MXPA06001663A

MXPA06001663A - Composiciones de goma de mascar que comprenden monatina y metodos para hacer las mismas.

Info

Publication number: MXPA06001663A
Application number: MXPA06001663A
Authority: MX
Inventors: David P Weiner
Original assignee: Cargill Inc
Priority date: 2003-08-14
Filing date: 2004-08-16
Publication date: 2006-07-03
Also published as: DE602004006141T2; EP1653810B1; CN1852661A; ATE360370T1; JP2012095663A; DE602004006141D1; US20050170041A1; CN1852661B; AU2004264949B2; JP2007502117A; KR101194132B1; ES2285521T3; BRPI0413581A; AU2004264949A1; WO2005016022A1; KR20060066090A; EP1653810A1

Abstract

Se describen composiciones de goma de masar que incluyen uno o mas estereoisomeros de monatina, un edulcorante de alta intensidad que se origina de manera natural.

Description

COMPOSICIONES DE GOMA DE MASCAR QUE COMPRENDEN MONATINA Y METODOS PARA HACER LAS MISMAS Campo de la invención La presente invención se refiere a composiciones de goma de mascar nuevas, incluyendo gomas funcionales o chicles bomba, que comprenden monatina, y a métodos para hacer estas composiciones . La presente invención se refiere también a composiciones de goma de mascar que comprenden un estereoisómero de monatina específico, mezclas especificas de estereoisómeros de monatina y/o monatina producida por una vía biosintética (por ejemplo, dentro de células) o in vitro. Antecedentes de la invención El uso de edulcorantes de alta intensidad no calóricos se está incrementando debido a preocupaciones de salud generadas acerca de la obesidad en niños, diabetes tipo II y enfermedades relacionadas. De esta manera, existe la demanda de edulcorantes que tengan una dulzura significativamente más alta que los edulcorantes convencionales, tales como azúcar granulada (sucrosa) . Muchos edulcorantes de alta intensidad contienen sinsabores desagradables y/o inesperados y perfiles de dulzura menos que deseables. En intentos por superar estos problemas, la industria continua llevando a cabo búsqueda significativa para inhibidores de amargura, tecnologías que oculten los E . : 169970 sinsabores y mezclas de edulcorantes para lograr un perfil de dulzura similar al de la sucrosa. La monatina (ácido 2-hidroxi-2- (indol-3-ilmetil) -4- aminoglutárico) es un edulcorante de alta intensidad que se origina de manera natural aislado de la planta Sclerochiton ilicifolíus, encontrada en la Región Transval de Sudáfrica. La monatina no contiene carbohidratos o azúcar, y casi ninguna caloría, a diferencia de la sucrosa u otros edulcorantes nutritivos que tienen una dulzura igual. Breve descripción de la invención La presente invención se refiere a composiciones de goma de mascar que comprenden composiciones de goma de mascar que comprenden monatina (ácido 2-hidroxi-2~ (indol-3-ilmetil) - 4-aminoglutárico - también conocido como ácido 4-amino-2- hidroxi-2- (lH-indol-3 -ilmetil) -pentanodioico, o alternativamente, a base de un sistema de numeración alterno, ácido 4-hidroxi-4- (3 -indolilmetil) glutámico, un compuesto que tiene la fórmula: La monatina es un edulcorante de alta intensidad y que se origina de manera natural . La monatina tiene cuatro formas estereoisoméricas : 2R, 4R (el westereoisómero R,R" o "R,R monatina"), 2S, 4S (el "estereoisómero S,S" o "S,S monatina"), 2R, 4S (el "estereoisómero R,S" o "R,S monatina") y 2S, 4R (el "estereoisómero S,R" o "S,R monatina"). Según se usa en la presente, a menos que se indique lo contrario, "monatina" se refiere a todos los cuatro estereoisómeros de monatina, asi como a cualquier mezcla de cualquier combinación de estereoisómeros de monatina (por ejemplo, una mezcla de los estereoisómeros R, R y S,S de monatina) . La monatina tiene una excelente calidad de dulzura. La monatina tiene un bajo perfil de sabor que es tan limpio o más limpio que el de otros edulcorantes, de alta intensidad conocidos. La curva de respuesta a dosis de la monatina es más lineal, y por lo tanto más similar a la de la sucrosa que otros edulcorantes de alta intensidad, tales como sacarina. El excelente perfil- de dulzura de la monatina la hace deseable para usarse en composiciones de goma de mascar, edulcorantes para mesa, alimentos, bebidas y otros productos. Diferentes estereoisómeros de monatina, incluyendo los estereoisómeros R,R y S,S, tienen potencial en la industria de los edulcorantes, ya sea como ingredientes separados o en mezclas. La monatina, y mezclas de estereoisómeros de monatina con otros edulcorantes, se cree que tienen características de sabor superiores y/o cualidades físicas, en comparación con otros edulcorantes de alta intensidad. Por ejemplo, la monatina es más estable que el aspartame (también conocido como "APM" ) , tiene un sabor más puro que el de la sacarina y un estereoisomero. (R,R monatina) es más dulce que el de sucralosa. Asimismo, los edulcorantes de monatina no tienen el sabor posterior amargo asociado con la sacarina, o los sabores posteriores metálicos, ácidos, astringentes o de quemazón de garganta de algunos edulcorantes de alta potencia. Además, los edulcorantes de monatina no exhiben el sabor posterior a regaliz asociado con ciertos edulcorantes naturales, tales como esteviosida y glicirricina . Más aún, a diferencia de los edulcorantes de aspartame, los edulcorantes de monatina no requieren de una advertencia de fenilalanina para pacientes con fenilcetonuria. Igualmente, se espera que la monatina no sea cariogénica (es decir, que no promueva las caries dentales) toda vez que no contiene carbohidratos fermentables . Se espera también que la monatina no ocasione una caída debajo de un pH de -5.7 (el cual podría ser dañino para los dientes) cuando se mezcle con saliva, medida por una prueba de caída de pH. Debido a su intensa dulzura, el estereoisómero R,R en particular debe ser económicamente competitivo en comparación con otros edulcorantes de alta intensidad. En un aspecto, la presente invención proporciona una composición de goma de mascar que incluye una porción de base para goma y una porción soluble, en donde la porción soluble incluye monatina, tal como R,R, S,S, R,S, o S,R monatina, o una mezcla de diferentes estereoisómeros . En una modalidad, la porción de base para goma comprende 3 a 50% en peso de un elastómero, 0.5 a 25% en peso de un ablandador; 2 a 30% en peso de un emulsionante; 5 a 75% en peso de una resina y 0 a 20% en peso de un relleno. El término "porcentaje en peso" significa % en peso. Por ejemplo, 1% en peso se refiere a 1 gramo por 100 gramos, o 10 gramos por 1 kg. en otra modalidad, la porción de base para goma puede representar 15 a 30% en peso de la composición. En otras modalidades, el elastómero se puede seleccionar de un hule natural, una goma natural, una goma biodegradable, un - elastómero sintético y una combinación de los mismos. Por ejemplo, el hule natural puede seleccionarse a partir de látex ahumado, látex líquido y guayule. La goma natural y/o biodegradable se puede seleccionar, por ejemplo, de jelutong, perillo, sorva, masaranduba balata, masaranduba chocolate, níspero, rosindiña, chicle, gutta hang kang, arabinogalactano, guar, xantano y gomas hechas de proteínas, tales como gluten y zeína. El término "natural" significa que existe en la naturaleza o es formado por la misma. El término "biodegradable" significa que es capaz de alterarse o descomponerse a través de la acción de procesos o agentes biológicos, tales como organismos vivos. En algunas modalidades, la goma biodegradable es menos pegajosa o no pegajosa. El elastómero sintético se puede seleccionar de, por ejemplo, copolímeros de butadieno-estireno, copolímeros de isobutileno-isopreno, polibutadieno, poliisobutileno y elastómeros poliméricos de vinilo. En algunas modalidades, un ablandador (también conocido como un plastificante) puede incluir uno o más de sebo, sebo hidrogenado, aceites vegetales hidrogenados, aceites vegetales parcialmente hidrogenados, manteca de cacao, monoestearato de glicerol, triacetato de glicerol, lecitina, monoglicéridos, diglicéridos, triglicéridos, monoglicéridos acetilados, ácidos grasos, jarabes, tales como jarabes de poliol (por ejemplo, jarabe de maltitol, jarabe de glicerol y glicerol) y jarabes poliólicos mixtos, y una combinación de los mismos. En otras modalidades, el relleno puede ser uno o más de lecitina, inulina, polidextrina, carbonato de calcio, carbonato de magnesio, silicato de magnesio, cal molida, silicato de aluminio, talco, alúmina, dióxido de titanio y fosfato de calcio. En otras modalidades, el emulsionante puede ser monoestearato de glicerol, lecitina, ácido poliglicerol polirricinoleico o estearato de magnesio. En otras modalidades, la resina puede ser un éster de colofonia, una resina de terpeno, un acetato de polivinilo, alcohol polivinílico, acetato de etilenvinilo, o copolímero de acetato de vinilo-laurato de vinilo. En otras odalidades, el éster de colofonia puede ser un éster glicerólico de una colofonia parcialmente hidrogenada, un éster glicerólico de colofonia polimerizada, un éster glicerólico de colofonia parcialmente dimerizada, un éster glicerólico de colofonia un éster pentaeriltritólico de colofonia parcialmente hidrogenada, un éster metílico de colofonia o un éster metílico de colofonia parcialmente hidrogenada . En modalidades, el emulsionante y el ablandador, el emulsionante y el relleno, el emulsionante y el relleno pueden ser compuestos diferentes. En otras modalidades, la porción soluble puede incluir además un edulcorante global, por ejemplo, un edulcorante de maíz, sucrosa, dextrosa, azúcar invertida, dextrina, fructosa, nebulosa, sólidos de jarabe de maíz, galactosa, trehalosa. isomaltulosa o una combinación de los mismos. Como alternativa, la porción soluble puede incluir además un edulcorante de alta intensidad o carbohidrato glicémico inferior (es decir, uno menos glicémico que la sucrosa) . Por ejemplo, edulcorante de alta intensidad o carbohidrato glicémico inferior se puede seleccionar de sorbitol (incluyendo sorbitol amorfo y cristalino), manitol, maltitol, hidrolisados de almidón hidrogenado, xilitol, alitame, taumatina, sucralosa, aspartame, acesulfame K, una dihidrochalcona, sacarina, neotame, un ciclamato, esteviosida, mogrosida, tagatosa, eritritol, isomalta, lactitol, glicirricina, filodulcina, monelina, mabinlina, brazelna, curculina, miraculina y pentadina. Como alternativa, la porción soluble puede incluir además un agente saborizante. Por ejemplo, el agente saborizante puede ser un aceite esencial o un sabor sintético, o una combinación de los mismos. El aceite esencial puede ser, por ejemplo, aceite de menta, aceite de hierbabuena o aceite de gaulteria. Como alternativa, el agente saborizante puede ser, por ejemplo, un agente saborizante de frutas (por ejemplo, aceite de naranja, aceite de limón, plátano, cereza, manzana, piña, uva, fresa, tutti-fruti, sandía o combinaciones de los mismos). En ciertas modalidades, la presente invención proporciona formulaciones de goma de mascar que comprenden el estereoisómero R,R de monatina, el estereoisómero S,S de monatina y/o una mezcla de estereoisómeros de monatina. Se puede proporcionar monatina, tal como en una mezcla de estereoisómeros, en forma sólida (por ejemplo, secada por congelación, cristalina, amorfa y/o en polvo) y líquida. En una modalidad, las composiciones de goma de mascar comprenden monatina o una sal de la misma en una cantidad que proporciona una dulzura comparable a la dulzura provista por la cantidad de sucrosa (y/o otros carbohidratos) presente en las composiciones de goma de mascar conocidas. Una "dulzura comparable" significa que un evaluador sensorial experimentado, en promedio, determinará que la dulzura presentada en una primera composición está dentro de una escala de 80% a 120% de la dulzura presentada en una segunda composición. En otra modalidad, una composición de goma de mascar comprende monatina o sal de la misma en una cantidad que proporciona dulzura a largo plazo incrementada. "Dulzura a largo plazo incrementada" significa una dulzura incrementada con el tiempo en comparación con la dulzura proporcionada con el tiempo por el aspartame o sucralosa en composiciones de goma de mascar similares. En una modalidad, el estereoisómero R,R de monatina representa aproximadamente 0.009 a aproximadamente 0.1% en peso de la composición (por ejemplo, alrededor de 0.015 a aproximadamente 0.025% en peso de la composición) . En otra modalidad, el estereoisómero S,S de monatina representa aproximadamente 0.1 a aproximadamente 1.1% en peso de la composición (por ejemplo, alrededor de 0.15 a aproximadamente 0.88 en peso de la composición). En otras modalidades, la porción soluble incluye una mezcla del estereoisómero S,S de monatina y acesulfame K (por ejemplo, alrededor de 0.1 a aproximadamente 1.1% en peso de la monatina y aproximadamente 0.1 a alrededor de 0.3% en peso de acesulfame K) . En otras modalidades, la monatina est encapsulada, ya sea sola o en combinación con otras sustancias .

El término "aproximadamente" abarca la escala de error experimental que ocurre en cualquier medición. A menos que se indique lo contrario, todos los números de medición se presume que tienen la palabra "aproximadamente" enfrente de ellos incluso si la palabra "aproximadamente" no se usa expresamente . "Encapsulado" significa encerrado o mantenido dentro de una cubierta o microcápsula, en donde, por ejemplo, la microcápsula protege a las sustancias encerradas, permitiéndoles ser liberadas más lentamente al ser masticadas. En ciertas modalidades, la porción soluble puede incluir además un edulcorante global, un edulcorante de alta intensidad o carbohidrato glicémico inferior, y un agente saborizante. En otras modalidades, la porción soluble puede incluir una mezcla de monatina y un ciclamato. En otras modalidades varios edulcorantes (incluyendo monatina) , asi como mezclas de edulcorante (incluyendo monatina) /saborizantes , se pueden encapsular, y coprocesarse y cosecarse. En algunas modalidades, las composiciones de goma de mascar comprenden monatina que comprende esencialmente en S,S o R,R monatina. En otras modalidades, las composiciones contienen predominantemente S,S o R,R monatina. "Predominantemente" significa que los estereoisómeros de monatina presentes en la composición, la monatina contiene más de 90% de un estereoisómero particular. En algunas modalidades, las composiciones están sustancialmente libres de S,S o R,R monatina. "Sustancialmente libres" significa los estereoisómeros de monatina presentes en la composición, la composición contiene menos de 2% de un estereoisomero particular. Además, o alternativamente, cuando se usa para describir la monatina producida en una vía biosintética, "sustancialmente libres" abarca la cantidad de un estereoisomero (por ejemplo, S,S monatina) producida como un subproducto en una vía biosintética que incluye enzimas quirales específicas (por ejemplo, D-aminoácido deshidrogenasas o D-aminoácido aminotransferasas) y/o substratos quirales específicos (por ejemplo, uno que tenga carbono en la estereoconfiguración R) para producir un estereoisómero específico diferente (por ejemplo, R,R monatina) . En otro aspecto de la presente invención, se proporciona una composición de goma de mascar que incluye una mezcla de monatina estereoisoméricamente enriquecida producida en una vía biosintética. "Mezcla de monatina estereoisoméricamente enriquecida" significa que la mezcla contiene más que un estereoisómero de monatina y por lo menos 60% de los estereoisómeros de monatina en la mezcla es un estereoisómero particular, tal como R,R, S,S, S,R o R,S. En otras modalidades, la mezcla contiene más de 65%, 7%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ó 99% de un estereoisómero de monatina particular. En otra modalidad, una composición de goma de mascar comprende una R,R o S,S monatina enriquecida estereoisoméricamente . R,R monatina "estereoisoméricamente enriquecida" significa que la monatina comprende al menos 60% de R,R monatina. S,S monatina "estereoisoméricamente enriquecida" significa que la monatina comprende al menos 60% de S,S monatina. En otras modalidades, monatina "estereoisoméricamente enriquecida" comprende más de 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ó 99% de R,R o S,S monatina. En otro aspecto de la presente invención, se proporciona un método para hacer una composición de goma de mascar. El método incluye producir biosintéticamente monatina ya sea in vivo o in vitro. Una "vía biosintética" comprende al menos una etapa de conversión biológica. En algunas modalidades, la vía biosintética es un proceso de varias etapas y al menos una etapa es una etapa de conversión biológica. En otras modalidades, la vía biosintética es un proceso de varias etapas que incluye etapas de conversión tanto biológica como química. En algunas modalidades, la monatina producida es una mezcla de monatina estereoisoméricamente enriquecida. En otro aspecto de la presente invención, existen varias vías biosintéticas para hacer monatina a partir de substratos seleccionados de glucosa, triptófano, ácido indol-3-láctico, así como indol-3-piruvato y ácido 2-hidroxi-2- (indol-3-ilmetil) -4-cetoglutárico (también conocido como "el precursor de monatina" , "MP" o la forma alfa-ceto de monatina) . Ejemplos de vías biosintéticas para producir o hacer monatina o sus intermediarios se describen en las figuras 1-3 y 11-13, las cuales muestran productos intermediarios potenciales y productos finales en cuadros . Por ejemplo, una conversión de un producto en otro, tal como glucosa en triptófano, triptófano en indol-3 -piruvato, indol-3-piruvato-MP, MP en monatina o ácido indol-3 -láctico (indol-lactato) en indol-3-piruvato, ocurre en estas vías. Estas conversiones dentro de las vías biosintéticas pueden ser facilitadas por medio de conversiones químicas y/o biológicas. El término "convertir" se refiere al uso ya sea de medios químicos o de al menos un polipéptido en una reacción para cambiar un primer intermediario por un segundo intermediario. Las conversiones pueden tener lugar in vivo o in vi tro. El término "conversión química" se refiere a una reacción que no es facilitada activamente por un polipéptido. El término "conversión biológica" se refiere a una reacción que es facilitada activamente por uno o más polipéptidos . Cuando se usan conversiones biológicas, los polipéptidos y/o células pueden ser inmovilizados sobre soportes tal como mediante fijación química sobre soportes poliméricos. La conversión se puede lograr usando cualquier reactor conocido por alguien capacitado en la técnica, por ejemplo en un reactor intermitente o continuo.

Ejemplos de polipéptidos , y sus secuencias de codificación, que se pueden usar para llevar a cabo conversiones biológicas se muestran en las figuras 1-3 y 11-13. Los polipéptidos que tienen una o más mutaciones por puntos que permiten que la especificidad de substrato y/o actividad de los polipéptidos sea modificada, pueden usarse para hacer monatina. Las células aisladas y recombinantes que expresan esos polipéptidos se pueden usar para producir monatina. Estas células pueden ser cualquier célula, tal como la célula vegetal, animal, bacteriana, de levadura, de algas , arqueal o de hongos . Por ejemplo, las células productoras de monatina pueden incluir una o más (tales como dos o más, o tres o más) de las siguientes actividades: triptófano aminotransferasa (EC 2.6.1.27), tirosina (aromática) aminotransferasa (EC 2.6.1.5), triptófano deshidrogenasa (EC 1.4.1.19), glutamato deshidrogenasa (EC 1.4.1.2, 1.4.1.3, 1.4.1.4), fenilalanina deshidrogenasa (EC 1.4.1.20), tripfófano-fenilpiruvato transaminasa (EC 2.6.1.28), aminotransferasa de substratos múltiples (EC 2.6.1.-), aspartato aminotransferasa (EC 2.6.1.1), L-aminoácido oxidasa (EC 1.4.3.2), triptófano oxidasa (sin número EC, Hadar et al., J. Bacteriol 125:1096-1104, 1976 y Furuya et al., Biosci Biotechnol Biochem 64:1486-93, 2000), D-aminoácido deshidrogenasa (EC 1.4.99.1), D-aminoácido oxidasa (EC 1.4.3.3), D-alanina aminotransferasa (EC 2.6.1.21), sintasa/liasa (EC 4.1.3.-), tal como 4-hidroxi-2-oxoglutarato aldolasa (EC 4.1.3.16) o 4-hidroxi-4-metil-2-oxoglutarato aldolas (EC 4.1.3.17) y/o sintasa/liasa (4.1.2.-). En otro ejemplo, las células pueden incluir una o más (tal como dos o más, o tres o más) de las siguientes actividades: indolelactato deshidrogenasa (EC 1.1.1.110), R- 4-hidroxifenilactato deshidrogenasa (EC 1.1.1.222), 3-(4)-hidroxifenilpiruvato reductasa (EC 1.1.1.237), lactato deshidrogenasa (EC 1.1.1.27, 1.1.1.28, 1.1.2.3), (3-imidazol-;5-il) lactato deshidrogenasa (EC 1.1.1.111), lactado oxidasa (EC 1.1.3.-), sintasa/liasa (4.1.3.-) tal como 4-hidroxi-2- oxoglutarato aldolasa (EC 4.1.3.16) o 4~hidroxi-4-metil-2- oxoglutarato aldolasa (EC 4.1.3.17), sintasa/liasa (4.1.2.-), triptofano aminotransferasa (EC 2.6.1.27), tirosina (aromática) aminotransferasa (EC 2.6.1.5), triptofano deshidrogenaba (EC 1.4.1.19), glutamato deshidrogenasa (EC 1.4.1.2, 1.4.1.3, 1.4.1.4), fenilalanina deshidrogenasa (EC 1.4.1.20), triptófano-fenilpiruvato transaminasa (EC 2.6.1.28), aminotransferasa de substratos múltiples (EC 2.6.1.-), aspartato aminotransferasa (EC 2.6.1.1), D- triptófano aminotransferasa, D-aminoácido deshidrogenasa (EC 1.4.99.1) y/o D-alanina aminotransferasa (EC 2.6.1.21). Además, las células pueden incluir una o más (tal como dos o más, o tres o más) de las siguientes actividades: triptófano arainotransferasa (EC 2.6.1.27), tirosina (aromática) aminotransferasa (EC 2.6.1.5), triptóf no deshidrogenasa (EC 1.4.1.19), glutamato deshidrogenasa (EC 1.4.1.2, 1.4.1.3, 1.4.1.4), fenilalanina deshidrogenasa (EC 1.4.1.20), triptófano-fenilpiruvato transaminasa (EC 2.6.1.28), aminotransferasa de substratos múltiples (EC 2.6.1.-), aspartato aminotransferasa (EC 2.6.1.1), L-aminoácido oxidasa (EC 1.4.3.2), triptófano oxidasa, D-triptófano aminotransferasa, D-aminoácido deshidrogenasa (EC 1.4.99.1), D-aminoácido oxidasa (EC 1.4.3.3), D-alanina aminotransferasa (EC 2.6.1.21), indol-lactato deshidrogenasa (EC 1.1.1.110), R-4-hidroxifenilactato deshidrogenasa (EC 1.1.1.222), 3 - ( ) -hidroxifenilpiruvato reductasa (EC 1.1.1.237), lactato deshidrogenasa (EC 1.1.1.27, 1.1.1.28, 1.1.2.3), (3 -imidazol-5-il) lactato deshidrogenasa (EC 1.1.1.111), lactato oxidasa (EC 1.1.3.-), sintasa/liasa (EC 4.1.3.-), tal como 4-hidroxi-2-oxoglutarato aldolasa (EC 4.1.3.16) o 4-hidroxi-4-metil-2 -oxoglutarato aldolasa (EC 4.1.3.17) y/o sintasa/liasa (4.1.2.-). Como un ejemplo más, las células pueden incluir una o más de las siguientes actividades de aldolasa: KHG aldolasa, ProA aldolasa, KDPG aldolasa y) polipéptidos relacionados (KDPH) , transcarboxibenzalpiruvato hidratasa-aldolasa, 4- (2-carboxifenil) -2-oxobut-3-enoato aldolasa, trans-O-hidroxibencilidenpiruvato hidratasa-aldolasa, 3-hidroxiaspartato aldolasa, benzoin aldolasa, dihidroneopterin aldolasa, L-treo-3 -fenilserina · benzaldehido-liasa (fenilserina aldolasa) , 4-hidroxi~2~oxovalerato aldolasa, 1, 2-dihidroxibencilpiruvato aldolasa y/o 2-hidroxibenzalpiruvato aldolasa. La monatina puede producirse mediante métodos que incluyan poner en contacto triptófano y/o ácido indol-3-láctico con un primer polipéptido, en donde el primer polipéptido convierta triptófano y/o ácido indol-3-láctico en indol-3 -piruvato (ya sea la forma D o la forma L de triptófano o ácido indol-3-láctico se puede usar como el substrato que se convierte en indol-3-piruvato; alguien capacitado en la técnica apreciará que los polipéptidos seleccionados para esta etapa exhiben idealmente la especificidad adecuada) , poniendo en contacto el indol-3-piruvato resultante con un segundo polipéptido, en donde el segundo polipéptido convierta al indol-3-piruvato en ácido 2-hidroxi 2- (indol-3-ilmetil) -4-cetoglutárico (MP) , y poniendo en contacto la MP con un tercer polipéptido, en donde el tercer polipéptido convierta MP en monatina. Los polipéptidos ejemplares que se pueden usar para estas conversiones se muestran en las figuras 2 y 3. Producir monatina en una vía biosintética por medio de una o más conversiones biológicas propociona ciertas ventajas. Por ejemplo, mediante el uso de polipéptidos específicos y/o ciertos substratos en la vía biosintética, se puede producir una mezcla enriquecida en un estereoisómero específico y/o producir una mezcla de monatina que esté sustancialmente libre de uno o más estereoisómeros . Una composición de monatina puede incluir impurezas como una consecuencia del método usado para la síntesis de monatina. Las composiciones de monatina producidas por medios puramente sintéticos (es decir, que no incluyan al menos una conversión biológica) contendrán diferentes impurezas que las composiciones de monatina producidas por la vía biosintética. Por ejemplo, con base en la materia prima usada, las composiciones de monatina producidas por medios puramente sintéticos pueden incluir contaminantes petroquímicos , tóxicos y/u otros contaminantes peligrosos inadecuados para consumo humano. Ejemplos de estos contaminantes son químicos peligrosos, tales como LDA, hidrógeno-Pd/C, diazometano, KCN, reactivo de Grignard y Na/HG. Por otro lado, se espera que una composición de monatina producida por medio de una vía biosintética pueda contener impurezas comestibles o potables, pero no contener material petroquímico, tóxido y/u otro material peligroso. Se espera que un método para producir monatina en una vía biosintética por medio de una o más conversiones biológicas produzca menos contaminantes tóxicos o peligrosos y/o pueda proporcionar un porcentaje más alto de un estereoisómero particular, en comparación con medios puramente sintéticos. Por ejemplo, se espera que cuando se haga monatina usando D-aminoácido deshidrogenasas, D-alanina (aspartato) aminotransferasas, aminotransferasas D-aromáticas o D-metionina aminotransferasas, se pueda obtener por lo menos 60% de R,R monatina y menos de 40% de S,S, S,R y/o R,S monatina. Se espera también que, por ejemplo, cuando se haga monatina usando las D-enzimas mencionadas arriba, así como por lo menos un substrato (por ejemplo, el precursor de monatina) que tenga un carbono en la estereoconfiguración R, se pueda obtener por lo menos 95% de R,R monatina y menos de 5% de S,S, S,R y/o R,S monatina. En contraste, se espera que cuando se haga monatina por medios puramente sintéticos, se obtenga alrededor de 25%-50% del estereoisómero deseado. En una modalidad, un método para producir monatina por medio de una vía biosintética, por ejemplo, que incluya uno o más de conversión biológica, no produce contaminantes petroquímicos, tóxicos o peligrosos. "Contaminantes petroquímicos , tóxicos o peligrosos" significa que cualquier material que sea petroquímico, tóxico y peligroso y/o de otra manera inadecuado para consumo humano, incluyendo aquellos contaminantes proporcionados como materia prima o creados cuando se produce monatina por medios puramente sintéticos. En otra modalidad, un método para producir monatina por una vía biosintética, por ejemplo, incluye uno o más de conversión biológica, produce sólo material comestible o potable. "material comestible o potable" significa uno o más compuestos o materiales que son adecuados para ser comidos o bebidos por humanos, o de otra manera seguros para consumo humano. Ejemplos de material comestible o potable incluyen monatina, triptófano, piruvato, glutamato, otros aminoácidos, así como otros compuestos o materiales que estén presentes naturalmente en el cuerpo. En una modalidad, una composición de goma de mascar comprende una porción de base para goma y una porción soluble, en donde la porción soluble comprende monatina o una sal de la misma. En otra modalidad, la porción soluble comprende además un saborizante cítrico. En otra modalidad, la porción soluble comprende además un saborizante cítrico, en donde la monatina o sal de la misma está presente en una cantidad que incrementa el sabor proporcionado por el sabor cítrico. En otras modalidades, la porción soluble comprende además un ciclamato y/o eritritol . En otras modalidades, una composición de goma de mascar que comprende monatina o sal de la misma contiene menos calorías y carbohidratos que la misma cantidad de la composición de goma de mascar que contiene sucrosa en lugar de la monatina o sal de la misma. En otra modalidad, la composición de goma de mascar comprende monatina o sal de la misma, y no es cariogénica. En otra modalidad, la composición de goma de mascar comprende monatina o sal de la misma presente en una cantidad que proporciona una dulzura incrementada y sabor oculto o incrementado, en comparación con otros edulcorantes de alta intensidad, tales como aspartame o sucralosa, sustituidos por monatina en la composición de goma de mascar. En otra modalidad, un método para hacer una goma de mascar endulzada con monatina que tiene dulzura a largo plazo incrementada provista por la monatina, comprende las etapas de: (a) producir monatina o sal de la misma a través de una vía biosintética; (b) combinar monatina o sal de la misma con otros ingredientes y (c) formar la composición de goma de mascar. En otra modalidad, una composición de goma de mascar comprende monatina o sal de la misma, en donde la monatina o sal de la misma está presente en una cantidad que proporciona una dulzura a largo plazo incrementada. En una modalidad, una composición de goma de mascar comprende monatina o sal de la misma presente en una cantidad que proporciona una dulzura prolongada en comparación con aspartame o sucralosa. En otra modalidad, una composición de goma de mascar comprende alrededor de 0.001 a aproximadamente 1.1% en peso de monatina o sal de la misma. Por ejemplo, la composición de goma de mascar puede comprender más de aproximadamente 0.25% en peso a alrededor de 1.1% en peso de monatina o sal de la misma. En otra modalidad, una composición de goma de mascar comprende alrededor de 0.009 a aproximadamente 0.1% en peso de R,R de monatina o sal de la misma. Por ejemplo, la composición de goma de mascar puede comprender alrededor de 0.015 a aproximadamente 0.025% en peso de R,R monatina o sal de la misma. En otra modalidad, una composición de goma de mascar comprende alrededor de 0.1 a aproximadamente 1.1% en peso de S,S monatina o sal de la misma. Por ejemplo, la composición de goma de mascar puede comprender de más de aproximadamente 0.25% en peso a alrededor de 1.1% en peso de S,S monatina o sal de la misma, o comprender alrededor de 0.15 a aproximdamente 0.88% en peso de S,S monatina o sal de la misma, o comprender de más de aproximadamente 0.25% en peso a alrededor de 0.88% en peso de S,S monatina o sal de la misma. En otra modalidad, una composición de goma de mascar comprende alrededor de 0 a aproximadamente 1.1% en peso de S,S monatina o sal de la misma, y de alrededor de 0 a aproximadamente 0.1% en peso R,R monatina o sal de la misma. En otras modalidades, una composición de goma de mascar comprende monatina o sal de la misma que está sustancialmente libre de S,S monatina o sal de la misma, o que está sustancialmente libre de R,R monatina o sal de la misma. En otras modalidades, la composición de goma de mascar comprende alrededor de 0.1 o menos% en peso de R,R monatina o sal de la misma, y está sustancialmente libre de S,S, S,R o R,S monatina o sal de la misma. En otras modalidades, la composición de goma de mascar comprende alrededor de 1.1 o menos¾ en peso de S,S monatina o sal de la misma, y está sustancialmente libre de R,R, S,R o R,S monatina o sal de la misma. En otras modalidades, una composición de goma de mascar consiste esencialmente en R,R monatina o sal de la misma, o consiste esencialmente en S,S monatina o sal de la misma. En otras modalidades, una composición de goma de mascar comprende R,R monatina estereoquímicamente enriquecida usando la misma, o una S,S monatina estereoquímicamente enriquecida o sal de la misma. En una modalidad, una monatina o sal de la misma comprende por lo menos 95% de R,R monatina o sal de la misma, o al menos 95% de S,S monatina o sal de la misma. En una modalidad, una composición de goma de mascar comprende monatina o sal de la misma producida en una vía biosintética. En una modalidad, una composición de goma de mascar comprende una porción de base para goma y una porción soluble que comprende monatina o sal de la misma, en donde todos los componentes de las porciones son naturales. En otra modalidad, una composición de goma de mascar que comprende monatina o sal de la misma es iodegradable . La composición de goma de mascar biodegradable puede comprender, por ejemplo, copolímeros de ácido láctico, proteínas, jelutong, perillo, sorva, masaranduba balata, masaranduba chocolate, níspero, rosindiña, chicle, guta hang kang, arabinogalactano, guar, xantano o una combinación de los mismos. En otras modalidades, una composición de goma de mascar comprende una porción de base de goma y una porción soluble, en donde la porción soluble comprende una mezcla de monatina estereoquímicamente enriquecida, y en donde la mezcla se produce por una vía biosintética . En otra modalidad, la vía biosintética es una vía de varias etapas y por lo menos una vía de varias etapas es una conversión química. En otras modalidades, la mezcla de monatina es ¦ predominantemente R,R monatina o sal de la misma, o es predominantemente S,S monatina o sal de la misma. En otras modalidades, una composición de goma de mascar comprende una porción de base para goma y una porción soluble, en donde la porción soluble comprende una composición de monatina producida en una vía biosintética, y en donde la composición de monatina no contiene contaminantes petroquímicos tóxicos o peligrosos. En otras modalidades, una composición de goma de mascar comprende monatina o sal de la misma producida en una vía biosintética y aislada a partir de una célula recombinante , y en donde la célula recombinante no contiene contaminantes petroquímicos, tóxicos o peligrosos. En ciertas modalidades, una composición de goma de mascar comprende una composición de base para goma y una porción soluble, en donde la porción de base para goma comprende 3 a 50% en peso de un elastómero; 0.5 a 25% en peso de un ablandador; 2 a 30% en peso de un emulsionante; 5 a 75% en peso de una resina y 0 a 20% en peso de un relleno. En algunas modalidades, el elastómero se selecciona del grupo que consiste en un hule natural, una goma natural, y un elastómero sintético. En algunas modalidades, el hule natural se selecciona del grupo que consiste en hule ahumado, hule líquido y guayule. En algunas modalidades, la goma natural se selecciona del grupo que consiste en jelutong, perillo, sorva, masaranduba balata, masaranduba chocolate, ; níspero, rosindiña, chicle y guta hang kang. En algunas modalidades, el elastómero sintético se selecciona del grupo que consiste en copolímeros de butadieno-estireno, , copolímeros de isobutileno-isopreno, polibutadieno, poliisobutileno y elastómeros poliméricos de vinilo. En algunas modalidades, el ablandador comprende uno o más de sebo, sebo hidrogenado, aceites vegetales hidrogenados, aceites vegetales parcialmente hidrogenados, manteca de cacao, monoestearato de glicerol, triacetato de glicerol, lecitina, monogliceridos, diglicéridos, triglicéridos , monogliceridos acetilados y ácidos grasos. En algunas modalidades, el relleno comprende uno o más de lecitina, inulina, polidextrina, carbonato de calcio, carbonato de magnesio, silicato de magnesio, cal molida, silicato de aluminio, talco, arcilla, alúmina, dióxido de titanio o fosfato de calcio. En algunas modalidades, el emulsionante es monoestearato de glicerol, lecitina, ácido poliglicerol poliricinoleico o estearato de magnesio. En algunas modalidades, la resina es un éster de colofonia, una resina de terpeno, un acetato de polivinal, alcohol polivinilico, acetato de etilen vinilo o copolímero de acetato de vinilo-laurato de vinilo. En algunas modalidades, el éster de colofonia es un éster glicerólico de colofonia parcialmente hidrogenada, un éster glicerólico de colofonia polimerizada, un éster glicerólico de colofonia parcialmente dimeriada, un éster glicerólico de colofonia, un éster pentaeritritólico de colofonia parcialmente hidrogenada, un éster metílico de colofonia o un éster metílico de colofonia parcialmente hidrogenada. En una modalidad, el emulsionante y el ablandador son compuestos diferentes. En otra modalidad, el emulsionante y el relleno son compuestos diferentes. En otra modalidad, el ablandador y el relleno son compuestos diferentes . En una modalidad, la porción soluble comprende además un edulcorante global. El edulcorante global puede ser, por ejemplo, un edulcorante de maíz, sucrosa, dextrosa, azúcar invertido, dextrina, fructosa, levulosa, sólidos de jarabe de maíz, galactosa, trehalosa, isomaltulosa o una combinación de los mismos. En una modalidad, la porción soluble comprende además un edulcorante de alta intensidad o carbohidrato glicémico inferior. El edulcorante de alta intensidad o carbohidrato glicémico inferior puede ser, por ejemplo, sorbitol, manitol, maltitol, hidrolizados de almidón hidrogenado, xilitol, alitame, taumatina, sucralosa, aspartame, acesulf me K, una dihidrochalcona, sacarina, neotame, un ciclamato, esteviosida, mogrosida, tagatosa, eritritol, isomalta, lactitol, glicirricina, filodulcina, monelina, mabinlina, brazeina, curculina, miraculina o pentadina. En una modalidad, la porción soluble comprende •además un agente saborizante. El agente saborizante puede ser, por ejemplo, un aceite esencial, un agente saborizante de frutas, un saborizante sintético o una combinación de los mismos. El aceite esencial puede ser por ejemplo, aceite de menta, aceite de hierbabuena o aceite de gaulteria. En algunas modalidades, el agente saborizante de frutas comprende un extracto, esencia o aceite de limón, lima, naranja, mandarina, toronja, cidro, kuncuat, plátano, cereza, manzana, piña, uva, fresa, tutti-fruti, sandía o combinaciones de los mismos. En una modalidad, una composición de goma de mascar comprende una porción de base para goma y una porción soluble, en donde la porción soluble comprende una mezcla de ,R y S,S monatina o sales de la misma. En otras modalidades, la porción soluble comprende una mezcla de monatina usando la misma y acesulfame K. En ciertas modalidades, una composición de goma de mascar comprende alrededor de 0.1 a aproximadamente 1.1% en peso de S,S monatina o sal de la misma y alrededor de 0.1 a aproximadamente 0.3% en peso de acesulfame , o comprende más de aproximadamente 0.25% en peso a aproximadamente 1.1% en peso de S,S monatina o sa de la misma y alrededor de 0.1 a aproximadamente 0.3% en peso de acesulfame K. En otras modalidades, una composición de goma de mascar comprende alrededor de 0.05 a aproximadamente 0.7% en peso de S,S monatina o sal de la misma y alrededor de 0.01 a aproximadamente .2% en peso de • acesulfame K, o comprende alrededor de 0.009 a aproximadamente 0.1% en peso de R,R monatina o sal de la misma y alrededor de 0.01 a aproximadamente 0.3% en peso de acesulfame K. En una modalidad, una composición de goma de mascar comprende una porción de base para goma y una porción soluble, en donde la porción soluble comprende monatina o sal de la misma que está encapsulada. En algunas modalidades, la porción de base para goma comprende 15 a 30% en peso de la composición. En otras modalidades, la porción soluble comprende además un edulcorante global, un edulcorante de alta intensidad, o carbohidrato glicémico inferior, y un agente saborizante. En una modalidad, un método para hacer una composición de goma de mascar que comprende monatina o sal de la misma comprende producir monatina o sal de la misma a partir de por lo menos un substato seleccionado de glucosa, triptófano, ácido indol-3-láctico, indol-3 -piruvato y el precursor de monatina. En ciertas modalidades, el método comprende combinar la monatina o sal de la misma con al menos algún otro ingrediente que no sea monatina o sal de la misma. En ciertas modalidades, la composición de goma de mascar hecha mediante el método comprende alrededor de 0 a aproximadamente 1.1% en peso de S,S monatina o sal de la misma, y alrededor de 0 aproximadamente 0.1% en peso de R,R monatina o sal de la misma. En ciertas modalidades, la composición de goma de mascar hecha mediante el método comprende más de aproximadamente 0.25% en peso a alrededor de 1.1% en peso de monatina o sal de la misma. En otra modalidad, un método para hacer una composición de goma de mascar que comprende monatina o sal de la misma comprende producir monatina o sal de la misma a través de una vía biosintética . En otra modalidad, un método para hacer una composición de goma de mascar que comprende monatina o sal de la misma comprende producir monatina o sal de la misma usando al menos una conversión biológica. En una modalidad, un método para hacer una composición de goma de mascar que comprende una composición de monatina comprende: (a) producir monatina o sal de la misma en una vía biosintética en una célula recombinante; (b) aislar la composición de monatina de la célula recombinante, en donde la composición de monatina consiste en monatina o sal de la misma y otro material comestible o potable. En otra modalidad, una composición de goma de mascar comprende monatina o sal de la misma y por lo menos algún otro ingrediente seleccionado de eritritol, trihalosa, sorbitol, manitol, maltitol, xilitol, alitame, taumatina, sucralosa, aspartame, acesulfame K, una dihidrochalcona, sacarina, neotame, un ciclamato, esteviosida, mogrosida, tagatosa, isomalta, lactitol, glicirricina, filodulcina, monelina, mabinlina, brazeína, curculina, miraculina y pentadina. En una modalidad, un método para hacer una composición de goma de mascar que comprende una composición de monatina comprende producir la composición de monatina en una vía biosintética, y en donde la composición de monatina no contiene contaminantes petroquímicos, tóxicos o peligrosos. En otra modalidad, un método para hacer una composición de goma de mascar que comprende una composición de monatina comprende producir la composición de monatina a partir de un substrato en' una vía de varias etapas, en donde una o más etapas de la vía de varias etapas es una conversión biológica, y en donde la composición de monatina no contiene contaminantes petroquímicos, tóxicos o peligrosos. En una modalidad, un método para hacer una composición de goma de mascar que comprende una composición de monatina comprende producir la composición de monatina en una vía biosintética, y en donde la composición de monatina consiste en monatina o sal de la misma y otro material comestible o potable. En otra modalidad, un método para hacer una composición de goma de mascar que comprende una composición de monatina comprende producir la composición de monatina a partir de un substrato en una vía de varias etapas, en donde una o más etapas en la vía de varias etapas es una conversión biológica, y en donde la composición de monatina consiste en monatina o sal de la misma y otro material comestible o potable. Será aparente para alguien capacitado en la técnica a partir de las enseñanzas de la presente que las modalidades específicas de la presente invención pueden estar dirigidas a una o a una combinación de los aspectos indicados arriba, así como a otros aspectos. Breve descripción de las figuras La figura 1 muestra vías biosintéticas usadas para producir monatina y/o indol-3-piruvato . Una vía produce indol-3-piruvato por medio de triptófano, mientras que otra produce indol-3-piruvato por medio de ácido indol-3 -láctico. La monatina se produce subsecuentemente por medio de un intermediario de MP. Los compuestos mostrados en cajas son substratos y productos producidos en vías biosintéticas. Las composiciones adyacentes a las flechas son cofactores, o reactivos que pueden usarse durante la conversión de un substrato en un producto. El cofactor o re.activo usado dependerá del polipéptido usado para la etapa particular de la vía biosintética. El cofactor PLP (5 '-fosfato de piridoxal) puede catalizar reacciones independientemente de un polipéptido, y por lo tanto, proporcionar simplemente PLP puede permitir la progresión del substrato en producto. La figura 2 es un diagrama más detallado de la vía biosintética que utiliza el intermediario de MP. Los substratos para cada etapa en las vías se muestran en cuadros. Los polipéptidos que permiten la conversión entre substratos se listan adyacentes a las flechas entre los substratos. Cada polipéptido es descrito por su nombre en común y un número de clase enzimática (EC) . La figura 3 muestra un diagrama más detallado de la vía biosintética de la conversión de ácido indol-3-láctico en indol-3-piruvato. Los substratos se muestran, en cuadros, y los polipéptidos que permiten la conversión entre los substratos se listan adyacentes a la flecha entre los substratos. Cada polipéptido es descrito por su nombre común y un número EC. La figura 4 muestra una reacción posible para hacer MP por medios químicos. Las figuras 5A y 5B son cromatogramas que muestran la identificación por LC/MS de la monatina producida' enzimáticamente .

La figura 6 es un espectro de masas por electroaspersion de monatina sintetizada enzimáticamente. Las figuras 7A y 7B son cromatogramas de los análisis de iones hijos LC/MS/MS de monatina producidos en una mezcla enzimática. La figura 8 es un cromatograma que muestra la medición de masas de alta resolución de monatina producida enzimáticamente . Las figuras 9A-9C son cromatogramas que muestran la separación quiral de (A) R-triptófano, (B) S-triptófano y (C) monatina producida enzimáticamente. La figura 10 es una gráfica de barras que muestra la cantidad relativa de monatina producida en células bacterianas después de la inducción de IFTG. El (-) indica una falta de adición del substrato (no se añadió triptófano piruvato) . Las figuras 11-12 son diagramas esquemáticos que muestran vías usadas para incrementar el rendimiento de monatina producida a partir de triptófano o indol-3 -piruvato . La figura 13 es un diagrama esquemático que muestra una vía que se puede usar para incrementar el rendimiento de monatina producida a partir de triprófano o indol-3 -piruvato . La figura 14 presenta una curva de respuesta a dosis obtenida con un estereoisómero R,R de monatina. La figura 15 presente una curva de respuesta a dosis obtenida con una mezcla de estereoisómeros R,R/S,S de monatina.

La figura 16 compara la curva de respuesta a dosis obtenida con una mezcla de estereoisómeros R, /S,S de monatina con una curva de respuesta a dosis obtenida con sacarina . La figura 17 muestra cromatografía de fase inversa de normas de monatina sintéticamente producida. La figura 18 muestra cromatografía quiral de parámetros de monatina. Descripción detallada de la invención Vista General de las Vías Biosintéticas para la Producción de Monatina Las siguientes explicaciones de términos y métodos se proporcionan para describir mejor la presente descripción y para guiar a aquellos expertos en la técnica en la práctica de la presente descripción. Según se usa en la presente, "que incluye" significa "que comprende" . Además, las formas singulares "un" , "uno" o "una" o "el" , "la" incluyen referencias plurales a menos que el contexto claramente indique lo contrario. Según se usa en la presente, "goma de mascar" se refiere a todos los tipos de goma de mascar, incluyendo gomas funcionales y chicle bomba. "Goma funcional" se refiere a una goma de mascar que comprende al menos un componente funcional o medicinal. Por ejemplo, las gomas funcionales pueden suministrar medicamentos, tales como nicotina, aspirina o medicamentos para malestar en viajes (por ejemplo, dimenhidrinato) , o nutrientes (por ejemplo, vitaminas y/o minerales) o conponentes cosméticos (por ejemplo, ingredientes para blanquear dientes y/o refrescar el aliento) . Como se muestra en las figuras 1-3 y 11-13, se pueden usar muchas vías biosintéticas para producir monatina o sus intermediarios tales como indol-3-piruvato o MP . Para la conversión de cada substrato (por ejemplo, glucosa, triptófano, ácido indol-3-láctico, indol-3-piruvato y MP) en cada producto (por ejemplo, triptófano, indol-3-piruvato, MP y monatina), pueden usarse varios polipéptidos diferentes. Más aún, estas reacciones pueden llevarse a cabo in vivo, in vitro o a través de una combinación de reacciones in vivo y reacciones in vivo, tal como reacciones in vitro que incluyan reacciones químicas no enzimáticas. Por lo tanto, las figuras 1-3 y 11-13 son ejemplares, y muestran varias vías diferentes que pueden usarse para obtener productos deseados . Glucosa en triptófano Muchos organismos pueden sintetizar triptófano a partir de glucosa. Las construcciones que tienen los genes necesarios para producir monatina, MP y/o indol-3-piruvato a partir de glucosa y/o triptófano pueden clonarse en estos organismos . En la presente se muestra que el triptófano puede convertirse en monatina. En otros ejemplos, un organismo puede ser manipulado usando polipéptidos conocidos para producir triptófano o para sobreproducir triptófano. Por e emplo, la patente de E.U.A. No. 4,371,614 describe una cepa de E. coli transformada con un plásmido que contiene un operón de triptófano tipo silvestre. Las titulaciones máximas de triptófano descritas en la patente de E.U.A. No. 4,371,614 son de aproximdamente 230 ppm. En forma similar, WO 8701130 describe una cepa de E. coli que ha sido genéticamente manipulada para producir triptófano y describe el incremento de la producción fermentativa de L-triprófano . Los expertos en la técnica reconocerán que los organismos capaces de producir triptófano a partir de glucosa también son capaces de utilizar otras fuentes de carbono y energía que pueden convertirse en glucosa o fructosa-6-fosfato, con resultados similares. Las fuentes de carbono y energía ejemplares incluyen, pero no están limitadas a, fructosa, sucrosa, almidón, celulosa o glicerol . Triptófano en indol-3 -piruvato Varios polipéptidos pueden usarse para convertir triptófano en indol-3 -piruvato . Los polipéptidos ejemplares incluyen, sin limitación, miembros de las clases de enzimas (EC) 2.6.1.27, 1.4.1.19, 1.4.99.1, 2.6.1.28, 1.4.3.2, 1.4.3.3, 2.6.1.5, 2.6.1.-, 2.6.1.1 y 2.6.1.21. Estas clases incluyen, sin limitación polipéptidos llamados triptófano aminotransferasa (también llamada L-fenilalanina-2-oxoglutarato aminotransferasa, triptófano transaminasa, 5- idroxitriptófano-cetoglutárico transaminasa, hidroxitriptófano aminotransferasa, L-triptófano aminotransferasa, L-triptófano transaminasa y L-triptófano : 2-oxoglutarato aminotransferasa) que convierte L-triptófano y 2-oxoglutarato en indol-3-piruvato y L-glutamato; D-triptófano aminotransferasa que convierte D-triptófano y un ácido 2-oxo en indol-3 -piruvato y un aminoácido; triptófano deshidrogenasa (también llamada NAD (P) -L-triptófano deshidrogenasa, L-triptófano deshidrogenasa, L-Trp-deshidrogenasa, TDH y L-triptófano :NAD (P) óxidorreductasa (desaminante) ) que convierte L-triptófano y NAD (P) en indol- 3-piruvato y NH3 y NAD (P) H; D-aminoácido deshidrogenasa, que convierte D-aminoácidos y FAD en indol-3 -piruvato y NH3 y FAD¾; triptófano-fenilpiruvato transaminasa (también llamada L-triptófano-cc-cetoisocaproato aminotransferasa y L-triptófano: fenilpiruvato aminotransferasa) que convierte L-triptófano y fenilpiruvato en ' indol-3-piruvato y L-fenilalanina; L-aminoácido oxidasa (también llamada ofio-aminoácido oxidasa y L-aminoácido :oxígeno óxidorreductasa (desaminante) ) que convierte un L-aminoácido y ¾0 y 02 en un ácido 2-oxo y NH3 y ¾02; D-aminoácido oxidasa (también llamada ofio-aminoácido oxidasa y D-aminoácido : oxígeno óxidorreductasa (desaminante) ) que convierte un D-aminoácido y ¾0 y 02 en un 2-oxoácido y N¾ y H202; y triptófano oxidasa que convierte L-triptófano y H20 y 02 en indol-3-piruvato y NH3 y H202. Estas clases contienen también tirosina (aromática) aminotransferasa, aspartate aminotransferasa, D-aminoácido (o D-alanina) aminotransferasa y aminotransferasa de amplio substrato (varios substratos) que tiene varias actividades aminotransferasa, algunas de las cuales pueden convertir triptófano y un ácido 2-oxo en indol-3-piruvato y un aminoácido . Once miembros de las clases aminotransferasa que tienen esta actividad se describen abajo en el ejemplo 1, incluyendo una nueva aminotransferasa mostrada en SEQ ID NOS : 11 y 12. Por lo tanto, esta descripción proporciona secuencias de aminoácidos y ácido nucleico aisladas que tienen al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% o incluso por lo menos 99% de identidad de secuencia con las secuencias mostradas en SEQ ID NOS : 11 y 12 , respectivamente . Esta descripción también abarca fragmentos y fusiones de las secuencias mostradas en SEQ ID NOS: 11 y 12 que codifican para un polipéptido que tiene actividad aminotransferasa o que conserva actividad aminotransferasa . Los fragmentos ejemplares incluyen, pero no están limitados a, por lo menos 10, 12, 15, 20, 25, 50, 100, 200, 500 ó 1,000 nucleótidos contiguos de SEQ ID NO: 11 o al menos 6, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 200, 300 ó 350 aminoácidos contiguos de SEQ ID NO: 12. Las secuencias descritas (y variantes, fragmentos y fusiones de las mismas) pueden ser parte de un vector. El vector puede usarse para transformar células hospederas, produciendo ¦ asi células recombinan es que pueden producir indol-3-piruvato a partir de triptofano, y en algunos ejemplos pueden producir además MP y/o monatina. Las L-aminoácido oxidasas (1.4.3.2) se conocen, y las secuencias pueden aislarse a partir de varias fuentes diferentes, tales como Vipera lebetine (sp P81375) , Ophiophagus hannah (sp P81383) , Agkistrodon rhodostoma (spP81382) , Crotalus atrox (sp P56742) , BurJ olderia cepacia, Arabidopsis thaliana, Caulobacter cresentus, Chlamydomonas reinhardtii , Mus musculus, Pseudomonas syringae y Rhodococcus str. Además, las triptofano oxidasas se describen en la literatura y pueden aislarse, por e emplo, a partir · de Coprinus sp . SF-1, col china con enfermedad de la raiz deforme, Arabidopsis thaliana, e hígado de mamífero. Un miembro de la clase de L-aminooxidasa que puede convertir triptofano en indol-3 -piruvato se describe abajo en el ejemplo 3, así como fuentes alternativas para clonación molecular. Muchos genes de D-aminoácido oxidasa están disponibles en bases de datos para clonación molecular. Se conocen las triptofano deshidrogenasas, y pueden asilarse, por ejemplo, de espinaca, Pisum sativum, Prosopis juliflora, chícharo, mesquita, trigo, maíz, tomate, tabaco, Chromobacerium violaceum y Lactobacilli . Se conocen muchas secuencias génicas de D-aminoácido deshidrogenasa . Como se muestra en las figuras 11-13, si una aminoácido oxidase, tal como triptófano oxidasa, se usa para convertir triptófano en indol-3-piruvato, puede añadirse catalasa para reducir o incluso eliminar la presencia de peróxido . Indol-3-lactato en índol-3-piruvato La reacción que convierte indol-3-lactato en indol-3-piruvato puede ser catalizada por una variedad de polipéptidos , tales como miembros de las clases 1.1.1.110, 1.1.1.27, 1.1.1.28, 1.1.2.3, 1.1.1.222, 1.1.1.237, 1.1.3.- o 1.1.1.111. La clase 1.1.1.110 de polipéptidos incluye indolelactato deshidrogenasas (también llamadas ácido indolelactático :NAD+ óxidorreductasa) . Las clases 1.1.1.27, 1.1.1.28 Y 1.1.2.3 incluyen lactato deshidrogenasas (también llamadas ácido láctico deshidrogenasas, lactato: NAD+ óxidorreductasa). La clase 1.1.1.222 contiene (R) -4-hidroxifenillactato deshidrogenasa (también llamada lactato D-aromático deshidrogenasa, lactato R-aromático deshidrogenasa y R-3- (4-hidroxifenil) lactato :NAD (P) +2 -óxidorreductasa) y la clase 1.1.1.237 contiene 3- (4-hidroxifenilpiruvato) reductasa (también llamada idroxifenilpiruvato reductasa y 4-hidroxifenillactato :NAD+ óxidorreductasa). La clase 1.1.3.- contiene lactato oxidasas y la clase 1.1.1.111 contiene (3-imidazol-5-il) lactato deshidrogenasas (también llamadas (S) -3- (imidazol-5- ' il) lactato :NAD (P) + óxidorreductasa) . Es probable que varios de los polipéptidos en estas clases permitan la producción de indol-3 -piruvato a partir de ácido indol-3-láctico . Ejemplos de esta conversión se proporcionan en el ejemplo 2. Reacciones químicas también pueden usarse para convertir ácido indol-3 -láctico en indol-3-piruvato . Estas reacciones químicas incluyen una etapa de oxidación que puede lograrse usando varios métodos, por ejemplo: oxidación con aire usando un catalizador B2 (China Chemical Repórter, vol . 13, No . 28, pág. 18(1), 2002), permanganato diluido y perclorato, o peróxido de hidrógeno en presencia de catalizadores de metal. Indol -3 -piruvato en ácido 2-hidroxi 2-(indol-3-ilmetil) -4-ceto-glutárico (MP) Varios polipéptidos conocidos que pueden usarse para converti indol-3-piruvato en MP. Las clases de polipéptidos ejemplares incluyen 4.1.3.-, 4.1.3.16, 4.1.3.17 y 4.1.2.-. Estas clases incluyen carbono-carbono sintasas/liasas, tales como aldolasas que catalizan la consensación de dos substratos de ácido carboxílico. La clase de polipéptidos EC 4.1.3.- son sintasas/liasas que forman enlaces carbono-carbono que utilizan substratos oxo-ácido (tales como indol-3-piruvato) como el electrófilo, mientras que EC 4.1.2.- son sintasas/liasas que forman enlaces carbono-carbono utilizando substratos de aldehido (tales como benzaldehído) como el electrófilo. Por ejemplo, el polipéptido descrito en EP 1045-029 (EC 4.1.3.16, -hidroxi-2-oxoglutarato glioxilato-liasa también llamado 4-hidroxi-2-oxoglutarato aldolasa, 2-oxo-4-hidroxiglutarato aldolasa o KHG aldolasa) convierte ácido glioxilico en piruvato en ácido 4-hidroxi-2-cetoglutárico, y el polipéptido 4-hidroxi-4-metil-2-oxoglutarato. aldolasa (EC 4.1.3.17, también llamado 4-hidroxi-4-metil-2-oxoglutarato piruvato-liasa o ProA aldolasa) , condensa dos ácidos ceto tales como dos piruvatos en 4-hidroxi-4-metil-2-oxoglutarato. Las reacciones utilizando estas liasas se describen en la presente . Las figuras 1-2 y 11-13 muestran diagramas esquemáticos de estas reacciones en las cuales una molécula de 3 carbonos (C3) se combina con indol-3-piruvato . Muchos miembros de las clases EC 4.1.2.- y 4.1.3.-, particularmente polipéptidos que utilizan PLP, pueden utilizar moléculas de C3 que sean aminoácidos tales como serina, cisteína y alanina o derivados de los mismos . Las condensaciones de aldol catalizadas por representantes de EC 4.1.2.- y 4.1.3.-requieren que la molécula de tres carbonos de esta vía sea piruvato o un derivado de piruvato. Sin embargo, otros compuestos pueden servir como una fuente de carbono de C3 y se pueden convertir en piruvato . La alanina puede ser transaminada por muchas transaminasas que utilicen PLP, incluyendo muchas de aquellas mencionadas arriba, para producir piruvato. Piruvato y amoníaco pueden obtenerse mediante reacciones de beta-eliminación (tales como aquellas catalizadas por triptofanasa o ß-tirosinasa) de L-serina, L-cisteina y derivados de serina y cisteína con grupos salientes suficientes, tales como O-metil-L-serina, O-bencil-L-serina, S-metilcisteína, S-bencilcisteína, S-alquil-L-cisteina, O-acil-L-serina y 3-cloro-L-alanina. El aspartato puede servir como una fuente de piruvato en reacciones de beta-liasa mediadas por PLP tales como aquellas catalizadas por triptofanasa (EC 4.1.99.1) y/o ß-tirosinasa (EC 4.1.99.2, también llamada tirosina-fenol liasa) . La velocidad de las reacciones de beta-liasa puede ser incrementada al llevar a cabo mutagénesis dirigida a sitio en los polipéptidos (4.1.99.1-2) como se describe por Mouratou et al. {J. Biol.. Che 274:1320-5, 1999) y en el ejemplo 8. Estas modificaciones permiten que los polipéptidos acepten substratos de aminoácidos dicarboxílicos . Lactato puede servir también como una fuente de piruvato, y es oxidado a piruvato por la adición de lactato deshidrogenasa y un cofactor oxidado o lactato oxidasa y oxígeno. Ejemplos de estas reacciones se describen abajo. Por ejemplo, como se muestra en la figura 2 y figuras 11-13, ProA aldolasa puede ponerse en contacto con indol-3-piruvato cuando se use piruvato como la molécula de C3. El MP también puede ser generado usando reacciones químicas, tales como las proporcionadas en el ejemplo 5. MP en monatina La conversión de MP en monatina puede caracterizarse por una o más de: triptófano aminotransferasas (2.6.1.27), triptófano deshidrogenasas (1.4.1.19), D-aminoácido deshidrogenasas (1.4.99.1), glutamato deshidrogenasas (1.4.1.2-4), fenilalanina deshidrogenasa (EC 1.4.1.20), triptóf no-fenilpiruvato transaminasas (2.6.1.28) o más generalmente miembros de la familia de aminotransferasas (2.6.1.-) tales como aspartato aminotransferasa (EC 2.6.1.1), tirosina (aromática) aminotransferasa (2.6.1.5), D-triptófano aminotransferasa, o D-alanina (2.6.1.21) aminotransferasa (figura 2). Once miembros de la clase de aminotransferasa se describen abajo (ejemplo 1), incluyendo un miembro nuevo de la clase mostrada en SEQ ID NOS : 11 y 12 y reacciones que demuestran la actividad de enzimas aminotransferasa y deshidrogenasa se proporcionan en el ejemplo 7. Esta reacción también se puede llevar a cabo usando reacciones químicas . La aminación del cetoácido (MP) se lleva a cabo mediante aminación reductora usando amoníaco y cianoborohidruro de sodio.

Las figuras 11-13 muestran polipéptidos adicionales que se pueden usar para convertir MP en monatina, así como proporcionar rendimientos incrementados de monatina a partir de indol-3-piruvato o triptófano. Por ejemplo, si se usa aspartato como el donador amino, aspartato aminotransferasa puede usarse para convertir el aspartato en oxaloacetato (figura 11) . El oxaloacetato se convierte en piruvato y dióxido de carbono mediante una descarboxilasa, tal como oxaloacetato descarboxilasa (figura 11) . Además, si se usa lisina como el donador amino, se puede usar lisina epsilón aminotransferasa para convertir la lisina en alisina (figura 12) . La alisina se convierte espontáneamente en 6-carboxilato de 1-piperidina (figura 12) . Si un polipéptido capaz de catalizar reacciones de aminación reductora (por ejemplo, glutamato deshidrogenasa) se usa para convertir MP en monatina, un polipéptido que puede reciclar NAD(P)H y/o producir un producto volátil (figura 13) puede usarse, tal como formiato deshidrogenasa . Consideraciones adicionales en el diseño de las vías biosintéticas Dependiendo de qué polipéptidos se usen para generar indol-3-piruvato, MP y/o monatina, cofactores, substratos y/o polipéptidos adicionales pueden proporcionarse a la célula de producción para incrementar la formación de producto. Además, la modificación genética puede diseñarse para incrementar la producción de productos tales como indol-3-piruvato, MP y/o monatina. De manera similar, una célula hospedera usada para la producción de monatina puede optimizarse. Remoción de peróxido de hidrógeno El peróxido de hidrógeno (H202) es un producto que, si se genera, puede ser dañino para la producción de células, polipéptidos o productos (por ejemplo intermediarios) producidos. La L-aminoácido oxidasa descrita arriba genera H202 como un producto. Por lo tanto, si se usa L-aminoácido oxidasa, el H202 resultante puede removerse o sus niveles reducirse para reducir el potencial de lesiones a la célula o producto . También se pueden usar catalasas para reducir el nivel de H202 en la célula (figuras 11-13) . La células de producción puede expresar un gen o una secuencia de ADNc que codifique para una catalasa (EC 1.11.1.6), la cual catalice la descomposición de peróxido de hidrógeno en agua y gas oxígeno. Por ejemplo, una catalaza puede ser expresada a partir de un vector transíectado en la célula de producción. Ejemplos de catalasas que pueden usarse incluyen, pero no están limitados a: tr|Q9EV50 (Staphylococcus xylosus) , trIQ9 BE8 {Bacillus halodurans) , tr|Q9URJ7 {Candida alhicans) , tr|P77948 (Streptomyces coelicolor) , tr | Q9RBJ5 {Xanthomonas campestris) (SwissProt Accesión Nos.). Los reactores biocatalíticos que utilizan L-aminoácido oxidasa, D-aminoácido oxidasa o triptófano oxidasa también pueden contener un polipéptido de catalasa. Modulación de la disponibilidad de 5' -fosfato de piridoxal (PLP) Como se muestra en la figura 1, PLP puede utilizarse en una o más de las etapas biosinteticas descritas en la presente. La concentración de PLP puede ser complementada de tal manera que el PLP no se vuelva una limitante en la eficiencia total de la reacción. La vía biosintética para vitamina B6 (el precursor de PLP) ha sido cuidadosamente estudiada en E. coli, y algunas de las proteínas han sido cristalizadas (Laber et al., FEBS Letters, 449:458, 1999). Dos de los genes (epd o gapB y serC) se requieren en otras vías metabólicas, mientras que tres genes (pdxA, pdxB y pdxJ) son únicos para la biosíntesis de fosfato de piridoxal . Uno de los materiales de partida en la vía de ?. coli es l-desoxi-D-xilulosa-5-fosfato (DXP) . La síntesis de este precursor a partir de metabolitos centrales de 2 y 3 carbonos comunes se cataliza por el polipéptido l-desoxi-D-xilulosa-5-fosfato sintasa (DXS) . El otro precursor es un derivado de treonina formado a partir de azúcar de 4 carbonos, 4-fosfato de D-eritrosa. Los genes requeridos para la conversión en fosf?-4-hidroxil-L treonina (HTP) son epd, pdxB y serC. La última reacción para la formación de PLP es una condensación intramolecular compleja y una reacción de cierre de anillos entre DXP y HTP, catalizada por los productos génicos de pdxA y pdxJ. Si PLP se vuelve un nutriente limitante durante la fermentación para producir monatina, la expresión incrementada de uno o más de los genes de la vía en una célula hospedera en producción puede usarse para incrementar el rendimiento de monatina. Un organismo hospedero puede contener varias copias de sus genes de vías nativa o copias de genes de vías no nativas pueden incorporarse en el genoma del organismo. Además, varias copias de los genes de vías salvajes pueden clonarse en el organismo hospedero. Una vía salvaje que se conserva en todos los organismos recicla los diferentes derivados de vitamina B6 a la forma PLP activa. Los polipéptidos implicados en esta vía son pdxK cinasa, pdxH oxidasa y pdxY cinasa. La sobreexpresion de uno o más de estos genes puede incrementar la disponibilidad de PLP. Los niveles de vitamina Bs pueden ser elevados mediante la eliminación o represión metabólica de los genes de la vía biosintetica nativa en el organismo hospedero. PLP reprime polipéptidos implicados en la biosíntesis del derivado de treonina precursora en la bacteria Flavobacterium sp. Cepa 238-7. Esta cepa bacteriana, libre de control metabólico, sobreproduce derivados de piridoxal y puede excretar hasta 20 mg/L de PLP. La manipulación genética del organismo hospedero que produce monatina en una forma similar permitirá la producción incrementada de LP sin sobreexpresión de los genes de la vía sintética. Utilización de amonio Las reacciones con triptofanasa pueden conducirse hacia la dirección sintética (producción de triptófano a partir de indol) al hacer amoníaco más disponible o mediante la remoción de agua. Las reacciones de aminación reductora, tales como aquellas catalizadas por glutamato deshidrogenasa, también pueden ser conducidas hacia delante por un exceso de amonio. El amoniaco puede hacerse disponible como un carbonato de amonio o sal de fosfato de amonio en un sistema de pH regulado con carbonato o fosfato . El amoniaco también puede ser provisto como piruvato de amonio o formiato de amonio. Como alternativa, el amoniaco puede suministrarse si la reacción se acopla con una reacción que genere amoniaco, tal como glutamato deshidrogenasa o triptófano deshidrogenasa. El amoniaco puede generarse mediante la adición de substratos naturales de EC 4.1.99.- (tirosina o triptófano) , los cuales serán hidrolizados a fenol o indol, purivato y NH3. Esto también permite un rendimiento incrementado de producto sintético sobre la cantidad de equilibrio normal al permitir que la enzima se hidrolice a su substrato preferido.

Remoción de productos y subproductos La conversión de triptofano en indol-3~piruvato por medio de una triptofano aminotransferasa puede afectar adversamente la velocidad de producción de indol-3-piruvato debido a que la reacción produce glutamato y requiere de co-substrato 2 -oxogluta ato (a-cetoglutarato) . El glutamato puede causar la inhibición de la aminotransferasa, y la reacción puede consumir grandes cantidades del co-substrato . Más aún, altas concentraciones de glutamato pueden ser dañinas a los procesos de separación corriente abajo. El polipéptido glutamato deshidrogenasa (GLDH) convierte el glutamato en 2 -oxoglutarato, reciclando de esta manera el co-substrato en la reacción catalizada por triptofano aminotransferasa . GLDH genera también equivalentes reductores (NADH o NADPH) que pueden usarse para generar energía para la célula (ATP) ba o condiciones aeróbicas . La utilización de glutamato por GLDH también reduce la formación de subproductos. Además, la reacción genera amoniaco, el cual puede servir como una fuente de nitrógeno para la célula o como un substrato en una aminación reductora para la etapa final mostrada en la figura 1. Por lo tanto, una célula de producción que sobreexprese un poliéptido GLDH se puede usar para incrementar el rendimiento y reducir el costo de medios y/o procesos de separación.

En la vía de triptófano o monatina, el donador amino de la etapa tres (por ejemplo, glutamato o aspartato) se puede convertir de nuevo en el receptor amino requerido para la etapa 1 (por ejemplo, 2-oxo-gutar to u oxaloacetato) , si una aminotransferasa de las clases de enzimas adecuadas se usa. La utilización de dos transaminasas separadas para esta vía, en la cual el substrato de una transaminasa no inhibe competitivamente la actividad de la otra transaminasa, puede incrementar la eficiencia de esta vía. Muchas de las reacciones en las vías descritas son reversibles y, por lo tanto, pueden alcanzar un equilibrio entre substratos y productos . El rendimiento de la vía puede ser incrementado mediante la remoción continua de los productos de los polipéptidos . Por ejemplo, la secreción de monatina en el caldo de fermentación usando una permeasa u otra proteína de transporte, o la cristalización selectiva de monatina a partir dé una corriente de reactor biocatalítico con recirculación concomitante de substratos incrementará el rendimiento de la reacción. La remoción de subproductos por medio de las reacciones enzim ticas adicionales o por medio de la sustitución de grupos donadores amino es otra forma de incrementar el rendimiento de la reacción. Varios ejemplos se describen en el ejemplo 13 y se muestran en las figuras 11-13. Por ejemplo', se puede producir un subproducto que esté no disponible para reaccionar en la dirección inversa, ya sea mediante cambio de fases (evaporación) o mediante la conversión espontánea en un producto final no reactivo, tal como un dióxido de carbono . Modulación de los bancos de substratos El banco de indol puede modularse al incrementar la producción de precursores de triptófano y/o alterar vias catabólicas que incluyan indol - 3 -piruvato y/o triptófano. Por ejemplo, la producción de ácido indol - 3 - acético a partir de indol - 3 -piruvato puede reducirse o eliminarse al suprimir funcionalmente el gen que codifique para EC 4.1.1.74 en la célula hospedera. La producción de indol a partir de triptófano puede reducirse o eliminarse al suprimir funcionalmente el gen que codifique para EC 4.1.99.1 en la célula hospedera. Como alternativa, un exceso de indol se puede utilizar como un substrato en un proceso in vitro o in vivo en combinación con cantidades incrementadas del gen que codifique para EC 4.1.99.1 (Kawasaki et al., J. Fer . And Bioeng. , 82:604-6, 1996) . Además, se pueden hacer modificaciones genéticas para incrementar el nivel de intermediarios tales como D-eritrosa-4-fosfato y crorismato. La producción de triptófano se regula en muchos organismos. Un mecanismo es mediante la inhibición por retroalimentación de ciertas enzimas en la vía; al incrementarse los niveles de triptofano, disminuye la velocidad de producción de triptofano. Así, cuando se usa una célula hospedera manipulada para producir monatina por medio de un intermediario de triptofano, se puede usar un organismo que no sea sensible a concentraciones de triptofano. Por ejemplo, una cepa de Catharanthus roseus que sea resistente a la inhibición de crecimiento por varios análogos de triptofano se seleccionó mediante la exposición repetida a altas concentraciones de 5 -met iltriptófano ( Schallenberg y Berlin, Z Naturforsch 34:541-5, 1979) . La actividad triptofano sintasa resultante de la cepa fue menos afectada por la inhibición del producto, probablemente debido a mutaciones en el gen. De manera similar, una célula hospedera usada para la producción de monatina puede ser optimizada. La producción de triptofano puede ser optimizada a través del uso de la evolución directa para evolver polipéptido que sean menos sensibles a la inhibición del producto. Por ejemplo, se pueden llevar a cabo tamizados sobre placas que no contengan triptofano en el medio, pero con altos niveles de análogos de triptofano no metabolizables . Las patentes de E.U.A. Nos. 5,756,345; 4,742,007 y 4,371,614 describen métodos usados para incrementar la productividad de triptofano en un organismo de fermentación. La última etapa de la biosíntesis de triptofano es la adición de serina a indol; por lo tanto la disponibilidad de serina puede incrementarse para incrementar la producción de triptofano. La cantidad de monatina producida por un organismo de fermentación puede ser incrementada al incrementar la cantidad de piruvato producida por el organismo hospedero. Ciertas levaduras, tales como Trichosporon cutaneum (Wang et al., Lett. Appl. Microbiol . 35:338-42, 2002) y Torulopsis glabrata (Li et al., Appl Microbiol. Biotechnol . 57:451-9, 2001) sobreproducen piruvato y pueden usarse para llevar a la práctica los métodos descritos en la presente. Además, se pueden hacer modificaciones genéticas a los organismos para promover la producción de ácido pirúvico, tal como aquellos en la cepa de E. coli W14852ip2 (Kawasaki et al., J. Ferm. And Bioeng. 82:604-6, 1996). Control de la guiralidad El perfil de sabor de la monatina puede ser alterado al controlar su estereoquímica (quiralidad) . Por ejemplo, diferentes estereoisómeros de monatina pueden desearse en diferentes mezclas de concentraciones para diferentes sistemas alimenticios. La quiralidad puede controlarse por medio de una combinación de pH y polipéptidos .

La raceraización en la posición C-4 de la monatina (véase molécula numerada arriba) puede ocurrir mediante la desprotonación y reprotonación del carbono alfa, la cual puede ocurrir por medio de un desplazamiento en pH o mediante la reacción con el cofactor PLP unido a una enzima tal como una racemaza o libre en solución. En un microorganismo, es poco probable que el pH se desplace lo suficiente como para causar la racemización, pero PLP es abundante. Los métodos para controlar l . quiralidad con polipéptidos dependen de la ruta biosintética utilizada para la producción de monatina. Cuando la monatina se forma usando la vía mostrada en la figura 2, lo siguiente puede considerarse. En una reacción biocatalítica, la quiralidad del carbono 2 puede determinarse por una enzima que convierta indol-3-piruvato en MP. Varias enzimas (por ejemplo, de EC 4.1.2.-, 4.1.3.-) pueden convertir indol-3-piruvato en MP, de esta manera, la enzima que forma el estereoisómero deseado puede seleccionarse. Como alternativa, la enantioespecificidad de la enzima que convierte indol-3 -piruvato en MP puede modificarse a través del uso de evolución dirigida, o anticuerpos catalíticos pueden manipularse y diseñarse para catalizar la reacción deseada. Una vez que se produce MP (ya sea enzimáticamente o mediante condensación química) , el grupo amino puede añadirse estereoespecíficamente usando una transaminasa, tal como aquellas descritas en la presente. Ya sea la configuración R o S del carbono 4 puede generarse dependiendo de si se usa una aminotransferasa de ácido D- o L-aromático. La mayoría de las aminotransferasas son específicas para el estereoisómero L; sin embargo, las D-triptófano aminotransferasas existen en ciertas plantas (Cohiba and Mito, Proceedings of the 8th International Symposium on Vitamin B6 and Carbonyl Catalysis, Osaka, Japón 1990) . Más aún, las D-alanina aminotransferasas (2.6.1.21), D-metionina-piruvato aminotransferasas (2.6.1.41) y tanto (R) -3-amino-2-metilpropanoato aminotransferasa (2.6.1.61) como (S) -3-amino-2-metilpropanoato aminotransferasa (2.6.1.22) han sido identificadas. Ciertas aminotransferasas sólo pueden aceptar el substrato para esta reacción con una configuración particular en el carbono C2. Por lo tanto, incluso si la conversión en MP no es estereoespecífica, la estereoquímica del producto final puede controlarse a través de la selección adecuada de una transaminasa. Ya que las reacciones son reversibles, el MP no reaccionado (estereoisómero no deseado) puede reciclarse de regreso a sus constituyentes, y se puede volver a formar una mezcla racémica de MP. Substratos activadores Los substratos fosforilados , tales como fosfoenolpiruvato ' (PEP) , se pueden usar en las reacciones descritas en la presente. Los substratos fosforilados pueden ser más energéticamente favorables y, por lo tanto, se pueden usar para incrementar las velocidades y/o rendimientos de reacción. En las condensaciones de aldol, la adición de un grupo fosfato estabiliza al tautómero enol del substrato nucleofílico, haciéndolo más reactivo. En otras reacciones, un substrato fosforilado puede proporcionar un mejor grupo saliente. De manera similar, los substratos pueden ser activados mediante la conversión en derivados de CoA o derivados de pirofosfato. Uso de monatina en una composición de goma de mascar El estereoisómero S,S de monatina es aproximadamente 50-200 veces más dulce que la sacarosa en peso. El estereoisómero R,R de monatina es aproximadamente 2000-2400 veces más dulce que la sucrosa en peso. La dulzura de la monatina se calcula usando evaluadores sensoriales experimentados en un procedimiento de comparación de dulzura, en donde una solución edulcorante de prueba se iguala para intensidad de dulzura contra una serie de soluciones de referencia.

Específicamente, se puede evaluar la dulzura de un edulcorante en relación con sucrosa al usar un panel de evaluadores sensoriales entrenados experimentados en el procedimiento de cálculo de dulzura. Todas las muestras (en los mismos reguladores de pH) se sirven por duplicado a una temperatura de 22°C±1°C. Soluciones de muestra pueden prepararse, por ejemplo, usando un regulador de pH que comprenda 0.16% (v/p) de ácido cítrico y 0.02% (v/p) de citrato de sodio a un pH de -3.0. Las soluciones de prueba, codificadas con códigos de números aleatorios de 3 dígitos, se presentan individualmente a los panelistas en orden aleatorio. Normas de referencia de sacarosa, que varían de 2.0-10.0% (v/p) de sucrosa, que se incrementan por etapas de 0.5% (p/v) de sucrosa también se proporcionan. Se pide a los panelistas calcular la dulzura al comparar la dulzura de la solución de prueba con los parámetros de sucrosa. Esto se lleva a cabo tomando 3 sorbos de la solución de prueba, seguidos por un •sorbo de agua, seguido por 3 sorbos de parámetro de sucrosa seguido por un sorbo de agua, etc. Los panelistas calculan la dulzura a un lugar decimal, por ejemplo, 6.8, 8.5. Se impone un periodo de descanso de cinco minutos entre la evaluación de las soluciones de prueba. También se pide a los panelistas enjuagarse bien y comer una galleta para reducir cualquier efecto potencial.

El valor equivalente de sucrosa (SEV, por sus siglas en inglés) (por ejemplo, % de sucrosa) , determinado por el panel de evaluadores sensoriales entrenados, se gráfica como una función de la concentración de monatina para obtener una curva de respuesta a dosis. Se aplica un ajuste de curva polinomial a la curva de respuesta a dosis y se usa para calcular la intensidad de dulzura o la potencia en un punto particular, por ejemplo, 8% de SEV, al dividir el valor equivalente de sucrosa (SEV) entre la concentración de monatina (por ejemplo, % de monatina). Véase, por ejemplo, figura 15 (curva de respuesta a dosis de ,R/S,S monatina); figura 14 (curva de respuesta a dosis de R,R monatina) . La monatina es soluble en soluciones acuosas a cncentraciones que son adecuadas para su consumo. Varias mezclas de estereoisómeros de monatina pueden ser cualitativamente mejores en ciertas matrices, o en la mezcla con otros edulcorantes. Las mezclas de monatina con otros edulcorantes se pueden usar para maximizar la intensidad de dulzura y/o perfil de dulzura, y para minimizar costos. La monatina se puede usar en combinación con otros edulcorantes y/o otros ingredientes para generar un perfil temporal similar al de la sucrosa o para o tros beneficios. Por ejemplo, la monatina puede mezclarse con otros edulcorantes nutritivos o no nutritivos para lograr perfiles de sabor particulares u objetivos de calorías. Así, las composiciones edulcorantes pueden incluir combinaciones de monatina con uno o más de los siguientes tipos de edulcorantes: (1) alcoholes de azúcar (tales como eritritol, sorbitol, maltitol, manitol , lactitol, xilitol, isomalta, jarabes glicémicos bajos, etc.); (2) otros edulcorantes de alta intensidad (tales como aspartame, sucralosa, sacarina, acesulfame-K, steviosida, ciclamato, neotame, taumatina, alitame, dihidrochalcona, monelina, glicirrihicina, mogrosida, filodulcina, mabinlina, brazeína, circulina, pentadina, etc.) y (3) edulcorantes nutritivos (tales como sucrosa, tagatosa, azúcar invertida, fructosa, jarabe de maíz, jarabe de maíz de alta fructosa (HFCS) , glucosa/dextrosa, trehalosa, isomaltulosa, etc.). La monatina puede usarse en mezclas tales como un modificador de sabor para suprimir sabores posteriores, incrementar otros sabores tales como limón, o mejorar el perfil de sabor temporal . Los datos indican también que la monatina es cuantitativamente sinergística con ciclamatos (los cuales se usan en Europa) , pero no se notó alguna sinergia cuantitativa significativa con aspartame, sacarina, acesulfame-K, sucralosa, o edulcorantes de carbohidratos. Debido a que la monatina no es un carbohidrato, la monatina puede usarse para disminuir el contenido de carbohidratos en las composiciones de goma de mascar. En una modalidad, una cantidad (por ejemplo una tableta) de una composición de goma de mascar de monatina contiene menos calorías y carbohidratos que la misma cantidad de composición de goma de mascar que contiene azúcar (por ejemplo, sucrosa o jarabe de maíz de alta fructosa) . En otras modalidades, las composiciones de goma de mascar que comprenden monatina (por ejemplo, que comprenden monatina y uno o más carbohidratos) proporcionan una sensación bucal, sabor y dulzura con el tiempo que es comparable con la proporcionada con goma de mascar similares que sólo contienen carbohidratos como el edulcorante. En una modalidad, una cantidad de una composición de goma de mascar que comprende monatina contiene más calorías y carbohidratos que la misma cantidad de la composición de goma de mascar que contiene sucrosa en lugar de la monatina. La monatina es estable en una forma seca, y tiene un perfil de sabor deseable sola o cuando se le mezcla con carbohidratos. No parece degradar irreversiblemente, pero más bien forma lactonas y/o lactamas a bajos pHs (en reguladores de pH acuoso) y alcanza un equilibrio. Puede racemizarse a la posición 4 lentamente con el tiempo en solución, pero esto ocurre típicamente a altos pHs. En general, la estabilidad de la monatina es comparable con o mejor que la del aspartame y el perfil de sabor de la monatina es comparable con o mejor que el de otros edulcorantes de calidad, tales como aspartame, alitame y sucralosa. La monatina no tiene el sabor posterior desagradable asociado con algunos otros edulcorantes de alta intensidad tales como sacarina y esteviosida. En ciertas modalidades, las composiciones de goma de mascar de la invención incluyen una porción de base para goma y una porción soluble que incluye monatina. El término "soluble" en el término "porción soluble" significa que esta porción puede disolverse en la boca y/o en saliva. La porción de base para goma es conservada en la boca a lo largo del masticado mientras que la porción soluble se disipa con una porción del sabor con el tiempo durante el masticado. En algunas modalidades, la porción soluble contiene componentes adicionales tales como saborizantes , colorantes, otros edulcorantes y/o un recubrimiento. Algunas modalidades de goma azucarada comprenden un recubrimiento que es sucrosa. En otras modalidades, las composiciones de goma de mascar se formulan de tal manera que se consideren libres de azúcar. Ciertas modalidades de goma libre de azúcar comprenden un recubrimiento (en forma de jarabe o cristalina) que es sorbitol, maltitol, isomalta, xilitol o eritritol . Opcionalmente, las composiciones de goma de mascar pueden comprender un recubrimiento que sea un sabor, una fruta liofilizada y/o un colorante. En ciertas modalidades, la monatina está presente en una cantidad que varía de 0.001 a 1.1% en peso de la composición de goma de mascar (por ejemplo, 0.009 a 1% en peso, 0.01 a 0.3% en peso, 0.01 a 0.04% en peso o 0.02 a 0.1% en peso) , incluyendo cualquier valor particular dentro de esa escala (por ejemplo, 0.001% en peso, 0.005% en peso, 0.01% en peso, 0.015% en peso, 0.02% en peso o 0.025% en peso de la composición de goma de mascar) . La monatina puede ser un estereoisómero particular o una mezcla de estereoisómeros diferentes. Por ejemplo, 0.009 a 0.1% en peso (por ejemplo, 0.015 a 0.025% en peso) del estereoisómero R,R de monatina o 0.1 a 1.1% en peso (por ejemplo, 0.15 a 0.88% en peso) del estereoisómero S , S de monatina pueden usarse en una composición de goma de mascar. Base para goma La composición de la base para goma determina típicamente si la goma se considera goma de mascar, chicle bomba o una goma funcional. En ciertas modalidades, la base para goma es inerte y no nutritiva y está hecha a partir de combinaciones de los siguientes componentes: elastómeros, ablandadores (plastificantes) , emulsionantes, resina y rellenos. Los ingredientes dentro de las composiciones generalmente se consideran grado alimenticio, reconocidos generalmente como seguros (GRAS) y/o son aprobados por la Oficina de Alimentos y Fármacos de Estados Unidos (FDA) . Los elastómeros proporcionan la naturaleza ahulada y cohesiva a las gomas, y pueden incluir, por ejemplo, uno o más hules naturales (por ejemplo, látex ahumado, látex líquido o guayule), gomas naturales o elastómeros sintéticos. En algunas modalidades, las gomas naturales incluyen jelutong, perillo, sorva, masaranduba balata, masaranduba chocolate, níspero, rosindiña, chicle y gutta hang kang. Por ejemplo, el chicle es una goma natural particularmente útil. En otras modalidades, los elastómeros sintéticos incluyen copolímeros de butadieno-estireno, copolímeros de isobutileno-isopreno, polibutadieno, poliisobutileno y elastómeros poliméricos de vinilo. En ciertas modalidades, un elastómero está presente en una base para goma en una cantidad sobre la escala de 3 a 70% en peso (por ejemplo, 3 a 60% en peso, 3 a 50% en peso, 5 a 45% en peso, 10 a 50% en peso, 15 a 45% en peso o 20 a 40% en peso de la base para goma) , incluyendo cualquier valor particular de la escala (por ejemplo, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 ó 65%· en peso) . Las resinas pueden usarse para variar la firmeza de la goma y ayudar a ablandar el componente elastomérico de la base para goma. Ejemplos no limitantes de resinas adecuadas incluyen una o más de las siguientes: un éster de colofonia, una resina de terpeno tal como resina de terpeno de a-pineno, ß-pineno y/o d-limoneno, acetato de polivinal, alcohol polivinílico, acetato de etilenvinilo y copolímero de acetato de vinilo-laurato de vinilo. En ciertas modalidades, un éster de colofonia puede ser un éster glicerólico de colofonia parcialmente hidrogenada, un éster glicerólico de colofonia polimerizada, un éster glicerólico de colofonia parcialmente dimerizada, un éster glicerólico de colofonia, un éster pentaeritritólico de colofonia parcialmente hidrogenada, un éster metílico de colofonia, o un éster metílico de colofonia parcialmente hidrogenada. En algunas modalidades, la resina está presente en una cantidad que varía de alrededor de 5 a 75% en peso de la base para goma, incluyendo cualquier valor particular dentro de esa escala. Por ejemplo, la resina puede estar presente en una cantidad que varíe de alrededor de 5 a 45% en peso, 10 a 75% en peso, 10 a 30% en peso, 15 a 60% en peso o 20 a 50% en peso de la base para goma. Ablandadores (también conocidos como plastificantes) pueden usarse para modificar la facilidad de masticado y/o sensación bucal de la composición de goma de mascar. En ciertas modalidades, los ablandadores incluyen aceites, grasas, ceras y emulsionantes. Ejemplos no limitativos que se pueden usar incluyen, por ejemplo, sebo, sebo hidrogenado, manteca, aceites vegetales hidrogenados o parcialmente hidrogenados tales como aceite de soya, cañóla, semilla de algodón, girasol, palma, coco, maíz, colza o semilla de palma, manteca de cacao, monoestearato de glicerol, triacetato de glicerol, abietato de glicerol, lecitina, monoglicéridos, diglicéridos , triglicéridos, monoglicéridos acetilados y ácidos grasos libres. Las ceras comúnmente usadas incluyen, por ejemplo, ceras de polipropileno/polietileno/Fisher-Tropsch, parafina, microcristalina y ceras naturales tales como candelila, cera de abeja y carnauba. Las ceras microcristalinas, especialmente aquellas con un alto grado de cristalinidad, también pueden considerarse como agentes de cuerpo o modificadores de textura. En ciertas modalidades, algunos jarabes de maíz, tales como Globe, proporcionan el ablandamiento de la base para goma antes de mezclarla con otros azúcares, y para dar cuerpo y humectancia. En otras modalidades, los ablandadores están presentes en una cantidad que varía de aproximadamente 0.5 a 30% en peso (por ejemplo, 0.5 a 25% en peso, 0.5 a 15% en peso o 1 a 7% en peso) de la base para goma, incluyendo cualquier valor particular dentro de la escala. Los emulsionantes ayudan a formar una dispersión uniforme de las fases no solubles/solubles y también pueden tener propiedades plastificantes . En ciertas modalidades, los emulsionantes adecuados incluyen monoestearato de glicerol (GMS) , lecitina (fosfatidil colina) , ácido poliglicerol pliricinoleico (PPGR) , mono y diglicéridos de ácidos grasos, diestearato de glicerol, triacetina, monoglicérido acetilado, triacetato de glicerol y acetato de magnesio. En otras modalidades, los emulsionantes pueden estar presentes en una variedad que varíe de aproximadamente 1 a 30% en peso de una base para goma, por ejemplo, 2 a 30% en peso, 3 a 20% en peso, o 5 a 15% en peso de la base para goma, incluyendo cualquier valor particular dentro de la escala (por ejemplo, 5, 10, 15, 20 ó 25% en peso) . Además, la composición de goma de mascar opcionalmente puede incluir adyuvantes o rellenos ya sea en la base para goma y/o porción soluble de la composición. Los adyuvantes o rellenos adecuados incluyen, por ejemplo, lecitina, inulina, polidextrina, carbonato de calcio, carbonato de magnesio, silicato de magnesio, cal molida, hidróxido de aluminio, silicato de aluminio, talco, arcilla, alúmina, dióxido de titanio y fosfato de calcio. En ciertas modalidades, se puede usar lecitina como un relleno inerte, para reducir la cantidad de pegajosidad. En otras modalidades, copolimeros de ácido láctico, proteínas (tales como gluten y/o zeína) y/o guar también se pueden usar para crear una goma que sea más fácilmente biodegradable . En otras modalidades, pueden estar presentes adyuvantes o rellenos en una cantidad que varíe de hasta en 20% de la base para goma (por ejemplo, 1 a 20% en peso, 1 a 15% en peso, 1 a 10% en peso, 2 a 18% en peso o 5 a 15% en peso de la base para goma) , incluyendo cualquier valor particular dentro de la escala.

Asimismo, agentes colorantes y blanqueadores también se pueden agregar opcionalmente a la composición de goma de mascar, y pueden incluir, por ejemplo, pigmentos tipo FD&C, extractos frutales y vegetales, dióxido de titanio, aminoácidos modificados con calor, polvo de cacao o mezclas de los mismos. En' ciertas modalidades, los agentes colorantes y blanqueadores pueden estar presentes en una cantidad que varíe de 0 a 5% en peso (por ejemplo, 0 a 1% en peso) de la base para goma, incluyendo cualquier valor particular dentro de la escala. Los componentes adicionales de la base para goma opcionalmente pueden incluir uno o más antioxidantes o conservadores, tales como hidroxianisol butilado (???) , idroxitolueno butilado (BHT) , tocoferóles, ß carotenos, propilgalato y acidulantes (por ejemplo, vitamina C) . En ciertas modalidades, los antioxidantes o conservadores pueden representar 0 a 0.2% en peso de la base para goma (por ejemplo, 0 a aproximdamente 0.05% en peso, 0 a 0.08% en peso, 0.05% en peso, o 0.1% en peso) . En algunas modalidades, una porción de base para goma de una composición incluye 3 a 50% en peso de un elastómero, 0.5 a 25% en peso de un ablandador, 2 a 30% en peso de un emulsionante, 5 a 75% en peso de una resina y 0 a 20% en peso de un relleno, con el % en peso total de la porción de base para goma siendo 100. La base para goma puede incluir, por e emplo, 30% en peso de resina de terpeno, 15% en peso de aceite vegetal hidrogenado (por e emplo, aceite de semilla de algodón hidrogenado) , 2% en peso de lecitina, 2.5% en peso de poliisobutileno, 27% en peso de acetato de polivinilo; 12.45% en peso de carbonato de calcio, 11% en peso de copolímero de isobutileno-isopreno y 0.05% en peso de BHT. En ciertas modalidades, la porción de base para goma puede representar alrededor de 5 a 95% en peso de la composición de goma de mascar, con el porcentaje en peso total de la composición siendo 100. Por ejemplo, la base para goma puede representar aproximadamente 5 a 80% en peso, 10 a 50% en peso, 15 a 30% en peso o aproximadamente 20 a 35% en peso de la composición de goma de mascar. Porción solubie En algunas modalidades de la invención, la porción soluble de la goma de mascar incluye, además de la monatina, edulcorantes globales, ablandadores, edulcorantes de alta intensidad, agentes saborizantes , agentes colorantes, adyuvantes, rellenos, componentes de una goma funcional (por ejemplo, nicotina), o combinaciones de los mismos. Por ejemplo, se pueden usar edulcorantes globales para proporcionar . cuerpo o viscosidad así como para impartir un nivel de dulzura deseado. En ciertas modalidades, los edulcorantes globales incluyen tanto azúcar como componentes sin azúcar y componentes de carbohidratos glicémicos, y constituyen entre alrededor de 5 a S5% en peso de la composición de goma de mascar (por ejemplo, 20 a 80% en peso o 30 a 60% en peso) de la goma de mascar. En otras modalidades, los edulcorantes de azúcar incluyen sucrosa, dextrosa (por ejemplo, dextrosa Cerelose) , maltosa, dextrina, azúcar invertida seca, fructosa, jarabe de maíz de alta fructosa, levulosa, galactosa, sólidos de jarabe de maíz y similares, solos o en combinación. Los edulcorantes sin azúcar y los componentes de carbohidratos glicémicos inferiores pueden incluir, pero no están limitados a, galactosa y alcoholes de azúcar tales como sorbitol, manitol, xilitol, lactitol, eritritol, maltitol, hidrolizados de almidón hidrogenado, isomalta, trehalosa y similares, solos o en combinación. En ciertas modalidades, las composiciones de goma de mascar de monatina comprenden otros edulcorantes de alta intensidad y/o edulcorantes sin azúcar. Un número de edulcorantes de alta intensidad son por lo menos 20 veces más dulces que la sucrosa. Estos incluyen, pero no están limitados a, sucralosa, aspartame, sales de acesulfame (por ejemplo, acesulfame-K) , alitame, sacarina y sus sales, ácido ciclámico y sus sales, glicirricina, dihidrochalconas (por ejemplo, neohesperidin dihidrochalcona) , taumatina, monelina, neotame, esteviosida (extraída de las hojas de Stevia rebaudiana) , mogrosida (extraída del fruto Lo Han Guo) , filodulcina (extraída de las hojas de Hydrangea macrophylla, alrededor de 400 a 600 veces más dulce que la sucrosa) , mabinlina, brazeína, pentadina y similares, solos o en combinación. En algunas modalidades, los edulcorantes de alta intensidad varían de 0.001 a 5% en peso de la composición de goma de mascar (por ejemplo, 0.009 a 1% en peso de la composición de goma de mascar) , incluyendo cualquier valor particular dentro de la escala. Por ejemplo, los edulcorantes de intensidad más alta tales como alitame (2000 veces más dulce que la sucrosa, 2000 X sucrosa) y taumatina (1600-3000X sucrosa) pueden estar presentes a alrededor de 0.02 a 0.10% en peso de la composición de goma de mascar; aspartame y compuestos similares (200 X de sucrosa) pueden estar presentes a aproximadamente 0.1 a 0.3% en peso de la composición de goma de mascar. En otras modalidades, la monatina y un edulcorante de alta intensidad tal como ciclamato o acesulfame K pueden usarse en una composición de goma de mascar. Por ejemplo, 0.05 a 0.7% en peso de monatina (por ejemplo, el estereoisómero S,S de monatina) y 0.01 a 0.2% en peso de acesulfame K pueden usarse en una composición de goma de mascar. En ciertas modalidades, incrementadores de dulzura, los cuales sólo son dulces en presencia de otros compuestos tales como ácidos, se pueden usar también en una composición de goma de mascar. Ejemplos no limitantes de incrementadores de dulzura incluyen curculina y miraculina (100 X sucrosa) . En otras modalidades, las soluciones edulcorantes acuosas tales como aquellas que contienen sorbitol, hidrolizados de almidón hidrogenado, jarabe de maiz, jarabe de poliol (por ejemplo, jarabe de maltitol) o combinaciones de los mismos, también se pueden usar como ablandadores y agentes aglutinantes en la composición de goma. En otras modalidades, las composiciones de goma de mascar de monatina comprenden agentes saborizantes, incluyendo saborizantes naturales o artificiales, o combinaciones de los mismos. Por ejemplo, los agentes saborizantes pueden estar presentes en una cantidad dentro de la escala de aproximadamente 0.1 a 15% en peso de la composición de goma de mascar (por ejemplo, 0.1 a 10% en peso, 0.2 a 5% en peso o 0.5 a 3% en peso de la composición de · goma de mascar) . En ciertas modalidades, el agente saborizante es un aceite esencial, tal como un aceite derivado de una planta o un fruto, aceite de menta, aceite de hierbabuena, otros aceites de menta, aceite de clavo, aceite de canela, aceite de gaulteria, baya, timo, hoja de cedro, nuez moscada, pimienta malagueta, salvia, macia, almendras, anís y similares) . En otras modalidades el agente saborizante es un extracto vegetal o una esencia frutal tal como manzana, plátano, sandía, pera, durazno, uva, fresa, frambuesa, cereza, ciruela, piña y albaricoque, o una combinación de saborizantes frutales (por ejemplo, tutti-fruti) . En otras modalidades, el agente saborizante es un saborizante cítrico, tal como un extracto, esencia o aceite de limón, lima, naranja, mandarina, toronj , cidro o kuncuat, . En modalidades, estos agentes saborizantes pueden usarse en forma líquida o sólida y pueden usarse individualmente o mezclados. Ingredientes opcionales, tales como agentes colorantes, emulsionantes, agentes farmacéuticos (por ejemplo, nicotina, aspirina, dimenhidrinato, cafeína) o nutrientes (por ejemplo, calcio o vitaminas), también se pueden incluir en goma de mascar. Los agentes colorantes y emulsionantes adecuados se describen arriba. En ciertas modalidades, uno o más de los componentes de la composición de goma de mascar pueden ser encapsulados . Por ejemplo, monatina y/o otros edulcorantes de alta intensidad, agentes colorantes y/o agentes saborizantes pueden ser encapsulados. La encapsulación de monatina y/o otros edulcorantes de alta intensidad puede incrementar la intensidad de dulzura principal, prolongar la duración de la dulzura y mejorar la protección y estabilidad del edulcorante. La encapsulación también puede proteger los agentes saborizantes. Véase, por ejemplo, patentes de E.U.A. Nos. 4,981,698, 5,004,595 y 5,266,335 para métodos para encapsular estos componentes . Cualquier composición de goma puede incluir monatina. En algunas modalidades, las composiciones de goma incluyen aproximadamente 17 a 23% en peso de base para goma (por ejemplo, 20% en peso) , 55 a 65% en peso del edulcorante global (por ejemplo, 60% en peso) , 15 a 21% en peso de jarabe de glucosa (por ejemplo, 18% en peso), 0.05 a 0.15% en peso de saborizante (por ejemplo, 0.1% en peso) y 0.05 a 0.15% en peso de otros aditivos (por ejemplo, 0.1% en peso) . En una modalidad, una composición de goma de mascar contiene alrededor de 20% en peso de base para goma, aproximadamente 3% en peso de glicerina, alrededor de 8% en peso de glucosa, aproximadamente 0.5% en peso de lecitina, alrededor de 1% en peso de saborizante frutal (por ejemplo, fresa) , alrededor de 0.07% en peso de colorante (por ejemplo, colorante rojo), aproximadamente 47% en peso de azúcar, alrededor de 20% en peso de inulina o relleno de polidextrina, aproximadamente 0.15% en peso de acesulfame K y 0.5% en peso de S,S monatina. En ciertas modalidades, la R,R monatina se puede usar en lugar de la mezcla de acesulfame K/S,S monatina al sustituir aproximadamente 0.02% en peso de monatina, y el resto puede rellenarse con azúcar global o relleno. En otra modalidad, una composición de goma libre de azúcar incluye aproximadamente 21 a 27% en peso (por ejemplo, 24.5% en peso) de una base para goma libre de azúcar, alrededor de 13 a 19% en peso (por ejemplo, 16.1% en peso) de una solución de sorbitol, aproximadamente 0.5 a 2.0% en peso (por ejemplo, 1.5% en peso) de un agente saborizante tal como un saborizante de menta, alrededor de 2 a 3.5% en peso (por ejemplo, 2.8% en peso) de glicerina y aproximdamente 0.009 a 1.1% en peso de monatina, dependiendo de la mezcla de estereoisómeros de monatina que se use, y alrededor de 50 a 60% en peso (por ejemplo, 55% en peso) de sorbitol en polvo. Preparación de composiciones de goma de mascar Las composiciones de goma de mascar pueden prepararse usando técnicas conocidas. En general, goma de mascar se puede fabricar al agregar secuencialmente los diferentes ingredientes para gomas de mascar a cualquier mezcladora disponible comercialmente conocida en la técnica (por ejemplo, una mezcladora de cuchillas sigma) . Véase, por ejemplo, las patentes de E.U.A. Nos. 5,334,397 y 5,800,848. Después de que los ingredientes han sido cuidadosamente mezclados, la masa de goma puede ser descargada del mezclador y configurarse en las formas deseadas tales como mediante laminado en hojas y corte en tabletas, extrusión en pedazos, o colado en gránulos o tabletas. Una variedad de gomas de mascar y formas de chicle bomba son posibles, incluyendo barras, trozos, tabletas, con relleno en el centro, bolas, formas de frutas, formas de cigarrillo, monedas, gomas de tubo y gomas en polvo comprimidas . En una modalidad, la base para goma se funde primero (por ejemplo, a una temperatura que varía de 80 a 125°C) y se agrega al mezclador activado. Como alternativa, la base puede ser fundida en el propio mezclador. También se puede agregar color en este momento. Un ablandador puede añadirse después junto con el jarabe y cualquier porción del agente de volumen. Porciones adicionales de los agentes de volumen pueden añadirse después al mezclador. En ciertas modalidades, los ingredientes de sabor se añaden a la mezcla para goma cerca del fin del proceso de mezclado. Las gomas de mascar pueden hacerse en una forma continua o intermitente. Almidón de maíz o talco se pueden usar para empolvar los productos de goma de mascar desde su empaque. Las pruebas sensoriales califican el sabor y textura de las composiciones de goma de mascar y/o sus componentes tales como recubrimiento. Ejemplos de pruebas sensoriales incluyen pruebas de clasificación oral y pruebas de triángulo. En pruebas- de clasificación oral, las composiciones de goma de mascar que tienen las mismas composiciones, pero que comprenden diferentes edulcorantes, se evalúan colateralmente por tres o más panelistas . Los panelistas clasifican la intensidad de dulzura de cada composición. En pruebas de triángulo, a tres o más panelistas se les dan tres muestras de las composiciones de goma de mascar, en donde dos muestras tienen la misma formulación y una tercera muestra de referencia/comparación tiene una formulación diferente. Se pide a los panelistas determinar cuál de las formulaciones tiene una dulzura u otras características sensoriales que sean diferentes de las otras dos . Se espera que la goma de mascar que contiene monatina, en comparación con gomas que contienen otros edulcorantes, exhiba dulzura más larga mientras se mastica, una vida en mostrador más larga, mayor estabilidad al calor y ácidos, asi como mejores características de sabor y ventajas de comercialización. Ejemplos Ejemplo 1 Clonación y expresión de triptofano aminotransferasas Este ejemplo describe métodos que se usaron para clonar triptofano aminotransferasas, las cuales se pueden usar para convertir triptofano en indol-3-piruvato . Vista general del experimento Once genes que codificaban para aminotransferasa se clonaron en E. coli. Estos genes fueron D-alanina aminotransferasa de Bacillus subtilis (dat, No. de Registro Genbank Y1 082.1 pb 28622-29470 y No. de Registro Genbank NP_388848.1, secuencia de ácido nucleico y secuencia de aminoácidos, respectivamente) , tirosina aminotransferasa de Sinorhizobium meliloti (también llamado Rhizobium meliloti) (tata, SEQ ID NOS: 1 y 2, secuencia de ácido nucleico y secuencia de aminoácidos, respectivamente) , tirosina aminotransferasa de Rhodobacter sphaeroides cepa 2.4.1 (tatA evaluada por homología, SEQ ID NOS: 3 y 4, secuencia de ácido nucleico y secuencia de aminoácidos, respectivamente), tirosina aminotransferasa de R. Sphaeroides 35053 (evaluada por homología, SEQ ID NOS: 5 y 6, secuencia de ácido nucleico y secuencia de aminoácidos, respectivamente) , aminotransferasa de substrato amplio de Leishmania major (bsat, evaluada por homología a fragmentos péptidos de L. mexicana, SEQ ID NOS: 7 y 8, secuencia de ácido nucleico y secuencia de aminoácidos, respectivamente) , aminotransferasa aromática de Bacillus subtilis {araT, evaluada por homología, SEQ ID NOS: 9 y 10, secuencia de ácido nucleico y secuencia de aminoácidos, respectivamente) , aminotransferasa aromática de Lactobacillus amylovorus (araT, evaluada por homología, SEQ ID NOS: 11 y 12, secuencia de aminoácido nucleico y secuencia de aminoácidos, respectivamente), aminotransferasa de substratos múltiples de R. Sphaeroides 35053 (evaluada por homología, SEQ ID NOS: 13 y 14, secuencia de ácido nucleico y secuencia de aminoácidos, respectivamente) , aminotransferasa de substratos múltiples de la cepa 2.4.1 de Rhodobacter sphaeroides (msa evaluada por homología, No. de Registro Genbank AAAE01000093.1, bp 14743-16155 y No . de Registro Genbank ZP00005082.1 , secuencia de ácido nucleico y aminoácidos, respectivamente) aspartato aminotransferasa de Escherichia coli (aspC, No. de Registro Genbank AE000195 1 bp -2755-1565 y No. de Registro Genbank AAC74014.1, secuencia de ácido nucleico y secuencia de aminoácidos, respectivamente), y tirosina aminotransferasa de E. coli (tyrB, SEQ ID NOS: 31 y 32, secuencia de ácido nucleico y secuencia de aminoácidos, respectivamente) . Los genes fueron clonados, expresados y probados para verificar su actividad en conversión de triptófano a indol-3-piruvato junto con enzimas disponibles comercialmente . Todos los once clones tuvieron actividad. Identificación de cepas bacterianas que pueden contener polipéptidos con la actividad deseada Ningún gen en la base de datos del NCBI (Centro Nacional para Información de Biotecnología) fue designado como triptófano aminotransferasas . Sin embargo, los organismos que tienen esta actividad enzimática han sido identificados. La actividad L-triptófano aminotransferasa (TAT) se ha medido- en extractos celulares o de proteínas purificadas a partir de las siguientes fuentes: aislado rhizobacteriano de Festuca octoflora, células de mitocondria y citosol de chícharo, células de vesícula de corona de girasol, Rhizobium leguminosarum biovariedad trifoli, Erwinia herbicola pv gypsophilae, Pseudomonas syringae pv. Savastanoi, Agrobacterium tumefaciens, Azospirillum lipferum y brasilense, Enterobacter cloacae, Enterobacter agglomerans, Bradyrhizobium elkanii, Candida maltosa, Azotobacter vinelandii , cerebro de rata, hígado de rata, Sinorhizobium meliloti, Pseudomonas fluorescens, CHAO, Lactococcus lactis, Lactobacillus casei, Lactobacillus helveticus, plántulas de trigo, cebada, Phaseolus aureus (frijol blanco) , Saccharomyces uvarum (carlsbergensis) , Leishmania sp . , maíz, brotes de tomate, plantas de chícharo, tabaco, puerco Clostridium sporogenes y Streptomyces griseus. Ejemplo 2 Conversión de iiidol-3-lactato en indol-3 -piruvato Como se muestra en las figuras 1 y 3, el ácido indol-3-láctico puede usarse para producir indol-3-piruvato. La conversión entre ácido láctico y piruvato es una reacción reversible, al igual que la conversión entre indol-3-piruvato e indol-3 -lactato . La oxidación de indol-lactato fue seguida típicamente debido a la alta cantidad de segundo plano a 340 nm a partir de indol-3 -piruvato . La mezcla de ensayo estándar contenía 100 mM de fosfato de potasio, pH 8.0, 0.3 mM de NAD+, 7 unidades de lactato deshidrogenasa (LDH) (Sigma-L2395 , St . Louis, MO) y 2 mM de substrato en 0.1 mL. El ensayo se llevó a cabo por duplicado en una placa de microtitulación transparente a UV, usando un lector de placa Molecular Devices SpectraMax. Polipéptido y regulador de pH se mezclaron y se pipetearon en pocilios que contenían el ácido indol-3-láctico y NAD+ y la absorbancia a 340 nm de cada pocilio se leyó a intervalos de 9 segundos después de un leve mezclado. La reacción se mantuvo a 25°C durante 5 minutos. El incremento en absorbancia a 340 nm sigue la produceion de NADH a partir de NAD+. Se llevaron a cabo controles nagativos separados sin NAD+ y sin substrato. D-LDH de Leuconostoc mesenteroides (número de catálogo Sigma L2395) pareció exhibir más actividad con los substratos derivados de indol que con L-LDH de Bacillus stearothermophilus (número de catálogo Sigma L5275) . Se utilizaron métodos similares con ácido D-láctico y NAD+ o NADH y piruvato, los substratos naturales de los polipéptidos D-LDH. La Vmax para la reducción de piruvato fue 100-1000 veces más alta que la Vmax para la oxidación de lactato. La Vmax para la reacción de oxidación de ácido indol-3-láctico con D-LDH fue aproximadamente un quinto que la de ácido láctico. La presencia de indol-3 -piruvato también medida al seguir el cambio en absorbancia 327 (el derivado de enol-borato) usando 50 mM de regulador de pH de borato de sodio que contenía 0.5 mM de EDTA y 0.5 mM de arsenato de sodio. Cambios pequeños pero respetables en absorbancia fueron observados, en comparación con los controles negativos para ambos polipéptidos L y D-LDH.

Además, las lactato deshidrogenasas de amplia especificidad (enzimas con actividad asociada con EC 1.1.1.27, EC 1.1.1.28 y/o EC 1.1.2.3) pueden clonarse y usarse para hacer indol-3 -piruvato a partir de ácido indol-3 -láctico. Las fuentes de deshidrogenasas de amplia especificidad incluyen E. coli, Neisseria gonorrhoeae y Lactobacillus plantarum. Como alternativa, el indol-3-piruvato puede producirse al poner en contacto indol-3-lactato con extractos celulares de Clostridíum sporogenes que contienen una indolactato deshidrogenasa (EC 1.1.1.110) ; o extractos celulares de Tripanosoma cruzi epimastigotes que contengan p-hidroxifenilactato deshidrogenasa (EC 1.1.1.222) conocidos por tener una actividad en indol-3 -piruvato; o Pseudomonas acidovorans o E. coli extractos celulares que contienen una imidazol-5-illactato deshidrogenasa (EC 1.1.1.111); o Coleus blumei, que contiene una hidroxifenilpiruvato reductasa (EC 1.1.1.237); o Candida maltosa que contiene una lactato deshidrogenasa D-aromática (EC 1.1.1.222). Las referencias que describen estas actividades incluyen, Nowicki et al. (FEMS Microbiol Lett 71:119-24, 1992), Jean y DeMoss {Canadian J. Microbiol. 14 1968, Coote and Hassall (Biochem, J. 111:237-9, 1969), Córtese et al. (C. R. Seances Soc. Biol. Fil. 162 390-5, 1968), Petersen y Alfermann {Z. Naturforsch. C. Biosci, 43 501-4, 1988) y Bhatnagar et al. (<T. Gen Microbiol 135:353-60, 1989). Además, una lactato oxidasa tal como aquella de Pseudomonas sp. (Gu et al. J. Mol. Catálisis B: Enzymatic: 18:299-305, 2002) se puede utilizar para la oxidación de indol-3 -láctico en indol-3 -piruvato. Ejemplo 3 Conversión de L-triptófano e indol-3 -piruvato utilizando L- aminoácido oxidasa Este ejemplo describe métodos usados para convertir triptófano en indol-3-piruvato por medio de una oxidasa (EC 1.4.3.2), como una alternativa a usar triptófano aminotransferasa como se describió en el ejemplo 1. L-aminoácido oxidasa se purificó de Crotalus durissus (Sigma, St . Louis, MO, número de catálogo A-2805) . Los números de registro de las L-aminoácido oxidasas para clonación molecular incluyen: CAD21325.1, AAL14831, NP 490275, BAB78253, A38314, CAB71136, JE0266, T08202, S48644, CAC00499, PS6742, P81383, 093364, P81382, P81375, S62692, P23623, AAD45200, AAC32267, CAA88452, AP003600 y Z48565. Las reacciones se llevaron a cabo en tubos microcentrífugos en un volumen total de 1 mL, incubados durante 10 minutos mientras se agitaba a 37°C. La mezcla de reacción contenia 5 mM de L-triptófano, 100 mM de regulador de pH de fosfato de sodio, pH 6.6, 0.5 mM de arsenato de sodio, 0.5 mM de EDTA, 25 mM de tetraborato de sodio, 0.016 mg de catalasa (83 U, Sigma C-3515) , 0.008 mg de FAD (Sigma) y 0.005-0.125 unidades de L-aminoácido oxidasa. Los controles negativos contenían todos los componentes excepto triptófano, y las piezas contenían todos los componentes excepto la oxidasa. Se usó catalasa para remover el peróxido de hidrógeno formado durante la desaminación oxidante . El tetraborato de sodio y arsenato fueron usados para estabilizar la forma enol-borato de indol-3-piruvato, la cual muestra una absorbancia máxima a 327 nm. Parámetros de indol-3-piruvato se prepararon a concentraciones de 0.1-1 mM en la mezcla de reacción. La L-aminoácido oxidasa comprada tuvo una actividad específica de 540 µg de indol-3-piruvato formado por minuto por mg de proteína. Este es el mismo orden de magnitud que la actividad específica de las enzimas triptófano aminotransfe sa . Ejemplo 4 Conversión de indol-3-piruvato en ácido 2-hidroxi-2- (indol-3- ilmetil) -4-cetoglutárico con una aldolasa Este ejemplo describe métodos que pueden usarse para convertir indol-3 -piruvato en MP usando una aldolasa (liasa) (figura 2). Las condensaciones de aldol son reacciones que forman enlaces carbono-carbono entre el carbono ß de un aldehido o cetona y el carbono de carbonilo de otro aldehido o cetona. Se forma un carbanión sobre el carbono adyacente al grupo carbonilo de un substrato, y sirve como un nucleófilo que ataca al carbono de carbonilo del segundo substrato (el carbono electrofílico) . Más comúnmente, el substrato electrofílico es un aldehido, por lo que la mayoría de las aldolasas se encuentran dentro de la categoría EC 4.1.2.-. En forma bastante común, el substrato nucleofílico es piruvato. Es menos común que las aldolasas catalicen la condensación entre dos ceto-ácidos o dos aldehidos. Sin embargo, las aldolasas que catalizan la condensación de dos ácidos carboxílicos han sido identificadas. Por ejemplo, EP 1045-029 describe la producción de ácido L-4-hidroxi-2-cetoglutárico a partir de ácido glioxílico y de piruvato usando un cultivo de pseudómonas (EC 4.1.3.16). Además, la 4-hidroxi-4metil-2-oxoglutarato aldolasa (4-hidroxi-4-metil-2-oxoglutarato piruvato liasa, EC 4.1.3.17) puede catalizar la condensación de dos cetoácidos . Por lo tanto, polipéptidos de aldolasa similares se usaron para catalizar la condensación de indol-3-piruvato con piruvato. Clonación 4-Hidroxi-4-metil-2-oxoglutarato piruvato liasas (ProA aldolasa, EC 4.1.3.17) y 4-hidroxi-2-oxoglutarato glioxilato-liasa (KHG aldolasa, EC 4.1.3.16) catalizan reacciones muy similares a la reacción aldolasa de la figura 2. Se diseñaron cebadores con excesos compatibles para el vector pET30 Xa/LIC (Novagen, Madison, WI) Resultados de actividad con productos de gen proA Ambas construcciones de genes C. testosteroni proA y 3. meliloti SMC00502 tuvieron altos niveles de expresión cuando se les indujo por IPTG. Las proteínas recombinantes eran altamente solubles, como se determina por análisis SDS-PAGE de proteina total y muestras de proteína total y extracto celular. El producto génico C. testosteroni se purificó a > de 95% de pureza. Debido a que el rendimiento del producto génico S. meliloti fue muy bajo después de la purificación de afinidad usando un cartucho His-Bind, el extracto celular se usó para los ensayos enzimáticos . Ambas aldolasas recombinantes catalizaron la formación de MP a partir de indol-3-piruvato y piruvato. La presencia tanto de fosfato de magnesio como fosfato divalentes se requirió para la actividad enzimática. No fue aparente producto cuando indol-3 -piruvato, piruvato o fosfato de potasio estuvo ausente. Una pequeña cantidad de producto se formó también en ausencia de enzima (típicamente un orden de magnitud menos que cuando la enzima estuvo presente) . El pico de producto eluyó de la columna C18 de fase inversa ligeramente después que el parámetro de indol-3-piruvato, el espectro de masas de este pico mostró un ion progenitor inducido por choque ( [M+H] +) de 292.1, el ion progenitor esperado para el producto MP. Los fragmentos hijos principales presentes - en el espectro de masas incluyeron aquellos con m/z - 158 (ion de carbonio de 1H-indol-3-carbaldehído) , 168 (ion de carbonio de 3-buta-l,3-dienil-lH-indol) , 274 (292 - H20) , 256 (292 - 2 ¾0) , 238 (292 - 3 H20) , 228 (292- CH403) y 204 (pérdida de piruvato) . El producto exhibió también un espectro de UV característico de otros compuestos que contienen indol tales como triptófano, con la max de 279-280 y un reborde pequeño a aproximdamente 290 nm. La cantidad de MP producida por la aldolasa de C. testosteroni se incrementó con un incremento en la temperatura de reacción de la temperatura ambiente a 37°G, cantidad de substrato y cantidad de magnesio. La actividad sintética de la enzima se redujo con un pH cada vez más alto, el producto máximo observado estuvo a un pH de . Con base en los parámetros de triptófano, la cantidad de MP producida bajo un ensayo de parámetro usando 20 //g de proteína purificada fue de aproximadamente 10-40 /¿g por un mL de reacción. Debido al alto grado de homología de las secuencias de codificación de ProA aldolasa de S. meliloti y C. testosteroni con otros genes descritos arriba, se espera que todos los productos génicos recombinantes puedan catalizar esta reacción. Además, se espera que las aldolasas que tienen treonina (T) en las posiciones 59 y 87, arginina (R) en 119, aspartato (D) e histidina (H) en 31 y 71, (con base en el sistema de numeración de C. testosteroni) tendrán actividad similar. Resultados de actividad con productos de gen khg Tanto las construcciones de genes khg de B. subtilis y E. colí tuvieron altos niveles de expresión de proteína cuando se indujeron con IPTG, mientras que khg de 3. meliloti tuvo un nivel de expresión más bajo. Las proteínas recombinantes fueron altamente solubles, como se juzga por el análisis SDS-PAGE de proteínas totales y extractos celulares. Los productos de gen khg de B. subtiis y E. coli se purificaron a >95% de pureza; el rendimiento del producto de gen 3. meliloti no fue tan alto después de la purificación de afinidad usando un cartucho His-Bind. No hay evidencia de que magnesio y fosfato se requieran para la actividad para esta enzima. Sin embargo, la literatura reporta llevar a cabo los ensayos en regulador de pH de fosfato de sodio, y la enzima supuestamente es bifuncional y tiene actividad en substratos fosforilados tales como 2-ceto-3~desoxi-6-fosfogluconato ( DPG) . Los ensayos enzimáticos se llevaron a cabo como se describió arriba, y en algunos casos el fosfato fue omitido. Los resultados indican que las KHG aldolasas recombinantes produjeron MP, pero no fueron tan activas como las ProA aldolasas. En algunos casos el nivel de MP producido por KHG fue casi idéntico a la cantidad producida por magnesio y potasio y fosfato solo. El fosfato no pareció incrementar las actividades KHG. La enzima de Bacillus tuvo la actividad más alta, aproximadamente 20-25% de actividad más alta que el magnesio y fosfato solos, como se determina por SRM (véase ejemplo 10) . La enzima de Sinorhizobium tuvo la menor cantidad de actividad, la cual pudo ser asociada con problemas de replicación y solubilidad indicados en la expresión. Todas las tres enzimas tienen el glutamato de sitio activo (posición 43 en el sistema de numeración de B. subtilis) asi como la lisina requerida para la formación de bases de zIF con piruvato (posición 130) ; sin embargo, la enzima de B. subtilis contiene una treonina en la posición 47, un residuo de sitio activo, en lugar de arginina. El KHG B. subtilis es más pequeño y parece estar en un racimo distinto al de las enzimas de S. meliloti y E. coli, con otras enzimas teniendo el sitio activo treonina. Las diferencias en el sitio de actividad pueden ser la razón para la actividad incrementada de la enzima de B. subtilis. Mejora de la actividad aldolasa Anticuerpos catalíticos pueden ser tan eficientes como las aldolasas naturales, aceptar una amplia gama de substratos y se pueden usar para catalizar la reacción mostrada en la figura 2. Las aldolasas también pueden ser mejoradas mediante evolución dirigida, por ejemplo como se describió anteriormente para una KDPG aldolasa (altamente homóloga a la KHG descrita arriba) escapada por el barajeo de ADN y PCR propensa a errores para remover el requerimiento de fosfato y para invertir la enantioselectividad. Los polipéptidos de KDPG aldolasa son útiles en reacciones bioquímicas toda vez que son altamente específicos para el substrato donador (en adelante, piruvato) , pero son relativamente flexibles con respecto al substrato receptor (por ejemplo, indol-3-piruvato) (Koeller & Wong, Nature 409:232-9, 2001) . La KHG aldolasa tiene actividad para condensación de piruvato con un número de ácidos carboxílicos . Las versiones de mamíferos de la KHG aldolasa se cree que tienen una especificidad más amplia que las versiones bacterianas, incluyendo actividad más alta en 4-hidroxi~4-metil-2-oxoglutarato y la aceptación de ambos estereoisómeros de 4-hidroxi-2-cetoglutarato . Las fuentes bacterianas parecen tener una preferencia de 10 veces por el estereoisómero R. Existen casi 100 homólogos de KHG disponibles en bases de datos genómicas, y su actividad ha sido demostrada en Pseudomonas, Paracoccus, Providencia, Sinorhizobium, Morganella, E. coli y en tejidos de mamíferos. Estas enzimas pueden usarse como un punto de partida para diseñar la enantioespecifacidad que se desea para la producción de monatina. Las aldolasas que utilizan piruvato y otros substratos que sean ya sea un ácido ceto y/o tengan un grupo hidrofóbico voluminoso tal como indol pueden desarrolladas para diseñar la especificidad, velocidad y selectividad del polipéptido. Además de KHG y ProA aldolasas demostradas en la presente, ejemplos de estas enzimas incluyen, pero no están limitados a: DPG aldolasa y polipéptidos relacionados (CDP) ; transcarboxibenzalpiruvato hidratasa-aldolasa de Nocardioides st; 4- (2 -carboxifenil) -2 -oxobut-3 -enoato aldolasa (2 ' -carboxibenzalpiruvato aldolasa) que condensa piruvato y 2-carboxibenzaldehído (un substrato que contiene anillos aromáticos) ; trans-O-hidroxibencilidenpiruvato hidratasa-aldolasa de Pseudomonas putlda y Sphingomonas aromaticivorans, la cual también utiliza piruvato y un aldehido que contiene aromáticos como substratos; 3-hidroxiaspartato aldolasa (eritro-3 -hidroxi-L-aspartato glioxilato liasa) , la cual usa ácidos 2-oxo como los substratos y se cree que está en el organismo Micrococcus denitrificans; benzoina aldolasa (benzaldehído liasa) , la cual utiliza substratos que contienen grupos bencilo, dihidroneopterina aldolasa; L-treo-3-fenilserina benzaldehído-liasa (fenilserina aldolasa) la cual condensa glicina con benzaldehído; 4-hidroxi-2 -oxovalerato aldolasa; 2 , 2 -dihidroxibencilpiruvato aldolasa y 2-hidroxibenzalpiruvato aldolasa. Un polipéptido que tenga la actividad deseada puede seleccionarse al .tamizar clones de interés usando los siguientes métodos. Auxótrofos de triptóf no se transforman con vectores que portan los clones de interés sobre un cásete de expresión y se cultivan sobre un medio que contiene pequeñas cantidades de monatina o MP . Ya que las reacciones de aminotransferasas y aldolasas son reversibles, las células son capaces de producir triptófano a partir de una mezcla racémica de monatina. En forma similar, los organismos (tanto recombinantes como tipo silvestre) pueden ser tamizados para su capacidad para utilizar MP o monatina como una fuente de carbono y energía. Una fuente de aldolasas objetivo son las bibliotecas de expresión de varias cepas de Pseudomonas y rizobacterianas . Las Pseudomonas tienen muchas vías catabólicas usuales para la degradación de moléculas aromáticas y también contienen muchas aldolasas; mientras que se sabe que las rizobacterias que contienen aldolasas crecen en la rizoesfera de la planta, y tiene muchos de los genes descritos para la construcción de una vía biosintética para monatina Ejemplo 5 Síntesis química del precursor de monatina El ejemplo 4 describió un método para usar una aldolasa para convertir indol-3 -piruvato en MP . Este ejemplo describe un método alternativo para sintetizar químicamente MP . MP puede formarse usando una condensación tipo aldol típica (figura 4) . Brevemente, una reacción tipo aldol típica incluye la generación de un carbanión a partir del éster de piruvato usando una base fuerte, tal como LDA (diisopropilamida de litio) , hexametildisilazano de litio o butilo-litio. El carbanión que se genera reacciona con el indol-piruvato para formar el producto acoplado. Grupos protectores que pueden usarse para proteger el nitrógeno de indol incluyen, pero no están limitados a: t-butiloxicarbonilo (Boc) y benciloxicarbonilo (Cbz) . Los grupos de bloqueo para ácidos carboxílicos incluyen, pero no están limitados a, esteres alquílieos (por ejemplo, esteres metílicos, etílicos, bencílicos) . Cuando estos grupos protectores se usan, no es posible controlar la estereoquímica del producto que se forma. Sin embargo, si 2 y/o R3 son grupos protectores quirales (figura 4) , tales como (S) -2-butanol , mentol o un amina quiral, esto puede favorecer la formación de un enantiómero MP sobre el otro. Ejemplo 6 Conversión de triptofano o indol-3 -piruvato en monatina Un proceso in vitro que utiliza dos enzimas, una aminotransferasa y una aldolasa, produjo monatina a partir de triptofano y piruvato. En la primera etapa alfa-cetoglutarato fue el receptor del grupo amino de triptofano en una reacción de transaminacion que generó indol-3 -piruvato y glutamato. Una aldolasa catalizó la segunda la reacción en la cual piruvato se hizo reaccionar con indol-3-piruvato , en presencia de Mg + y fosfato, generando el derivado alfa-ceto de monatina (MP) , ácido 2-hidroxi-2- (indol-3-ilmetil) -4-cetoglutárico . La transferencia del grupo amino del glutamato formado en la primera reacción produjo el producto deseado, monatina. La purificación y caracterización del producto estableció que el estereoisomero formado era S,S-monatina. Substratos, enzimas y condiciones alternativas se describen asi como mejoras que se hicieron a este proceso. Enzimas La aldolasa, 4-hidroxi-4-metil-2-oxoglutarato piruvato liasa (ProA aldolasa, gen proA) (EC 4.1.3.17) de Comamonas testosteroni se clonó, expresó y purificó como se describió en el ejemplo 4. Las 4-hidroxi-2-oxogutarato glioxilato liasas ( HG aldolasas) (EC 4.1.3.16 de B. subtilis, E. coli y S. meliloti fueron clonadas, expresadas y purificadas como se describe en el ejemplo 4. Las aminotransferasas usadas en conjunto con las aldolasas para producir monatina fueron L-aspartato aminotransferasa codificada por el gen aspC de E. coli, la tirosina aminotransferasa codificada por el gen tyrB de E. coli, enzima TatA de S.meliloti, la aminotransferasa de amplio substrato codificada por el gen hsat de L. major, o la glutá ico-oxaloacético transaminsa de corazón de puerco . (tipo lia) . La clonación, expresión y purificación de las proteínas no mamíferas se describen en el ejemplo 1.

Glutámíco-oxaloacétíco transaminasa . · de corazón de puerco (tipo lia) se obtuvo de Sigma (# G7005) . Método usando ProA aldolasa y L-aspartato aminotransferasa La mezcla de reacción contenía 50 mM de acetato de amonio, pH 8.0, 4 mM de MgCl2/ 3 mM de fosfato de potasio, 0.05 mM de fosfato de piridoxal, 100 mM de piruvato de amonio, 50 mM de triptófano, 10 mM de alfa-cetoglutarato, 160 mg de proA-aldolasa de C. testosteroni recombinante (extracto celular no purificado, aproximadamente 30% de aldolasas) , 233 mg de L-aspartato aminotransferasa de E. coli recombinante (extracto de células no purificado, aproximadamente 40% de aminotransferasa) en un litro . Todos los componentes excepto las enzimas se mezclaron juntos y se incubaron a 30°C hasta que se disolviera el triptófano. Las enzimas fueron añadidas después y la solución de reacción se incubó a 30°C con suave agitación (100 rmp) durante 3.5 horas. Después de 0.5 y 1 hora luego de la adición de las alícuotas de enzimas de triptófano sólido (50 mmoles cada uno) fueron añadidas a la reacción. Todo el triptófano agregado no se disolvió, pero la concentración se mantuvo a 50 mM o más alta. Después de 3.5 horas, el triptófano sólido se filtró. El análisis de la mezcla de reacción mediante LC/MS usando una cantidad definida de triptófano como un parámetro mostró que la concentración de triptófano en la solución era de 60.5 mM y la concentración de monatina era de 5.81 m (1.05 g) Se usaron los siguientes métodos para purificar el producto final . Noventa por ciento de la solución transparente se aplicó a una columna de resina BioRad AG50W-X8 (225 mL; capacidad de unión de 1.7 meq/mL) . La columna se lavó con agua, recogiendo fracciones de 300 mL, hasta que la absorbancia a 280 nm fuera <5% de la primera fracción de paso de flujo. La columna se eluyó después con acetato de amonio 1 M, pH 8.4, recogiendo fracciones de 4,300 mL. Todas las 4 fracciones contenían monatina y se evaporaron a 105 mL usando un evaporador giratorio con un baño de agua. Se formó un precipitado al reducirse el volumen y se filtró durante el transcurso del proceso de evaporación. El análisis de las fracciones de columna mediante LC/MS mostró que 99% del triptófano y monatina se unieron a la columna. El precipitado que se formó mediante el proceso de evaporación contenía >97% de triptófano y <2% de monatina. La relación de triptófano a producto en el sobrenadante fue de aproximadamente 2:1. El sobrenadante (7 mL) se aplicó a una columna Fast Flow DEAE Sepharose (Amersham Biosciences) de 100 mL convertida previamente en la forma de acetato mediante lavado con 0.5 L de NaOH 1M, 0.2 L de agua, 1.0 L de acetato de amonio 1.0 M, pH 8.4 y 0.5 L de agua. El sobrenadante se cargó a <2% mL/min y la columna se lavó con agua a 3-4 mL/min hasta que la absorbancia a 280 nra fuera de aproximadamente 0. La monatina fue eluída con 100 mM de acetato de amonio, pH 8.4, recogiendo 4 fracciones de 100 mL. El análisis de las fracciones mostró que la relación de triptófano a monatina en las fracciones de paso de flujo era de 85:15 y la relación en las fracciones eluyentes era de 7:93. Suponiendo el coeficiente de extinción a 280 nm de monatina fuera el mismo que el triptófano, las fracciones de eluyente que contenían 0.146 mmoles de producto. La extrapolación a la reacción de 1 L total produciría alrededor de 2.4 mmoles (alrededor de 710 mg) de monatina, para una recuperación de 68%. Las fracciones eluyentes de la columna de DEAE Sepharose fueron evaporadas a <20 mL. Un alícuota de producto se purificó más mediante la aplicación a una columna de fase inversa preparativa C8 usando las mismas condiciones cromatográficas que las descritas en el ejemplo 10 para la caracterización de monatina a escala analítica. Software Waters Fractionlynx™ se empleó para desencadenar una" colección de fracción automatizada de monatina con base en la detección del ion m/z = 293. La fracción que provenía de la columna C8 con el ion molecular protonado correspondiente para monatina se recogió, se evaporó hasta la sequedad y luego se disolvió en un volumen pequeño de agua. Esta fracción se usó para la caracterización del producto.

El producto resultante se caracterizó usando los siguientes métodos Espectroscopia UV/Visible. Las mediciones espectroscópicas UV/Visibles de monatina producidas enzim ticamente se llevaron a cabo usando un espectrofotómetro Cary 100 Bio UV/Visible. El producto purificado, disuelto en agua, mostró un máximo de absorción de 280 nm con un reborde a 280 nm, características típicas de los compuestos que contienen indol . Análisis LC/MS . Los análisis de mezclas para monatina derivada de las reacciones bioquímicas in vitro se llevaron a cabo como se describió en el ejemplo 10. Un análisis LC/MS típico de monatina en una mezcla sintética enzimática in vitro se ilustra en la figura 5. El panel inferior de la figura 5 ilustra un cromatograma de iones seleccionado para el ion molecular protonado de monatina a m/z = 293. Esta identificación de monatina en la mezcla fue corroborada por el espectro de masas ilustrado en la figura 6. El análisis del producto purificado mediante LC/MS mostró un solo pico con un ion molecular de 293 y bsorbancia a 280 nm. El espectro de masas fue idéntico al mostrado en la figura 6. Análisis MS/MS. Experimentos de iones hijos LC/MS/MS, como los descritos en el ejemplo 10, también se llevaron a cabo en monatina. Un espectro de masas de iones hijos de monatina se ilustra en la figura 7. Las asignaciones estructurales tentativas de todos los iones de fragmentos marcados en la figura 7 se hicieron . Éstas incluyeron los iones de fragmento de m/z = 275 (293 - ¾0) , 257 (293 - (2 x Ha0) ) , 230 (2 5 -COOH) , 212 (257-COOH) , 168 (ion de 3 -buta- l , 3 -dienil -l- lH-indol carbonio) , 158 (ion de lH-indol -3 -carbaldehído carbonio) , 144 (ion de 3 -etil- lH- indol carbonio) , 130 (ion de 3 -metilen-lH-indol carbonio) y 118 (ion de indol carbonio) . Muchos de estos son los mismos que los obtenidos para MP (ejemplo 4) , como se espera si se derivaban de la porción de indol de la molécula. Algunos son una unidad de masa más alta que aquellos observados para MP, debido a la presencia de un grupo amino en lugar de una cetona. Medición de masa precisa de monatina. La figura 8 ilustra el espectro de masas obtenido para monatina purificada empelando un espectrómetro de masas de tiempo de vuelo-cuadropolos híbridos Applied Biosystems-Perkin Elmer Q-Star. La masa medida para la monatina protonada usando triptofano como un parámetro de calibración de masas interna fue 293 . 1144 . La masa calculada de monatina protonada , con base en la composición elemental C1 H17 205 es 293 . 1137 . Este es un error de medición de masa de menos de 2 partes por millón (ppm) , proporcionando evidencia conclusiva de la composición elemental de la monatina producida enzimáticamente . Espectroscopia RMN. Los experimentos de RMN se llevaron acabo en un instrumento Varían Inova 500 MHz . La muestra de monatina (aproximadamente 3 mg) se disolvió en 0 . 5 mL de D20. Inicialmente, el solvente (D20) se usó como la referencia interna a 4.78 ppm. Ya que el pico para agua1 fue grande, la 1H R M se corrió con la supresión del pico para agua. Posteriormente, debido a lo amplio del pico de agua, el protón C-2 de monatina se usó como el pico de referencia y se estableció al valor publicado de 7.192 ppm. Para 13C-RNM, una corrida inicial de varios cientos de escaneos indicó que la muestra estaba muy diluida para obtener un espectro de 13C adecuado en el tiempo asignado. Por lo tanto, se llevó a cabo un experimento de coherencia de cuantum múltiple heteronuclear (HMQC) , el cual hizo posible la correlación de los hidrógenos y los carbonos a los cuales estaban unidos, y también proporcionó información sobre los desplazamientos químicos de los carbonos. Un resumen de los datos de ½ y HMQC se muestra en las tablas 1 y 2. Mediante la comparación con valores publicados, los datos de RM indicaron que la monatina producida enzimáticamente era (S,S), (R,R) o una mezcla de ambos . Análisis LC/ S quiral . Para establecer que la monatina producida in vitro era un estereoisómero, y no una mezcla de los enantiómeros quirales (S,S) y (R,R) , se llevaron a cabo análisis de LC/MS quirales usando la instrumentación descrita en el ejemplo 10. La separaciones LC quirales se hicieron usando una columna cromatografía quiral Chirobiotic T (Advanced Seprations Technology) a temperatura ambiente. La separación y detección, con base en protocolos publicados del vendedor, se optimizaron para los estereoisómeros R- (D) y S- (L) de triptófano. La fase móvil de LC consistía en A) agua que contenía 0.05% (v/v) de ácido trifluoroacético; B) metanol que contenía 0.05% (v/v) de ácido trifluoroacético . La elución fue isocrática a 70% de A y 30% de B. La velocidad de flujo fue de 1.0 mL/min y la absorbancia de PDA se monitoreó a partir de 200 nm a 400 nm. Los parámetros instrumentales usados para el análisis LC/MS quiral de triptófano y monatina son idénticos a aquellos descritos en el ejemplo 10 para el análisis LC/MS. La colección de espectros de masa para la región m/z 150-400 fue utilizada. Los cromatogramas de iones seleccionados para iones moleculares protonados ( [M + H] + = 205 tanto para R- como para S- triptófano y [M + H] + 293 para monatina) permitieron la identificación directa de estos analitos en las mezclas . Los cromatrogramas de R- y S-triptófano y monatina, separados mediante cromatografía quiral y monitoreados mediante MS, se muestran en la figura 9. El pico individual en el cromatrograma de monatina indica que el compuesto es un estereoisómero, con un tiempo de retención casi idéntico al de S-triptófano.

Tabla 1 Datos de ½ RNM 1 Vleggar et al. (J.C.S. Perkin Trans . 1:3095-8, 2Takeshi y Shusuke (JP2002060382, Tabla 2 Datos de 13C KNM (de espectro HMQC) 1 Vleggar et al. (J.C.S. Perkin Trans. 1:3095-8, 1992) Polarimetria. La rotación óptica se midió en un polarimetro Rudolph Autopol III. La monatina se preparó como una solución 14.6 mg/mL en agua. La rotación especifica esperada ([CC]D2C) para S,S monatina (forma de sal) es -49.6 para una solución 2 g/mL en agua (Vleggar et al.) . La [ ]D20 observada fue de -28.1 para la monatina purificada y producida enzimáticamente indicando que era el S,S estereoisómero . Mejoras Las condiciones · de reacción, incluyendo concentraciones de reactivos y enzimas, se optimizaron y rendimientos de 5-10mg/mL se produjeron usando la siguiente mezcla de reactivos: 50 mM de acetato de amonio, pH 8.3, 2 mM de MgCl2, 200 mM de piruvato (sal sodio o amonio) , 5 mM de alfa-cetoglutarato (sal sodio), 0.05 mM de fosfato de piridoxal, agua desairada para lograr un volumen final de 1 mL después de la adición de las enzimas, 3 mM de fosfato de potasio, 50 µg/mL de ProA aldolasa recombinante (extracto celular; concentración de proteínas total de 167 µg/mL) , 100 µg/mL de L-aspartato aminotransferasa codificada por el gen spC de E. coli (extracto celular; concentración de proteínas total de 2500 µg/mL) y triptofano sólido para dar una concentración de >60 mM (saturada; un poco no se disolvió a lo largo de la reacción) . La mezcla se incubó a 30°C durante 4 horas con agitación o mezclado suave. Sustituciones La concentración de alfa-cetoglutarato puede reducirse a 1 mM y complementarse con 9 mM de aspartato con un rendimiento equivalente de monatina. Los receptores de aminoácidos alternativos pueden utilizarse en la primera etapa, tales como oxaloacetato . Cuando aminotransferasa de substrato amplio de L. major recombinante se usó en lugar de la L-aspartato aminotransferasa de E. coli, se lograron rendimientos similare.s de monatina. Sin embargo, un segundo producto no identificado (3-10% del producto principal) con una masa molecular de 292 también se detectó mediante el análisis LC-MS . Concentraciones de monatina de 0.1-0.5 mg/mL se produjeron cuando la enzima codificada por tyrB de jS. coli, la enzima codificada por tat A de S. meliloti o la glut mico-oxaloacético transaminasa de corazón de cerdo (tipo lia) se añadió como la aminotransferasa. Cuando se inició la reacción a partir de indol-3-piruvato, se pudo llevar a cabo una aminación reductora para la última etapa con glutamato deshidrogenasa y NADH (como en el ejemplo 7) . Las KHG aldolasas de B. subtilis, E. coli y S. meliloti también fueron usadas con la L-aspartato aminotransferasa de E. coli para producir monatina enzimáticamente . Se usaron las siguientes condiciones de reacción: 50 mM de H4-0Ac pH 8.3, 2 mM de MgCl2, 200 mM de piruvato, 5 mM de glutamato, 0.05 mM de fosfato de piridoxal, agua desairada para lograr un volumen final de 0.5 mL después de la adición de las enzimas, 3 mM de fosfato de potasio, 20 µg/mL de KHG aldolasa de B.- subtilis recombinante (purificada) , alrededor de 400 µg/mL de L-aspartato aminotransferasa de E. coli (AspC) no purificada del extracto celular y 12 mM de indol-3-piruvato. Las reacciones se incubaron a 30°C durante 30 minutos con agitación. La cantidad de monatina producida usando la enzima B. subtilis fue de 80 ng/mL, y se incrementó con cantidades cada vez más altas de aldolasa. Si indol-3-piruvato y glutamato fueron reemplazados por cantidades saturadoras de triptófano y 5 mM de alfa-cetoglutarato , la producción de monatina se incrementaba a 360 ng/mL. Las reacciones se repitieron con 30 pg/mL de cada una de las tres enzimas KHG en 50 mM de Tris pH 8.3 , con cantidades saturadoras de triptófano, y se les dejó proceder durante 1 hora para incrementar así la detección. La enzima de Bacillus tuvo la actividad más alta que en el ejemplo 4, produciendo aproximadamente 4, 000 ng/mL de monatina. La KHG de E. coli produjo 3 , 000 ng/mL de monatina, y la enzima S. meliloti produjo 2 , 300 ng/mL . Ej emplo 7 Inter conversión entre P y monatina La aminación de MP para formar monatina puede ser catalizada por aminotransferasas tales como aquellas identificadas en los ejemplos 1 y 6, o por deshidrogenasas que requieran de un cof actor de reducción tal como ISLADH o N¾DPH. Esta reacciones son reversibles y pueden medirse en cualquier dirección. La direccionalidad, cuando se usa una enzima deshidorgenasa, puede ser ampliamente controlada por la concentración de sales de amonio . Actividad deshidrogenasa . La desaminación oxidante de monatina se moni toreo al seguir el incremento en absorbancia a 340 nm al convertirse ¾D (P) + en la N¾D(P)H más crcmofórica. La monatina se produjo enzináticamente y se purificó cerno se describe en el ejemplo 6. Una mezcla de ensayo típica contenía 50 mM de Tris-HC1 , pH 8 . 0 a 8 . 9 , 0 . 33 mM de NAD+ o NADP+, 2 a 22 unidades de glutamato deshidrogenasa (Sigma) y 10 - 15 mM de substrato en 0 . 2 mL . El ensayo se llevó a cabo por duplicado en una placa de microtitulación transparente a UV, sobre un lector de placa Molecular Devices SpectraMax Plus. Una mezcla de la enzima, regulador de pH y NAD (P) + se pipeteo en pocilios que contenían el substrato y el incremento en absorbancia 340 nm se monitoreó a intervalos de 10 segundos después de un breve mezclado. La reacción se incubó a 25°C durante 10 minutos. Se llevaron a cabo controles negativos y la adición de substrato, y se utilizó glutamato como un control positivo. La glutamato deshidrogenasa tipo III de hígado de bovino (Sigma # G-7882) catalizó la conversión de la monatina en el precursor de monatina a una velocidad de conversión de aproximadamente un ciento de la velocidad de la conversión de glutamato en alfa-cetoglutarato . Actividad de transaminación. Los ensayos de monatina aminotransferasa se llevaron a cabo con la aspartato aminotransferasa (AspC) de E. coli, la tirosina aminotransferasa (TyrB) de E. coli, la aminotransferasa de substrato amplio (BSAT) de L. major y las dos glutamato-oxaloacetato aminotransferasas de porcino disponibles comercialmente descritas en el ejemplo 1. Tanto oxaloacetato como alfa-cetoglutarato se probaron como el receptor de amino. La mezcla de ensayo contenía (en 0.5 mL) 50 mM de Tris-HCl, pH 8.0, 0.05 mM de PLP, 5 mM de receptor amino, 5 mM de monatina y 25 µg de aminotransferasa . Los ensayos se incubaron a 30°C durante 30 minutos, y las reacciones se detuvieron por la adición de 0.5 mL de alcohol isopropílico . La pérdida de monatina se monitoreó mediante LC/MS (ejemplo 10) . La cantidad más alta de actividad se notó con BSAT de L. major con oxaloacetato como el receptor amino, seguida por la misma enzima con alfa-cetoglutarato como el receptor amino. La actividad relativa con oxaloacetato fue: BSAT>AspC>porcino tipo IIa>porcino tipo I=TyrB. La actividad relativa con alfa-cetoglutarato fue BSAT>AspC>porcino tipo I>porcino tipo IIa>TyrB. Ejemplo 8 Producción de monatina a partir de triptofano y fuentes de C3 que no son piruvato Como se describió arriba en el ejemplo 6, indol-3-piruvato o triptofano pueden convertirse en monatina usando piruvato como la molécula de C3. Sin embargo, en algunas circunstancias, el piruvato podría no ser una materia prima deseable. Por ejemplo, el piruvato puede ser más costoso que otras fuentes de carbono C3, o puede tener efectos adversos en las fermentaciones si se añade al medio. Alanina puede ser transaminada por muchas enzimas PLP para producir piruvato. Las enzimas tipo triptofanasa llevan a cabo reacciones de beta-eliminación a velocidades más rápidas que otras enzimas PLP tales como aminotransferasas . Las enzimas de esta clase (4.1.99.-) pueden producir amoniaco y piruvato a partir de aminoácidos tales como L-serina, L-cisteína y derivados de serina y cisteína con buenos grupos salientes tales como O-metil-L-serina, O-bencil-L-serina, S-metilcisteína, S-bencilcisteína, S-alquil-L-cisteína, O-acil-L-serina, 3-cloro-L-alanina. Los procesos para producir monatina usando polipéptidos EC 4.1.99.- pueden mejorarse al matar la ß-tirosinasa (TPL) o triptofanasa de acuerdo con el método de Mouratou et al. (J:Biol. Chem 274:1320-5, 1999) . Mouratou et al. describe la capacidad para convertir la ß-tirosinasa en una ß-liasa de aminoácido dicarboxílico, la cual no ha sido reportado que ocurra en la naturaleza. El cambio en especificidad fue logrado al convertir valina (V) 283 en arginina (R) y arginina (R) 100 en treonina (T) . Estos cambios de aminoácido permiten que la liasa acepte un aminoácido dicarboxílico para la reacción de desaminación hidrolitica (tal como aspatatos) . El aspartato, por lo tanto, también se puede usar como una fuente de piruvato para reacciones de condensación de aldol subsecuentes. Además, las células o reactores enzimáticos pueden ser suministrados con lactato y una enzima que convierta lactato en piruvato. Ejemplos de enzimas capaces de catalizar esta reacción incluyen lactato deshidrogenasa y lactato oxidasa. La mezcla de reacción consistía en 50 p? de Tris-Cl pH 8.3, 2 mM de MgCl2, 200 m de fuente de carbono C3, 5 mM de alfa-cetoglutarato, sal sodio, 0.05 mM de fosfato de piridoxal, agua desaireada para lograr un volumen final de 0.5 mL después de la adición de las enzimas, 3 mM de fosfato de potasio pH 7.5, 25 g de ProA aldolasa de C. testosteroni recombinante cruda como la preparada en el ejemplo 4, 500 µg de L-aspartato aminotransferasa cruda (AspC) como la preparada en el ejemplo 1, y triptófano sólido para dar una concentración de >60 iti (saturada; un poco no se disolvió a lo largo de la reacción) . La mezcla de reacción se incubó a 30°C durante 30 minutos con mezclado. Serina, alanina y aspartato fueron suministrados como fuentes de 3 carbonos. Los ensayos se llevaron a cabo con y sin enzimas PLP secundarias (purificadas) capaces de llevar a cabo la beta-eliminación y las reacciones de beta-liasa (triptofanasa (TNA) , triptofanasa utante doble, ß-tirosinasa (TPL) ) . Los resultados se muestran en la tabla 3: Tabla 3 Producción de monatina utilizando fuentes de carbono C3 alternati as Fuente de Enzima PLP adicional Actividad carbono C3 relativa Ninguna Ninguna 0% Piruvato Ninguna 100% Serina Ninguna 3% Serina 11 g de TNA tipo silvestre 5.1% (1 ü) Serina 80 µg de TNA mutante doble 4.6% Alanina Ninguna 32% Alanina 11 µg de TNA tipo silvestre 41.7% Alanina 80 µg de TNA mutante 43.9% Aspartato 110 µg de TNA tipo 7.7% silvestre (10 ü) Aspartato 5 U TPL tipo silvestre 5.1% (crudo) Aspartato 80 g de TNA mutante 3 · 3*s La monatina producida a partir de alanina y serina como fuentes de tres carbonos se verificó mediante análisis de escaneo de hijos LC/MS/MS, y fue idéntica a la monatina caracterizada producida en el ejemplo 6. La alanina fue la mejor alternativa probada, y* fue transaminada por la enzima AspC . La cantidad de monatina producida se incrementó mediante la adición de la triptofanasa, la cual es capaz de la transaminación como una actividad secundaria. La cantidad de monatina producida con serina como una fuente de carbono casi se duplicó con la adición de las enzimas triptofanasa, incluso a pesar de que sólo un quinto de la cantidad de triptofanasa se añadiera en comparación con la aminotransferasa. AspC es capaz de cierta cantidad de actividad de beta-eliminación sola. Los resultados con aspartato indican que la actividad triptofanasa en aspartato no se incrementa con las mismas mutaciones dirigidas a sitio que las sugeridas previamente para ß-tirosinasa . Se espera que la ß-tirosinasa mutante tenga una actividad más alta para la producción de monatina. Ejemplo 9 Síntesis química de monatina La adición de alanina a ácido indol-3 -pirúvico produce monatina, y esta reacción puede llevarse a cabo sintéticamente con un reactivo de Grignard o de organolitio. Por ejemplo, a 3-cloro- o 3-bromo-alanina que había sido bloqueada adecuadamente en los grupos carboxilo y amino, se le añade magnesio bajo condiciones anhidras. El indol-3-piruvato (bloqueado adecuadamente) se añade después para formar el producto copulado seguido por la remoción de los grupos protectores para formar monatina. Los grupos protectores que son particularmente útiles incluyen THP (éter tetrahidropiranílico) el cual se une y se remueve fácilmente. Ejemplo 10 Detección de triptófano, monatina y MP Este ejemplo describe métodos usados para detectar la presencia de monatina o su precursor ácido 2-hidroxi-2- (indol-3-ilmetil) -4-ceto glutárico. Análisis LC/MS Los análisis de las mezclas de monatina, MP y/o triptófano derivados de reacciones bioquímicas in vi tro o in vivo se llevaron a cabo usando un instrumento de espectrometría de masas tándem-cromatografía de líquidos Waters/Micromass (LC/MS/MS) que incluía un cromatógrafo de líquidos Waters 2690 con un monitor de absorbancia Waters 996 Photo-Diode Array (PDA) puesto en serie entre el cromatógrafo y un espectrómetro de masas de cuatro polos triple Micromass Quattro Ultima. Las separaciones LC se llevaron a cabo usando una columna de cromatografía de fase inversa Ci8 Supelco Discovery, 2.1 mm x 150 mm, o una columna de cromatografía de fase inversa C8 Xterra MS, 2.1 mm x 250 mm, a temperatura ambiente. La fase móvil LC consistía en A) agua que contenía 0.05% (v/v) de ácido trifluoroacético y B) metanol que contenía 0.05% (v/v) de ácido trifluoroacético . La elución de gradiente fue lineal a partir de 5% de B a 35% de B, 0-9 min, lineal a partir de 35% de B a 90% de B, 9-16 min, isocrática a 90% de B, 16-20 min, lineal a partir de 90% de B a 5% de B, 20-22 min, con un periodo de re-equilibrio de 10 min entre corridas. La velocidad de flujo fue de 0.25 mL/min y la absorbancia de PDA se monitoreó a partir de 200 nra a 400 nm. Todos los parámetros de la ESI-MS fueron optimizados y se seleccionaron con base en la generación de los iones moleculares protonados ( [M + H] +) de los analitos de interés, la producción de los iones de fragmento característicos. Los siguientes parámetros instrumentales se usaron para el análisis LC/MS de monatina: Capilar: 3.5 kV; Cono 40 V; Hex 1:20 V; Abertura: 0 V; Hex 2: 0V; temperatura de origen: 100°C; temperatura de desoí atación: 350°C; gas de desolvatación : 500 L/h; gas concentrado: 50 L/h; resolución de masa baja (Ql) : 15.0; resolución de masa alta (Ql) : 15.0; energía iónica: 0.2; entrada: 50V; Energía de colisión: 2; Salida: 50V; resolución de masa baja (Q2) : 15; resolución de masa alta (Q2) : 15; energía iónica (Q2) : 3.5; Multiplicador: 650. Las incertidumbres para las relaciones de masa/carga reportadas im/z) y masas moleculares son ± 0.01%. La detección inicial de la forma ácido alfa-ceto de monatina (MP) y monatina en las mezclas se logró mediante el monitoreo por LC/MS con la recolección de espectros de masas para la región m/z 150-400. Los cromatogramas de iones seleccionados para iones moleculares protonados ( [ + H] + = 292 para MP, [M + H] + = 293 para monatina) permiten la identificación directa de estos analitos en las mezclas. Análisis MS/MS Experimentos de iones hijos LC/MS/MS se llevaron a cabo en monatina como sigue. Un análisis de iones hijos incluye la transmisión del ion progenitor (por ejemplo, m/z -293 para monatina) de interés a partir del primer analizador de masas (Ql) en la celda de colisión del espectrómetro de masas, en donde se introduce argón y se disocia químicamente los iones progenitores en iones fragmentados (hijos) . Estos iones fragmentados se detectan después con el segundo analizador de masas (Q2) y se pueden usar para corroborar la asignación estructural del progenitor. Triptófano se caracterizó y se cuantificó de la misma manera mediante la transmisión y fragmentación de m/z = 205. Se usaron los siguientes parámetros instrumentales para el análisis LC/MS/MS de monatina: Capilar: 3.5 kV; Cono: 40 V; Hex 1:20 V; Abertura: 0 V; Hex 2: 0V; temperatura de origen: 100 °C temperatura de desolvatación: 350°C; gas de desolvatación: 500 L/h; gas de cono: 50 L/h; resolución de masa baja (Ql) : 13.0; resolución de masa alta (Ql) : 13.0; energía iónica: 0.2; entrada: -5V; Energía de colisión: 14; Salida: IV; resolución de masa baja (Q2) : 15; resolución de masa alta (Q2) : 15; energía iónica (Q2) : 3.5; Multiplicador: 650. Determinación de alta emisión de monatina y triptófano Análisis de alta emisión (<5 min/muestra) de mezclas para monatina y triptófano derivadas de reacciones dn vitro o in vivo se llevaron a cabo usando los instrumentos descritos arriba, y los mismos parámetros que los descritos para LC/MS/MS . Las separaciones de LC se hicieron usando una columna Advanced Sepration Technologies Chirobiotic T de 4.6 mm x 50 mm a temperatura ambiente. La fase móvil LC consistía en A) agua que contenía 0.25% de ácido acético; B) metanol que contenía 0.25% de ácido acético. La elución isocrática fue a 50% de B, 0-5 min. La velocidad de flujo fue de 0.6 mL/min. Todos los parámetros del sistema de ESI-MS/MS fueron optimizados y seleccionados con base en una generación en fuente óptima del ion molecular protonado de triptófano y la norma interna 2H5-triptófano, asi como la producción inducida por colisión de iones fragmentados específicos de aminoácidos para varios experimentos de monitoreo de reacción (MRM) . Se usaron los siguientes parámetros instrumentales para el análisis LC/MS/MS de monatina y triptófano en el modo de monitoreo de reacción múltiple de iones positivos (mrm) : Capilar: 3.5 kV; Cono: 20 V; Hex 1: 15 V; Abertura: 1 V; Hex 2: 0V; temperatura de origen: 100°C; temperatura de desoí atación : 350°C; gas de desolvatación: 500 L/h; gas de cono: 40 L/h; resolución de masa baja (Ql) : 12.0; resolución de masa alta (Ql) : 12.0; energía iónica: 0.2; entrada: -5V; Energía de colisión: 14; Salida: IV; resolución de masa baja (Q2) : 15; resolución de masa alta (Q2) : 15; energía iónica (Q2) : 0.5; Multiplicador: 650. Parámetros de MRM: retraso entre canales: 0.03 s; retraso entre barridos: 0.03 s; tiempo de reposo: 0.05 s. Medición de masa precisa de monatina El análisis MS de alta resolución se llevo a cabo usando un espectrómetro híbrido de cuatro polos/de masas de tiempo de vuelo Applied Biosystems-Perkin. La masa medida para la monatina protonada usando triptófano como una norma de calibración de masas interna. La masa calculada de la monatina protonada, con base en la composición elemental Ca4Hi7N205 es 293.1137. La monatina producida usando el proceso biocatalítico descrito en el ejemplo A mostró una masa medida de 293.1144. Este es un error de medición de masa de menos de 2 partes por millón (ppm) , proporcionando evidencia conclusiva de la composición elemental de la monatina producida enzimáticamente .

Ejemplo 11 Producción de monatina en bacterias Este ejemplo describe métodos usados para producir monatina en células de E. coli. Alguien capacitado en la técnica entenderá que se pueden usar métodos similares para producir monatina en otras células bacterianas. Además, se pueden usar vectores que contengan otros genes en la vía de síntesis de monatina (figura 2) . Medio de Trp-1 + glucosa un medio mínimo que ha sido usado para la producción incrementada de triptófano en células de ?. coli (Zeman et al. Folia Microbiol. 35:200-4, 1990), se preparó como sigue. A 700 mL de agua nanopura se le añadieron los siguientes reactivos: 2 g de ( H)2S04, 13.6 g de KH2P04, 0.2 MgS04*7¾0, 0.01 g de CaCl2*2H20 y 0.5 mg de FeS04* 7H20. El pH se ajustó a 7.0, el volumen se incrementó a 850 mL y el medio se sometió a autoclave. Se preparó una solución de glucosa al 50% por separado y se filtró de manera estéril. Se añadieron 40 mL al medio de base (850 mL) para un volumen final de 1 L. Se preparó una solución de L-triptófano de 10 g/L en fosfato de sodio 0.1 M pH 7 y se filtró de manera estéril . Un volumen de un décimo se añadió típicamente a los cultivos como se especifica abajo. Se preparó también una solución de piruvato de sodio al 10% y se filtró de manera estéril. Se usó típicamente una alícuota de 10 mL por litro de cultivo. Grupos de ampicilina (100 mg/tnL) , kanamicina (25 mg/mL) e IPYG (840 nM) se prepararon, se filtraron para hacerlos estériles y se almacenaron a -20°C antes de usar. Tween 20 (monolaurato de polioxietilen 20-sorbitan) se utilizó a una concentración final de 0.2% (vol/vol) . Se usó ampicilina a concentraciones no letales, típicamente 1-10 ug/mL de concentración final. Placas frescas de E. coli BL21 (DE3) : : C. testosteroni proA/pEI 30 Xa/LIC (descritas en el ejemplo 4) se prepararon sobre medio LB que contenía 50 [og/mL de canamicina. Los cultivos nocturnos (5 mL) fueron inoculados a partir de una sola colonia y se cultivaron a 30°C en medio LB con canamicina. Típicamente, se usó un inoculo de 1 a 50 para la inducción en medio trp-1 + glucosa. Se añadió antibiótico fresco a una concentración final de 50 mg/L. Los matraces de agitación se cultivaron a 37°C antes de la inducción. Las células fueron muestreadas cada hora hasta que se obtuviera una OD6oo de 0.35-0.8. Las células se indujeron después con 0.1 mM de IPTG y la temperatura se redujo a 34°C. Se recogieron muestras (1 mL) antes de la inducción (punto de tiempo cero) y se centrifugaron a 5000 x g. El sobrenadante se congeló a -20°C para el análisis LC/MS . Cuatro horas después de la inducción, se recogió otra muestra de 1 mL, y se centrifugó para separar el caldo de la pella de células . Triptófano, piruvato de · sodio, ampicilina y Tween se añadieron como se describió arriba. Las células se cultivaron durante 48 horas después de la inducción, y otra muestra de 1 mL se tomó y se preparó como se indicó arriba. Después de 48 horas, se añadieron otra alícuota de triptófano y piruvato. El volumen de cultivo completo se centrifugó después de aproximadamente 70 horas de crecimiento (post-inducción) durante 20 minutos a 4°C y 3500 rpm. El sobrenadante se decantó y tanto el caldo como las células se congelaron a -80°C. Las fracciones de caldo se filtraron y se analizaron mediante LC/MS . Las alturas y áreas de los picos de [M + H] + = 293 se monitorearon como se describió en el ejemplo 10. El nivel de fondo de medio se restó. Los datos se normalizaron para el crecimiento de células al graficar la altura del pico [M + H]+ = 293 dividida entre la densidad óptica del cultivo a 600 nm. Niveles ms altos de monatina se produjeron cuando se añadieron piruvato, ampicilina y Tween 4 horas después de la inducción en lugar de en la inducción. Otros aditivos tales como PLP, fosfato adicional o MgCl2 adicional no incrementaron la producción de monatina. Titulaciones más altas de monatina se obtuvieron cuando se utilizó triptófano en lugar de indol-3 -piruvato, y cuando el triptófano se añadió después de la inducción en lugar de la inoculación, o en la inducción. Antes de la inducción, y 4 horas después de la inducción (en el momento de la adición del substrato) , típicamente no hubo nivel detectable de monatina en el caldo de fermentación o extractos celulares. Se hicieron controles negativos utilizando células con.pET30a vector solamente, así como cultivos en los que no se añadieron triptófano y piruvato. Un barrido MS progenitor demostró que el conpuesto con (m+1) /z= 293 no se derivaba de moléculas más grandes, y barridos hijos (llevados a cabo como en el ejemplo 10) fueron similares a los de la monatina hecha in vitro. El efecto de Tween se estudió al utilizar 0, 0.2% (vol/vol) y 0.6% de concentraciones finales de Tween 20. La cantidad más alta de monatina producida por los matraces de agitación fue a 0.2% de Tween. La concentración de ampicilina fue variada ente 0 y 10 g/mL. La cantidad de monatina en el caldo celular se incrementó rápidamente (2.5 X) entre 0 y 1 pg/mL, y se incrementó 1.3 X cuando la concentración de ampicilina se incrementó de 1 a 10 ¡jg/mL. Un experimento de curso de tiempo que mostraba resultados típicos se muestra en la figura 10. La cantidad de monatina secretada en el caldo de células se incrementó, incluso cuando los valores se normalizan para el crecimiento de células . Al usar el coeficiente de extinción molar de triptófano, la cantidad de monatina en el caldo se calculó como menor de 10 µg/mL. Se repitió el mismo experimento con las células que contenían vector sin inserto proA. Muchos de los número fueron negativos, indicando que la altura de pico a m/z = 293 era menor en estos cultivos que en el medio solo (figura 10) . Los números fueron consistentemente más bajos cuando estuvieron ausentes triptófano y piruvato, demostrando que la producción de monatina es un resultado de la reacción enzimática catalizada por la enzima aldolasa.

La producción in vivo de monatina en células bacterianas se repitió en experimentos con matraces de agitación de 800 mL y en termentadores . Una muestra de 250 mL de monatina (en caldo libre de células) se purificó mediante cromatografía de intercambio aniónico y cromatografía de líquidos de fase inversa preparativa. Esta muestra se evaporó, y se sometió al análisis de masas de alta resolución (descrito en el ejemplo 6) . El MS de alta resolución indicó que el metabolito que se estaba produciendo era monatina. Ensayos in vi tro indican que la aminotransferasa tiene que estar presente a niveles más altos que la aldolasa (véase ejemplo 6) , por lo tanto la aspartato aminotransferasa de E. coli fue sobre expresada en combinación con el gen de aldolasa para incrementar la cantidad de monatina producida. Los cebadores fueron designados para introducir proA de C. testosteroni en un operón con AspC/pET30 Xa/LIC, como sigue : cebador 5' : ACTC S¾TCC 3 AG(_^^ (SEQ ID NO: 67) y cebador 3 ' : aSGCTOTCmCOOTAGT^ SEQ ID NO: 68) . El cebador 5' contiene un sitio BamHI, el cebador 3 ' contiene un sitio Salí para clonación. Se llevó a cabo la PCR como se describió en el ejemplo 4, y se purificó con gel . La construcción aspC/pET30 Xa/LIC fue digerida con BamHI y Salí , al igual que el producto de PCR . Las digestiones se purificaron usando una columna centrífuga Qiagen . El producto de PCR proA fue ligado al vector usando el equipo de ligación de ADN rápida Roche (Indianápolis , IN) de acuerdo con las instrucciones del fabricante . Las transformaciones químicas se hicieron usando Novablues Singles (Novagen) como se describe en el ejemplo 1. Las colonias se cultivaron en medio LB que contenía 50 mg/L de canamicina y ADN plasmídico se purificó usando el equipo de miniprep centrífugo de Qiagen. Los clones se tamizaron mediante análisis de digestión de restricción y las secuencia se confirmó mediante Seq rigth (Houston, TX) . Las construcciones fueron subclonadas en BLR (DE3) , BLR (DE3 ) pLysS , BL21(DE3) y BL21 (DE3)pLysS (Novagen). La construcción pro.¾/pET30 Xa/LIC se transformó también en BL21 (DE3 ) pLysS . Comparaciones iniciales de BLR(DE3) en muestras de matraz de agitación bajo' condiciones estándares descritas arriba demostraron que la adición del segundo gen (aspC) mejoró la cantidad de monatina producida en siete veces. Para acelerar el crecimiento, se usaron cepas hospederas derivadas de BL21(DE3) . Los clones proA y los dos clones del operón del gen se introdujeron en medio Trp-1 como arriba, los hospederos pLysS tuvieron cloramfenicol (34 mg/L) añadido al medio también. Se llevaron a cabo experimentos en matraces de agitación con y sin la adición de 0.2% de Tween-20 y 1 mg/L de atnpicilina. La cantidad de monatina en el caldo se calculó usando monatina purificada y producida in vi tro como una norma. Se llevaron a cabo análisis SRM como se describió en el ejemplo 10. Las células fueron muestreadas a cero, 4 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas y 96 horas de crecimiento.

Los resultados se muestran en la tabla 4 para las cantidades máximas producidas en los caldos de cultivo. En la mayoría de los casos, las dos construcciones génicas tienen valores más altos que la construcción proA sola. Las cepas de pLysS, las cuales deben tener envolturas de 9*células más derramantes, tuvieron niveles más altos de monatina secretada, incluso a pesar de que estas cepas típicamente crecen a una velocidad más lenta. Las adiciones de Tween y ampicilina fueron benéficas. Tabla 4 Cantidad de monatina producida por bacterias de ?. col! Ejemplo 12 Producción de monatina en levadura Este ejemplo describe métodos usados para producir monatina en células eucarióticas . Alguien capacitado en la técnica entenderá que métodos similares pueden usarse para producir monatina en cualquier célula de interés. Además, se pueden usar otros genes (por ejemplo, aquellos listados en la figura 2) además de, o como alternativa a aquellos descritos en este ejemplo. El sistema de vector de marcado de epítopes de levadura pESC (Stratagene, La Jolla, CA) se usó para clonar y expresar los genes aspC de E. coli y proA de C. testosteroni en Saccharomyces cerevisiae. Los vectores pESC contienen tanto los promotores GAL1 como GALIO sobre hebras opuestas, con dos sitios de clonación múltiples distintos, permitiendo la expresión de dos genes al mismo tiempo. El vector PESC-His contiene también al gen His3 para la complementación de auxotropía de histidina en el hospedero (YPH500) . Los promotores GAL1 como GALIO son reprimidos por glucosa e inducidos por galactosa; se utiliza una secuencia de Kozak para la expresión óptima en levadura. Los plásmidos pESC son vectores promiscuos, permitiendo que se haga la construcción inicial en E. coli (con el gen Jbla para selección) ; sin embargo, no están presentes sitios de unión a ribosomas en los múltiples sitios de clonación. Los siguientes cebadores fueron diseñados para la clonación en pESC-His (los sitios de restricción están subrayados, la secuencia de Kozak está en negritas) : aspC (BamHl/SalI) , Gall : 5 ' -CGCGGATCCATAATGGTTGAGAACATTACCG-3 ' (SEQ ID NO: 69) y 5 ' -ACGCGTCGACTTACAGCACTGCCACAATCG-3 ' (SEQ ID NO: 70) . proA (EcoRl/Notl) , GALIO: 5'- CCGGAATTCATAATGGTCGAACTGGGAGTTGT-3 ' (SEQ ID NO: 71) y 5'-GAATGCGGCCGCTTAGTCAATATATTTCAGGCC-3 ' (SEQ ID NO : 72) . El segundo codón para ambas proteínas maduras se cambió de un aminoácido aromático a valina debido a la introducción de la secuencia de Kozak. Los genes de interés fueron amplificados usando ADN miniprep pET30 Xa/LIC a partir de los clones descritos en los ejemplos 1 y el ejemplo 4 como plantilla. Se llevó a cabo la PCR usando un termociclizador de gradiente ciclizadora Eppendorf Master y el siguiente protocolo para una reacción de 50 uL: 1.0 L de plantilla, 1.0 µ? de cada cebador, 0.4 rr de cada dTP, 3.5 U de polimerasa de alta fidelidad de expansión (Roche, Indianápolis, IN) y regulador de pH IX Expand ™ con Mg. El programa de termociclizador usado consistía en un inicio caliente a 90 °C durante 5 minutos, seguido por 29 repeticiones de las siguientes etapas: 94°C durante 30 segundos, 50°C durante 1 minuto 45 segundos y 72 °C durante 2 minutos 15 segundos. Después de las 29 repeticiones la muestra se mantuvo a 72 °C durante 10 minutos y luego se almacenó a 4°C. Los productos de PCR se purificaron mediante separación sobre un gel de TAE-agarosa al 1% seguidos por la recuperación usando un QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Valencia, CA) . El ADN del vector pESC-His (2.7 µg) fue digerido con BamHl/Sall y purificado en gel como arriba. El producto de PCR aspC fue digerido con BamHl/Salí y purificado con una columna de purificación de PCR QIAquick. Las ligaciones se llevaron a cabo con el equipo de ligación de ADN rápido de Roche siguiendo los protocolos del fabricante. Las ligaciones desalif cadas fueron electroforadas en 40 µ? de células competentes DH10B Electromax (Invitrogen) en una cuveta desechable Biorad de 0.2 cm usando un Biorad Gene Pulser II con controlador de impulsos más, de acuerdo con las instrucciones del fabricante . Después de 1 hora de recuperación en 1 mL de medio SOC, los transformantes se colocaron sobre placas en medio LB que contenía 100 µg/mL de ampicilina. Las preparaciones de ADN plasmldico para los clones se hicieron usando equipos miniprep centrífugos QIAprep. El ADN plasmídico se tamizó mediante digestión de restricción, y se secuenció (Seqwrigth) para la verificación usando los cebadores diseñados para el vector. El clon aspC/pESC-His fue digerido con EcoRi y .Noti, al igual que el producto de PCR proA. El ADN se purificó como arriba, y se ligó como arriba. Las dos construcciones génicas se transformaron en células DH10B y se tamizaron mediante digestión de restricción, y secuenciación de ADN. La construcción se transformó en la cepa YPH500 S. cerevisiae usando el equipo de transformación S.c. EasyComp™ (Invitrogen) . Las reacciones de transformación se colocaron sobre medio mínimo SC-His (manual de Invitrogen pYES2) que contenían 2% de glucosa. Colonias de levadura individuales se tamizaron para la presencia de los genes proA y aspC mediante PCR de colonia usando los cebadores de PCR anteriores. La células granuladas (2 µ?) fueron suspendidas en 20 µ? de regulador de pH Y-Lysis (Zymo Research) que contenia 1 µ? de zimolasa y se calentaron a 37°C durante 10 minutos. Cuatro µL de esta suspensión se usaron después en una reacción de PCR de 50 µ?. usando la mezcla de reacción de PCR y el programa descrito arriba. Cultivos de cinco mL fueron cultivados durante la noche sobre SC-His + glucosa a 30°C y 225 rpm. Las células fueron ajustadas gradualmente para crecer sobre rafinosa para de esta manera minimizar el periodo de retraso antes de la inducción con galactosa. Luego de aproximadamente 12 horas de crecimiento, las mediciones de absorbancia 600 nm se tomaron, y un volumen adecuado de células fue centrifugado y resuspendido para dar una OD de 0.4 en el medio SC-His fresco. Se usaron las siguientes fuentes de carbono secuencialmente : 1% de rafinosa + 1% de glucosa, 0.5% de glucosa + 1.5% de rafinosa, 2% de rafinosa y finalmente 1% de rafinosa + 2% de galactosa para la inducción. Después de aproximadamente 16 horas de crecimiento en medio de inducción, los cultivos de 50 mL se dividieron en cultivos de 25 mL duplicados, y los siguientes fueron añadidos solo a uno de los duplicados: (concentraciones finales) 1 g/L de L-triptófano, 5 mM de fosfato de sodio, pH 7.1, 1 g/L de piruvato de sodio, 1 mM de MgCl2. Las muestras de caldos y pellas de células del medio de no inducción, y de los cultivos de 16 horas antes de la adición de substratos para la via de monatina, fueron ahorradas como controles negativos. Además, construcciones que contenían sólo un gen aspC funcional (y un gen proA truncado) se utilizaron como otro control negativo. Se dejó que las células crecieran durante un total de 69 horas después de la inducción. Ocasionalmente las células de levadura fueron inducidas a una OD más baja, y sólo cultivadas durante 4 horas antes de la adición de triptófano y piruvato. Sin embargo, estos substratos de monatina parecen inhibir el crecimiento y la adición a OD más alta fue más efectiva. Las pellas de células de los cultivos fueron lisadas con 5 mL de YeastBuster™ + 50 µ? HP (Novagen) por gramo (peso húmedo) de células siguiendo los protocolos del fabricante, con la adición de inhibidores de proteasa y benzonasa nucleasa como se describió en ejemplos anteriores. El caldo de cultivo y extractos celulares se filtraron y analizaron mediante SRM como se describió en el ejemplo 10. usando este método, no se · detectó monatina en las muestras de caldo, indicando que las células no podían secretar monatina bajo estas condiciones. La fuerza motriz de los protones puede ser insuficiente bajo estas condiciones o los transportadores de aminoácidos generales pueden ser saturados con triptóf no. La expresión de proteínas no estuvo a un nivel que permitiera la detección de cambios usando SDS-PAGE. La monatina fue detectable (aproximadamente 60 ng/mL) transitoriamente en extractos de células del cultivo con dos genes funcionales, cuando se añadieron triptófano y piruvato al medio. La monatina no fue detectada en ninguno de los extractos células de control negativo. Ensayos in vitro para monatina se llevaron a cabo por duplicado con 4.4 mg/mL de proteína total (aproximadamente el doble de lo que se usa típicamente para extractos de células de E. col i) usando el ensayo optimizado descrito en el ejemplo 6. Se llevaron a cabo otros ensayos con la adición ya sea de 32 µg/mL de ProA aldolasa de C. testosteroni o 400 µg/mL de aminotransferasa AspC, para determinar qué enzima estaba limitando en el extracto celular. Se llevaron a cabo controles negativos sin la adición de enzima, o con la adición de sólo AspC aminotransferasa (la condensación de aldol puede ocurrir hasta cierto punto sin enzima) . Se llevaron a cabo controles positivos con enzimas parcialmente puras (31-40%) , usando 16 µg/xnL de aldolasa y 400 µg/mL· de aminotransferasa . Los resultados in vitro se analizaron mediante SRM. El análisis de los extractos de células mostró que el triptófano era transportado efectivamente al interior de las células cuando se añadía al medio después de la inducción, dando como resultado niveles de triptófano dos órdenes de magnitud más altos que aquellos en los cuales no se añadió triptófano adicional. Los resultados para el análisis de monatina in vitro se muestran en la tabla 5 (los números indican ng/mL) . Tabla 5 Producción de monatina con extractos de células de levadura Se obtuvieron resultados positivos con los extractos de células de la construcción de dos genes completa con y sin substrato añadido al medio de crecimiento. Estos resultados, en comparación con los controles positivos, indican que las enzimas fueron expresadas a niveles cercanos al 1% de la proteína total en levadura. La cantidad de monatina producida cuando el extracto de células de la construcción aspC (con proA) fue ensayado con aldolasa fue significativamente mayor que cuando los extractos de células fueron ensayados solos, e indican que la aminotransferasa a aspC recombinante comprende alrededor de 1-2% de la proteína total de levadura. Los extractos de células de cultivos no inducidos tuvieron una pequeña cantidad de actividad cuando se les ensayó con aldolasa debido a la presencia de aminotransferasas nativas en las células. Cuando se ensayaron con aminotransferasa aspC, la actividad de los extractos a partir de células no inducidas se incrementó hasta la cantidad de monatina producida por el control negativo con aspC (alrededor de 200 ng/mL) . En contraste, la actividad observada cuando se ensayó el extracto de células de construcción de dos genes se incrementa más cuando la aminotransferasa es suplementada que cuando se añade aldolasa. Ya que ambos genes deben ser expresados al mismo nivel, esto indica que la cantidad de monatina producida es maximizada cuando el nivel de aminotransferasa es más alto que el de aldolasa, de acuerdo con resultados mostrados en el ej emplo 6. La adición de piruvato y triptófano no sólo inhibe el crecimiento celular, sino que aparentemente inhibe la expresión de proteínas también. La adición del plásmido pESC-Trp puede usarse para corregir la auxotrofia de triptófano de las células hospederas YPH500, para proporcionar un medio para suministrar triptófano con efectos más bajos en crecimiento, expresión y secreción.

Ejemplo 13 Mejora de procesos enzimáticos usando reacciones copuladas En teoría, si no hay reacciones secundarias o degradación de los substratos o intermediarios, la cantidad máxima de producto formada a partir de la reacción enzimática ilustrada en la figura 1 es directamente proporcional a las constantes de equilibrio de cada reacción, y las concentraciones de triptófano y piruvato. El triptófano no es un substrato altamente soluble, y concentraciones de piruvato de más de 200 mM parecen tener un efecto negativo en el rendimiento (véase ejemplo 6) . Idealmente, la concentración de monatinas se maximiza con respecto a substratos, para de esta manera reducir el costo de separación. La separaciones físicas pueden llevarse a cabo de tal manera que la monatina sea removida de la mezcla de reacción, evitando que ocurran reacciones inversas. La materia prima y catalizadores pueden ser después regenerados . Debido a la similitud de la monatina en tamaño, carga e hidrofobicidad con varios de los reactivos de intermediarios, las separaciones físicas serán difíciles a menos que exista una alta cantidad de afinidad para monatina (tal como una técnica de cromatografía de afinidad) . Sin embargo, las reacciones de monatina pueden acoplarse a otras reacciones de tal manera que el equilibrio del sistema se desplace hacia la producción de monatina. Los siguientes son ejemplos de procesos para mejorar el rendimiento de monatina obtenida a partir de triptófano o indol-3-piruvato . Reacciones copuladas usando OKaloacetato descarboxilasa (EC 4.1.1.3) La figura 11 es una ilustración de la reacción. Triptófano oxidasa y catalasa se utilizan para conducir la reacción en la dirección de la producción de indol-3 -piruvato. La catalasa se usa en exceso de tal manera que peróxido de hidrógeno no esté disponible para reaccionar en la dirección inversa o para dañar las enzimas o intermediarios. Oxígeno se regenera durante la reacción de catalasa. Como alternativa, indol-3-piruvato puede usarse como el substrato . Se usa aspartato como el donador amino para la aminación de MP, y se utiliza una aspartato aminotransferasa . Idealmente, una aminotransferasa que tiene baja especificidad para la reacción triptófano/indol-3-piruvato en comparación con la reacción MP a monatina se usa de tal manera que el aspartato no se utilice para re-aminar el indol-3-piruvato . Se puede añadir oxaloacetato descarboxilasa (de Pseudomonas sp.) para convertir el oxaloacetato en piruvato y dióxido de carbono. Ya que el C02 es volátil, no está disponible para la reacción con las enzimas, reduciendo o incluso evitando las reacciones' inversas . El piruvato producido en esta etapa también puede utilizarse en la reacción de condensación de aldol . Otras enzimas descarboxilasa pueden usarse, y se sabe que existen homólogos en Actinobacillus actinomycetemcomitans, Aquifex aeolicus, Archaeoglobus fulgidus, Azotobacter vinelandii, Bacteroides fragilis, varias especies Bordetella, Campylobacter jejuní, Chlorobi m tepidum, Chlorojlexus aurantiacus, Enterococcus faecalis, husobacteriu nucleatum, Klebsíellapneumoniae, Legionellapneumophila, Magnetococcus MC-If Mannhei ia haemolytica, Methylobacillus fragellatus KT. Pasteurella multocida Pm70, Petrotoga miotherma, Porphyromonas gingival!s, varias especies de Pseudomonas, varias especies de Pyrococcus, Rhodococcus, varias especies de Salmonella, varias especies de Streptococcus, Therochromatium tepidum, Thermotoga marítima, Treponemapallidu y varias especies de Vijbrio. Se llevaron a cabo ensayos de triptófano aminotransferasa con la aspartato aminotransferasa [aspC) de E. coli, la tirosina aminotransferasa (TyrB) de E. coli, la aminotransferasa de substrato amplio (BSAT) de L. ajor y las dos glutamato-oxaloacetato aminotransferasa de porcino disponibles comercialmente como las descritas en el ejemplo 1. Tanto oxaloacetato como alfa-cetoglutarato fueron probados como el aceptor amino. La relación de actividad usando monatina (ejemplo 7) contra la actividad usando triptófano se comparó para determinar qué enzima tenía la especificidad más alta para la reacción de aminotransferasa de monatina. Estos resultados indicaron que la enzima con la especificidad más alta para la reacción de monatina contra la reacción de triptófano es la glutamato-oxaloacetato aminotransferasa tipo II-A de porcino, GOAT (Sigma G7005) . Esta especificidad fue independiente de qué receptor amino se utilizara. Por lo tanto, esta enzima se usó en la reacciones copuladas con oxaloacetato descarboxilasa . Una reacción típica iniciando a partir de indol-3-piruvato incluía (concentraciones finales) 50 rtiM de Tris-Cl pH 7.3, 6 mM indol -3 -piruvato, 6 mM de piruvato de sodio, 6 mM de aspartato, 0.05 mM de PLP, 3 mM de fosfato de potasio, 3 mM de MgCl2, 25 µg/mL de aminotransferasa, 50 µg/mL de aldolasa proA de C. testosteroni y 3 unidades/mL de descarboxilasa (Sigma 04878) . Se de ó que las reacciones procedieran durante 1 hora a 26°C. En algunos casos, se omitió la descarboxilasa o se sustituyó el aspartato con alfa-cetoglutarato (como controles negativos) . Las enzimas aminotransferasa descritas arriba también se probaron en lugar de la GOAT para confirmar experimentos de especificidad anteriores. Las muestras fueron filtradas y analizadas mediante LC/MS como se describió en el ejemplo 10. Los resultados demuestran que la enzima GOAT produjo la cantidad más alta de monatina por mg de proteína, con la menor cantidad de triptófano producida como un subproducto.

Además, hubo un beneficio de 2-3 veces de tener la enzima descarboxilasa añadida. La enzima aspC de E. coli también produjo grandes cantidades de monatina en comparación con las demás aminotransferasas . La producción de monatina fue incrementada al: 1) añadir periódicamente adiciones de 2 mM de indol-piruvato, piruvato y aspartato (cada media hora a una hora) , 2) llevar a cabo las reacciones en un ambiente anaeróbico o con reguladores de pH desgasificados, 3) permitir que las reacciones procedieran durante la noche y 4) usar descarboxilasa recién preparada que no había sido congelada-descongelada varias veces . La descarboxilasa fue inhibida por concentraciones de piruvato de más de 12 mM. A concentraciones de indol-3-piruvato más altas que 4 mM, se aceleraron las reacciones secundarias con indol-3-piruvato . La cantidad de indol-3 -piruvato usada en la reacción puede ser incrementada si la cantidad de aldolasa también fue incrementada. Niveles altos de fosfato (50 mM) y aspartato (50 mM) se encontró que eran inhibidores para la enzima descarboxilasa. La cantidad de enzima descarboxilasa añadida pudo ser reducida a 0.5 U/mL sin reducción en la producción de monatina en una reacción de una hora. La cantidad de monatina producida se incrementó cuando la temperatura se elevó de 26°C a 30°C y de 30°C a 37°C; sin embargo, a 37°C las reacciones secundarias de indol-3 -piruvato también fueron aceleradas . La cantidad de monatina producida se incrementó al incrementar el pH de 7 a 7.3, y fue relativamente estable de pH 7.3 a 8.3. Una reacción típica iniciando con triptófano incluía (concentraciones finales) 50 mM de Tris-Cl pH 7.3, 20 mM de triptófano, 6 mM de aspartato, 63 mM de piruvato de sodio, 0.05 mM de PLP, 3 mM de fosfato de potasio, 3 mM de MgCl2, 25 µ9/?t??_? de aminotransferasa, 50 µg/plL de aldolasa proA de C. testosteroni y 4 unidades/mL de descarboxilasa, 5-200 mU/mL de L-aminoácido oxidasa (Sigma A-2805) , 168 U/mL de catalasa (Sigma C-3515) y 0.008 mg de FAD. Las reacciones se llevaron a cabo durante 30 minutos a 30°C. Se observó una mejora con la adición de descarboxilasa. La cantidad más grande de monatina se produjo cuando se añadieron 50 mU/mL de oxidasa. Las mejoras fueron similares a aquellas observadas cuando se usó indol-3 -piruvato como el substrato. Además, la cantidad de monatina producida se incrementó cuando 1) el nivel de triptófano era bajo (es decir, de bajo de la ¾ de la enzima aminotransferasa y por lo tanto incapaz de competir con MP en el sitio activo) y 2) la relación de oxidasa a aldolasa y aminotransferasa se mantuvo a un nivel tal que no se pudo acumular indol-3-piruvato . Cuando se inicio ya sea con indol-3-piruvato o triptófano, la cantidad de monatina producida en los ensayos con tiempos de incubación de 1-2 horas se incrementó cuando 2-4 veces las cantidades de todas las enzimas se usaron mientras se mantenía la misma relación de enzimas. Usando cualquier substrato, concentraciones de aproximadamente 1 mg/mL de monatinas se lograron. La cantidad de triptófano producida si se iniciaba a partir de indol-piruvato era típicamente de menos de 20% de la cantidad de producto, lo cual muestra el beneficio de utilizar reacciones copuladas. Con la optimización y control adicionales de las concentraciones de intermediarios y reacciones secundarias, la productividad y rendimiento pueden mejorarse ampliamente. Reacciones copuladas usando Usina épsilon aminotransferasa (EC 2.6.1.36) Lisina épsilon aminotransferasa (L-lisina 6-transaminasa) se encuentra en varios organismos, incluyendo Rhodococcus, Mycobacterium, Streptomyces, Nocardia, Flavobacterium, Candida utilis y Streptomyces. Se utiliza por los organismos como la primera etapa en la producción de algunos antibióticos de beta-lactama ( ius y Demain, J. Microbiol. Biotech. , 7:95-100, 1997). Esta enzima convierte lisina en L-2-aminoadipato 6-semialdehído (alisina) , por una transaminación mediada por PLP del C-6 de lisina, utilizando alfa-cetoglutarato como el receptor amino. La alisina es inestable y espontáneamente sufre una deshidratación intramolecular para formar ß-carboxilato de 1-piperidina, una molécula cíclica. Esto inhibe efectivamente cualquier reacción inversa que ocurra. El esquema de reacción se ilustra en la figura 12. También se puede usar una enzima alternativa, lisina-piruvato 6-transaminasa (EC. 2.6.1.71). Una reacción típica contenía en 1 mL: 50 mM de Tris-Cl pH 7.3, 20 mM de indol-3-piruvato, 0.05 mM de PLP, 5 mM de fosfato de potasio pH 8, 2-50 mM de piruvato de sodio, 1.5 mM de MgCl2, 50 mM de lisina, 100 µg de aminotransferasa, (lisina épsilon aminotransferasa LAT-101, BioCatalytics Pasaden, CA) y 200 µg de aldolasa proA de C. testosteroni . La cantidad de monatina producida se incrementó con concentraciones más altas de piruvato. La cantidad máxima usando estas condiciones de reacción (a 50 mM de piruvato) fue 10 veces mayor que la que se observó con reacciones copuladas usando oxaloacetato descarboxilasa (aproximadamente 0.1 mg/mL) . Un pico con [M + H] + = 293 eluyó en el momento esperado para monatina y el espectro de masas contenía varios de los mismos fragmentos observados con otros proceso enzimáticos . Un segundo pico con la relación correcta masa a carga (293) eluyó ligeramente antes de lo que se observa típicamente para la S,S-monatina producida en el ejemplo 6, y puede indicar la presencia dé otro estéreoisomero de monatina. Se produjo muy poco triptófano por esta enzima. Sin embargo, es probable que cierta actividad en piruvato (produciendo alanina como subproducto) . Asimismo, se sabe que al enzima es inestable. Pueden hacerse mejoras al llevar a cabo experimentos de evolución dirigidos para incrementar la estabilidad, reducir la actividad con piruvato e incrementar la actividad con MP. Estas reacciones también pueden ser acopladas a L-aminoácido oxidasa/catalasa como se describió arriba. Otras reacciones copuladas Otra reacción de copulación que puede mejorar el rendimiento de monatina a partir de triptófano o indol-3-piruvato se muestra en la figura 13. Formiato deshidrogenasa (EC 1.2.1.2 ó 1.2.1.43) es una enzima común. Algunas formiato deshidrogenasa requieren NADH mientras que otras pueden utilizar NADPH. La glutamato deshidrogenasa catalizó la interconversión entre el precursor de monatina y monatina en . ejemplos previos, usando reguladores de pH a base de amonio. La presencia de formiato de amonio y formiato deshidrogenasa es un sistema eficiente para la regeneración de cofactores, y la producción de dióxido de carbono es una forma eficiente para reducir la velocidad de la reacciones inversas (Bommarius et al., Biocatalysis 10:37, 1994 y Galkin et al., Appl. Environ. Microblol. 63:4651-6, 1997). Además, grandes cantidades de formiato de amonio pueden disolverse en el regulador de pH de reacción. El rendimiento de monatina producida por reacciones de glutamato deshidrogenasa (o aminaciones reductoras similares) puede ser mejorado por la adición de formiato deshidrogenasa y formiato de amonio.

Pueden usarse otros procesos para conducir el equilibrio hacia la producción de monatina. Por ejemplo, si se utiliza aminopropano como el donador de aminoácidos en la conversión de MP en monatina con una aminotransferasa de aminoácido omega (EC 2.6.1.18) tal como aquellos descritos en las patentes de E.U.A. Nos. 5,360,724 y 5,300,437, uno de los productos resultantes podría ser acetona, un producto más volátil que el substrato aminopropano. La temperatura puede ser elevada periódicamente durante periodos cortos para vaporizar la acetona, aliviando así el equilibrio. La acetona tiene un punto de ebullición de 47°C, una temperatura que probablemente no degrade los intermediarios si se usa durante cortos periodos de tiempo. La mayoría de las aminotransferasas que tienen actividad en alfa-cetoglutarato también tienen actividad en el precursor de monatina. De manera similar, si se usa una glioxilato/aminotransferasa de ácido aromático (EC 2.6.1.60) con glicina como el donador amino, se produce glioxilato el cual _ es relativamente inestable y tiene un punto de ebullición altamente reducido en comparación con glicina. Ej emplo 14 Se prepara una composición de goma de mascar con sabor fresa usando los ingredientes listados en la tabla 6. El estereoisomero R,R de monatina puede ser sustituido por acesulfame K y el estereoisomero S,S de monatina.

Tabla 6 Ingrediente % (en peso) Base para goma 20 Glicerina 3 Glucosa 8 Lecitina 0.5 Saborizante de fresa 1 Colorante rojo 0.07 Azúcar 47.13 Relleno de inulina o polidextrina 19.65 Acesulfame K 0.15 S,S monatina 0.5 Total 100.00 La base para goma es 30% de resina de terpeno, 15% de aceite de semilla de algodón hidrogenado, 2% de lecitina, 2.5% de poliisiobutileno, 27% de acetato de polivinilo, 12.45% de carbonato de calcio, 11% de copolímero de isobutileno-isopreno y 0.05% de BHT. La base para goma es precalentada, añadida a un mezclador de hojas sigma y se mezcla hasta hacerla suave y plegable. Una solución de sorbitol y glicerina se calienta a 50°C y se añade al mezclador junto con los ingredientes restantes. Después de que se completa el mezclado, la goma es laminada hasta un espesor de 1.5 mM de grosor, empolvada con talco, cortada y envuelta. Se espera que el sabor de fresa sea menos ocultado y que la dulzura dure más en esta composición de goma de mascar que contiene monatina, en comparación con varias composiciones de goma de- mascar similares que contienen edulcorantes de alta intensidad que no son monatina.

Ejemplo 15 Formulaciones de goma de mascar que comprenden monatina y método para hacer las mismas Abajo hay varias formulaciones ejemplares de composiciones de goma de mascar que comprenden monatina, así como un método ejemplar para procesar las composiciones. Formulación A 200g de base para goma 340g de polvo de sorbitol (Cerestar P16616) 7g de greda 3.6g de jarabe de maltitol (Cerestar 16303 concentrado a 80 brix) 2g de mentol 1.5 g de S,S monatina Formulación B 200g de base para goma 340g de polvo de sorbitol (Cerestar P16616) 7g de greda 3.6g de jarabe de maltitol (Cerestarl6303 concentrado a 80 brix) 2g de mentol 0.05 g de R,R monatina Formulación C 200g de base para goma 340g de polvo de sorbitol (Cerestar P16616) 7g de greda 3.6g de jarabe de maltitol (Cerestar 16303 concentrado ) 2g de mentol 0.038 g de S,S monatina 0.038 g de R,R monatina Formulación D 320g de base para goma 400g de polvo de sorbitol (Cerestar P16616) lOOg de jarabe de maltitol (Cerestar 16303) 40g de manitol (Cerestar 16700) 10 g de isomalt 14g de mentol 18g de sabor menta lg de S,S monatina lg de acesulfame K 0.075 g de R,R monatina Formulación E 200g de base para goma " 400g de sorbitol (cristalino) 46g de jarabe de maltitol (80% ds) añadir 2% de saborizante de cereza + 0.02% de R,R monatina Formulación F 211 g de base para goma libre de azúcar 42Og de sorbitol 14g de glicerol añadir 2% de saborizante + 0.2% de S,S monatina + 0.015% de R,R monatina Formulación G 270g de base para goma 340g de sorbitol 34g de jarabe de sorbitol (70% ds) añadir 2% de saborizante + 0.15% de S,S monatina + 0.05% R,R monatina Formulación H 300 g de base para goma 550 g de eritritol 100 g de jarabe de maltitol 49.5 g de glicerina 0.5 g de S , S monatina Cómo se procesa la goma La base para goma se procesa por medio de extrusión y se coloca en un baño de agua para enfriar y solidificar. Gránulos de aproximadamente ¾ cm por ¾ cm se almacenan hasta su uso adicional. Los gránulos se mezclan usando un mezclador en Z (alto esfuerzo cortante) , y se alcanzan temperaturas de hasta 60 °C, ablandando la mezcla. Se añade talco si no está ya en la base para goma. El edulcorante cristalino (por ejemplo, sorbitol) y el suavizante/platificante (por ejemplo, sorbitol líquido, maltitol liquido o glicerol) se añaden por etapas de una forma alternante mientras se mezcla, para evitar que el motor del mezclador se sobrecaliente. Saborizantes, colorantes y edulcorantes se añaden y se mezclan. La mezcla se retira del mezclador, un tamaño intermitente típico es de varios cientos de kilogramos. La mezcla se empuja a través de un extrusor que homogeneiza y configura el chicle. Las hojas son aplanadas y cortadas y las piezas se empacan para goma en tableta o se recubren para gomas granuladas. Ejemplo 16 Formulación y método para hacer goma de mascar libre de azúcar Una formulación de ejemplo: Procedimiento de preparación ejemplar 1. Precalentar la base para goma en el microondas, luego añadir al mezclador en Z y mezclar hasta que sea suave y plegable . 2. Calentar la solución de sorbitol y glicerina en el microondas a 50 °C. 3. Añadir todos los ingredientes restantes a las cuchillas en Z. Mezclar durante 20 minutos, revisar la temperatura de la mezcla cada 5 minutos. 4. Después de que se complete el mezclado retirar la goma del mezclador y laminarla hasta un espesor de 1.5 mm. Empolvar con talco, cortar y envolver. Ejemplo 17 Evaluación de la monatina Las formulaciones de monatina, incluyendo R,R monatina o combinaciones de R,R monatina/eritritol , se evaluaron en relación a otros edulcorantes conocidos (aspartame y sucralosa) en té helado. Los parámetros sensoriales clave evaluados incluyeron la calidad de la dulzura, sabor posterior, sabor amargo y su sabor posterior. La evaluación cualitativa se ha llevado a cabo. Formulaciones de producto -- té helado Una formulación de té helado se desarrolló para evaluar el rendimiento del edulcorante (tabla 7) .

Tabla 7 Formulación de té helado Los edulcorantes se añadieron guientes concentraciones: Aspartame 0.0450% (p/v) Sucralosa 0.0170% (p/v) R,R monatina 0.0030, 0.0035, 0.0040% (p/v) más 1 g de maltodextrina S,S monatina 0.0030, 0.0035, 0.0040% (p/v) más 1 g de eritritol Evaluación sensorial La evaluación de bebidas de té helado" se llevó cabo por un panel (n = 6) de evaluadores de sentido experimentados . Los resultados de estas evaluaciones s resumen en la tabla 8.

Tabla 8 Evaluación sensorial de té (tamaño de porción 200 mL) Discusión La monatina desarrolló beneficios de rendimiento inesperados, incluyendo claros beneficios sensoriales, en las formulaciones edulcorantes. En té helado, y particularmente té ácido acidificado (es decir, con limón) la monatina incrementó los Indices de sabor de limón. Este beneficio fue incrementado más a través de la adición de bajas concentraciones de eritritol, las cuales fueron capaces de equilibrar y redondear el sabor y de acelerar los tiempos de inicio de dulzura. En bebidas, tales como té, la monatina desarrolló propiedades sensoriales mejoradas (por ejemplo, menos sabor posterior, menos sabor desagradable) , y/o mejoró la solubilidad y las características de solubilidad y estabilidad. La monatina usada para endulzar té helado contiene casi 0 calorías, en comparación con 32 calorías en 2 cucharaditas (aproximadamente 8 g) de sucrosa usada para endulzar té helado. Se espera que en las composiciones de goma de mascar, como en las bebidas, la monatina exhiba el incremento de los sabores cítricos, así como también proporcione un perfil tiempo/intensidad más favorable para dulzura, en comparación con aspartame o sucralosa. Se espera además que en las composiciones de goma de mascar, una mezcla de monatina y eritritol incremente más los sabores cítricos y proporcione perfiles de dulzura más favorables en comparación con aspartame o sucralosa.

Ejemplo 18 Evaluación de monatina en goma de mascar Introducción Gomas de mascar endulzadas individualmente con monatina, aspartame y sucralosa se prepararon en formato de chicle de sabor menta. Las gomas se prepararon para ser iso-dulces y se evaluaron para calidad de sabor dulce e intensidad de tiempo del suministro de dulzura. Formulaciones de goma y fabricación Las formulaciones usadas en esta evaluación se presentan en la tabla 9. Un método de fabricación estándar se adoptó para las tres formulaciones de goma, como se describe. Tabla 9 Formulaciones de goma de mascar Ingrediente Goma de APM Goma de sucralosa Goma de monatina (%; P/P) (R,R) Polvo de 55.6 55.7 55.86 sorbitol: P60 Base para goma 24.5 24.5 24.5 libre de azúcar : Valencia T Jarabe de 16.1 16.1 16.1 licasina (80/55) Glicerol 2.8 2.8 2.8 Saborizante de 0.7 0.7 0.7 menta: 11762- 34 (Givaudan) Aspartame 0.3 Sucralosa 0.2 Monatina (R, R) 0.04 El método de fabricación de goma fue como sigue: • precalentar la base para goma a 40-45°C y luego añadir a un mezclador con hojas en Z y mezclar ·. Tamizar el polvo de sorbitol · Remover una porción del sorbitol, dispersar edulcorante en esa porción y mezclar cuidadosamente • Regresar la mezcla de edulcorante/sorbitol a la cantidad restante de polvo de sorbitol y mezclar cuidadosamente · Mezclar licasina y glicerol en un tazón y precalentar a 50°C. • Añadir polvo de sorbitol al mezclador de cuchillas en Z que contiene la base para goma • Añadir licasina/glicerol y saborizante a la mezcladora de cuchillas en Z y mezclar durante 20 minutos. • Remover goma del mezclador de cuchillas en Z • Laminar hasta un espesor de 1.5mm usando un rodillo mecánico • Empolvar con talco en la relación de 3g de talco a 100 g de goma • Cortar en tabletas que midan 19mm x 73mm • Envolver tabletas individuales en papel aluminio Evaluación sensorial Las composiciones de goma de mascar fueron evaluadas por un panel de evaluadores de sentidos entrenados (n = 4) , todos muy experimentados en la evaluación sensorial formal de gomas de mascar, incluyendo una evaluación para parámetros de tiempo/intesidad. Las características cualitativas y temporales del sabor y dulzura de la goma se evaluaro . Los resultados de las evaluaciones se presentan en la tabla 10. En estas evaluaciones, la monatina suministró claros beneficios sensoriales a las composiciones de goma de mascar, en donde un equilibrio claro entre dulzura y sabor permitió que ambas fueran percibidas hasta una ventaja sensorial máxima. El perfil de tiempo/intensidad para dulzura por monatina también fue muy claramente superior al de aspartame o sucralosa. La dulzura se percibió durante un tiempo significativamente más largo cuando se consumió la goma endulzada con monatina.

Tabla 10 Evaluación sensorial de gomas de mascar Tiempo Goma de mascar endulzada Goma de mascar endulzada con Goma de mascar endulzada (Hasta) con aspartame sucralosa con monatina 30 Dulzura detectada después de Dulzura inmediata al alcanzar la Lento inicio de dulzura, segundos 25 segundos, lenta lengua la goma pero el sabor tarda detectado después de 25 5 acumulación de dulzura. más en ser liberado. segundos. 2 minutos Buen nivel de dulzura en 2 Alto nivel de dulzura al minuto. Acumulación de dulzura a los 50 minutos pero el sabor es Dulzura bastante raro después de 1 segundos. superado por la dulzura. minuto 50 segundos. Después de 1 minuto la dulzura y sabor se acumulan juntos sin que ninguno supere al otro. A los 2 minutos la dulzura ha alcanzado una buena intensidad sin ser intensa. 6 minutos Dulzura leve (2 minutos 30 La dulzura supera al sabor en 2 Después de 3 minutos la dulzura segundos). La dulzura alcanzó minutos 30 segundos. empieza a caer lentamente. 10 un pico a los 3 minutos. Nivel La dulzura alcanzó un pico a los 3 Aún buenos niveles de sabor y bajo de sabor y dulzura en 4 minutos y 20 segundos e inicia a dulzura permaneciendo después minutos. caer bastante rápido. de 4 minutos y 40 segundos. Se mastica muy poca dulzura Muy poca dulzura permaneciendo o sabor después de 5 minutos. después de 4 minutos 40 segundos. 10 minutos La goma es blanda a los 8 No hay dulzura o sabor siendo No se mastica demasiada dulzura minutos y sólo una dulzura y masticados a los 8 minutos 20 después de 6 minutos 30 sabor residual permanecen en segundos. segundos pero aún es aceptable. la boca. A los 9 minutos 40 segundos el A los nueve minutos la goma es sabor amargo de la base para goma bastante blanda pero la dulzura y puede detectarse. el sabor permanecen aún en la boca. 15 Todos Un inicio muy lento de Un inicio y decaimiento muy rápido Lento inicio y acumulación de dulzura pero se acumula y de la dulzura deja el sabor de la dulzura que no parece superar el supera el sabor. Blando y no base para goma al final. La dulzura sabor. Lenta reducción de la dulce al final del masticado. fue bastante intensa en naturaleza y dulzura que dura más que el tendió a superar el sabor. aspartame p sucralosa.

Ejemplo 19 Curva de respuesta a dosis de dulzura de monatina y sacarina La dulzura de monatina y sacarina se evaluó usando 20 evaluadores sensoriales entrenados, haciendo juicios por duplicado . Soluciones de prueba y referencia se prepararon en regulador de pH cítrico/citrato a pH 3.2. Véase figura 16. La respuesta más lineal de R,R/S,S monatina, en comparación con sacarina, es consistente con el suministro de un carácter de sabor tipo azúcar más. La planicie por arriba de 10% SEV indica ausencia/niveles bajos de "sabores suaves y sabores posteriores de supresión de mezcla" . La forma de la curva de respuesta a dosis de monatina es similar a la de aspartame, sucralosa y alitame, todos los cuales son edulcorantes de "calidad" . Con R,R/S,S monatina como el único edulcorante en el sistema modelo (pH 3.2), se observaron las siguientes características: (1) lento retraso en el inicio del sabor dulce; (2) se decae el sabor dulce bastante rápido; (3) ligero sabor posterior "tipo aspartame" , ligero sabor posterior dulce, sin amargura en sabor posterior y (4) sensación de enfriamiento residual en sistemas no saborizados. Ej emplo 2Q Estabilidad de monatina a pH 3 con temperaturas cada vez más altas Una muestra de monatina sintética se sometió a pH 3 temperaturas de 25°C, 50°C y 100°C. A temperatura ambiente y H 3, una pérdida de 14% en monatina se observó sobre un periodo de 48 horas. Esta pérdida se atribuyó a la formación de lactona. A 50°C y H 3, se observó una pérdida de 23% en monatina durante un periodo de 48 horas. Esta pérdida se atribuyó a la formación de lactona y a la acumulación de un compuesto desconocido después de aproximadamente 15.5 minutos. A 100°C y pH 3 , casi toda la monatina se había perdido después de 24 horas. El principal componente detectable fue desconocido a 15.5 minutos. Ejemplo 21 Estabilidad sensorial de monatina y aspartame a pH 2.5, 3.0, 4.0 a 40°C La estabilidad sensorial de las soluciones de monatina preparadas a pH 2.5, 3.0 y 4.0 y almacenadas a 40°C se monitoreó durante 100 días. La pérdida de dulzura a partir de estas soluciones se comparó con las pérdidas de dulzura de soluciones de aspartame y almacenadas bajo condiciones idénticas . La estabilidad sensorial de monatina (8% SEV, alrededor de 55 ppm, mezcla sintética que contenía aproximadamente 96% del par enantiomérico 2R,4R/2S,4S y 4% del par enantiomérico 2R,4S/2S,4R) en reguladores de pH de fosfato/citrato que tenían un pH de 2.5, 3.0 y 4.0 se examinó después del almacenamiento a 40 °C. La estabilidad de la monatina se comparó con la del aspartame (400 ppm) en los mismos reguladores de pH. Tres soluciones de referencia de sacarosa se prepararon en los mismos reguladores de pH de fosfato/citrato como las soluciones de monatina y aspartame. Todas las soluciones preparadas se almacenaron en la oscuridad. Composiciones reguladoras de pH: pH 2.5 ácido fosfórico (solución al 75%) 0.127% (p/v) Citrato trisódico monohidratado 0.005% (p/v) pH 3.0 ácido fosfórico (solución al 75%) 0.092% (p/v) Citrato trisódico monohidratado 0.031% (p/v) pH 4.0 ácido fosfórico (solución al 75%) 0.071% (p/v) Citrato trisódico monohidratado 0.047% (p/v) La dulzura de cada edulcorante en relación con sucrosa se evaluó por duplicado por un panel (n = 8) de evaluadores sensoriales entrenados experimentados en el procedimiento de cálculo de dulzura. Todas las muestras (en los mismos reguladores de pH) se sirvieron por duplicado a una temperatura de 22 °C ± 1°C. Soluciones de monatina (prueba) , codificadas con códigos de números aleatorios de 3 dígitos se presentaron individualmente a los panelistas, en orden aleatorio. Las normas de referencia de sucrosa que variaban de 4.0-10.0% (p/v) de sucrosa, se incrementaban por etapas de 0.5% (p/v) de sucrosa también se proporcionaron. Se pidió a los panelistas calcular la dulzura al comparar la dulzura de la solución de prueba con los parámetros de sucrosa. Esto se llevó a cabo al tomar tres sorbos de la solución de prueba, seguidos por un sorbo de agua, seguidos por tres sorbos de norma de sucrosa, seguidos por un sorbo de agua, etc. Se alentó a los panelistas a calcular la dulzura a un lugar décimo, por ejemplo, 6.8, 8.5. Un periodo de descanso de cinco minutos se impuso entre la evaluación de las soluciones de prueba. Se pidió también a los panelistas enjuagarse bien y comer una galleta para reducir cualquier efecto potencial . Las tablas 11 y 12 presentan los resultados de los estudios de estabilidad en los reguladores de pH de citrato y fosfato. A cada pH después de un almacenamiento de 100 dias a 40°C en la oscuridad, la retención porcentual de dulzura de monatina fue mayor que la retenida con aspartame. A un pH de 4.0, la pérdida de edulcorantes de la solución de monatina pareció casi haberse estabilizado toda vez que había muy poco cambio en la intensidad de dulzura medida entre los días 17 y 100, mientras que la solución de aspartame continuó perdiendo dulzura. Tabla 11 Estabilidad sensorial de monatina; dulzura después de 100 dias de almacenamiento a 40°C A. PH Tiempo Monatina Retención de Aspartame Retención (dias) SEV dulzura SEV (% de de dulzura (% de de monatina (%) sucrosa) de sucrosa) aspartame (%) 2.5 0 7.35 7.34 1 6.86 93.3 6.90 94.0 2 6.70 91.2 6.80 92.6 3 6.50 88.4. 6.60 89.9 4 6.26 85.2 6.29 85.7 7 6.08 82.7 6.01 81.9 8 5.98 81.4 52.98 81.5 9 5.89 80.1 5.97 81.3 11 5.78 78.6 5.86 79.8 50 4.61 · 62.7 4.19 57.1 100 2.10 · 28.6 0.80 10.9 B. c. pH Tiempo Monatina Retención de Aspartame Retención (dias) SEV dulzura SEV (% de de dulzura (% de de monatina (%) sucrosa) de sucrosa) aspartame (%) .0 0 7.40 7.10 3 7.08 95.7 6.75 95.1 8 6.42 86.8 6.23 87.8 11 6.36 85.9 6.02 84.8 17 6.10 82.4 5.75 81.0 24 6.25 84.5 5.85 82.4 50 6.14 82.9 5.29 74.5 100 5.80 78.4 4.10 57.7 Tabla 12 Estabilidad; cantidad de dulzura que permanece después de 100 días de almacenamiento a un pH indicado a 40 "C Los reguladores de pH respectivos fueron efectivos para mantener el pH; como se mostró en la tabla 13.

Tabla 13 Si se asume una reacción de degradación de pseudo-primer orden, una gráfica de porcentaje logn de retención contra tiempo (logn % RTN v.t) permite el cálculo de la vida media (t ¾) y constante de velocidad (k) de pérdida de dulzura bajo cualquier conjunto de condiciones dado. Al hacer esto, la cinética de la pérdida de dulzura de monatina y aspartame puede resumirse como sigue en la tabla 14. Tabla 14 A cada pH y después de 100 días de almacenamiento a 40°C, la retención porcentual de dulzura de monatina es mayor que la retenida de aspartame. A un pH de 4.0, la pérdida de ..dulzura de la solución de monatina parece haberse casi estabilizado toda vez que ha habido muy poco cambio en la intensidad de dulzura medida entre los días 17 y 100, mientras que la solución de aspartame continua perdiendo dulzura . Los cálculos de la vida media de monatina y aspartame indican que la dulzura suministrada por la monatina se pierde a una velocidad más lenta que la del aspartame. Los cálculos de vida media para la dulzura de monatina a pH 2.5, 3.0 y 4.0 fueron de 65 días, 115 días y 230 días, respectivamente. Los cálculos de vida media de aspartame fueron de 55 días, 75 días y 140 días bajo las mismas condiciones.

Así, bajo condiciones acidas y almacenamiento a 40 °C, la monatina suministra una dulzura más estable que el aspartame . Ejemplo 22 Cromatografía de estereoisomeros de monatina Preparación de muestras - aproximadamente 50-75 µg de material liofilizado se colocaron en un tubo microcentrlfugo . A esto se le añadieron 1.0 mL de metanol grado HPLC. La solución se sometió a vórtice durante 30 minutos, se centrifugó y se removió una alícuota del sobrenadante para su análisis. HPLC de fase inversa ' - cromatografía de dos picos de diastereómero distintos (R,R/S,S y R,S/S,R) se logró usando una columna para HPLC 2.1 x 250mm Xterra™ MS C8 de 5 µ?a ( aters Corporation) . La detección se llevó a cabo usando un espectrómetro de masas de cuatro polos triple Ultima™ de Micromass La fase móvil se suministró por el siguiente gradiente Tiempo (min) 0 9 16 20 21 0.05% de TFA A% 95 65 10 10 95 Metanol, 0.05% de TFA B% 5 35 90 90 5 Flujo mL/min 0.25 0.25 0.25 0. 25 0.25 HPLC quiral - Cromatografía de dos estereoisomeros de monatina distintos (R,R y S,S) se logró usando una columna para HPLC de 250 x 436mm Chirobiotic T (Advanced Separations Technologies, Inc.) . La detección se llevó a cabo usando un espectrómetro de masas de cuatro polos triple Ultima™ de Micromass. La fase móvil consistía en metanol con 0.2% de ácido acético y 0.05% de hidróxido de amonio. Espectrometría de masas (MS/MS) - La presencia de monatina se detectó por un experimento de monitoreo de reacción seleccionado (SRM) . El ion molecular protonado de monatina ( [M + H]+) tiene una m/z = 293.3. La fragmentación de este ion molecular produce un ion significativo a m/z = 257.3 que se origina a partir de varias deshidrataciones del ion molecular. Esta transición ha mostrado ser muy especifica para la monatina y se seleccionó como la transición (293.3 a 257.3) para el monitoreo durante el experimento SRM. Este método de detección se empleó tanto para las separaciones de fase inversa como quirales de monatina . Resultados - Las muestras estándares de R,S/S,R y S,S/R,R fueron evaluadas bajo HPLC de fase inversa. Las muestras se prepararon mediante la derivación y resolución enzimática. Los cromatogramas para las soluciones estándares se despliegan en la figura 17. Después del análisis de fase inversa, se llevó a cabo la cromatografía quiral para evaluar los estereoisómeros específicos presentes en las muestras. La cromatografía quiral de las soluciones de monatina de norma S,S y R,R se despliegan en la figura 18.

Ejemplo 23 Estabilidad de monatina a alta temperatura (80 °C) y pH neutro Una solución de 100 mL de 75 ppm de monatina a pH 7 se usó como una solución de abastecimiento . La muestra de monatina sintética contenía alrededor de 96% del par enantiomérico 2R, 4R/2S , 4S y 4% del par enantiomérico 2R, 4S/2 S , 4R . Las muestras se incubaron a 80 °C y pH 7 durante la duración del experimento y las muestras se retiraron después de 0, 1, 2 , 3, 4 horas y 1, 2 , 4, 7 , 14, 21 y 35 días . Todas las condiciones experimentales se llevaron a cabo por duplicado. Separación y cuantif icacion usando cromatografía de fase inversa LC-MS - Se estableció una curva de respuesta para ambos picos diastereoméricos detectados de la monatina sintética. Una escala de 5-150 ppm se puso entre corchetes con el parámetro de monatina sintético disuelto en agua desionizada. La separación de los dos picos diastereoméricos se logró usando una columna para HPLC Novapak C18 (Waters Corporation) de 3.9 x 150mm. Detectores visibles a luz ultravioleta (UV) y espectrómetros de masas (MS) se usaron en serie para la detección y cuantif icacion . La monatina y su pico de lactona tienen cada una, una UVnex a 279 nm que ayudó a una detección precisa. La cuantif icacion se hizo al adquirir un escudriñamiento de monitoreo iónico seleccionado (SIM) de 293 .3 m/z y 275.3 m/z en el modo de electroaspersión de iones positivos . Resultados - A un pH neutro , el grado de degradación de la monatina se determinó que era insignificante incluso después de 7-35 días. La desaparición de la monatina con el tiempo es altamente dependiente del pH toda vez que los subproductos primarios son ciclización y posiblemente mucho niveles pequeños de racemización. Durante el experimento 80°C y pH 7, no se detectó cambio alguno en la concentración de monatina RR/SS racémica o lactonas de la misma dentro de los límites de precisión proporcionados mediante el uso de LC-MS para la cuantificación. Debido a la estabilidad térmica de la monatina a pH neutro, se espera que la monatina tenga una estabilidad adecuada para las temperaturas de procesamiento de goma, y tenga una vida en mostrador más larga en composiciones de goma de mascar, en comparación con otros edulcorantes de alta intensidad, tales como aspartame. En vista de las muchas modalidades posibles a las cuales los principios de esta descripción pueden aplicarse, se debe reconocer que las modalidades ilustradas son sólo ejemplos particulares de la descripción y no se deben tomar como una limitación del alcance de la descripción. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Una composición de goma de mascar que comprende una porción de base para goma y una porción soluble, caracterizada porque la porción soluble comprende monatina o sal de la misma. 2. La composición de goma de mascar de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque una cantidad de la composición contiene menos calorías y carbohidratos que la misma cantidad de la composición de goma de mascar que contiene sucrosa en lugar de la monatina o sal de la misma. 3. Una composición de goma de mascar que comprende monatina o sal de la misma, caracterizada porque la monatina o sal de la misma está presente en una cantidad que proporciona una dulzura extendida y sabor no enmascarado o incrementado, en comparación con otros edulcorantes de alta intensidad sustiuidos por monatina o sal de la misma en la composición de goma de mascar. 4. La composición de goma de mascar de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque los otros edulcorantes de alta intensidad se seleccionan de aspartame y sucralosa . 5. Un método para hacer una composición de goma de mascar endulzada con monatina que tiene dulzura a largo plazo incrementada proporcionada por monatina o sal de la misma, caracterizado porque comprende las etapas de: (a) producir monatina o sal de la misma a través de una vía biosintética; (b) combinar monatina o sal de la misma con otros ingredientes y (c) formar la composición de goma de mascar. G. Una composición de goma de mascar que comprende monatina o sal de la misma, caracterizada porque la monatina o sal de la misma está presente en una cantidad que proporciona una dulzura a largo plazo incrementada. · 7. La composición de goma de mascar de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la monatina o sal de la misma está presente en una cantidad que proporciona una dulzura prolongada en comparación con aspartame o sucralosa . 8. La composición de goma de mascar de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la porción soluble comprende además un saborizante cítrico. 9. La composición de goma de mascar de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la porción soluble comprende además un saborizante cítrico, y en donde la monatina o sal de la misma está presente en una cantidad que incrementa el sabor proporcionado por el saborizante cítrico . 10. La composición de goma de mascar de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la composición comprende alrededor de 0.001 a aproximadamente 1.1% en peso de monatina o sal de la misma. 11. La composición de goma de mascar de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porque la composición está sustancialmente libre de S,S monatina o sal de la misma. 12. La composición de goma de mascar de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porque la composición está sustancialmente libre de R,R monatina o sal de la misma. 13. La composición de goma de mascar de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la composición comprende alrededor de 0.009 a aproximadamente 0.1% en peso de R,R monatina o sal de la misma. 14. La composición de goma de mascar de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque la composición comprende alrededor de 0.015 a aproximadamente 0.025% en peso de R,R monatina o sal de la misma. 15. La composición de goma de mascar de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la composición comprende alrededor de 0.1 a aproximadamente 1.1% en peso de S,S monatina o sal de la misma. 16. La composición de goma de mascar de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque la composición comprende alrededor de 0.15 a aproximadamente 0.88% en peso de S,S monatina o sal de la misma. 17. La composición de goma de mascar de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la composición comprende alrededor de 0 a aproximadamente 1.1% en peso de S,S monatina o sal de la misma y alrededor de 0 a aproximadamente 0.1% en peso de R,R monatina o sal de la misma.