是经对R-MP有立体选择性的酶所促进的。
应该注意的是，对于前述段落中涉及的一系列反应，本发明不需要明确地执行每个步骤；实质地执行这些步骤即可。换句话说，例如，生成莫纳甜组合物的方法，其包括由L-色氨酸生成吲哚-3-丙酮酸，由吲哚-3-丙酮酸生成2-羟基-2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸(“莫纳甜前体”或“MP”)，和由MP生产莫纳甜，其中每个反应都由适当的酶来促进，通过将L-色氨酸和酶组合并设定好条件以使所列的反应得以发生。在这种情况下L-色氨酸能反应生成吲哚-3-丙酮酸，经L-色氨酸反应生成的吲哚-3-丙酮酸可反应形成MP，而经吲哚-3-丙酮酸反应生成的MP可反应形成莫纳甜。该方法还可通过以下方式进行，通过提供能生成L-色氨酸的化合物，在适宜L-色氨酸生成的条件下进行并将该化合物与能够促进一系列反应的酶组合，在适宜这些反应发生的条件开始反应。按另一种方式，该方法可通过提供按所述途径能产生莫纳甜的经基因工程改造的微生物，并为发酵过程的发生提供适宜的条件。例如，将能天然生产大量L-色氨酸(或D-色氨酸)的微生物进行基因工程改造以生成或过量生成一种或多种可用于促进莫纳甜途径中反应的酶，并提供适宜的条件以使微生物能产生莫纳甜。
在本发明的另一实施方式中，提供了一种生成莫纳甜的方法，其中在L-色氨酸转化成吲哚-3-丙酮酸，吲哚-3-丙酮酸反应形成MP(其包括R-MP和S-MP优选只包括或主要包括R-MP)时α酮酸底物形成了一种L-氨基酸，而在R-MP转化成R，R莫纳甜时L-氨基酸反应再生成(也称为“再循环”)α酮酸底物。R-MP形成R，R莫纳甜的反应是由立体转化(stereoinverting)氨基转移酶如D-甲硫氨酸氨基转移酶(EC 2.6.1.41)或源于D-苯基甘氨酸氨基转移酶的酶所促进的。
在本发明的另一实施方式中，提供了一种生成莫纳甜组合物的方法，其包括由L-色氨酸生成D-色氨酸，由D-色氨酸生成吲哚-3-丙酮酸，由吲哚-3-丙酮酸生成R-MP，并由R-MP生成R，R莫纳甜。L-色氨酸生成D-色氨酸是由色氨酸消旋酶和功能相当的酶促进的。在特定实施方式中，D-色氨酸生成吲哚-3-丙酮酸和MP生成莫纳甜的反应是由相同的酶促进的。在其它的进一步实施方式中，吲哚-3-丙酮酸的反应是由具有R特异性醛缩酶活性的酶促进的从而形成R-MP，而D-色氨酸生成吲哚-3-丙酮酸和R-MP生成R，R莫纳甜的反应是由相同的酶促进的。
在本发明的其它实施方式中，披露了一种生成R，R莫纳甜或其盐的方法，包括，或基本由(a)利用色氨酸消旋酶(消旋酶应对莫纳甜活性受限或没有活性)由L-色氨酸生成D-色氨酸，(b)由D-色氨酸生成吲哚-3-丙酮酸，(c)由吲哚-3-丙酮酸生成R-莫纳甜前体，和(d)由R-莫纳甜前体生成R，R莫纳甜组成。
尽管公开了多种实施方式，本发明的其它实施方式对于本领域技术人员基于说明书而言是明显的。由本文说明书应该认识到，本发明可以从多方面进行改变，而不偏离本发明的实质和范围。因此，附图和详细描述应被认为是对特性的例举性说明而非限制。
附图简述
图1显示的是本发明中由L-色氨酸生成R，R莫纳甜的酶促反应过程的实例流程图。在这个实例中，过程包括在L-色氨酸反应中采用L-氨基转移酶(实例包括L-色氨酸氨基转移酶，L-芳族氨基转移酶，L-天冬氨酸氨基转移酶，和L-丙氨酸氨基转移酶)，其在以L-色氨酸为底物时比以R-MP和/或具有对底物R，R莫纳甜的限制活性和/或选择性的L-氨基酸氧化酶为底物具有更高的特异性和/或选择性。
图2显示的是本发明中生成R，R莫纳甜的另一过程的实例流程图。在这个实例中，过程包括采用对R-MP具有立体选择性的酶将R-MP转化成莫纳甜。
图3显示的是本发明中由L-色氨酸生成R，R莫纳甜的另一过程的实例流程图。在这个实例中，过程包括利用色氨酸消旋酶将L-色氨酸转化成D-色氨酸并将反应产物D-氨基酸联系反应形成吲哚-3-丙酮酸，以此作为底物反应形成R，R莫纳甜。
图4显示的是本发明中由L-色氨酸生成R，R莫纳甜的另一过程的实例流程图。在这个实例中，过程包括将与L-色氨酸反应联接的反应中形成的L-氨基酸转化为D-氨基酸；该D-氨基酸作为R-MP转化成R，R莫纳甜反应中的氨基供应者。
图5显示的是本发明中由L-色氨酸生成R，R莫纳甜的另一过程的实例流程图。在这个实例中，过程包括采用立体转化酶促进的R-MP向R，R莫纳甜的转化，以使与L-色氨酸反应联接的反应中形成的L-氨基酸可作为与R-MP向R，R莫纳甜反应联接的反应的底物。
图6显示的是本发明中生成R，R莫纳甜的另一过程的实例流程图。在这个实例中，过程包括再循环反应中生成的L-氨基酸以形成吲哚-3-丙酮酸，再以D-氨基酸作为反应物与R-MP通过一系列转化反应形成R，R莫纳甜。
图7显示的是本发明中生成R，R莫纳甜的另一过程的实例流程图。在这个实例中，过程包括通过将反应的副产物L-氨基酸转化成另一种产物来推动L-色氨酸反应的发生(即将该反应朝生成吲哚-3-丙酮酸的方向推动)。在这个实例中，L-天冬氨酸的副产物L-氨基酸在脱羧酶促进的可逆反应中被转化成L-丙氨酸。
图8显示的是本发明中生成R，R莫纳甜的另一过程的实例流程图。在这个实例中，过程包括再循环L-色氨酸反应副产物氨基酸，通过一系列转化反应以氨基酸作为R-MP反应的反应物。
图9(A和B)显示的是多种公开的芽孢杆菌D-氨基酸氨基转移酶(＂DAAT＂)的氨基酸序列比对。划线的氨基酸代表同源区。根据保守区设计了五对PCR引物。PCR引物如下：5′GAAGACCGTGGTTATCAATTT3′(SEQ IDNO：65)(正向引物，如图9A所示的F1)，5′GATGGTATTTACGAAGTAATC3′(SEQ ID NO：66)(正向引物，如图9A所示的F2)，5′AGATTTAATATCACAACGTAAC3′(SEQ ID NO：67)(反向引物，如图9A所示的R1)，5′GCCAAGTAAAATTTAAGATTTA3′(SEQ ID NO：68)(反向引物，如图9A所示的R2)，5′ATTTGCTGGGTGCGTATAAAG3′(SEQ ID NO：69)(反向引物，如图9B所示的R3)。
图10(A和B)显示的是来自于球形芽孢杆菌(B.sphaericus)DAAT的ATCC 4978和ATCC 7063的两种新型DAAT的氨基酸序列比对(实施例18所克隆的)。划线的是非同源氨基酸。
发明详述
缩写与术语
以下所提供的术语和方法的解释是为更好地描述发明并引导本领域技术人员实践本发明。本文所用的，“包括(including)”表示“包括(comprising)”。任何使用术语“包括”的地方，都应理解成“包括但不限于”的意思，而无论是否明确指出了“不限于”。此外，单数形式的“一”或“该”包括复数情况除非文中另有明确规定。例如，涉及“包括一种蛋白质”则包括一种或多种这类蛋白，而涉及“所述细胞”则包括一种或多种细胞和本领域技术人员已知的等效情况，等等。术语“大约”包含在任何测量中发生的实验性误差范围。除非另有规定，推定在所有测量数据前都有“大约”，即使并未明确使用“大约”这个词。
保守替换：在多肽中以另一种氨基酸替换一种氨基酸，该替换对多肽活性几乎没有影响。该替换被认为是保守的而不管交换的氨基酸是否表现出结构或功能的相似性。例如，理想地，包括一个或多个保守替换的色氨酸氨基转移酶多肽链保持了色氨酸氨基转移酶活性。可采用例如标准方法如位点定向诱变或PCR或本领域公知的方法通过操作编码多肽的核苷酸序列来制备含有一个或多个保守替换的多肽。
氨基酸可被蛋白中的新氨基酸替换其若对多肽活性几乎没有影响则被认为是保守替换，这类非限制实例包括：以ser或thr替换Ala；以gln，his，或lys替换arg；以glu，gln，lys，his，asp替换asn；以asn，glu，或gln替换asp；以ser或ala替换cys；以asn，glu，lys，his，asp，或arg替换gln；以asn，gln，lys，或asp替换glu；以pro替换gly；以asn，lys，gln，arg，tyr替换his；以leu，met，val，phe替换ile；以ile，met，val，phe替换leu；以asn，glu，gln，his，arg替换lys；以ile，leu，val，phe替换met；以trp，tyr，met，ile，或leu替换phe；以thr，ala替换ser；以ser或ala替换thr；以phe，tyr替换trp；以his，phe，或trp替换tyr；而以met，ile，leu替换val。
在其它文献中Ben-Bassat等，J.Bacteriol.169：151-151，(1987)；O′Regan等，Gene 77：237-251，(1989)；Sahin-Toth等，Protein Sci 3：240-247，(1994)；Hochuli等，Bio/Technology(5：1321-1325，(1988)；WO 00/67796(Curd等)和遗传学和分子生物学教科书中可发现更多的关于保守替换的信息。
源自：就说明书和权利要求而言，如果符合下列情况中的任何一种或多种则一种物质是“源自”生物体或来源：1)该物质存在于生物体/来源中；2)该物质从天然宿主中移除；或3)该物质从天然宿主移除并通过例如突变而发展。
分离的：本文所用的术语“分离的”是指从它的天然宿主中移除的任何物质；该物质无需表现出任何特定的纯度。例如“分离的核酸”是指没有直接与两端序列连接的天然存在的核酸，在其所源自的天然存在的生物体基因组中它是直接连接的(一在5′端和一在3′端)。例如，分离的核酸可以是但不限于：任意长度的重组DNA分子，倘若一段核酸序列被发现正常地直接侧向连接则天然存在的基因组中的重组DNA分子被移除或缺失。因而，分离的核酸包括但不限于：不依赖其它序列而以独立分子存在的重组DNA(例如：经PCR或限制性内切酶处理而生成的cDNA或基因组DNA片段)以及被整合入载体，自主复制质粒，病毒(例如逆转录病毒，腺病毒，或疱疹病毒)，或并入原核细胞或真核细胞基因组DNA的重组DNA。此外，分离的核酸可包括是杂交或融合核酸序列的一部分的重组DNA分子。
本文所用的涉及核酸的术语“分离的”还包括任何非天然存在的核酸，因为非天然存在的核酸在自然中未被发现并且在天然存在的基因组中没有可直接联接的序列。例如，非天然存在的核酸如工程核酸被认为是分离核酸。可利用普通的分子克隆或化学核酸合成技术来制备工程核酸。分离的非天然存在的核酸可不依赖于其它序列，或被整合入载体，自主复制的质粒，病毒(例如逆转录病毒，腺病毒，或疱疹病毒)，或原核细胞或真核细胞基因组DNA。此外，非天然存在的核酸可包括是杂交或融合核酸序列的一部分的核酸分子。
存在于例如cDNA或基因文库，或含有基因组DNA限制性酶消化物的凝胶切片中的成千上万其它核酸分子之中的核酸不被认为是分离核酸。
纯化的：本文所用的术语“纯化的”是指杂质已从感兴趣的样品中去除。术语“纯化的”不要求绝对纯度，而是相对性术语，除非文中另有指示。因而，例如，纯化的多肽或核酸制备物是一种其中的目标多肽或核酸比多肽或核酸的生物体天然环境拥有更高浓度或比其所出处的环境拥有更高浓度的物质。
立体转化氨基转移酶：“立体转化氨基转移酶”是一种可以优选地或选择性地生成手性氨基酸产物(如莫纳甜)并采用相反的手性底物作为氨基供应者的多肽。例如，立体转化氨基转移酶可以是D-苯基甘氨酸氨基转移酶(也称为D-4-羟苯基甘氨酸氨基转移酶)其可优选地或选择性地以L-谷氨酸作为底物以生成R，R莫纳甜。立体转化氨基转移酶的非限制性实例包括D-甲硫氨酸氨基转移酶(EC 2.6.1.41)和具有D-苯基甘氨酸氨基转移酶活性或D-4-羟苯基甘氨酸氨基转移酶活性的酶。
互补基因：“互补基因”是被表达时可使生物体突变无效的基因。例如，如果生物体在一段基因中有细胞合成色氨酸所要求的无效突变，互补基因则是其被表达时可使菌株在基础培养基(即：没有色氨酸)中生长。
立体选择性酶：“立体选择性酶”是相对于对另一种异构体的特异性和/或活性，其对一种异构体具有更强的特异性和/或更高的活性的酶。例如，一种立体选择性酶是一种对R-MP具有比对S-MP更高的特异性和/或活性的酶。在优选的实施方式中，相对于另一异构体，立体选择性酶对一种异构体具有限制活性。“限制”活性表示活性是最小的或不可觉察的，例如在本文中实验所测定的。例如，实施例6确定了HEXAspCP9T/R122G是对S，S莫纳甜具有限制活性的一种酶。实施例8确定了苜蓿中华根瘤菌(S.meliloti)TatA是对S-MP具有限制活性的另一种酶。在实施例18中，耐盐芽孢杆菌(B.halodurans)D-氨基转移酶对R-MP具有比对S-MP更高的选择性，可生成更高立体纯度的R，R莫纳甜。还有，实施例19表明了相对于R-MP，杂合DAT对S-MP具有限制活性。
同源的：本文所用的术语“同源的”表示当采用标准方法比对两组序列时，蛋白或核酸表现出与另一蛋白或核酸的序列具有很大程度的序列同一性。例如，当采用标准方法比对两组序列时，若R特异性醛缩酶含有与SEQID 22的醛缩酶至少约50％的序列同一性，则R特异性醛缩酶与SEQ ID 22的醛缩酶是同源的。
EC编号：酶的分类编号是由生物化学与分子生物学国际联合会所确定。
生成R，R莫纳甜和莫纳甜的其它立体异构体的生物合成途径
特别如WO 03/091396A2(参见：例如图1-3和11-13)所述，通过涉及生物转化(即：以多肽促进底物至产物的反应)的多步骤途径可由色氨酸生成莫纳甜。所述的途径包括色氨酸向吲哚-3-丙酮酸的生物转化，吲哚-3-丙酮酸向2-羟基-2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸(“MP”)的生物转化，和MP向莫纳甜的生物转化。本发明中用于生成莫纳甜的生物合成途径可包括，或基本由以下的一个或多个步骤，机制和/或途径组成。下述的步骤，机制和/或途径将被仅视为是示例性的。
生成莫纳甜或其盐的方法包括(a)由色氨酸生成吲哚-3-丙酮酸，(b)由吲哚-3-丙酮酸生成莫纳甜前体，和(c)由莫纳甜前体生成莫纳甜。
可用于将色氨酸转化成吲哚-3-丙酮酸的酶包括酶分类(＂EC＂)2.6.1.27，1.4.1.19，1.4.99.1，2.6.1.28，1.4.3.2，1.4.3.3，2.6.1.5，2.6.1.-，2.6.1.1，2.6.1.21和3.5.1.-的成员。这类别包括多肽如：色氨酸氨基转移酶，其将L-色氨酸和α-KG(即：α-酮戊二酸，也称为2-酮戊二酸)转化成吲哚-3-丙酮酸和L-谷氨酸；D-色氨酸氨基转移酶，其将D-色氨酸和2-酮酸转化成吲哚-3-丙酮酸和氨基酸；色氨酸脱氢酶，其将L-色氨酸和NAD(P)转化成吲哚-3-丙酮酸和NH3和NAD(P)H；D-氨基酸脱氢酶，其将D-氨基酸和FAD转化成吲哚-3-丙酮酸和NH3和FADH2；色氨酸-苯丙酮酸转氨酶，其将L-色氨酸和苯丙酮酸转化成吲哚-3-丙酮酸和L-苯丙氨酸；L-氨基酸氧化酶，其将L-氨基酸和H2O和O2转化成2酮酸和NH3和H2O2；D-氨基酸氧化酶，其将D-氨基酸和H2O和O2转化成2酮酸和NH3和H2O2；和色氨酸氧化酶，其将L-色氨酸和H2O和O2转化成吲哚-3-丙酮酸和NH3和H2O2。这类别还包括酪氨酸(芳族)氨基转移酶，天冬氨酸氨基转移酶，D-氨基酸(或D-丙氨酸)氨基转移酶，和具有多种氨基转移酶活性的宽(多底物)氨基转移酶，其中一些可以将色氨酸和2酮酸转化成吲哚-3-丙酮酸和氨基酸。此外，这类别包括苯丙氨酸脱氨酶，在水的参与下其可将色氨酸转化成吲哚-3-丙酮酸和铵。
由L-色氨酸生成吲哚-3-丙酮酸还可由一种或多种对底物L-色氨酸比对MP或莫纳甜具有更高的活性，更高的特异性或两者的酶来促进。对底物L-色氨酸比对MP或莫纳甜具有更高的活性和/或更高的特异性的酶实例包括但不限于L-色氨酸氨基转移酶，L-芳族氨基转移酶，L-天冬氨酸氨基转移酶，和L-氨基酸氧化酶。
用于将吲哚-3-丙酮酸转化成MP的酶包括酶分类EC 4.1.3.-，4.1.3.16，4.1.3.17，和4.1.2.-的成员。这类别包括碳碳合酶/裂合酶，如可促进两个羧酸底物缩合的醛缩酶。酶分类EC 4.1.3.-是那些利用酮酸底物(如吲哚-3-丙酮酸)作为亲电试剂形成碳碳键的合酶/裂合酶。例如，已知KHG醛缩酶(EC4.1.3.16)和ProA醛缩酶(EC 4.1.3.17)可将吲哚-3-丙酮酸和丙酮酸转化成MP。尽管ProA醛缩酶被认为是只表示源自睾丸酮丛毛单胞杆菌(Comamonastestosteroni)的4-羟基-4-甲基-2-酮戊二酸醛缩酶，本文中术语ProA醛缩酶被用于表示任何具有4-羟基-4-甲基-2-酮戊二酸醛缩酶活性的多肽，除非另有规定。Pro醛缩酶的适宜实例包括睾丸酮丛毛单胞杆菌ProA(SEQ ID NO.1(核酸序列)，SEQ ID NO：2(氨基酸序列))和苜蓿中华根瘤菌ProA(NCBI登录号：CAC46344)，或表现出与睾丸酮丛毛单胞杆菌ProA(SEQ ID NO：1(核酸序列)，SEQ ID NO：2(氨基酸序列))和/或苜蓿中华根瘤菌ProA(NCBI登录号：CAC46344)同源的酶。例如，适宜的酶具有与睾丸酮丛毛单胞杆菌ProA(SEQID NO：2)和/或苜蓿中华根瘤菌ProA(NCBI登录号：CAC46344)至少约40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％，和/或99％氨基酸序列同一性。还可通过化学反应如醛缩合生成MP。
可用于将MP转化成莫纳甜的酶包括酶分类(EC)：色氨酸氨基转移酶(2.6.1.27)，色氨酸脱氢酶(1.4.1.19)，D-氨基酸脱氢酶(1.4.99.1)，谷氨酸脱氢酶(1.4.1.2-4)，苯丙氨酸脱氢酶(1.4.1.20)，色氨酸-苯丙酮酸转氨酶(2.6.1.28)的成员，或氨基转移酶家族(2.6.1.-)中更普通的成员如天冬氨酸氨基转移酶(EC2.6.1.1)，酪氨酸(芳族)氨基转移酶(2.6.1.5)，D-色氨酸氨基转移酶，或D-丙氨酸(2.6.1.21)氨基转移酶(参见WO03/091396A2的附图2)。还可采用化学反应来进行该反应。利用氨和硼氢化钠通过还原胺化进行酮酸(MP)的胺化。WO03/091396A2的附图11-13显示了可用于将MP转化成莫纳甜的其它多肽，并可提供由吲哚-3-丙酮酸或色氨酸生成莫纳甜的更高产量。
莫纳甜组合物的味觉特征可通过调控组合物中各种莫纳甜立体异构体的相对量而改变。本发明提供了生成具有理想的R，R莫纳甜和/或S，R莫纳甜百分比的莫纳甜组合物的途径和物质。
经本文所述途径生成的莫纳甜化合物的手性可通过pH和生物转化中所用的多肽而改变。当采用生物合成途径形成莫纳甜时，需考虑以下内容。在生物促进反应中，莫纳甜碳2的手性(参见上文的化学结构)是由将吲哚-3-丙酮酸转化成MP的酶所决定的。多种酶(例如：来自于EC 4.1.2.-，4.1.3.-)可将吲哚-3-丙酮酸转化成MP。因而，可选择能形成所需异构体的酶。此外，吲哚-3-丙酮酸转化成MP的酶的对映特异性可通过使用可被工程改造成能促进所需反应的定向发展或促进抗体而被改进。一旦生成MP(通过酶促或化学缩合)，可立体特异性地添加氨基。取决于使用的是D-或L-芳族酸氨基转移酶可生成碳4的R或S构型(参见上文的化学结构)。许多氨基转移酶是对L-异构体特异的，而D-色氨酸氨基转移酶存在于特定的植物中(Kohiba andMito，Proceedings of the 8th International Symposium on Vitamin B6 andCarbonyl Catalysis，Osaka，Japan 1990)。此外，D-丙氨酸氨基转移酶(EC2.6.1.21)，D-甲硫氨酸-丙酮酸氨基转移酶(EC 2.6.1.41)和(R)-3-氨基-2-甲基丙酸酯氨基转移酶(EC2.6.1.61)，(S)-3-氨基-2-甲基丙酸酯氨基转移酶(EC2.6.1.22)已被鉴别。某些氨基转移酶可能只接受具有特定C2碳构型作为该反应的底物。因此，即使向MP的转化不是立体特异性的，最终产物的立体化学可通过选择适宜的氨基转移酶而被控制。因为反应是可逆的，未反应的MP(非期望的异构体)可被循环回它的成分，并再形成消旋的MP混合物。
现在参照附图，应注意以下问题。流程图是生成莫纳甜途径的实例，而附图中显示的途径和本发明的方法不限于实践途径的任何特定的方法，除非另有规定。例如，途径可在体内，体外或它们的结合中实施。
另外，利用本文公开的一种或多种途径来实施本发明的方法不要求每个成分(如：反应物和酶)都准确地和由实施者提供的一样；而是，给组合物(或宿主细胞)提供成分(或成分源)，和反应条件或其它有效条件以使途径能被有效实施即可。换句话说，例如，在附图中描述了生成莫纳甜组合物的过程，其包括由L-色氨酸生成吲哚-3-丙酮酸，由吲哚-3-丙酮酸生成2-羟基-2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸(“莫纳甜前体”或“MP”)，和由MP生产莫纳甜，其中每个反应都由适应的酶来促进，可以设想实施该途径包括将L-色氨酸和α-酮戊二酸和预期用于促进同一反应酶组合，而在适宜于每个反应发生的条件下不需要准确地提供吲哚-3-丙酮酸或MP。在这种情况下L-色氨酸能与α-酮戊二酸反应生成吲哚-3-丙酮酸。根据条件和所提供的酶，经L-色氨酸反应生成的吲哚-3-丙酮酸可反应形成MP，而再根据条件和所提供的酶，经吲哚-3-丙酮酸反应生成的MP可反应形成莫纳甜。
应该注意的是利用本文公开的一种或多种途径来实施本发明的方法不要求实施者准确地提供确定的起始物质或酶，如果这些原料或酶已经存在或是有效可用，或可以从反应体系中已经存在或有效可用的物质合成而来。换句话说，构想了实施确定以L-色氨酸作为起始物质的任何途径包括提供能生成L-色氨酸的化合物，在适宜L-色氨酸生成的条件下进行并将该化合物与能够促进一系列反应的酶组合，在适宜这些反应发生的条件开始反应。在另一实例中，还构想了实施确定的途径包括提供经基因工程改造的微生物以按照所述途径生成莫纳甜，并为发酵过程的进行提供适宜的条件。例如，将能自然生产大量L-色氨酸或D-色氨酸(参见美国专利No.5,728,555)的微生物进行基因工程改造以生成或过量生成一种或多种可用于促进(促进)莫纳甜途径中反应的酶，并提供适宜的条件以使微生物能产生莫纳甜。
现在轮到图1，所示的流程图示意性地描述了本发明中制备含有R，R莫纳甜的莫纳甜组合物的过程。如图1所示，整个途径包括色氨酸形成吲哚-3-丙酮酸的反应，吲哚-3-丙酮酸生成MP的反应，和MP生成包含R，R莫纳甜的莫纳甜的反应。
图1进一步图示了整体途径的特定变形，设计成在消耗莫纳甜S，S，R，S和S，R形式下增加莫纳甜R，R形式的生成。尤其是，图1图示了实施方式其中：在L-色氨酸反应中采用的氨基转移酶对该反应比对MP和4S莫纳甜反应具有更高的活性和/或特异性，或氧化酶对L-色氨酸比对4R莫纳甜具有更高的活性和/或特异性；促进吲哚-3-丙酮酸反应的酶是R特异性醛缩酶；而促进MP反应的酶是宽特异性的D酶，优选使其发展成与MP的R异构体一起能更高效地工作。
图1还图示了设计成使R，R莫纳甜生成更经济的特定变形。例如，在图1中不同于D-色氨酸或L-和D-色氨酸的组合，L-色氨酸被确定为起始物质。当对色氨酸特定形式的选择不影响莫纳甜组合物中最终莫纳甜化合物的手性(因此色氨酸反应形成吲哚-3-丙酮酸，其还没有手性)，有时可优选采用L-色氨酸作为起始物质至少因为L-色氨酸通常不很昂贵且比D-色氨酸更容易获得。
现在关注图1所示的第一反应，当色氨酸转化成吲哚-3-丙酮酸时，α-酮戊二酸，草酰乙酸，和/或丙酮酸的任一种或多种与色氨酸反应形成氨基酸(分别是谷氨酸，天冬氨酸，和丙氨酸)和吲哚-3-丙酮酸。图1描述了实施方式其中色氨酸起始物质是L-色氨酸，而α-酮戊二酸，草酰乙酸，和/或丙酮酸生成氨基酸的L-异构体形式(例如分别是L-谷氨酸，L-天冬氨酸，和L-丙氨酸)。
如图1所示，增加R，R莫纳甜生成的方法包括以具有对色氨酸不同于对MP或莫纳甜的更高的特异性，更高的活性/或两者的酶促进L-色氨酸的反应，而以D特异性酶促进MP的反应。如WO03/091396A2所公开的，特定的酶能促进色氨酸生成吲哚-3-丙酮酸的反应，以及MP生成莫纳甜的胺化反应。在胺化步骤中采用L-氨基转移酶可产生在莫纳甜C-4位上的S手性中心，而采用D酶可产生在莫纳甜C-4位上的D手性中心。因而，在这种情况下促进色氨酸反应的L-氨基转移酶在MP反应中也是有活性的，根据存在的MP形式可生成R，S和S，S莫纳甜。此外，其它某些酶，L-氨基酸氧化酶，不仅能促进色氨酸向吲哚-3-丙酮酸的反应，还具有降解R，R莫纳甜的副活性。在某些实施方式中，这种4R副活性被最小化或被消除。根据所需的最终组合物，氧化酶对莫纳甜4S形式的副活性可降低或使其对最终产物最小化可以是有益的。因此，所选择的L酶对色氨酸具有比对MP或莫纳甜更高的特异性和/或活性，则生成的R，R和S，R的量相对于S，S和R，S莫纳甜就越高。
根据图1所示的实施方式，适宜于色氨酸反应的酶包括：可以促进L-色氨酸反应形成吲哚-3-丙酮酸的L-氨基转移酶，其具有对该反应比对R-MP形成莫纳甜4S异构体的反应更高的特异性；而，可以促进L-色氨酸反应形成吲哚-3-丙酮酸的L-氨基酸氧化酶，其具有对该反应比对莫纳甜4R异构体形成MP的反应更高的特异性和/或活性，和任何前述酶的功能等效物。更具体而言，适宜酶的非限制性实施例可从L-色氨酸氨基转移酶(EC 2.6.1.27)和酪氨酸(芳族)氨基转移酶(EC 2.6.1.5)和L-氨基酸氧化酶(EC 1.4.3.2)，和源自于具有天冬氨酸氨基转移酶活性的酶的突变体中选择。
实施例6确定了一种特定酶，突变的HEXaspC多肽，其包含Pro 9至Tyr替换和Arg 122至Gly替换，可用于促进L-色氨酸和α-KG，草酰乙酸，丙酮酸，或它们的组合分别形成吲哚-3-丙酮酸和L-谷氨酸，L-天冬氨酸，和L-丙氨酸的反应。另一具有限制活性的特定酶是TatA，来自苜蓿苜蓿中华根瘤菌(S.meliloti)的L-色氨酸氨基转移酶。根据图1所示途径的优选实施方式适宜于色氨酸反应的其它酶包括具有以下特性的那些：如实施例6中酶对MP的转氨基速率是1/10或低于L-色氨酸的速率或如实施例9中，酶与消旋酶一起使用时，将生成大于90％的莫纳甜4R异构体。
相对于MP向莫纳甜的转化，对L-色氨酸向吲哚-3-丙酮酸的转化具有高度特异性的酶包括：HEXAspC(实施例6)，硕大利什曼原虫(Leishmaniamajor)宽特异性氨基转移酶(WO03/091396A2)，猪氨基转移酶(WO03/091396A2)和球形红细菌(Rhodobacter sphaeroides)TatA(实施例9)。例如通过诱变可以使这些酶发展成相对于色氨酸，其具有对R-MP和/或R，R莫纳甜的限制活性。
现在关注图1所确定的第二反应，对用于促进(或催化)吲哚-3-丙酮酸向MP反应的酶的选择将影响R，R莫纳甜与S，R莫纳甜的相对量。通常，生成的R-MP比S-MP的相对量越高，则生成的R，R莫纳甜比S，R莫纳甜的相对量也越高(以D酶促进MP至莫纳甜的反应)。在这方面可用的酶包括酶可产生的R-MP:S-MP比例高于由大肠杆菌KHG醛缩酶(Genbank登录号：AAC74920.1)，芽孢杆菌KHG醛缩酶(Genbank登录号：CAB14127.1)或睾丸酮丛毛单胞杆菌Pro A醛缩酶(SEQ ID NO：1(核酸序列)，SEQ ID NO：2(氨基酸序列))中的任一种促进时吲哚-3-丙酮酸和丙酮酸反应产生的比例的酶。因而，若希望优选生成R-MP，可采用一种或多种能生成更高的R-MP比S-MP相对量的酶。当希望莫纳甜组合物中以R，R形式的莫纳甜作为其唯一的莫纳甜成分时，应采用可选择性地生成与S-MP相反的R-MP的酶(“R特异性酶”)。可用于选择性地生成与S-MP相反的R-MP的R特异性酶的实例包括如实施例3所示的SEQ ID NO：22的醛缩酶和苜蓿苜蓿中华根瘤菌HGM醛缩酶。
图1确定了特定实施方式，其中R特异性醛缩酶促进吲哚-3-丙酮酸和丙酮酸形成R-MP的反应。还构想了在吲哚-3-丙酮酸和丙酮酸反应中使用醛缩酶优选生成R-MP，以及醛缩酶可产生的R-MP:S-MP比例高于由大肠杆菌KHG醛缩酶(Genbank登录号：AAC74920.1)，芽孢杆菌KHG醛缩酶(Genbank登录号：CAB14127.1)或睾丸酮丛毛单胞杆菌Pro A醛缩酶(SEQ ID NO：1(核酸序列)，SEQ ID NO：2(氨基酸序列))中的任一种酶所产生的比例。此外，还构想了吲哚-3-丙酮酸可与不同C3源(例如丝氨酸或半胱氨酸)反应形成R-MP而其它酶(例如其它裂合酶或合酶)可促进该反应。还可采用其它易于转化成丙酮酸的底物(如草酰乙酸)。实施例3提供了可优选地或选择性地生成R-MP或可产生的R-MP:S-MP比例高于由大肠杆菌KHG醛缩酶(Genbank登录号：AAC74920.1)，芽孢杆菌KHG醛缩酶(Genbank登录号：CAB14127.1)或睾丸酮丛毛单胞杆菌Pro A醛缩酶(SEQ ID NO：1(核酸序列)，SEQ IDNO：2(氨基酸序列))中的任一种酶所促进的吲哚-3-丙酮酸和丙酮酸反应产生的比例的醛缩酶源，例如SEQ ID NO.22的醛缩酶。实施例5还提供了用于鉴别这类酶的筛选方法。还构想了可优选地或选择性地生成R-MP或可产生的R-MP多于由大肠杆菌KHG醛缩酶(Genbank登录号：AAC74920.1)，芽孢杆菌KHG醛缩酶(Genbank登录号：CAB14127.1)或睾丸酮丛毛单胞杆菌Pro A醛缩酶(SEQ ID NO：1(核酸序列)，SEQ ID NO：2(氨基酸序列))中的任一种酶所产生的酶能由自然中已知或已发现的醛缩酶发展而来。可应用现有技术中已知的用于发展酶的任何技术，例如为改善期望特性-如为与野生型酶相比增强酶对底物活性。实施例4，5，6，7，9，10和11提供了一些发展酶的技术。
现在关注图1中确定的最后步骤，所示的R-MP形成R，R莫纳甜反应是由宽特异性D-氨基转移酶所促进的，例如D-丙氨酸氨基转移酶(EC 2.6.1.21，也称为D-氨基酸氨基转移酶或D-天冬氨酸氨基转移酶)或D-氨基酸脱氢酶。如上所述，MP向莫纳甜的转化是胺化反应，其产生了在莫纳甜C-4碳上的手性中心。若希望C-4位是R手性形式，则应采用能在氨基酸中生成“R”手性中心的酶。非限制性示例性酶包括：源自芽孢杆菌的D-丙氨酸氨基转移酶(实施例15-18)，包括源于耐盐芽孢杆菌(Bacillus halodurans)的D-丙氨酸氨基转移酶(实施例18)和具有改进的立体特异性的突变支链氨基转移酶(实施例7)。
其它示例性酶包括杂合D-氨基转移酶。杂合D-氨基转移酶可包含来自两种不同氨基酸氨基转移酶的结构元件。为改进其将MP转化成莫纳甜的性能，杂合D-氨基转移酶还可进一步发展(例如，经由诱变或重组改造)。实施例19中展示了一个这类杂合D-氨基转移酶的实例。实施例19中例示的杂合D-氨基转移酶包括了来自于球形芽孢杆菌(B.spaericus)D-氨基转移酶和嗜热脂肪土芽孢杆菌(G.stearothermophilus)D-氨基转移酶的元件。采用这类D-氨基转移酶可生成R，R莫纳甜(实施例19)。
实施例2也表明了采用不同D-氨基转移酶生产R，R莫纳甜。
根据某些实施方式，相对于对吲哚-3-丙酮酸，D-氨基转移酶对底物R-MP具有更强的特异性，更高的活性，或两者。在特定的其它实施方式中，D-氨基转移酶对底物吲哚-3-丙酮酸具有限制活性。具备这种特性的酶能从现存的酶中发展或突变而来，例如实施例6所示。
此外，在某些实施方式中，R-MP形成R，R莫纳甜的反应可由D-氨基酸脱氢酶所促进。实施例20表明了利用D-氨基酸脱氢酶(D-AADH-101至108，BioCatalytics)由R-MP生成R，R莫纳甜。为改进性能可进一步发展这类D-氨基酸脱氢酶(例如：经由诱变或重组改造)。
图2描绘了以生成R，R莫纳甜为目标的另一种策略。在图1的实施方式中，用于吲哚-3-丙酮酸形成R-MP反应的醛缩酶会影响形成的R，R:S，R比例，而在图2的实施方式中，促进MP向莫纳甜转化的D-酶会影响形成的R，R:S，R比例。根据图2的实施方式，非立体特异性酶可用于促进吲哚-3-丙酮酸向R-MP的反应，结果可形成S-MP和R-MP。为获得理想的R，R莫纳甜与S，R莫纳甜比例，要选择(或发展)相对于对S-MP具有对R-MP的适宜立体选择性的D酶。若希望莫纳甜组合物是以R.R形式的莫纳甜作为其唯一的莫纳甜成分时，可优选相对于对S-MP向莫纳甜的反应能选择性地促进R-MP向莫纳甜反应的酶。例如，可采用耐盐芽孢杆菌(Bacillus halodurans)的D-氨基转移酶(实施例18)和包含来自于球形芽孢杆菌和嗜热脂肪土芽孢杆菌的结构元件的杂合D-氨基转移酶(实施例19)作为选择性促进R-MP向莫纳甜反应的酶。
图3图示了生成富含R，R莫纳甜的组合物的另一可选途径。图3的途径是图1途径的改进型。在图3所示途径中，由L-色氨酸间接而不是直接生成了吲哚-3-丙酮酸。更具体而言，L-色氨酸被转化成D-色氨酸，而D-色氨酸再转化成吲哚-3-丙酮酸。实施例4图示了利用色氨酸消旋酶由L-色氨酸生成R，R莫纳甜。
L-色氨酸向D-色氨酸的转化可由色氨酸消旋酶或其功能等效物促进。实施例4提供了色氨酸消旋酶的有效来源和鉴别这类酶的筛选方法。实施例4描述了能够将L-色氨酸转化成D-色氨酸的色氨酸消旋酶的实例。为改进性能可进一步发展这类色氨酸消旋酶(例如，经由突变或重组改造)。
色氨酸消旋酶的非限制性实例包括氨基酸消旋酶(EC 5.1.1.-)的同源物或突变体，例如丝氨酸消旋酶，其中该同源物或突变体能够将L-色氨酸转化成D-色氨酸。氨基酸消旋酶来自的来源的非限制性实例包括微生物例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)，大肠杆菌(Escherichia coli)，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus)，耐盐芽孢杆菌(Bacillus halodurans)，嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)，地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)，霍乱弧菌(Vibrio cholerae)，栗酒裂殖酵母(Schizosaccaroycespombe)，蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)，鹑鸡肠球菌(Enterococcusgallinarum)，戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)，短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)，发酵乳杆菌(Lactobacilli fermenti)，短乳杆菌(Lactobacillus brevis)，嗜火产液菌(Aquifex pyrophilus)，乳杆菌(Lactobacilli)，链球菌(Streptococcus)，鱼腥藻(Anabaena sp.)，条纹假单胞菌(Pseudomonas striata)，香菇(Lentinusedodes)，魁蚶(Scapharca brouhtonii)，脱硫球菌(Desulfurococcus sp.)，嗜热球菌(Thermococcus sp.)，和条纹假单胞菌。氨基酸消旋酶来自的来源的其它非限制性实例包括家蚕，大鼠脑，或小鼠脑。为改进其将L-色氨酸转化成D-色氨酸的性能，可进一步发展这类氨基酸消旋酶(例如，经由诱变或重组改造)。
适宜的色氨酸消旋酶的有效来源的非限制性实例包括：微生物例如假单胞菌，如绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)(致黄假单胞菌(Pseudomonas aurereofaciens))(ATCC 15926)，和吡菌素伯克霍尔德氏菌(Burkholderia pyrrocina)(ATCC15958)。适宜的色氨酸消旋酶的有效来源的其它非限制性实例包括：植物，例如烟草植物如烟草(Nicotiana tabacum)，小麦植物如小麦(Triticum aestivum)，甜菜，番茄，和南非灌木似冬青叶硬木朔(Sclerochiton ilicifolius)。
图3所示的途径具备特定优势，包括当希望生成R，R莫纳甜时，同一酶可用于生成吲哚-3-丙酮酸的反应以及生成产物莫纳甜的反应。即：在图1所展示的途径中，L-氨基转移酶(或适宜的L酶)促进生成吲哚-3-丙酮酸的反应，而D-氨基转移酶促进生成莫纳甜的反应。与图3的途径相比，促进生成吲哚-3-丙酮酸反应的特定D-氨基转移酶还可以促进生成莫纳甜的反应。因此，在图3的途径中，若希望在形成吲哚-3-丙酮酸的反应以及形成莫纳甜的反应中使用同一酶，可优选宽特异性D-氨基转移酶。相反，在图1，2，4，6，7和8的途径中，选择与R-MP相比对吲哚-3-丙酮酸具有限制活性和/或特异性的D-氨基转移酶，能更高效地生成莫纳甜。
图3中示意描述的途径的另一优势在于与生成吲哚-3-丙酮酸反应相连的反应产物氨基酸现在可作为生成莫纳甜反应中的反应底物。即，在图1所示的途径中，L-色氨酸反应生成吲哚-3-丙酮酸而同时草酰乙酸，α-酮戊二酸和/或丙酮酸反应产生L-氨基酸。因为形成莫纳甜的反应与利用D-氨基酸作为底物的反应是相连的，在所示条件下，形成吲哚-3-丙酮酸反应中的L-氨基酸不能循环用于与R-MP反应相连的反应。相反，在图3所示途径中，由D-色氨酸形成吲哚-3-丙酮酸的反应是与形成D-氨基酸产物的反应相连的，其中D-氨基酸可循环用于与R-MP反应相连的反应中。这可实现在步骤1中使用非化学计量的氨基受体并由步骤1生成用于步骤3的氨基供体。
图4和5图示了图1途径的其它改进型。这些改进型涉及再循环由与L-色氨酸转氨反应相连的反应中形成的氨基酸产物和以与MP向莫纳甜的反应相连的反应的氨基酸反应物。
然后是图4，再循环是由能促进L-氨基酸向D-氨基酸转化及其逆反应的酶所完成的。更具体而言，如图4所示，在L-色氨酸反应形成吲哚-3-丙酮酸时α-KG反应形成L-谷氨酸，可提供谷氨酸消旋酶(EC 5.1.1.3)或功能等效物以促进L-谷氨酸向D-谷氨酸的转化及其逆反应。在这种情况下，随着吲哚-3-丙酮酸的生成而形成的产物L-谷氨酸被部分移除，因为它会转化成D-谷氨酸，而由L-谷氨酸转化形成的D-谷氨酸可有效地作为与MP至莫纳甜的反应相连的反应的底物。类似地，在D-谷氨酸反应中形成的α-KG可有效地作为与L-色氨酸至吲哚-3-丙酮酸的反应相连的反应的底物。
谷氨酸消旋酶的有效来源的非限制性实例包括戊糖片球菌，短小芽孢杆菌，发酵乳杆菌，短乳杆菌，大肠杆菌，嗜火产液菌和枯草芽孢杆菌。更具体而言(也是非限制性的)，谷氨酸消旋酶可由核酸如戊糖片球菌murI基因(Genbank登录号L22789)表达，或短乳杆菌谷氨酸消旋酶。
当L-色氨酸反应形成吲哚-3-丙酮酸时草酰乙酸反应形成L-天冬氨酸，可提供天冬氨酸消旋酶(EC 5.1.1.13)或功能等效物以将L-天冬氨酸转化成D-天冬氨酸。在这种情况下，在生成吲哚-3-丙酮酸的相同反应中形成的L-天冬氨酸会被部分移除，因为它会转化成D-天冬氨酸，而该D-天冬氨酸可有效地作为与MP至莫纳甜的反应相连的反应的底物。类似地，在D-天冬氨酸反应中形成的草酰乙酸可有效地作为与L-色氨酸至吲哚-3-丙酮酸的反应相连的反应的底物。
具有天冬氨酸消旋酶活性的适宜酶的非限制性实例包括ASPR-101(BioCatalytics，Inc.，129 N.Hill Ave，Suite 103，Pasadena，CA 91106-1955)和能够促进L-天冬氨酸向D-天冬氨酸转化的氨基酸消旋酶(EC 5.1.1.-)的同源物或突变体。
天冬氨酸消旋酶的有效来源的非限制性实例包括脱硫球菌，嗜热球菌，双壳类软体魁蚶，不动杆菌(Acinetobacter)，土壤杆菌(Agrobacterium)，古生球菌(Archaeoglobus)，芽孢杆菌，博德特菌(Bordetella)，慢生根瘤菌(Bradyrhizobium)，短杆菌，伯克霍尔德菌(Burkholderia)，弯曲杆菌(Campylobacter)，念珠菌(Candida)，柄杆菌(Caulobacter)，梭菌(Clostridium)，脱亚硫酸菌(Desulfitobacterium)，脱硫菌(Desulfotalea)，肠球菌(Enterococcus)，欧文氏菌(Erwinia)，埃希氏菌(Escherichia)，铁原体菌(Ferroplasma)，幽门螺杆菌(Helicobacter)，克雷伯杆菌(Klebsiella)，乳酸杆菌(Lactobacillus)，曼氏杆菌(Mannheimia)，苜蓿(Medicago)，中慢生根瘤菌(Mesorhizobium)，甲烷球菌(Methanococcus)，甲烷八叠球菌(Methanosarcina)，海洋芽孢杆菌(Oceanobacillus)，酒球菌(Oenococcus)，片球菌(Pediococcus)，极地杆菌(Polaribacter)，假单胞菌(Pseudomonas)，热球菌(Pyrococcus)，罗尔斯通氏菌(Ralsonia)，志贺氏菌(Shigella)，中华根瘤菌，沙门氏菌，鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas)，链球菌，热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter)，弧菌(Vibrio)，沃林氏菌(Wolinella)，黄单胞菌(Xanthomonas)，黄色杆菌(Xanthobacter)，耶尔辛氏菌(Yersinia)，和发酵单胞菌(Zymomonas)。
当L-色氨酸反应形成吲哚-3-丙酮酸时丙酮酸反应形成L-丙氨酸，可提供丙氨酸消旋酶或功能等效物以将L-丙氨酸转化成D-丙氨酸。在这种情况下，在生成吲哚-3-丙酮酸的相同反应中形成的L-丙氨酸会被部分移除，因为它会转化成D-丙氨酸，而该D-丙氨酸可有效地作为与MP至莫纳甜的反应相连的反应的底物。类似地，在D-丙氨酸反应中形成的丙酮酸可有效地作为与L-色氨酸至吲哚-3-丙酮酸的反应相连的反应的底物。
适宜的丙氨酸消旋酶的非限制性实例包括A8936(Sigma，PO Box14508，St.Louis，MO，63178)和实施例4所述嗜热脂肪土芽孢杆菌的丙氨酸消旋酶。
丙氨酸消旋酶的有效来源的非限制性实例包括：流产布鲁氏菌(Brucellaabortus)，粪链球菌(Streptococcus faecalis)，鼠伤寒沙门氏菌，大肠杆菌，枯草芽孢杆菌，铜绿假单胞菌，霍乱弧菌，栗酒裂殖酵母，蜡状芽孢杆菌和香菇。
实施例9和12图示了上述消旋酶的应用，以及它们在增加所需莫纳甜产物比例上的影响，并且提供了消旋酶的有效来源。
然后是图5，立体转化氨基转移酶被用于促进R-MP至莫纳甜的反应。尽管形成R，R莫纳甜(或S，R莫纳甜)的R-MP(或S-MP)反应通常是与D-氨基酸反应相连的，但立体异构氨基转移酶可促进相连的利用L-氨基酸由R-MP(或S-MP)形成R，R莫纳甜(或S，R莫纳甜)的反应。这样的话，L-色氨酸氨基转移酶反应的产物L-氨基酸可作为MP至莫纳甜的转氨反应的底物，而与MP至莫纳甜的反应相连的反应产物(即：草酰乙酰，丙酮酸，和/或α-KG)可作为L-色氨酸至吲哚-3-丙酮酸的反应相连的反应起始物质。可用的立体转化氨基转移酶的非限制性实例包括源自D-苯基甘氨酸氨基转移酶(EC2.6.1.72，也称为D-4-羟苯基甘氨酸氨基转移酶)，D-甲硫氨酸氨基转移酶(EC2.6.1.41，也称为D-甲基-氨基转移酶和D-甲硫氨酸-丙酮酸氨基转移酶)的突变体，和其同源物。D-苯基甘氨酸氨基转移酶的突变体的有效来源的非限制性实例包括假单胞菌，如恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)LW-4和施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)ST-201。D-甲硫氨酸氨基转移酶的有效来源的非限制性实例包括花椰菜和花生。
实施例10和11共同提供了立体转化酶的有效来源，和制备这类酶的方法。实施例还提供了鉴别这类酶的筛选方法。也构想了这类酶可由自然界已知或已发现的立体转化酶发展而来。作为立体转化酶的非限制性实例可以是D-氨基酸氨基转移酶的同源物或突变体或氨基酸消旋酶(EC 5.1.1.-)的同源物或突变体。
图6和7也展示了图1途径的改进型。图6和7所示的途径提供了通过可逆反应移除色氨酸反应的副产物和在某些情况下为MP反应提供底物来推动平衡反应动向(即朝产生莫纳甜的方向)的方法。
然后是图6，所示的途径通过将L-氨基酸转化成不同的L-氨基酸和CO2来移除与色氨酸反应相连的反应产物L-氨基酸，然后还通过将新形成的L-氨基酸转化成D-氨基酸来给与MP反应相连的反应提供底物。具体而言，所显示的L-色氨酸与草酰乙酸反应形成了吲哚-3-丙酮酸和L-天冬氨酸。天冬氨酸4-脱羧酶(EC 4.1.1.12)或功能等效物被用于促进L-天冬氨酸向L-丙氨酸和二氧化碳的转化，而具有丙氨酸消旋酶活性的酶被用于促进L-丙氨酸向D-丙氨酸的转化，其中D-丙氨酸可作为R-MP向莫纳甜转化中的氨基供体。
接着是图7，所示的途径图示了移除与色氨酸反应相连的反应产物L-氨基酸的其它方法。图中介绍的实施方式产生了在逆方向难以有效反应的副产物，例如由于挥发性(例如：二氧化碳)或自发转化成不能反应的终产物。这种途径的实例包括这样的实施例，其中α-KG与L-色氨酸反应生成L-谷氨酸，而且若需要，可提供谷氨酸脱羧酶(EC 4.1.1.15)或功能等效物以促进L-谷氨酸向4-氨基丁酯(二氧化碳作为副产物)的转化。L-谷氨酸氨脱羧酶的有效来源的非限制性实例包括产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)，魏氏梭菌(C.welchii)，或大肠杆菌。
用于驱动色氨酸反应动向(在生成莫纳甜方向)的这类途径的其它实例包括这样的反应，其中以草酰乙酸作为采用色氨酸的反应的共同底物且该草酰乙酸被转化成L-天冬氨酸，若需要，可提供天冬氨酸脱氢酶(EC 4.1.1.11)或功能等效物以促进L-天冬氨酸向β-丙氨酸(二氧化碳作为副产物)的转化。
然后是图8，所示途径图示了将与色氨酸反应相连的反应产物L-氨基酸转化成与MP反应相连的反应底物的其它方法。具体而言，在同一反应中采用α-KG和L-色氨酸，而α-KG形成L-谷氨酸，可提供具有L-丙氨酸氨基转移酶活性的酶和丙酮酸，而L-丙氨酸氨基转移酶促进丙酮酸和L-谷氨酸反应形成L-丙氨酸。为了促进L-丙氨酸向D-丙氨酸的转化还可提供丙氨酸消旋酶或功能类似物，其中D-丙氨酸可作为底物随MP一起生成莫纳甜和丙酮酸。参见实施例12。
在以上生物合成途径，和以下实施例描述的反应中所暗中描述的是含有生成莫纳甜(包括R，R莫纳甜)或莫纳甜前体(包括R莫纳甜前体)的生物合成途径所需的一种或多种化合物和/或酶的混合物。
对于体外的制备，本文所述的任意或所有的生物合成途径或本文所述途径中的单个步骤都可以在体外方案或体内，宿主细胞中，连续或平行进行操作。当本发明的方法是在体外进行一个或多个反应时，可以通过在水性反应介质或溶液中混合反应所需成分来实施在体外进行的生物合成反应。将如此形成的反应混合物维持足够的时间以合成所需的产物。
此外，通过在一种或多种酶的纯化中持续使用辅因子可增强一种或多种酶的活性。例如，在纯化球形芽孢杆菌D-丙氨酸氨基转移酶时，5’磷酸吡哆醛可实现活性的增强(实施例14)。
若本发明途径中的一个或多个反应将在体外进行，可任选地将本文所述生物合成途径中所采用的任意或所有酶固定在固体支持物上。该固定支持物的实例包括含有环氧基，醛基，螯合剂，或伯胺基的那些。适宜固定支持物的具体实例包括但不限于：
Figure A200680055015D0030125450QIETU
C(Rohm and Haas Company，Philadelphia，PA)树脂微球和
Figure A200680055015D0030125507QIETU
EC-EP(Resindion)。实施例21例示了球形芽孢杆菌D-丙氨酸氨基转移酶在
Figure A200680055015D0031125527QIETU
C树脂微球上的固定。实施例22例示了苜蓿中华根瘤菌Pro A醛缩酶在
Figure A200680055015D0031125541QIETU
C树脂微球上的固定。实施例23展示了应用了这些固定化酶的R，R莫纳甜的制备。
本文所述生物合成途径中所示的单个反应可由单个酶或同时作用的多种酶的混合物来促进(催化)。
本发明方法可用于制备含有所需百分比的R，R莫纳甜，或最小所需百分比的R，R莫纳甜的莫纳甜组合物。除上述反应步骤之外，特定反应步骤可由一种以上的酶来促进，例如，酶的混合物，以使最终的组合物或制备物含有所需百分比的R，R莫纳甜，例如，含有最小所需百分比的R，R莫纳甜，或最大所需百分比的R，R莫纳甜。可选地，通过组合本发明方法中两种独立工程途径制备莫纳甜，以生成含有所需百分比的R，R莫纳甜的组合物或制备物。
若采用指定酶分类中的酶作为实例时，可以预料的是具有至少约50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，82％，85％，87％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，和99％同源性的酶也可应用于该反应中。例如，与SEQ ID NO：22的醛缩酶具有至少约50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，82％，85％，87％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，和99％同源性的R特异性醛缩酶可用于上述任意途径中以产生R，R莫纳甜。
此外，若采用指定酶分类中的酶作为实例时，可以预料的是具有相同活性的所述酶的片段也可应用于该反应中。例如，具有醛缩酶功能的SEQ IDNO：22醛缩酶的片段可用于上述任意途径中以产生R，R莫纳甜。
采用本文公开的一种或多种多肽或生物合成途径生成的莫纳甜通常是R，R莫纳甜占生成莫纳甜总重量的至少约0.5-30％。在其它实施方式中，采用本文公开的一种或多种多肽或生物合成途径生成的莫纳甜是R，R莫纳甜大于生成莫纳甜总重量的30％；例如，R，R莫纳甜大于生成莫纳甜总重量的40％，50％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或99％。可选地，不同量的两种或多种莫纳甜制备物可被组合在一起以使制备物具有所需百分比的R，R莫纳甜。例如，含30％R，R莫纳甜的莫纳甜制备物可与含90％R，R莫纳甜的莫纳甜制备物组合在一起；若组合等量的30％R，R莫纳甜和90％R，R莫纳甜制备物，则所得的莫纳甜制备物将含60％R，R莫纳甜。
采用本文公开的一种或多种多肽或生物合成途径生成的莫纳甜或中间物(包括莫纳甜前体)可由反应成分纯化而得。在一个实施方式中，莫纳甜或中间物如莫纳甜前体可通过移除将从其被合成的酶制备中纯化出的物质来简单纯化。
在其它实施方式中，中间物，莫纳甜前体或莫纳甜是从其被合成的制备物纯化而来，以使所得“纯化的”组合物或制备物是莫纳甜占有机化合物总重的至少约5-60％。在另一实施方式中，莫纳甜或中间物如莫纳甜前体可被纯化至占有机化合物总重的至少约70％，80％，90％，95％或99％的纯度。
采用本文公开的一种或多种多肽或生物合成途径生成的莫纳甜或中间物(含有莫纳甜前体)可通过本领域普通技术人员公知的方法由反应成分纯化而得。在一个实施方式中，莫纳甜或中间物可按实施例13所述进行纯化。任选地，纯化的莫纳甜或中间物可进行重复结晶直至获得期望的纯度。
实施例
实施例1
莫纳甜，色氨酸，丙氨酸和谷氨酸的检测
该实施例描述了用于检测莫纳甜，色氨酸和谷氨酸存在的方法。它还描述了用于分离和检测莫纳甜的四种立体异构体的方法。
莫纳甜和色氨酸的LC/MS/MS多反应监测(＂MRM＂)分析
由体外或体内生物化学反应而来的莫纳甜和色氨酸混合物的分析是采用Waters/Micromass液相色谱-串联质谱(LC/MS/MS)设备，包括Waters 2795液相色谱，其具有顺序位于色谱和Micromass Quattro Ultima三级四级杆质谱仪之间的Waters 996光电二极管阵列(PDA)吸收监控器。LC分离是采用2.1mm×250mm的Xterra MS C8反相色谱柱在40℃完成的。LC流动相是由A)含0.05％(v/v)三氟乙酸的水和B)含0.05％(v/v)三氟乙酸的甲醇所组成的。
梯度洗脱是5％B至35％B线性洗脱0-4min，35％B至60％B线性洗脱4-6.5min，60％B至90％B线性洗脱6.5-7min，90％B等度洗脱7-11min，90％B至95％B线性洗脱11-12min，95％B至5％B线性洗脱12-13min，以及洗脱之间2min的再平衡期。流动速率为0.25mL/min，而PDA吸收是监测200nm-400nm。ESI-MS的所有参数是根据感兴趣分析物的质子化分子离子([M+H]+)的产生，和特征片段离子的产生来进行最优化和选择的。莫纳甜和色氨酸的LC/MS/MS多反应监测(MRM)分析采用以下设备参数：毛细管电压：3.5kV；锥孔电压：40V；Hex 1：20V；Aperture：0V；Hex 2：0V；源温度：100℃；脱溶剂温度：350℃；脱溶剂气流：500L/h；锥孔气流：50L/h；低质分辨率(Q1)：12.0；高质分辨率(Q1)：12.0；离子能量：0.2；入口：-5V；碰撞能量：8；出口：1V；低质分辨率(Q2)：15；高质分辨率(Q2)：15；离子能量(Q2)：3.5；增效器：650。五种莫纳甜特异性的亲代至子代MRM跃迁被用于在体外或体内反应中特异地检测莫纳甜。监测的跃迁是293.1至158.3，293.1至168.2，293.1至211.2，293.1至230.2，和293.1至257.2。以204.7至146.4的MRM跃迁监测色氨酸。为莫纳甜和色氨酸的内标定量，分析了含有四种不同比例的d5-色氨酸和d5莫纳甜分析物的四种标准物。对这些数据进行线性最小二乘分析形成了莫纳甜和色氨酸的标准曲线。每个样品都加入了固定量的d5-色氨酸和d5莫纳甜(d5莫纳甜是按照WO03/091396A2的方法由d5-色氨酸合成而得)，和相应比例(莫纳甜/d5莫纳甜；色氨酸/d5-色氨酸)与上述标准曲线联合使用以计算混合物中的每种分析物的量。
准确的莫纳甜质量测定
可采用Applied Biosystems-Perkin Elmer Q-Star串联四级杆/时间飞行时间质谱仪进行高分辨率MS分析。测得的质子化莫纳甜质量采用色氨酸作为内部质量校准标准。基于基本组合物C14H17N2O5，校准的质子化莫纳甜质量是293.1137。利用实施例2和3所述的生物催化方法生成的莫纳甜表现出293.1144的测量质量。这是小于百万分之二(ppm＂)的质量测量误差，提供酶促产生的莫纳甜基本组合物的结论性证据。
莫纳甜的手性LC/MS/MS(＂MRM＂)测量
在体外和体内反应中莫纳甜立体异构体分布的测定可通过1-氟-2，4-二硝基苯-5-L-丙氨酰胺(＂FDAA＂)进行衍生，之后通过反相LC/MS/MS MRM测定完成。
以FDAA衍生莫纳甜
向50μL的样品或标准品加入200μL的1％FDAA的丙酮溶液。加入40μL的1.0M碳酸氢钠，将混合物在40℃温育1h并不定时混合。取出样品并冷却，再以20μL的2.0M HCl中和(需要更多的HCl以实现缓冲生物性混合液的中和)。排气完成后，样品准备以LC/MS/MS进行分析。
用于测量体外和体内反应中莫纳甜立体异构体分布的LC/MS/MS多反应监测
采用上述的LC/MS/MS设备进行分析。能够分离所有四种莫纳甜立体异构体(具体是FDAA-莫纳甜)的LC分离是在Phenomenex Luna 2.0 x 250mm(3μm)C18反相色谱柱于40℃实施的。LC流动相是由A)含0.05％(质量/体积)醋酸胺的水和B)乙腈所组成的。洗脱是13％B等度洗脱0-2min，13％B至30％B线性洗脱2-15min，30％B至80％B线性洗脱15-16min，80％B等度洗脱16-21min，和80％B至13％B线性洗脱21-22min，在洗脱之间有8min的再平衡期。流动速率为0.23mL/min，而PDA吸收是监测200nm-400nm。ESI-MS的所有参数是根据FDAA-莫纳甜的质子化分子离子([M+H]+)的产生，和特征片段离子的产生来进行最优化和选择的。
阴性离子ESI/MS模式的莫纳甜的LC/MS分析采用以下设备参数：毛细管电压：2.0kV；锥孔电压：25V；Hex 1：10V；Aperture：0V；Hex 2：0V；源温度：100℃；脱溶剂温度：350℃；脱溶剂气流：500L/h；锥孔气流：50L/h；低质分辨率(Q1)：12.0；高质分辨率(Q1)：12.0；离子能量：0.2；入口：-5V；碰撞能量：20；出口：1V；低质分辨率(Q2)：12；高质分辨率(Q2)：12；离子能量(Q2)：3.0；增效器：650。三种FDAA-莫纳甜特异性的亲代至子代跃迁被用于在体外或体内反应中特异地检测FDAA-莫纳甜。跃迁是543.6至268.2，543.6至499.2，和543.6至525.2。FDAA-莫纳甜立体异构体的鉴别是基于与纯化的合成莫纳甜立体异构体相比的色谱滞留时间，和质谱数据。
包括谷氨酸和丙氨酸的氨基酸的液相色谱柱后荧光检测
用于测定体外和体内反应的谷氨酸的液相色谱及柱后荧光检测是在与Waters 474扫描荧光检测器，和Waters柱后反应模块联合的Waters 2690 LC系统或等效物上进行的。LC分离是在负载相互作用钠的离子交换柱于60℃进行的。流动相A是Pickering Na 328缓冲液(Pickering Laboratories，Inc.；Mountain View，CA)。流动相B是Pickering Na 740缓冲液。梯度洗脱是0％B至100％B线性洗脱0-20min，100％ B等度洗脱20-36min，和100％ B至0％B线性洗脱36-37min，在洗脱之间有至少8min的再平衡期，取决于样品基体。流动相的流速是0.5mL/min。OPA柱后衍生溶液的流速是0.5mL/min。荧光检测器设置为EX 338nm和Em 425nm。采用正亮氨酸作为分析的内标。氨基酸的鉴别是基于纯化的标准物的色谱滞留时间数据。
以LC/MS/MS检测L-和D-氨基酸
首先用蚁酸处理含有L-和D-氨基酸如来自于生物化学反应实验中的色氨酸，谷氨酸，和天冬氨酸的混合物的样品以变性蛋白。然后将样品离心并在LC/MS/MS分析之前通过0.45μm尼龙注射过滤器过滤。L-和D-氨基酸的鉴别是基于滞留时间和质量选择性检测。LC分离是采用Waters 2690液相色谱系统和柱温设定在45℃的ASTEC 2.1mm×250mm Chirobiotic TAG色谱柱完成的。LC流动相A和B分别是0.25％乙酸和甲醇中的0.25％乙酸。设定60％流动相A和40％ B以0.25ml/min的流速等度洗脱谷氨酸；而设定30％流动相A和70％ B以0.3ml/min的流速等度洗脱天冬氨酸和色氨酸。
用于分析L-和D-氨基酸的检测系统包括Waters 996光电二极管阵列(PDA)检测器和Micromass Quattro Ultima三级四级杆质谱仪。从195至350nm扫描的PDA顺序位于所述色谱系统和质谱仪之间。在阳性电喷雾电离模式(+ESI)下操作的Micromass Quattro Ultima三级四级杆质谱仪的参数设置如下：毛细管电压：3.0kV；锥孔电压：20V；Hex 1:15V；Aperture:1V；Hex 2:0V；源温度：100℃；脱溶剂温度：350℃；脱溶剂气流：530L/h；锥孔气流：30L/h；低质Q1分辨率：12.5；高质Q1分辨率：12.5；离子能量1:0.2；入口：-5；碰撞：8；出口1:10；低质Q2分辨率：12.5；高质Q2分辨率：12.5；离子能量2:0.5；增效器：650V。多反应监测(MRM)模式的MS/MS实验被设定为选择性地监测反应跃迁204.70至146.50，147.8至84.2，147.8至102.1，134.00至74.30，和134.00至88.2。色氨酸，谷氨酸，和天冬氨酸的定量分别是基于m/z＝146.5，m/z＝102.1，和m/z＝88.2的信号反应。
作为标准和用于试验的莫纳甜和莫纳甜前体(＂MP＂)的生成
莫纳甜的生成
按美国专利5,128,482所述合成生成R，R和S，S莫纳甜的消旋混合物。
通过衍生和水解步骤将R，R和S，S莫纳甜分离。简单而言，莫纳甜消旋混合物被酯化，以Cbz封闭游离的氨基，形成内酯，采用固定化的蛋白酶选择性地水解S，S内酯。还可按照Bassoli，A.et al，Eur.J.Org.Chem.，5：1652-1658，(2005)中所述的分离莫纳甜。
MP的生成
通过采用在0.1M磷酸钾缓冲液中的AT-103广谱D-氨基转移酶(BioCatalytics)进行R，R莫纳甜氨基转移以生成R-MP，并以丙酮酸作为氨基受体。通过采用在0.1M磷酸钾缓冲液中的AT-102广谱L-氨基转移酶(BioCatalytics)进行S，S莫纳甜氨基转移以生成S-MP，并以丙酮酸作为氨基受体。两个反应都在30℃和约pH8.0-8.3下进行约20小时。两种化合物都采用制备级HPLC和Rohm和Haas(Philadelphia，PA)疏水树脂(XADTM1600)以水洗脱进行纯化。含有大于90％纯度莫纳甜前体的样品被收集和冻干。
实施例2
由吲哚-3-丙酮酸生成莫纳甜
AT-103转氨酶是从BioCatalytics(Pasadena，CA)购买的转氨酶文库的一部分，该酶经检验用于与采用来自于睾丸酮丛毛单胞杆菌的ProA醛缩酶的反应相连的莫纳甜的生成。按WO 03/091396 A2所述制备醛缩酶。AT-103是来自于需要D-氨基酸(如D-谷氨酸，D-天冬氨酸，或D-丙氨酸)作为氨基酸供体的芽孢杆菌种的宽特异性D-转氨酶(EC 2.6.1.21)。将酶和其它成分/底物直接加入到试剂盒提供的反应缓冲液，其含有100mM磷酸钾缓冲液pH7.5，100mM氨基供体，和0.1mM 5’磷酸吡哆醛(＂PLP＂)。在1mL反应缓冲液中加入：4mg吲哚-3-丙酮酸，20mg丙酮酸，约50μg以细胞提取物提供的ProA，1μL 2M MgCl2，和2mg的氨基转移酶。反应平行进行。反应在30℃温和振荡(100rpm)下过夜温育。按实施例1所述的过滤样品并进行反相LC/MS/MS分析。结果表明采用AT-103酶生成了大约370μg/mL莫纳甜。在层析分离期间解决的两种立体异构体的峰面积联接的基础上，进一步分析结果测定S，R/R，S对R，R/S，S莫纳甜的比例。由AT-103生成的莫纳甜总量中，与混合的异构体相比，69％是R，R/S，S莫纳甜。该酶与WO 03/091396A2中所述的枯草芽孢杆菌DAT酶是同源的，已知后者对D-氨基酸具有宽特异性。采用实施例1所述的FDAA方法进行手性分析，其证实了如所预料的，D-氨基转移酶主要生成R，R莫纳甜，和一部分S，R莫纳甜。以S，S莫纳甜或R，R莫纳甜和α-酮戊二酸作为底物的进一步的跃迁实验证实了如所预料的BioCatalytics酶对在C4上的D-构型具有高度选择性。这些实验中，在S，S莫纳甜和α-酮戊二酸作为底物的反应中未检测到谷氨酸。
为降低在与AT-103(广谱D-转氨酶)和ProA醛缩酶相关反应中作为副产物生成的S，S莫纳甜或R，S莫纳甜的量，可采用组氨酸结合柱按照生产商的方案(Novagen，Madison，WI)纯化醛缩酶。纯化的酶优选应不含有细胞提取物中存在的野生型L-氨基转移酶活性(如天然的大肠杆菌AspC或TyrB活性)。采用PD-10柱(G25 Sephadex，Amersharn-Pharmacia)将组氨酸结合洗脱液脱盐以去除咪唑并以50mM Tris-Cl，pH7进行洗脱。实验以1mL体积平行进行，其中含有100mM Tris-Cl缓冲液，pH7.8，50μg ProA醛缩酶，4mg吲哚-3-丙酮酸，1或2mg D-氨基转移酶，200mM丙酮酸钠，2mM MgCl2，3mM磷酸钾，0.1mM PLP，和14.7mg of D-谷氨酸。将管在30℃温和振荡下进行温育。达到两小时的时间点立即在-20℃冷冻。在两小时用NaOH将pH从5调整至7-8，并将试验物温育过夜。按实施例1所述地过滤样品并分析莫纳甜。两小时样品不具有可检测量的莫纳甜，可能是由于低pH。使用1mg的D-氨基转移酶时过夜样品含有大约190ng/mL莫纳甜，约84％是R，R莫纳甜而16％是S，R莫纳甜。使用2mg的D-氨基转移酶时，生成540ng/mL莫纳甜，大约71％是R，R莫纳甜。
采用BioCatalytics氨基转移酶缓冲液进行类似实验，其含有100mM磷酸钾pH7.5，0.1mM PLP，和100mM D-谷氨酸。如上添加固体吲哚-3-丙酮酸和D-氨基转移酶。以原液添加ProA醛缩酶(50μg)，MgCl2，和50mM丙酮酸。同上处理试验物，且在此实验中不要求调整pH。以只提供酶和缓冲液而不含莫纳甜的BioCatalytics做阴性对照。实验结果如表1所示。
表1：在磷酸缓冲液中由吲哚-3-丙酮酸生成莫纳甜
 
Mg D-氨基转移酶 时间(小时) 莫纳甜总量(ng/mL) ％R，R
0 2 0 n/a
1 2 6780 未测定
2 2 13170 55％
0 16 0 n/a
1 16 15000 未测定
2 16 28930 51％
在磷酸缓冲液中莫纳甜的产量明显高于在Tris缓冲体系中莫纳甜的产量。
为比较来自于WO03/091396A2中的含BioCatalytics酶(AT-103)的克隆枯草芽孢杆菌DAT的活性，进行了其它实验。将枯草芽孢杆菌dat基因亚克隆到pET30a中以去除His-6标签。按WO03/091396A2所述在BL21(DE3)中产生不带标签和带标签的酶。按上文所述制备细胞提取物并进行总蛋白试验以估算蛋白浓度。进行平行的1mL反应，其含有500μg D-氨基转移酶，50μgProA醛缩酶，100mM磷酸钾pH7.5，3mM MgCl2，4mg吲哚-3-丙酮酸，200mM丙酮酸钠，7.35mg(50mM)D-谷氨酸，和0.1mM PLP。将样品在30℃温育1小时，2小时，和过夜，并过滤用于LC/MS/MS分析。采用实施例1所述FDAA衍生方案来测定，样品中仅含有莫纳甜的S，R和R，R立体异构体。结果如下表2所录。通过经反相色谱分离的峰面积来测定％RR。
表2：D-氨基转移酶的比较
 
酶 时间(小时) 莫纳甜(ppb) ％R，R莫纳甜
枯草芽孢杆菌DAT-HIS 1 512 未测定
枯草芽孢杆菌DAT不带标签 1 1056 未测定
BioCatalytics AT-103 1 2353 未测定
枯草芽孢杆菌DAT-HIS 2 894 80-90％
枯草芽孢杆菌DAT不带标签 2 1913 80％
BioCatalytics AT-103 2 6887 92.5％
枯草芽孢杆菌DAT-HIS 16 3014 31
枯草芽孢杆菌DAT不带标签 16 5612 33
BioCatalytics AT-103 16 16131 66
HIS-6标签的去除表现出具有改进的枯草芽孢杆菌D-氨基转移酶活性；但是，明显地BioCatalyticsD-氨基转移酶同源物具有最高的活性。还表现出对R-莫纳甜前体更高的底物偏好性。延长温育时间表现出降低了生成的R，R莫纳甜对映体过量。
由于芽孢杆菌D-氨基转移酶对以丙酮酸作为氨基受体和以D-丙氨酸作为氨基供体具有偏好性，可以预料的是采用D-丙氨酸作为MP至莫纳甜转化的氨基供体会具有相似或更好的结果。进行平行的1mL反应，其含有500μgD-氨基转移酶，50μg纯化的ProA醛缩酶，100mM磷酸钾pH7.5，3mMMgCl2，4mg吲哚-3-丙酮酸，100mM丙酮酸钠，25mM D-谷氨酸或D-丙氨酸，和0.1mM PLP。在分析前将样品温育2小时，并按如上处理。当以D-丙氨酸作为氨基供体，产生了略高于预期的莫纳甜水平(23对21ppm)。而且，可以预期的是高浓度的丙酮酸可抑制转氨步骤，因而一段时间内给予更小量的丙酮酸可改善莫纳甜生成的总体速率。从上述数据可观察到相对于上表在此实验中只使用一半的丙酮酸，并生成了明显更多的莫纳甜。尽管文献中报导ProA醛缩酶主要生成羟醛的S-对映体缩合产物，本研究中使用的ProA醛缩酶明显产生了高百分比的R-MP并在相关实验中生成高达92％的R，R莫纳甜。如实施例19所示，高百分比的R，R莫纳甜不是由于D-氨基转移酶选择性。
实施例3
由D-色氨酸生成R，R莫纳甜
在每1mL反应混合物中添加以下物质：大约60μg睾丸酮丛毛单胞杆菌ProA醛缩酶(如WO 03/091396 A2所述以细胞提取物供应)，4mM MgCl2，50mM D-色氨酸，0.5mg BioCatalytics D-氨基转移酶(AT-103)，100mM丙酮酸钠，100mM磷酸钾缓冲液pH7.5或100mM乙酸钠缓冲液pH8，0.05mMPLP，3mM磷酸钾(仅加入乙酸盐反应中)，和10mM α-酮戊二酸。平行进行实验，以不加醛缩酶的作为阴性对照。样品在30℃温和振荡下温育过夜(20小时)。乙酸钠样品的实际pH大约是5，而磷酸缓冲样品的最终pH大约是7。无一醛缩酶表现出在pH5具有明显活性；含ProA醛缩酶的样品略高于阴性对照但可能不大于实验误差。在磷酸钾中，ProA醛缩酶产生了73.4ppm莫纳甜，其中R，R:S，R比例为1.7:1(～63％R，R来自于D-色氨酸)。
由于芽孢杆菌D-氨基转移酶对以丙酮酸作为氨基受体和以D-丙氨酸作为氨基供体具有偏好性，可以预料的是由D-色氨酸生成R，R或S，S莫纳甜时没有必要添加α-酮戊二酸。采用纯化的ProA醛缩酶(50-60μg)和2.5小时的温育时间重复上述实验(在100mM磷酸钾缓冲液中)。平行进行用或不用α-酮戊二酸的实验。当加入10mMα-酮戊二酸时，采用D-色氨酸作为底物可形成56.1ppm莫纳甜(79.5％R，R，20.5％S，R)。当省略α-酮戊二酸时，可形成102.5ppm莫纳甜(79％R，R，21％S，R)。
对于来自苜蓿中华根瘤菌，睾丸酮丛毛单胞杆菌的HMG醛缩酶，和SEQID NO：22的醛缩酶的莫纳甜总产量和异构体分布的比较
从BioCatalytics(Pasadena，CA)购买AT-103转氨酶(宽特异性D-氨基转移酶)并按美国公开申请2005282260所述在以HMG醛缩酶由D-色氨酸和丙酮酸生成莫纳甜的相关反应中使用该酶或实施例18中生成的球形芽孢杆菌重组酶。
按美国公开20040063175和WO03091396A2所述制备和纯化来自睾丸酮丛毛单胞杆菌(ProA)和苜蓿中华根瘤菌的HMG醛缩酶。为生成SEQ IDNO：22醛缩酶的试验数量，50mL培养物在含氨苄青霉素(100μg/mL)的Luria-Bertani(＂LB＂)培养液中生长至约OD600为大约0.5。以200μg/L脱水四环素诱导含SEQ ID NO：21构建体的菌株。细胞在诱导后生长5小时，并根据生产商的方案(Novagen，Bugbuster reagent)制备细胞提取物。还加入苯并核酸酶和蛋白酶抑制剂。在BioRad Laboratories Experion自动化电泳台上分离细胞提取物中的可溶蛋白并采用1.1.98.0版本的Experion软件分析浓度和表达百分比。SEQ ID NO：22的醛缩酶以原酶(未纯化)用于以下反应中。
在每1mL反应混合物中加入以下物质：大约50μg醛缩酶，4mM MgCl2，50mM D-色氨酸，0.5mg纯化的球形芽孢杆菌D-氨基转移酶，200mM丙酮酸钠，100mM磷酸钾缓冲液pH7.5，和0.05mM PLP。平行进行实验，以不加醛缩酶的作为阴性对照。样品在30℃温和振荡下温育1小时和过夜(18小时)。由于镁和磷酸盐促进了非酶反应，在无醛缩酶的过夜反应中生成了小量的莫纳甜(<0.5ppm)。从以下显示的数据中减去这些值，显示平均结果。当采用这类方法生成莫纳甜时能检测到的立体异构体仅是R，R和S，R。R，R百分比如下所列，是由反相LC峰面积测定的。
表3：由D-色氨酸生成的总莫纳甜和％R，R
 
酶(时间点) 总莫纳甜(ppm) ％R，R莫纳甜
睾丸酮丛毛单胞杆菌ProA(1小时) 16.63 86.45
睾丸酮丛毛单胞杆菌ProA(18小时) 86.86 63.1
苜蓿中华根瘤菌HMG(1小时) 20.5 96.7
苜蓿中华根瘤菌HMG(18小时) 88.3 89.9
SEQ ID NO：22(1小时) 14.70 100
SEQ ID NO：22(18小时) 95.14 97.35
还采用实施例1所列的FDAA衍生方法分析SEQ ID NO：22醛缩酶的18小时样品在立体异构体上的分布，其产生的结果为94.9％ R，R和5.1％ S，R莫纳甜。与睾丸酮丛毛单胞杆菌和苜蓿中华根瘤菌HMG醛缩酶相比，SEQ IDNO：22醛缩酶对R-MP生成具有更高的对映体特异性。
采用L-色氨酸作为起始底物并将按美国公开申请2005282260所述地制备并纯化而得的HexAspC宽特异性L-氨基转移酶和醛缩酶联合，同时进行相同的实验。这些反应主要应生成S，S莫纳甜和R，S莫纳甜。反应还补充了10mM α-酮戊二酸作为L-色氨酸转氨中的氨基受体。此外，将以下平行结果平均化得到总莫纳甜(减去无醛缩酶存在的背景水平)，而S，S莫纳甜百分比是基于反相LC峰面积而显示的。在某些情况下，因为醛缩酶是相当R特异性的几乎不生成总莫纳甜，立体异构分布的反相估计更不准确，因为一些色氨酸峰尾可与S，S/R，R莫纳甜峰一起洗脱出来。与醛缩酶的R特异性相比该趋势仍有价值。在括号中显示了采用FDAA衍生方法进一步分析的结果，其更准确。在大约400ppm以上的总莫纳甜数高于用来定量结果的标准级的线性范围，只能定性结果。如美国公开申请2005282260所示，睾丸酮丛毛单胞杆菌ProA醛缩酶通常产生95-100％ S，S莫纳甜。
表4：由L-色氨酸生成的总莫纳甜和％ S，S
 
酶(时间点) 总莫纳甜(ppm) ％S，S莫纳甜
睾丸酮丛毛单胞杆菌ProA(1小时) 440.35 92.5
睾丸酮丛毛单胞杆菌ProA(18小时) 958.3 92.2
苜蓿中华根瘤菌HMG(1小时) 45.9 66.3
苜蓿中华根瘤菌HMG(18小时) 108.1 61.4
SEQ ID NO：22(1小时) 17.85 55.1(18.9)
SEQ ID NO：22(18小时) 135.5 27.3(19.1)
可以观察到SEQ ID NO：22醛缩酶的R特异性与基准ProA酶相比相当高。这种R特异性还反映在生成低的％ S，S莫纳甜，尽管在这些反应中HexAspC氨基转移酶对S-MP具有高度特异性。另外，根据所生成的S，S莫纳甜水平，苜蓿中华根瘤菌HMG醛缩酶的R特异性处于睾丸酮丛毛单胞杆菌ProA醛缩酶和SEQ ID NO：22醛缩酶之间。当将S，S莫纳甜产量与R，R莫纳甜产量比较时，总莫纳甜量不指示醛缩酶的活性。对于MP转氨反应，D-氨基转移酶比HexAspC更不活跃，尤其是在这些反应的MP浓度下。
为了进一步比较SEQ ID NO：22醛缩酶和来自睾丸酮丛毛单胞杆菌的ProA酶，在开始于D-氨基酸的反应中采用不同的D-氨基转移酶/醛缩酶比例(这些实验没有平行样品)。同上所述进行反应。反应中醛缩酶浓度保持恒定，使用大约50μg醛缩酶。反应中D-氨基转移酶的量保持恒定，使用大约0.5mg。对于2和10mg/mL浓度的D-氨基转移酶，使用冻干酶。对于2个最高的D-氨基转移酶浓度，平行进行。
表5：D-氨基转移酶浓度对于R，R莫纳甜生成的影响
 
醛缩酶 D-氨基转移酶浓度 时间 总莫纳甜(约ppm) ％R，R莫纳甜
SEQ ID NO：22 0.25mg/mL 1小时 2 100
SEQ ID NO：22 0.25mg/mL 过夜 141 97.1
SEQ ID NO：22 0.5mg/mL 1小时 8 100
SEQ ID NO：22 0.5mg/mL 过夜 273 96.5
SEQ ID NO：22 1mg/mL 1小时 34 100
SEQ ID NO：22 1mg/mL 过夜 638 96.5
SEQ ID NO：22 2mg/mL 1小时 979 100
SEQ ID NO：22 2mg/mL 过夜 1910 97.3
SEQ ID NO：22 10mg/mL 1小时 2930 99.1
SEQ ID NO：22 10mg/mL 过夜 2950 96.5
睾丸酮丛毛单胞杆菌ProA 0.25mg/mL 1小时 4 78.7
睾丸酮丛毛单胞杆菌ProA 0.25mg/mL 过夜 257 61.1
睾丸酮丛毛单胞杆菌ProA 0.5mg/mL 1小时 25 79.0
睾丸酮丛毛单胞杆菌ProA 0.5mg/mL 过夜 480 62.5
睾丸酮丛毛单胞杆菌ProA 1mg/mL 1小时 74 73.8
 
睾丸酮丛毛单胞杆菌ProA 1mg/mL 过夜 810 68.1
睾丸酮丛毛单胞杆菌ProA 2mg/mL 1小时 325 73.1
睾丸酮丛毛单胞杆菌ProA 2mg/mL 过夜 2220 71.9
睾丸酮丛毛单胞杆菌ProA 10mg/mL 1小时 2910 59.7
睾丸酮丛毛单胞杆菌ProA 10mg/mL 过夜 2450 67.5
若莫纳甜水平在400ppm以上，结果不在标准曲线的线性范围内，只是大约值。当适当稀释时，生成的R，R莫纳甜最大值大约是1100ppm。对以10mg/mLD-氨基转移酶进行SEQ ID NO：22醛缩酶的FDAA立体异构分析。在2小时，样品含有98.5％R，R莫纳甜。在17小时，样品含有95.9％R，R莫纳甜。即便在长时间温育后并使用大量氨基转移酶，SEQ ID NO：22醛缩酶也产生高百分比的R，R莫纳甜。若供应足够的D-氨基转移酶，SEQ IDNO：22醛缩酶产生与睾丸酮丛毛单胞杆菌ProA醛缩酶一样多的总莫纳甜，表现出相似的特异活性。
表6：醛缩酶浓度对于R，R莫纳甜生成的影响
 
醛缩酶 醛缩酶浓度 时间 总莫纳甜(约ppm) ％R，R莫纳甜
SEQ ID NO：22 25μg/mL 1小时 7.0 100
SEQ ID NO：22 25μg/mL 过夜 275 97.4
SEQ ID NO：22 50μg/mL 1小时 9.0 97.3
SEQ ID NO：22 50μg/mL 过夜 334 95.7
SEQ ID NO：22 100μg/mL 过夜 297 93.3
睾丸酮丛毛单胞杆菌ProA 25μg/mL 1小时 16 78.2
睾丸酮丛毛单胞杆菌ProA 25μg/mL 过夜 491 73.2
睾丸酮丛毛单胞杆菌ProA 50μg/mL 1小时 18 64.1
睾丸酮丛毛单胞杆菌ProA 50μg/mL 过夜 437 63.0
睾丸酮丛毛单胞杆菌ProA 100μg/mL 1小时 26 62.5
睾丸酮丛毛单胞杆菌ProA 100μg/mL 过夜 513 61.5
当醛缩酶浓度改变时，在总莫纳甜上没有太多增长。R，R莫纳甜百分比随时间也随醛缩酶浓度降低，尤其当D-氨基转移酶有限时。
为进一步测试试验醛缩酶的R特异性，将按美国公开申请2005282260所述地制备和纯化的L-色氨酸和HexAspC氨基转移酶一起开始进行实验。在转氨中相对于R-MP，HexAspC显示出对S-MP的强选择性，因而高于50％R，S莫纳甜的百分比指示了高立体特异性醛缩酶。提供10mM α-酮戊二酸作为氨基受体；但是在高浓度时，丙酮酸也被L-氨基转移酶所利用。在这些反应中，通常只生成在FDAA衍生方案检测限内的S，S和R，S莫纳甜。
表7：L-氨基转移酶浓度对于S，S莫纳甜生成的影响
 
醛缩酶 L-氨基转移酶浓度 时间 总莫纳甜(约ppm) ％S，S莫纳甜
SEQ ID NO：22 0.25mg/mL 1小时 13 33.8
SEQ ID NO：22 0.25mg/mL 过夜 127 34.2
SEQ ID NO：22 0.5mg/mL 1小时 31 30.9
SEQ ID NO：22 0.5mg/mL 过夜 272 26.8
SEQ ID NO：22 1mg/mL 1小时 34 20.3
SEQ ID NO：22 1mg/mL 过夜 385 23.5
睾丸酮丛毛单胞杆菌ProA 0.25mg/mL 1小时 523 94.2
睾丸酮丛毛单胞杆菌ProA 0.25mg/mL 过夜 1817 93.7
睾丸酮丛毛单胞杆菌ProA 0.5mg/mL 1小时 602 91.8
睾丸酮丛毛单胞杆菌ProA 0.5mg/mL 过夜 2122 89.9
睾丸酮丛毛单胞杆菌ProA 1mg/mL 1小时 873 90.2
睾丸酮丛毛单胞杆菌ProA 1mg/mL 过夜 1237 82.6
表8：醛缩酶浓度对于S，S莫纳甜生成的影响
 
醛缩酶 醛缩酶浓度 时间 总莫纳甜(约ppm) ％S，S莫纳甜
SEQ ID NO：22 25μg/mL 1小时 11 25.1
SEQ ID NO：22 25μg/mL 过夜 112 20.0
SEQ ID NO：22 50μg/mL 1小时 18 31.8
SEQ ID NO：22 50μg/mL 过夜 160 27.0
SEQ ID NO：22 100μg/mL 1小时 33 33.2
SEQ ID NO：22 100μg/mL 过夜 238 41.4
睾丸酮丛毛单胞杆菌ProA 25μg/mL 1小时 305 86.4
睾丸酮丛毛单胞杆菌ProA 25μg/mL 过夜 1094 87.5
睾丸酮丛毛单胞杆菌ProA 50μg/mL 1小时 575 90.9
睾丸酮丛毛单胞杆菌ProA 50μg/mL 过夜 1449 89.5
睾丸酮丛毛单胞杆菌ProA 100μg/mL 1小时 817 93.6
睾丸酮丛毛单胞杆菌ProA 100μg/mL 过夜 1360 89.7
对于高度R-特异性的醛缩酶，如SEQ ID NO：22，生成较少的总莫纳甜且增加醛缩酶的量会增加总莫纳甜(以及％ S，S)。这些醛缩酶产生较少的S-MP底物，是所用L-氨基转移酶的优选底物。对于R-特异性更弱的酶，如ProA，增加醛缩酶不会显著改善总莫纳甜产量或％S，S莫纳甜。增加所加入的L-氨基转移酶的量会降低所产生的S，S莫纳甜的百分比。
在两个缓冲体系：如上所述的100mM磷酸钾和100mM 3-(N-吗啉代)丙磺酸(＂MOPS＂)(含3mM磷酸钾)中，进一步研究了SEQ ID NO：22醛缩酶的活性和特异性。同上采用1mg/ml AT-103 D-氨基转移酶和50mM D-色氨酸进行实验。平行进行实验4.5小时。在磷酸钾中SEQ ID NO：22醛缩酶生成了116ppm莫纳甜和99.1％R，R莫纳甜(FDAA衍生方法)，在MOPS中SEQID NO：22醛缩酶生成了75.5ppm莫纳甜且96.2％是R，R莫纳甜。甚至与对照比，在MOPS中无SEQ ID NO：22醛缩酶时生成的莫纳甜背景水平明显更高，且MOPS中R，R百分比更低。可能是MOPS的存在影响了D-氨基转移酶的选择性和活性。
SEQ ID NO：21的亚克隆
SEQ ID NO：21的醛缩酶基因是来自于Diversa Corp。SEQ ID NO：21是Diversa Corp筛选的环境文库的一部分。但SEQ ID NO：21的醛缩酶基因可通过本领域普通技术人员已知的任何方法进行重新构建。例如，按实施例10，18和19所述，可采用组合PCR方法重构SEQ ID NO：21的醛缩酶基因。
以下引物可用于PCR扩增醛缩酶基因(SEQ ID NO：21)：5′-gaggagctcgagtcagacgtatttcagtcctttttc-3′(SEQ ID NO：23)和5′-agaagacatatgatttatcagccggggac-3′(SEQ ID NO：24)。用XhoI和NdeI消化获得的PCR产物，并在被设计进引物的位点上切开。将片段进行凝胶纯化(QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen，Velencia，CA))并与经XhoI和NdeI消化和凝胶纯化的pET28b连接。以化学方法将连接物转移到TOP10F′感受态细胞中。为插入物筛选平板上生长的菌落并将带有插入物的几个单菌落进行DNA序列分析(Agencourt，Beverly，MA)。
SEQ ID NO：22醛缩酶的纯化
证实的醛缩酶克隆被转化到BL21(DE3)或BL21(DE3)pLysS中。加入适宜抗生素的过夜生长的培养物被稀释到新鲜培养液中(通常1:100)并在37℃通风条件下生长至OD600～0.6。然后用异丙基硫代半乳糖苷(＂IPTG＂)诱导培养物并转换至30℃(通风)持续温育过夜。离心收集细胞。通常对细胞团进行冷冻解冻循环以帮助细胞裂解。在BugBuster和Benzoase(Novagen，Madison，WI)中裂解细胞团(按照生产商的方案)。离心去除细胞碎片。将原始的蛋白提取物应用到按照生产商方案制备好的组氨酸结合柱上。洗涤该柱并按照生产商的方案洗脱蛋白。用PD-10柱(GE Healthcare，Piscataway，NJ)将纯化的蛋白脱盐。用于交换的缓冲液是50mM磷酸钾pH7.5，100mM NaCl，4mM MgCl2。以Amicon离心浓缩器(Millipore，Billerica，MA)浓缩纯化的蛋白。
实施例4
(1)色氨酸消旋酶
以D-色氨酸作为起始物质，采用D-氨基转移酶和醛缩酶生成了R，R莫纳甜(实施例3)。尽管那样，由于几个因素L-色氨酸还是一种优选的起始物质。例如，L-色氨酸更便宜，比D-色氨酸更易于获得。本发明描述了获取活性色氨酸消旋酶的几种方法。通过采用R特异性醛缩酶，即优选地或选择性地生成R-MP的醛缩酶来改善R，R莫纳甜的产生。图1和2图示了采用色氨酸消旋酶，D-氨基转移酶和R特异性醛缩酶由L-色氨酸生成富含R，R莫纳甜立体异构体的方法。
通过构建需要活性消旋酶生长的菌株来选择色氨酸消旋酶。色氨酸营养缺陷型在基础培养基中生长需要L-色氨酸源。补充含D-色氨酸的培养基是选择能将D-色氨酸转化成L-色氨酸的消旋酶的一个途径。色氨酸营养缺陷型在补充D-色氨酸的基础培养基中生长。来自Coli Genetic Stock Center的菌株CAG18455和CAG18579和NRRL12264(lipA—，λDE3溶源化，并以其质粒固化)在补充D-色氨酸时不生长而在补充L-色氨酸时生长。大肠杆菌可作为宿主微生物但也可采用其它宿主微生物，如酵母，其它芽孢杆菌，或其它真核生物体。当经D-氨基转移酶转化时，色氨酸营养缺陷型(特别是NRRL12264(lipA-，λDE3溶源化并消除其质粒))能在D-色氨酸上生长。这证实了大肠杆菌将D-色氨酸转运入细胞的能力。
Salcher和Lingens公开了在致黄假单胞菌(ATCC15926)中存在色氨酸消旋酶。Salcher，O.，和Lingens，F.，J.Gen.Microbiol.121：465-471(1980)。还公开了在几种植物中存在色氨酸消旋酶包括，烟草，甜菜，番茄，和小麦，而该酶表现出在渗透压或干旱条件被诱导。色氨酸消旋酶可在黄麦爵(Sclerochiton ilicifolius)的天然莫纳甜生成途径中发挥作用。为分离消旋酶活性，由ATCC15926(或另一具有消旋酶活性的生物体)构建表达文库且将该文库转化到色氨酸营养缺陷型中。选择以D-色氨酸作为色氨酸源时能生长的菌株。相似的方法还被用于筛选含已知消旋酶的许多菌株以寻找对D-色氨酸具有活性的消旋酶。对D-色氨酸具有活性的消旋酶实例包括丙氨酸消旋酶，丝氨酸消旋酶，和谷氨酸消旋酶。Yoshimura T.，和Esaki，N.，＂AminoAcid Racemases：Functions and Mechanisms，＂Journal of Bioscience andBioengineering 96，103-109，(2003).
丙氨酸消旋酶是依赖PLP的已由鼠伤寒沙门氏菌(dadB基因)克隆而得。丙氨酸消旋酶的其它来源是大肠杆菌，枯草芽孢杆菌，铜绿假单胞菌，霍乱弧菌，栗酒裂殖酵母和蜡状芽孢杆菌。担子菌蘑菇，香菇也含有宽活性的丙氨酸消旋酶。
丝氨酸消旋酶是依赖PLP的，在真核生物(例如：家蚕，大鼠脑，小鼠脑cDNA)以及芽孢杆菌(鹑鸡肠球菌)中被发现。
谷氨酸消旋酶是不依赖PLP的并已由戊糖片球菌，短小芽孢杆菌，发酵乳杆菌，短乳杆菌，大肠杆菌，嗜火产液菌，和枯草芽孢杆菌克隆而得。某些谷氨酸消旋酶是非常特异的，因而，即使结构类似的氨基酸天冬氨酸，天冬酰胺，和谷氨酰胺都不可作为该酶的底物。
天冬氨酸消旋酶也是存在的并且是不依赖PLP的。天冬氨酸消旋酶在乳杆菌，链球菌菌株中，和某些古细菌如脱硫球菌和嗜热球菌菌株中被发现。双壳类软体魁蚶也含有天冬氨酸消旋酶。
在文献中发现的其它消旋酶包括来自鱼腥藻和条纹假单胞菌的氨基酸消旋酶(EC 5.1.1.10)，脯氨酸消旋酶，和多功能苯基丙氨酸消旋酶。还正在检验相关的异构酶或消旋酶。检验有效的消旋酶以确保它们不是D-色氨酸氨基转移酶。通过序列分析和/或酶试验完成有效消旋酶的筛选。用于选择色氨酸消旋酶的筛选方法还可用于已公开含有色氨酸消旋酶的其它芽孢杆菌或古芽孢杆菌，以及已经构建可以表达的真核cDNA文库。
按实施例8所述，在对莫纳甜活性上筛选通过色氨酸消旋酶检验的酶。理想的是，获得的酶对色氨酸非常特异并对莫纳甜几乎没有或没有消旋酶活性。
色氨酸消旋酶也可由现存的消旋酶，转氨酶，或异构酶发展和/或改进而得(经由诱变或重组改造)。此外，因为丙氨酸氨基转移酶(和其它氨基转移酶)的晶体结构是已知的，它们可以作为理性的基于结构的诱变的基础。上述过程可用于色氨酸消旋酶活性的初步选择和改进活性的筛选。
(2)色氨酸消旋酶文库
文库的构建
吡菌素伯克霍尔德氏菌(ATCC15958)和绿针假单胞菌(ATCC15926)是从美国典型培养物保藏中心获取的。按ATCC所推荐培养它们并按Mekalanos，J.J.，＂Duplication and amplification of toxin genes in Vibrio cholerae，＂Cell35：253-263，(1983)中所述的方法制备基因组DNA。以Sau3AI限制性内切酶部分消化基因组DNA。采用Qiagen QIAquick凝胶提取试剂盒(Valencia，CA)凝胶纯化1-3Kbp片段。纯化的DNA被连接到经BamHI消化并按如上纯化的pTrc99a中(Amersham，Piscataway，NJ)。以3:1的插入物/载体摩尔比将连接物在室温下过夜温育。用化学方法将连接文库转化入TOP10F′感受态细胞(Invitrogen，Carlsbad，CA)并涂布在含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基上。将转化的平板温育过夜后，将菌落从平板上挑下，用液体LB培养基洗涤并采用Qiagen QIAquick小量制备试剂盒(Valencia，CA)小量制备适宜大小的细胞团。大约30000个菌落被聚集并小量制备。
聚集的质粒被转化入CAG18455(trpC83::Tn10，rph-1)或CAG18579(trpC::Tn10kan，rph-1)。两个菌株都是色氨酸缺陷型，因此它们在M9基础培养基(Difco)上不会生成，除非培养基中补充了色氨酸。该转化体被涂布在补充了色氨酸的M9基础培养基上。这可选择能将D-色氨酸转化成L-色氨酸的菌株。
文库转化之前，检验菌株在含L-或D-色氨酸的基础培养基上的生长。检验菌株在补充了D-色氨酸的基础培养基上的生长并观察到其不生长。两种菌株在以L-色氨酸代替D-色氨酸的基础培养基上都能生长。此外，以D-特异性氨基转移酶由枯草芽孢杆菌(WO 03/091396)转化得到NRRL12264的衍生物(所用菌株已消除了色氨酸操纵子质粒，以λDE3溶源化，删除lipA，除其它染色体的编码突变外(serB，ΔtrpED，tnaA2，aroP))。NRRL12264菌株不能在补充D-色氨酸的基础培养基上生长，但能在以L-色氨酸代替D-色氨酸的相同基础培养基上生长。由T7启动子启动D-氨基转移酶的表达。转化的菌株能在补充D-色氨酸的M9基础培养基上生长。
筛选在D-色氨酸培养基上生长的菌落。分离质粒并重新转化到亲代菌株(CAG18455或CAG18579)中以证实在D-色氨酸培养基上的生长是依赖于质粒而不是宿主的突变。分析与色氨酸缺陷型互补的质粒核酸序列。并进一步分析确定含有色氨酸消旋酶的克隆。
以相似方式从其它组织来源分离色氨酸消旋酶。有文献报导在烟草组织培养细胞(Nicotiana tabacum L.var.Wisconsin 38)(Miura，G.A.，和Mills，S.E.，＂The conversion of D-tryptophan to L-tryptophan in cell cultures of tobacco，＂Plant Physiol.47：483-487，(1974))和小麦(Triticum aestivum)原蛋白提取物(Rekoslavskaya，N.I.，等，＂Synthesis and physiological function of D-tryptophanduring wheat germination，＂Russian J.Plant Physiol.44：196-203，(1997))中都有色氨酸消旋酶活性。如文献中所述，制备了组织的cDNA表达文库，而该表达文库被用于按以上所述转化色氨酸缺陷型。
可以预期的是若使用相同的菌株并按文献所述复制相同的生长条件，具有色氨酸消旋酶活性的酶能被分离或mRNA可被分离且能制得cDNA表达文库，其含有具备色氨酸消旋酶活性的酶的编码序列。例如，可能要求特定生长阶段或特定培养基成分以诱导具有色氨酸消旋酶活性的酶的细胞生成。
(3)色氨酸消旋酶试验
将被鉴别为可能含有色氨酸消旋酶的克隆转化到通常用于重组蛋白表达的大肠杆菌菌株中，如BL21。细胞在LB肉汤中生长至600nm光学浓度为0.4-0.6。以IPTG(0.1mM终浓度)诱导启动子驱动消旋酶的表达。诱导之后，细胞可以在37℃下表达蛋白1-3小时(通风)。收集细胞并通过法兰西压榨，超声波处理，或以化学手段(如BugBuster(Novagen))裂解。离心裂解的细胞以去除细胞碎片。澄清的提取液直接用于试验。
在溶液中加入不同量的提取液以使终浓度是50mM磷酸钾(pH7.0)和2mM L-色氨酸。加入5’磷酸吡哆醛至终浓度为10μM。温育样品然后进行LC/MS分析。当仅采用L-色氨酸作为底物时出现D-色氨酸峰则表明是阳性结果。D-色氨酸浓度应该随时间延长而增加直至达到平衡，而速率也应随着蛋白浓度增加直至酶浓度高到不再被底物饱和。同上D-色氨酸还可被转化成L-色氨酸。
互补基因可编码D-氨基转移酶。该转氨反应需要α-酮酸如α-酮戊二酸，草酰乙酸，或丙酮酸作为氨基受体。这些化合物可能存在于细胞提取物中，通常以较小的量。可采用PD-10脱盐柱去除这些化合物且仍可用原提取物进行试验。同样地，互补基因还可编码D-氨基酸氧化酶或D-氨基酸脱氢酶。这些酶还要求辅因子和共底物，它们可通过PD-10脱盐柱去除。可采用传统的柱层析纯化色氨酸消旋酶活性。最后，被鉴别为有效色氨酸消旋酶的开放读码框被克隆到带亲合标签的表达载体中。然后通过亲和层析纯化有效的色氨酸消旋酶。在任一情况中基本按以上所述在酶试验中使用被纯化的蛋白。
(4)色氨酸消旋酶的反向基因工程改造
通过常规的蛋白纯化技术，包括硫酸铵分级和常规柱层析，可从植物或微生物源中纯化色氨酸消旋酶。一旦纯化蛋白使其可在双向凝胶中分离，即可采用多肽微测序技术或常规Edman型氨基酸测序(在因特网上，该类技术通常使用的方案和设备的说明，可参见＂golgi.harvard.edu/microchem/＂)。在某些情况下，生物体的基因组序列不能作为用于蛋白纯化的蛋白源，因为这类序列还未被测定。对于这种情况，可根据从最接近的已知相关蛋白源获得的序列设计第一套简并引物。然后按照已建立的方案进行简并PCR和基因组步行，以分离色氨酸消旋酶的编码序列。
(5)从嗜热脂肪土芽孢杆菌中克隆丙氨酸消旋酶
从嗜热脂肪土芽孢杆菌中克隆了丙氨酸消旋酶(SEQ ID NO：41)。嗜热脂肪土芽孢杆菌(ATCC12980D)的基因组DNA是从ATCC(Manassas，VA)购买的。以下引物被用于扩增来自嗜热脂肪土芽孢杆菌的丙氨酸消旋酶：5′-atggacgagtttcaccgcga-3′(SEQ ID NO：25)和5′-ttatgcatcgcttcatccgc-3′(SEQ IDNO：26)。并利用Zero Blunt TOPO PCR克隆试剂盒(Invitrogen，Carlsbad，CA)将PCR产物与pCR-Blunt-TOPO连接。通过测序证实正确的克隆子(Agencourt，Beverly，MA)。并以正确的克隆作为后续PCR反应的模板。
以下引物被用于扩增所述丙氨酸消旋酶：5′-ataataggatcctcatccgcggccaacggcg-3′(SEQ ID NO：27)和5′-gggaaaggtaccgaggaataataaatggacgagtttcaccgcg-3′(SEQ ID NO：28)。以限制性内切酶KpnI和BamHI消化PCR产物。这类酶在被设计进引物的位点上切割。将消化的PCR产物进行凝胶纯化并与经KpnI和BamHI消化和凝胶纯化的pTrc99a连接。以化学方法将连接物转化到TOP10F′感受态细胞中并涂布在补充了50μg/ml卡那霉素的LB平板上。为插入物筛选分离物并通过序列分析(Agencourt，Beverly，MA)证实带有插入物的几个分离物具有正确序列(SEQ ID NO：40)。
采用Stratagene(La Jolla，CA)快变多位点定向诱变试剂盒对pTrc99a/丙氨酸消旋酶构建体进行位点诱向突变(＂SDM＂)。诱变引物如下：
5′-gccggacgacacgcacattnnkgcggtcgtgaaggcgaacgcc-3′(SEQ ID NO：29)，5′-gtgaaggcgaacgcctatggannkggggatgtgcaggtggcaagg-3′(SEQ ID NO：30)，5′-cctcccgcctggcggttgccnnkttggatgaggcgctcgctttaa-3′(SEQ ID NO：31)，5′-caaccaggcgaaaaggtgagcnnkggtgcgacgtacactgcgcag-3′(SEQ ID NO：32)，5′-gatcgggacgattccgatcggcnnkgcggacggctggctccgccg-3′(SEQ ID NO：33)，5′-gccatttggaaacgatcaacnnkgaagtgccttgcacgatcag-3′(SEQ ID NO：34)(n＝任意核苷酸而k＝g或t)。
通过分析现有的嗜热脂肪土芽孢杆菌的丙氨酸消旋酶晶体结构选择用于诱变的残基。选择来自活性位点的在5
Figure A200680055015D0053133309QIETU
和10
Figure A200680055015D0053133309QIETU
之间的大氨基酸残基。
在SDM反应中按照生产商的方案使用了所有六对引物。根据生产商的方案SDM反应被转化进XL-10 Gold。转化反应被涂布在补充了100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基上。在平板中添加LB肉汤并从平板上挑取菌落。让重悬细胞在37℃生长几个小时并采用QIAquick小量制备试剂盒小量制备质粒。制得的诱变文库被用于转化色氨酸营养缺陷型CAG18455。转化被涂布在补充了葡萄糖，痕量元素，维生素，100μg/ml氨苄青霉素，100μM IPTG和3mM D-色氨酸的M9基础培养基上。在37℃温育几天之后，长出了菌落。将这些菌落在LB(100μg/ml氨苄青霉素)上划线。从这些分离物中分离质粒并重新转化进CAG18455。再转化细胞被涂布到含100μg/ml氨苄青霉素的LB上。形成单菌落后，如上所述将这些菌落在M9 D-色氨酸培养基上划线。看起来所有菌落都再生长，这表明了生长是由于消旋酶的诱变形式。可以观察到对照细胞不生长。
几个单菌落被用于体外活性试验。细胞生长至OD600大约为0.6再以100μM IPTG诱导。将细胞在37℃下再温育2小时并通过离心收集。细胞团被储存于-80℃直至后一天的使用。将细胞团在冰中解冻。以BugBuster(不含伯胺)细胞裂解试剂和Benzoase(Novagen)裂解细胞。通过离心移除细胞碎片(～10,000xg，30分钟，4℃)。将上清液作为原细胞提取物保留。
试验缓冲液含有50mM磷酸钾(pH8.0)，10μM磷酸吡哆醛，0.01％β-巯基乙醇，和50mM D-或L-色氨酸。每mL试验液中加入200μL提取物。将样品冷冻表示0时间点，以及30分钟和过夜时间点的时间。将样品旋转，过滤，并转移到SRC进行分析。
表9：始于L-色氨酸的试验结果
 
时间(分钟) L-色氨酸(ppm) D-色氨酸(ppm)
0 1240 3.6
30 1193 24.5
过夜 1192 583.2
表10：始于D-色氨酸的试验结果
 
时间(分钟) L-色氨酸(ppm) D-色氨酸(ppm)
0 0.5 7506
30 0.5 7519
过夜 14.9 7463
确定了这个分离物中的消旋酶基因的DNA序列(SEQ ID NO：42)并发现该分离物具有三种突变。在相应的蛋白分离物中的突变如下：M35C，F66E，和Y354A(SEQ ID NO：43)。在这个突变体中还发现了另一个突变。这是一种自发突变，并非位点定向诱变的部分。
将突变的消旋酶克隆到用于表达和纯化的pET30中。下列引物被用于来自pTrc99a构建体中的消旋酶基因的PCR扩增：5′-gggaaaggtaccgaggaataataaatggacgagtttcaccgcg-3(SEQ ID NO：35)和5′-gcggcgccatggacgagtttcaccgcg-3′(SEQ ID NO：36)。以NcoI和BamHI消化PCR产物，凝胶纯化，并与经NcoI和BamHI消化然后凝胶纯化的pET30连接。以化学方法将连接物转化到TOP10感受态细胞中(Invitrogen，Carlsbad，CA)。为插入物筛选转化的分离物。将带有插入物的质粒进行测序(Agencourt，Beverly，MA)。带有正确序列的分离物被转化到用于表达和纯化的BL21λDE3或BL21 λDE3 pLysS。该新构建体被命名为pET30Trp消旋酶。
(6)色氨酸消旋酶的纯化
在含有适宜抗生素(50μg/ml卡那霉素和20μg/ml氯霉素)的新鲜LB培养液中亚培养含有pET30Trp消旋酶构建体的过夜培养物并生长至OD600～0.6(37℃通风)。以100μM IPTG诱导表达并继续在37℃通风温育2小时。离心收集细胞并储存于-80℃直至使用。将细胞团在冰中解冻并以不含伯胺的BugBuster细胞裂解试剂和Benzoase核酸酶(Novagen，Madison，WI)裂解细胞。通过离心移除细胞碎片而将上清液作为原蛋白提取物使用。采用0.45μm注射过滤器过滤原蛋白提取物并将其用于已根据生产商说明预平衡好的组氨酸结合柱(Novagen，Madison，WI)中。洗涤柱并按照生产商方案洗脱蛋白。以50mM磷酸钾pH8.0，10μM5’磷酸吡哆醛(＂PLP＂)作为洗脱液用PD-10柱(GE Healthcare，Piscataway，NJ)将纯化的蛋白脱盐。利用Amicon离心浓缩器(Millipore，Billerica，MA)将脱盐蛋白浓缩。按上述方法纯化野生型丙氨酸消旋酶。
(7)色氨酸消旋酶的试验
在几个试验中检验经纯化的消旋酶。在一个试验中，采用由D-氨基酸氧化酶生成过氧化氢作为一个检测体系。经由按该实施例所述而分离的消旋酶由L-色氨酸生成氧化酶的D-色氨酸底物。试验物包括：每个试验0，1，10，25，50，100，200μg酶，50mM磷酸钾pH8.0，10μM PLP，50mM L-色氨酸。试验物在37℃温育1小时。温育后，在反应混合物中加入100mg/mlD-氨基酸氧化酶(AOD-101 BioCatalytics，Pasadena，CA)和0.5mM FAD。利用Amplex Red试剂盒(Molecular Probes，Eugene，OR)和Perkin Elmer HTS7000 Plus BioAssay阅读荧光仪(Wellesley，MA)测定生成的过氧化氢。试验数据总结在以下的表11和12。
表11：标准曲线
 
H2O2浓度(μM) 荧光仪读数
0 485
1 8691
2 16958
3 24719
4 31692
5 38083
表12：试验结果
 
蛋白浓度(μg/试验) 野生型消旋酶(荧光仪读数) 突变(Trp)消旋酶(荧光仪读数)
0 5226 5192
1 4272 6215
10 4149 10543
25 4239 21177
50 3141 30465
100 3160 39068
200 2370 35163
试验结果表明突变消旋酶是生成过氧化氢所必须的。当加入的突变消旋酶量增加时产生的过氧化氢量也增加。
分析了消旋酶(野生型和突变型)对丙氨酸的活性。反应缓冲液含有：100mM磷酸钾pH8.0，10μM PLP，50mM L-丙氨酸，12μg/mL野生型消旋酶或94μg/ml突变消旋酶。用1体积0.5M蚁酸终止反应并采用实施例1所述的Chirobitic柱以LC/MS/MS进行分析。
试验数据总结在下表13中：
表13：
 
时间(分钟) 野生型消旋酶(ppm产生的D-丙氨酸) 突变(Trp)消旋酶(ppm产生的D-丙氨酸)
0 65 87
5 334 2430
10 1161 3257
20 1670 4003
30 3075 4621
40 3177 4931
60 3986 5328
突变消旋酶表现出保留了对原始底物丙氨酸的活性。
以L-色氨酸，D-色氨酸，L-丙氨酸，D-丙氨酸的一种作为底物检测突变消旋酶的活性。反应缓冲液含有：100mM磷酸钾pH8.0，10μM PLP，50mM底物，94μg/ml突变消旋酶。用1体积0.5M蚁酸终止反应并按实施例1所述进行分析。以丙氨酸作为底物的试样在室温下(22℃)温育而以色氨酸作为底物的试样则在37℃温育。结果总结在下表14。
表14：
 
时间(分钟) 由L-Trp生成的D-Trp ppm 由D-Trp生成的L-Trp ppm 由L-ala生成的D-ala ppm 由D-ala生成的L-ala ppm
0 未检出 0.8 420.5 565.9
5 未检出 1 1268 1874
10 未检出 1.4 1448 1968
20 未检出 2.2 1590 1505
30 0.3 2.8 1840 1923
40 3.1 2.8 1779 1960
60 9 3.7 1295 1070
1080 57.4 66.7 1611 2932
消旋酶在双向上起作用并保留了野生活性。
用几种底物检验了突变消旋酶。按以上所述纯化用于试验的酶。试验条件如下：50mM磷酸钾pH8.0，10μM PLP，25mM底物，40μg/ml突变消旋酶。用1体积2M蚁酸终止反应并按实施例1所述进行分析。试样在37℃下温育。结果(由L-异构体生成的D-异构体ppm)总结在下表15中(nd＝未检出)：
表15：
 
时间(分钟) Lys Ala Glu Met Tyr Leu Trp Phe
0 12 156 86 104 nd nd nd nd
3 2310 2180 607 1200 nd 37 nd nd
5 2450 1310 1110 1290 nd 80 nd 14
10 6630 2850 1950 2260 11 139 nd 14
20 9550 1970 4660 2090 30 280 nd 47
30 15500 2090 4860 1750 63 320 nd 22
60 10200 2540 4490 2150 136 710 nd 54
120 18000 2430 6340 1940 224 1050 nd 188
240 13200 1830 6560 1990 515 1170 15 490
可能这种消旋酶能消旋除在此检验之外的其它氨基酸。
尽管突变消旋酶对多种氨基酸表现出活性，但对莫纳甜未表现出任何消旋活性。按以上所述纯化用于试验的酶。试验条件如下：100mM磷酸钾pH8.0，10μM PLP，50mM莫纳甜，1mg/ml突变消旋酶。试样在37℃下温育。通过如实施例1所述的FDAA衍生分析试样。试验结果如下表16所示：
表16：
 
时间(小时) S，S莫纳甜起始底物 R，R莫纳甜起始底物
0 100％SS 100％RR
1 100％SS 100％RR
18 100％SS 100％RR
甚至使用突变消旋酶18小时后，也未出现S，S莫纳甜向S，R莫纳甜或R，R莫纳甜向R，S莫纳甜的转化。
理想的酶具有对色氨酸的活性，而对其它氨基酸或氨基酸样化合物，尤其是莫纳甜，几乎没有或没有活性。若酶具有对莫纳甜的显著活性，可诱变酶以降低其对莫纳甜和/或谷氨酸的活性，而保持色氨酸活性不变或在足够高的水平以用于产生莫纳甜。可用于诱变的技术包括但不限于：易错PCR，定位突变，建模以识别原位突变靶点(参与底物结合的位点)，通过诱变菌株(passage through mutagenic strains)，和DNA混编。
(8)色氨酸消旋酶莫纳甜生成
在每1mL反应混合物中添加以下物质：大约50μg SEQ ID NO：22的醛缩酶，16mg/mL纯化色氨酸消旋酶，4mM MgCl2，50mM L-色氨酸，0.5mgD-氨基转移酶(由实施例14所述的球形芽孢杆菌纯化而来)，100mM丙酮酸钠，100mM磷酸钾缓冲液pH7.5，和0.05mM PLP。由于丙酮酸是宽特异性D-氨基转移酶的可接受氨基受体，不使用α-酮戊二酸。对照中以D-色氨酸作为起始底物而不含有消旋酶。样品在30℃温和振荡下温育2小时或过夜。按实施例1所述分析样品。试验结果如下表17所示(nd＝未检出)
表17：
 
时间(小时) 起始底物 总莫纳甜ppm RR/SS％RPLC RS/SR％RPLC ％RRFDAA ％SRFDAA
2 L-trp nd 0 0
18 L-trp 7.4 100 0 96.5 3.5
2 D-trp 12 99.17 0.83
18 D-trp 170 98.65 1.35 97.5 2.5
表17显示了利用色氨酸消旋酶将L-色氨酸底物转化成D-色氨酸而生成的R，R莫纳甜。未使用色氨酸消旋酶由D-色氨酸生成的R，R莫纳甜作为对照。所产生的R，R莫纳甜百分比几乎与以L-或D-色氨酸作为起始物质时相同。这结果表明消旋酶在促进R，R莫纳甜消旋中不具有可检测的活性。
(9)关键氨基酸变化的分离
制备了诱变丙氨酸消旋酶的几种回复体。利用上述的快变多位点定向诱变试剂盒(Stratagene，La Jolla，CA)通过定位诱变制备回复体，采用下列引物：
5′-gccatttggaaacgatcaactatgaagtgccttgcacgatcag-3′(SEQ ID NO：37)，5′-ctcccgcctggcggttgccttcttggatgaggcgctcgctttaag-3′(SEQ ID NO：38)，5′-gccggacgacacgcacattatggcggtcgtgaaggcgaacgcc-3′(SEQ ID NO：39)
单个或组合使用引物，尝试制备在位点35，66和354(根据源于ATCC12980的氨基酸序列编号)上三种突变的六种可能组合。制备了突变的几种组合并检验了色氨酸消旋酶活性。试验条件如下：50mM磷酸钾pH8.0，10μM PLP，30mM L-色氨酸，100μg/ml酶。试验在37℃下温育特定时间。按实施例1所述分析样品。
试验结果总结在下表18中(nd＝未检出)。
表18
 
时间(分钟) MF1 MF2 MY1 突变消旋酶
0 nd nd nd nd
5 nd nd nd nd
10 nd nd nd nd
20 nd nd nd nd
30 nd nd nd nd
40 nd nd nd nd
60 9.8 nd nd 12.5
1080 54.8 90.8 nd 92.4
突变列表：
MF1：N41S(自发突变)，P197L，Y354A
MF2：F66E，P197L，Y354A
MY1：M35C，F66E，P197L
诱变的消旋酶：M35C，F66E，P197L，Y354A
结果表明Y354A突变是对色氨酸的活性所必需的。若缺乏该突变则没有可检测的对色氨酸的活性。
通过任意方法如诱变PCR，通过诱变菌株，或其它本领域公知技术，丙氨酸消旋酶可被进一步转化成更宽特异性消旋酶。更受关注的丙氨酸消旋酶的进行可集中于活性位点残基，包括Lys129，Met134，以及包括和在Gly283和Trp288之间的残基(嗜热脂肪土芽孢杆菌中的编号)。
实施例5
用于筛选重组大肠杆菌中丙酮酸醛缩酶的选择方法
在实施例4(5)，9和10(3)所述的和图1-9所示的许多步骤将以优选由吲哚-3-丙酮酸和丙酮酸生成R-MP的醛缩酶最佳地进行。因此，方法被描述以分离和检验含有编码优选生成R-MP的醛缩酶的核酸的克隆。之前已描述了在以核糖作为碳源的M9基础培养基上生长时需要补充丙酮酸的大肠杆菌菌株。Ponce，E.，等，＂Cloning of the two pyruvate kinase isoenzymes structuralgenes from Escherichia coli.：The relative roles of these enzymes in pyruvatebiosynthesis，＂J.Bacterial 177：5119-5722，(1995)。该菌株的相应基因型为：
Figure A200680055015D0061134454QIETU
。通过Datsenko和Wanner，Proceed.Natl.Acad.Sd.USA97：6640-6645，(2000)中的方法生成了双敲除型。这些菌株可形成生成丙酮酸的醛缩酶的筛选基础以筛选对莫纳甜的特定立体异构体，莫纳甜前体的特定立体异构体，或莫纳甜或莫纳甜前体的类似物更为活跃的醛缩酶。莫纳甜前体的类似物包括已被鉴定为ProA醛缩酶或KHG醛缩酶底物的化合物，例如4-羟基-4-甲基-2-酮戊二酸，4-羧基-4-羟基-2-酮己二酸，4-羟基-4-甲基-2-酮己二酸，或在醛醇缩合反应中被转化成丙酮酸的其它富含羧基化合物。可采用的莫纳甜类似物的实例是4-羟基-4-甲基谷氨酸，通过试验细胞中的天然氨基转移酶其易被转氨成4-羟基-4-甲基-2-酮戊二酸(ProA的底物)。
克隆
下列引物可用于生成pykA敲除型：
5′-ATGTCCAGAAGGCTTCGCAGAACAAAAATCGTTACCACGTTAGGTGTA GGCTGGAGCTGCTTC-3′(SEQ ID NO：3)和
5′-CTCTACCGTTAAAATACGCGTGGTATTAGTAGAACCCACGGTACCATA TGAATATCCTCCTTAG-3′(SEQ ID NO：4)。
下列引物可用于生成pykF敲除型：
5′-AGGACGTGAACAGATGCGGTGTTAGTAGTGCCGCTCGGTACCAGCATA TGAATATCCTCCTTAG-3′(SEQ ID NO：5)和
5′-ATGAAAAAGACCAAAATTGTTTGCACCATCGGACCGAAAACCGGTGTA GGCTGGAGCTGCTTC-3′(SEQ ID NO：6)。
采用标准方案以pKD3或pKD4作为模板进行PCR反应。PCR产物被电穿孔表达λ红色同源重组体系的大肠杆菌菌株中。PCR产物与pykA或pykF具有同源性并被重组到染色体上的这些位点。当出现双交叉时，所得的子代携带了删除pykA或pykF的基因和抗生素抗性标记。通过标准P1转导技术将具有抗生素抗性标记的删除基因转导入大肠杆菌菌株(MG1655)。
菌株分析
检测了双敲除型在补充了Balch′s维生素溶液，Balch′s改进的痕量元素溶液(Balch，W.E.，等，＂Methanogens：revaluation of a unique biological group，＂Microbiol.Rev.43：260-296，(1979))，和0.4％ D-核糖的基础培养基(M9盐)(Difco)上的生长。未观察到双突变型的生长，除非培养基中还含有5mM丙酮酸。而野生型MG1655在含有和缺乏丙酮酸的上述培养基上都能生长。检测了双敲除型在补充了0.4％葡萄糖而不是核糖的上述基础培养基上的生长。在该培养基上的生长类似于野生型菌株所观察到的。在这个培养基中，经ptsI基因产物(可由磷酸烯醇丙酮酸制成丙酮酸并将磷酸转移至葡萄糖的磷酸转移酶系统的酶)可由葡萄糖生成丙酮酸。还检测了双敲除菌株在上述的补充了0.4％L-阿拉伯糖或0.4％D-木糖而不是核糖的基础培养基上的生长。生长的这些含5-碳(非PTS)底物没有生成丙酮酸。双敲除型在这些条件下未生长，除非补充5mM丙酮酸，而野生型菌株在含有和缺乏丙酮酸下都能正常生长。
利用pBAD-TOPO TA表达试剂盒(Invitrogen)将WO 03/091396 A2实施例2中所述的来自睾丸酮丛毛单胞杆菌的proA醛缩酶基因(在pET30 Xa/LIC中克隆的)和WO 03/091396 A2实施例3中所述的aspC/proA基因操纵子(在pET30 Xa/LIC和pET32中克隆的)亚克隆到pBAD-TOPO中。
通过可诱导的araBAD启动子调控基因在这些构建体中的表达。存在阿拉伯糖(例如4％)和IPTG时，表达基因。除非补充丙酮酸或丙酮酸源，否则菌株在基础培养基上不生长。可在培养基中补充莫纳甜，莫纳甜前体，或莫纳甜或莫纳甜前体的类似物。文献中所用底物的典型范围是0.5-5mM。例如，ProA醛缩酶可将莫纳甜前体转化成丙酮酸和吲哚-3-丙酮酸，为菌株提供丙酮酸源并使其能在含0.4％阿拉伯糖的基础培养基上生长。表达proA和aspC基因的构建体可将莫纳甜转化为莫纳甜前体并将莫纳甜前体转化为丙酮酸和吲哚-3-丙酮酸。此外，氨基转移酶可将吲哚-3-丙酮酸转化成L-色氨酸并与色氨酸营养缺陷型互补。这个体系被用于筛选醛缩酶并筛选对莫纳甜的特定立体异构体，莫纳甜前体的特定立体异构体，或莫纳甜或莫纳甜前体的类似物更为活跃的醛缩酶。例如，如果对WO 03/091396 A2实施例2中公开的任意醛缩酶实施定向发展，利用含R或S莫纳甜前体的培养基的平板试验被用于比较制得的突变酶的对映体特异性。如果在含R莫纳甜前体的平板上生长而在含S莫纳甜前体的平板上几乎不或不生长，则该醛缩酶对在反应位点为R手性的底物具有特异性。
制备了含1×Balch′s维生素溶液和Balch′s改进的痕量元素溶液的M9基础培养基平板。Balch，W.E.，等，＂Methanogens：reevaluation of a uniquebiological group.＂Microbiol.Rev.43：260-296，(1979)。含有葡萄糖或阿拉伯糖作为碳源(0.4％w/v)并在平板中补充了溶解在20mM磷酸钾缓冲液(pH8.0)的5mM莫纳甜(R，R；S，S消旋混合物)或等体积的不含莫纳甜的磷酸钾缓冲液。生长情况总结在下表20中：
表20：
 
葡萄糖 葡萄糖莫纳甜 阿拉伯糖 阿拉伯糖莫纳甜
MG1655 ++++ ++++ ++++ ++++
MG1655ΔpykA ΔpykF ++++ ++++ + ++
MG1655        ΔpykAΔpykF+aspCproA/pBAD-topO ++++ ++++ + ++
可以预期的是通过控制ProA和AspC水平，增加莫纳甜的吸收，以莫纳甜前体替换莫纳甜(在这种情况下不需要氨基转移酶)，或使用莫纳甜的较不疏水的类似物，例如上述的那些，可优化筛选。增加莫纳甜吸收的方法包括添加氨基酸混合物，添加特定氨基酸，和使用清洁剂，抗生素，抗生素类似物，或有助于渗透细胞壁的酶，和添加少量丙酮酸以使其生长以防醛缩酶不能提供足以支持生长的丙酮酸。多粘菌素B九肽(Dixon和Chopra，Antimicrobial Agents and Chemotherapy 2P：781-788(1986))和微囊藻素RR(Dixon，等，FEMS Microbiology Letters 230：167-170(2004))已被公开可作为渗透大肠杆菌外膜的制剂。
可以预期的是将其它启动子体系/质粒用于这个筛选系统会具有等效的结果。实例包括T7启动子体系，和IPTG可诱导启动子例如tac和lac。
aspC和proA被克隆到pTrc99a表达载体中(Amersham，Piscataway，NJ)。得到的载体被转化到色氨酸营养缺陷型CAG18455或CAG185799(参见实施例4的菌株说明)。转化体被涂布到含0.1mM IPTG和5mM莫纳甜的M9基础培养基。37℃3天后，含操纵子质粒的菌株形成了菌落，而亲代菌株看起来不生长。此外，生长依赖于IPTG的存在，这表明操纵子的表达是生长所必需的。在该互补性研究中，aspC/proA操纵子将莫纳甜形成MP再将MP形成吲哚-3-丙酮酸。然后吲哚-3-丙酮酸被转化成L-色氨酸，使色氨酸营养缺陷型在M9基础培养基上生长。
几种有效的生物可能含有R特异性醛缩酶并可按上述检测。在谷氨酸棒状杆菌的培养悬浮物中检测到R，R莫纳甜的存在。这表明了存在可以形成R莫纳甜前体的酶。此外，利用反相色谱在苜蓿中华根瘤菌的无细胞提取物中检测到多种莫纳甜异构体的存在，再次表明可能存在可以形成莫纳甜前体的R立体异构体的醛缩酶或氨基转移酶。
通过以proA(睾丸酮丛毛单胞杆菌)作为模板的BLAST分析发现稻草假单胞菌(Pseudomonas straminea)(黄褐假单胞菌(Pseudomonasochraceae)NGJI)，苜蓿中华根瘤菌，鞘氨醇单胞菌LB126，节杆菌(Arthrobacter keyseri)12B，鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)CO92株，慢生大豆根瘤菌USDA 110株，少动鞘氨醇单胞菌(假单胞菌)(Sphingomonas(Pseudomonas)paucimobilis)，鼠疫耶尔森菌(Yersiniapestis)KIM，耐重金属青枯菌(Ralstonia metallidurans)CH34，假结核耶尔森菌(Yersinia pseudotuberculosis)IP32953，豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarumbiovar viciae)rhiz23g02-plk_1009_341(Sanger Institute)，新鞘氨醇杆菌(Novosphingobium aromaticivorans)DSM12444，恶臭假单胞菌KT2440，趋磁磁螺菌(Magnetospirillum magnetotacticum)MS-1，沼泽红假单胞菌(Phodopseudomonas palustris)CGA009，野油菜黄单胞菌(Xanthomonascampestris)ATCC-33913，鞭毛地毯黄单胞菌(Xanthomonas axonopodiscitri)306，和阿弗曼链霉菌(Streptomyces avermitilis)MA-4680具有同源性。参见美国申请20050282260。这些生物体用作为DNA源并在上述筛选中检测。
能在没食子酸，丁香酸，原儿茶酸，邻苯二甲酸，对羟基苯甲酸，和芴中生长的生物体可能含有能形成莫纳甜的醛缩酶并具有用于上述筛选的可能。下列生物体经4，5-双加氧酶途径代谢原儿茶酸并具有有效的醛缩酶：支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica)RB50，副百日咳博德特杆菌(Bordetella parapertussis)12822，肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)MGH78578，趋磁磁螺菌MS-1，沼泽红假单胞菌CGA009，鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas aromaticivorans)F199，鞭毛地毯黄单胞菌306，野油菜黄单胞菌ATCC-33913。
而下列生物体经3，4-双加氧酶途径降解原儿茶酸并具有有效的醛缩酶：乙酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)ADP1，不动杆菌ATCC 33305，ADP1，根癌农杆菌C58，棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)AvOP，慢生大豆根瘤菌USDA 110株，慢生大豆根瘤菌USDA 438株，流产布鲁氏菌，羊种布鲁氏菌(Brucella melitensis)16M，羊种猪种布鲁氏菌(Brucella melitensissuis)1330，洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)J2315，真菌伯克霍尔德菌(Burkholderia fungorum)LB400，类鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderiapseudomallei)K96243，棒状杆菌(Corynebacteriumefficiens)YS-314，谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC-13032，百脉根中慢生根瘤菌(Mesorhizobium loti)MAFF303099，鸟分枝杆菌副结核亚种(Mycobacteriumavium subsp.)k10株，铜绿假单胞菌PAO1，荧光假单胞菌Pf0-1，荧光假单胞菌SBW25，恶臭假单胞菌KT2440，丁香假单胞菌番茄致病变种DC3000株(Pseudomonas syringae pv.tomato str.DC3000)，茄科罗尔斯通氏菌(Ralstonia solanacearum)，红球菌I24(IG-15)株，苜蓿中华根瘤菌1021，阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)MA-4680，天蓝链霉菌(Streptomycescoelicolor)A3(2)，鞭毛地毯黄单胞菌306，野油菜黄单胞菌ATCC-33913。
实施例6
HEXAspC的位点定向诱变
发现大肠杆菌AspC的六突变体(hexamutant)(HEXaspC)相对于AspC在S，S莫纳甜的生成上具有更好的活性，如WO03/091396A2实施例6所述。HEX(登录号:/AHFA gi：127190)包括以下来自AspC的突变体(大肠杆菌编号)：V35L，K37Y，T43I，N64L，T104S，和N285S。根据结构分析和文献报导(Rothman，S.，和Kirsch，J.，J.MoI.Biol.327：593-608，(2003)；Rothman，S.，等，Protein Science 13：763-772，(2004))，创建了多于5种的突变体，其被认为能增加向在莫纳甜生成途径中所用的底物的动力学活性：L-色氨酸，S-MP，或两者。其中两种突变体增加了色氨酸和S，S莫纳甜的转氨速率。其中两种突变体对S，S莫纳甜的形成表现出增强的立体选择性而一种是较小的立体选择性。根据这些，可以预期具有类似突变体的来自芽孢杆菌的宽特异性D-氨基转移酶可用作图3所示的R，R莫纳甜途径中的D-氨基转移酶，如实施例4(4)所述。其中一种突变体(HEXaspCP9T/R122G)对L-色氨酸转氨作用具有增强活性，但在S，S莫纳甜生成或S，S莫纳甜转氨作用中的活性明显下降。因而，可以预期这种酶在图1，2，4，5，6，7，和8中所示的R，R莫纳甜生成的第一步中，如实施例9和10(3)所述。通常，对L-色氨酸具有与AspC类似活性，对R-MP和S-MP具有限制活性的氨基转移酶可用于图1，2，4，5，6，7，和8所描述的过程中。
方法和材料
由J.F.Kirsch教授(Department of Molecular and Cell Biology，Universityof California，Berkeley，Berkeley，CA 94720-3206)提供了在pUC19中克隆的HEX基因并将其作为模板将所述基因克隆进pET23a的模板。参见Onuffer，J.J.，和Kirsch，J.F.，＂Redesign of the substrate specificity of Escherichiacoli aspartate aminotransferase to that of Escherichia coli tyrosineaminotransferase by homology modeling and site-directed mutagenesis，＂ProteinScience 4：1150-1151(1995)。还参见NCBI登录号1AHF_AGI：127190(HEX氨基酸序列)。为将HEX基因克隆进pET23a载体(Novagen，Madison，WI)设计了以下引物：
HEXaspC引物：
N端：5′-GCGGAACATATGTTTGAGAACATTACCGCC-3′(SEQ IDNO：7)；
C端：5′-ATAACCGGATCCTTACAGCACTGCCACAATCG-3′(SEQ IDNO：8)
采用以下PCR方案进行基因扩增：在100μL反应中，加入50ng DNA模板，1.0μM每种引物，0.2mM每种dNTP，1U Pfu Turbo聚合酶(Stratagene；LaJolla，CA)，和1X克隆Pfu缓冲液。热循环器的程序采用94℃热启动5分钟，随后25个循环的94℃变性步骤(30s)，55℃的退火步骤(1分钟)，72℃的延长步骤(2分钟)，最后在72℃终止步骤(7分钟)。以BamHI和NdeI(NewEngland Biolabs)限制性内切酶消化经纯化的PCR产物。利用Roche快速DNA连接试剂盒，将PCR产物连接到也经BamH1和NdeI消化的pET23a上。利用Bio-Rad基因脉冲发生器II系统按照生产商的方案将脱盐的连接物电穿孔到大肠杆菌DH10B细胞中。利用Qiagen Spin小量制备试剂盒制备小量制备DNA并将其作为诱变反应的模板。按照生产商的方案(Novagen)将质粒转化到E coli BL21(DE3)细胞中。
根据蛋白建模观察，在130位的色氨酸残基被认为对于与吡哆醛环堆积作用是重要的，而且表现为是S莫纳甜前体(“S-MP”)底物的空间位阻来源。因此，具有更小疏水侧链的氨基酸(苯丙氨酸)被用于替代色氨酸。突变的静止是基于文献的动力学数据，不过创建了期望突变的新组合。对HEXaspC的所有突变，除了W130F，都是采用Stratagene快变试剂盒按照生产商的说明所进行的。W130F突变是采用Stratagene快变试剂盒按照生产商的说明只除了将PCR反应的延伸温度降至66℃所进行的。除W130F单突变引物之外，用于多变试剂盒的引物都是利用在<www.stratagene.com>上的快变多试剂盒引物设计工具设计的。
引物序列如下表21所列：
表21：
 
引物 序列(5′-3′)
AspCW130F_反向 CGCTCTTATGGTTCGGTTTGCTTGGGTTGCTCACCC(SEQ ID NO：9)
AspCW130F_正向 GGGTGAGCAACCCAAGCTTTCCGAACCATAAGAGCG(SEQ ID NO：10)
R122G-1a CAAAAAATACCAGCGTTAAGGGAGTGTGGGTGAGCAACC(SEQ ID NO：11)
P9T_4a CATTACCGCCGCTACTGCCGACCCGATTC(SEQ ID NO：12)
I68V-1a CACCAAAAATTACCTCGGCGTAGACGGCATCCCTGAATT(SEQ ID NO：13)
T156Aa TGATGCGGAAAATCACGCTCTTGACTTCGATGCAC(SEQ ID NO：14)
a表示引物经5′磷酸化修饰。
HEXaspC突变基因的表达和酶活性的分析
将来自以下菌株的新鲜平板或冷冻甘油储藏物接种到Novagen过夜表达TM自诱导体系2(目录号#71366-3；溶液1-6)的液态培养物(5mL)中：
大肠杆菌BL21(DE3)::HEXaspCpET23a
大肠杆菌BL21(DE3)::HEXaspCW130FpET23a
大肠杆菌BL21(DE3)::HEXaspCT156ApET23a
大肠杆菌BL21(DE3)::HEXaspCP9T/T156ApET23a
大肠杆菌BL21(DE3)::HEXaspCP9T/R122GρET23a
大肠杆菌BL21(DE3)::HEXaspCR122G/T156ApET23a
培养物在37℃230rpm下温育6-8小时。测定每种培养物的OD600并计算获得25mL OD600为0.03-0.05所需要的培养物体积。将计算体积的每种液态培养物转移到含25mL相同培养基的烧瓶中。过夜表达TM自诱导体系2是一个完善的化学定义培养基，其用于以乳糖作为诱导剂的IPTG诱导表达系统的高水平表达，并且不需要监测细胞生长。过夜表达培养物在30℃230rmp振荡下温育18小时。通过离心收集细胞并用冷50mM MOPS，pH7.0洗涤一次。然后采用含1μL/mL benzonase核酸酶(Novagen目录号#70746-3)，5μL/mL蛋白酶抑制剂调配液II(Novagen目录号#539132)和0.33μL/10mL r-裂解酶(Novagen目录号#71110-3)的BugbusterTM(不含伯胺)提取试剂(Novagen目录号#70923-3)按照Novagen推荐方案裂解细胞。25℃温和振荡温育15分钟后，4℃下21000g离心15分钟将每种悬浮液中的细胞碎片聚团。小心地将上清液移出作为无细胞提取物分析。通过在30％ BugbusterTM(不含伯胺)提取试剂悬浮细胞碎片部分，21,000xg离心10分钟，在10％ BugbusterTM(不含伯胺)提取试剂悬浮离心得到的细胞团，再次离心以分离洗涤后的细胞团，来分离包含体部分。
通过在4-15％梯度凝胶(Bio-Rad # 161-1104)的SDS-PAGE对无细胞提取物和包含体部分进行蛋白表达分析。对于细胞提取物样品，20微克的可溶蛋白点样到每个凝胶泳道(和1X蛋白上样缓冲液预混并在95℃加热5分钟)。以1X蛋白上样缓冲液(0.2mL)溶解包含体部分，在95℃加热10分钟，并将5μL每种溶液点样到每条泳道中。采用Labworks BioImaging 1D-凝胶工具(UVP，Inc.Upland，CA)通过条带亮度分析计算每种HEX突变体相对于上样到每条泳道中的可溶蛋白总量的量，结果如下表22：
表22
 
样品 HEXaspC蛋白/总的可溶蛋白
大肠杆菌BL21(DE3)::HEXaspCP9T/T156ApET23aCFE 0.310
大肠杆菌BL21(DE3)::HEXaspCP9T/R122ApET23aCFE 0.145
大肠杆菌BL21(DE3)::HEXaspCpET23a CFE 0.172
大肠杆菌BL21(DE3)::HEXaspCR122A/T156ApET23aCFE 0.174
大肠杆菌BL21(DE3)::HEXaspCW130FpET23a CFE 0.114
大肠杆菌BL21(DE3)::HEXaspCT156ApET23a CFE 0.120
凝胶分析显示HEXaspCR122A/T156A突变体是唯一的被发现实际质量与包含体一样的蛋白。The HEXaspCP9T/T156A蛋白具有最高的表达水平，比HEXaspC蛋白好大约90％。相反，W130F，T156A和P9T/R122G表达的浓度低于HEXaspC。
利用以下反应条件测定用于生成S，S莫纳甜的HEXaspC突变蛋白的活性：每1mL反应中含有50mM TAPS，pH8.2，4mM MgCl2，3mM磷酸钠，pH8.0，200mM丙酮酸钠(pH调整至8)，5mM α-酮戊二酸(pH调整至8)，50mM色氨酸，0.05mM3-磷酸吡哆醛，50μg/mL ProA醛缩酶(以无细胞提取物加入)和不同浓度的(约50和500μg/mL)氨基转移酶(以无细胞提取物加入)。脱气水被用于制备储液并将反应混合物体积调整至1.0mL。在加酶之前加入磷酸吡哆醛。将反应管在30℃温和振荡下温育4小时。加酶之后在1，2，和4小时抽取样品(0.01mL)，过滤，并以LC/MS/MS分析，如实施例1所述。根据反应中存在的氨基转移酶的量标准化莫纳甜的产量。
在这些试验条件下，HEXaspC和HEXaspCT156A每mg氨基转移酶生成了最多的总莫纳甜，而P9T/R122G蛋白生成了最少，之后是HEXaspCW130F。HEXaspCW130F和P9T/R122G酶对S-MP表现出最高的立体选择性(大于98％S，S莫纳甜)，即使在使用高酶浓度时(大于300μg/mL)。在含有高浓度的P9T/T156A酶的酶促反应中S，S莫纳甜产物的百分比降至小于90％。其它突变体表现出的产物立体选择性与原始HEXaspC突变体十分类似(约95％ S，S莫纳甜)。按实施例1所述采用FDAA衍生试剂分析含有HEXaspC酶的反应的产物，发现形成的第二立体异构体是R，S莫纳甜。
色氨酸和莫纳甜氨基转移酶活性的分析试验
以L-色氨酸和S，S莫纳甜作底物检测了突变体的转氨活性。按实施例1所述以带OPA柱后衍生的HPLC，根据之后的反应共产物谷氨酸的生成测定了氨基转移酶活性。在1.0mL反应混合物中含有100mM HEPPS缓冲液，pH8.0，20mM α-酮戊二酸，0.08mM磷酸吡哆醛，25mM色氨酸或S，S莫纳甜，和酶(以2.5mg的细胞提取蛋白提供)。除酶之外将所有成分混合在一起。加酶以启动反应并将反应溶液在30℃(温和振荡)温育90分钟。反应平行进行，以不加酶的作为阴性对照。通过加入10％蚁酸(终浓度)终止反应，以21000rpm离心混合物，并小心移出上清液过滤。根据谷氨酸的背景水平和加入酸以沉淀蛋白的稀释来修正数据，然后通过加入的突变氨基转移酶量进行标准化。以色氨酸作为底物时，HEXaspC每mg氨基转移酶每小时产生13.0mM谷氨酸。突变体的相对活性如下，以百分比表示：HEXaspCWBOF(156％)，HEXaspCT156A(151％)，HEXaspCP9T/T156A(63.7％)，HEXaspCP9T/R122G(116％)，和HEXaspCR122G/T156A(107％)。以S，S莫纳甜作为底物时，HEXaspC每mg氨基转移酶每小时产生7.43mM谷氨酸。突变体的相对活性如下，以百分比表示：HEXaspCW130F(113％)，HEXaspCT156A(87.7％)，HEXaspCP9T/T156A(67.3％)，HEXaspCP9T/R122G(11.2％)，和HEXaspCR122G/T156A(114％)。
HEXaspCP9T/R122G突变体对色氨酸向吲哚-3-丙酮酸的转化具有增强活性，但对S，S莫纳甜转氨的活性降低。色氨酸与莫纳甜活性的比例是18.2，与之相比HEXaspC是1.75，使其成为利用需要L-氨基转移酶如实施例9和10(2)所述的那些的途径生成R，R莫纳甜的理想候选酶。可见，HEXaspCP9T/R122G是对S，S莫纳甜以及MP具有限制活性的氨基转移酶的实例。
大部分突变改进了L-色氨酸活性，只有两种突变增强了对L-色氨酸和S，S莫纳甜两者的活性(HEXaspCW130F和HEXaspCR122G/T156A)。由于在这些试验中使用了25mM底物，酶极可能被饱和，而活性是酶kcat的反映。但是，在如上所述的实施生成S，S莫纳甜试验的条件下，S-MP的浓度不可能足以饱和酶，因而S，S莫纳甜的生成没有总体上升，由于kcat的增加被Km的增加所抵消。据报道，对于类似底物，某些突变使kcat增加，还增加了对氨基酸底物的表观Km。如果利用增加底物浓度，可以预期的是相对于HEXaspC，这两种突变体会在S，S莫纳甜的产率上具有优势。在上述的生成S，S莫纳甜的条件下，HEXaspCT156A突变表现出具有增强的色氨酸转氨速率但对MP转氨速率没有显著影响。
通过对HEXaspC和其中一种芽孢杆菌D-氨基转移酶(参见例如Sugio，S，等，Biochemistry 34：9661-9669，(1995))结构的比较，AspC的W130F，R122G，T156A，和HEX突变可与D-氨基转移酶结构上相应的残基对应。可以预期的是在宽特异性D-氨基转移酶上的类似突变会改进R，R莫纳甜的整体产量，如实施例3所述。例如，在AspC上由色氨酸130提供的官能性在芽孢杆菌D-氨基转移酶上通过丝氨酸179-181与谷氨酸166(YM-1编号规则)的侧链之间的氢键所替代。为减少空间位阻，谷氨酸可被突变成天冬氨酸残基。某些D-氨基转移酶在179位具有苏氨酸残基，其将增加空间位阻，应被避免。球形芽孢杆菌酶在181位上以丙氨酸替代了丝氨酸，其也可减小空间位阻。
天冬氨酸氨基转移酶研究的其它信息也可被应用于D-氨基转移酶。AspC酶在活性位点上具有精氨酸，其可与二羧酸酯底物的侧链相互作用，D-氨基转移酶具有Ser240-Ser243的环。Ser240，Thr242，和Ser243的侧链面向相同方向并与Ser180的羟基形成口袋，为非极性和极性底物提供了可相互作用的表面。Ser180参与PLP结合；但是，为改进D-氨基转移酶对R-MP的活性，可修饰Ser240，Thr242，或Ser243残基以接受更大的底物或亲合负电荷底物。例如，Thr242可被突变成Ser以减小侧链长度。其中一个残基可被突变赖氨酸或精氨酸，例如Ser243。Val30-Val36残基(YM-I编号)位于β链上穿过了D-氨基转移酶的活性位点，对于活性也是很重要的。Tyr31，Val33，Glu32，和Lys35被认为是面向活性位点。Tyr31，Glu32，和Val33在所有的芽孢杆菌同源体中是不变的。Ro，等，FEBS Lett 398：141-145，(1996))将Val33诱变成Ala并发现其略微地增强对α-酮戊二酸转氨反应的促进效率而明显地改进了对较大体积底物(更小空间位阻)的促进效率。在某些同源物中Lys35被Arg所取代，但若考虑空间位阻是，则优选Lys残基。对于保守替代例如异亮氨酸而言还优选缬氨酸34和36，也是由于对大分子如MP更小的空间位阻。由于实施例15和16所述的新型D-氨基转移酶(＂4978＂)比实施例19所述的球形芽孢杆菌酶和杂合DAT具有更高的活性，因此明显地成为进一步诱变反应的选择。基于对YM-1D-氨基转移酶的晶体结构分析，上述观点可被应用于来自ATCC株4978的D-氨基转移酶。上述氨基酸的编号比在4978蛋白序列上的相应氨基酸小1个氨基酸。
实施例7
在莫纳甜的生成中使用支链氨基转移酶(＂BCAT＂)
AT-102和AT-104是从BioCatalytics(Pasadena，CA)购买的支链L-氨基转移酶(EC 2.6.1.42)。利用化学方法制备的S，S和R，R莫纳甜底物检测了酶的转氨活性。反应在0.5mL的总体积内进行，并平行进行。试验含有50mMTris pH7.8，0.08mM PLP，10mM α-酮戊二酸(＂α-KG＂)，5mM莫纳甜，和1mg/mL氨基转移酶。阴性对照不含有外源氨基转移酶。样品在30℃100rpm振荡下温育2小时。过滤样品进行LC/MS/MS分析，如实施例1所述，进行至特定的谷氨酸水平。谷氨酸水平应与MP产量在化学计量上是相关。以R，R作为反应底物时，阴性对照中存在很低水平的谷氨酸。AT-104比阴性对照生成了稍多的谷氨酸，这表明对R，R莫纳甜(D氨基酸)活性水平低。两种支链L-氨基转移酶对S，S莫纳甜都表现出活性。AT-102生成了102μg/mL谷氨酸而AT-104生成64μg/mL谷氨酸。作为比较，在这些条件下宽特异性氨基转移酶(AT-101，也来自BioCatalytics)生成了75μg/mL。支链氨基转移酶具有的高活性是有些预料不到的，因为莫纳甜与通常作为宽特异性或天冬氨酸氨基转移酶的底物的二羧酸氨基酸和芳族氨基酸具有更高的结构类似性。但是，由于莫纳甜的谷氨酸骨架，可利用谷氨酸作为氨基供体的许多氨基转移酶也具有对莫纳甜的活性。
使用BCAT由吲哚-3-丙酮酸生成莫纳甜
检测了AT-102和AT-104在采用来自睾丸酮丛毛单胞杆菌的ProA醛缩酶(按WO03091396A2所述制备的)的相连反应中生成的莫纳甜。在试剂盒所提供的反应缓冲液中直接加入酶和其它成分/底物，其包括100mM磷酸钾缓冲液pH7.5，100mM L-谷氨酸，和0.1mM PLP。在1mL反应缓冲液中加入了：4mg吲哚-3-丙酮酸，20mg丙酮酸，约50μg以细胞提取物提供的ProA，1μL 2M MgCl2，和2mg待检测的氨基转移酶。所有反应均平行地进行，并以不添加额外的氨基转移酶的反应作为阴性对照。以阳性对照(AT-101)为阳性对照进行比较；这种酶是宽特异性L-氨基转移酶。莫纳甜的背景产量是由于在重组ProA酶的细胞提取物中存在天然大肠杆菌氨基转移酶。反应在30℃温和振荡(100rpm)下温育过夜。按实施例1所述过滤样品并进行反相LC/MS/MS分析。结果如下表23所示：
表23
 
酶 生成的莫纳甜μg/mL
AT-101 173.05
AT-102 122.05
AT-104 133.05
阴性 73.25
明显地AT-102和AT-104氨基转移酶比阴性对照生成了更多莫纳甜并具有阳性对照的大约50-60％活性。
来自大肠杆菌的支链氨基转移酶已被研究成熟并详细地分析了其晶体结构。Okada，K.，等，(1997)J.Biochem(Tokyo)121：631-641，(1997)。该酶与芽孢杆菌D-氨基转移酶如实施例2，3，和6所述的具有相似的整体折叠和显著的序列同源性。此外，BCAT酶和来自芽孢杆菌的D-氨基转移酶是仅有的两类PLP依赖型氨基转移酶，面对PLP加氢表现出立体异构特异性。Yoshimura，T.，等，J.Am.Chem.Soc.115：3897-3900，(1993)。BACT被认为是唯一的α-氨基酸底物结合到它的与磷酸基团同边的羧基上，使其具有与D-氨基转移酶相似的折叠和机制而仍保留对L-氨基酸的特异性的酶。Peisach，D.，等，Biochemistry 57：4958-4967，(1998)。据信BCAT的L-特异性源于在BCAT中定位底物α-羧基的D-氨基转移酶的极性氨基酸侧链被非极性残基所取代的事实。可以预期的是如果所有或者部分这类残基被突变成芽孢杆菌D-氨基转移酶的相应氨基酸，可将BCAT转化成D-特异性氨基转移酶。对大肠杆菌BCAT可进行以下突变(根据登录号gi：14719463编号)：Phe37至Tyr，Val110至His，Met108至Arg。如实施例6所述在这些位点上还可进行其它极性氨基酸取代，以剪切酶活性位点接受大的二羧酸底物。还需将Tyr165转化成Leu，以反映D-氨基转移酶的PLP相互作用；还需要对Tyr96(至Phe)，Arg41，和Arg98进行突变以防止α-羧基结合到BCAT酶的不正确方向上。也可将Trp127突变成Tyr以降低疏水侧链与pro-S构型结合的可能性；Tyr32和Tyr130可与L-谷氨酸在BCAT的活性位点上相互作用并被突变成负电荷氨基酸以使这种作用最小化。Goto，M.，et al，Biochemistry42：3725-3733，(2003)；Okada，K.，Biochemistry 40：7453-7463，(2001)。
由于D-氨基转移酶和支链氨基转移酶都具有生成莫纳甜的活性，可以预期BCAT可被转化成具有生成R，R莫纳甜活性的D-氨基转移酶，从而提供另一种可能的D-氨基转移酶以用于许多实施例所述的反应方案。根据上述结果，可能的是AT-104酶已表现出对莫纳甜D-氨基构象的若干活性。
芽孢杆菌支链氨基转移酶的克隆和诱变
地衣芽孢杆菌包含与大肠杆菌支链氨基转移酶相比，被公认的和D-氨基转移酶更密切相关的支链氨基转移酶。检验了D-转氨活性，并根据上述预测的大肠杆菌BCAT活性位点残基进行诱变。
菌株
地衣芽孢杆菌(ATCC编号14580)在营养琼脂中30℃过夜生长。菌落团被置于100μL灭菌水中95℃加热10分钟，以裂解细胞。3μL被用于后续的聚合酶链式反应(PCR)扩增。
聚合酶链式反应方案
利用NcoI和SalI位点设计引物以将地衣芽孢杆菌基因(915bp)克隆进pET 28b和pET 30a载体(Novagen，Madison，WI)和pTRC99a(GE HealthcareLife Sciences)。pET30构建体含有N末端组氨酸标签和S标签，而pET28构建体未被标记。
地衣芽孢杆菌bcat引物：
N端5′-GGTTAAGGCCATGGGGGACCAGAAAGACCA-3′(SEQ IDNO：44)；和
C端：5′-GGCCTTCCGTCGACTCAGCTGACACTTAAGCT-3′(SEQ IDNO：45)
采用下列PCR方案扩增编码区。在50μL反应中，使用了3μL模板，1μM每种引物，0.4mM每种dNTP，3.5U延伸高保真聚合酶，和1X含Mg延伸TM缓冲液(Roche，Indianapolis，IN)。所采用的热循环仪程序包括96℃热启动5分钟，之后30次重复下列步骤：94℃30秒，50℃1分钟45秒，和72℃2分钟15秒。30次循环之后，样品在72℃保持7分钟然后4℃储藏。获得正确大小的洁净PCR产物(大约900pb)。
克隆
PCR产物被纯化并以SalI和NcoI在SalI缓冲液(New England Biolabs，Ipswich，MA)中消化。利用Qiagen QIAquick凝胶提取试剂盒纯化经消化的载体(pET28，pET30，和pTRC99a)和插入物。利用Roche快速DNA连接试剂盒(Roche)制成连接物并纯化。利用0.2cm小池和Bio-Rad基因脉冲发生器II系统按Bio-Rad电穿孔手册所述将连接物转化到大肠杆菌DH10B中。可在900μL SOC培养基37℃225rpm离心30分钟回收细胞。细胞被涂布在含卡那霉素(25μg/mL)的LB琼脂平板上。利用Qiagen spin小量制备试剂盒纯化质粒DNA并通过SalI和NcoI的限制性消化筛选正确插入物。表现为具有正确插入的质粒的序列可通过Agencourt BioScience Corporation(Beverly，MA)的双脱氧链终止DNA测序仪来确认。测序证实的编码序列在NCBI登录号CP000002 GI 56160984 2851268..2850354，其生成具有如登录号AAU24468 GI52004526所列的氨基酸序列的蛋白。
基因表达和试验
质粒DNA(pET载体)被转化进大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)(Novagen，Madison，WI)以构建pET载体。培养物生长并利用Qiagen小量制备试剂盒分离质粒，通过限制性消化分析以确认同一性。一般在含卡那霉素(50μg/mL)的LB培养基上进行诱导。细胞在37℃生长至OD600为0.4-0.8并以0.1mMIPTG(异丙基硫代半乳糖苷)诱导，诱导后3-4小时取样。按照NovagenBugBusterTM试剂(含benzonase核酸酶并加入Roche完全蛋白酶抑制剂调配液)所带的方案制备细胞提取物。经SDS-PAGE鉴定，获得了高水平的预期分子量的可溶蛋白。通过SDS-PAGE分离细胞提取物中的可溶蛋白。
采用以下方案通过由丙酮酸(或由α-酮戊二酸至谷氨酸)和D-色氨酸生成丙氨酸来分析细胞提取物的D-氨基转移酶活性；平行的1mL反应通常在100mM磷酸钾缓冲液(pH7.5)，50μM磷酸吡哆醛，25mM丙酮酸钠，和50mMD-色氨酸中进行。通过加入无细胞提取物或纯化酶启动反应并在30℃温和振荡下温育15分钟过夜。为进行比较，在每个试验中加入大约相同水平的D-氨基转移酶(通常接近0.5mg)，而AT-103(BioCatalytics)往往作为基准酶。加入蚁酸至终浓度为百分之二以终止反应，通过离心去除沉淀的蛋白。还进行了不加蛋白的对照反应。也以零时间点作为阴性对照。按实施例1所述采用OPA衍生检测丙氨酸和谷氨酸。相对于AT-103和球形芽孢杆菌酶，支链氨基转移酶具有低水平的D-氨基转移酶活性。
还检测了支链氨基转移酶由D-色氨酸生成莫纳甜的能力(如实施例3)，但在检测条件下未表现出活性。
pTRC99a构建体被转化进电转感受态大肠杆菌CAG18455细胞中，其是用于色氨酸生成的营养缺陷型。细胞在含Balch′s维生素，100mg/L L-色氨酸，0.4％葡萄糖，和氯化钙的M9基础培养基上生长。没有L-色氨酸则细胞不能生长。以10，100和1000μM IPTG在OD6000.4诱导4.5小时。在SDS-PAGE上可观察到正确MW的条带。利用QuikChange多位点定向诱变试剂盒(Stratagene)突变质粒。按生产商所述设计了下表24中的引物。
表24：
 
氨基酸突变(E.coli编号) 核苷酸突变(地衣芽孢杆菌编号) 引物序列
Y32F tac 96-->ttc ATCACGGATTTTTATTCGGGGACGGCGTG(SEQ IDNO：46)
Y32D tac 96-->gac ATCACGGATTTTTAGACGGGGACGGCGTG(SEQ IDNO：47)
F37Y ttt 111-->tat GGACGGCGTGTATGAAGGGATCAGGG(SEQ IDNO：48)
R41K agg 123-->aag TGTTTGAAGGGATCAAGGTATACGACGGCAAC(SEQ ID NO：49)
F37Y+R41K GACGGCGTGTATGAAGGGATCAAGGTATACGACG(SEQ ID NO：50)
Y96F tac276-->ttc GCTGAAAGACGCTTTCATCCGCTTGGTOG(SEQ IDNO：51)
Y96H tac276->cac GCTGAAAGACGCTCACATCCGCTTGGTC(SEQ IDNO：52)
R98Y cgc282->tac CTGAAAGACGCTTACATCTACTTGGTCGTTTCAAGAGG(SEQ ID NO：53)
Y96F÷R98Y GGCTGAAAGACGCTTTCATCTACTTGGTCGTTTCAAGAGG(SEQ ID NO：54)
Y96H+R98Y GCTGAAAGACGCTCACATCTACTTGGTCGTTTCAAGAGG(SEQ ID NO：55)
L108R ctc312-->cgc GCAGGTGACCGCGGACTCGATCCAAAC(SEQ IDNO：56)
L110H ctc318->cac GCAGGTGACCTCGGACACGATCCAAAC(SEQ IDNO：57)
L108R+L110H GCAGGTGACCGCGGACACGATCCAAACAATTG(SEQ ID NO：58)
L127Y ttg369->tac GTCATCATAATTGTCGAACCATACGCAATATTCCCGAAAC(SEQ ID NO：59)
L127K ttg369-->aag GTCATCATAATTGTCGAACCAAAGGCAATATTCCCGAAAC(SEQ ID NO：60)
I130E ata375-->gaa GTCATCATAATTGTCGAACCATTGGCAGAATTCCCGAAAC(SEQ ID NO：61)
L127Y+I130E CGAGTGTCATCATAATTGTCGAACCATACGCAGAATTCCCGAAAC(SEQ ID NO：62)
L127K+I130E CCGAGTGTCATCATAATTGTCGAACCAAAGGCAGAATTCCCGAAAC(SEQ ID NO：63)
Y165L tac477->ttg AATCGCTGAACTTGTTAAACAATATTCTTGTCCGGATCGAGG(SEQ ID NO：64)
氨基酸的突变是基于大肠杆菌BCAT晶体结构的且上表中的编号是对大肠杆菌蛋白而言。DNA突变的编号是基于地衣芽孢杆菌bcat基因。
引物被稀释至0.1mg/mL且在50μL诱变反应中通常使用大约100ng每种寡核苷酸引物，对于更大的引物按比例提高使用浓度。对于与退火的相同模板区域基本互补寡核苷酸引物，有时在该区域的整个引物池的使用总量为100ng。在反应中使用200ng的模板(在pTRC99a中的地衣芽孢杆菌bcat)，5μL 10X快变缓冲液，2μL dNTPs，和2μL酶混合物。在37℃下以DpnI限制性内切酶(Stratagene)(2μL)处理扩增产物2小时，并转移至1.5mL厚壁管进行乙醇沉淀。重悬的(浓缩的)反应混合物(2.5μL)被转化进快变试剂盒所包含的XL10-Gold超感受态细胞中。小量制备了几个菌落并测序以确保突变是随机的并估计获得的诱变水平。平板上的菌落被重悬并进行大容量的小量制备。然后将小量制备DNA转化到色氨酸营养缺陷株中，并涂布在上述的基础培养基上(含IPTG)或采用以D-色氨酸作为唯一氮源的基础培养基。利用在之前轮表现为不能很好结合的引物在大容量的小量制备中进行第二轮和第三轮突变。在每个阶段，将在基础培养基上快速生长的菌落(较大菌落)保留以进一步分析。从选择平板中分离出下表25所示的突变。在某些情况下，出现在选择培养基上的这类相同突变大于一次。
表25
 
克隆 突变
4 F37Y，Y96F
6 Y96F
28 F37Y，Y165L
32 Y96F，L127K
5-1 F37Y，Y96F，R98Y，L108R，L110H，L127Y
5-2 F37Y，R41K，Y96F，R98Y，L108R，L110H，L127Y
在LB培养基上诱导突变构建体以制备重组蛋白，并如上制备细胞提取物。在BioRad Laboratories Experion自动化电泳台上分离细胞提取物的可溶蛋白并利用版本1.1.98.0的Experion软件分析浓度和表达百分比。观察到很低水平的可溶重组蛋白；因而感兴趣条带的定量是不可能的。采用50-250μL细胞提取物进行试验以检测D-色氨酸转氨反应。以α-酮戊二酸和丙酮酸作为氨基受体分析克隆4，6，28，和32，并在30℃下温育2小时和过夜。细胞提取物中的丙氨酸/谷氨酸的背景水平被减去。对5-1和5-2的试验，通过Experion软件估计的BCAT的蛋白浓度是野生型酶为275.1ng/μL，BCAT 5-1为409.3ng/μl，而BCAT5-2为148.2ng/μl。试验结果如下表26-28所示。
表26
 
BCAT 谷氨酸(mM)2小时 谷氨酸(mM)过夜
野生型(100μL) 0.0912 0.2304
野生型(250μL) 0.251 0.521
4(100μL) 0.0642 0.1202
4(250μL) 0.154 0.295
6(100μL) 0.053 0.112
6(250μL) 0.141 0.289
28(100μL) 0.0586 0.1402
28(250μL) 0.155 0.367
32(100μL) 0.0616 0.1236
32(250μL) 0.167 0.339
表27
 
BCAT 丙氨酸(mM)2小时 丙氨酸(mM)过夜
野生型(250μL) 0.199 0.438
4(250μL) 0.093 0.249
6(250μL) 0.097 0.249
28(250μL) 0.117 0.325
32(250μL) 0.102 0.285
表28
 
BCAT 谷氨酸(mM)1小时 谷氨酸(mM)过夜
野生型(50μL) 0.018 0.075
野生型(100μL) 0.037 0.152
5-1(50μL) 0.005 0.017
5-1(100μL) 0.01 0.045
5-2(50μL) 0.001 0.011
5-2(100μL) 0.003 0.031
明显地与大多数L-氨基转移酶一样，相对于丙酮酸酶对α-酮戊二酸作为氨基受体具有偏好性。所有突变体具有D-氨基转移酶活性，如野生型亲代一样。不清楚野生型酶具有更高还是更低的D-氨基转移酶活性，因为对细胞提取物中的BCAT蛋白进行精确定量是不可能的。但是，可以预期的是突变酶相对于野生型具有更低的L-氨基转移酶活性，从而改进了D-对L-转氨率的比值。持续诱变可为莫纳甜途径提供可选的酶。
实施例8
谷氨酸和天冬氨酸消旋酶的克隆，表达，和检测
该实施例中描述了用于克隆和检测可用于L-谷氨酸和D-谷氨酸(或L-和D-天冬氨酸或L-和D-丙氨酸)之间相互转化的氨基酸消旋酶的方法。谷氨酸，天冬氨酸和丙氨酸消旋酶被用于生成R，R莫纳甜的生物合成途径中，在该途径中一个步骤生成L-氨基酸(如L-谷氨酸，L-天冬氨酸，或L-丙氨酸)而另一步骤消耗D-氨基酸(如D-谷氨酸，D-天冬氨酸，或D-丙氨酸)。图4图示了采用L-色氨酸特异性氨基转移酶，R-特异性醛缩酶，D-氨基转移酶和谷氨酸(或天冬氨酸或丙氨酸)消旋酶由L-色氨酸生成R，R莫纳甜的生物合成途径。
将基因克隆进pET28和pET30载体以生成未标记蛋白和带可切割的N端HIS6-Tag/T7-Tag融合蛋白。利用固定化金属亲和层析纯化得到的蛋白。
实验综述
在大肠杆菌中克隆和表达来自短乳杆菌(Genbank登录号D29627，核酸序列)，和戊糖片球菌(murI基因)(Genbank登录号L22789)的编码谷氨酸消旋酶(EC 5.1.1.3)的基因。检测提取物在L-谷氨酸向D-谷氨酸和D-谷氨酸向L-谷氨酸转化中的活性。还以L-和D-天冬氨酸之间的相互转化检测了BioCatalytics天冬氨酸消旋酶(EC 5.1.1.13)。
用于克隆的基因组DNA的分离
从美国典型培养物保藏中心获取了短乳杆菌基因组DNA(ATCC8287D)。戊糖片球菌(ATCC 25745)在乳酸菌MRS肉汤中于37℃下生长并取2mL用于采用Mekalanos，J.J.，＂Duplication and amplification of toxin genes inVibrio cholerae，＂Cell 35：253-263，(1983)中的方法的基因组DNA分离。
聚合酶链式反应方案
用于克隆进pET 28和pET30载体(Novagen，Madison，WI)的引物被设计成带5′限制性位点和悬臂。
短乳杆菌谷氨酸消旋酶引物：
N端：5′-GCGGCGCCATGGAAAATGATCCGATTGGTCTAATG-3′(SEQID NO：15)，和
C端：5′-GCGGCGGTCGACGCAATTACAATTGTGTTTGTC-S′(SEQ IDNO：16)。
戊糖片球菌谷氨酸消旋酶引物：
N端：5′-GCGGCGCCATGGATGTATGTATAATTTTATTTAG-3′(SEQ IDNO：17)，和
C端：5′-GCGGCGGTCGACAAATTTCATTATTCATTCTAATTT-3′(SEQID NO：18)。
采用以下PCR方案扩增来自短乳杆菌的基因。在50μL反应中，使用了0.150μg模板，1.6μM每种引物，0.4mM每种dNTP，2.8U延伸高保真TM聚合酶(Roche，Indianapolis，IN)，0.5U Pfu聚合酶(Stratagene，La Jolla，CA)和1X含Mg延伸TM缓冲液。采用的热循环仪程序包括96℃热启动3分钟，8次重复下列步骤：94℃ 30秒，52℃ 45秒，和72℃ 2分钟，之后22次重复以下步骤：94℃ 30秒，60℃ 45秒，和72℃ 2分钟。22次重复后，样品在72℃保持7分钟然后于4℃储存。这个PCR方案生成的产物为～830bp，是通过与DNA大小标记的比较鉴定的。
采用以下PCR方案扩增来自戊糖片球菌的基因。在50μL反应中，使用了0.15μg模板，1.6μM每种引物，0.4mM每种dNTP，2.8U延伸高保真TM聚合酶，0.5U Pfu聚合酶和1X含Mg延伸TM缓冲液。采用的热循环仪程序包括96℃热启动3分钟，8次重复下列步骤：94℃ 30秒，37℃ 45秒，和72℃ 2分钟，之后8次重复以下步骤：94℃ 30秒，45℃ 45秒，和72℃ 2分钟，接着14次重复以下步骤：94℃ 30秒，55℃ 45秒，和72℃ 2分钟。14次重复后，样品在72℃保持7分钟然后于4℃储存。这个PCR方案生成的产物为～840bp，是通过与DNA大小标记的比较鉴定的。
克隆
采用Qiagen凝胶提取试剂盒(Valencia，CA)从0.8％ TAE-琼脂糖凝胶中凝胶纯化PCR产物。采用SmartSpec 3000TM分光光度计定量PCR产物。以限制性酶NcoI和SalI按照生产商的推荐方案(New England Biolabs，Beverly，MA)消化产物并采用Qiagen凝胶提取试剂盒从0.8％ TAE-琼脂糖凝胶中凝胶纯化。通过限制性酶NcoI和SalI的消化制备pET28和pET30载体，之后以虾类碱性磷酸酶处理并采用Qiagen凝胶提取试剂盒从0.8％ TAE-琼脂糖凝胶中纯化。
采用快速TM DNA连接试剂盒(Roche，Indianapolis，IN)连接经消化的载体和插入物。将大约50ng处理插入物，100ng处理载体(插入物与载体的摩尔比为3:1)，5U T4 DNA连接酶(快速TM DNA连接试剂盒中含有的)，和1X连接缓冲液在室温下温育5分钟。采用高纯度PCR产物纯化试剂盒(Roche)纯化连接反应物并将其转化进大肠杆菌DH10B电转感受态细胞(Invitrogen，Carlsbad，CA)。在10μL连接反应物中加入40μL DH10B细胞并采用BioRad基因脉冲发生器II通过电穿孔进行转化，条件如下：在0.2cm小池中2.5kV，25μF，200ohm。在37℃225rpm振荡下以1mL室温SOC回收细胞1小时。将细胞涂布在含卡那霉素(50μg/mL)的LB平板上。
利用Qiagen spin小量制备试剂盒从制得的转化体中纯化质粒DNA，并通过NcoI和SalI的限制性消化筛选正确插入物。表现为具有正确插入物的质粒的序列可通过双脱氧链终止DNA测序仪来确认。
基因表达和试验
经序列分析证实的质粒DNA被亚克隆进大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)(Novagen，Madison，WT)中。培养物在生长并采用Qiagen小量制备试剂盒分离质粒，通过限制性消化分析以证实同一性。
在BL21(DE3)中对pET28(未标记)和pET30(组氨酸标签)载体中的短乳杆菌和戊糖片球菌谷氨酸消旋酶开始进行诱导。进行了时程研究，让培养物在250mL含卡那霉素(50μg/mL)的LB中生长至OD600为0.5-0.6并以100mMIPTG(异丙基硫代半乳糖苷)诱导，在诱导后0和3小时取样。600μL(0小时)和275μL(3小时)中的细胞被重悬在40μL含2-巯基乙醇的十二烷基硫酸钠缓冲液中，并在95℃加热10分钟，再冷却。采用4-15％梯度凝胶通过SDS-PAGE分析这类总细胞蛋白样品份。
还从3小时培养物中制备了细胞提取物，通过采用含0.625μL benzonase核酸酶和3μL蛋白酶抑制剂调配液#3的0.625mL Novagen BugBusterTM试剂(Calbiochem-Novabiochem Corp.，San Diego，CA)在室温下温和振荡20分钟以悬浮来自5mL培养物的细胞团，并在16000xg离心以去除细胞碎片。上清液(细胞提取物)被点样到4-15％梯度凝胶中以分析细胞可溶蛋白。
来自克隆的短乳杆菌和戊糖片球菌谷氨酸消旋酶的3小时样品显示出总蛋白和可溶蛋白都符合正确大小(大约31kDa)。相对于短乳杆菌pET28(未标记)的基因产物以及在两种载体中的戊糖片球菌基因产物，短乳杆菌pET30(组氨酸标签)基因产物在更高水平过量表达，并有更多可溶蛋白(>20％的可溶蛋白)。在pET28和pET30载体中的戊糖片球菌基因产物表现出等效的过量表达和可溶性，其明显低于短乳杆菌pET30基因产物的观察结果。
来自诱导培养物(250mL)的细胞被离心并以0.85％ NaCl洗涤一次。将细胞团重悬在含5μL/mL蛋白酶抑制剂调配液#3(Calbiochem-NovabiochemCorp.，San Diego，CA)和1μL/mLbenzonase核酸酶的5mL/g(细胞湿重)的BugBusterTM(Novagen)试剂中。将样品在定轨摇床上温室诱导20℃分钟。通过在4℃下16,000Xg离心20分钟去除不溶细胞碎片。
采用以下方案试验细胞提取物的谷氨酸消旋酶活性。在10mM磷酸钾(pH8.0)，0.2mM二硫苏糖醇(＂DTT＂)，和10mM L-谷氨酸和D-谷氨酸中进行400-μL反应。通过加入20-100μL无细胞提取物起始反应并室温温育。在1分钟，5分钟，10分钟，20分钟和1小时的时程后采取样品份(0分钟样品作为对照反应)。在每份40-μL样品中加入2M蚁酸(25μL)以终止反应并通过离心去除沉淀的蛋白。移除上清液，-80℃冷冻直至LC/MS/MS分析。
由100mM IPTG(3小时)诱导的pET30细胞提取物的试验结果证明短乳杆菌(Genbank登录号BAA06106.1 GI：468450)和戊糖片球菌(Genbank登录号AAA16761.1 GI：349029)酶对两种谷氨酸异构体都具有相当水平的消旋酶活性。戊糖片球菌消旋酶(20μL细胞提取物)以任一底物启动10-20分钟即在L-和D-谷氨酸之间达到了平衡。短乳杆菌酶(20μL细胞提取物)也在大约20分钟内达到平衡。
利用与上述相似的方案试验了从BioCatalytics，Inc.(Pasadena，CA)购买的部分纯化天冬氨酸消旋酶(目录号#ASPR-101)对L-天冬氨酸和D-天冬氨酸的活性。商业化酶对两种异构体都表现出消旋酶活性。使用0.5-1mg酶，在20-60分钟内达到平衡。
还利用以下方案试验了所有三种消旋酶(短乳杆菌谷氨酸消旋酶，戊糖片球菌谷氨酸消旋酶和BioCatalytics天冬氨酸消旋酶)对S，S莫纳甜的活性。在10mM磷酸钾(pH8.0)，0.2mM DTT，和10mM S，S莫纳甜中进行400-μL反应。通过加入无细胞提取物(短乳杆菌和戊糖片球菌)或纯化酶(BioCatalytics天冬氨酸消旋酶)起始反应并室温温育。在1分钟，5分钟，10分钟，20分钟和1小时的时程后采取样品份(作为对照反应的0分钟样品以及无酶样品)。在每份40-μL样品中加入2M蚁酸(25μL)以终止反应并通过离心去除沉淀的蛋白。移除上清液，-80℃冷冻直至LC/MS/MS分析(实施例1)。随时间过去S，S莫纳甜浓度没有降低，S，R莫纳甜也没有任何增加(开始存在<5％污染副产品，甚至在无酶对照中)。因此，经试验的消旋酶都未对莫纳甜表现出活性。
实施例9
利用丙氨酸，谷氨酸，或天冬氨酸消旋酶由L-色氨酸生成R，R莫纳甜
该实施例描述了利用L-色氨酸(L-酪氨酸，或芳族)氨基转移酶，ProA醛缩酶，丙氨酸，谷氨酸，或天冬氨酸消旋酶和宽特异性D-氨基酸氨基转移酶由L-色氨酸生成富含立体异构体R，R莫纳甜的方法。图5的图表图示了该途径。这个生成富含立体异构体R，R莫纳甜的途径的步骤1要求对莫纳甜前体(MP)生成莫纳甜具有低活性的酶。根据更早的结果，我们采用了WO03/091396 A2实施例1所述的苜蓿中华根瘤菌和球形红芽孢杆菌tatA基因产物。
材料和方法
按实施例8所述在大肠杆菌制得了来自短乳杆菌和戊糖片球菌的谷氨酸消旋酶。在某些情况下，带组氨酸标签的这类酶可采用组氨酸结合900柱按生产商的方案(Novagen，Madison，WI)进行纯化并采用PD-10柱(G25Sephadex，Amersham-Pharmacia)脱盐以除去咪唑。以25mM磷酸钾pH8.0洗脱酶。天冬氨酸消旋酶(ASPR-101)和D-氨基转移酶(AT-103)是从BioCatalytics，Inc.购买，丙氨酸消旋酶是从Sigma(St.Louis，MO)(目录号A8936)购买。按WO03/091396 A2实施例1所述制备苜蓿中华根瘤菌和球形红芽孢杆菌酪氨酸(芳族)氨基转移酶。WO03/091396 A2实施例4所述制备睾丸酮丛毛假单胞菌ProA醛缩酶。利用Bio-Rad蛋白试验按照生产商的方案(Hercules，CA)完成总蛋白试验。
采用消旋酶生成的S，S莫纳甜量的减少
反应混合物(1mL体积，平行进行)含有100mM磷酸钾缓冲液(pH8)，2mM MgCl2，0.05mM5’磷酸吡哆醛(＂PLP＂)，200mM丙酮酸钠，5mMα-酮戊二酸或草酰乙酸钠，大约280μg/mL以细胞提取物供应的苜蓿中华根瘤菌TatA，1mg/mL BioCatalytics D-氨基转移酶(AT-103)，100μL/mL谷氨酸消旋酶细胞提取物或1mg/mL天冬氨酸消旋酶，和大约100μg/mL以细胞提取物供应的ProA醛缩酶。加入固体色氨酸至浓度10.2mg/ml。阴性对照不含有消旋酶。样品在30℃下(250rpm振荡)温育1小时，2小时，或过夜。离心样品以去除沉淀，注射器过滤，并于-80℃储存，直至按实施例1所述采用LC/MS/MS方法分析莫纳甜。
大部分样品含有>95％ S，S莫纳甜，因为细胞提取物中存在一定量的天然L-氨基转移酶。但是，含有消旋酶的样品降低了总莫纳甜的量因为消旋酶使L-谷氨酸对MP的转氨效力变小。没有消旋酶，在时程内产生了1545-2355ppm莫纳甜(主要是S，S)。存在消旋酶，仅产生了340-879ppm(短乳杆菌酶)，444-531ppm(戊糖片球菌酶)，和506-1460ppm莫纳甜(天冬氨酸消旋酶)。这些数据表明消旋酶在生成莫纳甜所要求的反应条件下是有活性的。为使由细胞提取物酶，例如天冬氨酸氨基转移酶形成的S，S莫纳甜最小化，以纯化酶和更高的D-氨基转移酶/L-氨基转移酶比例来实施进一步的实验。
L-色氨酸向含4-R异构体莫纳甜的转化
采用大约54μg纯化L-氨基转移酶(短乳杆菌酶或戊糖片球菌TatA)，1mg天冬氨酸氨基转移酶(BioCatalytics)，1mg D-氨基转移酶，5mM草酰乙酸作为氨基受体，和75μg纯化醛缩酶重复上述实验。反应平行进行2小时取样并温育过夜。以苜蓿中华根瘤菌L-氨基转移酶但不含醛缩酶作为阴性对照。除以反相色谱对R，R/S，S和S，R/R，S莫纳甜峰值定量之外，利用实施例1所述的FDAA衍生技术测定每种立体异构体的百分比。结果如下表29所述。
表29
 
L-氨基转移酶 温育时间 总莫纳甜(ppm) ％S，S ％R，R ％R，S ％S，R
苜蓿中华根瘤菌TatA 2小时 17.1 10.2 58.1 0.8 31.0
苜蓿中华根瘤菌TatA 2小时 15.8 13.3 55.3 1.0 30.4
苜蓿中华根瘤菌TatA 过夜 77.7 25.8 40.0 1.3 32.9
苜蓿中华根瘤菌TatA 过夜 67.9 29.4 37.3 1.5 31.8
 
球形红芽孢杆菌TatA 2小时 241.2 96.3 2.3 0.8 0.6
球形红芽孢杆菌TatA 2小时 223.2 95.7 2.7 1.0 0.6
球形红芽孢杆菌TatA 过夜 600.4 96.6 1.8 0.5 1.1
球形红芽孢杆菌TatA 过夜 618.5 96.1 2.1 0.5 1.3
无消旋酶的对照 2小时 7.1 92.0 1.4 6.6 0.0
无消旋酶的对照 2小时 5.7 94.0 1.2 4.8 0.0
无消旋酶的对照 过夜 44.6 93.5 1.3 4.7 0.5
无消旋酶的对照 过夜 37.5 95.4 0.9 3.7 0.0
明显地，当以苜蓿中华根瘤菌TatA用于L-色氨酸转氨时消旋酶的存在增加了所生成的莫纳甜的总量。莫纳甜水平在2小时试验中从平均6.4增至16.5ppm，在过夜试验中从41至73ppm。此外，通过使用消旋酶形成的R，R百分比从约1％增至多达58％。另一种有效甜味剂，莫纳甜S，R立体异构体是另一种主要成分，从阴性对照的接近0增至31％。相对于苜蓿中华根瘤菌L-色氨酸转氨酶，球形红芽孢杆菌TatA对S-MP明显具有更高活性，表明了当莫纳甜4-R异构体是期望产物时，具有一种对L-色氨酸比对MP有高的底物特异性的酶的重要性。在2小时时间点总莫纳甜的大约10％是4S，苜蓿中华根瘤菌TatA被认为对MP具有限制活性。
以纯化的苜蓿中华根瘤菌TatA(54μg)和短乳杆菌谷氨酸消旋酶重复实验。若采用纯化的谷氨酸消旋酶，每1mL反应使用大约64μg。还检测了含有谷氨酸消旋酶的细胞提取物并使用了1.4mg可溶蛋白。仍采用无消旋酶的阴性对照且所有样品平行进行。结果如下表30所示。
表30
 
谷氨酸消旋酶 温育时间 总莫纳甜(ppm) ％S，S ％R，R ％R，S ％S，R
短乳杆菌(纯化的) 2小时 3.3 49.1 34.2 3.7 13.0
短乳杆菌(纯化的) 2小时 3.6 47.9 35.2 3.5 13.4
短乳杆菌(纯化的) 过夜 29.3 58.9 24.7 3.2 13.2
短乳杆菌(纯化的) 过夜 40.2 55.1 25.0 4.7 15.3
短乳杆菌(细胞提取物) 2小时 10.5 45.8 35.9 1.1 17.2
短乳杆菌(细胞提取物) 2小时 10.5 47.4 33.9 1.1 17.6
短乳杆菌(细胞提取物) 过夜 79.4 70.3 17.9 1.3 10.5
短乳杆菌(细胞提取物) 过夜 80.1 69.1 19.1 1.1 10.7
无 2小时 2.7 84.1 7.1 6.3 2.4
无 2小时 3.2 84.9 6.0 6.8 2.2
无 过夜 36.5 92.3 2.3 4.2 1.2
无 过夜 30.5 92.7 2.0 4.1 1.3
仍然，消旋酶的加入明显地增加了由L-色氨酸生成的总莫纳甜，也增加了含4R异构体莫纳甜与S，S莫纳甜的相对量。使用纯化的醛缩酶，消旋酶，和L-氨基转移酶大大改善了控制期望立体异构体形成的能力。L比D氨基转移酶的比例也是调控终产物立体异构性的途径。
当对实施例2表1和2所示的结果和类似于上述条件的反应条件的结果进行比较时，可以观察到由吲哚-3-丙酮酸形成了大约7-29ppm的莫纳甜且形成的R，R莫纳甜百分比大约为51-90％。天冬氨酸消旋酶的使用使产生的总莫纳甜增至16-78ppm莫纳甜，其中R，R大约40-58％。此外，采用了更稳定和更便宜的原材料(L-色氨酸)。在实施例3中，由D-色氨酸生成了大约73ppm莫纳甜，其中R，R:S，S大约为1.7:1。4R异构体的总量是总莫纳甜的>80％。因为R，R莫纳甜和R，S莫纳甜都是有效的甜味剂(比蔗糖甜>1000倍)，不要求昂贵的D-氨基酸底物而富含这类异构体的能力是很关键的。
可以预期的是非特异性或R特异性醛缩酶的有效性会增加反应速率还会增加形成的R，R莫纳甜百分比。参见实施例5。尽管据报导用于这些试验的来自睾丸酮丛毛假单胞菌的ProA醛缩酶在裂解反应中主要偏好S构型底物，但明显地这种ProA醛缩酶会生成R-MP。因而，更优选生成R构象MP的醛缩酶有利于生成更高百分比的R，R莫纳甜。此外，可以预期的是对生成莫纳甜具有更低活性的L-色氨酸氨基转移酶也会降低形成的S，S和R，R莫纳甜量。最后，可对D-氨基转移酶进行改进，或使用可选的D-氨基转移酶，相对于S-MP可增加对R-MP的底物特异性。如果需要，这还可增加R，R产物的形成。
重复天冬氨酸消旋酶实验以比较SEQ ID NO：22的R选择性醛缩酶活性和来自睾丸酮丛毛假单胞菌的ProA醛缩酶活性。大约50μg纯化的L-氨基转移酶(苜蓿中华根瘤菌TatA)，1mg天冬氨酸消旋酶(BioCatalytics)，1mg D-氨基转移酶(AT-103，BioCatalytics)，5mM草酰乙酸作为氨基受体，和50μg适当的纯化的醛缩酶。反应平行进行并在30℃下温育过夜。采用实施例1所述的FDAA衍生技术测定每种立体异构体的百分比。结果如下表31所示。
表31
 
醛缩酶 总莫纳甜(ppm) ％S，S ％R，R ％R，S ％S，R
SEQ ID NO：22 211 72.7 27.3
睾丸酮丛毛假单胞菌 422 30.2 38.5 31.3
睾丸酮丛毛假单胞菌ProA的异构体分布与以上的之前实验一致，而采用SEQ ID NO：22的R选择性醛缩酶时，R，R莫纳甜的百分比高得多，生成的S，S量检测不到，且S，R莫纳甜的量也更低。
如实施例2和3所述，D-丙氨酸可作为MP至莫纳甜转氨反应的氨基供体。许多L-氨基转移酶具有一定程度上以丙酮酸作为氨基受体并生成L-丙氨酸的能力。由于以上提及的反应使用高浓度的丙酮酸，一些丙酮酸可能转化成L-丙氨酸。例如，在L-色氨酸的转氨反应中，发现如果缺乏α-酮戊二酸在2小时内实施例6所述的HexAspC酶将10-18％的丙酮酸(50-200mM初始浓度)转化成L-丙氨酸。当两种氨基受体以高浓度(>50mM)存在时，酶对α-酮戊二酸显示出10倍偏好性。AspC(WO 03/091396 A2所述的)也由丙酮酸生成一些L-丙氨酸。因此，可以期望的是在上述反应中可省略添加α-酮戊二酸或草酰乙酸并采用丙氨酸消旋酶(EC 5.1.1.1)替代谷氨酸或天冬氨酸消旋酶。
在流产布鲁氏菌和粪链球菌中首先鉴定出丙氨酸消旋酶。Marr，AG.，and Wilson，P.W.，Arch.Biochem.Biophys.，49：424-433，(1954)；Wood，W.A.，and Gunsalus，LC，J.Biol.Chem.190：403-416，(1951)。鼠伤寒沙门氏杆菌中的dadB基因被确定为丙氨酸消旋酶活性的来源并在基因组数据库中发现几百种同源物。其它已知的丙氨酸消旋酶活性来源是大肠杆菌，枯草芽孢杆菌，铜绿假单胞菌，霍乱弧菌，栗酒裂殖酵母，蜡状芽孢杆菌。担子菌类蘑菇，香菇也含有宽活性丙氨酸消旋酶。嗜热脂肪土芽孢杆菌的热稳定同源物是从Sigma-Aldrich(目录号#A8936)购买的并被固定化作为商业应用。Inagaki，K.，Biochemistry 25：3268(1986)。
以丙氨酸消旋酶生成莫纳甜
利用睾丸酮丛毛假单胞菌ProA醛缩酶检测莫纳甜的生成。大约50μg纯化的L-氨基转移酶(苜蓿中华根瘤菌TatA)，1mg D-氨基转移酶(AT-103，BioCatalytics)，丙酮酸作为氨基受体，50μg纯化的醛缩酶，和70μg从Sigma(St.Louis，MO)(目录号A8936)购买的丙氨酸消旋酶。反应平行进行并温育过夜。采用实施例1所述的FDAA衍生技术测定每种立体异构体的百分比。不含消旋酶的作为对照。结果如下表32所示。
表32
 
条件 总莫纳甜 ％SS ％RS ％RR ％SR
Ala消旋酶(1小时) 4 66 21 12 1
无Ala消旋酶(1小时) 2.7 69 26 5 0
Ala消旋酶(24小时) 82.9 90 5 4 2
无Ala消旋酶(24小时) 170.3 89 5 4 2
与无丙氨酸消旋酶相比，存在丙氨酸消旋酶时在1小时时间点有多3倍R，R莫纳甜。结果显示采用丙氨酸消旋酶可能产生R，R莫纳甜。通过采用选择性生成R-莫纳甜前体的醛缩酶可改进所生成的R，R莫纳甜百分比，L-氨基转移酶对R-莫纳甜前体不具有或具有限制活性而D-氨基转移酶对吲哚-3-丙酮酸不具有或具有限制活性。
实施例10
D-苯基甘氨酸氨基转移酶(D-4-羟基苯基甘氨酸氨基转移酶)
如图3所示，立体转化氨基转移酶可用于生成莫纳甜的生物合成途径。例如，D-苯基甘氨酸氨基转移酶或其突变体可以L-谷氨酸作为氨基供体由R-MP生成R，R莫纳甜。
(1)由寡核苷酸引物PCR合成施氏假单胞菌4D-羟基苯基甘氨酸氨基转移酶
该实施例描述了合成可用于以L-谷氨酸作为氨基供体将R莫纳甜前体转化成R，R莫纳甜的4D-羟基苯基甘氨酸氨基转移酶，立体转化酶的方法。
引物设计
以施氏假单胞菌4D-羟基苯基甘氨酸氨基转移酶(4D-HPG AT)的公开序列(Genbank登录号.AY319935，核酸序列；Genbank登录号.AAQ8290，蛋白序列)作为PCR引物设计的模板。可选地，以来自恶臭假单胞菌的4D-羟基苯基甘氨酸氨基转移酶(CAD42450(蛋白)，AX467211(核酸))作为序列模板。总共设计了34个正向引物和35个反向引物；正向和反向引物为40mer共享了20个重叠碱基对。此外，设计了2个含有用于克隆进pET 28和pET30载体(Novagen，Madison，WI)的5′限制性位点和悬臂的外引物。
施氏假单胞菌4D-HPG AT外引物：N端(带NdeI位点)：
5′-GGCCGGCATATGTCGATCCTTAACGACTACAAACGT-3′(SEQ IDNO：19)，和C端(带XhoI位点)：
5′-GGAAGGCTCGAGTCATGATTGGTTTCCAGACAAATT-3′(SEQ IDNO：20)
聚合酶链式反应方案
采用下列方案扩增来自施氏假单胞菌的基因序列。初级的100μL PCR反应包含0.05μM每种69个内引物，0.4mM每种dNTP，10U rTth聚合酶XL(Roche，Indianapolis，IN)，0.625U Pfu聚合酶(Stratagene，La Jolla，CA)，1X XL缓冲液和1mMMg(OAc)2。所采用的热循环仪程序包括94℃热启动3分钟，15次重复以下步骤：94℃ 30秒，42℃ 30秒，和68℃ 15秒，之后10次重复以下步骤：94℃ 30秒，52℃ 30秒，和68℃ 30秒，之后10次重复以下步骤：94℃ 30秒，60℃ 30秒，和68℃ 1分钟15秒。最后10个循环后，将样品在68℃维持7分钟然后于4℃储存。这个PCR方案生成产物的成片条带在0.8％TAE-琼脂糖凝胶中的～0.5kb。
采用初级PCR反应作为模板建立二级PCR反应。二级的100μL PCR反应包含2.5μL初级PCR反应物，0.5μM每种2个外引物(带NdeI和XhoI限制性位点)，0.4mM每种dNTP，10U rTth聚合酶XL，0.625U Pfu聚合酶，1X XL缓冲液和1mM Mg(OAc)2。所采用的热循环仪程序包括94℃热启动3分钟，10次重复以下步骤：94℃ 30秒，52℃ 30秒，和68℃ 1分钟30秒，之后15次重复以下步骤：94℃ 30秒，60℃ 30秒，和68℃ 1分钟30秒。15次重复之后，将样品在68℃维持7分钟然后于4℃储存。这个PCR方案生成了特征性产物条带在0.8％ TAE-琼脂糖凝胶中的～1.4kb。
采用Qiagen凝胶提取试剂盒(Valencia，CA)从0.8％TAE-琼脂糖凝胶中凝胶纯化PCR产物。按照生产商的方案(Invitrogen，Carlsbad，CA)，产物被TOPO克隆并转化进TOP10细胞。采用Qiagen spin小量制备试剂盒从制得的转化体中纯化质粒DNA并通过NcoI和SalI的限制性消化筛选正确的插入物。表现为具有正确插入物的质粒的序列可通过带有通用M13正向和M13反向引物的双脱氧链终止DNA测序仪来确认。对其中10个克隆测序后，所有都具有由期望序列的至少一种突变。最佳的克隆具有引起氨基酸改变的单碱基对突变。采用快变诱变方案按照生产商推荐(Stratagene，La Jolla，CA)修正这个克隆的序列。
按照生产商推荐的方案(New England Biolabs，Beverly，MA)以限制性酶NdeI和XhoI消化修正的TOPO克隆并采用Qiagen凝胶提取试剂盒从0.8％TAE-琼脂糖凝胶中凝胶纯化。通过限制性酶NdeI和XhoI消化制备载体pET28和pET 30，随后以虾类磷酸化酶处理并采用Qiagen凝胶提取试剂盒从0.8％TAE-琼脂糖凝胶中纯化。
采用NEB快连接试剂盒(Beverly，MA)连接消化的载体和插入物。将大约50ng处理的插入物，100ng处理的载体(插入物与载体的摩尔比3:1)，5UT4 DNA连接酶，和1X连接缓冲液在室温下温育5分钟。以化学方法将连接混合物转化进TOP10F′感受态细胞(Invitrogen)。在37℃ 225rpm振荡下以0.25mL室温SOC回收细胞1小时。将细胞涂布在含卡那霉素(50μg/mL)的LB平板上。利用Qiagen spin小量制备试剂盒从制得的转化体中纯化质粒DNA，并通过NdeI和XhoI的限制性消化筛选正确插入物。
基因表达和试验
质粒DNA被转化进大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)(Novagen，Madison，WI)。培养物生长并利用Qiagen小量制备试剂盒分离质粒，通过限制性消化分析以确认同一性。
对pET 28(组氨酸标记)和pET 30(未标记)载体中的施氏假单胞菌D-4-羟基苯基甘氨酸氨基转移酶实施诱导。进行了时程研究，让培养物在250mL含卡那霉素(50μg/mL)的LB中生长至OD600为0.5-0.6并以100mM IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)诱导，在诱导后0和3小时取样。来自0小时和3小时的适宜体积细胞被重悬在40μL含2-巯基乙醇的十二烷基硫酸钠缓冲液中，并在95℃加热10分钟，再冷却。采用4-15％梯度凝胶通过SDS-PAGE分析这类总细胞蛋白样品份。
还从3小时培养物中制备了细胞提取物，通过采用含0.625μL benzonase核酸酶和3μL蛋白酶抑制剂调配液#3的0.625mL Novagen BugBusterTM试剂(Calbiochem-Novabiochem Corp.，San Diego，CA)在室温下温和振荡20分钟以悬浮来自5mL培养物的细胞团，并在16000xg离心以去除细胞碎片。上清液(细胞提取物)被点样到4-15％梯度凝胶中以分析细胞可溶蛋白。之后，采用组氨酸结合900柱按照生产商的方案(Novagen，Madison，WI)纯化蛋白并采用PD-10柱(G25 Sephadex，Arnersham-Pharmacia)脱盐以去除咪唑。
(2)含D-苯基甘氨酸氨基转移酶(＂DPGAT＂)的生物体的分离
按以下方式分离含立体转化D-苯基甘氨酸氨基转移酶(也被称为D-4-羟基苯基甘氨酸氨基转移酶)的假单胞菌属和类属。将土壤样品接种于含以下培养基的培养皿上：(每升)15g琼脂，3.4g KH2PO4，3.55g Na2HPO4，0.2gMgSO4-7H2O，8mg CaCl2-2H2O，10mg酵母提取物，1ml 1000x痕量元素溶液(Balch，W.E.，等，＂Methanogens：reevaluation of a unique biological group，＂Microbiol.Rev.43：260-296，(1979))，和1g D-苯基甘氨酸(D-4-羟基苯基甘氨酸)。
如下通过PCR检测分离物中立体转化氨基转移酶(由已知的D-苯基甘氨酸氨基转移酶设计引物)的存在或进一步富集以检测立体转化氨基转移酶的存在：来自平板的分离物在不含琼脂的上述液体培养基上30℃振荡生长至OD600约1.0。通过离心收集细胞并以0.85％ NaCl洗涤两次。将10mg(湿重)样品悬浮在1ml磷酸钾缓冲液(pH7.0)和5mMD-苯基甘氨酸或D-4-羟基苯基甘氨酸。将被中和的15mM(氨氧基)醋酸加入按上述所制备的平行样品中。通过HPLC测量D-苯基甘氨酸(或D-4-羟基苯基甘氨酸)的消耗。
选择能够降解D-苯基甘氨酸(或D-4-羟基苯基甘氨酸)、但存在(氨氧基)醋酸时降解速率降低的分离物作进一步分析。通过PCR检测分离物中立体转化氨基转移酶(由已知的D-苯基甘氨酸氨基转移酶设计引物)的存在。
通过在上述液体培养基中生长培养物来证实立体转化氨基转移酶的存在，收集细胞并制备无细胞原提取物(＂CFE＂)检测D-苯基甘氨酸氨基转移酶或D-4-羟基苯基甘氨酸氨基转移酶的活性。将CFE加入具有以下终浓度的反应混合物中：0.1M 3-(环己胺)-1-丙磺酸(＂CAPS＂)(pH9.5)，60mM L-谷氨酸(钠盐)，5mM苯酰甲酸甲酯或4-羟基苯甲酸和50μM PLP。
通过将CFE加入含以下浓度的反应混合物中测定逆反应：50mM磷酸钾(pH7.0)，60mM D-苯基甘氨酸或D-4-羟基苯基甘氨酸，5mM α-酮戊二酸，和50μM PLP。试验在35℃温育将在时间点取样并通过煮沸2分钟终止。通过GiI-Av，E.，等，＂Resolution of underivatized amino acids by reversed phasechromatography，＂J.Am.Chem.Soc，102：5115-5117，(1980)的HLPC方法或通过实施例1所述测量生成谷氨酸的方法定量产物。
作为PCR方法的替换方案，通过常规蛋白纯化技术，包括硫酸铵分级，和常规柱层析从分离的芽孢杆菌中纯化立体转化D-苯基甘氨酸氨基转移酶。一旦蛋白被纯化至合理纯度，即可采用多肽微测序技术或常规Edman氨基酸测序(参见http://golgi.harvard.edu/microchem/对于使用这类技术的方案和设备说明)。可根据从最接近的已知相关蛋白源获得的序列设计简并引物。然后按照已建立的方案进行简并PCR和基因组步行以分离立体转化D-苯基甘氨酸氨基转移酶的编码序列。
(3)DPGAT莫纳甜的生成
如以上(1)和(2)所述的D-羟基苯基甘氨酸氨基转移酶被用于原无细胞蛋白提取物，或按以上(1)所述的纯化。按WO 03/091396 A2实施例1中所述制备苜蓿中华根瘤菌和球形红细菌酪氨酸(芳族)氨基转移酶。按WO 03/091396A2实施例4中所述制备睾丸酮丛毛单胞杆菌ProA醛缩酶。利用Bio-Rad总蛋白试验按照生产商的方案(Hercules，CA)进行总蛋白试验。
反应混合物(1mL体积，平行进行)中含有100mM磷酸钾缓冲液(pH8)，2mM MgCl2，0.05mM5’磷酸吡哆醛(＂PLP＂)，200mM丙酮酸钠，5mM α-酮戊二酸钠，大约280μg/mL以细胞提取物供应的苜蓿中华根瘤菌TatA，100μL/mL D-羟基苯基甘氨酸氨基转移酶细胞提取物或1mg/mL纯化的D-羟基苯基甘氨酸氨基转移酶，和大约100μg/mL以细胞提取物供应的ProA醛缩酶。加入固体色氨酸至浓度10.2mg/ml。建立不含有D-羟基苯基甘氨酸氨基转移酶的阴性对照。样品在30℃温和振荡下温育约1小时或过夜。离心样品以去除沉淀，注射器过滤，并于-80℃储存，直至按实施例1所述采用LC/MS/MS方法分析莫纳甜。
采用本领域公知的诱变技术，包括诱变PCR，通过突变菌株，位点定向诱变，易错PCR，或通过如DNA混编或其它定向发展技术制备对莫纳甜生成具有改进活性的D-羟基苯基甘氨酸氨基转移酶。通过在以R，R莫纳甜作为氮源的基础培养基上的生长选择改进的D-羟基苯基甘氨酸氨基转移酶。开始，选择是基于生长，但对于选择改进的氨基转移酶，是基于生长速率进行筛选。即，培养含突变基因的细胞并在以R，R莫纳甜作为氮源的基础培养基上表达基因。比较含突变基因的细胞和未突变类型的生长速率。选择那些具有更快生长速率的细胞并进一步分析氨基转移酶。可进一步突变D-羟基苯基甘氨酸氨基转移酶直至获得所需的活性。
(4)DPGAT试验
如以上(1)所述表达不含组氨酸标签的DPGAT并将提取物用于试验。建立试验，其包含100mM磷酸钾pH7.0，60mM D-苯基甘氨酸，5mM α-酮戊二酸，和50μM 5’磷酸吡哆醛。在每ml试验体积中加入按该实施例之前所述制备得到的100μL提取物启动试验。在几个时间点(0，1，2，5，10，30，60，和120分钟)采取样品并以等体积的2M蚁酸终止。也在过夜温育后采取样品(～1200分钟)。通过实施例1所述的OPA方法分析样品中的谷氨酸生成。结果总结在下表33中。
表33
 
条件 时间(分钟) μM/mL L-谷氨酸
无底物 0 0.033
1 0.033
2 0.033
5 0.035
10 0.034
30 0.036
60 0.044
120 0.038
～1200 0.058
D-苯基甘氨酸 0 0.055
1 0.112
2 0.169
5 0.315
10 0.387
30 0.892
60 1.304
120 1.514
～1200 1.056
明显地，酶对D-苯基甘氨酸具有一定活性。还检测了对R，R莫纳甜的酶活性。按以上所述建立试验，其含有60mM浓度的R，R莫纳甜。结果如下表34所示。
表34
 
条件 时间(分钟) μM/mL L-谷氨酸
R，R莫纳甜 0 0.041
1 0.040
2 0.041
5 0.041
10 0.041
30 0.042
60 0.041
120 0.040
～1200 0.045
对R，R莫纳甜没有表现出任何可检测活性。但是，可以预期的是任意或该实施例(3)中所述的SDM方法可被用于改进对R，R莫纳甜或R-MP的转氨活性。例如，已经完成了施氏假单胞菌酶的结晶和初步分析。Kongsaeree，P，等，Acta Cryst.D5P：953-954，(2003)。一旦结构被公开，可采用软件如Accelrys完成分子对接实验以测定哪里的空间位阻或离子排斥会抑制R，R莫纳甜与D-羟基苯基甘氨酸底物结合位点的结合。D-羟基苯基甘氨酸是较大的分子，R，R莫纳甜也是。两种成分都具有疏水区域和羟基。如实施例6所述可对结合口袋进行修饰以使酶更适合于二羧酸底物。例如，接近第二个羧基的残基被修饰成碱性的如精氨酸。此外，在部分(1)中所述的恶臭假单胞菌基因和可按(2)中所述被分离的其它基因可作为基因混编的模板。此外，可采用寡核苷酸改组或其它诱意突变方法诱变在该实施例中收集的施氏假单胞菌，并按以上(3)所述进行筛选。
实施例11
D-甲硫氨酸氨基转移酶基因的发现
背景
D-甲硫氨酸-丙酮酸氨基转移酶(EC 2.6.1.41)被认为是另一个立体转化转氨酶，尽管是很少的。该酶促进D-甲硫氨酸和丙酮酸向L-丙氨酸和4-甲硫-2-酮丁酸的可逆转化。草酰乙酸，苯基丙酮酸，2-酮丁酸，2-酮戊酸，2-酮庚酸，乙醛酸，和酮戊二酸也可作为氨基受体。
D或L甲硫氨酸的转氨反应被认为是高等植物(花椰菜，番茄，苹果，豌豆，香蕉，花生)以及土壤微生物(大肠杆菌，假单胞菌豌豆致病变种(Pseudomonas pisi)，铜绿假单胞菌，蕈状芽孢杆菌(Bacillus mycoides)，乙酸钙不动杆菌，嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)B12E，三叶草根瘤菌(Rhizobium trifolii)N2P7，指状青霉(Penicillium digitatum)，酿酒酵母，棒状杆菌D7F)中乙烯生成途径的一部分。Billington，D.C.，等，Biochem J.182：827-836，(1978)。在细菌中，L-甲硫氨酸通常作为乙烯生成研究中底物而宽特异性酶如来自大肠杆菌的TyrB或AspC被认为是负责转氨反应的。但是，Primrose，S.B.，J.Gen.Microbiol.PJ：159-65，(1976)和Primrose，S.B.，J.Gen.Microbiol.98：519-528，(1977)中指出大肠杆菌的SPA O株(沃里克大学培养物保藏中心)由D-甲硫氨酸产生的乙烯几乎与批量培养物中由L-甲硫氨酸产生的一样多。由于在大肠杆菌未鉴别到宽特异性D-氨基转移酶，一种可能的解释是大肠杆菌D-氨基酸脱氢酶(由dadA基因所编码)将D-甲硫氨酸转化成4-甲硫-2-酮丁酸。在大肠杆菌中可能存在甲硫氨酸消旋酶，但没有文献公开了这种酶。
与大肠杆菌相反，相对于L-甲硫氨酸和丙酮酸当D-甲硫氨酸和丙酮酸被补给到酶提取物中时，花椰菜小花(线粒体提取制备物)和萌发中的豌豆种子中生成的乙烯更高。Mapson，L.W.，et ah，Biochem J.115：653-661，(1969)；Durham，J.I.，等，Phytochemistry 12：2123-2126，(1973)。因此，数据不支持甲硫氨酸和L-氨基转移酶的组合的可能性。通过透析花椰菜细胞提取物排除了脱氢酶活性；在试验混合物中不存在NAD。由于不消耗氧可排除氧化酶活性且不需要FAD。纯化了来自花生组织的D-甲硫氨酸氨基转移酶，表现为依赖PLP，并表现为不依赖L-甲硫氨酸氨基转移酶活性。有可能这些D-甲硫氨酸-丙酮酸氨基转移酶实际上生成D-丙氨酸作为副产物(类似于实施例2和3所述的芽孢杆菌酶)且细胞含有丙氨酸消旋酶可将D-丙氨酸再生成L-丙氨酸(或类似的氨基供体)。另一种情况，从高等植物中发现的宽特异性D-氨基转移酶有利于发展生成R，R莫纳甜或S，S莫纳甜的方法。
实验综述
利用标准层析方案和Pharmacia AKTA Explorer系统从花椰菜小花和萌发中的豌豆胚中部分纯化D-甲硫氨酸氨基转移酶。通过LC/MS/MS指纹图谱技术并利用哈佛痕量化学工具搜索数据库以测定同源蛋白的蛋白序列。通过标准PCR方案或通过实施例10(7)所述的基因合成从cDNA文库中克隆植物基因的编码区域。
可选地，由在D-甲硫氨酸存在(并生成乙烯)下生长的花椰菜组织或花生种子构建cDNA表达文库(Stratagene，La Jolla，CA)。文库被转化进来自大肠杆菌基因储藏中心(耶鲁)的大肠杆菌甲硫氨酸营养缺陷型如RC519或AB1931株。能在含D-甲硫氨酸的基础培养基中生长的菌株的质粒含有感兴趣的编码区域(参见实施例4(1)，类似筛选技术)。
一旦获取感兴趣的编码区域并在标准大肠杆菌实验室株中表达，制得的基因产物可用于实施例10(3)所述的生成R，R莫纳甜的试验以替代D-羟基苯基甘氨酸氨基转移酶，除了pH为7.5之外(氨基转移酶的最适pH)。若D-甲硫氨酸氨基转移酶对氨基供体底物有严格要求，则该酶可用于如实施例2和3所述的制备R，R莫纳甜。该基因可被诱变并按实施例10(3)所述筛选增强的活性。
方法
从花椰菜分离
通过搅拌器交替浸泡和混合以400mL4℃蔗糖/缓冲溶液(0.4M蔗糖和0.1M磷酸钠缓冲液pH7.4)提取了400g新鲜采摘的花椰菜小花。通过纱布过滤以去除细胞碎片并在4℃下40000xg离心30分钟。固体材料(含线粒体)被重悬在20mL 10mM磷酸钠缓冲液pH7.4并以200mL冷丙酮(-30℃)提取酶。再将悬浮液离心并采用Savant Speed Vac干燥沉淀。以10mM磷酸钠缓冲液pH7.4溶解固体材料并用PD-10柱去除残留的丙酮。
通过在0.1M磷酸钠缓冲液pH7.4温育5mM D-甲硫氨酸，1mM丙酮酸，0.05mM PLP和2mMEDTA以及酶制备物以试验氨基转移酶活性。试验在25℃下进行16小时。利用LC/MS(m/z为328)和与实施例1类似的技术通过形成2，4-二硝基苯腙衍生物测定4-甲硫基-2-酮丁酸。制备了含0.4％(w/v)2，4-二硝基苯腙的2M硫酸溶液，并在温育后将一半体积加入试验混合物中。混合物在30℃温和振荡下混合30分钟并通过离心收集沉淀进行LC/MS分析。以类似方式试验了通过标准层析技术分离的蛋白部分的活性，但通过实施例1所述OPA柱后衍生技术测定共产物丙氨酸。
从花生分离(Arachia hypogea L.cv.Starr，)
按照Durham，J.I.，et al.，Phytochemistry 12：2123-2126，(1973)的方法从萌发中的花生胚匀浆物(去除了子叶)中纯化D-甲硫氨酸氨基转移酶。在原提取物制备中使用还原剂以稳定酶，并通过33,000xg离心去除细胞碎片。通过低温温育并移除沉淀中的蛋白进一步纯化35-50％硫酸铵部分。采用丙酮进一步分级上清液。然后通过凝胶过滤层析(Sephadex 200 G.E.Healthcare，Piscataway，NJ)进一步纯化活性部分。
因为蛋白部分富含转氨酶蛋白，采用2D-凝胶电泳分离感兴趣酶以用于微测序。在清楚阐述存于NCBI的植物序列中的同源编码区后，利用标准分子生物学技术在大肠杆菌中重组生成D-氨基转移酶蛋白。可以期望的是来自花椰菜小花或花生种子或重组生成的同源酶的细胞提取物可用于实施例10(3)所述(若为立体转化转氨酶)或实施例2和3所述(若为宽特异性D-氨基转移酶)的R，R莫纳甜生成中。
实施例12
L-丙氨酸氨基转移酶/丙氨酸消旋酶/D-丙氨酸氨基转移酶
图8图示了采用L-氨基酸氨基转移酶(例如L-芳族氨基转移酶，L-丙氨酸氨基转移酶和/或L-色氨酸氨基转移酶)，R-特异性消旋酶，丙氨酸消旋酶和D-丙氨酸氨基转移酶由L-色氨酸生成富含立体异构体R，R莫纳甜的生物合成途径。
实施例6中描述了色氨酸特异性氨基转移酶。可选的，如WO 03/091396A2实施例1所述制备了苜蓿中华根瘤菌和球形红芽孢杆菌酪氨酸(芳族)氨基转移酶。如WO 03/091396 A2实施例4所述制备了睾丸酮丛毛单胞杆菌ProA醛缩酶。采用Bio-Rad蛋白试验按照生产商的方案(Hercules，CA)完成了总蛋白试验。丙氨酸消旋酶从Sigma(St.Louis，MO)(目录号A8936)购买。D-丙氨酸氨基转移酶从BioCatalytics(Pasadena，CA)(目录号AT-103)购买。
L-丙氨酸氨基转移酶广泛分布在真核生物，细菌和古细菌中。经鉴定(根据序列同源性)以下生物体含有L-丙氨酸氨基转移酶(EC2.6.1.2)：拟南芥，棉阿舒囊霉(Ashbya gossypii)，棕色固氮菌，长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)，小秀丽线虫(Caenorhabditis elegans)，白色念珠菌(Candida albicans)，光滑念珠菌(Candida glabrata)，莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)，新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)，汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)，智人(Homo sapiens)，大麦(Hordeum vulgare)，乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)，稻瘟菌(Magnaporthe grisea)，蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)，小家属(Mus musculus)，粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)，水稻(Oryza sativa)，黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)，火炬松(Pinus taeda)，恶臭假单孢菌，深海热球菌(Pyrococcus abyssi)，强烈火球菌(Pyrococcus furiosus)，嗜热古细菌(Pyrococcus horikoshii)，褐家鼠(Rattus norvegicus)，酿酒酵母，栗酒裂殖酵母，红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)，克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)，霍乱弧菌，副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)，创伤弧菌(Vibrio vulnificus)，解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)，和玉米(Zea mays)。此外，许多氨基转移酶具有低水平的丙氨酸氨基转移酶活性，且给定高水平的L-谷氨酸和丙酮酸可将其转化成L-丙氨酸和α-酮戊二酸。通过标准诱变技术如易错PCR和经由突变菌株，或通过定向发展技术改进低活性的酶。利用公开有效的序列设计引物并采用标准的扩增，克隆，表达和纯化基因/酶的技术克隆L-丙氨酸氨基转移酶基因。
反应混合物(1mL体积，平行进行)含有100mM磷酸钾缓冲液(pH8)，2mM MgCl2，0.05mM5’磷酸吡哆醛(＂PLP＂)，200mM丙酮酸钠，5mM α-酮戊二酸，大约280μg/mL以细胞提取物供应的苜蓿中华根瘤菌TatA(或其它L-色氨酸特异性氨基转移酶)(如实施例4(5)部分)，100μg L-丙氨酸氨基转移酶，100μL/mL丙氨酸消旋酶细胞提取物或1mg/mL纯化丙氨酸消旋酶(Sigma)，大约280μg/mL以细胞提取物供应的宽特异性D-丙氨酸氨基转移酶(实施例15和18包含可用于该反应的D-氨基转移酶实例)和大约100μg/mL以细胞提取物供应的ProA醛缩酶。加入固体色氨酸至浓度10.2mg/ml。阴性对照不含有丙氨酸消旋酶。样品在30℃下温育约1小时或过夜。离心样品以去除沉淀，注射器过滤，并按实施例1所述采用LC/MS/MS方法分析莫纳甜，储存于-80℃。
实施例13
从酶促反应混合物中纯化R，R莫纳甜
从以下反应混合物中纯化产物R，R莫纳甜。在0.33升体积中，室温下将50mM碳酸氢铵，pH8.2，4mM MgCl2，0.05mM磷酸吡哆醛(＂PLP＂)，200mM丙酮酸钠，和50mM D-色氨酸混合于500mL玻璃瓶中直至色氨酸溶解。用氮气吹洗液体几分钟，然后加入3.0mg/mL Biocatalytics，Inc.(Pasadena，CA)宽特异性D-转氨酶(目录号# AT-103)和0.1mg/mL纯化的SEQ ID NO：22的醛缩酶。在室温下温和搅动反应混合物。醛缩酶按实施例3所述纯化。在混合物开始制好后的15小时和22小时以固体加入额外份的50mM D-色氨酸。每次加入后以氮气吹洗上部空间。虽然所加的色氨酸没有全部溶解，但浓度维持在约50mM。40小时后，将剩余固体色氨酸过滤掉。由柱后荧光检测液相色谱(参见实施例1)对反应混合物的分析显示出溶液中色氨酸浓度是49mM而莫纳甜浓度是3.9mM。
通过两步离子交换层析步骤纯化产物莫纳甜。首先将过滤好的反应溶液加到BioRad AG50W-X8树脂柱中(140mL；结合容量为1.7meq/mL)。以2 x 150mL H2O洗涤柱然后用1M NH4OH(1 x 450mL，之后3 x 150mL)进行洗脱。NH4OH部分是结合的，以HCl中和并通过Whatman(Maidstone，England)玻璃微纤维过滤器和German Sciences(AnnArbor，MI)0.45μm过滤器连续过滤。然后采用具有YM100(MWCO 100kDa)的Amicon(Millipore；Billerica，MA)超滤搅拌釜(8200型)超滤澄清溶液。采用带温水浴的roto-蒸发器将超滤的滤液蒸发至大约160mL。通过玻璃微纤维过滤器过滤再次澄清液体。
将制得的溶液加到之前已通过以0.5L 1M NaOH，H2O，和1.0M碳酸氢铵洗涤再额外加水洗涤而转化成碳酸氢盐形式的1L快流速DEAE琼脂糖凝胶柱(Amersham Biosciences)。以<2mL/min加入溶液并以3-4mL/min加水洗涤直至在280nm处的吸收<1。以50mM碳酸氢铵，pH8.3(2.5L)洗脱R，R莫纳甜。采用带温水浴的roto-蒸发器蒸发这部分洗脱液。将得到的浆液在4℃下温育几天直至形成结晶。收集结晶，以冷100％乙醇洗涤并在真空干燥器中干燥(0.38g)。
采用FDAA衍生，之后以LC/MS/MS多反应监测分析固体产物的异构体纯度(参见实施例1)，显示样品是96.3％的R，R莫纳甜和3.7％ S，R莫纳甜。
还通过总莫纳甜方法(参见实施例1)分析了样品相对于其它有机化合物的纯度。以Photodiode阵列检测仪扫描200-500nm的UV吸收。根据总体的峰面积，莫纳甜占了面积的96.1％(包括R，R和S，S峰)。
由柱后荧光检测液相色谱对样品的分析显示了样品的氨基酸组成是98.8％的莫纳甜含痕量的色氨酸(1.2％)和丙氨酸(0.02％)。
Midwest Microlab，LLC(Indianapolis，IN)上进行了元素分析。该分析表明了样品含1％重量的不燃(有机)物质，和铵和碳酸氢盐残余物。
实施例14
在纯化期间改进D-氨基转移酶活性保持
纯化球形芽孢杆菌HIS6-D-丙氨酸氨基转移酶的标准程序
从BL21(DE3)::球形芽孢杆菌dat pET30a(实施例18)新鲜培养平板开始(含50μg/mL卡那霉素的LB琼脂)，细胞在5mL含50μg/mL卡那霉素的Luria-Bertani肉汤(＂LB＂)于37℃225rpm下生长3-5小时。随后，培养物在0.25％(v/v)被转移到含Novagen过夜表达系统II溶液1-6(EMD Bioscience，Madison，WI)外加50μg/mL卡那霉素的烧瓶中。细胞在37℃225rpm下过夜生长(16-18小时)。当OD600为大约8.0时，在带JS-16.25转子的Beckman(Fullerton，CA)J25II离心机中以10,000rpm离心10分钟收集细胞。用50mMEPPS缓冲液(pH8.2)洗涤细胞团一次，并再次离心细胞。收集洗涤后的细胞团立即使用或于-80℃冷冻直至需要纯化。
为制备含球形芽孢杆菌HIS6-D-丙氨酸氨基转移酶(HIS6-BsphDAT)蛋白的无细胞提取物，以3-4体积的50mM EPPS，pH8.2悬浮细胞，然后用Microfluidics(Newton，MA)均质机(在20,000psi 3孔)分散，保持悬浮液温度低于15℃。之后所有纯化步骤均在4℃进行。将细胞提取物在15,000xg离心15分钟以去除细胞碎片。轻轻移出上清液立即使用或于-80℃冷冻。将一份无细胞提取物加入之前已用含200mM氯化钠的50mM EPPS，pH8.2平衡过的Novagen组氨酸结合柱(目录#70971-4)或GE Healthcare(Piscataway，NJ)螯合琼脂糖凝胶TM快流速树脂柱(nickel(II)形式)(以1.2-1.5v/v比例)中。加入样品后，以3-5体积的平衡缓冲液，3-5体积含25mM咪唑的平衡缓冲液，3-5体积含100mM咪唑的平衡缓冲液和3-5体积含500mM咪唑的平衡缓冲液连续洗涤/洗脱柱。在最后一次洗涤中HIS6-BsphDAT被洗脱。利用Amicon(Billerica，MA)Centricon-70或Ultra-15离心过滤装置(MWCO 10kDa)将500mM咪唑洗液浓缩2-10X。之前已用含50μM PLP的50mM EPPS，pH8.2平衡过的一次性GE Healthcare PD10脱盐柱去除咪唑和氯化钠。
利用Pierce BCA分析试剂盒(Rockford，IL)测定脱盐后溶液中的蛋白浓度。采用Bio-Rad(Hercules，CA)Experion Pro260毛细管芯片系统或通过4-15％梯度凝胶的SDS-PAGE测定每种洗脱液的纯度和无细胞提取物部分的表达水平。通常该过程生成多于300mg的酶(来自600mL过夜表达II培养)，经Experion软件判断其纯度为～90％。纯化的酶按份(1-5mL)储存于-80℃直至使用。
改进程序
如上制备无细胞提取物。类似的His6-BsphDAT蛋白纯化但有以下变化：用于细胞裂解和蛋白纯化的所有缓冲液含有100mM磷酸钾，pH7.8，和50μMPLP。仅用GE Healthcare螯合琼脂糖凝胶TM快流速树脂(nickel(II)形式)纯化蛋白。
活性试验
利用通过两种纯化程序制备的酶试验由色氨酸和丙酮酸生成吲哚-3-丙酮酸。反应混合物含有100mM磷酸钾，pH7.8，0.05mM磷酸吡哆醛，100mM丙酮酸钠，40mM D-色氨酸，和0.03-0.1mg/mL纯化的酶。以固体形式加入色氨酸。除酶以外所有成分被混合在一起并于30℃温育直至色氨酸溶解。然后加入酶并将反应溶液在室温下温育。在预定的时间点，对反应取样并将样品立即在冰上储存，稀释后按实施例1所述柱后荧光检测液相色谱法进行丙氨酸分析。下表34列出了以每分钟每mg酶所形成的丙氨酸浓度表示酶制备物的比活性。
表34：改进纯化程序对酶活性的影响
 
酶制备物 比活性(μM丙氨酸(mg)-1(min)-1)
无50μM PLP纯化的His6-BsphDAT 2.9
含50μM PLP纯化的His6-BsphDAT 14.2
表34所示的结果表明纯化过程中使用磷酸吡哆醛导致活性增强。
实施例15
两种新型芽孢杆菌D-氨基酸氨基转移酶的克隆
如实施例18所述重组制备了几种芽孢杆菌D-氨基酸氨基转移酶(EC2.6.1.21，也称为D-丙氨酸氨基转移酶或D-天冬氨酸氨基转移酶)以用于生成R，R莫纳甜的相关试验。这些酶与之前公开的用于生成莫纳甜的D-氨基转移酶(美国公开号No.20040063175和美国公开号No.2005282260)是同源的。用于选择可能含有新型D-氨基酸氨基转移酶(＂DAAT＂)候选菌株的途径是浏览ATCC中所保藏的球形芽孢杆菌列表并分析某些之前保藏在不同种名下的菌株。以下生物体来自ATCC：ATCC 4978—原来以旋转芽孢杆菌(Bacillusrotans)保藏的球形芽孢杆菌和ATCC 7063—原来以Bacillus serositidis保藏的球形芽孢杆菌和ATCC 21538—原来以环状芽孢杆菌(Bacilluscir culans)保藏的球形芽孢杆菌。将来自球形芽孢杆菌，耐盐芽孢杆菌(Bacillus halodurans)，嗜热脂肪土芽孢杆菌，蜡状芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌，和地衣芽孢杆菌的已知DAAT蛋白序列集结以获取不同DAAT蛋白间保守的序列区域。根据蛋白序列保守区设计引物并用于聚合酶链式反应(＂PCR＂)扩增来自上述ATCC菌株的DAAT基因序列。
根据公开芽孢杆菌DAAT序列比对的保守区域设计了5个PCR引物。(参见图9的比对)。
聚合酶链式反应方案
如上所述根据DAAT比对的保守区域设计了引物。寡核苷酸引物序列如下所示：5′GAAGACCGTGGTTATCAATTT3′(SEQ ID NO：65)(正向引物)，5′GATGGTATTTACGAAGTAATC3′(SEQ ID NO：66)(正向引物)，5′AGATTTAATATCACAACGTAAC3′(SEQ ID NO：67)(反向引物)，5′GCCAAGTAAAATTTAAGATTTA3′(SEQ ID NO：68)(反向引物)，5′ATTTGCTGGGTGCGTATAAAG3′(SEQ ID NO：69)(反向引物)。基于引物组合比对和已知DAAT所预计的PCR片段大小为：SEQ ID NO：65和SEQ IDNO：67-大约380bp，SEQ ID NO：65和SEQ ID NO：68-大约395bp，SEQ IDNO：65和SEQ ID NO：69-大约534bp，SEQ ID NO：66和SEQ ID NO：67-大约336bp，SEQ ID NO：66和SEQ ID NO：68-大约346bp，SEQ ID NO：66和SEQ ID NO：69-大约510bp。
将上述引物组合用于以下ATCC菌株的菌落PCR：ATCC 4978—原来以旋转芽孢杆菌保藏的球形芽孢杆菌；ATCC 7063—原来以Bacillus serositidis保藏的球形芽孢杆菌和ATCC 21538—原来以环状芽孢杆菌保藏的球形芽孢杆菌。
将上述三个菌株在营养琼脂上于30℃生长。从平板上挑出单菌落并用25μL灭菌蒸馏水重悬。在96℃10分钟裂解细胞。按以下进行PCR：每50μL反应中加入，5μL裂解细胞，0.8μL每种引物，2μL dNTP，0.8μL延伸高保真聚合酶(Roche，Indianapolis，IN)和1X延伸TM缓冲液。94℃热启动3分钟，之后按94℃30秒，40℃45秒，72℃2分钟循环15次。将退火温度提高至45℃再循环15次。最后，在72℃7分钟完成链延伸步骤。几个引物组合给出了上述菌株的预期大小的PCR产物。利用Zero Blunt 
Figure A200680055015D0107141730QIETU
克隆试剂盒按每个生产商的方案(Invitrogen)克隆PCR产物并通过Agencourt BioScienceCorporation(Beverly，MA)的双脱氧链终止DNA测序法进行测序。将DNA和氨基酸水平的序列与球形芽孢杆菌DAAT序列进行比对。从ATCC 4978，ATCC 7063和ATCC 21538三个菌株中获得了正确的DAAT/DAT序列。ATCC4978和ATCC 7063给出的PCR产物在翻译时所生成的具有不同氨基酸残基的蛋白相对于球形芽孢杆菌D-氨基转移酶序列发生改变。
进行基因组步行以获得ATCC 4978和ATCC 7063的完整基因序列。菌株ATCC4978在营养肉汤中于30℃生长。菌株ATCC7063在营养琼脂中生长。利用Gentra试剂盒(Gentra Systems，Minneapolis，MN)按生产商的方案制备了每个菌株的基因组DNA。按生产商的方案(BD基因组步行TM通用试剂盒，Clontech，www.Clontech.com)构建了对应每个菌株的4个文库。根据采用保守引物组合获得的序列(参见上文)按基因组步行TM生产商的方案设计了基因特异引物，可实现与原始产物有几百个同源碱基对重叠。随后将这些基因特异引物与基因组步行TM衔接头引物用于完整DAT ORFS的上游和下游序列的PCR。
基因特异寡核苷酸引物序列如下所示：
4978 DAT GSP1上游5′GACATGCTCCTCCGCTGTAAATAATTCACC3′(SEQ ID NO：70)
4978 DAT GSP1下游5′CCCTGGTGATGAAGTGAAGCCAGTATTAAC3′(SEQ ID NO：71)
4978 DAT GSP2上游5′ATCGCCAAATTGATAACCACGGTCTTC3′(SEQ ID NO：72)
4978 DAT GSP2下游5′ACGTCCCGTAGCAAACTTTGAAAAAGGTGT3′(SEQ ID NO：73)
7063 DAT GSP1上游5′TGCATAGAATCGGTCGATATGTTCAGTAGC3′(SEQ ID NO：74)
7063 DAT GSP1下游5′GCGGAGAAACGATTACAGAAGGTTCTTCAA3′(SEQ ID NO：75)
7063 DAT GSP2上游5′GTCACC AAATTGATAACC ACGGTCTTC 3′(SEQ ID NO：76)
7063 DAT GSP2下游5′GGTGTACTTTAT ACGCACCC AGCAAAT 3′(SEQ ID NO：77)
衔接头寡核苷酸引物序列如下所示：
AP1 5′GTAATACGACTCACTATAGGGC 3′(SEQ ID NO：78)
AP2 5′ACTATAGGGCACGCGTGGT 3′(SEQ ID NO：79)
如下进行初次基因组步行TMPCR：在每50μL反应中加入，2.5μL DNA文库，2μL每种引物(AP1(SEQ ID NO：78)和适宜的GSP1)，1.5μL dNTP，1X XLPCR缓冲液，1mM乙酸镁，和1μL RTTH聚合酶(Roche，Indianapolis，IN)。94℃热启动3分钟，之后按94℃ 30秒，55℃ 30秒，68℃ 1分钟循环10次。将退火温度降低至48℃再循环20次。最后，在68℃ 7分钟完成链延伸步骤。如下进行二次基因组步行TMPCR：在每50μL反应中加入，1.0μL初次PCR反应物(经1:50稀释)，2μL每种引物(AP2(SEQ ID NO：79)和适宜的GSP2)，1.5μL dNTPs，1X XL PCR缓冲液，1mM乙酸镁，和1μL RTTH聚合酶。94℃热启动3分钟，之后按94℃30秒，55℃30秒，68℃1分钟循环10次。将退火温度降低至48℃再循环15次。最后，在68℃ 7分钟完成链延伸步骤。
几个文库给出的PCR产物大小在～200bp至～1.5Kb的范围。将PCR产物进行TOPO克隆(如上所述)并通过Agencourt BioScience Corporation(Beverly，MA)的双脱氧链终止DNA测序法进行测序；将这些新序列与采用保守引物组合获得的原始序列进行比对并确认了起始和终止密码子，通过这种方式获得了完整的DAAT ORF。根据特定的完整DAAT序列设计新引物对(带有用于克隆的限制性位点)以分别从ATCC4978和7063菌株中PCR完整的DAAT基因。
寡核苷酸引物序列如下所示：
ATCC4978DAATNdeIF
5′GGCCTTGGCATATGAGTTATAGCTTATGGAATGACC 3′(SEQ IDNO：80)
ATCC4978DAATBamHIR
5′GGCCTTAAGGATCCTTATGCGCGAATACCTTTTGGG 3′(SEQ IDNO：81)
ATCC7063DAATNdeIF
5′GGCCTTGGCATATGAGCTACACTTTATGGAATGA 3′(SEQ IDNO：82)
ATCC7063DAATBamHIR2a
5′GGCCAAGGATCCGCTACCCACTAATCATTAGA3′(SEQ ID NO：83)
采用以下PCR方案扩增ATCC 4978和ATCC 7063 DAAT基因的编码区。在50μL反应中加入，3μL基因组DNA，0.8μL每种引物，2μL dNTPs，0.8μL延伸高保真聚合酶(Roche，Indianapolis，IN)，1X含Mg延伸TM缓冲液，和0.2μL PfU聚合酶(Stratagene，La Jolla，CA)。所用的热循环仪程序包括：94℃热启动3分钟，之后按以下步骤94℃ 30秒，50℃ 30秒，72℃ 90秒循环8次。随后在退火温度58℃下循环22次。最后在72℃保持7分钟进行链延伸步骤。两个菌株均获得了正确大小的洁净PCR产物(大约850bp的dat基因)。
利用Qiagen QIAquick PCR纯化试剂盒(Valencia，CA)纯化了ATCC 4978和ATCC 7063 DAAT基因的PCR产物，并在BamHI缓冲液(New EnglandBiolabs，Ipswich，MA)以NdeI和BamHI进行消化。通过Qiagen QIAquick凝胶提取试剂盒纯化经NdeI和BamHI消化的载体(pET28和pET30)和插入物。采用Roche快速DNA连接试剂盒(Roche)进行连接并通过QIAquick PCR纯化试剂盒进行纯化。通过0.2cm小池和Bio-Rad基因脉冲发生器II系统按Bio-Rad电穿孔手册将连接物转化到大肠杆菌DH10B。可在900μL SOC培养基37℃225rpm30分钟回收细胞。细胞被涂布在含卡那霉素(25μg/mL)的LB琼脂平板上。利用Qiagen spin小量制备试剂盒纯化质粒DNA并通过PCR和NdeI和BamHI的限制性消化筛选正确插入物。表现为具有正确插入的质粒的序列可通过Agencourt BioScience Corporation(Beverly，MA)的双脱氧链终止DNA测序仪来确认。序列分析证实了来自ATCC 4978和ATCC 7063的DAAT基因编码序列，其生成了SEQ ID NO：84(ATCC 4978 DAAT DNA序列)和SEQ ID NO：85(ATCC 7063 DAAT DNA序列)的DNA序列和SEQ IDNO：86(ATCC 4978 DAAT氨基酸序列)和SEQ ID NO：87(ATCC 7063 DAAT氨基酸序列)的氨基酸序列。
来自ATCC 4978和ATCC 7063的两种新型DAAT与球形芽孢杆菌DAAT比对结果如图10所示。
我们获得了ATCC 4978和ATCC 7063菌株的新型D-氨基转移酶，相对于球形芽孢杆菌D-氨基转移酶，其蛋白序列具有特征性氨基酸残基改变。来自ATCC 4978和ATCC 7063的DAAT与球形芽孢杆菌DAAT(ATCC 10208)仅有72％和67％的同一性。目前这两种菌株在ATCC都被列为球形芽孢杆菌，而它们被保藏为旋转芽孢杆菌和B.serositidis。根据序列比对并突出显示两种新型DAAT与球形芽孢杆菌DAAT之间的不同，鉴别出许多可用于评估(单独地或组合地)它们在R，R莫纳甜生物合成中增强DAAT活性的作用的候选残基，以及其它DAAT序列。
实施例16
ATCC 4978和ATCC 7063 DAAT蛋白的基因表达和试验
按实施例15所述来自ATCC 4978和ATCC 7063的新型DAAT(在pET载体中的)被转化进大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)(Novagen，Madison，WT)。采用上述方案培养细胞并通过Qiagen小量制备试剂盒分离质粒，如上所述通过限制性消化分析以确认质粒同一性。
通常在含卡那霉素(50μg/mL)的LB培养基上诱导DAAT基因。细胞在37℃生长至OD600为0.4-0.8，以0.1mMIPTG(异丙基硫代半乳糖苷)诱导，诱导后3-4小时取样。按照Novagen BugBusterTM试剂(含benzonase核酸酶并加入Roche完全蛋白酶抑制剂调配液)所带的方案制备细胞提取物。就在pET载体中的ATCC 4978和ATCC 7063基因产物而言，经SDS-PAGE鉴定都获得了具有预期分子量的可溶蛋白。利用无组氨酸标签的构建体(pET30)可观察到更高水平的可溶蛋白。BioRad Laboratories Experion自动化电泳台(Hercules，CA)分离细胞提取物中的可溶蛋白并利用1.1.98.0版的Experion软件分析浓度和表达百分比。
采用以下方案通过由丙酮酸和D-色氨酸(或R，R莫纳甜)生成丙氨酸来分析来自未标记构建体(pET30)的蛋白提取物的D-氨基转移酶活性。除非以下特别说明，平行的500μL反应是在100mM磷酸钾缓冲液(pH7.5)，80μM磷酸吡哆醛，25mM丙酮酸钠，和50mM D-色氨酸或R，R莫纳甜中进行。通过加入无细胞提取物(4978或7063)或纯化酶(球形芽孢杆菌)启动反应并在30℃温和振荡下温育15分钟-2小时。除非以下特别说明，为进行比较在每个试验中加入大约相同水平的总蛋白，而纯化的球形芽孢杆菌(ATCC号10208)作为基准酶。加入蚁酸至终浓度为百分之二以终止反应，通过离心去除沉淀的蛋白。还进行了不加蛋白的对照反应。也以零时间点作为阴性对照。按实施例1所述采用OPA衍生检测丙氨酸。平行反应的平均结果如下表35和36所示。
表35：ATCC 4978和ATCC 7063 D-氨基转移酶的转氨活性(15分钟)
 
D-氨基转移酶 丙氨酸(mM)以D-色氨酸作为底物 丙氨酸(mM)以R，R莫纳甜作为底物
ATCC 4978 7.78 0.32
ATCC 7063 0.28 0.025
球形芽孢杆菌(未标记) 11.93 3.57
表36：ATCC 4978和ATCC 7063 D-氨基转移酶的转氨活性(2小时)
 
D-氨基转移酶 丙氨酸(mM)以D-色氨酸作为底物 丙氨酸(mM)以R，R莫纳甜作为底物
ATCC 4978 16.46 2.33
ATCC 7063 2.51 0.21
球形芽孢杆菌(未标记) 13.73 12.23
因而，我们证实了来自ATCC 4978和ATCC 7063确实具有D-氨基酸氨基转移酶并具有生成R，R莫纳甜的能力。ATCC 4978 DAAT的活性高于从ATCC 7063 DAAT所观察到的。没有在4978和球形芽孢杆菌之间进行定量对比，因为4978未经纯化。
实施例17
采用来自ATCC 4978的DAAT生成R，R莫纳甜
还试验了来自ATCC 4978的氨基转移酶在由D-色氨酸生成莫纳甜的能力(如实施例3)。在每1mL反应混合物中添加以下物质：大约50μg醛缩酶(睾丸酮丛毛单胞杆菌ProA醛缩酶或SEQ ID NO：22的醛缩酶，纯化的)，4mMMgCl2，50mM D-色氨酸(以固体提供)，1.0mg D-氨基转移酶，100mM丙酮酸钠，100mM磷酸钾缓冲液pH7.5，和0.05mM PLP。平行进行实验，以不加氨基转移酶的作为阴性对照。样品在30℃温和振荡下温育不同时间长度。在采用这些方法生成的莫纳甜中仅能检测到立体异构体是R，R或S，R。按实施例1所述检测到的总莫纳甜和R，R莫纳甜百分比如下表37-39所述。表37-39中所述的结果都是平行反应的平均值。
表37：用于以大约50μg睾丸酮丛毛单胞杆菌ProA生成莫纳甜的球形芽孢杆菌和ATCC 4978 D-氨基转移酶的比较
 
D-氨基转移酶 总莫纳甜(mg/g DAT蛋白)15分钟 总莫纳甜(mg/g DAT蛋白)30分钟 总莫纳甜(mg/g DAT蛋白)1小时 总莫纳甜(mg/g DAT蛋白)2小时
ATCC 4978 419.3 598 1017 1348
球形芽孢杆菌(标记) 46.5 128 232 241
表38：用于以大约50μg睾丸酮丛毛单胞杆菌ProA生成莫纳甜的球形芽孢杆菌和ATCC 4978 D-氨基转移酶的比较
 
D-氨基转移酶 ％R，R莫纳甜15分钟 ％R，R莫纳甜30分钟 ％R，R莫纳甜1小时 ％R，R莫纳甜2小时
ATCC 4978 48.9 38.4 34.4 33.25
球形芽孢杆菌(标记) 72.3 63.4 56.1 53.5
表39：用于以大约50μgSEQ ID NO：22的醛缩酶生成莫纳甜的球形芽孢杆菌和ATCC 4978 D-氨基转移酶的比较
 
D-氨基转移酶 总莫纳甜(mg/g DAT蛋白)2小时 ％R，R莫纳甜2小时
ATCC 4978 501 92.1
球形芽孢杆菌(标记) 201 95.6
因而，我们证明了来自ATCC 4978的D-氨基酸氨基转移酶具有生成R，R莫纳甜的能力。当比较以mg莫纳甜/g蛋白的总莫纳甜产量，ATCC 4978DAAT的活性高于球形芽孢杆DAAT菌所观察到的。SEQ ID NO：22的R-特异性醛缩酶的采用使得形成的R，R莫纳甜占产生的莫纳甜总量的百分比有明显改进。
实施例18
克隆公开的芽孢杆菌D-氨基酸氨基转移酶
重组制备了几种芽孢杆菌D-氨基酸氨基转移酶(EC 2.6.1.21，也称为D-丙氨酸氨基转移酶或D-天冬氨酸氨基转移酶)以用于生成R，R莫纳甜的相关试验。这些酶与之前公开的用于生成莫纳甜的D-氨基转移酶(美国公开号No.20040063175和美国公开号No.2005282260)是同源的。
菌株
将球形芽孢杆菌(ATCC号10208)和地衣芽孢杆菌(ATCC 10716)在营养琼脂上30℃过夜生长。将菌落集置于100μL灭菌水中并在95℃加热5分钟以裂解细胞。取3μL用于后续的聚合酶链式反应(＂PCR＂)扩增。基因组DNA被排定为耐盐芽孢杆菌(ATCC号BAA-125D)并用水重悬至浓度100ng/μL。蜡状芽孢杆菌基因组DNA(ATCC号1-987D和14579D)也被用于克隆。
聚合酶链式反应方案
采用NcoI和BamHI位点，为将球形芽孢杆菌dat基因克隆进pET 28b和pET 30a载体(Novagen，Madison，WT)设计了引物。pET30构建体含有N端组氨酸标签和S标签，而pET28构建体未标记。
球形芽孢杆菌dat引物：
N端：S′-GATATACCATGGCATACTCATTATGGAATG-3′(SEQ IDNO：88)和C端：S′-GTTATCGGATCCTTAGGCATTAATTGAAATTG-3′(SEQID NO：89)。
采用NdeI和BamHI位点，为克隆进pET28b和pET 30a载体设计了地衣芽孢杆菌引物和耐盐芽孢杆菌引物。在该方案中，pET 30构建体未标记，而pET 38构建体含有小的N端组氨酸标签。
地衣芽孢杆菌dat引物：
N端：5′-GGCCGGTTCATATGAAAGTTCTTTTTAACGGC(SEQ IDNO：90)和
C端：5′-CCTTCCGGATCCTTAAACCGTTTTGGCTGTCT-3′(SEQ IDNO：91)
耐盐芽孢杆菌引物
N端5′-GATATACATATGGATTATTGCCTTTACCAA-3′(SEQ ID NO：92)和
C端：5′-GAATCCGGATCCTCACTGCTTCATCGCTGTTTG-3′(SEQ IDNO：93)
为蜡状芽孢杆菌编码序列设计了引物。一组引物可生成在NCBI以AE016877 gi：298990965138634...5139506(873bp)登录的所列序列。一组引物可生成类似于NCBI登录号AE017355 gi：49328240 4965653...4966537(885bp)的苏云金芽孢杆菌预测dat并带额外12bp上游的产物。设计的两组引物都带有N端NdeI和C端BamHI限制性位点。设计引物以克隆进pBAD-TOPO TA克隆。
蜡状芽孢杆菌引物：
N端5′-TAAGAGGAATAACATATGGCATACGAAAGATTT-3′(SEQ IDNO：94)和C端5′-GAATTCGGATCCTTAAGAAGATGACATATTGG-3′(较短的PCR产物)(SEQ ID NO：95)
N端5-TAAGAGGAATAACATATGGGATCGAAATTGGCA-3′(较长的PCR产物)(SEQ ID NO：96)
采用以下PCR方案扩增球形芽孢杆菌，耐盐芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌基因的编码区域。在50μL反应中，采用了3μL模板(2μL基因组DNA)，1.6μM每种引物，0.25mM每种dNTP，3.5U延伸高保真聚合酶(Roche，Indianapolis，IN)，和1X含Mg延伸TM缓冲液。所用的热循环仪程序包括：94℃热启动3分钟，之后按以下步骤94℃ 30秒，50℃ 30秒，72℃ 2分钟循环8次。随后在退火温度58℃下循环22次。30个循环后，将样品在72℃ 7分钟，然后储存于4℃。获得了正确大小的洁净PCR产物(对于dat基因，大约850bp)。
采用组合PCR技术构建了编码登录号AAA22252(gi：142542)蛋白的嗜热脂肪土芽孢杆菌dat(登录号J04460 gi：142541)。该基因/蛋白的来源经常被描述为芽孢杆菌种，热稳定芽孢杆菌种，或芽孢杆菌YM-1。组合过程如下：根据上述基因序列及其互补DNA序列从IDT排定了43个寡核苷酸(40mer)，其在正义和反义链之间有20个碱基对的重叠。用水将引物稀释至250μM并取每种引物5μL在微量离心管中混合在一起。按以下进行PCR：每100μL反应中加入1.5μL引物集，4μL dNTP，1X XL PCR缓冲液，1mM乙酸镁，2μL rTth聚合酶(Roche，Indianapolis，IN)，和0.25μL Pfu聚合酶(Stratagene，La Jolla，CA)。94℃热启动3分钟，之后按94℃ 30秒，40℃ 30秒，和68℃ 15秒循环15次。将退火温度增至44℃且延伸时间增至30秒(在68℃)再循环10次。退火温度48℃且延伸时间75秒再循环10次。最后，在68℃ 7分钟完成链延伸步骤。采用以下引物进行二次PCR，其为克隆设计了NdeI(N端)和BamHI(C端)：
N端5′-GGCCTTGGCATATGGGATACACTTTATGGAATGACC-3′(SEQID NO：97)和
C端5′-TTGGAACCGGATCCTTATATATGAAGCGGTTTTGG-3′(SEQID NO：98)
每100μL PCR中包含2.5μL初次反应物，0.4μL每种引物，3μL dNTPs，1X XL PCR缓冲液，1mM乙酸镁，2μL rTth聚合酶，和0.25μL Pfu聚合酶。94℃热启动3分钟，之后按94℃ 30秒，40℃ 30秒，和68℃ 90秒循环10次。将退火温度增至48℃再循环15次，最后在68℃ 7分钟完成链延伸步骤。利用来自二次PCR的模板进行三次PCR，并采用与二次PCR反应相同的条件。在琼脂糖凝胶中能观察到大约900bp的产物。
克隆
采用Qiagen QIAquick PCR纯化试剂盒(Valencia，CA)纯化球形芽孢杆菌DAT的PCR产物并在以BamHI缓冲液中以BamHI和NcoI进行消化(NewEngland Biolabs，Ipswich，MA)。利用Qiagen QIAquick凝胶提取试剂盒纯化消化的载体(pET28和pET30)和插入物。采用Roche快速DNA连接试剂盒(Roche)进行连接并通过QIAquick PCR纯化试剂盒来纯化。利用0.2cm小池和Bio-Rad基因脉冲发生器II系统按Bio-Rad电穿孔手册所述将连接物转化到大肠杆菌DH10B中。可在900μL SOC培养基37℃ 225rpm30分钟回收细胞。细胞被涂布在含卡那霉素(25μg/mL)的LB琼脂平板上。利用Qiagenspin小量制备试剂盒纯化质粒DNA并通过BamHI和NcoI的限制性消化筛选正确插入物。表现为具有正确插入物的质粒的序列可通过AgencourtBioScience Corporation(Beverly，MA)的双脱氧链终止DNA测序仪来确认。测序证实的编码序列在NCBI登录号AF081278区：134..985(gi：3513754)，其生成具有如登录号AAC33964(gi：3513755)所列的氨基酸序列的蛋白。
凝胶纯化地衣芽孢杆菌DAT(～850bp)和嗜热脂肪土芽孢杆菌的PCR产物并采用Zero Blunt 
Figure A200680055015D0117142702QIETU
克隆试剂盒按每个生产商的方案(Invitrogen)进行克隆。采用化学方法将质粒转化到TOP10感受态细胞中以初步筛选。通过限制性消化筛选质粒DNA且序列被证实以与在NCBI中地衣芽孢杆菌的编码序列匹配，匹配序列的登录号U26947区247..1098(gi：857560)，其生成具有如登录号P54692(gi：1706292)所列的氨基酸序列的蛋白，除了在429位有一个从A至G的沉默突变。对于嗜热脂肪土芽孢杆菌，序列与上述登录号匹配。通过限制性消化(NdeI/BamHI)，连接到pET载体上，并电转化到DH10B感受太细胞以扩增来亚克隆编码区域。
同上凝胶纯化耐盐芽孢杆菌DAT的PCR产物并以NdeI和BamHI消化再连接到pET 28和pET 30载体上。在DH10B细胞中扩增载体。通过PCR筛选小量制备DNA并确认序列。可发现该基因序列为登录号NC_002570(gi：57596592)2934903..2935754，其编码氨基酸序列登录号NP_243677(gi：15615374)的蛋白。
采用典型PCR方案扩增蜡状芽孢杆菌的编码序列并按照生产商方案(Invitrogen)克隆。
基因表达和试验
质粒DNA(pET载体)被亚克隆进大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)(Novagen，Madison，WI)用于pET载体中的构建体。培养物生长并利用Qiagen小量制备试剂盒分离质粒，通过限制性消化分析以确认同一性。一般在含卡那霉素(50μg/mL)的LB培养基上进行诱导。细胞在37℃生长至OD600为0.4-0.8并以0.1mM IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)诱导，诱导后3-4小时取样。按照Novagen BugBusterTM试剂(含benzonase核酸酶并加入Roche完全蛋白酶抑制剂调配液)所带的方案制备细胞提取物。经SDS-PAGE鉴定，对于两种耐盐芽孢杆菌基因产物，两种球形芽孢杆菌基因产物，两种嗜热脂肪土芽孢杆菌基因产物和未标记的地衣芽孢杆菌基因产物都获得了高水平的预期分子量的可溶蛋白。对于采用了纯化蛋白的反应，利用组氨酸结合柱按照生产商方案(Novagen，Madison，WT)纯化组氨酸标记基因产物。在PD-10柱(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)上将洗脱部分脱盐并以25-100mM磷酸钾缓冲液，pH7.5洗脱。Pierce BCA试剂盒进行总蛋白试验，并从SDS-PAGE估计表达百分比。可选地，在BioRad Laboratories Experion自动化电泳台上分离细胞提取物中的可溶蛋白并采用1.1.98.0版本的Experion软件分析浓度和表达百分比。按Invitrogen所推荐地表达含有蜡状芽孢杆菌基因的pBAD-TOPO构建体，但就DAAT表达水平而言在SDS-PAGE分析中重组蛋白与其他蛋白没有区别。
采用以下方案由丙酮酸和D-色氨酸(或R，R莫纳甜)生成丙氨酸来分析细胞提取物的D-氨基转移酶活性。平行的1mL反应通常是在100mM磷酸钾缓冲液(pH7.5)，50μM磷酸吡哆醛，25mM丙酮酸钠，和50mM D-色氨酸或R，R莫纳甜中进行。通过加入无细胞提取物或纯化酶启动反应并在30℃温和振荡下温育15分钟-过夜。为进行比较在每个试验中加入大约相同水平的D-氨基转移酶(通常接近0.5mg)，而AT-103(BioCatalytics)作为阳性对照(或基准)。加入蚁酸至终浓度为百分之二以终止反应，通过离心去除沉淀的蛋白。还进行了不加蛋白的对照反应。也以零时间点作为阴性对照。按实施例1所述采用OPA衍生检测丙氨酸。
还检测了氨基转移酶由D-色氨酸生成莫纳甜的能力(如实施例3)。在每1mL反应混合物中添加以下物质：大约50-100μg醛缩酶(通常是睾丸酮丛毛单胞杆菌ProA醛缩酶，纯化的)，4mM MgCl2，50mM D-色氨酸(以固体提供)，0.5-2mg D-氨基转移酶，200mM丙酮酸钠，100mM磷酸钾缓冲液pH7.5，和0.05mM PLP。平行进行实验，以不加氨基转移酶的作为阴性对照。样品在30℃温和振荡下温育1小时，2小时，和过夜(17-20小时)。在采用这些方法生成的莫纳甜中仅能检测到立体异构体是R，R或S，R。通过反相LC峰面积测定的R，R百分比如下所列。1小时后的球形芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌，和耐盐芽孢杆菌D-氨基转移酶的转氨活性如下表40所示。数据被标准化成每mL0.5mg的D-氨基转移酶。
表40：球形芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌，和耐盐芽孢杆菌D-氨基转移酶的转氨活性
 
D-氨基转移酶 丙氨酸(mM)以D-色氨酸作为底物 丙氨酸(mM)以R，R莫纳甜作为底物
耐盐芽孢杆菌(标记) 15.5 1.3
耐盐芽孢杆菌(未标记) 17.5 1.4
地衣芽孢杆菌(未标记) 28.4 0.21
球形芽孢杆菌(未标记) 29.0 22.5
球形芽孢杆菌(标记) 17.1 12.0
采用球形芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌，和耐盐芽孢杆菌D-氨基转移酶生成的莫纳甜如下表41所示。每个反应中包含大约90μg睾丸酮丛毛单胞杆菌ProA。所生成总莫纳甜的数据都被标准化采用0.5mg的D-氨基转移酶。
表41：球形芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌，和耐盐芽孢杆菌D-氨基转移酶生成莫纳甜的比较
 
D-氨基转移酶 总莫纳甜(ppm)3小时 总莫纳甜(ppm)过夜 ％R，R3小时 ％R，R过夜
耐盐芽孢杆菌(标记) 3.2 13.7 100 99.3
耐盐芽孢杆菌(未标记) 4 15.5 100 99.3
地衣芽孢杆菌(未标记) 0.6 8.1 100 29.3
球形芽孢杆菌(未标记) 279.6 577.6 61.55 65.7
球形芽孢杆菌(标记) 111.2 246 61.0 63.1
球形芽孢杆菌D-氨基转移酶(未标记)具有最高的由D-色氨酸生成莫纳甜的活性，但比起其他酶，耐盐芽孢杆菌酶对R-MP比对S-MP具有高得多的选择性，因此R，R莫纳甜立体纯度更高。在检测条件下蜡状芽孢杆菌细胞提取物不具有可检测量的活性，尽管基因可能在所选宿主中未表达。
如上所述，试验了嗜热脂肪土芽孢杆菌DAT(未标记，其表达得更好)并与纯化的球形芽孢杆菌DAT和AT-103(BioCatalytics)比较。结果如下表42和43所示。采用每mL 0.5mg的D-氨基转移酶检测了嗜热脂肪土芽孢杆菌，AT-103，和球形芽孢杆菌D-氨基转移酶的转氨活性(表42)。
表42：嗜热脂肪土芽孢杆菌，AT-103，和球形芽孢杆菌(纯化的)D-氨基转移酶的转氨活性
 
D-氨基转移酶 丙氨酸(mM)15分钟，以D-色氨酸作为底物 丙氨酸(mM)15分钟，以R，R莫纳甜作为底物 丙氨酸(mM)2小时，以D-色氨酸作为底物 丙氨酸(mM)2小时，以R，R莫纳甜作为底物
AT-103 8.91 1.21 9.47 6.13
球形芽孢杆菌(标记) 8.91 1.65 9.53 7.17
嗜热脂肪土芽孢杆菌(未标记) 2.05 0.053 8.10 0.78
表43：嗜热脂肪土芽孢杆菌，AT-103，和球形芽孢杆菌(纯化的)生成总莫纳甜的比较
 
D-氨基转移酶 总莫纳甜(ppm)2小时 总莫纳甜(ppm)过夜 ％R，R2小时 ％R，R过夜
AT-103 450 645 65.5 60.6
球形芽孢杆菌(标记) 110 175 64 54
嗜热脂肪土芽孢杆菌(未标记) nd 10 n/a 27
天然的嗜热脂肪土芽孢杆菌酶的莫纳甜转氨活性明显低于AT-103，和球形芽孢杆菌酶。
实施例19
创建杂合D-氨基转移酶
在实施例18和15中描述了几种芽孢杆菌D-氨基转移酶。尽管嗜热脂肪土芽孢杆菌酶对莫纳甜具有低转氨活性，可由D-色氨酸生成较少的总莫纳甜，但是它仍然具有感兴趣的结构要素，是一种热稳定酶。因此，创造了一种介于较高活性酶(球形芽孢杆菌)和土芽孢杆菌(Geobacillus)酶之间的杂合蛋白。
杂合DAT编码序列的组合
所设计的靶蛋白序列是SEQ ID NO：99。与SEQ ID NO：99对应的编码序列SEQ ID NO：100是根据大肠杆菌密码子用法而设计的。
采用组合PCR技术构建杂合DAT。组合过程如下：根据上述基因序列和它的互补DNA序列从IDT中排定出43个寡核苷酸(40mers)，其在正义和反义链之间有20个碱基对的重叠。用水将引物稀释至250μM并取每种引物5μL在微量离心管中混合在一起。按以下进行PCR：每100μL反应中加入1.5μL引物集，4μL dNTP，1X XL PCR缓冲液，1mM乙酸镁，2μL rTth聚合酶(Roche，Indianapolis，IN)，和0.25μL Pfu聚合酶(Stratagene，La Jolla，CA)。94℃热启动3分钟，之后按94℃30秒，40℃15秒，和68℃30秒循环15次。将退火温度增至44℃且延伸时间增至30秒再循环10次。退火温度48℃且延伸时间75秒再循环10次。最后，在68℃7分钟完成链延伸步骤。采用以下引物进行二次PCR，其为克隆设计了NdeI(N端)和BamHI(C端)：N端-5′-GGCCTTGGCATATGGGATACACTTTATGGAATGACCA-3′(SEQ IDNO：101)和C端-5′-TTGGAACCGGATCCTTAGCTGTTAAGGCTCAGTGGAA-3′(SEQ ID NO：102)
每100μLPCR中包含2.5μL初次反应物，3μL dNTP，1X XL PCR缓冲液，1mM乙酸镁，2μL rTth聚合酶，和0.25μL Pfu聚合酶。94℃热启动3分钟，之后按94℃30秒，42℃30秒，和68℃75秒循环10次。将退火温度增至48℃再循环15次，最后在68℃7分钟完成链延伸步骤。在琼脂糖凝胶中能观察到大约850bp的产物。
克隆
利用Qiagen QIAquick凝胶提取试剂盒(Valencia，CA)纯化PCR产物，并采用Zero Blunt 
Figure A200680055015D01221
克隆试剂盒按每个生产商的方案(Invitrogen)进行克隆。利用化学方法将质粒转化进TOP10感受态细胞以通过PCR进行初步筛选，通过限制性消化筛选质粒DNA且序列被证实。
以BamHI和NdeI消化质粒小量制备物(New England Biolabs，Ipswich，MA)。采用Roche快速DNA连接试剂盒(Roche)连接消化的载体(pET28和pET30)和插入物并通过Roche High-Pure PCR产物纯化试剂盒来纯化。利用0.2cm小池和Bio-Rad基因脉冲发生器II系统按Bio-Rad电穿孔手册所述将连接物转化到大肠杆菌DH10B中。可在900μL SOC培养基37℃225rpm30分钟回收细胞。细胞被涂布在含卡那霉素(25μg/mL)的LB琼脂平板上。利用Qiagen spin小量制备试剂盒纯化质粒DNA并通过BamHI和NdeI的限制性消化筛选正确插入物。
基因表达和试验
根据制造商的方案(Novagen，Madison，WI)，将质粒DNA转化进大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)。培养物生长并利用Qiagen小量制备试剂盒分离质粒，通过PCR分析以确认同一性。含卡那霉素(50μg/mL)的LB培养基上进行诱导。细胞在37℃生长至OD600为0.5并以0.1mM IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)诱导并在诱导后3小时取样。按照Novagen BugBusterTM试剂(含benzonase核酸酶并加入Roche完全蛋白酶抑制剂调配液)所带的方案制备细胞提取物。经SDS-PAGE鉴定，两种基因产物都获得了高水平的预期分子量的可溶蛋白。但是，蛋白的溶解水平较低。未标记的基因产物表达地更好并作为细胞提取物进行试验。在BioRad Laboratories Experion自动化电泳台上分离细胞提取物中的可溶蛋白并采用1.1.98.0版本的Experion软件分析浓度和表达百分比，以标准化用于对比试验的D-氨基转移酶量。
采用以下方案通过由丙酮酸和D-色氨酸(或R，R莫纳甜)生成丙氨酸来分析细胞提取物的D-氨基转移酶活性。平行的1mL反应在100mM磷酸钾缓冲液(pH7.5)，50μM磷酸吡哆醛，25mM丙酮酸钠，和50mM D-色氨酸或R，R莫纳甜中进行(除非另外指定)。通过加入无细胞提取物或纯化酶启动反应并在30℃温和振荡下温育15分钟至过夜。为进行比较，在每个试验中加入大约相同水平的D-氨基转移酶(0.5mg)(除非另外指定)。以AT-103(BioCatalytics)或球形芽孢杆菌D-氨基转移酶(实施例18)作为基准酶。加入蚁酸至终浓度为百分之二以终止反应，通过离心去除沉淀的蛋白。还进行了不加蛋白的对照反应。也以零时间点作为阴性对照。按实施例1所述采用OPA柱后衍生检测丙氨酸。每mL反应体积中0.5mg采用D-氨基转移酶的反应结果如下表44所示。
表44：球形芽孢杆菌酶(纯化的)，嗜热脂肪土芽孢杆菌，和杂合D-氨基转移酶的转氨活性
 
D-氨基转移酶 丙氨酸(mM)15分钟，以D-色氨酸作为底物 丙氨酸(mM)15分钟，以R，R莫纳甜作为底物 丙氨酸(mM)2小时，以D-色氨酸作为底物 丙氨酸(mM)2小时，以R，R莫纳甜作为底物
杂合DAT(未标记) 13.5 0.084 14.2 0.54
球形芽孢杆菌(标记) 13.6 4.60 13.9 10.6
嗜热脂肪土芽孢杆菌(未标记) 6.6 0.18 13.5 2.2
还试验了氨基转移酶由D-色氨酸生成莫纳甜的能力(如实施例3)。在每1mL反应混合物中添加以下物质：大约50-100μg纯化的睾丸酮丛毛单胞杆菌ProA醛缩酶，4mM MgCl2，50mM D-色氨酸(以固体提供)，0.5-2mg D-氨基转移酶，200mM丙酮酸钠，100mM磷酸钾缓冲液pH7.5，和0.05mM PLP。平行进行实验，以不加氨基转移酶的作为阴性对照。样品在30℃温和振荡下温育1小时，2小时和过夜(17小时-20小时)。在采用这些方法生成的莫纳甜中仅能检测到立体异构体是R，R或S，R。通过反相LC峰面积检测到R，R莫纳甜百分比如下表45所述。对于低浓度莫纳甜，R，R百分比不和RPLC峰面积判断的一样准确。因此，通过实施例1所述的FDAA衍生方法进一步分析某些样品。这些结果的数据显示在表格的括号中。
表45：嗜热脂肪土芽孢杆菌，杂合DAT，和球形芽孢杆菌(纯化的)生成总莫纳甜的比较
 
D-氨基转移酶 总莫纳甜(ppm)2小时 总莫纳甜(ppm)过夜 ％R.R2小时 ％R，R过夜
杂合DAT(未标记) 9.5 42.5 84.1(79.8) 81.1(69.6)
球形芽孢杆菌(标记) 68.5 182.5 62.7(53.8) 55.1(53.5)
嗜热脂肪土芽孢杆菌(未标记) 4.5 15.0 34.1(20.7) 32.1(21.7)
杂合DAT比嗜热脂肪土芽孢杆菌酶生成了更多莫纳甜，不过杂合DAT的莫纳甜转氨速率更低。可能是在莫纳甜生成的条件下(这里是低MP浓度)，杂合酶由于其更低的Km可能表现地更好。而且，杂合DAT获得了比任一亲代酶都更高的R，R百分比。相对于亲代酶，该酶对R-MP表现出具有更高的对映体选择性。采用实施例3所述的中华根瘤菌醛缩酶和杂合DAT完成相同的试验(温育时间4小时)。杂合DAT生成了与上述相似的莫纳甜量，但使用替代酶时，生成了95％的R，R(根据FDAA衍生结果)，而对应的是睾丸酮丛毛单胞杆菌ProA醛缩酶的80％。
还检测了杂合DAT对R-MP和S-MP的转氨活性(如实施例1所述生成的)。采用10mM R-MP或S-MP，50mM D-丙氨酸，100mM磷酸钾pH7.5，0.5mg/mL D-氨基转移酶，和50μM PLP在30℃下进行2小时和过夜试验。实验平行进行并从MP样品中减去了背景水平。两种D-氨基转移酶由每种底物生成的莫纳甜比例如下表46所述。以丙酮酸(生成的)比例作图时可观察到相似的趋势。明显地相对于未表现出选择性的AT-103 D-氨基转移酶，杂合DAT对R-MP更具选择性。
表46：杂合DAT和AT-103对R-MP和S-MP转氨的比较
 
D-氨基转移酶 R-活性/S-活性2小时 R-活性/S-活性过夜
杂合DAT(未标记) 8.6 2.2
AT-103 0.68 1.68
为进一步改善杂合DAT活性，进行了位点定向诱变。根据快变多位点定向诱变试剂盒(Stratagene)的提示设计了引物。创造了两种不同突变体：杂合DAT2和杂合DAT3。杂合DAT2包括153位上氨基酸由丙氨酸至精氨酸的突变和第181位丝氨酸的删除。设计丙氨酸至精氨酸的突变以帮助协调莫纳甜前体底物上的第二个羧基，就如存在于AspC L-氨基转移酶中所示的一样。丝氨酸删除是尝试消除一些空间位阻以使更大的莫纳甜前体分子能更容易地接触到活性位点。杂合DAT3包含180-182丝氨酸的删除，以一个精氨酸代替。创造了两个其他突变体，分别是153位ala至arg突变或丝氨酸删除。含有删除的所有三种突变都不产生可溶蛋白，尽管在很高浓度它们过度表达。明显地在该区域中未移除氨基酸对于结构是重要的。在检测条件下(如上)153位ala至arg的突变不生成莫纳甜。在153位附近存在明显的空间位阻，其将造成在未删除180-182区时莫纳甜前体底物的组装更为困难。可以预期的是丝氨酸突变成更小的氨基酸如甘氨酸或丙氨酸，将使活性朝莫纳甜前体改进，尤其是与153位ala至arg的突变联合时。
实施例20
采用商业可供的D-氨基酸脱氢酶
D-氨基酸脱氢酶是从BioCatalytics(Pasadena，CA)购买的文库的一部分。
MP和莫纳甜之间的相互转化
可由氨基转移酶或需要还原辅基如NADH或NADPH的脱氢酶促进MP的胺化以形成莫纳甜。这些反应是可逆的，可在任一方向上测量。通过铵盐浓度很大程度上可控制采用脱氢酶的方向性。
采用商业可供脱氢酶将莫纳甜转化成MP(莫纳甜前体)
通过以下在340nm处的吸收监测莫纳甜的氧化脱氨，因为NAD+被转化成更发色的NADH。
在0.2mL试验混合物中含有100mM碳酸氢钠，pH9，10mM NAD+，20mg/mL D-氨基酸脱氢酶(D-AADH-101至108，BioCatalytics)，和50mM R，R莫纳甜(一价钾盐)。在UV通透痕量滴定板中平行进行试验，30℃温育。通过Molecular Devices SpectraMax Plus板阅读仪测量终点吸收。不加酶进行阴性对照。过夜反应的吸收变化如下：无酶对照，0.05；D-AADH-101，0.865；D-AADH-102，1.075；D-AADH-103，0.94；D-AADH-104，0.335；D-AADH-105，0.78；D-AADH-106，0.745；D-AADH-107，0.925；和D-AADH-108，1.06。
采用脱氢酶由MP生成莫纳甜
作为试验底物的R-MP是由采用AT-103宽范围D-氨基转移酶(BioCatalytics)在磷酸钾缓冲液中以丙酮酸作为氨基受体由R，R莫纳甜转氨生成的。S-MP是由采用AT-102宽范围L-氨基转移酶(BioCatalytics)在磷酸钾缓冲液中以2-酮戊二酸作为氨基受体由S，S莫纳甜转氨生成的。两种化合物都采用制备级HPLC纯化。
在0.25mL试验混合物中含有200mM甲酸铵，50mM磷酸钾pH7.5，5mM NADH，20mg/mL D-氨基酸脱氢酶(D-AADH-101至108，BioCatalytics)，和10mM MP(钾盐)。对于一半试验，加入2mg/mL甲酸盐脱氢酶(＂FDH＂)(FDH-101，BioCatalytics，4.8U/mg)。样品在30℃温育16小时。采用LC/MS/MS分析样品的莫纳甜并采用实施例1所述的FDAA方法测定异构体分布。减去无D-氨基酸脱氢酶对照的背景水平以计算MP中存在的莫纳甜杂质。
对于由R-MP生成R，R莫纳甜，酶活性如下：D-AADH-103>D-AADH-101>D-AADH-107>D-AADH 106>D-AADH-108>D-AADH-105。由D-AADH 102生成的莫纳甜量非常低而D-AADH-104未显示出由R-MP生成了R，R莫纳甜。在缺乏甲酸脱氢酶的反应中由D-AADH-103生成了大约43ppm R，R莫纳甜。FDH的添加改进了所有活性酶的莫纳甜产量。改进范围多2.4倍莫纳甜至多10.1倍莫纳甜(D-AADH-103)。D-AADH-103生成大约434ppm R，R莫纳甜。
当以S-MP作为反应底物时S，R莫纳甜的产量如下，酶活性如下：D-AADH-106>D-AADH-107>D-AADH-105>D-AADH-101>D-AADH-102>D-AADH-103>D-AADH-108。在试验中D-AADH-104未显示出生成了S，R莫纳甜。由D-AADH-106生成了大约15ppm S，R莫纳甜，还使用FDH酶时为26ppm。
由吲哚-3-丙酮酸生成莫纳甜
采用BioCatalytics氨基酸脱氢酶联合SEQ ID NO：22醛缩酶在以下条件下进行由吲哚-3-丙酮酸和丙酮酸生成莫纳甜的试验：将1mg/mL脱氢酶，10mM NADH，500μg/mL醛缩酶(纯化的)，50mM磷酸钾缓冲液pH7.5，4mM MgCl2，20mg/mL吲哚-3-丙酮酸，200mM甲酸铵，和200mM丙酮酸在30℃100rpm下温育20小时。无氨基酸脱氢酶作为阴性对照。实验平行进行。相对于阴性对照，无一脱氢酶表现出由吲哚丙酮酸和丙酮酸生成了可计量的莫纳甜(按实施例1所述的LC/MS/MS来测定)。但是，生成了大量丙氨酸和色氨酸。预期增加醛缩酶与脱氢酶的比例将提高莫纳甜产量。也可以预期的是定向发展方法可用于改进MP对丙酮酸和吲哚-3-丙酮酸的还原性胺化活性的比例。
实施例21
球形芽孢杆菌D-丙氨酸氨基转移酶的固定化
按实施例14所述的HIS6-标签蛋白一样纯化球形芽孢杆菌D-丙氨酸氨基转移酶。
按照Mateo，C，等，Biotechnology Progress 18：629-634，(2002)中的程序将酶固定在
Figure A200680055015D01281
 C树脂微球上。采用Pierce Slide-A-Lyzer透析盒(7KMWCO；目录号# 66370；Rockford，IL)在0.4L 0.5M磷酸钾，pH7.8中将纯化的酶(4mL的6.0mg/mL)在室温下透析1小时。改变缓冲液并继续透析1小时。加入磷酸吡哆醛(＂PLP＂)至终浓度为0.05mM并将获得的溶液与0.2g从Sigma-Aldrich(Fluka目录号#46115；St.Louis，MO)购买的Eupergit
Figure A200680055015D0128143054QIETU
 C树脂混合。将酶-树脂悬浮液在室温适度混合下温育过夜。通过在4000xg离心5分钟从酶溶液中分离树脂微球。去除上清夜并以3 x 3mL含0.05mM PLP的100mM磷酸钾，pH7.8洗涤树脂。洗涤之间将混合物在3000xg离心5分钟。通过测量每个上清夜中的蛋白量并减去用于固定的蛋白初始量的总和来测定结合到树脂上的蛋白量。采用Pierce BCATM蛋白分析试剂盒以牛血清白蛋白作为标准(目录号#23225；Rockford，IL)测量蛋白浓度。最后将洗涤的固定酶微球悬浮在4mL含0.05mM PLP的100mM磷酸钾，pH7.8中。
在室温温和混合下温育以1.9M丙氨酸封闭固定酶微球上未反应的环氧基团。24小时后，如上所述洗涤微球以去除过量的丙氨酸并最终悬浮在含0.05mM PLP的100mM磷酸钾，pH7.8中。固定酶的终浓度是每g树脂微球上118mg蛋白。
实施例22
苜蓿中华根瘤菌Pro A醛缩酶的固定化
采用类似于实施例14所述的HIS6-标记球形芽孢杆菌D-丙氨酸氨基转移酶的程序按HIS6-标记蛋白纯化苜蓿中华根瘤菌HMG醛缩酶(＂proA＂)。
从新鲜的BL21(DE3)::苜蓿中华根瘤菌proA pET30(Xa/LIC)培养平板(含50μg/mL卡那霉素的LB琼脂)启动，细胞在5ml含50μg/mL卡那霉素的Luria-Bertani肉汤(＂LB＂)中37℃225rpm生长过夜。随后，按0.5-0.6％(v/v)将培养物转移到装有800mL含50μg/mL卡那霉素的LB肉汤的烧瓶中。细胞在37℃225rpm下生长直至OD600达到0.6-0.7。通过添加0.2mM IPTG诱导基因表达。将培养物在30℃225rpm下进一步温育4小时然后在带JS-16.25转子的Beckman(Fullerton，CA)J25II中10,000rpm离心10分钟以收集细胞。以冷50mM EPPS缓冲液，pH8.2洗涤细胞团一次，并再次离心细胞。收集洗涤的细胞团并立即使用。为制备含苜蓿中华根瘤菌HIS6-proA醛缩酶(HIS6-SmelproA)蛋白的无细胞提取物，将细胞悬浮在3-4体积的含100mMNaCl的50mM EPPS，pH8.2中，然后采用Microfluidics(Newton，MA)匀浆仪(在20,000psi3孔)裂解，保持悬浮液温度低于15℃。之后所有纯化步骤均在4℃进行。将细胞提取物在15,000xg离心15分钟以去除细胞碎片。将每份含有15-20mg可溶蛋白的无细胞提取物加入之前已用Novagen结合缓冲液平衡过的Novagen组氨酸结合柱(目录#70971-4)中。以2 x 10mLNovagen结合缓冲液和1 x 10mL以结合缓冲液1:1稀释的Novagen洗涤缓冲液洗涤柱。以5mL Novagen洗脱缓冲液从每根柱上洗脱HIS6-SmelproA。来自各个柱的洗脱液被组合在一起并以Amicon(Billerica，MA)Ultra-15离心过滤装置(MWCO 10 kDa)浓缩2X。经由之前已用含100mM NaCl的50mM EPPS5 pH 8.2平衡过的一次性GE Healthcare PD10脱盐柱(目录号#17-0851-01)交换缓冲液。
采用Pierce BCATM蛋白分析试剂盒(目录号#23225；Rockford，IL)测定脱盐溶液的蛋白浓度。在Bio-Rad Protean II小量凝胶系统(Hercules，CA)和4-15％梯度凝胶上通过SDS-PAGE测定每个部分的纯度和无细胞提取物部分的表达。通常地，该程序可从3200mL LB培养物中得到60-70mg纯度达～90％的酶。将纯化酶按份(1-5mL)储存于-80℃直至使用。
和实施例21所述的球形芽孢杆菌D-丙氨酸氨基转移酶一样根据Mateo，C，等，(2002)Biotechnology Progress 18：629-634，(2002)程序将酶固定到 C树脂微球上，除在固定化期间缓冲液中以4mM氯化镁以代替0.05mM PLP之外。以甘氨酸封闭后，将洗涤的固定酶悬浮在含4mM氯化镁的100mM磷酸钾pH7.8中。苜蓿中华根瘤菌proA醛缩酶的终浓度是每克树脂微球52mg蛋白。
实施例23
利用固定酶生成R，R莫纳甜
按实施例21和22所述纯化和固定球形芽孢杆菌HIS6-标记D-丙氨酸氨基转移酶和苜蓿中华根瘤菌HIS6-标记proA醛缩酶。
在15mL带螺帽的聚丙烯管中制备100mM磷酸钾中的50mM丙酮酸钠，40mM D-色氨酸，4mM MgCl2，和50μM PLP的溶液，pH7.8。在每个溶液中加入两种固定酶至终体积4mL。在室温温和混合下将制得的悬浮液温育长达24小时。通过HPLC和/或LC-MS分析，测量D-色氨酸，D-丙氨酸，R，R莫纳甜和丙酮酸跟踪每个反应的进展。采用手性LC/MS/MS测定产物莫纳甜的异构体纯度。所有分析方法如实施例1所述。采用固定酶实验的典型结果如下表47所示。在反应终形成的莫纳甜异构体纯度的分析表明了酶促反应的产物是在74-80％R，R。
表47：采用固定酶生成R，R莫纳甜
 
proA醛缩酶浓度(μg/mL) D-丙氨酸氨基转移酶浓度(μg/mL) 莫纳甜浓度(mM)(4小时时间点) 色氨酸浓度(mM)(4小时时间点) 丙氨酸浓度(mM)(4小时时间点)
50 500 0.06 17.75 20.51
50 1000 0.29 15.03 24.71
100 1000 0.33 15.17 24.73
100 2000 0.54 14.40 29.45
序列表
<110>嘉吉公司
     Brazeau，Brian J.
     Burke，Ellen
     de Souza，Mervyn
     Gort，Steven J.
     Hicks，Paula M.
     Kollmann，Sherry R.
     Luginbuhl，Peter
     McFarlan，Sara C.
     Richardson，Toby
     Sanchez-Riera，Fernando A.
     Solheid，Christopher
     Weiner，David
     Zhao，Lishan
<120>用于生成莫纳甜异构体及其前体的多肽和生物合成途径
<130>2464.021PC00
<150>To Be Assigned
<151>2006-04-26
<160>102
<170>PatentIn version 3.3
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<211>684
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<212>PRT
<213>Comamonas testosteroni
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<212>PRT
<213>Aldolase(Bacillus subtilis)
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<211>34
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<213>Bacillus rotans
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Figure A200680055015D01591
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<212>PRT
<213>Bacillus serositidis
<400>87
Figure A200680055015D01592
Figure A200680055015D01611
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<220>
<223>BamHI Primer
<400>102
Figure A200680055015D01653

Claims (52)

1.一种方法，其包括通过一途径生成莫纳甜或其盐，所述途径包括：由L-色氨酸生成吲哚-3-丙酮酸，由所述吲哚-3-丙酮酸生成至少包括R-莫纳甜前体(＂R-MP＂)的莫纳甜前体(＂MP＂)，以及由所述莫纳甜前体生成莫纳甜，其中所述莫纳甜至少包括R，R莫纳甜，且其中由L-色氨酸生成吲哚-3-丙酮酸是经对L-色氨酸比对莫纳甜前体、莫纳甜、或两者具有更高活性、更高特异性、或两者的一种或多种酶促进的。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述的一种或多种酶选自L-色氨酸氨基转移酶、L-芳族氨基转移酶、L-天冬氨酸氨基转移酶、L-氨基酸氧化酶、和它们的组合。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述的一种或多种酶选自苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)TatA、HEXAspCP9T/R122G、和它们的组合。
4.如权利要求2所述的方法，其中所述的一种或多种酶对莫纳甜前体、莫纳甜、或两者具有限制活性、限制特异性、或两者。
5.如权利要求4所述的方法，其中由所述R-莫纳甜前体生成所述R，R莫纳甜是由一种或多种选自D-氨基转移酶和D-氨基酸脱氢酶的酶促进的。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述D-氨基转移酶选自耐盐芽孢杆菌(Bacillus halodurans)D-氨基转移酶，杂合D-氨基转移酶，嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)D-氨基转移酶，地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)D-氨基转移酶，ATCC4978D-氨基转移酶，ATCC7063D-氨基转移酶，具有D-氨基转移酶活性的地衣芽孢杆菌支链氨基转移酶，和它们的同源物。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述耐盐芽孢杆菌D-氨基转移酶含有登录号NP-243677所列的氨基酸序列，或其同源物。
8.如权利要求6所述的方法，其中所述具有D-氨基转移酶活性的地衣芽孢杆菌支链氨基转移酶选自含有相应于大肠杆菌(E.coli)F37Y的突变的地衣芽孢杆菌支链氨基转移酶，含有相应于大肠杆菌Y96F的突变的地衣芽孢杆菌支链氨基转移酶，含有相应于大肠杆菌Y165L的突变的地衣芽孢杆菌支链氨基转移酶，含有相应于大肠杆菌L127K的突变的地衣芽孢杆菌支链氨基转移酶，含有相应于大肠杆菌R98Y的突变的地衣芽孢杆菌支链氨基转移酶，含有相应于大肠杆菌L108R的突变的地衣芽孢杆菌支链氨基转移酶，含有相应于大肠杆菌L110H的突变的地衣芽孢杆菌支链氨基转移酶，含有相应于大肠杆菌L127Y的突变的地衣芽孢杆菌支链氨基转移酶，含有相应于大肠杆菌R41K的突变的地衣芽孢杆菌支链氨基转移酶，和其同源物。
9.如权利要求6所述的方法，其中所述杂合D-氨基转移酶是SEQ IDNO：99，或其同源物。
10.如权利要求6所述的方法，其中所述ATCC4978D-氨基转移酶是SEQ ID NO：86，或其同源物。
11.如权利要求6所述的方法，其中所述ATCC7063D-氨基转移酶是SEQ ID NO：87，或其同源物。
12.如权利要求5所述的方法，其中所述D-氨基转移酶是在存在5’磷酸吡哆醛的情况下纯化的。
13.如权利要求5所述的方法，其中所述D-氨基酸脱氢酶选自D-AADH-101、D-AADH-102、D-AADH-103、D-AADH-105、D-AADH-106、D-AADH-107、D-AADH-108、和它们的同源物。
14.如权利要求4所述的方法，其中所述生成的R，R莫纳甜是生成的总莫纳甜重量的至少约60％。
15.如权利要求1所述的方法，其中由吲哚-3-丙酮酸生成所述莫纳甜前体是经具有R-特异性醛缩酶活性的一种或多种酶促进的。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述的具有R-特异性醛缩酶活性的一种或多种酶是选自苜蓿中华根瘤菌HMG醛缩酶、SEQ ID NO：22醛缩酶、和它们的同源物的醛缩酶。
17.如权利要求1所述的方法，其中所述方法进一步包括至少一个纯化步骤，其中所述R，R莫纳甜被纯化至占总有机化合物重量至少约60％的纯度。
18.如权利要求5所述的方法，其中所述的一种或多种酶选自对R-莫纳甜前体比对S-α-酮酸莫纳甜或吲哚-3-丙酮酸具有更高活性、更高特异性、或两者的D-氨基转移酶和D-氨基酸脱氢酶。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述的一种或多种酶选自对S-α-酮酸莫纳甜或吲哚-3-丙酮酸具有限制活性、限制特异性、或两者的D-氨基转移酶和D-氨基酸脱氢酶。
20.如权利要求18所述的方法，其中所述的选自L-色氨酸氨基转移酶、L-芳族氨基转移酶、L-天冬氨酸氨基转移酶和L-氨基酸氧化酶的一种或多种酶对莫纳甜前体、莫纳甜、或两者具有限制活性、限制特异性、或两者，并且所述的选自D-氨基转移酶和D-氨基酸脱氢酶的一种或多种酶对S-α-酮酸莫纳甜具有限制活性、限制特异性、或两者。
21.一种方法，其包括通过一途径生成R，R莫纳甜或其盐，所述途径包括：由L-色氨酸生成D-色氨酸，由D-色氨酸生成吲哚-3-丙酮酸，由吲哚-3-丙酮酸生成R-莫纳甜前体，和由R-莫纳甜前体生成R，R莫纳甜，其中由L-色氨酸生成D-色氨酸是经选自色氨酸消旋酶、具有色氨酸消旋酶活性的消旋酶、和它们的组合的一种或多种酶促进的。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述具有色氨酸消旋酶活性的消旋酶是源于丙氨酸消旋酶、谷氨酸消旋酶、或天冬氨酸消旋酶。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述具有色氨酸消旋酶活性的消旋酶选自SEQ ID NO：43的丙氨酸消旋酶，对应于具有M35C突变的SEQ IDNO：41的丙氨酸消旋酶，对应于具有F66E突变的SEQ ID NO：41的丙氨酸消旋酶，对应于具有Y354A突变的SEQ ID NO：41的丙氨酸消旋酶，对应于具有P197L突变的SEQ ID NO：41的丙氨酸消旋酶，和它们的同源物。
24.如权利要求21所述的方法，其中所述由D-色氨酸生成吲哚-3-丙酮酸是经一种或多种酶促进的，且由R-莫纳甜前体生成R，R莫纳甜是经与促进由R-莫纳甜前体生成R，R莫纳甜相同的一种或多种酶所促进的。
25.如权利要求1所述的方法，其中所述方法进一步包括与L-色氨酸相连的反应，其中α-酮酸底物被转化成相应的D-氨基酸。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述的α-酮酸底物是选自α-酮戊二酸，草酰乙酸，和丙酮酸的一种或多种底物，其分别被转化成选自L-谷氨酸，L-天冬氨酸，L-丙氨酸的一种或多种相应产物；其中，采用促进转化成D-氨基酸的消旋酶分别将所述的相应产物转化成选自D-谷氨酸、D-天冬氨酸和D-丙氨酸的相应D-氨基酸。
27.如权利要求26所述的方法，其中所述消旋酶选自丙氨酸消旋酶、谷氨酸消旋酶、和天冬氨酸消旋酶。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述丙氨酸消旋酶选自嗜热脂肪芽孢杆菌丙氨酸消旋酶和嗜热脂肪土芽孢杆菌丙氨酸消旋酶的热稳定同源物，所述谷氨酸消旋酶选自短乳杆菌(L.brevis)谷氨酸消旋酶和戊糖片球菌(P.pentosaceus)谷氨酸消旋酶，且所述天冬氨酸消旋酶是BioCatalytics的ASPR-101。
29.如权利要求1所述的方法，其中由R-莫纳甜前体生成R，R莫纳甜是经立体转化氨基转移酶所促进的。
30.如权利要求1所述的方法，进一步包括在L-色氨酸反应形成吲哚-3-丙酮酸时由α-酮戊二酸生成L-谷氨酸，且采用谷氨酸脱羧酶由L-谷氨酸生成4-氨基丁酸。
31.如权利要求1所述的方法，进一步包括在L-色氨酸反应形成吲哚-3-丙酮酸时由草酰乙酸生成L-天冬氨酸，且采用天冬氨酸脱羧酶由L-天冬氨酸生成β-丙氨酸。
32.如权利要求1所述的方法，进一步包括在L-色氨酸反应形成吲哚-3-丙酮酸时由草酰乙酸生成L-天冬氨酸，且采用天冬氨酸4-脱羧酶由L-天冬氨酸生成L-丙氨酸，并采用丙氨酸消旋酶由L-丙氨酸生成D-丙氨酸。
33.如权利要求32所述的方法，其中通过R-莫纳甜前体与D-丙氨酸的反应由R-莫纳甜前体形成R，R莫纳甜。
34.如权利要求1所述的方法，其中方法进一步包括
(a)由α-酮戊二酸反应生成L-谷氨酸，其中所述α-酮戊二酸反应与L-色氨酸反应相连；
(b)采用L-丙氨酸氨基转移酶由所述L-谷氨酸与丙酮酸反应生成L-丙氨酸；和，
(c)采用丙氨酸消旋酶由L-丙氨酸生成D-丙氨酸，其中通过所述R-莫纳甜前体与所述D-丙氨酸的转氨反应由所述R-莫纳甜前体生成所述R，R莫纳甜。
35.如权利要求2所述的方法，其中所述一种或多种酶被固定在固体支持物上。
36.一种生成莫纳甜或其盐的方法，其包括使D-色氨酸和一种或多种D-氨基转移酶反应，所述一种或多种D-氨基转移酶选自耐盐芽孢杆菌D-氨基转移酶、杂合D-氨基转移酶、嗜热脂肪土芽孢杆菌D-氨基转移酶、地衣芽孢杆菌D-氨基转移酶、ATCC4978D-氨基转移酶、ATCC7063D-氨基转移酶、和它们的同源物。
37.如权利要求36所述的方法，其中所生成莫纳甜的至少约75％是R，R莫纳甜。
38.一种生成莫纳甜或其盐的方法，其包括使莫纳甜前体和一种或多种D-氨基转移酶反应，所述一种或多种D-氨基转移酶选自耐盐芽孢杆菌D-氨基转移酶、杂合D-氨基转移酶、嗜热脂肪土芽孢杆菌D-氨基转移酶、地衣芽孢杆菌D-氨基转移酶、ATCC4978 D-氨基转移酶、ATCC 7063 D-氨基转移酶、具有D-氨基转移酶活性的地衣芽孢杆菌支链氨基转移酶、和它们的同源物。
39.一种方法，其包括在存在5’磷酸吡哆醛的情况下纯化D-氨基转移酶。
40.如权利要求39所述的方法，其中所述D-氨基转移酶是球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus)D-丙氨酸氨基转移酶。
41.一种组合物，其包括R-莫纳甜前体，L-色氨酸，D-氨基酸和对L-色氨酸比对莫纳甜前体或莫纳甜具有更高活性、更高特异性、或两者的一种或多种酶。
42.如权利要求41所述的组合物，其中所述一种或多种酶选自L-色氨酸氨基转移酶，L-芳族氨基转移酶，L-天冬氨酸氨基转移酶，和L-氨基酸氧化酶。
43.如权利要求41所述的组合物，其中所述一种或多种酶是立体转化氨基转移酶。
44.如权利要求41所述的组合物，其中所述组合物额外含有选自D-氨基转移酶和D-氨基酸脱氢酶的酶。
45.如权利要求41所述的组合物，其中所述组合物额外含有具有R-特异性醛缩酶活性的一种或多种酶。
46.如权利要求41所述的组合物，其中所述组合物额外含有选自丙氨酸消旋酶，谷氨酸消旋酶，和天冬氨酸消旋酶的一种或多种酶。
47.一种杂合D-氨基转移酶，其含有SEQ ID NO：99，或其同源物。
48.一种ATCC4978D-氨基转移酶，其含有SEQ ID NO：86，或其同源物。
49.一种ATCC7063D-氨基转移酶其含有SEQ ID NO：87，或其同源物。
50.一种具有D-氨基转移酶活性的地衣芽孢杆菌支链氨基转移酶，其选自含有相应于大肠杆菌F37Y的突变的地衣芽孢杆菌支链氨基转移酶，含有相应于大肠杆菌Y96F的突变的地衣芽孢杆菌支链氨基转移酶，含有相应于大肠杆菌Y165L的突变的地衣芽孢杆菌支链氨基转移酶，含有相应于大肠杆菌L127K的突变的地衣芽孢杆菌支链氨基转移酶，含有相应于大肠杆菌R98Y的突变的地衣芽孢杆菌支链氨基转移酶，含有相应于大肠杆菌L108R的突变的地衣芽孢杆菌支链氨基转移酶，含有相应于大肠杆菌L110H的突变的地衣芽孢杆菌支链氨基转移酶，含有相应于大肠杆菌L127Y的突变的地衣芽孢杆菌支链氨基转移酶，含有相应于大肠杆菌R41K的突变的地衣芽孢杆菌支链氨基转移酶，和其同源物。
51.一种消旋酶，其含有SEQ ID NO：43，或其同源物。
52.一种在存在5’磷酸吡哆醛的情况下纯化的D-氨基转移酶，其中所述D-氨基转移酶相对于在存在5’磷酸吡哆醛的情况下未纯化的相同D-氨基转移酶表现出改进的活性。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101365787B (zh) * 2005-04-26 2014-03-05 嘉吉有限公司 用于生产莫纳甜的立体异构体和其前体的多肽和生物合成途径
CN113717896A (zh) * 2021-09-24 2021-11-30 扬州大学 发酵乳杆菌yzu-06及其应用

Families Citing this family (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7297800B2 (en) 2001-12-27 2007-11-20 Ajinomoto Co., Inc. Process of producing glutamate derivatives
US7572607B2 (en) * 2002-04-23 2009-08-11 Cargill, Incorporated Polypeptides and biosynthetic pathways for the production of monatin and its precursors
US8372989B2 (en) * 2002-04-23 2013-02-12 Cargill, Incorporated Polypeptides and biosynthetic pathways for the production of monatin and its precursors
ATE463568T1 (de) 2002-08-26 2010-04-15 Ajinomoto Kk Neue aldolasen und verfahren zur herstellung von substituierter alpha-ketosäure
KR100723826B1 (ko) 2002-12-09 2007-06-04 아지노모토 가부시키가이샤 변이형 ｄ－아미노트랜스퍼라제 및 이를 사용하는 광학활성글루탐산 유도체의 제조방법
KR20060061811A (ko) * 2003-08-01 2006-06-08 카아길, 인코포레이팃드 모나틴 식탁용 감미제 조성물 및 이의 제조 방법
AU2004268594A1 (en) * 2003-08-25 2005-03-10 Cargill, Incorporated Beverage compositions comprising monatin and methods of making same
DE602004031444D1 (de) * 2003-10-21 2011-03-31 Cargill Inc Herstellung von monatin und monatinvorstufen
GB2430794B (en) * 2004-05-20 2009-10-21 Waters Investments Ltd Method and apparatus for identifying proteins in mixtures
US8153405B2 (en) * 2005-04-20 2012-04-10 Cargill, Incorporated Products and methods for in vivo secretion of monatin
US8158389B2 (en) * 2005-04-20 2012-04-17 Cargill, Incorporated Products and methods for in vivo secretion of monatin
US7582455B2 (en) * 2005-04-26 2009-09-01 Cargill, Incorporated Polypeptides and biosynthetic pathways for the production of stereoisomers of monatin and their precursors
US8076108B2 (en) 2005-04-26 2011-12-13 Cargill, Incorporated Polypeptides and biosynthetic pathways for the production of stereoisomers of monatin and their precursors
BRPI0708673A2 (pt) 2006-03-07 2011-06-07 Cargill Inc método para fabricação de polipeptìdeos com atividade de aldolase e polinucleotìdeos que codificam estes polipeptìdeos
EA029538B1 (ru) * 2006-03-07 2018-04-30 Басф Энзаймс Ллк Полипептид, обладающий активностью альдолазы, полинуклеотид, кодирующий этот полипептид, и способы получения и применения полинуклеотида и полипептида
US20090198072A1 (en) * 2006-05-24 2009-08-06 Cargill, Incorporated Methods and systems for increasing production of equilibrium reactions
CA2653054A1 (en) 2006-05-24 2007-12-06 Cargill, Incorporated Methods and systems for increasing production of equilibrium reactions
CN101239941B (zh) * 2007-02-08 2012-02-29 味之素株式会社 光学活性化合物的制造方法
US8367847B2 (en) * 2007-10-01 2013-02-05 Cargill, Incorporated Production of monatin enantiomers
US8076107B2 (en) * 2007-10-01 2011-12-13 Cargill, Incorporated Production of monatin stereoisomers
US8003361B2 (en) * 2007-10-01 2011-08-23 Cargill Incorporated Production of monatin enantiomers
WO2009088442A2 (en) * 2008-01-03 2009-07-16 Cargill, Incorporated Isomerases and epimerases and methods of using
WO2011002469A1 (en) * 2009-07-02 2011-01-06 Cargill, Incorporated Isomerases and epimerases and methods of using
BRPI0822219A2 (pt) * 2008-01-03 2014-11-04 Cargill Inc Ácidos nucléicos de aminotransferase e oxidoreductase e polipeptídeos e métodos de uso.
PL2238242T3 (pl) * 2008-01-03 2015-06-30 Basf Enzymes Llc Transferazy i oksydoreduktazy, kwasy nukleinowe kodujące je oraz sposoby ich wytwarzania i zastosowania
CN102741406A (zh) 2010-10-14 2012-10-17 味之素株式会社 用于产生莽那亭的方法
US20120208244A1 (en) * 2010-10-15 2012-08-16 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing monatin
US8771997B2 (en) * 2011-04-20 2014-07-08 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing monatin using an L-amino acid aminotransferase
WO2012147674A1 (ja) * 2011-04-25 2012-11-01 味の素株式会社 モナティンの製造方法
EP3047030A4 (en) * 2013-09-17 2017-02-22 Zymochem Inc. A high yield route for the production of compounds from renewable sources
US20220372528A1 (en) 2019-04-25 2022-11-24 Zymochem, Inc. Production of chemicals from renewable sources
CN113106082B (zh) * 2021-05-27 2022-11-04 云南师范大学 动物粪便宏基因组来源的丙氨酸消旋酶及其制备和应用

Family Cites Families (56)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3002889A (en) * 1960-06-20 1961-10-03 Kyowa Hakko Kogyo Kk Method of producing l-glutamic acid
US3128237A (en) * 1961-02-24 1964-04-07 Ajinomoto Kk Process for producing l-glutamic acid by bacterial fermentation
US3399114A (en) * 1964-08-22 1968-08-27 Asahi Chemical Ind Process for producing l-glutamic acid by using bacteria
US4371614A (en) * 1980-08-22 1983-02-01 Ajinomoto Co., Inc. E.Coli bacteria carrying recombinant plasmids and their use in the fermentative production of L-tryptophan
EP0232262A4 (en) 1985-08-15 1989-09-19 Stauffer Chemical Co MICROORGANISM PRODUCING TRYPTOPHANE.
GB2205834B (en) * 1987-06-15 1990-10-31 South African Inventions 3-(1-amino-1,3-dicarboxy-3-hydroxy-but-4-yl)-indole compounds
US5300437A (en) * 1989-06-22 1994-04-05 Celgene Corporation Enantiomeric enrichment and stereoselective synthesis of chiral amines
WO1989011212A2 (en) 1989-08-30 1989-11-30 Wm. Wrigley Jr. Company Method of controlling release of cyclamate in chewing gum and gum produced thereby
GB2240105B (en) * 1990-01-19 1993-06-09 Technology Finance Corp Process for the production of 3-(1-amino-1,3-dicarboxy-3-hydroxy-but-4-yl) indole
US5360724A (en) * 1992-12-18 1994-11-01 Celgene Corporation Process for the preparation of chiral 1-aryl-2-aminopropanes
US6264999B1 (en) * 1993-09-30 2001-07-24 Wm. Wrigley Jr. Company Chewing gum containing erythritol and method of making
JP3698742B2 (ja) 1994-03-01 2005-09-21 協和醗酵工業株式会社 光学活性４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸の製造法
US5985617A (en) * 1997-02-18 1999-11-16 Liao; James C. Microorganisms and methods for overproduction of DAHP by cloned PPS gene
CA2234412C (en) * 1997-06-09 2008-09-02 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Method for producing optically active compound
DE19818541C2 (de) 1998-04-24 2003-04-10 Forschungszentrum Juelich Gmbh Mikrobielle Herstellung von Substanzen aus dem aromatischen Stoffwechsel / III
US5994559A (en) * 1998-08-06 1999-11-30 The Board Of Governors For Higher Education, State Of Rhode Island And Providence Plantations Synthesis of monatin-A high intensity natural sweetener
JP2002060382A (ja) 2000-08-22 2002-02-26 Ajinomoto Co Inc モナティンの立体異性体及びその使用、並びにモナティン類の製造方法及びそのための中間体
DE10129711B4 (de) 2001-06-22 2007-08-23 Forschungszentrum Jülich GmbH Verfahren zur fermentativen Herstellung von Pyruvat
JP2003171365A (ja) 2001-11-30 2003-06-20 Ajinomoto Co Inc モナティン類及びその製造中間体の製造方法並びに新規中間体
EP1449832A4 (en) 2001-11-30 2005-02-02 Ajinomoto Kk CRYSTALS OF NON-NATURAL STEREO-ISOMERAL SALTS OF MONATIN AND THEIR USE
US7297800B2 (en) * 2001-12-27 2007-11-20 Ajinomoto Co., Inc. Process of producing glutamate derivatives
EP2460884A3 (en) 2001-12-27 2013-03-27 Ajinomoto Co., Inc. Process for preparing monatin
EP1466890B1 (en) 2001-12-27 2012-04-04 Ajinomoto Co., Inc. Processes for the preparation of glutamic acid compounds and intermediates thereof and novel intermediates used in the processes
EP1489166A4 (en) * 2002-03-01 2006-04-05 Kyowa Hakko Kogyo Kk RACEMASE OF AMINO ACID HAVING LOW SUBSTRATE SPECIFICITY AND PROCESS FOR PRODUCTION OF RACEMIC AMINO ACID
JP2003292484A (ja) 2002-04-01 2003-10-15 Ajinomoto Co Inc γ−ヒドロキシアミノ酸誘導体及びモナティン類の製造方法
US7572607B2 (en) * 2002-04-23 2009-08-11 Cargill, Incorporated Polypeptides and biosynthetic pathways for the production of monatin and its precursors
BRPI0309527B1 (pt) * 2002-04-23 2015-08-18 Cargill Inc Métodos para produção de monatina
US8372989B2 (en) * 2002-04-23 2013-02-12 Cargill, Incorporated Polypeptides and biosynthetic pathways for the production of monatin and its precursors
ATE463568T1 (de) 2002-08-26 2010-04-15 Ajinomoto Kk Neue aldolasen und verfahren zur herstellung von substituierter alpha-ketosäure
KR100723826B1 (ko) 2002-12-09 2007-06-04 아지노모토 가부시키가이샤 변이형 ｄ－아미노트랜스퍼라제 및 이를 사용하는 광학활성글루탐산 유도체의 제조방법
ATE522497T1 (de) * 2003-01-09 2011-09-15 Ajinomoto Kk Verfahren zur herstellung eines glutaminsäurederivats, ein pyroglutaminsäurederivat und ein neues zwischenprodukt für die herstellung
JP4239600B2 (ja) 2003-01-24 2009-03-18 味の素株式会社 ２ｒ−モナティンの製造方法
JP2004331650A (ja) 2003-04-14 2004-11-25 Kanazawa Univ Tlo Inc モナチン類の製造法
JP2004331644A (ja) 2003-04-14 2004-11-25 Kanazawa Univ Tlo Inc モナチン類の製造法
JP4760375B2 (ja) * 2003-06-26 2011-08-31 味の素株式会社 Ｉｈｏｇの回収方法およびモナティンの製造方法
KR20060061811A (ko) 2003-08-01 2006-06-08 카아길, 인코포레이팃드 모나틴 식탁용 감미제 조성물 및 이의 제조 방법
MXPA06001663A (es) 2003-08-14 2006-07-03 Cargill Inc Composiciones de goma de mascar que comprenden monatina y metodos para hacer las mismas.
AU2004268594A1 (en) 2003-08-25 2005-03-10 Cargill, Incorporated Beverage compositions comprising monatin and methods of making same
DE602004031444D1 (de) 2003-10-21 2011-03-31 Cargill Inc Herstellung von monatin und monatinvorstufen
JP4500977B2 (ja) * 2003-11-05 2010-07-14 味の素株式会社 新規アミノ酸誘導体及び甘味剤
JP5113978B2 (ja) * 2003-11-21 2013-01-09 味の素株式会社 グルタミン酸誘導体の有機アミン塩及びその利用
JP5319885B2 (ja) 2004-02-27 2013-10-16 味の素株式会社 モナティンの製造方法
JP4604524B2 (ja) * 2004-03-16 2011-01-05 味の素株式会社 変異型アルドラーゼ、並びにこれを用いた光学活性ｉｈｏｇ及び光学活性モナティンの製造方法
JP4604537B2 (ja) * 2004-03-31 2011-01-05 味の素株式会社 Ｌ−システイン生産菌及びｌ−システインの製造法
US7935377B2 (en) * 2004-06-04 2011-05-03 Ajinomoto Co., Inc. Crystals of free (2R, 4R)-monatin and use thereof
CA2506247C (en) * 2004-06-07 2012-02-21 Ajinomoto Co., Inc. Novel aldolase, and method for producing optically active ihog and monatin
KR101216575B1 (ko) * 2004-07-14 2012-12-31 아지노모토 가부시키가이샤 (2ｒ,4ｒ)-모나틴 칼륨 염 결정 및 이를 함유하는 감미료조성물
JP2007284349A (ja) 2004-07-27 2007-11-01 Ajinomoto Co Inc モナティンまたはその塩の製造方法
US20060083695A1 (en) * 2004-10-15 2006-04-20 Ajinomoto Co. Inc Sweetener composition
US8153405B2 (en) * 2005-04-20 2012-04-10 Cargill, Incorporated Products and methods for in vivo secretion of monatin
US8158389B2 (en) * 2005-04-20 2012-04-17 Cargill, Incorporated Products and methods for in vivo secretion of monatin
WO2007133184A2 (en) * 2005-04-26 2007-11-22 Cargill, Incorporated Polypeptides and biosynthetic pathways for the production of stereoisomers of monatin and their precursors
US8076108B2 (en) * 2005-04-26 2011-12-13 Cargill, Incorporated Polypeptides and biosynthetic pathways for the production of stereoisomers of monatin and their precursors
US7582455B2 (en) * 2005-04-26 2009-09-01 Cargill, Incorporated Polypeptides and biosynthetic pathways for the production of stereoisomers of monatin and their precursors
BRPI0708673A2 (pt) * 2006-03-07 2011-06-07 Cargill Inc método para fabricação de polipeptìdeos com atividade de aldolase e polinucleotìdeos que codificam estes polipeptìdeos
CA2653054A1 (en) * 2006-05-24 2007-12-06 Cargill, Incorporated Methods and systems for increasing production of equilibrium reactions

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101365787B (zh) * 2005-04-26 2014-03-05 嘉吉有限公司 用于生产莫纳甜的立体异构体和其前体的多肽和生物合成途径
CN113717896A (zh) * 2021-09-24 2021-11-30 扬州大学 发酵乳杆菌yzu-06及其应用
CN113717896B (zh) * 2021-09-24 2023-07-14 扬州大学 发酵乳杆菌yzu-06及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
EP2010650A2 (en) 2009-01-07
AU2006343640A1 (en) 2007-11-22
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CA2649939A1 (en) 2007-11-22
BRPI0621613A2 (pt) 2011-12-13
JP2009535028A (ja) 2009-10-01
US7582455B2 (en) 2009-09-01
WO2007133183A3 (en) 2008-09-12
US20060252135A1 (en) 2006-11-09

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