CN1852661A - 含有莫那甜的口香糖组合物及其制造方法 - Google Patents

含有莫那甜的口香糖组合物及其制造方法 Download PDF

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Abstract

本发明描述了含有天然高强度甜味剂莫那甜的一种或多种立体异构体的口香糖组合物。

Description

含有莫那甜的口香糖组合物及其制造方法
相关申请的交叉参考
本申请要求2003年8月14日提交的美国临时专利申请60/495,191的权益，该申请全文纳入引为参考。
                        技术领域
本发明涉及含有莫那甜(monatin)的新型口香糖组合物及其制造方法，该组合物包括功能性香口胶和泡泡糖。本发明也涉及含有莫那甜的特定立体异构体、莫那甜立体异构体的特定混合物和/或通过生物合成途径在体内(例如胞内)或体外产生的莫那甜的口香糖组合物。
                        背景技术
由于对儿童肥胖、II型糖尿病及相关疾病的关注，无卡路里高强度甜味剂的使用增加了。因此，需要具有甜味显著高于常规甜味剂，例如砂糖(蔗糖)的甜味剂。许多高强度甜味剂具有不合意的臭味和/或未预料到的和差强人意的甜味特征。为克服这些问题，该行业不停进行着苦味抑制剂、臭味掩盖技术和甜味剂混合物的研究以实现类似于蔗糖的甜味特征。
莫那甜(2-羟基-2-(吲哚-3-基甲基)-4-氨基戊二酸)是分离自在南非的德兰氏瓦省(Transvaal)地区发现的植物Sclerochiton ilicifolius的天然高强度甜味剂。在等甜度时，与蔗糖或其它营养性甜味剂不同，莫那甜不含碳水化合物或糖类且几乎无卡路里。
                        发明概述
本发明涉及含有莫那甜(2-羟基-2-(吲哚-3-基甲基)-4-氨基戊二酸，也称为4-氨基-2-羟基-2-(1H-吲哚-3-基甲基)-戊二酸，或者基于其它编号系统是4-羟基-4-(3-吲哚基甲基)谷氨酸)的口香糖组合物，该化合物如下式所示：
Figure A20048002710300101
莫那甜是天然高强度甜味剂。莫那甜具有四种立体异构体形式：2R，4R(“R，R立体异构体”或“R，R莫那甜”)；2S，4S(“S，S立体异构体”或“S，S莫那甜”)；2R，4S(“R，S立体异构体”或“R，S莫那甜”)和2S，4R(“S，R立体异构体”或“S，R莫那甜”)。除非另有说明，本文使用的“莫那甜”表示莫那甜的所有四种立体异构体以及莫那甜立体异构体的任何组合的任何混合物(例如，莫那甜的R，R和S，S立体异构体的混合物)。
莫那甜具有优良的甜味性能。莫那甜具有与其它已知的高强度甜味剂同样清晰甚至更清晰的味道特征。莫那甜的剂量应答曲线更加线性，因此比其它高强度甜味剂，例如糖精更类似于蔗糖。莫那甜优良的甜味特征使之适合用于口香糖组合物、餐用甜味剂、食物、饮料和其它产品。
莫那甜的各种立体异构体，包括R，R和S，S立体异构体不论以单独成分或以混合物形式均可能应用于甜味剂行业。与其它高强度甜味剂相比，认为莫那甜与莫那甜的立体异构体和其它甜味剂的混合物具有优越的味觉特征和/或物理性能。例如，莫那甜比天冬甜素(也称为“APM”)更稳定，具有比糖精更清爽的味道，并且一种立体异构体(R，R莫那甜)比三氯蔗糖更甜。类似地，莫那甜甜味剂无糖精相关的苦的回味，或其它一些高强度甜味剂相关的金属味、酸味、涩味或喉咙烧灼的回味。此外，莫那甜甜味剂未显示与其它某些天然甜味剂，例如甜菊糖和甘草甜素相关的甘草回味。
此外，与天冬甜素甜味剂不同，莫那甜甜味剂无需警告患苯酮尿的患者具有苯丙氨酸。类似地，由于莫那甜不含可发酵的碳水化合物，预计它不是生龋齿的(即，不促进牙齿腐烂)。也希望当莫那甜与唾液混合时在pH降低测试中测量到不导致pH降低至5.7(对牙齿有害)以下。与其它高强度甜味剂相比，由于其强烈的甜味，R，R立体异构体在经济上特别具有竞争力。
本发明的一个方面是提供含有胶基部分和可溶部分的口香糖组合物，其中可溶部分含有莫那甜，例如R，R、S，S、R，S或S，R莫那甜或各种立体异构体的混合物。在一个实施方案中，胶基部分含有3-50重量％的弹性体；0.5-25重量％的软化剂；2-30重量％的乳化剂；5-75重量％的树脂和0-20重量％的填料。术语“重量％”表示重量百分比。例如，1重量％表示每100克中的1克，或是每1公斤中的10克。在另一个实施方案中，胶基部分可为组合物的15-30重量％。在其它实施方案中，弹性体可选自天然橡胶、天然树胶、生物可降解的树胶、合成的弹性体及其组合。
例如，天然橡胶可选自烟熏乳胶(smoked latex)、液态乳胶和银胶菊。天然和/或生物可降解的树胶可选自，例如节路顿胶、派里罗胶(perillo)、香豆果胶(sorva)、二齿铁线子木胶(massaranduba balata)、巧克力铁线子木胶(massaranduba chocolate)、红檀木胶(nispero)、柔星丁哈胶(rosindinha)、糖胶树胶、古塔胶(gutta hang kang)、阿拉伯半乳聚糖、瓜耳胶、黄原胶和从蛋白质制造的胶，例如谷蛋白和玉米蛋白。术语“天然”表示天然存在或形成的。术语“生物可降解”表示能通过生物方法或试剂，例如活的生物体的作用腐烂或分解。在一些实施方案中，生物可降解的树胶是低粘性或非粘性的。合成的弹性体可选自，例如丁二烯-苯乙烯共聚物、异丁烯-异戊二烯共聚物、聚丁二烯、聚异丁烯和乙烯基聚合弹性体。
在一些实施方案中，软化剂(也称为增塑剂)可含有以下一种或多种：牛油、氢化牛油、氢化植物油、部分氢化植物油、可可脂、单硬脂酸甘油酯、三乙酸甘油酯、卵磷脂、单甘油酯、甘油二酯、甘油三酯、乙酰化单甘油酯、脂肪酸、糖浆，例如多元醇糖浆(如，麦芽糖醇糖浆、甘油糖浆和甘油)和混合多元醇糖浆，及其组合。在其它实施方案中，填料可是以下一种或多种：卵磷脂、菊粉、聚糊精、碳酸钙、碳酸镁、硅酸镁、重质碳酸钙、硅酸铝、滑石粉、粘土、氧化铝、二氧化钛和磷酸钙。在其它实施方案中，乳化剂可是单硬脂酸甘油酯、卵磷脂、聚甘油多聚蓖酸或硬脂酸镁。在其它实施方案中，树脂可是松香酯、萜树脂、乙酸聚乙烯醇纤维、聚乙烯醇、乙烯乙酸乙烯酯或乙酸乙烯酯-月桂酸乙烯酯共聚物。在其它实施方案中，松香酯可是部分氢化松香的甘油酯、聚合松香的甘油酯、部分二聚松香的甘油酯、松香的甘油酯、部分氢化松香的季戊四醇酯、松香的甲酯或部分氢化松香的甲酯。
在一些实施方案中，乳化剂和软化剂、乳化剂和填料、软化剂和填料可是不同的化合物。
在其它实施方案中，可溶性部分还可含有散装(bulk)甜味剂，例如玉米甜味剂、蔗糖、右旋糖、转化糖、糊精、果糖、左旋糖、固体玉米糖浆、半乳糖、海藻糖、异麦芽酮糖或其组合。或者，可溶性部分还可含有高强度甜味剂或低糖碳水化合物(即一种血糖低于蔗糖的碳水化合物)。例如，高强度甜味剂或低糖碳水化合物可选自山梨糖醇(包括无定形和结晶山梨糖醇)、甘露醇、麦芽糖醇、氢化的淀粉水解物、木糖醇、阿力甜(alitame)、索马甜(thaumatin)、三氯蔗糖、天冬甜素、丁磺氨K、二氢查尔酮、糖精、纽甜(neotame)、环己氨基磺酸盐(cyclamate)、甜菊苷、罗汉果甙、塔格糖、赤藓糖、异麦芽糖(isomalt)、乳糖醇、甘草甜素、叶甜素、莫内林、马槟榔甜素(mabinlin)、布那珍(brazzein)、仙茅甜蛋白(curculin)、奇果蛋白(miraculin)和倍他丁(pentadin)。
或者，可溶部分还可含有调味剂。调味剂可以是，例如，香精油或合成调味剂或其组合。香精油可以是，例如，薄荷油、留兰香油或冬青油。调味剂或者可以是，例如，水果(例如橙油、柠檬油、香蕉、樱桃、苹果、菠萝、葡萄、草莓、什锦水果、西瓜或其组合)调味剂。
在某些实施方案中，本发明提供了含有莫那甜的R，R立体异构体、莫那甜的S，S立体异构体和/或莫那甜的立体异构体的混合物的口香糖制品。莫那甜，例如立体异构体的混合物，可以固体(例如，冻干、结晶、无定形和/或粉末)和液体形式提供。在一个实施方案中，口香糖组合物含有的莫那甜或其盐的量能提供与已知口香糖组合物中的蔗糖(和/或其它碳水化合物)提供的甜味相当的甜味。“相当的甜味”表示由有经验的感觉评价人员平均决定的第一种组合物中的甜味在第二种组合物中甜味的80％-120％内。在另一个实施方案中，口香糖组合物含有的莫那甜或其盐的量提供增加的长期甜味。“增加的长期甜味”表示与类似的口香糖组合物中天冬甜素或三氯蔗糖提供甜味的时间相比，增加了提供甜味的时间。
在一个实施方案中，莫那甜的R，R立体异构体约是组合物的0.009-0.1重量％(例如，约是组合物的0.015-0.025重量％)。在另一个实施方案中，莫那甜的S，S立体异构体约是组合物的0.1-1.1重量％(例如，约是组合物的0.15-0.88重量％)。在其它实施方案中，可溶性部分含有莫那甜的S，S立体异构体和丁磺氨K(例如，约0.1-1.1重量％的莫那甜和约0.1-0.3重量％的丁磺氨K)的混合物。在其它实施方案中，莫那甜可单独或与其它物质结合包裹化。
术语“约”包括了发生在任何测量中的实验误差的范围。除非另有说明，所有测量值均假定在其前有该词“约”，即使未明确使用该词“约”。“包裹化”表示封闭或维持于包衣或微囊中，其中，例如微囊保护所封闭的物质，使之通过咀嚼缓慢释放。
在某些实施方案中，可溶性部分还可含有散装甜味剂、高强度甜味剂或低糖碳水化合物和调味剂。在其它实施方案中，可溶性部分可含有莫那甜和环己氨基磺酸盐的混合物。在其它实施方案中，多种甜味剂(包括莫那甜)以及甜味剂(包括莫那甜)/调味剂混合物可包裹化并共同加工和干燥。
在一些实施方案中，口香糖组合物含有基本上由S，S或R，R莫那甜组成的莫那甜。在其它实施方案中，组合物主要含有S，S或R，R莫那甜。“主要”表示就组合物中的莫那甜立体异构体而言，莫那甜含有大于90％的某种立体异构体。在一些实施方案中，组合物基本上不含S，S或R，R莫那甜。“基本上不含”表示就组合物中的莫那甜立体异构体而言，该组合物含有少于2％的某种立体异构体。或者，当用于描述以生物合成途径产生的莫那甜时，“基本上不含”包括作为生物合成途径副产物而产生的立体异构体(例如，S，S莫那甜)的量，所述生物合成途径涉及使用手性-特异性酶(例如，D-氨基酸脱氢酶或D-氨基酸转氨酶)和/或手性特异性物质(例如，在R-立体构型中具有碳的某种物质)来产生各种特异性的立体异构体(例如，R，R莫那甜)。
本发明的另一方面提供了一种含有生物合成途径产生的立体异构富含的莫那甜混合物的口香糖组合物。“立体异构富含的”表示该混合物含有多于一种的莫那甜立体异构体并且混合物中至少60％的莫那甜立体异构体是某种立体异构体，例如R，R，S，S，S，R或R，S。在其它实施方案中，混合物含有大于65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的某种莫那甜立体异构体。在另一个实施方案中，口香糖组合物含有立体异构富含的R，R或S，S莫那甜。“立体异构富含的”R，R莫那甜表示莫那甜含有至少60％的R，R莫那甜。“立体异构富含的”S，S莫那甜表示莫那甜含有至少60％的S，S莫那甜。在其它实施方案中，“立体异构富含的”莫那甜含有大于65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的R，R或S，S莫那甜。
本发明的另一方面提供了一种制造口香糖组合物的方法。该方法包括在体内或体外生物合成产生莫那甜。“生物合成途径”包括至少一步生物转化步骤。在一些实施方案中，生物合成途径是多步骤方法并且至少一步是生物转化步骤。在其它实施方案中，生物合成途径是涉及生物和化学转化步骤的多步骤方法。在一些实施方案中，产生的莫那甜是立体异构富含的莫那甜混合物。
在本发明的另一方面，几种生物合成途径用于从选自以下的物质制造莫那甜：葡萄糖、色氨酸、吲哚-3-乳酸以及吲哚-3-丙酮酸和2-羟基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸(也称为“莫那甜前体、“MP”或莫那甜的α-酮式)。用于产生或制造莫那甜或其中间体的生物合成途径的例子披露于图1-3和图11-13，这些图的方框中显示了可能的中间体产物和终产物。例如，在这些途径中发生一种产物转化为另一种，如葡萄糖转化为色氨酸，色氨酸转化为吲哚-3-丙酮酸，吲哚-3-丙酮酸转化为MP，MP转化为莫那甜，或者吲哚-3-乳酸(吲哚乳酸盐)转化为吲哚-3-丙酮酸(pyruvate)。
可通过化学和/或生物转化来协助这些生物合成途径中的转化。术语“转化”表示在反应中使用化学方法或至少一种多肽来将第一种中间体改变为第二种中间体。转化可在体内或体外发生。术语“化学转化”表示未由多肽活性协助的反应。术语“生物转化”表示由一种或多种多肽协助的反应。当使用生物转化时，多肽和/或细胞可固定在支持物上，例如通过活性连接在聚合支持物上。转化可使用本领域的普通技术人员已知的任何反应器来实现，例如分批或连续反应器。
可用于进行生物转化的多肽及其编码序列的例子示于图1-3和11-13。使得底物特异性和/或多肽活性得以修饰的具有一个或多个点突变的多肽可用于制造莫那甜。表达这种多肽的分离和重组的细胞可用于产生莫那甜。这些细胞可是任何细胞，例如植物、底物、细菌、酵母、藻类、古菌或真菌细胞。
例如，产生莫那甜的细胞可含有一种或多种(例如，两种或多种，或三种或多种)以下活性物质：色氨酸转氨酶(EC 2.6.1.27)、酪氨酸(芳族)转氨酶(EC 2.6.1.5)、色氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.19)、谷氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.2，1.4.1.3，1.4.1.4)、苯丙氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.20)、色氨酸-苯基丙酮酸转氨酶(EC 2.6.1.28)、多底物转氨酶(EC2.6.1.-)、天冬氨酸转氨酶(EC 2.6.1.1)、L-氨基酸氧化酶(EC 1.4.3.2)、色氨酸氧化酶(无EC号，Hadar等，J.Bacteriol 125：1096-1104，1976和Furuya等，Biosci BiotechnolBiochem 64：1486-93，2000)、D-色氨酸转氨酶(Kohiba和Mito，《第8届国际维生素B6和羰基催化研讨会纪要》(Proceedings of the 8th International Symposium onVitamin B6 and Carbonyl Catalysis)，大阪，日本，1990)、D-氨基酸脱氢酶(EC1.4.99.1)、D-氨基酸氧化酶(EC 1.4.3.3)、D-丙氨酸转氨酶(EC 2.6.1.21)、合成酶/裂解酶(EC 4.1.3.-)，例如4-羟基-2-氧代戊二酸醛缩酶(EC 4.1.3.16)或4-羟基-4-甲基-2-酮戊二酸醛缩酶(EC 4.1.3.17)和/或合成酶/裂解酶(4.1.2.-)。
在另一个实施例中，细胞可含有一种或多种(例如，两种或多种，或三种或多种)以下活性物质：吲哚乳酸脱氢酶(EC 1.1.1.110)、R-4-羟基苯基乳酸脱氢酶(EC1.1.1.222)、3-(4)-羟基苯基丙酮酸还原酶(EC 1.1.1.237)、乳酸脱氢酶(EC 1.1.1.27，1.1.1.28，1.1.2.3)、(3-咪唑-5-基)乳酸脱氢酶(EC 1.1.1.111)、乳酸氧化酶(EC 1.1.3.-)、合成酶/裂解酶(4.1.3.-)，例如4-羟基-2-氧代戊二酸醛缩酶(EC 4.1.3.16)或4-羟基-4-甲基-2-酮戊二酸醛缩酶(EC 4.1.3.17)、合成酶/裂解酶(4.1.2.-)、色氨酸转氨酶(EC2.6.1.27)、酪氨酸(芳族)转氨酶(EC 2.6.1.5)、色氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.19)、谷氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.2，1.4.1.3，1.4.1.4)、苯丙氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.20)、色氨酸-苯基丙酮酸转氨酶(EC 2.6.1.28)、多底物转氨酶(EC 2.6.1.-)、天冬氨酸转氨酶(EC 2.6.1.1)、D-色氨酸转氨酶、D-氨基酸脱氢酶(EC 1.4.99.1)和/或D-丙氨酸转氨酶(EC 2.6.1.21)。
此外，该细胞可含有一种或多种(例如，两种或多种，或三种或多种)以下活性物质：色氨酸转氨酶(EC 2.6.1.27)、酪氨酸(芳族)转氨酶(EC 2.6.1.5)、色氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.19)、谷氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.2，1.4.1.3，1.4.1.4)、苯丙氨酸脱氢酶(EC1.4.1.20)、色氨酸-苯基丙酮酸转氨酶(EC 2.6.1.28)、多底物转氨酶(EC 2.6.1.-)、天冬氨酸转氨酶(EC 2.6.1.1)、L-氨基酸氧化酶(EC 1.4.3.2)、色氨酸氧化酶、D-色氨酸转氨酶、D-氨基酸脱氢酶(EC 1.4.99.1)、D-氨基酸氧化酶(EC 1.4.3.3)、D-丙氨酸转氨酶(EC 2.6.1.21)、吲哚乳酸脱氢酶(EC 1.1.1.110)、R-4-羟基苯基乳酸脱氢酶(EC1.1.1.222)、3-(4)-羟基苯基丙酮酸还原酶(EC 1.1.1.237)、乳酸脱氢酶(EC 1.1.1.27，1.1.1.28，1.1.2.3)、(3-咪唑-5-基)乳酸脱氢酶(EC 1.1.1.111)、乳酸氧化酶(EC 1.1.3.-)、合成酶/裂解酶(EC 4.1.3.-)、例如4-羟基-2-氧代戊二酸醛缩酶(EC 4.1.3.16)或4-羟基-4-甲基-2-酮戊二酸醛缩酶(EC 4.1.3.17)和/或合成酶/裂解酶(4.1.2.-)。
其它例子中，细胞含有一种或多种以下醛缩酶活性物质：KHG醛缩酶、ProA醛缩酶、KDPG醛缩酶和/或相关的多肽(KDPH)、转羧基亚苄基丙酮酸水合酶-醛缩酶、4-(2-羧基苯基)-2-氧代-3-烯酸酯醛缩酶、转-O-羟基苄基亚基丙酮酸水合酶-醛缩酶、3-羟基天冬氨酸醛缩酶、苯偶姻醛缩酶、二氢新蝶呤醛缩酶、L-对-3-苯基丝氨酸苯甲醛-裂解酶(苯基丝氨酸醛缩酶)、4-羟基-2-氧代戊酸醛缩酶、1，2-二羟基苄基丙酮酸醛缩酶和/或2-羟基亚苄基丙酮酸醛缩酶。
莫那甜可通过以下方法生产，包括使色氨酸和/或吲哚-3-乳酸与第一种多肽接触，其中第一种多肽将色氨酸和/或吲哚-3-乳酸转化为吲哚-3-丙酮酸(色氨酸或吲哚-3-乳酸的D或L形式均可用作转化为吲哚-3-丙酮酸的底物；本领域的技术人员可理解的是选择用于此步骤的多肽最好显示适当的特异性)，使得到的吲哚-3-丙酮酸与第二种多肽接触，其中第二种多肽将吲哚-3-丙酮酸转化为2-羟基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸(MP)；并使MP与第三种多肽接触，其中第三种多肽将MP转化为莫那甜。可用于这些转化的示范性多肽示于图2和3。
通过一步或多步生物转化在生物合成途径中产生莫那甜提供了某些有利之处。例如，通过在生物合成途径中使用特异性的多肽和/或特定的底物，可产生富含特定立体异构体的混合物和/或产生基本上不含一种或多种立体异构体的莫那甜混合物。
作为莫那甜合成所用方法的结果，莫那甜组合物可含有杂质。通过纯合成方法(即，未涉及任何一步生物转化)生产的莫那甜组合物可含有不同于通过生物合成途径生产的莫那甜组合物的杂质。例如，基于使用的原材料，通过纯合成方法生产的莫那甜组合物可含有不适合于人用的石化、毒性和/或其它有害的污染物。这种污染物的例子是有害的化学物质，例如LDA、氢-Pd/C、重氮甲烷、KCN、格氏试剂和Na/Hg。另一方面，期望通过生物合成途径生产的莫那甜组合物可含有可食用或可饮用的杂质，而不含有石化、毒性和/或其它有害的物质。
与纯合成方法相比，期望通过一步或多步生物转化在生物合成途径这生产莫那甜的方法可产生较少的毒性或有害污染物和/或能提供较高百分比的某种立体异构体。例如，当使用D-氨基酸脱氢酶、D-丙氨酸(天冬氨酸)转氨酶、D-芳族转氨酶或D-甲硫氨酸转氨酶制造莫那甜时，期望至少可得到60％的R，R莫那甜并且少于40％的S，S、S，R和/或R，S莫那甜。并且当使用上述D-酶以及至少一种在R立体构型中具有碳的底物(例如，莫那甜前体)制造莫那甜时，也期望至少可得到95％的R，R莫那甜并且少于5％的S，S，S，R和/或R，S莫那甜。相反，当通过纯合成方法制造莫那甜时，期望得到约25％-50％的所需立体异构体。
在一个实施方案中，通过生物合成途径生产莫那甜的方法(例如，涉及一步或多步生物转化)未产生石化、毒性或有害的污染物。“石化、毒性或有害的污染物”表示石化、毒性、有害和/或其它不适合于人用的任何物质，包括以原材料提供或当通过纯合成方法生产莫那甜时产生的污染物。在另一个实施方案中，通过生物合成途径生产莫那甜的方法(例如，涉及一步或多步生物转化)仅产生了可食用或可饮用的物质。“可食用或可饮用的物质”表示适合于为人所食用或饮用的，或者是人们可安全使用的一种或多种化合物或物质。可食用或可饮用的物质的例子包括莫那甜、色氨酸、丙酮酸、谷氨酸、其它氨基酸以及天然存在于人体的其它化合物或物质。
在一个实施方案中，口香糖组合物含有胶基部分和可溶性部分，其中可溶性部分含有莫那甜或其盐。在另一个实施方案中，可溶性部分还具有柑桔味，其中莫那甜或其盐的存在量增强柑桔味所提供的香味。在其它实施方案中，可溶性部分还含有环己氨基磺酸盐和/或赤藓醇。
在其它实施方案中，含有莫那甜或其盐的口香糖组合物含有的卡路里和碳水化合物低于相同量的含有蔗糖而非莫那甜或其盐的口香糖组合物。在另一个实施方案中，口香糖组合物含有莫那甜或其盐并且是不生龋齿的。在另一个实施方案中，与其它高强度甜味剂，例如取代口香糖组合物中莫那甜的天冬甜素或三氯蔗糖相比，口香糖组合物中含有莫那甜或其盐的存在量可提供时间更长的甜味和未加遮掩或增强的香味。
在另一个实施方案中，用于制造莫那甜加甜口香糖组合物的方法包括以下步骤，所述组合物具有由莫那甜提供的增强的长期甜味：(a)通过生物合成途径生产莫那甜或其盐；(b)使莫那甜或其盐与其它成分结合；与(c)形成口香糖组合物。在另一个实施方案中，口香糖组合物含有莫那甜或其盐，其中莫那甜或其盐的存在量提供增强的长期甜味。在一个实施方案中，与天冬甜素或三氯蔗糖相比，口香糖组合物含有莫那甜或其盐的存在量提供时间延长的甜味。
在另一个实施方案中，口香糖组合物含有约0.001-1.1重量％的莫那甜或其盐。例如，口香糖组合物可含有约大于0.25-1.1重量％的莫那甜或其盐。在另一个实施方案中，口香糖组合物约含有0.009-0.1重量％的R，R莫那甜或其盐。例如，口香糖组合物可含有约0.015-0.025重量％的R，R莫那甜或其盐。在另一个实施方案中，口香糖组合物约含有0.1-1.1重量％的S，S莫那甜或其盐。例如，口香糖组合物可含有约0.25重量-1.1重量％的S，S莫那甜或其盐，或含有约0.15-0.88重量％的S，S莫那甜或其盐，或含有约0.25重量-0.88重量％的S，S莫那甜或其盐。在另一个实施方案中，口香糖组合物含有约0-1.1重量％的S，S莫那甜或其盐与约0-0.1重量％的R，R莫那甜或其盐。
在其它实施方案中，口香糖组合物含有基本上不含S，S莫那甜或其盐，或者基本上不含R，R莫那甜或其盐的莫那甜或其盐的组合物。在其它实施方案中，口香糖组合物含有约0.1或更低重量％的R，R莫那甜或其盐并且基本上不含S，S、S，R或R，S莫那甜或其盐。在其它实施方案中，口香糖组合物含有约0.1或更低重量％的S，S莫那甜或其盐并且基本上不含R，R、S，R或R，S莫那甜或其盐。
在其它实施方案中，口香糖组合物基本上由R，R莫那甜或其盐，或者基本上由S，S莫那甜或其盐组成。在其它实施方案中，口香糖组合物含有立体异构富含的R，R莫那甜或其盐，或者立体异构富含的S，S莫那甜或其盐。在一个实施方案中，莫那甜或其盐含有至少95％的R，R莫那甜或其盐，或者至少95％的S，S莫那甜或其盐。
在一个实施方案中，口香糖组合物含有通过生物合成途径生产的莫那甜或其盐。在一个实施方案中，口香糖组合物包括含有莫那甜或其盐的胶基部分和可溶性部分，其中两部分中所有的成分均是天然的。在另一个实施方案中，含有莫那甜或其盐的口香糖组合物是生物可降解的。生物可降解的口香糖组合物可含有，例如乳酸共聚物、蛋白质、节路顿胶、派里罗胶、香豆果胶、二齿铁线子木胶、巧克力铁线子木胶、红檀木胶、柔星丁哈胶、糖胶树胶、古塔胶、阿拉伯半乳聚糖、瓜耳胶、黄原胶或其组合。
在其它实施方案中，口香糖组合物包括胶基部分和可溶性部分，其中可溶性部分含有立体异构富含的莫那甜混合物，而莫那甜混合物通过生物合成途径产生。在另一个实施方案中，生物合成途径是多步骤途径并且该多步骤途径中的至少一步是化学转化。在其它实施方案中，莫那甜混合物主要是R，R莫那甜或其盐，或者主要是S，S莫那甜或其盐。在其它实施方案中，口香糖组合物包括胶基部分和可溶性部分，其中可溶性部分含有通过生物合成途径生产的莫那甜组合物，而莫那甜组合物不含石化、毒性或有害的污染物。在其它实施方案中，口香糖组合物含有通过生物合成途径生产并且分离自重组细胞的莫那甜或其盐，而重组细胞不含石化、毒性或有害的污染物。
在某些实施方案中，口香糖组合物包括胶基部分和可溶性部分，其中胶基部分含有3-50重量％的弹性体；0.5-25重量％的软化剂；2-30重量％的乳化剂；5-75重量％的树脂和0-20重量％的填料。在一些实施方案中，弹性体选自天然橡胶、天然树胶与合成的弹性体。在一些实施方案中，天然橡胶选自烟熏乳胶、液态乳胶和银胶菊。在一些实施方案中，天然树胶选自节路顿胶、派里罗胶、香豆果胶、二齿铁线子木胶、巧克力铁线子木胶、红檀木胶、柔星丁哈胶、糖胶树胶和古塔胶。在一些实施方案中，合成的弹性体选自丁二烯-苯乙烯共聚物、异丁烯-异戊二烯共聚物、聚丁二烯、聚异丁烯和乙烯基聚合弹性体。
在一些实施方案中，软化剂含有一种或多种牛油、氢化牛油、氢化植物油、部分氢化的植物油、可可脂、单硬脂酸甘油酯、三乙酸甘油酯、卵磷脂、单甘油酯、甘油二酯、甘油三酯、乙酰化单甘油酯和脂肪酸。在一些实施方案中，填料包括卵磷脂、菊粉、聚糊精、碳酸钙、碳酸镁、硅酸镁、重质碳酸钙、硅酸铝、滑石粉、粘土、氧化铝、二氧化钛和磷酸钙的一种或多种。在一些实施方案中，乳化剂可是单硬脂酸甘油酯、卵磷脂、聚甘油多聚蓖酸或硬脂酸镁。在一些实施方案中，树脂可是松香酯、萜树脂、乙酸聚乙烯醇纤维、聚乙烯醇、乙烯乙酸乙烯酯或乙酸乙烯酯-月桂酸乙烯酯共聚物。在一些实施方案中，松香酯可是部分氢化松香的甘油酯、聚合松香的甘油酯、部分二聚松香的甘油酯、松香的甘油酯、部分氢化松香的季戊四醇酯、松香的甲酯或部分氢化松香的甲酯。在一个实施方案中，乳化剂和软化剂是不同的化合物。在另一个实施方案中，乳化剂和填料是不同的化合物。在另一个实施方案中，软化剂和填料是不同的化合物。
在一个实施方案中，可溶性部分还含有散装甜味剂。散装甜味剂可是，例如玉米甜味剂、蔗糖、右旋糖、转化糖、糊精、果糖、左旋糖、固体玉米糖浆、半乳糖、海藻糖、异麦芽酮糖或其组合。在一个实施方案中，可溶性部分还可含有高强度甜味剂或低糖碳水化合物。高强度甜味剂或低糖碳水化合物可是，例如山梨糖醇、甘露醇、麦芽糖醇、氢化的淀粉水解物、木糖醇、阿力甜、索马甜、三氯蔗糖、天冬甜素、丁磺氨K、二氢查尔酮、糖精、纽甜、环己氨基磺酸盐、甜菊苷、罗汉果苷、塔格糖、赤藓糖、异麦芽糖、乳糖醇、甘草甜素、叶甜素、莫内林、马槟榔甜素、布那珍、仙茅甜蛋白、奇果蛋白或倍他丁。
在一个实施方案中，可溶性部分还含有调味剂。调味剂可是，例如香精油、果味剂、合成调味剂或其组合。香精油可是，例如薄荷油、留兰香油或冬青油。在一些实施方案中，果味剂可含有柠檬、酸橙、橙、红桔、葡萄柚、香橼、金桔、香蕉、樱桃、苹果、菠萝、葡萄、草莓、什锦水果、西瓜或其组合的提取物、香精或油。
在一个实施方案中，口香糖组合物包括胶基部分和可溶性部分，其中可溶性部分含有R，R和S，S莫那甜或其盐的的混合物。在其它实施方案中，可溶性部分含有莫那甜或其盐与丁磺氨K的混合物。在某些实施方案中，口香糖组合物含有约0.1-1.1重量％的S，S莫那甜或其盐与约0.1-0.3重量％的丁磺氨K，或者含有约0.25-1.1重量％的S，S莫那甜或其盐与约0.1-0.3重量％的丁磺氨K。在其它实施方案中，口香糖组合物含有0.05-0.7重量％的S，S莫那甜或其盐与约0.01-0.2重量％丁磺氨K，或者含有约0.009-0.1重量％的R，R莫那甜或其盐与约0.01-0.3重量％的丁磺氨K。
在一个实施方案中，口香糖组合物包括胶基部分和可溶性部分，其中可溶性部分含有包裹化的莫那甜或其盐。在一些实施方案中，胶基部分占组合物的15-30重量％。在其它实施方案中，可溶性部分还含有散装甜味剂、高强度甜味剂或低糖碳水化合物、与调味剂。
在一个实施方案中，制造含有莫那甜或其盐的口香糖组合物的方法包括从至少一种选自以下的底物生产莫那甜：葡萄糖、色氨酸、吲哚-3-乳酸、吲哚-3-丙酮酸和莫那甜前体。在某些实施方案中，该方法包括将莫那甜或其盐与至少一种其它非莫那甜或其盐的成分结合。在某些实施方案中，通过该方法制备的口香糖组合物含有约0-1.1重量％的S，S莫那甜或其盐与约0-0.1重量％的R，R莫那甜或其盐。在某些实施方案中，通过该方法制备的口香糖组合物含有约0.25-1.1重量％的莫那甜或其盐。
在另一个实施方案中，制造含有莫那甜或其盐的口香糖组合物的方法包括通过生物合成途径生产莫那甜或其盐。在另一个实施方案中，制造含有莫那甜或其盐的口香糖组合物的方法包括使用至少一步生物转化生产莫那甜或其盐。
在一个实施方案中，制造含有莫那甜或其盐的口香糖组合物的方法包括：(a)在重组细胞中通过生物合成途径生产莫那甜或其盐；(b)从重组细胞中分离莫那甜组合物，其中该莫那甜组合物由莫那甜或其盐以及其它可食用或可饮用的物质组成。在另一个实施方案中，口香糖组合物含有莫那甜或其盐以及至少一种选自以下的其它成分：赤藓醇、海藻糖、山梨醇、甘露醇、麦芽糖醇、木糖醇、阿力甜、索马甜、三氯蔗糖、天冬甜素、丁磺氨K、二氢查尔酮、糖精、纽甜、环己氨基磺酸盐、甜菊苷、罗汉果苷、塔格糖、异麦芽糖、乳糖醇、甘草甜素、叶甜素、莫内林、马槟榔甜素、布那珍、仙茅甜蛋白、奇果蛋白或倍他丁。
在一个实施方案中，制造含有莫那甜或其盐的口香糖组合物的方法包括通过生物合成途径生产莫那甜组合物，并且该莫那甜组合物中不含石化、毒性或有害的污染物。在另一个实施方案中，制造含有莫那甜组合物的口香糖组合物的方法包括在多步骤途径中从底物生产莫那甜组合物，其中该多步骤途径中的一步或多步是生物转化，并且该莫那甜组合物不含石化、毒性或有害的污染物。
在一个实施方案中，制造含有莫那甜组合物的口香糖组合物的方法包括在生物合成途径中生产莫那甜组合物，并且该莫那甜组合物由莫那甜或其盐以及其它可食用或可饮用的物质组成。在另一个实施方案中，制造口香糖组合物的方法包括在多步骤途径中从底物生产莫那甜组合物，其中该多步骤途径中的一步或多步是生物转化，并且该莫那甜组合物由莫那甜或其盐以及其它可食用或可饮用的物质组成。
本领域的普通技术人员在本文的指导下可明白本发明的具体实施方案可涉及上述各方面的某个方面或其与其它方面的组合。
                            附图简述
图1显示了用于生产莫那甜和/或吲哚-3丙酮酸的生物合成途径。一条途径通过色氨酸产生吲哚-3-丙酮酸，而其它途径通过吲哚-3-乳酸生产吲哚-3-丙酮酸。然后通过MP中间体生产莫那甜。
显示于方框中的化合物是在生物合成途径中生产的底物和产物。接近箭头的组合物是用于底物转化为产物过程的辅助因子或反应物。辅助因子或反应物的使用取决于生物合成途径的具体步骤所使用的多肽。辅助因子PLP(吡哆醛5’-磷酸)可催化独立于多肽的反应，因此仅提供PLP可使底物转化为产物。
图2是利用MP中间体的生物合成途径的更详细的图解。该途径中每一步的底物均示于方框中。致使底物之间进行转化的多肽列于接近底物之间的箭头处。每种酶用其通用名和酶分类(EC)号描述。
图3显示了吲哚-3-乳酸转化为吲哚-3-丙酮酸的生物合成途径的更详细图解。底物示于方框中，致使底物之间进行转化的多肽列于接近底物之间的箭头处。每种酶用其通用名和酶分类号描述。
图4是通过化学方法制造MP的一种可能的反应。
图5A和5B是酶法生产的莫那甜的LC/MS鉴定的色谱图。
图6是酶合成的莫那甜的电雾化质谱图。
图7A和7B是在酶混合物中产生的莫那甜的LC/MS/MS子离子分析的色谱图。
图8显示了酶法生产的莫那甜的高分辨率质谱测量的色谱图。
图9A-9C显示了(A)R-色氨酸、(B)S-色氨酸、和(C)酶法生产的莫那甜的手性分离的色谱图。
图10显示了IPTG诱导后在细菌细胞中产生的莫那甜相对量的柱状图。(-)表示未加入底物(未加入色氨酸或丙酮酸)。
图11-12显示了用于增加从色氨酸或吲哚-3-丙酮酸生产莫那甜的产量的途径的示意图。
图13显示了可用于增加从色氨酸或吲哚-3-丙酮酸生产莫那甜的产量的途径的示意图。
图14给出了用莫那甜的R，R立体异构体获得的剂量应答曲线。
图15给出了用莫那甜的R，R/S，S立体异构体混合物获得的剂量应答曲线。
图16比较了用莫那甜的R，R/S，S立体异构体混合物获得的剂量应答曲线与用糖精获得的剂量应答曲线。
图17显示了合成生产的莫那甜的标准品的反相色谱图。
图18显示了莫那甜标准品的手性色谱图。
                            发明详述
莫那甜生产的生物合成途径的综述
提供以下对术语和方法的解释是为了更好地描述本文内容并指导本领域的普通技术人员实践本发明。本文使用的“包括”表示“含有”。此外，除非文中另有明确指出，单数形式的“一个”或“该”均包括其复数形式。本文使用的“口香糖”表示所有类型的口香糖，包括功能性香口胶和泡泡糖。“功能性香口胶”表示含有至少一种功能性或医药成分的口香糖。例如，功能性香口胶可递送药物，如尼古丁、阿司匹林或传递呕吐药物(例如，乘晕宁)，或营养物质(例如，维生素和/或矿物质)，或化妆品成分(例如，牙齿净白和/或口气清新成分)。
如图1-3和11-13所示，许多生物合成途径均可用于生产莫那甜或其中间体，例如应答-3-丙酮酸或MP。为将每种底物(例如，葡萄糖、色氨酸、吲哚-3-乳酸、吲哚-3-丙酮酸和MP)转化为每种产物(例如，色氨酸、吲哚-3-丙酮酸、MP和莫那甜)，可使用几种不同的多肽。此外，这些反应可在体内、体外、或通过结合体内反应和体外反应(例如包括非酶化学反应的体外反应)来进行。因此，图1-3和11-13是示范性的并且显示了多种可用于获得所需产物的不同途径。
葡萄糖转化为色氨酸
许多生物体可从葡萄糖合成色氨酸。含有从葡萄糖和/或色氨酸生产莫那甜、MP和/或吲哚-3-丙酮酸所需基因的构建物可克隆进这种生物体。本文显示色氨酸可转化为莫那甜。
在其它实施例中，某种生物体可使用已知的多肽工程处理来生产色氨酸或超量生产色氨酸。例如，美国专利号4,371,614描述了用含有野生型色氨酸操纵子的质粒转化的大肠杆菌(E.coli)菌株。
披露于美国专利号4,371,614的色氨酸的最大滴度约为230ppm。类似地，WO8701130描述了遗传工程处理来生产色氨酸的大肠杆菌菌株并讨论了增加L-色氨酸的发酵产量。本领域的技术人员可意识到能从葡萄糖生产色氨酸的生物体也能利用可转化为葡萄糖或果糖-6-磷酸的其它碳氮源而有相似的结果。示范性的碳氮源包括(但不限于)蔗糖、果糖、淀粉、纤维素或甘油。
色氨酸转化为吲哚-3-丙酮酸
几种多肽可用于将色氨酸转化为吲哚-3-丙酮酸。示范性的多肽包括(但不限于)以下酶分类(EC)的成员：2.6.1.27、1.4.1.19、1.4.99.1、2.6.1.28、1.4.3.2、1.4.3.3、2.6.1.5、2.6.1.-、2.6.1.1和2.6.1.21。这些类型包括(但不限于)命名为色氨酸转氨酶，将L-色氨酸和2-酮戊二酸转化为吲哚-3-丙酮酸和L-谷氨酸的多肽(也命名为L-苯丙氨酸-2-酮戊二酸转氨酶、色氨酸转氨酶、5-羟基色氨酸-酮戊二酸转氨酶、羟基色氨酸转氨酶、L-色氨酸转氨酶、L-色氨酸转氨酶和L-色氨酸：2-酮戊二酸转氨酶)；将D-色氨酸和2-含氧酸转化为吲哚-3-丙酮酸就氨基酸的D-色氨酸转氨酶；将L-色氨酸和NAD(P)转化为吲哚-3-丙酮酸与NH3和NAD(P)H的色氨酸脱氢酶(也命名为NAD(P)-L-色氨酸脱氢酶、L-色氨酸脱氢酶、L-Trp-脱氢酶、TDH和L-色氨酸：NAD(P)氧化还原酶(脱氨基作用))；将D-氨基酸和FAD转化为吲哚-3-丙酮酸与NH3和FADH2的D-氨基酸脱氢酶；将L-色氨酸和苯基丙酮酸转化为吲哚-3-丙酮酸和L-苯丙氨酸的色氨酸-苯基丙酮酸转氨酶(也命名为L-色氨酸-α-酮异己酸转氨酶和L-色氨酸：苯基丙酮酸转氨酶)；将L-氨基酸与H2O和O2转化为2-含氧酸与NH3和H2O2的L-氨基酸氧化酶(也命名为蛇氨基酸氧化酶(ophio-amino-acid oxidase)和L-氨基酸：氧氧化还原酶(脱氨基作用))；将D-氨基酸与H2O和O2转化为2-含氧酸与NH3和H2O2的D-氨基酸氧化酶(也命名为蛇氨基酸氧化酶和D-氨基酸：氧氧化还原酶(脱氨基作用))；和将L-色氨酸与H2O和O2转化为吲哚-3-丙酮酸与NH3和H2O2的色氨酸氧化酶。这些类型也包括酪氨酸(芳族)转氨酶、天冬氨酸转氨酶、D-氨基酸(或D-丙氨酸)转氨酶和具有多种转氨酶活性的广谱(多底物)转氨酶，其中一些酶可将色氨酸与2-含氧酸转化为吲哚-3-丙酮酸与氨基酸。
具有这种活性的转氨酶类型的11个成员描述于以下实施例1，包括SEQ IDNO：11和12所示的新颖的转氨酶。因此，本文提供分别与SEQ ID NO：11和12所示序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或者甚至至少99％的序列同一性的核酸和氨基酸序列。本文也包括编码具有转氨酶活性或保留转氨酶活性的多肽的SEQ ID NO：11和12所示序列的片段和融合体。示范性的片段包括(但不限于)SEQ ID NO：11的至少10、12、15、20、25、50、100、200、500或1000个毗连的核苷酸或者SEQ ID NO：12的至少6、10、15、20、25、50、75、100、200、300或350个毗连的氨基酸。披露的序列(与变体、片段及其融合体)可是载体的一部分。载体可用于转化宿主细胞，藉此产生可从色氨酸生产吲哚-3-丙酮酸的重组细胞，并且在一些实施例中重组细胞还可产生MP和/或莫那甜。
L-氨基酸氧化酶(1.4.3.2)是已知的，并且序列可分离自几种不同的来源，例如地中海蝰蛇(Vipera lebetine)(sp P81375)、眼睛王蛇(Ophiophagus hannah)(spP81383)、红口蝮蛇(Agkistrodon rhodostonia)(spP81382)、西部菱斑响尾蛇(Crotalusatrox)(sp P56742)、洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)、拟南芥(Arabidopsisthaliana)、新月柄杆菌(Caulobacter cresentus)、莱因哈德衣藻(Chlamydonzonasreinhardtii)、小鼠(Mus musculus)、丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)和红球菌(Rhodococcus)菌株。色氨酸氧化酶描述于参考文献并可分离自，例如鬼伞属(Coprinus sp.)SF-1、患有根肿病的大白菜、拟南芥和哺乳动物肝脏。将色氨酸转化为吲哚-3-丙酮酸的L-氨基酸氧化酶类的一个成员以及用于分子克隆的其它来源描述于以下实施例3中。用于分子克隆的数据库中有许多D-氨基酸氧化酶基因可用。
色氨酸脱氢酶是已知的，并且可分离自，例如菠菜、豌豆(Pisum sativum)、柔黄花牧豆树(Prosopis juliflora)、豌豆、牧豆、小麦、玉米、西红柿、烟草、紫色色杆菌(Chromobacterium violaceum)和乳杆菌(Lactobacilli)。许多D-氨基酸脱氢酶基因序列是已知的。
如图11-13所示，如果氨基酸氧化酶(例如色氨酸氧化酶)用于将色氨酸纯化为吲哚-3-丙酮酸，可加入过氧化氢酶来降低或甚至消除过氧化氢的存在。
吲哚-3-乳酸转化为吲哚-3-丙酮酸
将吲哚-3-乳酸转化为吲哚-3-丙酮酸的反应可用各种多肽催化，例如1.1.1.110、1.1.1.27、1.1.1.28、1.1.2.3、1.1.1.222、1.1.1.237、1.1.3.-或1.1.1.111多肽类的成员。1.1.1.110类多肽包括吲哚乳酸脱氢酶(也命名为吲哚乳酸：NAD+氧化还原酶)。1.1.1.27、1.1.1.28和1.1.2.3类包括乳酸脱氢酶(也命名为乳酸脱氢酶，乳酸：NAD+氧化还原酶)。1.1.1.222类包括(R)-4-羟基苯基乳酸脱氢酶(也命名为D-芳族乳酸脱氢酶、R-芳族乳酸脱氢酶和R-3-(4-羟基苯基)乳酸：NAD(P)+2-氧化还原酶)并且1.1.1.237类包括3-(4-羟基苯基丙酮酸)还原酶(也命名为羟基苯基丙酮酸还原酶和4-羟基苯基乳酸：NAD+氧化还原酶)。1.1.3.-类包括乳酸氧化酶，而1.1.1.111类包括(3-咪唑-5-基)乳酸脱氢酶(也命名为(S)-3-(咪唑-5-基)乳酸：NAD(P)+氧化还原酶)。这些类型中的几种多肽可能致使从吲哚-3-乳酸生产吲哚-3-丙酮酸。该转化过程的例子提供于实施例2中。
也可使用化学反应将吲哚-3-乳酸转化为吲哚-3-丙酮酸。这种化学反应包括可使用几种方法实现的氧化步骤，例如：存在金属催化剂时使用B2催化剂(ChinaChemical Reporter，13卷，第28页，18(1)，2002)、稀释的高锰酸盐和高氯酸盐、或过氧化氢的空气氧化。
吲哚-3-丙酮酸转化为2-羟基2-(吲哚-3基甲基)-4-酮戊二酸(MP)
几种已知的多肽可用于将吲哚-3-丙酮酸转化为MP。示范性的多肽类包括4.1.3.-、4.1.3.16、4.1.3.17和4.1.2.-。这些类型包括碳-碳合成酶/裂解酶，例如催化两种羧酸底物缩合的醛缩酶。多肽类EC 4.1.3.-是使用含氧酸底物(例如吲哚-3-丙酮酸)作为亲电试剂以形成碳-碳键的合成酶/裂解酶，而EC 4.1.2.-是使用醛类底物(例如苯甲醛)作为亲电试剂以形成碳-碳键的合成酶/裂解酶。
例如，描述于EP 1045-029的多肽(EC 4.1.3.16，4-羟基-2氧代戊二酸乙醛酸-裂解酶，也命名为4-羟基-2-酮戊二酸醛缩酶、2-氧代-4-羟基戊二酸醛缩酶或KHG醛缩酶)将乙醛酸和丙酮酸转化为4-羟基-2-酮戊二酸，而多肽4-羟基-4-甲基-2酮戊二酸醛缩酶(EC 4.1.3.17，也命名为4-羟基-4-甲基-2-酮戊二酸丙酮酸-裂解酶或ProA醛缩酶)将两种酮酸(例如，两种丙酮酸)缩合为4-羟基-4-甲基-2-酮戊二酸。使用这些裂解酶的反应描述于本文。
图1-2和11-13是这些反应的示意图，其中3-碳(C3)分子与吲哚-3-丙酮酸结合。EC 4.1.2.-和4.1.3.-的许多成员，特别是利用PLP的多肽可利用是氨基酸的C3分子，例如丝氨酸、半胱氨酸和丙氨酸或其衍生物。由EC 4.1.2.-和4.1.3.-的代表性多肽催化的羟醛缩合需要该途径中的3碳分子是丙酮酸或丙酮酸的衍生物。然而，其它化合物可用作C3碳源并转化为丙酮酸。丙氨酸可被许多利用PLP的转氨酶(包括许多上述的酶)转氨基来产生丙酮酸。丙酮酸和氨可通过具有足够离去基团的L-丝氨酸、L-半胱氨酸的β-消除反应(例如通过丝氨酸酶或β酪氨酸催化的反应)获得，例如O-甲基-L-丝氨酸、O-苄基-L-丝氨酸、S-甲基半胱氨酸、S-苄基半胱氨酸、S-烷基-L-半胱氨酸、O-酰基-L-丝氨酸和3-氯-L-丙氨酸。天冬氨酸可在PLP介导的β裂解酶反应中用作丙酮酸的来源，例如由色氨酸酶(EC 4.1.99.1)和/或O-酪氨酸酶(EC 4.1.99.2，也命名为酪氨酸-苯酚裂解酶)催化的反应。可通过在(4.1.99.1-2)多肽上进行如Mouratou等(J.Biol.Chem 274：1320-5，1999)和实施例8中所述的定点诱变增加B裂解酶反应的速率。这些修饰使得多肽接受二羧基氨基酸底物。乳酸也可用作丙酮酸的来源，并通过加入乳酸脱氢酶和氧化辅助因子或乳酸氧化酶和氧来氧化为丙酮酸。这些反应的例子描述于下文。例如，如图2和图11-13所示，当使用丙酮酸作为C3分子时，ProA醛缩酶可与吲哚-3-丙酮酸反应。
MP也可使用化学反应来产生，例如实施例5所提供的羟醛缩合。
MP转化为莫那甜
MP转化为莫那甜可通过以下一种或多种酶来催化：色氨酸转氨酶(2.6.1.27)、色氨酸脱氢酶(1.4.1.19)、D-氨基酸脱氢酶(1.4.99.1)、谷氨酸脱氢酶(1.4.1.2-4)、苯丙氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.20)、色氨酸-苯基丙酮酸转氨酶(2.6.1.28)，或更常用的是转氨酶家族(2.6.1.-)的成员，例如天冬氨酸转氨酶(EC 2.6.1.1)、酪氨酸(芳族)转氨酶(2.6.1.5)、D-色氨酸转氨酶或D-丙氨酸(2.6.1.21)转氨酶(图2)。转氨酶类的11个成员描述于下文(实施例1)，包括SEQ ID NO：11和12所示类的新颖成员，说明转氨酶和脱氢酶活性的反应在实施例7中提供。
也可使用活性反应进行该反应。酮酸(MP)的胺化通过使用氨和氰基硼氢化钠的还原反应进行。
图11-13显示了可用于将MP转化为莫那甜并增加从吲哚-3-丙酮酸或色氨酸获得莫那甜的产量的其它多肽。例如，如果天冬氨酸用作氨基供体，天冬氨酸转氨酶可用于将天冬氨酸转化为草酰乙酸(图11)。草酰乙酸通过脱羧酶，例如草酰乙酸脱羧酶(图11)转化为丙酮酸和二氧化碳。此外，如果赖氨酸用作氨基供体，赖氨酸ε转氨酶可用于将赖氨酸转化为醛赖氨酸(图12)。醛赖氨酸自发转化为1-哌啶(piperideine)6-羧酸盐(图12)。如果使用能催化还原性胺化(animation)反应的多肽(例如，谷氨酸脱氢酶)转化MP为莫那甜，可使用能反复利用NAD(P)H和/或产生挥发性产物(图13)的多肽，例如甲酸脱氢酶。
设计生物合成途径中要考虑的其它问题
向生产细胞加入辅助因子、底物和/或其它多肽来提高产物形成随使用哪种多肽来产生吲哚-3-丙酮酸、MP和/或莫那甜而定。此外，遗传修饰可设计为提高产物的产量，例如吲哚-3-丙酮酸、MP和/或莫那甜。用于生产莫那甜的宿主细胞可类似地进行最优化。
除去过氧化氢
过氧化氢(H2O2)是一种如果产生会破坏生产细胞、产生的多肽或产物(例如，中间体)的产物。所述L-氨基酸氧化酶产生作为产物的H2O2。因此，如果使用L-氨基酸氧化酶，要除去得到的H2O2或要降低其水平以减少对细胞或产物的损害。
过氧化氢酶可用于降低细胞内H2O2的水平(图11-13)。生产细胞可表达编码过氧化氢酶(EC 1.11.1.6)的基因或cDNA序列，所编码的过氧化氢酶将过氧化氢分解为水和氧气。例如，过氧化氢酶可从转染进生产细胞的载体来表达。可使用的过氧化氢酶的例子包括(但不限于)：tr|Q9EV50(木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus))、tr|Q9KBE8(耐盐杆菌(Bacillus halodurans))、tr|Q9URJ7(白色念珠菌(Candidaalbicans))、tr|P77948(天青蓝链霉菌(Streptomyces coelicolor))、tr|Q9RBJ5(野油菜黄单孢菌(Xanthomonas campestris))(SwissProt登录号)。利用L-氨基酸氧化酶、D-氨基酸氧化酶或色氨酸氧化酶的生物催化反应器也可含有过氧化氢酶多肽。
调节吡哆醛-5’-磷酸(PLP)的利用度
如图1所示，PLP可用在本文所述的一步或多步生物合成步骤中。可补充PLP的浓度以使PLP不成为反应的总效率的限制因素。
维生素B6(PLP的前体)在大肠杆菌中的生物合成途径已得到充分研究，并且已结晶了一些蛋白质(Laber等，FEBS Letters，449：45-8，1999)。其它代谢途径中需要两种基因(epd或gapB与serC)，而对吡哆醛磷酸的生物合成而言三种基因(pdxA、pdxB和pdxJ)是独特的。大肠杆菌途径中的一种起始物质是1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸(DXP)。从常规2和3碳中心代谢物合成该前体由多肽1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶(DXP)催化。其它前体是从4-碳糖、D-赤藓糖4-磷酸形成的苏氨酸衍生物。转化至磷酸-4-羟基-L-苏氨酸(HTP)所需的基因是epd、pdxB和serC。形成PLP的最后反应是由pdxA和pdxJ的基因产物催化的DXP和HTP之间的复合物分子内缩合与闭环反应。
如果PLP成为发酵过程中生产莫那甜的限制性营养，增加生产宿主细胞中一种或多种途径基因的表达可用于增加莫那甜的产量。宿主生物体可含有多拷贝的其天然途径基因或者非天然途径基因的拷贝可掺入生物体的基因组。此外，多拷贝的补救途径基因可克隆进宿主生物体。
所有生物体中均保留有的一种补救途径反复利用维生素B6的各种衍生物来激活PLP形式。涉及该途径的多肽是pdxK激酶、pdxH氧化酶和pdxY激酶。中心基因的一种或多种的过度表达可增加PLP的利用度。
可通过消除或抑制宿主生物体中的天然生物合成途径基因的代谢调节来提高维生素B6的水平。PLP抑制涉及前体苏氨酸衍生物在细菌黄杆菌属(Flavobacteriumsp.)菌株238-7的生物合成的多肽。不进行代谢控制的该细菌菌株过度表达吡哆醛衍生物并且可分泌20mg/l的PLP。以类似的方式遗传调节生产莫那甜的宿主生物体可增加PLP产量而不过度表达生物合成途径基因。
铵的利用
可通过使氨利用率更高或除去水来驱动色氨酸酶反应朝合成方向进行(从吲哚生产色氨酸)。还原性胺化反应(例如谷氨酸脱氢酶催化的反应)也可由过量的氨驱动。
可使用作为碳酸盐或磷酸盐缓冲系统中的碳酸铵或磷酸铵盐的氨。氨也可以丙酮酸铵或甲酸铵提供。或者，如果反应与产生氨的反应偶联(如谷氨酸脱氢酶或色氨酸脱氢酶)，可提供氨。加入可水解成苯酚或吲哚、丙酮酸和NH3的EC4.1.99.-(酪氨酸或色氨酸)的天然底物能产生氨。通过使酶水解其优选底物也能使合成产物的增加产量超过正常平衡量。
移出产物和副产物
因为色氨酸通过色氨酸转氨酶转化为吲哚-3-丙酮酸的反应生成谷氨酸并需要共同的底物2-酮戊二酸(α-酮戊二酸)，该反应不利于吲哚-3-丙酮酸的生产率。谷氨酸抑制转氨酶，并且该反应消耗大量的共同底物。此外，谷氨酸浓度高对下游分离过程不利。
多肽谷氨酸脱氢酶(GLDH)将谷氨酸转化为2-氧代戊二酸，藉此在由色氨酸转氨酶催化的反应中反复利用共同的底物。GLDH也产生可用于在需氧条件下产生细胞所需能量(ATP)的还原性等价物(NADH或NADPH)。通过GLDH利用谷氨酸也减少副产物形成。此外，反应产生可用作细胞的氮源或作为图1所示最后步骤中还原性胺化底物的氨。因此，过度表达GLDH多肽的生产细胞可用于增加产量和降低培养基和/或分离方法的成本。
在色氨酸转化为莫那甜的途径中，如果使用来自适当酶类的转氨酶，步骤3的氨基供体(如谷氨酸或天冬氨酸)可转化回步骤1所需的氨基受体(如2-氧代-戊二酸或草酰乙酸)。使用此途径的2个独立的转氨酶能提高此途径的效率，其中1个转氨酶的底物不竞争性抑制另一个转氨酶的活性。
所述途径中的许多反应是可逆的，并且因此会在底物和产物间达到平衡。可通过从多肽中连续移出产物来增加该途径的产量。例如，用透性酶或其它转运蛋白使莫那甜分泌入发酵液或者使莫那甜从生物催化反应器液流中选择性结晶并同时反复利用底物会提高反应产量。
通过其它酶反应或驱动氨基供体基团来除去副产物是另一种增加反应产量的方法。几个例子讨论于实施例13且示于图11-13。例如，可通过相变(蒸发)或自发转化为不起反应的终产物(如二氧化碳)来产生不能以反方向反应的副产物。
调节底物集合
可通过增加色氨酸前体生成和/或改变涉及吲哚-3-丙酮酸和/或色氨酸的代谢途径来调节吲哚集合。例如，可通过功能性删除宿主细胞中编码EC 4.1.1.74的基因来降低或消除从吲哚-3-丙酮酸产生吲哚-3-乙酸。可通过功能性删除宿主细胞中编码EC 4.1.99.1的基因来降低或消除从色氨酸产生吲哚。或者，过量的吲哚可用作与编码EC 4.1.99.1的基因的增加量相结合的体外或体内过程中的底物(Kawasaki等，J.Ferm.and Bioeng.，82：604-6，1996)。此外，可进行遗传修饰以增加中间体(例如D-赤藓糖4-磷酸和分支酸)的水平。
大部分生物体中可调节色氨酸产生。一种机制是通过途径中的某些酶的反馈抑制；随着色氨酸水平增加，色氨酸的产率降低。因此，当使用通过色氨酸中间体产生莫那甜的工程改造的宿主细胞时，可使用对色氨酸浓度不敏感的生物体。例如，可通过反复暴露于高浓度5-甲基色氨酸来选择抗各种色氨酸类似物的生长抑制的玫瑰长春花(Catharanthus roseus)品系(Schallenberg和Berlin，Z Naturforsch34：541-5，1979)。可能由于基因突变，所得品系的色氨酸合酶活性受产物抑制的影响小。用于莫那甜生产的宿主细胞可类似地进行最优化。
可通过使用定向进化来最优化色氨酸生产以演化出对产物抑制不敏感的多肽。例如，可在不含色氨酸、但具有高水平的非代谢色氨酸类似物的培养基平板上进行筛选。美国专利号5,756,345；4,742,007和4,371,614描述用于增加发酵生物体中色氨酸产率的方法。色氨酸生物合成的最后步骤是将丝氨酸掺入吲哚；藉此提高丝氨酸的利用度来增加色氨酸生产。
可通过增加宿主生物体产生的丙酮酸的量来提高发酵生物体产生的莫那甜量。某些酵母，例如丝孢酵母菌(Trichosporon cutaneum)(Wang等，Lett.Appl.Microbiol.35：338-42，2002)和光滑球拟酵母菌(Torulopsis glabrata)(Li等，Appl Microbiol.Biotechnol.57：451-9，2001)过量产生丙酮酸并能用于实践本文所披露的方法。此外，可在例如大肠杆菌菌株W1485lip2(Kawasaki等，J.Ferm.and Bioeng.82：604-6，1996)的生物体中进行遗传修饰以促进丙酮酸产生。
控制手性
莫那甜的味觉特征可通过控制立体化学(手性)来改变。例如，各种浓度的不同食物系统的不同混合物中需要不同的莫那甜异构体。手性可通过结合pH和多肽来控制。
通过pH变化或与辅助因子PLP反应使α碳去质子化和再质子化可在莫那甜的C-4位置(见上面编号的分子)发生外消旋化，所述PLP与酶结合(例如外消旋酶)或在溶液中是游离的。在微生物中，pH不可能变化到足以导致外消旋，但PLP是丰富的。控制多肽手性的方法取决于用于产生莫那甜的生物合成途径。
当莫那甜用图2所示途径形成时，要考虑以下情况。在生物催化反应中，碳-2的手性由将吲哚-3-丙酮酸转化为MP的酶确定。多种酶(如来自EC 4.1.2.-、4.1.3.-)能使吲哚-3-丙酮酸转化为MP，因此可选择形成所需异构体的酶。或者，可通过使用定向进化修饰将吲哚-3-丙酮酸转化成MP的酶的对映特异性或可改造催化性抗体来催化所需反应。一旦产生MP(通过酶法或化学缩合)，可用转氨酶立体特异性地加入氨基，例如本文所述的转氨酶。碳-4的R或S构象的产生取决于使用的是D-还是L-芳族酸转氨酶。大部分转氨酶对L-异构体特异，然而，一些植物中存在D-色氨酸转氨酶(Kohiba和Mito，《第8届国际维生素B6和羰基催化研讨会纪要》，日本大阪，1990)。此外，鉴定了D-丙氨酸转氨酶(2.6.1.21)、D-甲硫氨酸-丙酮酸转氨酶(2.6.1.41)、(R)-3-氨基-2-甲基丙酸转氨酶(2.6.1.61)和(S)-3-氨基-2-甲基丙酸转氨酶(2.6.1.22)。某些转氨酶仅接受在C2碳有特定构象的该反应的底物。因此，即使非立体定向性地转化为MP，也可通过适当选择转氨酶来控制终产物的立体化学。由于反应可逆，未反应的MP(不需要的异构体)可循环回到其组分并再形成MP的外消旋混合物。
激活底物
磷酸化的底物，如磷酸烯醇丙酮酸(PEP)可用于本文所披露的反应。磷酸化的底物在能量上更有利，因此可用于增加反应速率和/或产量。在羟醛缩合中，加入磷酸基团稳定亲核底物的烯醇相互转化异构体，使之更具反应性。在其它反应中，磷酸化的底物可提供更好的离去基团。底物可通过转化成CoA衍生物或焦磷酸衍生物来类似地激活。
莫那甜在甜味剂组合物中的用途
按重量计，莫那甜的S，S立体异构体比蔗糖约甜约50-200倍。按重量计，莫那甜的R，R立体异构体比蔗糖约甜约2000-2400倍。莫那甜的甜味是用有经验的感觉评价人员在甜味比较过程中计算的，该过程将测试甜味剂溶液与一系列参考溶液中的一种的甜度进行比较。
具体地，可使用多位在甜味测试过程中有经验的训练有素的感觉评价人员来评估甜味剂相对于蔗糖的甜度。所有的样品(在相同的缓冲液中)在22℃±1℃时均制备两份。例如使用约pH 3.0的含有0.16％(v/w)柠檬酸和0.02％(v/w)柠檬酸钠的缓冲液。用3个随机数字的代码编号的测试溶液随机提供给评价人员。也提供了以0.5％(w/v)幅度增加的蔗糖参考标准品(2.0-10.0％(w/v)蔗糖)。要求评价人员通过比较测试溶液与蔗糖标准品的甜味来估计甜味。该过程按照喝3次测试溶液、然后喝一次水，接着再喝3次蔗糖标准品，然后再喝一次水等来进行。评价人员将甜味估计至十分位，例如6.8、8.5。评估测试溶液之间有5分钟的休息期间。也要求评价人员仔细漱口并吃饼干以降低任何可能的持续影响。
多位感觉评价人员确定的蔗糖等价值(SEV)(例如，蔗糖％)作为莫那甜的浓度对所得剂量应答曲线的函数来作图。将多项式曲线拟合应用于剂量应答曲线并通过将蔗糖等价值(SEV)除以莫那甜的浓度(例如，莫那甜％)用于计算在某点(例如，8％SEV)的甜度或能力。参见，例如图15(R，R/S，S莫那甜剂量应答曲线)；图14(R，R莫那甜剂量应答曲线)。
莫那甜可以适合使用的浓度溶于水溶液。在某些基料中或与其它甜味剂混合的莫那甜立体异构体混合物的质量可能较好。莫那甜与其它甜味剂的混合物可使甜度和/或特征曲线最大且成本最低。莫那甜可与其它甜味剂和/或其它成分组合以产生类似于蔗糖的暂时特征，或其它益处。
例如，莫那甜可与其它营养性和非营养性甜味剂混合以实现特定的风味或卡路里。因此，甜味剂组合物可包括莫那甜与一种或多种以下类型的甜味剂的组合：(1)糖醇(如赤藓醇、山梨糖醇、麦芽糖醇、甘露醇、乳糖醇、木糖醇、异麦芽糖、低糖糖浆等)；(2)其它高强度甜味剂(如天冬甜素、三氯蔗糖、糖精、丁磺氨K、甜菊苷、环己氨基磺酸盐、纽甜、索马甜、阿力甜、二氢查耳酮、莫内林、甘草甜素、罗汉果苷、叶甜素、马槟榔甜素、布那珍、多肽菌素、倍他丁等)，和(3)营养性甜味剂(如蔗糖、塔格糖、转化糖、果糖、玉米糖浆、高果糖玉米糖浆(HFCS)、葡萄糖/右旋糖、海藻糖、异麦芽酮糖等)。莫那甜可作为风味修饰剂用于这种混合物以抑制回味、增强其它风味，如柠檬味，或增强暂时风味特征。数据也显示，莫那甜与环己氨基磺酸盐(用于欧洲)有协同作用，但与天冬甜素、糖精、丁磺氨K、三氯蔗糖或碳水化合物甜味剂未观察到显著的协同作用。
由于莫那甜不是碳水化合物，它可用于降低口香糖组合物正电碳水化合物含量。在一个实施方案中，一定量的(例如，条状)莫那甜口香糖组合物含有的卡路里和碳水化合物低于相同量的含糖(例如，蔗糖或高果糖的玉米糖浆)的口香糖组合物。在其它实施方案中，含莫那甜的口香糖组合物(例如，含莫那甜或一种或多种碳水化合物)在一段时间中提供的口感、香味和甜度与仅含碳水化合物作为甜味剂的类似口香糖组合物的相当。在一个实施方案中，一定量的含莫那甜的口香糖组合物含有的卡路里和碳水化合物低于相同量的含蔗糖而非莫那甜的口香糖组合物。
莫那甜在干燥形式下稳定，并在单用或与碳水化合物混合时具有所需味道特征。它未显示出不可逆的分解，但在低pH时会形成内酯和/或内酰胺(在水性缓冲液中)并达平衡。在溶液中，随时间推移它可在4位缓慢外消旋化，但这通常在高pH下发生。通常，莫那甜的稳定性与天冬甜素相当或更好，莫那甜的味道特征与其它品质的甜味剂，如天冬甜素、阿力甜和三氯蔗糖相当或更好。与糖精和甜菊苷等其它高强度甜味剂相比，莫那甜无不佳的回味。
在某些实施方案中，本发明的口香糖组合物包括胶基部分和含有莫那甜的可溶部分。术语“可溶部分”中的术语“可溶”表示该部分可溶解于口和/或唾液中。胶基部分在整个咀嚼过程中维持于口中而可溶部分在咀嚼过程中随香味散布开。在一些实施方案中，可溶部分含有其它的成分，例如调味剂、色素、其它甜味剂和/或包衣。
一些加糖的口香糖实体含有蔗糖的包衣。在其它实施方案中，口香糖组合物配制为无糖的。某些无糖口香糖实体含有包衣(糖浆或结晶形式)，所述包衣为山梨醇、麦芽糖醇、异麦芽糖、木糖醇或赤藓醇。口香糖组合物可任选含有是调味剂、冻干液和/或色素的包衣。
在某些实施方案中，莫那甜组合物的量为口香糖组合物的0.001-1.1重量％(例如，0.009-1重量％、0.01-0.3重量％、0.01-0.04重量％或0.02-0.1重量％)，包括此范围内的任何具体数值(例如，口香糖组合物的0.001重量％、0.005重量％、0.01重量％、0.015重量％、0.02重量％或0.025重量％)。莫那甜可是某种立体异构体或不同立体异构体的混合物。例如，0.009-0.1重量％(如，0.015-0.025重量％)的莫那甜的R，R立体异构体或0.1-1.1重量％(例如，0.15-0.88重量％)的莫那甜S，S立体异构体可用于口香糖组合物中。
胶基
胶基的组成通常决定了该口香糖是口香糖、泡泡糖还是功能胶。在某些实施方案中，胶基是惰性和非营养性的，并且从以下成分的组合中制得：弹性体、软化剂(增塑剂)、乳化剂、树脂和填料。组合物中的成分通常认为是食品级的，该级别要通常认为是安全的(GRAS)和/或由美国食品与药物管理局(FDA)批准的。弹性体赋予口香糖弹性、粘合的特征，包括，例如一种或多种天然橡胶(例如，烟熏乳胶、液态乳胶或银胶菊)、天然树胶或合成的弹性体。在一些实施方案中，天然树胶包括节路顿胶、派里罗胶、香豆果胶、二齿铁线子木胶、巧克力铁线子木胶、红檀木胶、柔星丁哈胶、糖胶树胶和古塔胶。例如，糖胶树胶是特别有用的天然树胶。在其它实施方案中，合成的弹性体包括丁二烯-苯乙烯共聚物、异丁烯-异戊二烯共聚物、聚丁二烯、聚异丁烯和乙烯基聚合弹性体。在某些实施方案中，胶基中弹性体的量为3-70重量％(例如，胶基的3-60重量％、3-50重量％、5-45重量％、10-50重量％、15-45重量％或20-40重量％)，包括该范围内的任何具体数值(例如，3、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60或65重量％)。
树脂可用于调节胶基的硬度并帮助软化胶基中的弹性体成分。合适的树脂的非限制性例子包括一种或多种选自以下的树脂：松香酯、萜烯树脂，如得自α-蒎烯、β-蒎烯和/或d-二戊烯的萜烯树脂、乙酸聚乙烯醇纤维、聚乙烯醇、乙烯乙酸乙烯酯和乙酸乙烯酯-月桂酸乙烯酯共聚物。在某些实施方案中，松香酯可是部分氢化松香的甘油酯、聚合松香的甘油酯、部分二聚化松香的甘油酯松香的甘油酯、部分氢化松香的季戊四醇酯、松香的甲酯或部分氢化松香的甲酯。在一些实施方案中，松香的量是甲酯基础的5-75重量％，包括该范围内任何具体的数值。例如，树脂的量可是约甲酯基础的5-45重量％、10-75重量％、10-30重量％、15-60重量％或20-50重量％。
软化剂(也称为增塑剂)可用于修饰口香糖组合物咀嚼的容易程度和/或口感。在某些实施方案中，软化剂包括油、脂肪、蜡和乳化剂。可用物质的非限制性例子包括，例如牛油、氢化牛油、猪油、氢化或部分氢化的植物油，如大豆油、油菜(canola)、棉籽油、葵花籽油、棕榈油、椰油、玉米油、红花油或棕榈仁油，可可脂、单硬脂酸甘油酯、三乙酸甘油酯、松香甘油酯、卵磷脂、单甘油酯、甘油二酯、甘油三酯、乙酰化单甘油酯和游离的脂肪酸。常规使用的蜡包括，例如聚丙烯/聚乙烯/Fisher-Tropsch蜡、石蜡、微晶蜡与天然蜡，如小烛树蜡、蜂蜡和棕榈蜡。微晶蜡，特别是具有高度结晶的也可认为是增稠剂或结构改良剂。在某些实施方案中，一些玉米糖浆(例如Globe)在胶基与其它糖类混合前使之软化，提供稠度并使之湿润。在其它实施方案中，软化剂的量约为胶基的0.5-30重量％(例如，0.5-25重量％、0.5-15重量％或1-7重量％)，包括该范围中任何具体数值。
乳化剂有助于形成非可溶/可溶部分的均匀分布，并且也具有增塑性能。在某些实施方案中，合适的乳化剂包括单硬脂酸甘油酯(GMS)、卵磷脂(磷脂酰胆碱)、聚甘油多聚蓖酸(PPGR)、脂肪酸单甘油酯和甘油二酯、二硬脂酸甘油酯、三醋精、乙酰化单甘油酯、三乙酸甘油酯和硬脂酸镁。在其它实施方案中，乳化剂的量约是胶基的1-30重量％，例如2-30重量％、3-20重量％或5-15重量％，包括该范围内的任何数值(例如，5、10、15、20或25重量％)。
此外，口香糖组合物在组合物的胶基和/或可溶部分任选含有佐剂或填料。合适的佐剂或填料包括，例如卵磷脂、菊粉、聚糊精、碳酸钙、碳酸镁、硅酸镁、重质碳酸钙、硅酸铝、滑石粉、粘土、氧化铝、二氧化钛和磷酸钙。在某些实施方案中，卵磷脂可用作惰性填料来降低粘性。在其它实施方案中，乳酸共聚物、蛋白质(例如谷蛋白和/玉米蛋白)和/或瓜尔胶可用作更易生物降解的口香糖。在其它实施方案中，佐剂或填料的量约达胶基的20重量％(例如，胶基的1-20重量％、1-15重量％、1-10重量％、2-18重量％或5-15重量％)，包括该范围内的任何具体数值。
类似地，色素试剂和增白剂也可任选加入口香糖组合物，并且包括，例如FD&C型色淀、水果和植物提取物、二氧化钛、热改良的氨基酸、可可粉或其混合物。在某些实施方案中，色素试剂和增白剂的量约是胶基的0-5重量％(例如，0-1重量％)，包括该范围内的任何具体数值。
胶基的其它成分任选包括一种或多种抗氧化剂或防腐剂，例如丁基化羟基茴香醚(BHA)、丁基化羟基甲苯(BHT)、育儿酚、β胡萝卜素、没食子酸丙酯和酸化剂(例如，维生素C)。在某些实施方案中，抗氧化剂或防腐剂可是胶基的0-0.2重量％(例如，0-约0.05重量％、0-0.08重量％、0.05重量％或0.1重量％)。
在一些实施方案中，组合物的胶基部分包括3-50重量％的弹性体、0.5-25重量％的软化剂、2-30重量％的乳化剂、5-75重量％的树脂和20重量％的填料，胶基的总重量％是100。胶基例如可含有30重量％的萜烯树脂、15重量％的氢化植物油(例如，氢化棉籽油)、2重量％的卵磷脂、2.5重量％的聚异丁烯、27重量％的聚乙酸乙烯酯、12.45重量％的碳酸钙、11重量％的异丁烯-异戊二烯共聚物和0.05重量％的BHT。
在某些实施方案中，胶基部分可月为口香糖组合物的2-95重量％，该组合物总的重量％是100。例如，胶基可是口香糖组合物的约5-80重量％、10-50重量％、15-30重量％或约20-35重量％。
可溶部分
在本发明的一些实施方案中，除莫那甜以外，口香糖的可溶部分包括散装甜味剂、软化剂、高强度甜味剂、调味剂、色素试剂、佐剂、填料、功能胶的成分(例如，尼古丁)或其组合。例如，散装甜味剂可用于提供稠度或粘性并赋予所需的甜味水平。在某些实施方案中，散装的甜味剂包括糖类与无糖和低糖碳水化合物成分，并构成口香糖组合物的约5-95重量％(例如，20-80重量％或30-60重量％)。在其它实施方案中，糖类甜味剂包括单用或联用的蔗糖、右旋糖(例如，工业葡萄糖)、麦芽糖、糊精、干的转化糖、果糖、高果糖玉米糖浆、左旋糖、半乳糖、固体玉米糖浆等。无糖的甜味剂和低糖碳水化合物成分可包括(但不限于)单用或联用的塔格糖和糖醇，如山梨醇、甘露醇、木糖醇、乳糖醇、赤藓醇、麦芽糖醇，氢化的淀粉水解物、异麦芽糖、海藻糖等。
在某些实施方案中，莫那甜口香糖组合物含有其它高强度甜味剂和/或无糖甜味剂。许多高强度甜味剂比蔗糖至少甜20倍。这些甜味剂包括(但不限于)单用或联用的三氯蔗糖、天冬甜素、丁磺氨的盐(例如，丁磺氨K)、阿力甜、糖精及其盐、环己氨基磺酸及其盐、甘草甜素、二氢查尔酮(例如，新橙皮苷、二氢查尔酮)、索马甜、莫内林、纽甜、甜菊苷(从甜菊(Stevia rebaudiana)的叶子提取)、罗汉果甙(从罗汉果(Lo Han Guo)果实中提取)、叶甜素(从绣球(Hydrangea macrophylla)的叶子中提取，约比蔗糖甜400-600倍)、马槟榔甜素、布那珍、倍他丁等。在一些实施方案中，高强度甜味剂的范围是口香糖组合物的0.001-5重量％(例如口香糖组合物的0.009-1重量％)，包括该范围内的任何具体数值。例如，高强度甜味剂，如阿力甜(比蔗糖甜2000倍，2000×蔗糖)和索马甜(1600-3000×蔗糖)可约是口香糖组合物的0.02-0.10重量％；天冬甜素和类似的化合物(200×蔗糖)可约是口香糖组合物的0.1-0.3重量％。在其它实施方案中，莫那甜和高强度甜味剂，例如环己基磺酸盐或丁磺氨K可用于口香糖组合物中。例如，0.05-0.7重量％的莫那甜(例如，莫那甜的S，S立体异构体)和0.01-0.2重量％的丁磺氨K可用于口香糖组合物中。
在某些实施方案中，甜味增强剂(仅在有其它化合物，例如酸时是甜的)也可用于口香糖组合物中。甜味增强剂的非限制性例子包括仙茅甜蛋白和奇果蛋白(100×蔗糖)。
在其它实施方案中，水性甜味剂溶液，例如含有山梨醇、氢化的淀粉水解物、玉米糖浆、多元醇糖浆(如麦芽糖醇糖浆)或其组合也可用作口香糖组合物中的软化剂和粘合剂。
在其它实施方案中，莫那甜口香糖组合物含有调味剂，包括天然或人造调味剂及其组合。例如，调味剂的量可是口香糖组合物的月0.1-15重量％(例如，0.1-10重量％、0.2-5重量％或0.5-3重量％)。在某些实施方案中，调味剂是精油，例如得自植物或水果的油、薄荷油、留兰香油、其它薄荷油、丁香油、肉桂油、鹿蹄草、月桂、百里香、雪松叶、肉豆蔻、香辣椒、鼠尾草、肉豆蔻、杏仁、茴香等的油。在其它实施方案中，调味剂是植物提取物或水果香精，例如苹果、香蕉、西瓜、梨、桃子、葡萄、草莓、木莓、樱桃、李、菠萝和杏，或水果调味剂的组合(例如，什锦果味)。在其它实施方案中，调味剂是柑桔香精，例如柠檬、酸橙、橙子、桔子、葡萄柚、香橼或金桔的提取物、香精或油。在一些实施方案中，这些调味剂可以液体或固体形式使用并可单独或混合使用。
任选的成分，例如色素试剂、乳化剂、药学试剂(例如，尼古丁、阿司匹林、乘晕宁、咖啡因)也可包括在口香糖中。合适的色素试剂和乳化剂描述于下文。
在某些实施方案中，口香糖组合物的一种或多种成分可被包裹化。例如，可包裹莫那甜和/或其它高强度甜味剂、色素试剂和/或调味剂。莫那甜和/或其它高强度甜味剂的包裹化可提高预先甜度、延长甜味持续时间并增强对甜味剂的保护及其稳定性。包裹化也可保护调味剂。参见，例如美国专利号4,981,698；5,004,595和5,266,335所述的包裹这些成分的方法。
任何口香糖组合物均可含有莫那甜。在一些实施方案中，口香糖组合物含有约17-23重量％的胶基(例如20重量％)、55-65重量％的散装甜味剂(例如，60重量％)、15-21重量％葡萄糖糖浆(例如，18重量％)、0.05-0.15重量％调味剂(例如，0.1重量％)和0.05-0.15重量％的其它添加剂(例如，0.1重量％)。在一个实施方案中，口香糖组合物含有约20重量％的胶基、约3重量％的甘油、约8重量％的葡萄糖、约0.5重量％的卵磷脂、约1％水果调味剂(例如，草莓)、约0.07重量％色素(例如，红色色素)、约47重量％糖类、约20重量％菊粉或聚糊精填料、约0.15重量％丁磺氨K和0.5重量％的S，S莫那甜。在某些实施方案中，可通过替换约0.02重量％的莫那甜并用散装糖类或填料补足剩余部分来使R，R莫那甜取代丁磺氨K/S，S莫那甜混合物。
在另一个实施方案中，无糖的口香糖组合物含有约21-27重量％(例如，24.5重量％)的无糖胶基、约13-19重量％(例如，16.1重量％)的山梨醇溶液、约0.5-2.0重量％(例如，1.5重量％)的调味剂，如薄荷调味剂，约2-3.5重量％(例如，2.8重量％)的甘油和约0.009-1.1重量％的莫那甜(取决于所用的莫那甜立体异构体的混合物)与约50-60重量％(例如，55重量％)的山梨醇粉末。
口香糖组合物的制备
可使用已知技术制备口香糖组合物。总体上，口香糖组合物可通过将各种口香糖成分依次加入任何本领域已知的市售可得的混合器(例如，Sigma浆叶混合器)中来制造。参见，例如美国专利号5,334,397和5,800,848。各成分充分混合后，从混合器中放出口香糖团并加工成所需形状，例如通过碾压成薄板并切割成条状、挤成块状或做成小球或片状。各种形状的口香糖和泡泡糖均是可能的，包括条状、块状、片状、夹心的(center filled)、球形、水果形、香烟形、硬币形、管胶(tube gum)和压粉胶(compressed powder gum)。
在一个实施方案中，首先将胶基融化(例如，在80-125℃的温度)并加入运行中的混合器。或者，胶基可在混合器中融化。色素也可在此时加入。加入糖浆和一部分散装试剂后可加入软化剂。然后将散装试剂的其它部分加入混合器。在某些实施方案中，在混合过程几乎结束时将调味剂成分加入口香糖混合物。口香糖可以连续或分批方式制备。玉米淀粉或滑石粉可在包装前撒在口香糖产品上。
感官测试鉴定口香糖组合物和/或其成分，例如包衣的口味和质地的等级。感官测试的例子包括口头分级测试和三角测试。在口头分级测试中，配方相同但含有不同甜味剂的口香糖组合物由3个或更多的专门小组并行评价。专门小组给每种组合物的甜度分级。在三角测试中，3种口香糖组合物的样品给予3个或更多的专门小组，其中两种样品具有相同的配方，而第三种参考/比较样品具有不同的配方。要求专门小组确定哪种配方具有不同于其它两种的甜味或其它感官特征。
与含有其它甜味剂的口香糖相比，期望含有莫那甜的口香糖在咀嚼过程中表现出更长时间的甜味，更长的储存时间、更高的酸和热稳定性以及更好的口味特征和市场竞争力。
                            实施例
                            实施例1
色氨酸转氨酶的克隆和表达
该实施例描述了用于克隆色氨酸转氨酶的方法，该酶用于将色氨酸转化成吲哚-3-丙酮酸。
实验概述
11个编码转氨酶的基因克隆入大肠杆菌。这些基因是枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)D-丙氨酸转氨酶(dat，核酸序列和氨基酸序列的Genbank登录号分别为Y14082.1bp 28622-29470和NP 388848.1)、苜蓿根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)(也称为Rhizobium meliloti)酪氨酸转氨酶(tatA，核酸序列和氨基酸序列分别为SEQ IDNOS：1和2)、类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)菌株2.4.1酪氨酸转氨酶(同源性确定的tatA，核酸序列和氨基酸序列分别为SEQ ID NOS：3和4)、类球细红菌(Rsphaeroides)35053酪氨酸转氨酶(经同源性确定，核酸序列和氨基酸序列分别为SEQ ID NO：5和6)、硕大利什曼原虫(Leishmania major)广谱底物转氨酶(经与墨西哥利什曼原虫(L.mexicana)的肽片段的同源性确定的bsat，核酸序列和氨基酸序列分别为SEQ ID NO：7和8)、枯草芽孢杆菌芳族转氨酶(经同源性确定的araT，核酸序列和氨基酸序列分别为SEQ ID NO：9和10)、食淀粉乳杆菌(Lactobacillusamylovorus)芳族转氨酶(经同源性确定的araT，核酸序列和氨基酸序列分别为SEQID NOS：11和12)、类球红细菌35053多底物转氨酶(经同源性确定，核酸序列和氨基酸序列分别为SEQ ID NOS：13和14)、类球红细菌菌株2.4.1多底物转氨酶(经同源性确定的msa，核酸序列和氨基酸序列分别为Genbank登录号AAAE01000093.1，bp 14743-16155和ZP00005082.1)、大肠杆菌天冬氨酸转氨酶(aspC，核酸序列和氨基酸序列分别为Genbank登录号AE000195.1bp 2755-1565和Genbank登录号AAC74014.1)和大肠杆菌酪氨酸转氨酶(tyrB，核酸序列和氨基酸序列分别为SEQID NOS：31和32)。克隆、表达了基因并(比较)测试其与可市售可得的酶在将色氨酸转化为吲哚-3-丙酮酸中的活性。所有11个克隆均有活性。
鉴定包含具有所需活性的多肽的细菌菌株
NCBI(国家生物技术信息中心)数据库中没有基因命名为色氨酸转氨酶。然而，具有此酶活的生物得到鉴定。在以下来源的细胞提取物中或从纯化蛋白中测量到L-色氨酸转氨酶(TAT)活性：分离自羊茅(Festuca octoflora)的根瘤菌、豌豆线粒体和细胞溶质、向日葵冠瘿细胞、豌豆根瘤菌三叶草生物变种(R.leguminosarum biovartrifoli)、草生欧文氏菌石头花致病变种(E.herbicola pv.gypsophilae)、丁香假单胞菌萨氏致病变种(P.syringae pv.savastanio)、根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)、生脂固氮螺菌(Azospirillum lipferum)、巴西固氮螺菌(A.brasilense)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、团聚肠杆菌(Enterobacter agglomerans)、埃氏慢生根瘤菌(Bradyrhizobium elkanii)、麦芽念珠菌(C.maltosa)、棕色固氮菌(Azotobacter.vinelandii)、大鼠脑、大鼠肝、苜蓿根瘤菌、荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)CHA0、乳酸乳球菌(Lactococcus.Lactis)、干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus.Helveticus)、小麦幼苗、大麦、金色菜豆(Phaseolusaureus)(绿豆)、葡萄状酵母(Saccharomyces uvarum)(卡尔斯伯根糖酵母)、利什曼原虫属、玉米、番茄茎、豌豆植物、烟草、猪、生孢梭菌(Clostridium.Aporogenes)和灰色链霉菌(Streptomyces griseus)。
                            实施例2
吲哚-3-乳酸转化为吲哚-3-丙酮酸
如图1和3所示，吲哚-3-乳酸可用于产生吲哚-3-丙酮酸。如吲哚-3-丙酮酸和吲哚-3-乳酸之间的转化一样，乳酸和丙酮酸间的转化是可逆反应。由于吲哚-3-丙酮酸在340nm处的高背景量，通常可跟踪吲哚-乳酸的氧化。
0.1mL的标准试验混合物含有100mM磷酸钾、pH8.0，0.3mM NAD+，7单位乳酸脱氢酶(LDH)(Sigma-L2395，St.Louis，MO)和2mM底物。试验使用MolecularDevices SpectraMax Plus板阅读器在UV-透明微量滴定板中重复2次。混合多肽和缓冲液并移液至含吲哚-3-乳酸和NAD+的孔中，短暂混合后，以9秒间隔阅读各孔在340nm处的吸光度。反应在25℃保持5分钟。从NAD+生成NADH后，340nm处的吸光度增加。进行的独立对照无NAD+与底物。肠膜明串珠菌(Leuconostoc.Mesenteroides)的D-LDH(Sigma目录号L2395)看上去显示与吲哚衍生底物的活性大于嗜热脂肪芽孢杆菌(Baccilus stearothermophilus)的L-LDH(Sigma目录号L5275)的。
使用D-乳酸和NAD+或NADH和丙酮酸、D-LDH多肽的天然底物可进行类似的方法。丙酮酸还原的Vmax比乳酸氧化的Vmax高100-1000倍。吲哚-3-乳酸与D-LDH的氧化反应的Vmax约为乳酸的五分之一。吲哚-3-丙酮酸的存在也经使用含0.5mM EDTA和0.5mM砷酸钠的50mM硼酸钠缓冲液跟踪327(烯醇-硼酸盐衍生物)处吸光度变化来测量。与L和D-LDH多肽的阴性对照相比，观察到小但可重复的吸光度变化。
此外，可克隆广谱特异性的乳酸脱氢酶(活性与EC 1.1.1.27、EC 1.1.1.28和/或EC 1.1.2.3相关的酶)并用于从吲哚-3-乳酸产生吲哚-3-丙酮酸。广谱特异性的脱氢酶的来自大肠杆菌、淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)和植物乳杆菌(Lactobacillus.plantarum)。
此外，可通过使吲哚-3-乳酸接触以下物质来产生吲哚-3-丙酮酸：生孢梭菌(Clostridium.sporogenes)的细胞提取物，提取物包含吲哚乳酸脱氢酶(EC 1.1.1.110)；或克氏表鞭毛型锥虫(Trypanosoma cruzi epimastigotes)细胞提取物，提取物含有已知对吲哚-3-丙酮酸有活性的p-羟苯基乳酸脱氢酶(EC 1.1.1.222)；或食酸假单胞菌(Pseudomonas.Acidovorans)或大肠杆菌细胞提取物，提取物含有咪唑-5-基乳酸脱氢酶(EC 1.1.1.111)；或含有羟苯基丙酮酸还原酶(EC 1.1.1.237)的锦紫苏(Coleusblumei)；或含有D-芳族乳酸脱氢酶(EC 1.1.1.222)的麦芽念珠菌。描述这种活性的参考文献有Nowicki等(FEBS Microbiol Letters，71：119-24，1992)、Jean和DeMoss(Canadian J.Microbiol.14 1968、Coote和Hassall(Biochem.J.111：237-9，1969)、Cortese等(C.R.Seances Soc.Biol.Fil.162 390-5，1968)、Petersen和Alfermann(Z.Naturforsch.C：Biosci.43 501-4，1988)和Bhatnagar等(J.GenMicrobiol135：353-60，1989)。此外，乳酸氧化酶，例如假单胞菌属(Pseudomonas)的酶(Gu等J.Mol.Catalysis B：Enzymatic：18：299-305，2002)可用于将吲哚-3-乳酸氧化成吲哚-3-丙酮酸。
                            实施例3
用L-氨基酸氧化酶将L-色氨酸转化成吲哚-3-丙酮酸
该实施例描述了作为实施例1所述使用色氨酸转氨酶的替代方法的通过氧化酶(EC 1.4.3.2)将L-色氨酸转化成吲哚-3-丙酮酸的方法。L-氨基酸氧化酶纯化自南美响尾蛇(Crotalus durissus)(Sigma，St.Louis，MO，目录号A-2805)。用于分子克隆的L-氨基酸氧化酶的登录号包括：CAD21325.1、AAL14831、NP 490275、BAB78253、A38314、CAB71136、JE0266、T08202、S48644、CAC00499、P56742、P81383、O93364、P81382、P81375、S62692、P23623、AAD45200、AAC32267、CAA88452、AP003600和Z48565。
反应在微离心管中进行，总体积1mL，37℃振荡孵育10分钟。反应混合物含有5mM L-色氨酸，100mM磷酸钠缓冲液、pH6.6，0.5mM砷酸钠，0.5mM EDTA，25mM四硼酸钠，0.016mg过氧化氢酶(83U，Sigma C-3515)，0.008mg FAD(Sigma)和0.005-0.125单位的L-氨基酸氧化酶。阴性对照含有除色氨酸以外的所有成分，空白含有除氧化酶以外的所有成分。过氧化氢酶用于去除在氧化脱氨期间形成的过氧化氢。四硼酸钠和砷酸钠用于稳定在327nm显示最大吸光度的吲哚-3-丙酮酸的烯醇-硼酸盐形式。浓度为0.1-1mM的吲哚-3-丙酮酸的标准品在反应混合物中制备。
购得的L-氨基酸氧化酶的比活为每分钟每毫克蛋白形成540μg吲哚-3-丙酮酸。这与色氨酸转氨酶的比活是相同的数量级。
                            实施例4
用醛缩酶将吲哚-3-丙酮酸转化成2-羟基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸
该实施例描述了用醛缩酶(裂合酶)将吲哚-3-丙酮酸转化成MP的方法(图2)。醛醇缩合是在一种醛或酮的β-碳与另一种醛或酮的羰基碳间形成碳-碳键的反应。在与一个底物的羰基相邻的碳上形成碳负离子，并用作亲核体攻击第2个底物的羰基碳(亲电碳)。亲电底物最常见是醛，因此大部分醛缩酶属于EC 4.1.2.-类别。亲核底物通常是丙酮酸。醛缩酶不常催化两种酮酸或两种醛间的缩合。
然而，鉴定了催化2个羧酸缩合的醛缩酶。例如，EP 1045-029描述了使用假单胞菌培养物(EC 4.1.3.16)从乙醛酸和丙酮酸产生L-4-羟基-2-酮戊二酸。此外，4-羟基-4-甲基-2-氧代戊二酸醛缩酶(4-羟基-4-甲基-2-氧戊二酸丙酮酸裂合酶，EC4.1.3.17)能催化两种酮酸缩合。因此，类似的醛缩酶多肽用于催化吲哚-3-丙酮酸与丙酮酸的缩合。
克隆
4-羟基-4-甲基-2-氧戊二酸丙酮酸裂合酶(ProA醛缩酶，EC 4.1.3.17)和4-羟基-2-氧代戊二酸乙醛酸裂合酶(KHG醛缩酶，EC 4.1.3.16)催化很类似图2所示醛缩酶反应的反应。引物设计为具有与pET30Xa/LIC载体(Novagen，Madison，WI)相容的突出端。
proA基因产物的活性结果
当用IPTG诱导时，睾丸酮丛毛单胞菌proA(C.testosteroni proA)和苜蓿根瘤菌SMc00502基因构建物有高水平表达。重组蛋白通过SDS-PAGE分析总蛋白和细胞提取物样品确定高度可溶。睾丸酮丛毛单胞菌基因产物纯化至＞95％纯度。由于用His-结合柱亲和纯化后苜蓿根瘤菌基因产物的产量很低，将细胞提取物用于酶测定。
两种重组醛缩酶都催化从吲哚-3-丙酮酸和丙酮酸形成MP。酶活性需要二价镁和磷酸钾的存在。当缺乏吲哚-3-丙酮酸、丙酮酸或磷酸钾时，没有明显产物。无酶时也形成少量产物(通常比有酶时低1个数量级)。
从反相C18柱洗脱的产物峰稍迟于吲哚-3-丙酮酸标准品，该峰的质谱显示碰撞诱导母离子([M+H]+)是292.1，母离子预示产物是MP。质谱中存在的主要子片段包括m/z＝158(1H-吲哚-3-碳醛正碳离子)、168(3-丁-1，3-二烯基-1H-吲哚-正碳离子)、274(292-H2O)、256(292-2H2O)、238(292-3H2O)、228(292-CH4O3)和204(失去丙酮酸)的子片段。产物也表现出其它含吲哚的化合物，例如色氨酸的紫外光谱特征，λmax为279-280且在约290nm处有一小的肩峰。
随着反应温度从室温增加到37℃、底物量和镁量的增加，睾丸酮丛毛单胞菌醛缩酶法产生的MP量增加。酶的合成活性随着pH增加而减少，在pH7观察到最多产物。基于色氨酸标准品，用20μg纯化的蛋白在标准测定下生成的MP量约为10-40μg/mL反应液。
由于苜蓿根瘤菌和睾丸酮丛毛单胞菌ProA醛缩酶编码序列与上述其它基因的高度同源性，预期所有重组基因产物能催化此反应。此外，预期在59位和87位有苏氨酸(T)，在119位有精氨酸(R)，在120位有天冬氨酸(D)，在31位和71位有组氨酸(H)(基于睾丸酮丛毛单胞菌的编号系统)的醛缩酶有类似活性。
khg基因产物的活性结果
当用IPTG诱导时，枯草芽孢杆菌和大肠杆菌khg基因构建物有高水平表达，而苜蓿根瘤菌khg的表达水平较低。重组蛋白通过SDS-PAGE分析总蛋白和细胞提取物样品判断是高度可溶的。枯草芽孢杆菌和大肠杆菌khg基因产物纯化到＞95％纯度；用His-结合柱亲和纯化后，苜蓿根瘤菌基因产物的产量不高。
没有迹象证明该酶活性需要镁和磷酸盐。然而，文献报导是在磷酸钠缓冲液中进行的测定，所报导的酶是双功能并对磷酸化底物如2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡糖酸(KDPG)有活性。酶测定如上所述进行，在一些情况中省去了磷酸盐。结果表明重组KHG醛缩酶法产生MP，但活性不如ProA醛缩酶。在一些情况中，用KHG产生的MP水平几乎与单用镁和磷酸盐产生的量相同。磷酸盐似乎不增加KHG活性。如SRM所测定的，杆菌酶活性最高，比单用镁和磷酸盐的活性约高20-25％(见实施例10)。根瘤菌酶活性量最低，这可能与表达中注意到的折叠和溶解问题相关。所有3种酶具有谷氨酸(枯草芽孢杆菌编号系统中的43位)以及赖氨酸(130位)与丙酮酸形成Shiff碱所需的活性位点；然而，枯草芽孢杆菌酶在47位含有的活性位点残基是苏氨酸，而非精氨酸。枯草芽孢杆菌KHG较小且似乎在不同于苜蓿根瘤菌和大肠杆菌酶，以及其它有活性位点苏氨酸的酶的簇中。活性位点的差异可能是枯草芽孢杆菌酶活性增加的原因。
改进醛缩酶活性
催化抗体可与天然醛缩酶一样有效，接受广谱范围的底物，并能用于催化图2所示反应。
也能通过定向进化改进醛缩酶，例如通过DNA改组和易错PCR以去除对磷酸盐的需求和逆转对映选择性的上述KDPG醛缩酶(与上述KHG高度同源)。因为KDPG醛缩酶多肽对供体底物(本文是丙酮酸)具有高度特异性，而对受体底物(即吲哚-3-丙酮酸)相对灵活(Koeller和Wong，Nature 409：232-9，2001)，它们用于生化反应。KHG醛缩酶有缩合丙酮酸与许多羧酸的活性。据认为哺乳动物的KHG醛缩酶具有比细菌的个广泛的特异性，包括对4-羟基-4-甲基-2-氧戊二酸活性较高和接受4-羟基-2-酮戊二酸的2种立体异构体。细菌来源似乎对R异构体具有10倍优先性。基因组数据库中有约100个KHG同系物，在假单胞菌属(Pseudomonas)、副球菌属(Paracoccus)、普罗威登斯菌(Providencia)、根瘤菌(Sinorhizobium)、摩根氏菌(Morganella)、大肠杆菌和哺乳动物组织中证明活性。这些酶能用作设计莫那甜产生需要的对映特异性的起始点。
利用丙酮酸和酮酸和/或有大的疏水基团的另一底物，例如吲哚的醛缩酶能“演化”来修改多肽特异性、速度和选择性。除了本文证明的KHG和ProA醛缩酶之外，这些酶的例子包括(但不限于)：KDPG醛缩酶和相关多肽(KDPH)；类诺卡氏菌属(Nocardioides sp)的转羧基亚苄基丙酮酸水合酶-醛缩酶；缩合丙酮酸与2-羧基苯甲醛(一种含芳环的底物)的4-(2-羧苯基)-2-氧丁-3-烯醇盐醛缩酶(2’-羧基亚苄基丙酮酸醛缩酶)；恶臭假单胞菌(Pseudomonas.Putida)和食芳香物鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas aromaticivorans)的反式-O-羟基苯亚甲基丙酮酸水合酶-醛缩酶，它也利用丙酮酸和含芳族物质的醛作为底物；使用2-含氧酸作为底物且认为是在生物脱氮微球菌(Micrococcus denitrificans)中的3-羟基天冬氨酸醛缩酶(赤-3-羟基-L-天冬氨酸乙醛酸裂合酶)；利用含苄基的底物的苯偶姻醛缩酶(苯甲醛裂合酶)；二氢新蝶呤醛缩酶；缩合甘氨酸与苯甲醛的L-苏-3-苯基丝氨酸苯甲醛-裂合酶(苯基丝氨酸醛缩酶)；4-羟基-2-氧戊酸醛缩酶；1，2-二羟基苄基丙酮酸醛缩酶和2-羟基亚苄基丙酮酸醛缩酶。
使用下列方法筛选感兴趣的克隆来选择具有所需活性的多肽。用表达盒上携带感兴趣克隆的载体转化色氨酸营养缺陷型并生长于含少量莫那甜或MP的培养基上。由于转氨酶和醛缩酶反应是可逆的，细胞能从莫那甜的外消旋混合物生成色氨酸。类似地，通过利用MP或莫那甜作为碳源和能源的能力可筛选生物(重组和野生型)。靶醛缩酶的一个来源是各种假单胞菌和根瘤菌菌株的表达文库。假单胞菌有许多用于降解芳族分子的不寻常的分解代谢途径，这些途径也含有许多醛缩酶；而根瘤菌含有醛缩酶，它已知在植物根际中生长，并且具有许多描述为用于构建莫那甜生物合成途径的基因。
                            实施例5
化学合成莫那甜前体
实施例4描述了使用醛缩酶将吲哚-3-丙酮酸转化成MP的方法。本实施例描述另一种化学合成MP的方法。MP可使用典型的醛醇类型缩合来形成(图4)。简言之，典型的醛醇类型反应涉及用强碱，如LDA(二异丙基酰胺锂)、六甲基二硅氮烷锂或丁基锂产生丙酮酸酯的碳负离子。产生的碳负离子与吲哚-丙酮酸反应以形成偶联产物。
可用于保护吲哚氮的保护基团包括(但不限于)：叔-丁氧基羰基(Boc)和苄氧基羰基(Cbz)。羧酸的阻断基团包括(但不限于)烷基酯(例如甲基、乙基、苄基酯)。当使用这些保护基团时，不可能控制所形成产物的立体化学。然而，如果R2和/或R3是手性保护基团(图4)，例如(S)-2-丁醇、薄荷醇或手性胺，这有助于使一种MP对映异构体的形成胜过另一种。
                            实施例6
色氨酸或吲哚-3-丙酮酸转化成莫那甜
使用转氨酶和醛缩酶两种酶的体外方法从色氨酸和丙酮酸产生莫那甜。在第1步骤中，α-酮戊二酸是产生吲哚-3-丙酮酸和谷氨酸的转氨反应中色氨酸的氨基的受体。醛缩酶催化第2个反应，其中丙酮酸在有Mg2+和磷酸盐时与吲哚-3-丙酮酸反应产生莫那甜(MP)，2-羟基-2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸的α-酮衍生物。第1个反应中形成的谷氨酸的氨基转移产生所需产物莫那甜。产物的纯化和性质鉴定确认所形成的异构体是S，S-莫那甜。其它的底物、酶和条件以及对此方法的改进也得到描述。
酶
如实施例4所述，克隆、表达和纯化来自睾丸酮丛毛单胞菌的醛缩酶、4-羟基-4-甲基-2-氧戊二酸丙酮酸裂合酶(ProA醛缩酶，proA基因)(EC 4.1.3.17)。如实施例4所述，克隆、表达和纯化来自枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和苜蓿根瘤菌的4-羟基-2-氧代戊二酸乙醛酸裂合酶(KHG醛缩酶)(EC 4.1.3.16)。
用于结合醛缩酶以产生莫那甜的转氨酶是大肠杆菌aspC基因编码的L-天冬氨酸转氨酶、大肠杆菌tyrB基因编码的酪氨酸转氨酶、苜蓿根瘤菌的TatA酶、硕大利什曼原虫bsat基因编码的广谱底物转氨酶或来自猪心的谷氨酸-草酰乙酸转氨酶(IIa型)。实施例1描述了非哺乳动物蛋白的克隆、表达和纯化。来自猪心的谷氨酸-草酰乙酸转氨酶(IIa型)得自Sigma(#G7005)。
使用ProA醛缩酶和L-天冬氨酸转氨酶的方法
1升反应混合物中含有50mM醋酸铵，pH8.0、0.4mM MgCl2、3mM磷酸钾、0.05mM磷酸吡哆醛、100mM丙酮酸铵、50mM色氨酸、10mM α-酮戊二酸、160mg重组睾丸酮丛毛单胞菌ProA醛缩酶(未纯化的细胞提取物，约30％的醛缩酶)、233mg重组大肠杆菌L-天冬氨酸转氨酶(未纯化的细胞提取物，约40％醛缩酶)。除了酶以外，所有成分混合在一起并于30℃孵育直至色氨酸溶解。随后加入酶，反应溶液于30℃孵育并轻柔振荡(100rpm)3.5小时。酶加入后0.5和1小时，等份的固体色氨酸(各50微摩尔)加入反应。加入的色氨酸不全溶解，但浓度维持于50mM或更高。3.5小时后，滤去固体色氨酸。使用量确定的色氨酸作为标准品通过LC/MS分析反应混合物显示溶液中的色氨酸浓度为60.5mM，莫那甜浓度为5.81mM(1.05g)。
下列方法用于纯化终产物。90％的清溶液上BioRad AG50W-X8树脂柱(225mL；结合量为1.7meq/mL)。柱用水洗，收集300mL的部分，直至280nm处的吸光度＜首先流出部分的5％。然后柱用1M醋酸铵，pH8.4洗脱，收集4个300mL部分。所有4个部分含有莫那甜并用装有温水浴的旋转蒸发仪蒸发到105mL。随着体积减小形成了沉淀，并在蒸发过程中滤去沉淀物。
通过LC/MS分析柱部分显示99％的色氨酸和莫那甜结合在柱上。蒸发过程中形成的沉淀含有＞97％的色氨酸和＜2％的莫那甜。上清液中色氨酸与产物的比例约为2∶1。
上清液(7ml)上100mL预先用0.5L 1M NaOH、0.2L水、1.0L 1.0M醋酸铵，pH8.4和0.5L水洗转化成醋酸盐形式的快流DEAE琼脂糖(Amersham Biosciences)柱。上清液以＜2mL/分钟上样，柱用3-4mL/分钟的水洗涤直至280nm处的吸光度约为0。莫那甜用100mM醋酸铵，pH8.4洗脱，收集4个100-mL部分。
对各部分的分析显示流出部分中色氨酸与莫那甜比例为85∶15，而在洗脱部分的比例为7∶93。假定莫那甜在280nm处的消光系数与色氨酸相同，则洗脱部分含有0.146微摩尔的产物。就68％的回收率而言，总共1L的反应液估计可产生成约2.4微摩尔(约710mg)莫那甜。
DEAE琼脂糖柱的洗脱部分蒸发到＜20mL。等量的产物通过C8反相制备柱进一步纯化，使用的色谱条件与实施例10所述用于分析级别的莫那甜特征的相同。Waters FractionlynxTM软件用于在检测到m/z＝293离子的基础上触发莫那甜的自动分部收集。收集来自C8柱具有莫那甜的相应质子化分子离子的部分，蒸发到干燥，然后溶解于小体积水。此部分用于鉴定产物的特征。
所得产物用下列方法确定特征。
紫外/可见光谱学.紫外/可见光谱测量酶法生成的莫那甜用Cary 100Bio UV/可见光分光光度计完成。溶于水的纯化产物显示在280nm处具有最大吸收峰，288nm处有一肩峰，这是含吲哚的化合物的典型特征。
LC/MS分析.用于得自体外生化反应的莫那甜的混合物分析如实施例10所述进行。图5描述了体外酶合成混合物中莫那甜的典型LC/MS分析。图5的下面一幅阐明莫那甜的质子化分子离子在m/z＝293的所选离子色谱。对混合物中莫那甜的鉴定由图6所述的质谱确认。用LC/MS分析纯化产物显示有293的分子离子单峰和280nm的吸光度。质谱与图6所示相同。
MS/MS分析.如实施例10所述，也对莫那甜进行了LC/MS/MS子离子实验。图7描述了莫那甜的子离子质谱。进行了图7中标记的所有片段离子的试验性结构分配。这包括m/z＝275(293-H2O)、257(293-(2xH2O))、230(275-COOH)、212(257-COOH)、168(3-丁-1，3-二烯基-1H-吲哚-正碳离子)、158(1H-吲哚-3-碳醛正碳离子)、144(3-乙基-1H-吲哚-正碳离子)、130(3-亚甲基-1H-吲哚-正碳离子)和118(吲哚正碳离子)的片段离子。如同所预料的，如果这些片段获得自分子的吲哚部分，许多这些片段与MP获得的(实施例4)相同。由于存在氨基而非酮，一些片段比MP所发现的高1个质量单位。
莫那甜的精确质量测定.图8阐述了使用Applied Biosystems-Perkin ElmerQ-Star杂合四极/飞行时间质谱仪获得的纯化的莫那甜的质谱。使用色氨酸作为内部质量校验标准，质子化莫那甜的测量质量是293.1144。基于C14H17N2O5的元素组成，质子化莫那甜的计算质量是293.1137。此质量测量误差小于每百万分二(2ppm)，确认了酶法生成莫那甜的元素组成。
NMR光谱学.NMR实验在Varian Inova 500MHz仪器上进行。莫那甜样品(约3mg)溶于0.5ml D2O。溶剂(D2O)起初用作4.78ppm处的内标。由于水的峰大，抑制水峰来进行1H-NMR。然后，由于水峰宽，莫那甜的C-2质子用作参考峰，并设置为在公布值7.192ppm。
对于13C-NMR，初次进行的几百次扫描表明样品太稀释不能在规定时间内获得足够的13C谱。因此，进行异核多级量子相干(HMQC)实验，它能使其所连的氢和碳相关，也提供碳化学位移的信息。
表1和2总结了1H和HMQC数据。通过与公布值比较，NMR数据表明酶法产生的莫那甜是(S，S)、(R，R)或两者的混合物。
手性LC/MS分析.为确定体外产生的莫那甜是一种异构体而不是(R，R)和(S，S)对映异构体的混合物，用实施例10所述仪器进行手性LC/MS分析。
手性LC分离用Chirobiotic T(Advanced Separations Technology)手性色谱柱在室温进行。基于供应商公布的方案优化色氨酸的R-(D)和S-(L)异构体的分离和检测。LC流动相由A)含有0.05％(v/v)三氟乙酸的水；B)含0.05％(v/v)三氟乙酸的甲醇组成。洗脱液由70％A和30％B组成。流速为1.0mL/分钟，检测200nm到400nm的PDA吸光度。用于色氨酸和莫那甜的手性LC/MS分析的仪器参数与实施例10所述用于LC/MS分析的相同。使用所收集的m/z 150-400区的质谱。质子化分子离子的所选离子色谱(用于R-和S-色氨酸的[M+H]+＝205且用于莫那甜的[M+H]+＝293)可直接鉴定混合物中的这些分析物。
图9显示了通过手性色谱分离并由MS检测的R-和S-色氨酸和莫那甜的色谱。莫那甜色谱中的单峰表明该化合物是一种异构体，保留时间几乎与S-色氨酸相同。
                            表1
                        1H-NMR数据
Figure A20048002710300501
  Cargill   Veleggaar等1   Takeshi等2
  原子   δH   J(HH)Hz   δH   J(HH)Hz   δH   J(HH)Hz
  2   7.192(1H，s)   7.192(s)   7.18(s)
  4   7.671(d)   7.99   7.686(d)   7.9   7.67(d)   8.0
  5   7.104(dd)   7.99   7.102(dd)   8.0，8.0   7.11(dd)   7.5，7.5
  6   7.178(dd)   *   7.176(dd)   8.0，8.0   7.17(dd)   7.5，7.5
  7   7.439(d)   7.99   7.439(d)   8.1   7.43(d)   8.0
  10a   3.242(d)   14.5   3.243(d)   14.3   3.24(d)   14.5
  10b   3.033(d)   14.5   3.051(d)   14.3   3.05(d)   14.5
  12   2.626(dd)2.015(dd)   15.5，1.515.0，12.0   2.651(dd)2.006(dd)   15.3，1.715.3，11.7   2.62(dd)2.01(dd)   15.5，1.815.5，12.0
  13   3.571(dd)   10.75*，1.5   3.168(dd)   11.6，1.8   3.57(dd)   12.0，1.8
1Veleggaar等(J.C.S.Perkin Trans.1：3095-8，1992).
2Takeshi和Shusuke(JP2002060382，2002-02-26).
             表2
   13C-NMR数据(来自HMQC谱)
 Cargill   Veleggaar等1
  原子  δC   δC
  2  126.1   126.03
  3  *   110.31
  4  120.4   120.46
  5  120.2   120.25
  6  122.8   122.74
  7  112.8   112.79
  8  *   137.06
  9  *   129.23
  10a  36.4   36.53
  12  39.5   39.31
  13  54.9   54.89
  14  *   175.30
  15  *   181.18
1Veleggaar等(J.C.S.Perkin Trans.1：3095-8，1992)。
旋光测定.在Rudolph Autopol III旋光仪上测量旋光。莫那甜制备为14.6mg/mL的水溶液。对于1g/mL水溶液，S，S莫那甜(盐形式)预期的比旋光([α]D 20)是-49.6(Veleggaar等)。纯化、酶法生成莫那甜的观察到的[α]D 20为-28.1，表明它是S，S异构体。
改进
最优化包括试剂和酶浓度的反应条件，并用下列试剂混合物产生了5-10mg/mL的产量：50mM醋酸铵、pH8.3，2mM MgCl2，200mM丙酮酸(钠或铵盐)，5mM α-酮戊二酸(钠盐)，0.05mM吡哆醛磷酸，在酶加入后达到1mL终体积的脱气水，3mM磷酸钾，50μg/mL重组ProA醛缩酶(细胞提取物；总蛋白浓度为167μg/mL)，1000μg/mL大肠杆菌aspC基因编码的L-天冬氨酸转氨酶(细胞提取物；总蛋白浓度为2500μg/mL)和使浓度＞60mM的固体色氨酸(饱和的；一些在整个反应过程中未溶解)。混合物于30℃孵育4小时并轻柔搅拌或混合。
替换
α-酮戊二酸的浓度可降低至1mM并补充9mM天冬氨酸产生等量的莫那甜。其它氨基酸受体可用于第1步，如草酰乙酸。
当重组硕大利什曼原虫广谱底物转氨酶用于取代大肠杆菌L-天冬氨酸转氨酶时，获得类似的莫那甜产量。然而，分子量为292的第2种未鉴定产物(主要产物的3-10％)也通过LC-MS分析检测到。当大肠杆菌tyrB编码的酶、苜蓿根瘤菌tatA编码的酶或来自猪心的谷氨酸-草酰乙酸转氨酶(IIa型)作为转氨酶加入时，产生的莫那甜浓度为0.1-0.5mg/mL。当反应始于吲哚-3-丙酮酸时，使用谷氨酸脱氢酶和NADH(如实施例7)的还原性胺化(反应)可用于最后步骤。
枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和苜蓿根瘤菌的KHG醛缩酶也与大肠杆菌L-天冬氨酸转氨酶一起使用来以酶法生成莫那甜。使用下列反应条件：50mM NH4-Oac、pH8.3，2mM MgCl2，200mM丙酮酸，5mM谷氨酸，0.05mM吡哆醛磷酸，在酶加入后加入脱气水使终体积达到0.5mL，3mM磷酸钾，20μg/mL重组枯草芽孢杆菌KHG醛缩酶(纯化的)，约400μg/mL来自细胞提取物的未纯化的大肠杆菌L-天冬氨酸转氨酶(AspC)和12mM吲哚-3-丙酮酸。反应于30℃振荡孵育30分钟。用枯草芽孢杆菌的酶产生的莫那甜量为80ng/mL，并随醛缩酶量的增加而提高。如果用饱和量的色氨酸和5mM α-酮戊二酸取代吲哚-3-丙酮酸和谷氨酸，莫那甜产量增加到360ng/mL。用30μg/mL的3种KHG酶与饱和量的色氨酸在50mM Tris pH8.3中重复反应，并使反应进行1小时以增加检测量。杆菌酶如实施例4一样，具有最高的活性，产生约4000ng/mL莫那甜。大肠杆菌KHG产生3000ng/mL莫那甜，苜蓿根瘤菌酶产生2300ng/mL。
                            实施例7
MP和莫那甜间的相互转化
MP胺化以形成莫那甜可通过转氨酶，例如实施例1和6鉴定的酶催化，或通过需要还原辅因子，例如NADH或NADPH的脱氢酶催化。这些反应是可逆的且能以任一方向测量。当使用脱氢酶时，方向性主要通过铵盐的浓度控制。
脱氢酶活性.随着NAD(P)+转化成更发色的NAD(P)H，通过跟踪340nm处的吸光度增加来监测莫那甜的氧化脱氨。莫那甜如实施例6所述酶法产生和纯化。
典型的0.2mL测定混合物含有50mM Tris-HCl、pH8.0到8.9，0.33mM NAD+或NADP+，2到22单位的谷氨酸脱氢酶(Sigma)和10-15mM底物。测定在UV-透明微量滴定板中用Molecular Devices SpectraMax Plus板阅读器进行，重复2次。酶、缓冲液和NAD(P)+的混合物移液入含底物的孔，短暂混合后，以10秒间隔监控340nm处吸光度的增加。反应于25℃孵育10分钟。阴性对照不加底物来进行，谷氨酸用作阳性对照。牛肝的III型谷氨酸脱氢酶(Sigma #G-7882)催化莫那甜转化为莫那甜前体，转化率约为谷氨酸转化为α-酮戊二酸的百分之一。
转氨活性.用大肠杆菌的L-天冬氨酸转氨酶(AspC)、大肠杆菌的酪氨酸转氨酶(TyrB)、硕大利什曼原虫的广谱底物转氨酶(BSAT)和两个实施例1所述市售可得的猪谷氨酸-草酰乙酸转氨酶进行莫那甜转氨酶测定。草酰乙酸和α-酮戊二酸作为氨基受体测试。测定混合物含有(0.5mL中)50mM Tris-HCl、pH8.0，0.05mM PLP，5mM氨基受体，5mM莫那甜和25μg转氨酶。测定于30℃孵育30分钟，加入0.5mL异丙醇终止反应。莫那甜减少通过LC/MS监测(实施例10)。注意到以草酰乙酸为氨基受体的硕大利什曼原虫BSAT活性量最高，接着是以α-酮戊二酸作为氨基受体的该酶。使用草酰乙酸的相对活性是：BSAT＞AspC＞猪IIa型＞猪I型＝TyrB。使用α-酮戊二酸的相对活性是：BSAT＞AspC＞猪I型＞猪IIa型＞TyrB。
                            实施例8
从色氨酸和除丙酮酸以外的C3来源产生莫那甜
如上面实施例6所述，吲哚-3-丙酮酸或色氨酸能使用丙酮酸作为C3分子来转化为莫那甜。然而，在一些情况中丙酮酸可能不是理想的原料。例如，丙酮酸可能比其它C3碳源贵，或者如果加入培养基可能对发酵有不利影响。丙氨酸可通过许多PLP-酶转氨以产生丙酮酸。
色氨酸酶样的酶进行β-消除反应的速度快于其它PLP酶如转氨酶。该类别(4.1.99.-)的酶能从氨基酸产生氨和丙酮酸，所述氨基酸是例如L-丝氨酸、L-半胱氨酸、有良好离去基团的丝氨酸和半胱氨酸衍生物例如O-甲基-L-丝氨酸、O-苄基-L-丝氨酸、S-甲基半胱氨酸、S-苄基半胱氨酸、S-烷基-L-半胱氨酸、O-酰基-L-丝氨酸和3-氯-L-丙氨酸。
用EC 4.1.99.-多肽生成莫那甜的方法可通过根据Mouratou等(J.Biol.Chem274：1320-5，1999)的方法使β-酪氨酸酶(TPL)或色氨酸酶突变加以改进。Mouratou等描述了将β-酪氨酸酶转化成二羧基氨基酸β-裂合酶的能力，自然界中还未报道有此种情况发生。使缬氨酸(V)283转化成精氨酸(R)与精氨酸(R)100变成苏氨酸(T)来实现特异性的改变。这些氨基酸改变使裂合酶可接受二羧基氨基酸用于水解脱氨反应(如天冬氨酸)。因此，天冬氨酸也可作为丙氨酸的来源用于随后的醛醇缩合反应。
此外，可提供乳酸与将乳酸转化成丙酮酸的酶的细胞或酶反应器。能催化此反应的酶的例子包括乳酸脱氢酶和乳酸氧化酶。
反应混合物包括50mM Tris-Cl、pH8.3，2mM MgCl2，200mM C3碳源，5mMα-酮戊二酸，钠盐，0.05mM吡哆醛磷酸，在酶加入后加入脱气水使终体积达到0.5mL，3mM磷酸钾、pH7.5，25μg如实施例4制备的粗重组睾丸酮丛毛单胞菌ProA醛缩酶，500μg如实施例1制备的粗L-天冬氨酸转氨酶(AspC)，使浓度＞60mM的固体色氨酸(饱和；一些在整个反应过程中未溶解)。反应混合物于30℃混合孵育30分钟。提供丝氨酸、丙氨酸和天冬氨酸作为3-碳源。用或不用能进行β-消除反应和β-裂合酶反应二级PLP酶(纯化的)(色氨酸酶(TNA)，双突变体色氨酸酶，β-酪氨酸酶(TPL))进行测定。结果示于表3：
                   表3
        用其它C3-碳源产生莫那甜
  C3-碳源   另外的PLP酶   相对活性
  无   无   0％
  丙酮酸   无   100％
  丝氨酸   无   3％
  丝氨酸   11μg野生型TNA(1U)   5.1％
  丝氨酸   80μg双突变体TNA   4.6％
  丙氨酸   无   32％
  丙氨酸   11μg野生型TNA   41.7％
  丙氨酸   80μg突变体TNA   43.9％
  天冬氨酸   110μg野生型TNA(10U)   7.7％
  天冬氨酸   5U野生型TPL(粗)   5.1％
  天冬氨酸   80μg突变体TNA   3.3％
从作为3-碳源的丙氨酸和丝氨酸产生的莫那甜通过LC/MS/MS子扫描分析确认，与经特征鉴定的实施例6中产生的莫那甜相同。丙氨酸是测试的最佳选择之一，它通过AspC酶转氨。产生的莫那甜量通过加入能作为二级活性转氨的色氨酸酶而增加。即使与转氨酶相比加入的色氨酸酶量仅为五分之一，加入色氨酸酶并以丝氨酸作为碳源产生的莫那甜量几乎加倍。单用AspC可有一定量的β-消除活性。使用天冬氨酸的结果表明色氨酸酶对天冬氨酸的活性不随前述β-酪氨酸酶同样的定点诱变而增加。预期突变型β-酪氨酸酶具有较高的产生莫那甜的活性。
                            实施例9
化学合成莫那甜
向吲哚-3-丙酮酸中加入丙氨酸产生莫那甜，该反应能用Grignard或有机锂试剂合成进行。
例如，在无水条件下向羧基和氨基被适当阻断的3-氯或-3-溴-丙氨酸加入镁。然后加入吲哚-3-丙酮酸(适当阻断的)以形成偶联产物，接着去除保护基团以形成莫那甜。特别有用的保护基团包括THP(四氢吡喃基醚)，它易连接和去除。
                            实施例10
检测色氨酸、莫那甜和MP
该实施例描述用于检测莫那甜或其前体2-羟基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸的存在的方法。
LC/MS分析
用Waters/Micromass液相色谱-串联质谱(LC/MS/MS)仪对从体外或体内生化反应获得的莫那甜、MP和/或色氨酸的混合物进行分析，所述仪器包括装有Waters996光电二极管阵列(PDA)吸光度检测器的Waters 2690液相色谱，它串联置于色谱与Micromass Quattro Ultima三重四极质谱仪间。LC分离用Supelco Discovery C18反相色谱柱，2.1mm×150mm或Xterra MS C8反相色谱柱，2.1mm×250mm于室温进行。LC流动相由A)含0.05％(v/v)三氟乙酸的水和B)含0.05％(v/v)三氟乙酸的甲醇组成。
梯度洗脱是从5％B到35％B线性洗脱，0-9分钟；从35％B到90％B线性洗脱，9-16分钟；在90％B等溶剂洗脱，16-120分钟；从90％B到5％B线性洗脱，20-22分钟；每次洗脱之间再平衡10分钟。流速是0.25mL/分钟，监测200nm到4000nm的PDA吸光度。基于感兴趣的分析物的质子化分子离子([M+H]+)的生成和特征性片段离子的产生来最优化和选择所有ESI-MS参数。
下列仪器参数用于莫那甜的LC/MS分析：毛细管：3.5kV；圆锥：40V；Hex 1：20V；孔径：0V；Hex 2：0V；源温度：100℃；去溶剂化温度：350℃；去溶剂化气体：500L/h；圆锥气体：50L/h；低质量分辨率(Q1)：15.0；高质量分辨率(Q1)：15.0；离子能量：0.2；进入：50V；碰撞能量：2；出口：50V；低质量分辨率(Q2)：15；高质量分辨率(Q2)：15；离子能量(Q2)：3.5；倍增器：650。所报道的质荷比(m/z)和分子量的不确定性为±0.01％。使用所收集的m/z150-400区的质谱用LC/MS检测实现对混合物中α-酮酸形式的莫那甜(MP)和莫那甜的初步检测。所选择的质子化分子离子的离子色谱(MP为[M+H]+＝292，莫那甜为[M+H]+＝293)可直接鉴定混合物中的这些分析物。
MS/MS分析
对莫那甜进行如下的LC/MS/MS子离子实验。子离子分析包括将感兴趣的母离子(如对于莫那甜，m/z＝293)从第1个质量分析器(Q1)传送到质谱的碰撞小室，在该处导入氩气并使母离子化学解离成片段(子)离子。随后用第2个质量分析器(Q2)检测这些片段离子，这些片段离子可用于确证母离子结构分配。
下列仪器参数用于莫那甜的LC/MS/MS分析：毛细管：3.5kV；圆锥：40V；Hex 1：20V；孔径：0V；Hex 2：0V；源温度：100℃；去溶剂化温度：350℃；去溶剂化气体：500L/h；圆锥气体：50L/h；低质量分辨率(Q1)：15.0；高质量分辨率(Q1)：15.0；离子能量：0.2；进入：-5V；碰撞能量：14；出口：1V；低质量分辨率(Q2)：15；高质量分辨率(Q2)：15；离子能量(Q2)：3.5；倍增器：650。
高通量测定莫那甜和色氨酸
对得自体外和体内反应的莫那甜和色氨酸的混合物的高通量分析(＜5分钟/样品)用上述仪器进行，参数与LC/MS/MS所述相同。LC分离用4.6mm×50mmAdvanced Separation Technologies Chirobiotic T柱于室温进行。LC流动相由A)含0.25％乙酸的水；B)含0.25％乙酸的甲醇组成。用50％B等溶剂洗脱0-5分钟。流速为0.6mL/min。基于色氨酸和内标2H5-色氨酸的质子化分子离子的最佳来源产生和用于多反应检测(MRM)实验的碰撞诱导的氨基酸特异性片段离子的产生，最优化和选择ESI-MS/MS系统的所有参数被(表1)。下列仪器参数用于莫那甜和色氨酸的LC/MS/MS分析：毛细管：3.5kV；圆锥：20V；Hex 1：15V；孔径：1V；Hex 2：0V；源温度：100℃；去溶剂化温度：350℃；去溶剂化气体：500L/h；圆锥气体：40L/h；低质量分辨率(Q1)：12.0；高质量分辨率(Q1)：12.0；离子能量：0.2；进入：-5V；碰撞能量：14；出口：1V；低质量分辨率(Q2)：15；高质量分辨率(Q2)：15；离子能量(Q2)：0.5；倍增器：650。MRM参数：信道间延迟：0.03s；扫描间延迟：0.03s；驻留：0.05s。
莫那甜的精确质量测量
使用Applied Biosystems-Perkin Elmer Q-Star杂合四极/飞行时间质谱仪进行高分辨的MS分析。质子化莫那甜的测量质量用色氨酸作为内部质量校验标准。基于C14H17N2O5的元素组成，质子化莫那甜的计算质量是293.1137。用实施例A所述生物催化法产生的莫那甜的测量质量为293.1144。此质量测量误差小于每百万分二(2ppm)，确认了酶法产生的莫那甜的元素组成。
                            实施例11
在细菌中产生莫那甜
该实施例描述了在大肠杆菌细胞中产生莫那甜的方法。本领域技术人员应理解的是类似方法可用于在其它细菌细胞中产生莫那甜。此外，可使用含有莫那甜合成途径中其它基因的载体(图2)。
用于增加大肠杆菌细胞中的色氨酸产量的极限培养基Trp-1+葡萄糖培养基(Zeman等，Folia Microbiol.35：200-4，1990)如下制备。向700mL纳米纯水中加入下列试剂：2g(NH4)2SO4、13.6g KH2PO4、0.2g MgSO4*7H2O、0.01g CaCl2*2H2O和0.5mg FeSO4*7H2O。pH调至7.0，体积增加到850mL，培养基高压灭菌。单独制备50％葡萄糖溶液并无菌过滤。向基础培养基(850mL)中加入40mL，终体积达到1L。
10g/L L-色氨酸溶液在0.1M磷酸钠、pH7中制备并无菌过滤。通常向培养物中加入十分之一体积的以下特定的物质。也制备10％丙酮酸钠溶液并无菌过滤。每升培养物通常使用10mL等份的样品。制备氨苄青霉素(100mg/mL)、卡那霉素(25mg/mL)和IPTG(840mM)贮存液，无菌过滤，使用前保存于-20℃。吐温20(聚氧乙烯20-单月桂酸山梨聚糖)以0.2％(体积/体积)终浓度使用。氨苄青霉素以非致死浓度使用，通常是1-10μg/mL终浓度。
大肠杆菌BL21(DE3)：：睾丸酮丛毛单胞菌proA/pET30Xa/LIC的新鲜平板(实施例4所述)在含50μg/mL卡那霉素的LB培养基上制备。从单菌落中接种过夜培养物(5mL)且于30℃生长在具有卡那霉素的LB培养基中。通常1到50接种物用于trp-1+葡萄糖培养基中的诱导。新鲜抗生素加入至终浓度为50mg/L。诱导前，摇瓶生长于37℃。
每小时细胞取样直至OD600达到0.35-0.8。然后用0.1mM IPTG诱导细胞，并将温度降至34℃。诱导前(零时间点)收集样品(1ml)并于5000×g离心。上清液在-20℃冷冻用于LC/MS分析。诱导后4小时，收集另外的1mL样品，离心分离细胞球与培养液。加入上述的色氨酸、丙酮酸钠、氨苄青霉素和吐温。
诱导后细胞生长48小时，如上收集并制备另1mL样品。在48小时处，加入另一等份的色氨酸和丙酮酸。生长约70小时后(诱导后)，整个培养物于4℃、3500rpm离心20分钟。倒出上清液，培养液和细胞均冷冻于-80℃。过滤培养液部分并通过LC/MS分析。如实施例10所述检测[M+H]+＝293处峰的高度和面积。减去培养基的背景水平。通过绘制[M+H]+＝293的峰高除以600nm处培养物的光密度的图使数据对于细胞生长得到标准化。
当丙酮酸、氨苄青霉素和吐温在诱导后4小时而非在诱导时加入时，产生的莫那甜水平较高。其它添加物如PLP、其它磷酸盐或额外的MgCl2不增加莫那甜产量。当用色氨酸而非吲哚-3-丙酮酸，并且当色氨酸在诱导后而非接种或诱导时加入，获得较高滴度的莫那甜。诱导前和诱导后4小时(底物加入时)，发酵液或细胞提取物中一般没有可检测水平的莫那甜。阴性对照仅用具有pET30a载体的细胞以及未加入色氨酸和丙酮酸的培养物进行。亲代MS扫描证明(m+1)/z＝293的化合物不是来自于较大的分子，子扫描(如实施例10进行)类似于体外制备的莫那甜。
用0、0.2％(体积/体积)和0.6％终浓度的吐温-20来研究吐温的作用。在0.2％吐温时，摇瓶产生的莫那甜量最高。氨苄青霉素浓度在0和10μg/mL间变化。细胞培养液中的莫那甜的量在0和1μg/mL间迅速增加(2.5倍)，并且当氨苄青霉素浓度从1增加到10μg/mL时，莫那甜量增加了1.3倍。
图10显示了表现出典型结果的时程实验。甚至使值对于细胞生长得到标准化时，分泌到细胞培养液的莫那甜量增加。通过使用色氨酸的摩尔消光系数，培养液中的莫那甜量估计小于10μg/mL。用含有无proA插入物的载体的细胞重复同一实验。许多数值为负，这表明这些培养物中m/z＝293处的峰高度小于单用培养基的峰高(图10)。当缺乏色氨酸和丙酮酸时，数值均较低，说明莫那甜产生是醛缩酶催化酶反应的结果。
在800mL摇瓶实验和发酵罐中重复莫那甜在细菌细胞中的体内产生。通过阴离子交换层析和反相制备液相色谱纯化250mL莫那甜样品(在无细胞的培养液中)。蒸发该样品并用于高分辨质量分析(如实施例6所述)。高分辨MS表明产生的代谢物是莫那甜。
体外测定说明转氨酶需要以高于醛缩酶的水平存在(参见实施例6)，因此大肠杆菌的天冬氨酸转氨酶超量表达并联合醛缩酶基因以增加所产生的莫那甜的量。引物设计为将睾丸酮丛毛单胞菌proA导入有aspC/pET30Xa/LIC的操纵子，其为如下所示：5’引物：ACTCGGATCCGAAGGAGATATACATATGTACGAACTGGGACT(SEQ ID NO：67)和3’引物：CGGCTGTCGACCGTTAGTCAATATATTTCAGGC(SEQ ID NO：68)。5’引物包含BamHI位点，3’引物包含用于克隆的SalI位点。PCR如实施例4所述进行并凝胶纯化。aspC/pET30Xa/LIC构建物与PCR产物均用BamHI和SalI消化。消化物用Qiagen自旋柱纯化。按照厂商说明用Roche快速DNA连接试剂盒(Indianapolis，IN)将proA PCR产物连接到载体。如实施例1所述用Novablues Singles(Novagen)进行化学转化。菌落在含50mg/L卡那霉素的LB培养基中生长并且用Qiagen spin miniprep试剂盒纯化质粒DNA。通过限制酶消化分析筛选克隆并通过Seqwright(Houston，TX)确定序列。构建物亚克隆入BLR(DE3)、BLR(DE3)pLysS、BL21(DE3)和BL21(DE3)pLysS(Novagen)。ProA/pET30Xa/LIC构建物也转化入BL21(DE3)pLysS。
在上述标准条件下对BLR(DE3)摇瓶样品的初步比较证明加入第2个基因(aspC)使莫那甜的产量提高7倍。为加速生长，使用BL21(DE3)-衍生的宿主菌株。proA克隆和2个基因操纵子克隆在上述Trp-1培养基以及加入培养基的具有氯霉素(34mg/L)的pLysS宿主中诱导。加入和不加入0.2％吐温-20和1mg/L氨苄青霉素进行摇瓶实验。用体外产生的纯化的莫那甜为标准品来计算培养液中莫那甜的量。SRM分析如实施例10所述进行。在生长0、4小时、24小时、48小时、72小时和96小时处进行细胞取样。
培养液中产生的最大量的结果示于表5。在大多数情况下，2个基因构建物得到高于单用proA构建物的值。虽然具有更易渗漏的细胞被膜的pLysS菌株的生长速度一般较慢，其分泌的莫那甜水平较高。加入吐温和氨苄青霉素有益。
                                     表4
                            大肠杆菌产生的莫那甜量
  构建物   宿主   吐温+Amp   μg/mL莫那甜   时间
  proA   BL21(DE3)   -   0.41   72小时
  proA   BL21(DE3)   +   1.58   48小时
  proA   BL21(DE3)pLysS   -   1.04   48小时
  proA   BL21(DE3)pLysS   +   1.60   48小时
  aspC：proA   BL21(DE3)   -   0.09   48小时
  aspC：proA   BL21(DE3)   +   0.58   48小时
  aspC：proA   BL21(DE3)pLysS   -   1.39   48小时
  aspC：proA   BL21(DE3)pLysS   +   6.68   48小时
                            实施例12
酵母中莫那甜的产生
该实施例描述用于在真核细胞中产生莫那甜的方法。本领域技术人员应理解的是类似方法可用于在任何感兴趣细胞中产生莫那甜。此外，可使用除了该实施例所述以外的其它基因(例如列于图2的)，或择一而用。
pESC酵母表位标记载体系统(Stratagene，La Jolla，CA)用于将大肠杆菌aspC和睾丸酮丛毛单胞菌proA基因克隆和表达入酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中。pESC载体在相反链上包含具有2个不同的多克隆位点的GAL1和GAL10启动子，使得可同时表达2个基因。pESC-His载体也含有用于补充宿主(YPH500)中的组氨酸营养缺陷型的His3基因。GAL1和GAL10启动子受葡萄糖抑制且由半乳糖诱导；Kozak序列用于使酵母中的表达最优化。PESC质粒是能在大肠杆菌中产生初始构建物(具有bla基因用于选择)的穿梭载体；然而，多克隆位点中没有细菌核糖体结合位点。
设计下列引物用于克隆入pESC-His(加下划线的是限制性位点，Kozak序列以黑体显示)：aspC(BamHI/SalI)，GAL1：5’-CGC GGATCCATAATGGTTGAGAACATTACCG-3’(SEQ ID NO：69)和5’-ACGC GTCGACTTACAGCACTGCCACAATCG-3’(SEQ ID NO：70)。proA(EcoRI/NotI)，GAL10：5’CCG GAATTCATAATGGTCGAACTGGGAGTTGT-3’(SEQ ID NO：71)和5’-GAA TGCGGCCGCTTAGTCAATATATTTCAGGCC-3’(SEQID NO：72)。
由于导入Kozak序列，两种成熟蛋白的第2个密码子从芳族氨基酸变成缬氨酸。用实施例1和实施例4所述克隆的pET30Xa/LIC miniprep DNA作为模板扩增感兴趣的基因。使用Eppendorf Master循环梯度热循环仪和以下用于50μL反应的方案进行PCR：1.0μL模板、1.0μM各种引物、0.4mM各种dNTP、3.5U扩增高保真聚合酶(Roche，Indianapolis，IN)和有Mg的1×ExpandTM缓冲液。热循环仪使用的程序包括94℃、5分钟的热启动，然后94℃、30秒，50℃、1分钟45秒，72℃、2分钟15秒，重复29轮。29轮后，样品在72℃维持10分钟，随后贮存于4℃。通过在1％TAE-琼脂糖凝胶上分离来纯化PCR产物，然后用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)回收。
pESC-His载体DNA(2.7μg)如上述用BamHI/SalI消化并用凝胶纯化。aspC PCR产物用BamHI/SalI消化并用QIA快速PCR纯化柱纯化。用Roche快速DNA连接试剂盒按照厂商的方案进行连接。根据厂商的说明，使用附加脉冲控制器的Biorad基因脉冲器II在0.2cm Biorad一次性比色皿中将脱盐的连接物电穿孔入40μlElectromasx DH10B感受态细胞(Invitrogen)。在1mL SOC培养基中恢复1小时后，转化子培养于含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基平板上。用QIAprep SpinMiniprep试剂盒制备用于克隆的质粒DNA。质粒DNA通过限制酶切消化筛选，使用为载体设计的引物来测序(Seqwright)确认。
aspC/pESC-His克隆和proA PCR产物用EcoRI和NotI消化。DNA如上述纯化和连接。2个基因构建物转化入DH10B细胞并经限制酶切消化和DNA测序筛选。
用S.c.EasyCompTM转化试剂盒(Invitrogen)将构建物转化入酿酒酵母菌株YPH500。转化反应物在含2％葡萄糖的SC-His极限培养基(Invitrogen pYES2手册)上平板培养。通过使用上述PCR引物的菌落PCR筛选每个酵母菌落中proA和aspC基因的存在。结球的细胞(2μl)悬浮于20μL含1μl消解酶的Y-裂解缓冲液(ZymoResearch)并于37℃加热10分钟。随后4μL该悬浮液用于使用上述PCR反应混合物和程序的50μL PCR反应中。
5mL培养物在SC-His+葡萄糖中以30℃和225rpm生长过夜。逐步调整细胞在棉子糖上的生长以将半乳糖诱导前的滞后期减至最小。生长约12小时后，测量600nm的吸光度，取适当体积的细胞重悬浮于新鲜SC-His培养基中以产生0.4的OD。依次使用下列碳源：1％棉子糖+1％葡萄糖，0.5％葡萄糖+1.5％棉子糖，2％棉子糖和最后的1％棉子糖+2％半乳糖来诱导。
诱导培养基中生长约16小时后，50mL培养物分成双份25mL培养物，以下物质仅加入双份培养物之一：(终浓度)1g/L L-色氨酸，5mM磷酸钠、pH7.1，1g/L丙酮酸钠，1mM MgCl2。保存非诱导培养基和加入用于莫那甜途径的底物之前16小时培养物的培养液和细胞球的样品作为阴性对照。此外，仅含功能性aspC基因(和截短的proA基因)的构建物用作另一种阴性对照。细胞可在诱导后总共生长69小时。酵母细胞偶尔在较低OD诱导，在加入色氨酸和丙酮酸前仅生长4小时。然而，这些莫那甜底物似乎抑制生长并且在较高OD时加入更有效。
按照厂商的方案使用5mL YeastBusterTM+50μl THP(Novagen)每克(湿重)细胞加上前面例子所述的蛋白酶抑制剂和benzonase核酸酶来裂解培养物的细胞球。过滤培养液和细胞提取物并用实施例10所述SRM分析。使用该方法，培养液样品中没有检测到莫那甜，表明在这些条件下细胞不能分泌莫那甜。在这些条件下，质子动力可能不足或一般的氨基酸转运子可为色氨酸所饱和。蛋白表达不是在可用SDS-PAGE检测出变化的水平。
当色氨酸和丙酮酸加入培养基时，具有2个功能基因的培养物的细胞提取物中可短暂检测到莫那甜(约60μg/mL)。任何阴性对照细胞提取物中未检测到莫那甜。使用实施例6所述最优化测定用4.4mg/mL总蛋白(约为通常用于大肠杆菌细胞提取物的两倍)在体外进行2次莫那甜测定。加入32μg/mL睾丸酮丛毛单胞菌ProA醛缩酶或400μg/mL AspC转氨酶进行其它测定以确定哪个酶在细胞提取物中是有限的。不加酶或仅加AspC转氨酶(无酶时在一定程度上可发生醛醇缩合)来进行阴性对照。阳性对照用使用16μg/mL醛缩酶和400μg/mL转氨酶的部分纯化的酶(30-40％)进行。
体外结果经SRM分析。对细胞提取物的分析显示当色氨酸在诱导后加入培养基时，它被有效转运入细胞，导致色氨酸水平比没有额外加入色氨酸的高两个数量级。体外莫那甜分析的结果示于表6(数值表示ng/mL)。
                                           表5
                               用酵母细胞提取物产生的莫那甜
  aspC构建物 +醛缩酶 +AspC   二基因构建物   +醛缩酶 +AspC
  抑制(葡萄糖培养基)   0   888.3   173.5   0   465.2   829
  24小时诱导   0   2832.8   642.4   0   1375.6   9146.6
  69小时诱导   0   4937.3   340.3   71.9   1652.8   23693.5
  69小时+底物   0   556.9   659.1   21.9   755.6   16688.2
  +对照(纯化的酶)   21853   21853
  -对照(无酶)   0   254.3   0   254.3
使用整个二基因构建物细胞提取物无论向生长培养基中加入和不加底物均获得阳性结果。这些结果与阳性对照相比，表明酶以接近酵母中1％总蛋白的水平表达。当用醛缩酶测定aspC构建物(截短的proA)的细胞提取物时，产生的莫那甜量明显大于单用细胞提取物测定的，表明重组AspC转氨酶含有约1-2％酵母总蛋白。当用醛缩酶测定时，由于细胞中存在天然转氨酶，未诱导培养物的细胞提取物具有少量活性。当用AspC转氨酶测定时，未诱导细胞的提取物活性增加到使用AspC的阴性对照生成的莫那甜量(大约200ng/ml)。相反，当测定二基因构建物细胞提取物时，补充转氨酶的观察到的活性比加入醛缩酶的增加更多。由于2个基因都应以相同水平表达，表明当转氨酶水平高于醛缩酶水平时产生的莫那甜量最大，这与实施例6所示结果一致。
加入丙酮酸和色氨酸不仅抑制细胞生长，也明显抑制蛋白表达。加入pESC-Trp质粒可用于纠正YPH500宿主细胞的色氨酸营养缺陷型，是一种提供色氨酸而对生长、表达和分泌影响较少的方法。
                            实施例13
采用偶联反应改进酶方法
理论上，如果没有副反应或底物降解或中间体的产生，图1所示酶反应中形成的最大产物量直接与各反应的平衡常数、色氨酸和丙酮酸的浓度成比例。色氨酸不是高度可溶的底物，并且大于200mM的丙酮酸浓度似乎对产量有不利影响(参见实施例6)。
为降低分离成本，莫那甜浓度最好相对于底物最大。可进行物理分离，如此莫那甜可从反应混合物中移出并防止逆反应发生。然后可再生原料和催化剂。由于莫那甜在大小、电荷和疏水性方面与其它一些试剂和中间体类似，物理分离困难，除非有对莫那甜的亲和性高的技术，例如亲和层析技术。然而，莫那甜反应可偶联其它反应，使得系统的平衡移向莫那甜产生。以下是改进从色氨酸或吲哚-3-丙酮酸获得莫那甜产量的方法的例子。
采用草酰乙酸脱羧酶(EC 4.1.1.3)的偶联反应
图11是该反应的示意图。色氨酸氧化酶和过氧化氢酶用于驱动反应向产生吲哚-3-丙酮酸的方向进行。过量使用过氧化氢酶从而使得过氧化氢不能以相反方向反应或者损害酶或中间体。氧在过氧化氢酶反应期间再生。此外，吲哚-3-丙酮酸可用作底物。
天冬氨酸用作MP胺化的氨基供体，并使用天冬氨酸转氨酶。与MP至莫那甜的反应相比，最好使用对色氨酸/吲哚-3-丙酮酸反应特异性低的转氨酶，如此天冬氨酸不用于再次胺化吲哚-3-丙酮酸。可加入草酰乙酸脱羧酶(来自假单胞菌属)将草酰乙酸转化成丙酮酸和二氧化碳。由于CO2是挥发性的，它不能用于与酶反应，可减少或甚至防止逆反应。此步骤中产生的丙酮酸也可用于醛醇缩合反应。可使用其它脱羧酶，已知的同系物存在于伴放线放线杆菌(A.actinomycetemcomitans)、风产液菌(Aquifex aeolicus)、闪烁古生球菌(Archaeoglobus fulgidus)、棕色固氮菌、脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)、一些博德特氏菌属(Bordetella)、空肠弯曲杆菌(C.jejuni)、微温绿菌(Chlorobium tepidum)、橙色绿屈挠菌(Chloroflexus aurantiacus)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、具核梭杆菌(F.nucleatum)、肺炎克氏杆菌(Klebsiellapneumoniae)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)、磁球菌(Magnetocuccus)MC-1、溶血曼海米亚菌(Mannheimia haemolytica)、鞭毛甲基杆菌KT(Methylobacillusflagellatus KT)、多杀巴斯德氏菌(P.Multocida)Pm70、微热石袍菌(Petrotogamiotherma)、牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)、一些假单胞菌属、一些火球菌属(Pyrococcus)、红球菌属(Rhodococcus)、一些沙门氏菌属(Salmonella)、一些链球菌属(Streptococcus)、微温热着色菌(Thermochromatium tepidum)、海栖热袍菌(Thermotoga maritima)、梅毒密螺旋体(Treponema pallidum)和一些弧菌属(Vibrio)种。
用大肠杆菌的天冬氨酸转氨酶(AspC)、大肠杆菌的酪氨酸转氨酶(TyrB)、硕大利什曼原虫的广谱底物转氨酶(BSAT)和两个实施例1所述市售可得的猪谷氨酸-草酰乙酸转氨酶进行色氨酸转氨酶测定。草酰乙酸和α-酮戊二酸作为氨基受体测试。比较使用莫那甜的活性(实施例7)与使用色氨酸的活性之比来确定哪一个酶对莫那甜转氨酶反应的特异性最高。这些结果表明相对于色氨酸反应，对莫那甜反应特异性最高的酶是猪II-A型谷氨酸-草酰乙酸转氨酶GOAT(Sigma G7005)。此特异性不取决于使用哪一个氨基受体。因此，此酶用于使用草酰乙酸脱羧酶的偶联反应。
始于吲哚-3-丙酮酸的典型反应物包括(终浓度)50mM Tris-Cl、pH7.3，6mM吲哚-3-丙酮酸，6mM丙酮酸钠，6mM天冬氨酸，0.05mM PLP，3mM磷酸钾，3mMMgCl2，25μg/mL转氨酶，50μg/mL睾丸酮丛毛单胞菌ProA醛缩酶和3单位/mL脱羧酶(Sigma O4878)。反应可在26℃进行1小时。在一些情况中，省去脱羧酶或用α-酮戊二酸取代天冬氨酸(作为阴性对照)。也测试了取代GOAT的上述转氨酶以证实以前的特异性实验。过滤样品并如实施例10所述用LC/MS分析。结果证明GOAT酶法产生了的莫那甜每mg蛋白的量最高，而作为副产物的色氨酸的产生量最少。此外，加入脱羧酶可增加2-3倍。与其它转氨酶相比，大肠杆菌AspC酶也产生大量的莫那甜。
提高莫那甜产量可通过：1)定期加入2mM吲哚-3-丙酮酸、丙酮酸和天冬氨酸(每半小时到1小时)，2)在厌氧环境中或有脱气缓冲液的情况下进行反应，3)将反应进行过夜，和4)使用没有多次冻融的新鲜制备的脱羧酶。丙酮酸浓度＞12mM会抑制脱羧酶。吲哚-3-丙酮酸浓度高于4mM时，与吲哚-3-丙酮酸的副反应加速。如果醛缩酶量也增加，用于反应的吲哚-3-丙酮酸的量可增加。高水平的磷酸盐(50mM)和天冬氨酸(50mM)发现可抑制脱羧酶。在1小时反应中，加入的脱羧酶量可减少到0.5U/mL而不降低莫那甜产量。当温度从26℃提高到30℃以及从30℃提高到37℃时，莫那甜的产量增加；然而，37℃时吲哚-3-丙酮酸的副反应也加速。莫那甜的产量随pH从7增加到7.3而增加，并且在pH7.3-7.8相对稳定。
始于色氨酸的典型反应物包括(终浓度)50mM Tris-Cl、pH7.3，20mM色氨酸，6mM天冬氨酸，6mM丙酮酸钠，0.05mM PLP，3mM磷酸钾，3mM MgCl2，25μg/mL转氨酶，50μg/mL睾丸酮丛毛单胞菌ProA醛缩酶和4单位/mL脱羧酶，5-200mU/mLL-氨基酸氧化酶(Sigma A-2805)，168U/mL过氧化氢酶(Sigma C-3515)和0.008mgFAD。反应于30℃进行30分钟。加入脱羧酶观察到提高。当使用50mU/mL氧化酶时，产生莫那甜的量最大。所观察到的提高类似于将吲哚-3-丙酮酸用作底物的。此外，当1)色氨酸水平低(即低于转氨酶的Km从而不能与MP竞争活性位点)，和2)氧化酶与醛缩酶和转氨酶之比维持于吲哚-3-丙酮酸不能积聚的水平时，产生的莫那甜量增加。
无论始于吲哚-3-丙酮酸还是色氨酸，当使用2-4倍量的所有酶而维持同一酶比例时，1-2小时孵育时间的测定中产生的莫那甜量增加。使用任一底物达到的莫那甜浓度约1mg/mL。如果始于吲哚-3-丙酮酸，产生的色氨酸量一般低于产物量的20％，这说明了使用偶联反应的好处。随着对中间体浓度和副反应的进一步最优化及控制，可极大提高产率和产量。
采用赖氨酸ε转氨酶(EC 2.6.1.36)的偶联反应
在一些生物中发现赖氨酸ε转氨酶(L-赖氨酸6-转氨酶)，包括红球菌、分枝杆菌(Mycobacterium)、链霉菌(Streptomyces)、诺卡氏菌(Nocardia)、黄杆菌、产朊假丝酵母(Candida.utilis)和链霉菌。这些生物利用该酶作为产生一些β-内酰胺抗生素的第一步中(Rius和Demain，J.Microbiol.Biotech.，7：95-100，1997)。该酶利用α-酮戊二酸作为氨基受体，通过PLP-介导的赖氨酸的C-6转氨作用将赖氨酸转化成L-2-氨基己二酸6-半醛(ε-醛赖氨酸)。ε-醛赖氨酸不稳定且自发经过分子内脱水形成1-哌啶6-羧酸盐，一种环状分子。这有效抑制任何逆反应发生。图12描述反应流程。也能使用其它酶--赖氨酸-丙酮酸6-转氨酶(EC 2.6.1.71)。
1mL典型反应物包括：50mM Tris-Cl、pH7.3，20mM吲哚-3-丙酮酸，0.05mMPLP，6mM磷酸钾、pH8，2-50mM丙酮酸钠，1.5mM MgCl2，50mM赖氨酸，100μg转氨酶(赖氨酸ε转氨酶LAT-101，BioCatalytics Pasadena，CA)和200μg睾丸酮丛毛单胞菌ProA醛缩酶。产生的莫那甜量随丙酮酸浓度增加而增加。使用这些反应条件(50mM丙酮酸)的最大量比用草酰乙酸脱羧酶(约0.1mg/mL)的偶联反应观察到的低10倍。
[M+H]+＝293处峰在莫那甜的预计时间洗脱并且质谱包含几种用其它酶方法观察到的相同片段。有正确质荷比(293)的第2个峰的洗脱时间稍早于实施例6中产生的S，S莫那甜通常观察到，表明可能存在另一种莫那甜异构体。该酶法产生的色氨酸很少。然而，可能对丙酮酸有一些活性(产生丙氨酸作为副产物)。同样，该酶已知不稳定。可通过定向进化实验来改进以增加稳定性，减少与丙酮酸的活性并提高与MP的活性。这些反应也能与上述L-氨基酸氧化酶/过氧化氢酶偶联。
其它偶联反应
图13显示了另一种能提高来自色氨酸或吲哚-3-丙酮酸的莫那甜产量的偶联反应。甲酸脱氢酶(EC 1.2.1.2或1.2.1.43)是常见的酶。一些甲酸脱氢酶需要NADH而另一些能利用NADPH。谷氨酸脱氢酶在前面的例子中使用基于铵的缓冲液催化莫那甜前体和莫那甜间的相互转化。有甲酸铵和甲酸脱氢酶是辅因子再生的有效系统，并且二氧化碳的产生是降低逆反应速度的有效方法(Bommarius等，Biocatalysis10：37，1994和Galkin等，Appl.Environ.Microbiol.63：4651-6，1997)。此外，大量甲酸铵能溶于反应缓冲液。加入甲酸脱氢酶和甲酸铵可提高谷氨酸脱氢酶反应(或类似的还原性胺化)产生的莫那甜产量。
其它方法能用于驱动平衡趋向于产生莫那甜。例如，如果氨基丙烷在用Ω-氨基酸转氨酶(EC 2.6.1.18)，例如美国专利5,360,724和5,300,437所述，将MP转化成莫那甜中用作氨基酸供体，所得产物之一可是丙酮，一种比底物，氨基丙烷更易挥发的产物。可定期短时提高温度以急骤蒸出丙酮，藉此缓解平衡。丙酮的沸点为47℃，在该温度如果使用时间短不会降解中间体。大部分对α-酮戊二酸有活性的转氨酶也对莫那甜前体有活性。类似地，如果乙醛酸/芳族酸转氨酶(EC 2.6.1.60)与作为氨基供体的甘氨酸一起使用，相比于甘氨酸，产生的乙醛酸不稳定且沸点低很多。
                            实施例14
使用列于表6中的成分制备草莓香味的口香糖组合物。莫那甜的R，R异构体可替代丁磺氨K和莫那甜的S，S异构体。
             表6
  成分   ％(重量比)
  胶基   20
  甘油   3
  葡萄糖   8
  卵磷脂   0.5
  草莓水果调味剂   1
  红色色素   0.07
  糖   47.13
  菊粉或聚糊精填料   19.65
  丁磺氨K   0.15
  S，S莫那甜   0.5
  总量   100.0
胶基是30％的萜烯树脂、15％氢化的棉籽油、2％的卵磷脂、2.5％的聚丁烯、27％聚乙酸乙烯酯、12.45％的碳酸钙、11％的异丁烯-异戊二烯共聚物和0.05％的BHT。
胶基预热、加入sigma-浆叶搅拌器并搅拌直至变得软而柔韧。山梨醇溶液和甘油加热至50℃并与剩余的成分一起加入混合器。混合完成后，口香糖碾成1.5mm厚、撒上滑石粉、切割并包装。
与含有除莫那甜以外的高强度甜味剂的类似口香糖组合物相比，期望含有莫那甜的该口香糖组合物中的草莓香味更浓并且甜味可持续更长时间。
实施例15：含有莫那甜的口香糖配方及其制备方法
以下是含有莫那甜的口香糖组合物几个示范性例子以及加工该组合物的示范性方法。
配方A
200g胶基
340g山梨醇粉末(Cerestar P16616)
7g白垩
3.6g麦芽糖醇糖浆(浓缩至80白利糖度的Cerestar 16303)
2g薄荷醇
1.5g S，S莫那甜
配方B
200g胶基
340g山梨醇粉末(Cerestar P16616)
7g白垩
3.6g麦芽糖醇糖浆(浓缩至80白利糖度的Cerestar 16303)
2g薄荷醇
0.05g R，R莫那甜
配方C
200g胶基
340g山梨醇粉末(Cerestar P16616)
7g白垩
3.6g麦芽糖醇糖浆(浓缩至80白利糖度的Cerestar 16303)
2g薄荷醇
0.038g S，S莫那甜
0.038g R，R莫那甜
配方D
320g胶基
400g山梨醇粉末(Cerestar P16616)
100g麦芽糖醇糖浆(Cerestar 16303)
40g甘露醇(Cerestar 16700)
10g异麦芽糖
14g薄荷醇
18g薄荷香料
1g S，S莫那甜
1g丁磺氨K
0.075g R，R莫那甜
配方E
200g胶基
400g山梨醇(晶体)
46g麦芽糖醇糖浆(80％ds)
加上2％樱桃香精+0.02％R，R莫那甜
配方F
211g无糖胶基
420g山梨醇
14g甘油
加上2％香精+0.2％S，S莫那甜+0.015％R，R莫那甜
配方G
270g胶基
340g山梨醇
34g山梨醇糖浆(70％ds)
加上2％香精+0.15％S，S莫那甜+0.05％R，R莫那甜
配方H
300g胶基
550g赤藓醇
100g麦芽糖醇糖浆
49.5g甘油
0.5g S，S莫那甜
如何加工口香糖：
通过挤出制造胶基并置于水浴冷却和固化。约1/2cm见方的小球保存待用。小球使用Z搅拌器(高剪切力)混合，并将温度升至60℃来软化混合物。如果胶基中无滑石粉则加入。在混合的同时依次分批加入结晶的甜味剂(例如，山梨醇)和软化剂/增塑剂(例如，液体山梨醇、液体麦芽糖醇或甘油)以防止搅拌器马达过热。加入香料、色素和甜味剂并混合。从搅拌器中取出混合物，典型的每批大小是几百公斤。混合物推过使之均匀化并使口香糖成形的挤压机。擀平片状物并切割，每片包装为条状口香糖或包衣为球状口香糖。
实施例16：制备无糖口香糖的配方与方法
一种示范性配方：
  成分   ％(w/w)
  无糖胶基   24.500
  山梨醇溶液   16.100
  薄荷香精   1.500
  甘油   2.800
  莫那甜   按需加入
  山梨醇粉末   54.800
示范性制备方法：
1.在微波炉中预热胶基，然后加入Z-浆叶混合器中丙混合直至变软和柔韧。
2.在微波炉中将山梨醇溶液和甘油加入至50℃。
3.将所有剩余部分加入Z-搅拌器。混合20分钟，每5分钟检查混合的温度。
4.混合结束后，将口香糖从混合器中取出并碾为1.5mm厚。撒上滑石粉、切割并包装。
实施例17：评价莫那甜
在冰茶中评价含有R，R莫那甜或R，R莫那甜/赤藓醇组合的莫那甜制品与已知的其它甜味剂(天冬甜素和三氯蔗糖)。所评价的关键的感官参数包括甜味质量、回味、苦味及其回味。进行了定量评价。
产品制品—冰茶
开发了一种冰茶制品来评价甜味剂性能(表7)。
表7.冰茶制品
  成分   供应商   浓度(w/v)
  柠檬酸   0.200
  柠檬酸钠   0.020
  茶叶提取物‘Assam’285002   Plantextrakt   0.150
  天然红茶香料提取物31108304010000   Rudolph Wild   0.050
  苯甲酸钠(20％w/w)   0.075
  甜味剂   视需要加入
  水   补充至体积
甜味剂按以下浓度加入：
天冬甜素             0.0450％(w/v)
三氯蔗糖             0.0170％(w/v)
R，R莫那甜           0.0030，0.0035，0.0040％(w/v)加上1g麦芽糖糊精
R，R莫那甜/赤藓醇    0.0030，0.0035，0.0040％(w/v)加上1g赤藓醇
感官评价
由一组(n＝6)有经验的感觉评价人员来评价这些冰茶饮品。这些评价的结果总结于表9。
表8.茶的感官评价(提供的量为200ml)
  产品   甜味剂/浓度   意见
  冰茶   天冬甜素/450ppm   暂时特征良好，尽管天冬甜素的典型味道非常明显。均衡的，但茶味淡。无味道增强的证据。
  “   三氯蔗糖/170ppm   甜味出现延迟，这意味着第一感觉是酸味。因为甜味特性与酸味或香味特性不匹配，故而产品的香味和总体印象不均衡。
  “   莫那甜(40ppm)+麦芽糊精(1g)(0.5％)   甜味和香味特性非常均衡。注意到柠檬香味明显比其它甜味剂强。
  “   莫那甜(40ppm)+赤藓醇(1g)(0.5％)   甜味和香味特性均衡。注意到柠檬香味甚至比单用莫那甜/麦芽糊精的更强。回味中的涩味极大降低/消除。
讨论
莫那甜能给甜味剂制品带来意想不到的益处，包括明显的感官益处。当用于冰茶尤其是酸化的茶(即加入柠檬)中，莫那甜增强了柠檬的香味。加入低浓度的赤藓醇可进一步增加这种益处，而赤藓醇能使香味均衡且萦绕并加速甜味开始的时间。在饮料中，例如茶，莫那甜带来改进的感官特性(例如，较少的回味、较少的怪味)和/或改进的溶解性和稳定特性。用于冰茶的莫那甜几乎不含卡路里，而用于加糖冰茶中的2茶匙(约8克)蔗糖却含有32卡路里。
期望口香糖组合物中的莫那甜如同饮料中的一样，相比于天冬甜素或三氯蔗糖可表现出增强的柑桔香精并提供更好的甜味的时间/强度特性。还期望口香糖组合物中的莫那甜和赤藓醇的混合物相比于天冬甜素或三氯蔗糖可进一步提高柑桔香精并提供更好的甜味特性。
实施例18：口香糖中莫那甜的评价
介绍
分别加入莫那甜、天冬甜素和三氯蔗糖的口香糖制备成有薄荷香味的条状口香糖形式。这些口香糖制备成相同甜的(iso-sweet)并评估甜味的质量和甜味传递的时间-强度(情况)。
口香糖制品及生产
用于该项评价的制品示于表9。所有三种口香糖制品所采用的标准生产方法如下所述。
表9.口香糖制品
  成分(％；w/w)  APM口香糖   三氯蔗糖口香糖   莫那甜(R，R)口香糖
  山梨醇粉末：P60W  55.6   55.7   55.86
  无糖胶基部分：Valencia T  24.5   24.5   24.5
  Lycasin糖浆(80/55)  16.1   16.1   16.1
  甘油  2.8   2.8   2.8
  薄荷香精：11762-34(Givaudan)  0.7   0.7   0.7
  天冬甜素  0.3
  三氯蔗糖   0.2
  莫那甜(R，R)   0.04
以下是口香糖生产的方法；
·将胶基部分预热至40-45℃，然后加入Z-浆叶混合器并混合
·山梨醇粉末过筛
·取出一部分山梨醇，将甜味剂分散入该部分并彻底混合
·合并甜味剂/山梨醇混合物与剩余的散装山梨醇粉末并彻底混合
·将lycasin与甘油在碗中混合并预热至50℃
·将山梨醇粉末加入装有胶基部分的Z-浆叶混合器
·将lycasin/与甘油加入Z-浆叶混合器并搅拌20分钟
·从Z-浆叶混合器中取出口香糖
·使用机械滚筒碾成1.5mm厚
·以3g滑石粉比100g口香糖的比例撒上滑石粉
·切割成19mm×73mm见方的条状物
·将每个条状物包裹进箔片
感官评价
由一组经训练的感觉评价人员(n＝4)来评价口香糖组合物，这人员在正式的口香糖感官评价中富有经验，包括评价时间/强度参数。评价了口香糖的香味和甜味的质量与临时特性。
该评价的结果示于表10。在这些评价中，莫那甜在口香糖组合物中带来了明显的感官益处，在该组合物中中甜味和香味之间明显的均衡使得可体会到二者最大的感官益处。莫那甜的甜味的时间/强度特性也明显优于天冬甜素或三氯蔗糖。当咀嚼含有莫那甜的口香糖时可感觉到甜味的持续时间明显延长了。
表10.口香糖的感官评价
  时间(直至)   加天冬甜素的口香糖   加三氯蔗糖的口香糖   加莫那甜的口香糖
  30秒   25秒后察觉到甜味，甜味缓慢增加   口香糖一接触舌头立刻感觉到甜味，但香味要较长的时间才释放   甜味缓慢开始，25秒后才觉察到
  2分钟   2分钟时甜味水平良好，但甜味盖过香味   1分钟时甜味水平高。1分50秒时甜味很令人不适   50秒时甜味增加。1分钟时甜味和香味一起增加而不太强2分钟时甜味达到良好的强度而没有令人不适
  6分钟   令人不适的甜味(2分30秒)3分钟时最甜4分钟时香味和甜味水平低5分钟时咀嚼出很少的甜味或香味   2分30秒时甜味盖过香味3分20秒时最甜并且很快开始降低4分40秒时甜味残留极少   3分钟时甜味开始缓慢降低4分40秒后香味和甜味依旧可维持良好的水平
  10分钟   8分钟时口香糖无味并且在口中仅残留少许甜味和香味   8分20秒时咀嚼不出甜味或香味9分40秒时觉察到胶基部分有苦味   6分30秒后咀嚼不出很多甜味但还是可接受的9分钟时口香糖很淡但甜味和香味依旧留于口中
  总体评价   甜味开始得相当慢，但渐渐增加并盖过香味。咀嚼结束时淡而无甜味。   甜味的快速开始和减退使得最后胶基部分的香味残留。本质上，甜味令人非常不适并且易于盖过香味   甜味缓慢开始与增加并且不盖过香味甜味缓慢减退并比天冬甜素或三氯蔗糖持续时间长
实施例19：莫那甜和糖精的甜度剂量应答曲线
用20名经训练的感觉评价人员来评估莫那甜和糖精的甜味，做出的判断要重复进行。用pH3.2的柠檬酸/柠檬酸盐缓冲液制备测试和参考溶液。参见图16。与糖精相比，R，R/S，S莫那甜的应答更呈线形，这与其带来更像蔗糖的味道特征是一致的。高出10％SEV的曲线平稳端说明不存在“混合物抑制的”怪味和回味或其水平低。莫那甜的剂量应答曲线的形状类似于均为“高质量”甜味剂的天冬甜素、三氯蔗糖和阿力甜。
在以R，R/S，S莫那甜作为单一甜味剂的模型系统(pH 3.2)中观察到以下特征：(1)甜味的开始轻微滞后；(2)甜味迅速消退；(3)轻微“天冬甜素样”回味，微甜的回味，回味中无苦味；和(4)在未调味的系统中残留清凉感觉。
实施例20：pH3时莫那甜随温度升高的稳定性
将合成的莫那甜样品置于pH3，25℃、50℃和100℃的环境中。室温pH3时，观察到48小时期间损失14％的莫那甜。这种损失是由于形成内酯。50℃ pH3时，48小时期间损失23％的莫那甜。这种损失是由于形成内酯并在约15.5分钟后有未知化合物累积。100℃ pH3时，24小时期间几乎所有莫那甜都损失了。主要的可检测成分是15.5分钟时的未知化合物。
实施例21：40℃ pH2.5、3.0、4.0时莫那甜和天冬甜素的感官稳定性
对在pH2.5、3.0和4.0制备并储藏于40℃的莫那甜溶液内的感官稳定性进行100天的检测。将这些溶液损失的甜味与在相同条件下制备并储存的天冬甜素溶液损失的甜味进行比较。
储存于40℃之后检测莫那甜(8％SEV，约55ppm，含有约96％的2R，4R/2S，4S对映异构体对和4％的2R，4S/2S，4R对映异构体对的合成混合物)在pH值为2.5、3.0和4.0的磷酸盐/柠檬酸盐缓冲液中的稳定性。比较莫那甜和相同缓冲液中的天冬甜素的(400ppm)的稳定性。用与莫那甜和天冬甜素相同的磷酸盐/柠檬酸盐缓冲液制备三种蔗糖参考溶液。所有制备的溶液避光储存。
缓冲液成分：pH2.5  磷酸(75％溶液)0.127％(w/v)
                   一水合柠檬酸三钠0.005％(w/v)
            pH3.0  磷酸(75％溶液)0.092％(w/v)
       一水合柠檬酸三钠0.031％(w/v)
pH4.0  磷酸(75％溶液)0.071％(w/v)
       一水合柠檬酸三钠0.047％(w/v)
通过一组(n＝8)经训练对甜味评价过程富于经验的感觉评价人员来重复评估两次各种甜味剂相对于蔗糖的甜味。所有的样品(以相同的缓冲液配制)在22℃±1℃时均制备两份。用3个随机数字的代码编号的莫那甜(测试)溶液随机单独提供给评价人员。也提供了以0.5％(w/v)蔗糖的幅度增加的蔗糖参考标准品(4.0-10.0％(w/v)蔗糖)。要求评价人员通过比较测试溶液与蔗糖标准品的甜味来估计甜味。该过程按照喝3次测试溶液、然后喝一次水，接着再喝3次蔗糖标准品，然后再喝一次水等来进行。评价人员将甜味估计至十分位，例如6.8、8.5。评估测试溶液之间有5分钟的休息期间。也要求评价人员仔细漱口并吃饼干以降低任何可能的持续影响。
表11和12给出了在磷酸盐柠檬酸盐缓冲液中进行的稳定性研究的结果。在每个pH与在40℃避光储存100天后，莫那甜甜度的残留百分比大于天冬甜素的残留百分比。在pH4.0时，莫那甜溶液的甜味损失几乎稳定，因为在第17-100天检测到的甜味变化很小，而天冬甜素溶液的甜味却继续损失。
                                    表11
                  莫那甜的感官稳定性：40℃储存100天后的甜味
A.
  pH   时间(天)  SEV莫那甜(％蔗糖)   莫那甜残留的甜味(％)  SEV天冬甜素(％蔗糖)   天冬甜素残留的甜味(％)
  2.5   0  7.35  7.34
  1  6.86   93.3  6.90   94.0
  2  6.70   91.2  6.80   92.6
  3  6.50   88.4  6.60   89.9
  4  6.26   85.2  6.29   85.7
  7  6.08   82.7  6.01   81.9
  8  5.98   81.4  5.98   81.5
  9  5.89   80.1  5.97   81.3
  11  5.78   78.6  5.86   79.8
  50  4.61   62.7  4.19   57.1
  100  2.10   28.6  0.80   10.9
B.
  pH   时间(天)   SEV莫那甜(％蔗糖)   莫那甜残留的甜味(％)  SEV天冬甜素(％蔗糖)   天冬甜素残留的甜味(％)
  3.0   0   7.08   7.15
  1   7.05   99.6   6.90   96.5
  2   6.60   93.2   6.87   96.1
  3   6.47   91.4   6.60   92.3
  4   6.49   91.6   6.43   89.9
  7   6.04   85.3   6.17   86.3
  8   5.93   83.8   5.93   82.9
  9   5.88   83.1   5.94   83.1
  11   5.88   83.1   5.83   81.5
  50   5.12   72.3   4.71   65.9
  100   4.10   57.9   2.20   30.8
C.
  pH   时间(天)   SEV莫那甜(％蔗糖)   莫那甜残留的甜味(％)  SEV天冬甜素(％蔗糖)   天冬甜素残留的甜味(％)
  4.0   0   7.40   7.10
  3   7.08   95.7   6.75   95.1
  8   6.42   86.8   6.23   87.8
  11   6.36   85.9   6.02   84.8
  17   6.10   82.4   5.75   81.0
  24   6.25   84.5   5.85   82.4
  50   6.14   82.9   5.29   74.5
  100   5.80   78.4   4.10   57.7
                    表12
稳定性：40℃在规定的pH储存100天后残留甜味的量
  pH   甜味剂   剩余甜味(％)
  2.5   天冬甜素   11
  2.5   莫那甜   29
  3.0   天冬甜素   31
  3.0   莫那甜   58
  4.0   天冬甜素   58
  4.0   莫那甜   78
由表13可以看出，各种缓冲液可有效维持pH。
              表13
  甜味剂   标称的pH   实际pH(50天后)
  莫那甜   2.5   2.39
  3.0   3.13
  4.0   4.28
  天冬甜素   2.5   2.49
  3.0   3.13
  4.0   4.19
如果假设有伪第一顺序中断反应，则logn保留百分比对时间的图(logn％ RTN v.t)可估算任何给定条件下甜度损失的半衰期(t)和速度常数(k)。如此，莫那甜和天冬甜素甜味损失的动力学总结于表14。
                       表14
  甜味剂   pH  半衰期(t；天)  速度常数(k；天-1)
  莫那甜   2.5  65天  0.011天-1
  3.0  115天  0.006天-1
  4.0  230天  0.003天-1
  天冬甜素   2.5  55天  0.013天-1
  3.0  75天  0.009天-1
  4.0  140天  0.005天-1
40℃在每种pH储存100天后，莫那甜残留的甜味百分比大于天冬甜素残留的百分比。pH4.0时，莫那甜溶液甜味的损失几乎稳定，因为在第17-100天测得的甜度变化很小，而天冬甜素溶液的甜味却继续损失。
莫那甜和天冬甜素的半衰期估计值表明莫那甜的甜味损失速度低于天冬甜素的。pH2.5、3.0和4.0时莫那甜甜味的半衰期估计值分别为65天、115天和230天。相同条件下天冬甜素的半衰期估计值为55天、75天和140天。
因此，40℃在酸性条件下储存时莫那甜可比天冬甜素带来更加稳定的甜味。
实施例22：莫那甜立体异构体的层析
样品制备—在微离心管中放入约50-75μg冻干物质。向其中加入1.0mL HPLC级甲醇。将溶液涡漩搅拌30分钟，离心并取出用于分析的等份上清液。
反相HPLC—用2.1×250mm XterraTM MS C8 5μm(Waters Corporation)HPLC柱进行层析得到两个不同的非对映体峰(R，R/S，S和R，S/S，R)。用Micromass的UltimaTM三重四极质谱仪进行检测。流动相按以下梯度输送：
  时间(分钟)   0   9   16   20   21
  0.05％TFA   A％   95   65   10   10   95
  甲醇，0.05％TFA   B％   5   35   90   90   5
  流速mL/分钟   0.25   0.25   0.25   0.25   0.25
手性HPLC—用250×4.6mm Chirobiotic T(Advanced Separations Technologies，Inc.)HPLC柱进行层析得到两个不同的莫那甜立体异构体(R，R和S，S)。用Micromass的UltimaTM三重四极质谱仪进行检测。流动相由甲醇和0.2％乙酸以及0.05％氨水构成。
质谱(MS/MS)—通过选择性反应检测(SRM)实验检测莫那甜的存在。质子化的莫那甜分子离子([M+H]+)的m/z＝293.3。断裂该分子离子产生将分子离子多次脱水得到的m/z＝257.3的明显的离子。这种转变对莫那甜是非常特异性的并选作用于在SRM实验过程中进行检测的转变(293.3至257.3)。该方法可用于莫那甜的反相和手性分离。
结果—在反相HPLC条件下评价R，S/S，R和S，S/R，R标准样品。通过衍生和酶法拆分制备样品。标准溶液的色谱图示于图17。反相分析后进行手性层析以评估存在于样品中的具体异构体。标准S，S和R，R莫那甜溶液的手性层析示于图18。
实施例23：莫那甜在高温(80℃)和中性pH下的稳定性
使用pH为7的100毫升75ppm的莫那甜溶液作为原液。合成的莫那甜样品含有约96％的2R、4R/2S、4S对映异构体对和4％的2R、4S/2S、4R对映异构体对。在整个试验过程中，将所述样品孵育在80℃和pH7，在0、1、2、3、4小时和1、2、4、7、14、21和35天时取样。所有试验条件均重复一次。
使用LC-MS(使用反相色谱)进行分离和定量
建立合成莫那甜的两个检测到的非对映异构体峰的应答曲线。5-150ppm的范围与溶解在去离子水中的合成莫那甜标准物相等。使用3.9×150mm的NovapakC18(Waters Corporation)HPLC柱来分离两个非对映异构体峰。串联使用紫外-可见(UV)和质谱仪(MS)来进行检测和定量。莫那甜及其内酯的峰分别在279nm处最大紫外吸收，这有助于精确检测。通过正离子电喷模式获得的293.3m/z和275.3m/z的选择性离子检测(SIM)扫描来定量。
结果—在中性pH下，即使在7-35天后莫那甜的降解程度也不明显。由于主要的副产物是环化(副产物)以及可能有极低水平的外消旋作用，莫那甜随时间变化而消失的程度取决于pH。在80℃和pH7的实验过程中，在使用LC-MS定量检测所提供的精度限制内没有检测到外消旋RR/SS莫那甜或其内酯的浓度有变化。由于莫那甜在中性pH的热稳定性，期望与其它高强度甜味剂，例如天冬甜素相比，莫那甜在口香糖加工的过程中具有适当的稳定性并且在口香糖组合物中有较长的储存时间。
考虑到本文所述原理可应用于许多可能的实施方案，应该意识到的是所阐述的实施方案仅是本文内容的某些实施例并不能认为是对本内容范围的限制。
序列表
<110>嘉吉有限公司(CARGILL，INC.)
<120>含有莫那甜的口香糖组合物及其制造方法
<130>023829-0361
<140>PCT/US2004/026330
<141>2004-08-16
<150>US60/495,191
<151>2003-08-14
<160>74
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>1170
<212>DNA
<213>苜蓿根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)
<400>1
atgttcgacg ccctcgcccg ccaagccgac gatcccttgc ttttcctgat cggcctgttc     60
aggaaggatg agcgccccgg aaaggtcgat ctcggcgtag gagtctatcg cgacgagacc    120
ggacgcacgc cgatcttccg ggccgtcaag gcggcggaaa agcggcttct cgaaacacag    180
gacagcaagg cctatatcgg ccccgaaggg gacctcgtct ttctcgatcg gctctgggaa    240
ctcgtcggcg gcgacacgat cgagcggagc catgttgcgg gcgtccagac gcccggcggc    300
tccggcgcgc tccgtttggc ggcggacctc atcgcccgca tgggcggccg aggcatctgg    360
ctcgggctgc cgagctggcc gaaccacgcg ccgatcttca aggcggccgg gctcgatatc    420
gccacctacg acttcttcga cattccgtcg cagtcggtca tcttcgataa tctggtgagc    480
gcgctggaag gcgccgcatc cggcgatgcg gtgctgctgc atgcaagctg ccacaacccg    540
accggcggcg tcctgagcga agcacaatgg atggagatcg ccgcgctggt ggccgagcgc    600
ggcctgctgc cgctcgtcga tctcgcctat caggggttcg gccgcggcct cgaccaggat    660
gtcgcgggcc tccggcatct tctcggcgtg gtcccggaag cgctcgtcgc ggtttcctgc    720tcgaagtcct tcgggcttta tcgcgagcgc gcgggcgcga tcttcgcgcg gaccagctcg    780actgcctcgg cggacagggt gcgctcaaac ctcgcgggcc tcgcacgcac cagctattcc    840atgccgccgg atcacggcgc agccgtcgtg cggacgatcc ttgacgaccc ggaactcagg    900cgcgactgga cggaggagct cgagacgatg cggctcagga tgacgggcct ccggcggtcg    960cttgccgagg gactccgcac ccgctggcag agcctcggcg cagtcgccga tcaggagggc   1020atgttctcca tgctgccgct ttccgaagcg gaggttatgc ggctcaggac cgagcacggc   1080atctatatgc cggcatccgg ccgcatcaac atcgccgggc tgaagacggc ggaagccgcc   1140gagattgccg gcaagttcac cagtctctga                                    1170
<210>2
<211>389
<212>PRT
<213>苜蓿根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)
<400>2
Met Phe Asp Ala Leu Ala Arg Gln Ala Asp Asp Pro Leu Leu Phe Leu
1               5                   10                  15
Ile Gly Leu Phe Arg Lys Asp Glu Arg Pro Gly Lys Val Asp Leu Gly
            20                  25                  30
Val Gly Val Tyr Arg Asp Glu Thr Gly Arg Thr Pro Ile Phe Arg Ala
        35                  40                  45
Val Lys Ala Ala Glu Lys Arg Leu Leu Glu Thr Gln Asp Ser Lys Ala
    50                  55                  60
Tyr Ile Gly Pro Glu Gly Asp Leu Val Phe Leu Asp Arg Leu Trp Glu
65                  70                  75                  80
Leu Val Gly Gly Asp Thr Ile Glu Arg Ser His Val Ala Gly Val Gln
                85                  90                  95
Thr Pro Gly Gly Ser Gly Ala Leu Arg Leu Ala Ala Asp Leu Ile Ala
        100                 105                 110
Arg Met Gly Gly Arg Gly Ile Trp Leu Gly Leu Pro Ser Trp Pro Asn
        115                 120                 125
His Ala Pro Ile Phe Lys Ala Ala Gly Leu Asp Ile Ala Thr Tyr Asp
    130                 135                 140
Phe Phe Asp Ile Pro Ser Gln Ser Val Ile Phe Asp Asn Leu Val Ser
145                 150                 155                 160
Ala Leu Glu Gly Ala Ala Ser Gly Asp Ala Val Leu Leu His Ala Ser
                165                 170                 175
Cys His Asn Pro Thr Gly Gly Val Leu Ser Glu Ala Gln Trp Met Glu
            180                 185                 190
Ile Ala Ala Leu Val Ala Glu Arg Gly Leu Leu Pro Leu Val Asp Leu
        195                 200                 205
Ala Tyr Gln Gly Phe Gly Arg Gly Leu Asp Gln Asp Val Ala Gly Leu
    210                 215                 220
Arg His Leu Leu Gly Val Val Pro Glu Ala Leu Val Ala Val Ser Cys
225                 230                 235                 240
Ser Lys Ser Phe Gly Leu Tyr Arg Glu Arg Ala Gly Ala Ile Phe Ala
                245                 250                 255
Arg Thr Ser Ser Thr Ala Ser Ala Asp Arg Val Arg Ser Asn Leu Ala
            260                 265                 270
Gly Leu Ala Arg Thr Ser Tyr Ser Met Pro Pro Asp His Gly Ala Ala
        275                 280                 285
Val Val Arg Thr Ile Leu Asp Asp Pro Glu Leu Arg Arg Asp Trp Thr
    290                 295                 300
Glu Glu Leu Glu Thr Met Arg Leu Arg Met Thr Gly Leu Arg Arg Ser
305                 310                 315                 320
Leu Ala Glu Gly Leu Arg Thr Arg Trp Gln Ser Leu Gly Ala Val Ala
                325                 330                 335
Asp Gln Glu Gly Met Phe Ser Met Leu Pro Leu Ser Glu Ala Glu Val
            340                 345                 350
Met Arg Leu Arg Thr Glu His Gly Ile Tyr Met Pro Ala Ser Gly Arg
        355                 360                 365
Ile Asn Ile Ala Gly Leu Lys Thr Ala Glu Ala Ala Glu Ile Ala Gly
    370                 375                 380
Lys Phe Thr Ser Leu
385
<210>3
<211>1260
<212>DNA
<213>类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)
<400>3
atgcgctcta cgacggctcc tggtccgagt ggggcatgta tgacgatctc aaggtcgcga     60
aaggatgacg aaggaatgct gaccgccctg aagccgcagc ccgcggacaa gatcctgcaa    120
ctgatccaga tgttccgcga ggatgcgcgc gcggacaaga tcgatctggg cgtgggcgtc    180
tacaaggacc cgaccgggct caccccggtc atgcgggccg tgaaggcggc cgagaagcgg    240
ctctgggagg tcgagaccac caagacctac accggccttg ccgacgagcc ggcctacaat    300
gccgcgatgg cgaagctgat cctcgcgggc gcggtcccgg ccgaccgggt ggcctcggtc    360
gccacccccg gcggcacggg cgcggtgcgt caggcgctcg agctgatccg catggcctcg    420
cccgaggcca ccgtctggat ctcgaacccg acctggccga accatctgtc gatcgtgaaa    480
tatctcggca tcccgatgcg ggaataccgc tatttcgacg ccgagaccgg cgccgtcgat    540
gccgagggca tgatggagga tctggcccag gtgaaggcgg gcgacgtggt gctgctgcac    600
ggctgctgcc acaacccgac cggcgccaac ccgaacccgg tgcagtggct ggccatctgc    660
gagagcctgg cccggacagg cgcggtgccg ctgatcgacc tcgcctatca gggcttcggc    720
gacgggctcg agatggatgc ggcggcgacg cggcttctgg ccaccagact gcccgaggtg    780
ctgatcgcgg cctcctgctc gaagaacttc ggcatctacc gcgagcgcac gggcatcctg    840
atcgccatcg gcgaggcggc gggccggggc acggtgcagg ccaacctcaa cttcctgaac    900
cggcagaact actccttccc gccggaccat ggcgcgcggc tcgtgaccat gatcctcgag    960
gacgagacgc tgagcgccga ctggaaggcg gaactcgagg aggtgcggct caacatgctg  1020
acactgcgcc gccagcttgc cgatgcgctg caggccgaga ccggctcgaa ccgcttcggc  1080
ttcgtggccg agcatcgcgg catgttctcg cgcctcggga tcacgcccgc cgaggtggag  1140
cggctgcgga ccgagcacgg ggtctacatg gtgggcgatt cgcggctgaa catcgcgggg  1200
ctgaaccgga cgaccgtgcc ggtgctggcg cgcgcggtgg ccaaggtgct gcgcggctga  1260
<210>4
<211>419
<212>PRT
<213>类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)
<400>4
Met Arg Ser Thr Thr Ala Pro Gly Pro Ser Gly Ala Cys Met Thr Ile
1               5                   10                  15
Ser Arg Ser Arg Lys Asp Asp Glu Gly Met Leu Thr Ala Leu Lys Pro
            20                  25                  30
Gln Pro Ala Asp Lys Ile Leu Gln Leu Ile Gln Met Phe Arg Glu Asp
        35                  40                  45
Ala Arg Ala Asp Lys Ile Asp Leu Gly Val Gly Val Tyr Lys Asp Pro
    50                  55                  60
Thr Gly Leu Thr Pro Val Met Arg Ala Val Lys Ala Ala Glu Lys Arg
65                  70                  75                  80
Leu Trp Glu Val Glu Thr Thr Lys Thr Tyr Thr Gly Leu Ala Asp Glu
                85                  90                  95
Pro Ala Tyr Asn Ala Ala Met Ala Lys Leu Ile Leu Ala Gly Ala Val
            100                 105                 110
Pro Ala Asp Arg Val Ala Ser Val Ala Thr Pro Gly Gly Thr Gly Ala
        115                 120                 125
Val Arg Gln Ala Leu Glu Leu Ile Arg Met Ala Ser Pro Glu Ala Thr
    130                 135                 140
Val Trp Ile Ser Asn Pro Thr Trp Pro Asn His Leu Ser Ile Val Lys
145                 150                 155                 160
Tyr Leu Gly Ile Pro Met Arg Glu Tyr Arg Tyr Phe Asp Ala Glu Thr
                165                 170                 175
Gly Ala Val Asp Ala Glu Gly Met Met Glu Asp Leu Ala Gln Val Lys
            180                 185                 190
Ala Gly Asp Val Val Leu Leu His Gly Cys Cys His Asn Pro Thr Gly
        195                 200                 205
Ala Asn Pro Asn Pro Val Gln Trp Leu Ala Ile Cys Glu Ser Leu Ala
    210                 215                 220
Arg Thr Gly Ala Val Pro Leu Ile Asp Leu Ala Tyr Gln Gly Phe Gly
225                 230                 235                 240
Asp Gly Leu Glu Met Asp Ala Ala Ala Thr Arg Leu Leu Ala Thr Arg
                245                 250                 255
Leu Pro Glu Val Leu Ile Ala Ala Ser Cys Ser Lys Asn Phe Gly Ile
            260                 265                 270
Tyr Arg Glu Arg Thr Gly Ile Leu Ile Ala Ile Gly Glu Ala Ala Gly
        275                 280                 285
Arg Gly Thr Val Gln Ala Asn Leu Asn Phe Leu Asn Arg Gln Asn Tyr
    290                 295                 300
Ser Phe Pro Pro Asp His Gly Ala Arg Leu Val Thr Met Ile Leu Glu
305                 310                 315                 320
Asp Glu Thr Leu Ser Ala Asp Trp Lys Ala Glu Leu Glu Glu Val Arg
                325                 330                 335
Leu Asn Met Leu Thr Leu Arg Arg Gln Leu Ala Asp Ala Leu Gln Ala
            340                 345                 350
Glu Thr Gly Ser Asn Arg Phe Gly Phe Val Ala Glu His Arg Gly Met
        355                 360                 365
Phe Ser Arg Leu Gly Ile Thr Pro Ala Glu Val Glu Arg Leu Arg Thr
    370                 375                 380
Glu His Gly Val Tyr Met Val Gly Asp Ser Arg Leu Asn Ile Ala Gly
385                 390                 395                 400
Leu Asn Arg Thr Thr Val Pro Val Leu Ala Arg Ala Val Ala Lys Val
                405                 410                 415
Leu Arg Gly
<210>5
<211>1260
<212>DNA
<213>类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)
<400>5
atgcgctcta cgacggctcc tggtccgagt ggggcatgta tgacgatctc aaggtcgcga     60
aaggatgacg aaggaatgct gaccgccctg aagccgcagc ccgcggacaa gatcctgcaa    120
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tacaaggacc cgaccgggct caccccggtc atgcgggccg tgaaggccgc cgagaagcgg    240
ctctgggagg tcgagaccac caagacctac accggccttg ccggcgagcc cgcctacaat    300
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ggctgctgcc acaacccgac cggcgccaac ccgaacccgg tgcagtggct ggccgtctgc    660
gagagcctgg cccggacagg cgcggtgccg ctgatcgacc tcgcctatca gggcttcggc    720
gacgggctcg agatggatgc ggcggcgacg cggcttctgg ccaccagact gcccgaggtg    780
ctgatcgcgg cctcctgctc gaagaacttc ggcatctacc gcgagcgaac gggcatcctg    840
atcgccatcg gcgaggcggc gggccggggc acggtgcagg ccaacctcaa cttcctgaac    900
cggcagaact actccttccc gccggaccat ggcgcgcggc tcgtgaccat gatcctcgag    960
gacgagacgc tgagcgccga ctggaaggcg gaactcgagg aggtgcggct caacatgctg   1020
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ttcgtggccg agcatcgcgg catgttctcg cgcctcggga tcacgcccgc cgaggtggag  1140
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ctgaaccgga cgaccgtgcc ggtgctggcg cgcgcggtgg ccaaggtgct gcgcggctga  1260
<210>6
<211>419
<212>PRT
<213>类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)
<400>6
Met Arg Ser Thr Thr Ala Pro Gly Pro Ser Gly Ala Cys Met Thr Ile
1               5                   10                  15
Ser Arg Ser Arg Lys Asp Asp Glu Gly Met Leu Thr Ala Leu Lys Pro
            20                  25                  30
Gln Pro Ala Asp Lys Ile Leu Gln Leu Ile Gln Met Phe Arg Glu Asp
        35                  40                  45
Ala Arg Ala Asp Lys Ile Asp Leu Gly Val Gly Val Tyr Lys Asp Pro
    50                  55                  60
Thr Gly Leu Thr Pro Val Met Arg Ala Val Lys Ala Ala Glu Lys Arg
65                  70                  75                  80
Leu Trp Glu Val Glu Thr Thr Lys Thr Tyr Thr Gly Leu Ala Gly Glu
                85                  90                  95
Pro Ala Tyr Asn Ala Ala Met Ala Lys Leu Ile Leu Ala Gly Ala Val
            100                 105                 110
Pro Ala Asp Arg Val Ala Ser Val Ala Thr Pro Gly Gly Thr Gly Ala
        115                 120                 125
Val Arg Gln Ala Leu Glu Leu Ile Arg Met Ala Ser Pro Glu Ala Thr
    130                 135                 140
Val Trp Ile Ser Asn Pro Thr Trp Pro Asn His Leu Ser Ile Val Lys
145                 150                 155                 160
Tyr Leu Gly Ile Pro Met Arg Glu Tyr Arg Tyr Phe Asp Ala Glu Thr
                165                 170                 175
Gly Ala Val Asp Ala Glu Gly Leu Met Glu Asp Leu Ala Gln Val Lys
            180                 185                 190
Ala Gly Asp Val Val Leu Leu His Gly Cys Cys His Asn Pro Thr Gly
        195                 200                 205
Ala Asn Pro Asn Pro Val Gln Trp Leu Ala Val Cys Glu Ser Leu Ala
    210                 215                 220
Arg Thr Gly Ala Val Pro Leu Ile Asp Leu Ala Tyr Gln Gly Phe Gly
225                 230                 235                 240
Asp Gly Leu Glu Met Asp Ala Ala Ala Thr Arg Leu Leu Ala Thr Arg
                245                 250                 255
Leu Pro Glu Val Leu Ile Ala Ala Ser Cys Ser Lys Asn Phe Gly Ile
            260                 265                 270
Tyr Arg Glu Arg Thr Gly Ile Leu Ile Ala Ile Gly Glu Ala Ala Gly
        275                 280                 285
Arg Gly Thr Val Gln Ala Asn Leu Asn Phe Leu Asn Arg Gln Asn Tyr
    290                 295                 300
Ser Phe Pro Pro Asp His Gly Ala Arg Leu Val Thr Met Ile Leu Glu
305                 310                 315                 320
Asp Glu Thr Leu Ser Ala Asp Trp Lys Ala Glu Leu Glu Glu Val Arg
                325                 330                 335
Leu Asn Met Leu Thr Leu Arg Arg Gln Leu Ala Asp Ala Leu Gln Ala
            340                 345                 350
Glu Thr Gly Ser Asn Arg Phe Gly Phe Val Ala Glu His Arg Gly Met
        355                 360                 365
Phe Ser Arg Leu Gly Ile Thr Pro Ala Glu Val Glu Arg Leu Arg Thr
    370                 375                 380
Glu His Gly Val Tyr Met Val Gly Asp Ser Arg Leu Asn Ile Ala Gly
385                 390                 395                 400
Leu Asn Arg Thr Thr Val Pro Val Leu Ala Arg Ala Val Ala Lys Val
                405                 410                 415
Leu Arg Gly
<210>7
<211>1239
<212>DNA
<213>硕大利什曼原虫(Leishmania major)
<400>7
atgtccatgc aggcggccat gaccacggcg gagcgctggc agaagattca ggcacaagct    60
cccgatgtca tcttcgatct cgcaaaacgc gccgccgctg ccaagggccc caaggccaac   120
ctcgtcattg gtgcctaccg cgacgagcag ggccgtccct atccgctacg cgtggtccgc   180
aaggctgagc agcttctctt ggacatgaat ctcgactacg agtacctacc catctcgggc   240
taccagccct tcatcgatga ggcggtaaag attatctacg gcaataccgt cgagctggag   300
aacctggttg cggtgcagac gctgagcggg accggtgctg tctctctcgg ggcgaagctg   360
ctgactcgcg tcttcgacgc tgagacgacg cccatctacc tttccgaccc cacgtggccc   420
aaccactacg gcgtcgtgaa ggctgctggc tggaagaaca tctgcacgta cgcctactac   480
gaccccaaga cggtcagcct gaatttcgag ggcatgaaga aagacattct ggcggcgccg   540
gacggctccg tgttcattct gcaccagtgc gcgcacaacc ccaccggcgt ggacccgtcg   600
caggagcagt ggaacgagat cgcgtcactg atgctggcca agcaccatca ggtgttcttc   660
gactccgcct accaaggcta tgcgagcggc agcctcgaca cggacgcgta tgctgcccgc   720
ctgtttgccc gccgcggcat cgaggtactg ctggcgcagt cgttctccaa gaacatgggc   780
ttgtacagcg agcgtgcagg cacgctgtcg ctgctcctca aggacaagac gaagcgcgcg   840
gatgtaaaga gcgtgatgga ttcgctgatc cgtgaggagt acacgtgccc cccagcccac   900
ggtgcccgct tagcccacct aatcctgagc aacaacgaac tgcgaaagga gtgggaggca   960
gagctatcag ccatggcaga gcgcatccgt acgatgcgcc gcaccgtgta cgacgagctg  1020
ctgcgcctgc agacgcccgg gagctgggaa catgtcatta accagattgg catgttttcc  1080
ttcctcgggc tgtcaaaggc gcagtgcgaa tactgccaaa accacaacat cttcatcaca  1140
gtgtcgggcc gcgctaacat ggcaggtctg acgcatgaga cggcgctgat gctagcacag  1200
acgatcaacg atgctgtgcg caatgtgaat cgtgagtga                         1239
<210>8
<211>412
<212>PRT
<213>硕大利什曼原虫(Leishmania major)
<400>8
Met Ser Met Gln Ala Ala Met Thr Thr Ala Glu Arg Trp Gln Lys Ile
1               5                   10                  15
Gln Ala Gln Ala Pro Asp Val Ile Phe Asp Leu Ala Lys Arg Ala Ala
            20                  25                  30
Ala Ala Lys Gly Pro Lys Ala Asn Leu Val Ile Gly Ala Tyr Arg Asp
        35                  40                  45
Glu Gln Gly Arg Pro Tyr Pro Leu Arg Val Val Arg Lys Ala Glu Gln
    50                  55                  60
Leu Leu Leu Asp Met Asn Leu Asp Tyr Glu Tyr Leu Pro Ile Ser Gly
65                  70                  75                  80
Tyr Gln Pro Phe Ile Asp Glu Ala Val Lys Ile Ile Tyr Gly Asn Thr
                85                  90                  95
Val Glu Leu Glu Asn Leu Val Ala Val Gln Thr Leu Ser Gly Thr Gly
            100                 105                 110
Ala Val Ser Leu Gly Ala Lys Leu Leu Thr Arg Val Phe Asp Ala Glu
        115                 120                 125
Thr Thr Pro Ile Tyr Leu Ser Asp Pro Thr Trp Pro Asn His Tyr Gly
    130                 135                 140
Val Val Lys Ala Ala Gly Trp Lys Asn Ile Cys Thr Tyr Ala Tyr Tyr
145                 150                 155                 160
Asp Pro Lys Thr Val Ser Leu Asn Phe Glu Gly Met Lys Lys Asp Ile
                165                 170                 175
Leu Ala Ala Pro Asp Gly Ser Val Phe Ile Leu His Gln Cys Ala His
            180                 185                 190
Asn Pro Thr Gly Val Asp Pro Ser Gln Glu Gln Trp Asn Glu Ile Ala
        195                 200                 205
Ser Leu Met Leu Ala Lys His His Gln Val Phe Phe Asp Ser Ala Tyr
    210                 215                 220
Gln Gly Tyr Ala Ser Gly Ser Leu Asp Thr Asp Ala Tyr Ala Ala Arg
225                 230                 235                 240
Leu Phe Ala Arg Arg Gly Ile Glu Val Leu Leu Ala Gln Ser Phe Ser
            245                 250                 255
Lys Asn Met Gly Leu Tyr Ser Glu Arg Ala Gly Thr Leu Ser Leu Leu
            260                 265                 270
Leu Lys Asp Lys Thr Lys Arg Ala Asp Val Lys Ser Val Met Asp Ser
        275                 280                 285
Leu Ile Arg Glu Glu Tyr Thr Cys Pro Pro Ala His Gly Ala Arg Leu
    290                 295                 300
Ala His Leu Ile Leu Ser Asn Asn Glu Leu Arg Lys Glu Trp Glu Ala
305                 310                 315                 320
Glu Leu Ser Ala Met Ala Glu Arg Ile Arg Thr Met Arg Arg Thr Val
                325                 330                 335
Tyr Asp Glu Leu Leu Arg Leu Gln Thr Pro Gly Ser Trp Glu His Val
            340                 345                 350
Ile Asn Gln Ile Gly Met Phe Ser Phe Leu Gly Leu Ser Lys Ala Gln
        355                 360                 365
Cys Glu Tyr Cys Gln Asn His Asn Ile Phe Ile Thr Val Ser Gly Arg
    370                 375                 380
Ala Asn Met Ala Gly Leu Thr His Glu Thr Ala Leu Met Leu Ala Gln
385                 390                 395                 400
Thr Ile Asn Asp Ala Val Arg Asn Val Asn Arg Glu
                405                 410
<210>9
<211>1182
<212>DNA
<213>枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
<400>9
atggaacatt tgctgaatcc gaaagcaaga gagatcgaaa tttcaggaat acgcaaattc     60
tcgaatcttg tagcccaaca cgaagacgtc atttcactta caatcggcca gcctgatttt    120
ttcacaccgc atcatgtgaa agctgccgca aaaaaagcca ttgatgaaaa cgtgacgtca    180
tatactccga atgccggcta cctggagctg agacaagctg tgcagcttta tatgaagaaa    240
aaagcggatt tcaactatga tgctgaatct gaaattatca tcacaacagg cgcaagccaa    300
gccattgatg ctgcattccg gacgatttta tctcccggtg atgaagtcat tatgccaggg    360
cctatttatc cgggctatga acctattatc aatttgtgcg gggccaagcc tgtcattgtt    420
gatactacgt cacacggctt taagcttacc gcccggctga ttgaagatgc tctgacaccc    480
aacaccaagt gtgtcgtgct tccttatccg tcaaacccta ccggcgtgac tttatctgaa    540
gaagaactga aaagcatcgc agctctctta aaaggcagaa atgtcttcgt attgtctgat    600
gaaatataca gtgaattaac atatgacaga ccgcattact ccatcgcaac ctatttgcgg    660
gatcaaacga ttgtcattaa cgggttgtca aaatcacaca gcatgaccgg ttggagaatt    720
ggatttttat ttgcaccgaa agacattgca aagcacattt taaaggttca tcaatacaat    780
gtgtcgtgcg cctcatccat ttctcaaaaa gccgcgcttg aagctgtcac aaacggcttt    840
gacgatgcat tgattatgag agaacaatac aaaaaacgtc tggactatgt ttatgaccgt    900
cttgtttcca tgggacttga cgtagttaaa ccgtccggtg cgttttatat cttcccttct    960
attaaatcat ttggaatgac ttcatttgat tttagtatgg ctcttttgga agacgctggc   1020
gtggcactcg tgccgggcag ctcgttctca acatatggtg aaggatatgt aaggctgtct   1080
tttgcatgct caatggacac gctgagagaa ggcctagacc gtttagaatt atttgtatta   1140
aaaaaacgtg aagcaatgca gacgataaac aacggcgttt aa                      1182
<210>10
<211>393
<212>PRT
<213>枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
<400>10
Met Glu His Leu Leu Asn Pro Lys Ala Arg Glu Ile Glu Ile Ser Gly
1               5                   10                  15
Ile Arg Lys Phe Ser Asn Leu Val Ala Gln His Glu Asp Val Ile Ser
            20                  25                  30
Leu Thr Ile Gly Gln Pro Asp Phe Phe Thr Pro His His Val Lys Ala
        35                  40                  45
Ala Ala Lys Lys Ala Ile Asp Glu Asn Val Thr Ser Tyr Thr Pro Asn
    50                  55                  60
Ala Gly Tyr Leu Glu Leu Arg Gln Ala Val Gln Leu Tyr Met Lys Lys
65                  70                  75                  80
Lys Ala Asp Phe Asn Tyr Asp Ala Glu Ser Glu Ile Ile Ile Thr Thr
                85                  90                  95
Gly Ala Ser Gln Ala Ile Asp Ala Ala Phe Arg Thr Ile Leu Ser Pro
            100                 105                 110
Gly Asp Glu Val Ile Met Pro Gly Pro Ile Tyr Pro Gly Tyr Glu Pro
        115                 120                 125
Ile Ile Asn Leu Cys Gly Ala Lys Pro Val Ile Val Asp Thr Thr Ser
    130                 135                 140
His Gly Phe Lys Leu Thr Ala Arg Leu Ile Glu Asp Ala Leu Thr Pro
145                 150                 155                 160
Asn Thr Lys Cys Val Val Leu Pro Tyr Pro Ser Asn Pro Thr Gly Val
                165                 170                 175
Thr Leu Ser Glu Glu Glu Leu Lys Ser Ile Ala Ala Leu Leu Lys Gly
            180                 185                 190
Arg Asn Val Phe Val Leu Ser Asp Glu Ile Tyr Ser Glu Leu Thr Tyr
        195                 200                 205
Asp Arg Pro His Tyr Ser Ile Ala Thr Tyr Leu Arg Asp Gln Thr Ile
    210                 215                 220
Val Ile Asn Gly Leu Ser Lys Ser His Ser Met Thr Gly Trp Arg Ile
225                 230                 235                 240
Gly Phe Leu Phe Ala Pro Lys Asp Ile Ala Lys His Ile Leu Lys Val
                245                 250                 255
His Gln Tyr Asn Val Ser Cys Ala Ser Ser Ile Ser Gln Lys Ala Ala
            260                 265                 270
Leu Glu Ala Val Thr Asn Gly Phe Asp Asp Ala Leu Ile Met Arg Glu
        275                 280                 285
Gln Tyr Lys Lys Arg Leu Asp Tyr Val Tyr Asp Arg Leu Val Ser Met
    290                 295                 300
Gly Leu Asp Val Val Lys Pro Ser Gly Ala Phe Tyr Ile Phe Pro Ser
305                 310                 315                 320
Ile Lys Ser Phe Gly Met Thr Ser Phe Asp Phe Ser Met Ala Leu Leu
                325                 330                 335
Glu Asp Ala Gly Val Ala Leu Val Pro Gly Ser Ser Phe Ser Thr Tyr
            340                 345                 350
Gly Glu Gly Tyr Val Arg Leu Ser Phe Ala Cys Ser Met Asp Thr Leu
        355                 360                 365
Arg Glu Gly Leu Asp Arg Leu Glu Leu Phe Val Leu Lys Lys Arg Glu
    370                 375                 380
Ala Met Gln Thr Ile Asn Asn Gly Val
385                 390
<210>11
<211>1176
<212>DNA
<213>食淀粉乳杆菌(Lactobacillus amylovorus)
<400>11
atgccagaat tagctaatga tttaggatta agcaaaaaga tcactgatgt aaaagcttca     60
ggaattagaa tctttgataa caaagtttca gctattcctg gcattatcaa attgact ttg   120
ggtgaaccag atatgaatac tcctgagcat gttaagcaag cggctattaa gaatattgca    180
gataatgatt cacactatgc tccacaaaag ggaaagcttg aattaagaaa agctatcagt    240
aaatatttga aaaagattac tggaattgaa tatgatccag aaacagaaat cgtagtaaca    300
gttggtgcaa ctgaagcaat taacgctacc ttgtttgcta ttactaatcc gggtgacaag    360
gttgcaattc ctacgccagt cttttctcta tattggcccg tggctacact tgctgatgcc    420
gattatgttt tgatgaatac tgcagaagat ggttttaagt taacacctaa gaagttagaa    480
gaaactatca aagaaaatcc aacaattaaa gcagtaattt tgaattatcc aactaaccca    540
actggtgttg aatatagcga agatgaaatt aaagctttgg ctaaggtaat taaagataat    600
catctgtacg taattaccga tgaaatttac agtactttga cttacggtgt aaaacacttt    660
tcaattgcca gcttaattcc agaaagagca atttatatct ctggtttatc taaatcacat    720
gcgatgactg gttatcgttt aggctatgtt gccggacctg caaaaattat ggcagaaatt    780
ggtaaagttc atggccttat ggtgacgact acgacggatt catcacaagc tgccgcaatt    840
gaagcacttg aacacggact tgatgaccct gagaaatata gggaagttta tgaaaagcgt    900
cgtgactatg ttttaaagga attagccgag atagagatgc aagcagttaa gccagaaggt    960
gcattttata tctttgctaa aattccagct aagtatggca aagacgatat gaaatttgcc   1020
ttggatttag cttttaaaga aaaagtgggt atcactccag gtagtgcatt tggtcctggt   1080
ggtgaaggtc atattagatt atcttatgca tcaagtgatg aaaacttgca tgaggcaatg   1140
aagcgaatga agaaagtttt acaagaggac gaataa                             1176
<210>12
<211>391
<212>PRT
<213>食淀粉乳杆菌(Lactobacillus amylovorus)
<400>12
Met Pro Glu Leu Ala Asn Asp Leu Gly Leu Ser Lys Lys Ile Thr Asp
1               5                   10                  15
Val Lys Ala Ser Gly Ile Arg Ile Phe Asp Asn Lys Val Ser Ala Ile
            20                  25                  30
Pro Gly Ile Ile Lys Leu Thr Leu Gly Glu Pro Asp Met Asn Thr Pro
        35                  40                  45
Glu His Val Lys Gln Ala Ala Ile Lys Asn Ile Ala Asp Asn Asp Ser
    50                  55                  60
His Tyr Ala Pro Gln Lys Gly Lys Leu Glu Leu Arg Lys Ala Ile Ser
65                  70                  75                  80
Lys Tyr Leu Lys Lys Ile Thr Gly Ile Glu Tyr Asp Pro Glu Thr Glu
                85                  90                  95
Ile Val Val Thr Val Gly Ala Thr Glu Ala Ile Asn Ala Thr Leu Phe
            100                 105                 110
Ala Ile Thr Asn Pro Gly Asp Lys Val Ala Ile Pro Thr Pro Val Phe
        115                 120                 125
Ser Leu Tyr Trp Pro Val Ala Thr Leu Ala Asp Ala Asp Tyr Val Leu
    130                 135                 140
Met Asn Thr Ala Glu Asp Gly Phe Lys Leu Thr Pro Lys Lys Leu Glu
145                 150                 155                 160
Glu Thr Ile Lys Glu Asn Pro Thr Ile Lys Ala Val Ile Leu Asn Tyr
                165                 170                 175
Pro Thr Asn Pro Thr Gly Val Glu Tyr Ser Glu Asp Glu Ile Lys Ala
            180                 185                 190
Leu Ala Lys Val Ile Lys Asp Asn His Leu Tyr Val Ile Thr Asp Glu
        195                 200                 205
Ile Tyr Ser Thr Leu Thr Tyr Gly Val Lys His Phe Ser Ile Ala Ser
    210                 215                 220
Leu Ile Pro Glu Arg Ala Ile Tyr Ile Ser Gly Leu Ser Lys Ser His
225                 230                 235                 240
Ala Met Thr Gly Tyr Arg Leu Gly Tyr Val Ala Gly Pro Ala Lys Ile
                245                 250                 255
Met Ala Glu Ile Gly Lys Val His Gly Leu Met Val Thr Thr Thr Thr
            260                 265                 270
Asp Ser Ser Gln Ala Ala Ala Ile Glu Ala Leu Glu His Gly Leu Asp
        275                 280                 285
Asp Pro Glu Lys Tyr Arg Glu Val Tyr Glu Lys Arg Arg Asp Tyr Val
    290                 295                 300
Leu Lys Glu Leu Ala Glu Ile Glu Met Gln Ala Val Lys Pro Glu Gly
305                 310                 315                 320
Ala Phe Tyr Ile Phe Ala Lys Ile Pro Ala Lys Tyr Gly Lys Asp Asp
                325                 330                 335
Met Lys Phe Ala Leu Asp Leu Ala Phe Lys Glu Lys Val Gly Ile Thr
            340                 345                 350
Pro Gly Ser Ala Phe Gly Pro Gly Gly Glu Gly His Ile Arg Leu Ser
        355                 360                 365
Tyr Ala Ser Ser Asp Glu Asn Leu His Glu Ala Met Lys Arg Met Lys
    370                 375                 380
Lys Val Leu Gln Glu Asp Glu
385                 390
<210>13
<211>1413
<212>DNA
<213>类球红细菌(R.sphaeroides)
<400>13
atgcgcgagc ctcttgccct cgagatcgac ccgggccacg gcggcccgct gttcctcgcc     60
atcgccgagg cgatcaccct cgacatcacc cgcgggcggc tgaggcccgg agcgagactg    120
cccggcacac gcgcgctggc gcgggcgctc ggcgtgcatc gcaacacggt ggatgccgcc    180
tatcaggagt tgctgaccca gggctggctg caggccgagc ccgcgcgggg caccttcgtg    240
gcgcaggatc tgccgcaggg gatgctggtg cacaggcccg cgcccgcgcc ggtcgagccg    300
gtcgcgatgc gcgcggggct cgccttctcc gatggcgcgc cggaccccga gctggtgccc    360
gacaaggcgc tggcgcgggc ctttcgccgg gcgctcctgt cgcccgcctt ccgcgccgga    420
gcggattacg gcgatgcccg cggcacctcc tcgctgcggg aggcgctggc agcctatctc    480
gcctcggacc ggggcgtggt cgcggatcct gcgcggctgc tgatcgcgcg gggcagccag    540
atggcgctgt tcctggtagc ccgggcggcg ctggcgccgg gagaggcgat cgcggtcgag    600
gagccgggct atccgctggc ctgggaggcg ttccgcgcag cgggagcgga ggtgcgcggc    660
gtgccggtgg atggcggcgg cctcaggatc gacgcgctcg aggccgcgct ggcccgggat    720
ccgcgaatcc gggcggtcta tgtcacgccc catcaccagt atccgacgac cgtcaccatg    780
ggcgcggcgc ggcggttgca gcttctggaa ctggcagagc gccaccggct cgcgctgatc    840
gaggacgact acgaccacga ataccgcttc gagggccgtc cggtgctgcc gctggctgcc    900
cgcgcgccgg aaggtctgcc gctgatctat gtgggctcgc tgtcgaaact gctctcgccc    960
ggtatccggc tgggatacgc gctggcgccc gagcggctgc tgacccgcat ggccgcggcg   1020
cgcgccgcca tcgaccggca gggcgacgcg ccgctcgagg cggcgctggc cgagctgatc   1080
cgcgacggcg atctgggccg tcatgcccgc aaggcgcgca gggtctaccg ggcgcggcgg   1140
gatctgctgg cggagcgtct cacggcgcag ctggccgggc gcgccgcctt cgatctgccg   1200
gccgggggcc tcgcgctgtg gctgcgctgc gcgggcgtct cggccgagac ctgggccgaa   1260
gccgcagggc aggcggggct cgccctgctg ccgggcacgc gcttcgcgct ggagagcccg   1320
gcgccgcagg ccttccggct gggctatgcg gcgctggacg aggggcagat cgcccgggcg   1380
gtggagatcc tcgcccggag cttccccggc tga                                1413
<210>14
<211>470
<212>PRT
<213>类球红细菌(R.sphaeroides)
<400>14
Met Arg Glu Pro Leu Ala Leu Glu Ile Asp Pro Gly His Gly Gly Pro
1               5                   10                  15
Leu Phe Leu Ala Ile Ala Glu Ala Ile Thr Leu Asp Ile Thr Arg Gly
            20                  25                  30
Arg Leu Arg Pro Gly Ala Arg Leu Pro Gly Thr Arg Ala Leu Ala Arg
        35                  40                  45
Ala Leu Gly Val His Arg Asn Thr Val Asp Ala Ala Tyr Gln Glu Leu
    50                  55                  60
Leu Thr Gln Gly Trp Leu Gln Ala Glu Pro Ala Arg Gly Thr Phe Val
65                  70                  75                  80
Ala Gln Asp Leu Pro Gln Gly Met Leu Val His Arg Pro Ala Pro Ala
                85                  90                  95
Pro Val Glu Pro Val Ala Met Arg Ala Gly Leu Ala Phe Ser Asp Gly
            100                 105                 110
Ala Pro Asp Pro Glu Leu Val Pro Asp Lys Ala Leu Ala Arg Ala Phe
        115                 120                 125
Arg Arg Ala Leu Leu Ser Pro Ala Phe Arg Ala Gly Ala Asp Tyr Gly
    130                 135                 140
Asp Ala Arg Gly Thr Ser Ser Leu Arg Glu Ala Leu Ala Ala Tyr Leu
145                 150                 155                 160
Ala Ser Asp Arg Gly Val Val Ala Asp Pro Ala Arg Leu Leu Ile Ala
                165                 170                 175
Arg Gly Ser Gln Met Ala Leu Phe Leu Val Ala Arg Ala Ala Leu Ala
            180                 185                 190
Pro Gly Glu Ala Ile Ala Val Glu Glu Pro Gly Tyr Pro Leu Ala Trp
        195                 200                 205
Glu Ala Phe Arg Ala Ala Gly Ala Glu Val Arg Gly Val Pro Val Asp
    210                 215                 220
Gly Gly Gly Leu Arg Ile Asp Ala Leu Glu Ala Ala Leu Ala Arg Asp
225                 230                 235                 240
Pro Arg Ile Arg Ala Val Tyr Val Thr Pro His His Gln Tyr Pro Thr
                245                 250                 255
Thr Val Thr Met Gly Ala Ala Arg Arg Leu Gln Leu Leu Glu Leu Ala
            260                 265                 270
Glu Arg His Arg Leu Ala Leu Ile Glu Asp Asp Tyr Asp His Glu Tyr
        275                 280                 285
Arg Phe Glu Gly Arg Pro Val Leu Pro Leu Ala Ala Arg Ala Pro Glu
    290                 295                 300
Gly Leu Pro Leu Ile Tyr Val Gly Ser Leu Ser Lys Leu Leu Ser Pro
305                 310                 315                 320
Gly Ile Arg Leu Gly Tyr Ala Leu Ala Pro Glu Arg Leu Leu Thr Arg
                325                 330                 335
Met Ala Ala Ala Arg Ala Ala Ile Asp Arg Gln Gly Asp Ala Pro Leu
            340                 345                 350
Glu Ala Ala Leu Ala Glu Leu Ile Arg Asp Gly Asp Leu Gly Arg His
        355                 360                 365
Ala Arg Lys Ala Arg Arg Val Tyr Arg Ala Arg Arg Asp Leu Leu Ala
    370                 375                 380
Glu Arg Leu Thr Ala Gln Leu Ala Gly Arg Ala Ala Phe Asp Leu Pro
385                 390                 395                 400
Ala Gly Gly Leu Ala Leu Trp Leu Arg Cys Ala Gly Val Ser Ala Glu
                405                 410                 415
Thr Trp Ala Glu Ala Ala Gly Gln Ala Gly Leu Ala Leu Leu Pro Gly
            420                 425                 430
Thr Arg Phe Ala Leu Glu Ser Pro Ala Pro Gln Ala Phe Arg Leu Gly
        435                 440                 445
Tyr Ala Ala Leu Asp Glu Gly Gln Ile Ala Arg Ala Val Glu Ile Leu
    450                 455                 460
Ala Arg Ser Phe Pro Gly
465                 470
<210>15
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>15
ggtattgagg gtcgcatgaa ggttttagtc aatgg                                 35
<210>16
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>16
agaggagagt tagagcctta tgaaatgcta gcagcct                               37
<210>17
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>17
ggtattgagg gtcgcatgtt cgacgccctc gcccg                                 35
<210>18
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>18
agaggagagt tagagcctca gagactggtg aacttgc                               37
<210>19
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>19
ggtattgagg gtcgcatgga acatttgctg aatcc                                 35
<210>20
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>20
agaggagagt tagagcctta aacgccgttg tttatcg                               37
<210>21
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>21
ggtattgagg gtcgcatgcg cgagcctctt gccct                                 35
<210>22
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>22
agaggagagt tagagcctca gccggggaag ctccggg                               37
<210>23
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>23
ggtattgagg gtcgcatgtc cacgcaggcg gccat                                 35
<210>24
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>24
agaggagagt tagagcctca ctcacgattc acattgc                               37
<210>25
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>25
ggtattgagg gtcgcatgcc agaattagct aatga                                 35
<210>26
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>26
agaggagagt tagagcctta ttcgtcctct tgtaaaa                               37
<210>27
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>27
ggtattgagg gtcgcatgcg ctctacgacg gctcc                                 35
<210>28
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>28
agaggagagt tagagcctca gccgcgcagc accttgg                               37
<210>29
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>29
ggtattgagg gtcgcatgtt tgagaacatt accgc                                 35
<210>30
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>30
agaggagagt tagagcctta cagcactgcc acaatcg                               37
<210>31
<211>1194
<212>DNA
<213>大肠杆菌(E.coli)
<400>31
gtgtttcaaa aagttgacgc ctacgctggc gacccgattc ttacgcttat ggagcgtttt     60
aaagaagacc ctcgcagcga caaagtgaat ttaagtatcg gtctgtacta caacgaagac    120
ggaattattc cacaactgca agccgtggcg gaggcggaag cgcgcctgaa tgcgcagcct    180
catggcgctt cgctttattt accgatggaa gggcttaact gctatcgcca tgccattgcg    240
ccgctgctgt ttggtgcgga ccatccggta ctgaaacaac agcgcgtagc aaccattcaa    300
acccttggcg gctccggggc attgaaagtg ggcgcggatt tcctgaaacg ctacttcccg    360
gaatcaggcg tctgggtcag cgatcctacc tgggaaaacc gcgtagcaat attcgccggg    420
gctggattcg aagtgagtac ttacccctgg tatgacgaag cgactaacgg cgtgcgcttt    480
aatgacctgt tggcgacgct gaaaacatta cctgcccgca gtattgtgtt gctgcatcca    540
tgttgccaca acccaacggg tgccgatctc actaatgatc agtgggatgc ggtgattgaa    600
attctcaaag cccgcgagct tattccattc ctcgatattg cctatcaagg atttggtgcc    660
ggtatggaag aggatgccta cgctattcgc gccattgcca gcgctggatt acccgctctg    720
gtgagcaatt cgttctcgaa aattttctcc ctttacggcg agcgcgtcgg cggactttct    780
gttatgtgtg aagatgccga agccgctggc cgcgtactgg ggcaattgaa agcaacagtt    840
cgccgcaact actccagccc gccgaatttt ggtgcgcagg tggtggctgc agtgctgaat    900
gacgaggcat tgaaagccag ctggctggcg gaagtagaag agatgcgtac tcgcattctg    960
gcaatgcgtc aggaattggt gaaggtatta agcacagaga tgccagaacg caatttcgat   1020
tatctgctta atcagcgcgg catgttcagt tataccggtt taagtgccgc tcaggttgac   1080
cgactacgtg aagaatttgg tgtctatctc atcgccagcg gtcgcatgtg tgtcgccggg   1140
ttaaatacgg caaatgtaca acgtgtggca aaggcgtttg ctgcggtgat gtaa         1194
<210>32
<211>397
<212>PRT
<213>大肠杆菌(E.coli)
<400>32
Val Phe Gln Lys Val Asp Ala Tyr Ala Gly Asp Pro Ile Leu Thr Leu
1               5                   10                  15
Met Glu Arg Phe Lys Glu Asp Pro Arg Ser Asp Lys Val Asn Leu Ser
            20                  25                  30
Ile Gly Leu Tyr Tyr Asn Glu Asp Gly Ile Ile Pro Gln Leu Gln Ala
        35                  40                  45
Val Ala Glu Ala Glu Ala Arg Leu Asn Ala Gln Pro His Gly Ala Ser
    50                  55                  60
Leu Tyr Leu Pro Met Glu Gly Leu Asn Cys Tyr Arg His Ala Ile Ala
65                  70                  75                  80
Pro Leu Leu Phe Gly Ala Asp His Pro Val Leu Lys Gln Gln Arg Val
                85                  90                  95
Ala Thr Ile Gln Thr Leu Gly Gly Ser Gly Ala Leu Lys Val Gly Ala
            100                 105                 110
Asp Phe Leu Lys Arg Tyr Phe Pro Glu Ser Gly Val Trp Val Ser Asp
        115                 120                 125
Pro Thr Trp Glu Asn Arg Val Ala Ile Phe Ala Gly Ala Gly Phe Glu
    130                 135                 140
Val Ser Thr Tyr Pro Trp Tyr Asp Glu Ala Thr Asn Gly Val Arg Phe
145                 150                 155                 160
Asn Asp Leu Leu Ala Thr Leu Lys Thr Leu Pro Ala Arg Ser Ile Val
                165                 170                 175
Leu Leu His Pro Cys Cys His Asn Pro Thr Gly Ala Asp Leu Thr Asn
            180                 185                 190
Asp Gln Trp Asp Ala Val Ile Glu Ile Leu Lys Ala Arg Glu Leu Ile
        195                 200                 205
Pro Phe Leu Asp Ile Ala Tyr Gln Gly Phe Gly Ala Gly Met Glu Glu
    210                 215                 220
Asp Ala Tyr Ala Ile Arg Ala Ile Ala Ser Ala Gly Leu Pro Ala Leu
225                 230                 235                 240
Val Ser Asn Ser Phe Ser Lys Ile Phe Ser Leu Tyr Gly Glu Arg Val
                245                 250                 255
Gly Gly Leu Ser Val Met Cys Glu Asp Ala Glu Ala Ala Gly Arg Val
            260                 265                 270
Leu Gly Gln Leu Lys Ala Thr Val Arg Arg Asn Tyr Ser Ser Pro Pro
        275                 280                 285
Asn Phe Gly Ala Gln Val Val Ala Ala Val Leu Asn Asp Glu Ala Leu
    290                 295                 300
Lys Ala Ser Trp Leu Ala Glu Val Glu Glu Met Arg Thr Arg Ile Leu
305                 310                 315                 320
Ala Met Arg Gln Glu Leu Val Lys Val Leu Ser Thr Glu Met Pro Glu
                325                 330                 335
Arg Asn Phe Asp Tyr Leu Leu Asn Gln Arg Gly Met Phe Ser Tyr Thr
            340                 345                 350
Gly Leu Ser Ala Ala Gln Val Asp Arg Leu Arg Glu Glu Phe Gly Val
        355                 360                 365
Tyr Leu Ile Ala Ser Gly Arg Met Cys Val Ala Gly Leu Asn Thr Ala
    370                 375                 380
Asn Val Gln Arg Val Ala Lys Ala Phe Ala Ala Val Met
385                 390                 395
<210>33
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>33
ggtattgagg gtcgcgtgtt tcaaaaagtt gacgc                                 35
<210>34
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>34
agaggagagt tagagcctta catcaccgca gcaaacg                               37
<210>35
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>35
ggtattgagg gtcgcatgga gtccaaagtc gttga                                 35
<210>36
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>36
agaggagagt tagagcctta cacttggaaa acagcct                               37
<210>37
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>37
ggtattgagg gtcgcatgaa aaactggaaa acaag                                 35
<210>38
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>38
agaggagagt tagagcctta cagcttagcg ccttcta                               37
<210>39
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>39
ggtattgagg gtcgcatgcg aggggcatta ttcaa                                 35
<210>40
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>40
agaggagagt tagagcctca gcccttgagc gcgaag                                36
<210>41
<211>1416
<212>DNA
<213>大肠杆菌(E.coli)
<400>41
atggaaaact ttaaacatct ccctgaaccg ttccgcattc gtgttattga gccagtaaaa     60
cgtaccaccc gcgcttatcg tgaagaggca attattaaat ccggtatgaa cccgttcctg    120
ctggatagcg aagatgtttt tatcgattta ctgaccgaca gcggcaccgg ggcggtgacg    180
cagagcatgc aggctgcgat gatgcgcggc gacgaagcct acagcggcag tcgtagctac    240
tatgcgttag ccgagtcagt gaaaaatatc tttggttatc aatacaccat tccgactcac    300
cagggccgtg gcgcagagca aatctatatt ccggtactga ttaaaaaacg cgagcaggaa    360
aaaggcctgg atcgcagcaa aatggtggcg ttctctaact atttctttga taccacgcag    420
ggccatagcc agatcaacgg ctgtaccgtg cgtaacgtct atatcaaaga agccttcgat    480
acgggcgtgc gttacgactt taaaggcaac tttgaccttg agggattaga acgcggtatt    540
gaagaagttg gtccgaataa cgtgccgtat atcgttgcaa ccatcaccag taactctgca    600
ggtggtcagc cggtttcact ggcaaactta aaagcgatgt acagcatcgc gaagaaatac    660
gatattccgg tggtaatgga ctccgcgcgc tttgctgaaa acgcctattt catcaagcag    720
cgtgaagcag aatacaaaga ctggaccatc gagcagatca cccgcgaaac ctacaaatat    780
gccgatatgc tggcgatgtc cgccaagaaa gatgcgatgg tgccgatggg cggcctgctg    840
tgcatgaaag acgacagctt ctttgatgtg tacaccgagt gcagaaccct ttgcgtggtg    900
caggaaggct tcccgacata tggcggcctg gaaggcggcg cgatggagcg tctggcggta   960
ggtctgtatg acggcatgaa tctcgactgg ctggcttatc gtatcgcgca ggtacagtat  1020
ctggtcgatg gtctggaaga gattggcgtt gtctgccagc aggcgggcgg tcacgcggca  1080
ttcgttgatg ccggtaaact gttgccgcat atcccggcag accagttccc ggcacaggcg  1140
ctggcctgcg agctgtataa agtcgccggt atccgtgcgg tagaaattgg ctctttcctg  1200
ttaggccgcg atccgaaaac cggtaaacaa ctgccatgcc cggctgaact gctgcgttta  1260
accattccgc gcgcaacata tactcaaaca catatggact tcattattga agcctttaaa  1320
catgtgaaag agaacgcggc gaatattaaa ggattaacct ttacgtacga accgaaagta  1380
ttgcgtcact tcaccgcaaa acttaaagaa gtttaa                            1416
<210>42
<211>1371
<212>DNA
<213>弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)
<400>42
atgaattatc cggcagaacc cttccgtatt aaaagcgttg aaactgtatc tatgatcccg     60
cgtgatgaac gcctcaagaa aatgcaggaa gcgggttaca atactttcct gttaaattcg    120
aaagatattt atattgacct gctgacagac agtggcacta acgcaatgag cgacaagcag    180
tgggccggaa tgatgatggg tgatgaagcg tacgcgggca gcgaaaactt ctatcatctg    240
gaaagaaccg tgcaggaact gtttggcttt aaacatattg ttccgactca ccaggggcgt    300
ggcgcagaaa acctgttatc gcagctggct attaaacctg ggcaatatgt tgccgggaat    360
atgtatttca ctaccacccg ttatcaccag gaaaaaaatg gtgcggtgtt tgtcgatatc    420
gttcgtgacg aagcgcacga tgccggtctg aatattgcgt ttaaaggtga tatcgatctt    480
aaaaaattac aaaagctgat tgatgaaaaa ggcgcagaga atattgcgta tatctgcctg    540
gcggtgacgg ttaacctcgc gggcggccaa ccggtctcga tggctaacat gcgtgcggtg    600
cgtgaactga cagaagcgca tggcattaaa gtgttctacg acgctacccg ctgcgtagaa    660
aacgcctact ttatcaaaga gcaagagcag ggctttgaga acaagagcat cgccgagatc   720
gtgcatgaga tgttcagcta cgccgacggt tgtaccatga gtggtaaaaa agactgtctg   780
gtgaacatcg gcggcttcct gtgcatgaac gatgacgaaa tgttctcttc tgccaaagag   840
ttagtcgtgg tctacgaagg gatgccatct tacggcggcc tggccggacg tgatatggaa   900
gcgatggcga ttggcctgcg tgaagccatg cagtacgaat atattgagca ccgcgtgaag   960
caggttcgct acctgggcga taagctgaaa gccgctggcg taccgattgt tgaaccggta  1020
ggcggtcacg cggtattcct cgatgcgcgt cgcttctgcg agcatctgac gcaagatgag  1080
ttcccggcac aaagtctggc tgccagcatc tatgtggaaa ccggcgtgcg cagtatggag  1140
cgcggaatta tctctgcggg ccgtaataac gtgaccggtg aacaccacag accgaaactg  1200
gaaaccgtgc gtctgactat tccacgtcgt gtttatacct acgcacatat ggatgttgtg  1260
gctgacggta ttattaaact ttaccagcac aaagaagata ttcgcgggct gaagtttatt  1320
tacgagccga agcagttgcg tttctttact gcacgctttg attacatcta a           1371
<210>43
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>43
ggtattgagg gtcgcatgga aaactttaaa catct                                 35
<210>44
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>44
agaggagagt tagagcctta aacttcttta agttttg                               37
<210>45
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>45
ggtattgagg gtcgcatgaa ttatccggca gaacc                                 35
<210>46
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>46
agaggagagt tagagcctta gatgtaatca aagcgtg                               37
<210>47
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>47
ccagggcacc ggcgcagagc aaatctatat t                                     31
<210>48
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>48
tgcgccggtg ccctggtgag tcggaatggt                                       30
<210>49
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>49
tcctgcacgc ggcaaagggt tctgcactcg gt                                     32
<210>50
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>50
ctttgccgcg tgcaggaagg cttcccgaca                                       30
<210>51
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>51
aggggaccgg cgcagaaaac ctgttatcg                                        29
<210>52
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>52
tctgcgccgg tcccctggtg agtcggaaca at                                    32
<210>53
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>53
gttagtccgc gtctacgaag ggatgccat                                        29
<210>54
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>54
gtagacgcgg actaactctt tggcagaag                                        29
<210>55
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>55
ggtattgagg gtcgcatgta cgaactggga gttgt                                 35
<210>56
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>56
agaggagagt tagagcctta gtcaatatat ttcaggc                               37
<210>57
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>57
ggtattgagg gtcgcatgtc cggcatcgtt gtcca                                 35
<210>58
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>58
agaggagagt tagagcctca gacatatttc agtccca                               37
<210>59
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>59
ggtattgagg gtcgcatgcg actgaacaac ctcgg                                 35
<210>60
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>60
agaggagagt tagagcctca gttctccacg tattcca                               37
<210>61
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>61
ggtattgagg gtcgcatgag cgtggttcac cggaa                                 35
<210>62
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>62
agaggagagt tagagcctca atcgatatat ttcagtc                               37
<210>63
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>63
ggtattgagg gtcgcatgag cctggttaat atgaa                                 35
<210>64
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>64
agaggagagt tagagcctta tgactttaac gcgttga                               37
<210>65
<211>684
<212>DNA
<213>睾丸酮丛毛单胞菌(C.testosteroni)
<400>65
atgtacgaac tgggagttgt ctaccgcaat atccagcgcg ccgaccgcgc tgctgctgac     60
ggcctggccg ccctgggctc cgccaccgtg cacgaggcca tgggccgcgt cggtctgctc    120
aagccctata tgcgccccat ctatgccggc aagcaggtct cgggcaccgc cgtcacggtg    180
ctgctgcagc ccggcgacaa ctggatgatg catgtggctg ccgagcagat tcagcccggc    240
gacatcgtgg tcgcagccgt caccgcagag tgcaccgacg gctacttcgg cgatctgctg    300
gccaccagct tccaggcgcg cggcgcacgt gcgctgatca tcgatgccgg cgtgcgcgac    360
gtgaagacgc tgcaggagat ggactttccg gtctggagca aggccatctc ttccaagggc    420
acgatcaagg ccaccctggg ctcggtcaac atccccatcg tctgcgccgg catgctggtc    480
acgcccggtg acgtgatcgt ggccgacgac gacggcgtgg tctgcgtgcc cgccgcgcgt    540
gccgtggaag tgctggccgc cgcccagaag cgtgaaagct tcgaaggcga aaagcgcgcc    600
aagctggcct cgggcatcct cggcctggat atgtacaaga tgcgcgagcc cctggaaaag    660
gccggcctga aatatattga ctaa                                           684
<210>66
<211>227
<212>PRT
<213>睾丸酮丛毛单胞菌(C.testosteroni)
<400>66
Met Tyr Glu Leu Gly Val Val Tyr Arg Asn Ile Gln Arg Ala Asp Arg
1                5                  10                  15
Ala Ala Ala Asp Gly Leu Ala Ala Leu Gly Ser Ala Thr Val His Glu
            20                  25                  30
Ala Met Gly Arg Val Gly Leu Leu Lys Pro Tyr Met Arg Pro Ile Tyr
        35                  40                  45
Ala Gly Lys Gln Val Ser Gly Thr Ala Val Thr Val Leu Leu Gln Pro
    50                  55                  60
Gly Asp Asn Trp Met Met His Val Ala Ala Glu Gln Ile Gln Pro Gly
65                  70                  75                  80
Asp Ile Val Val Ala Ala Val Thr Ala Glu Cys Thr Asp Gly Tyr Phe
                85                  90                  95
Gly Asp Leu Leu Ala Thr Ser Phe Gln Ala Arg Gly Ala Arg Ala Leu
            100                 105                 110
Ile Ile Asp Ala Gly Val Arg Asp Val Lys Thr Leu Gln Glu Met Asp
        115                 120                 125
Phe Pro Val Trp Ser Lys Ala Ile Ser Ser Lys Gly Thr Ile Lys Ala
    130                 135                 140
Thr Leu Gly Ser Val Asn Ile Pro Ile Val Cys Ala Gly Met Leu Val
145                 150                 155                 160
Thr Pro Gly Asp Val Ile Val Ala Asp Asp Asp Gly Val Val Cys Val
                165                 170                 175
Pro Ala Ala Arg Ala Val Glu Val Leu Ala Ala Ala Gln Lys Arg Glu
            180                 185                 190
Ser Phe Glu Gly Glu Lys Arg Ala Lys Leu Ala Ser Gly Ile Leu Gly
        195                 200                 205
Leu Asp Met Tyr Lys Met Arg Glu Pro Leu Glu Lys Ala Gly Leu Lys
    210                 215                 220
Tyr Ile Asp
225
<210>67
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>67
actcggatcc gaaggagata tacatatgta cgaactggga ct                         42
<210>68
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>68
cggctgtcga ccgttagtca atatatttca ggc                                   33
<210>69
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>69
cgcggatcca taatggttga gaacattacc g                                     31
<210>70
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>70
acgcgtcgac ttacagcact gccacaatcg                                       30
<210>71
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>71
ccggaattca taatggtcga actgggagtt gt                                    32
<210>72
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>72
gaatgcggcc gcttagtcaa tatatttcag gcc                                   33
<210>73
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>73
ggtattgagg gtcgc                                                       15
<210>74
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>74
agaggagagt tagagcc                                                     17

Claims (75)

1.一种包含胶基部分和可溶部分的口香糖组合物，其特征在于，所述可溶部分含有莫那甜或其盐。
2.如权利要求1所述的口香糖组合物，其特征在于，一定量的所述组合物含有的卡路里和碳水化合物低于相同量的含有蔗糖而非莫那甜或其盐的口香糖组合物。
3.一种含有莫那甜或其盐的口香糖组合物，其特征在于，与代替口香糖组合物中的莫那甜或其盐的其它高强度甜味剂相比，所述莫那甜或其盐的存在量提供时间延长的甜味和未加遮掩或增强的香味。
4.如权利要求3所述的口香糖组合物，其特征在于，所述其它高强度甜味剂选自天冬甜素和三氯蔗糖。
5.一种制备加入莫那甜的口香糖组合物的方法，所述组合物具有由莫那甜或其盐提供的增强的长期甜味，该方法包括以下步骤：
(a)通过生物合成途径产生莫那甜或其盐；
(b)将莫那甜或其盐与其它成分结合；和
(c)形成口香糖组合物。
6.一种含有莫那甜或其盐的口香糖组合物，其特征在于，所述莫那甜或其盐的量可提供增强的长期甜味。
7.如权利要求1所述的口香糖组合物，其特征在于，与天冬甜素或三氯蔗糖相比，所述莫那甜或其盐的存在量可提供时间延长的甜味。
8.如权利要求1所述的口香糖组合物，其特征在于，所述可溶部分还含有柑桔香精。
9.如权利要求1所述的口香糖组合物，其特征在于，所述可溶部分还含有柑桔香精并且所述莫那甜或其盐的存在量能增强由柑桔香精提供的香味。
10.如权利要求1所述的口香糖组合物，其特征在于，所述组合物含有约0.001-1.1重量％的莫那甜或其盐。
11.如权利要求10所述的口香糖组合物，其特征在于，所述组合物基本上不含S，S莫那甜或其盐。
12.如权利要求10所述的口香糖组合物，其特征在于，所述组合物基本上不含R，R莫那甜或其盐。
13.如权利要求1所述的口香糖组合物，其特征在于，所述组合物含有约0.009-0.1重量％的R，R莫那甜或其盐。
14.如权利要求13所述的口香糖组合物，其特征在于，所述组合物含有约0.015-0.025重量％的R，R莫那甜或其盐。
15.如权利要求1所述的口香糖组合物，其特征在于，所述组合物含有约0.1-1.1重量％的S，S莫那甜或其盐。
16.如权利要求15所述的口香糖组合物，其特征在于，所述组合物含有约0.15-0.88重量％的S，S莫那甜或其盐。
17.如权利要求1所述的口香糖组合物，其特征在于，所述组合物含有约0-1.1重量％的R，R莫那甜或其盐以及约0-0.1重量％的R，R莫那甜或其盐。
18.如权利要求1所述的口香糖组合物，其特征在于，所述组合物含有约0.1或更低重量％的R，R莫那甜或其盐，并且所述莫那甜或其盐基本上不含S，S、S，R或R，S莫那甜或其盐。
19.如权利要求1所述的口香糖组合物，其特征在于，所述组合物含有约1.1或更低重量％的S，S莫那甜或其盐，并且所述莫那甜或其盐基本上不含R，R、S，R或R，S莫那甜或其盐。
20.如权利要求1所述的口香糖组合物，其特征在于，所述莫那甜或其盐基本上由R，R莫那甜或其盐组成。
21.如权利要求1所述的口香糖组合物，其特征在于，所述莫那甜或其盐基本上由S，S莫那甜或其盐组成。
22.如权利要求1所述的口香糖组合物，其特征在于，所述莫那甜或其盐是立体异构富含的R，R莫那甜或其盐。
23.如权利要求1所述的口香糖组合物，其特征在于，所述莫那甜或其盐是立体异构富含的S，S莫那甜或其盐。
24.如权利要求1所述的口香糖组合物，其特征在于，所述莫那甜或其盐含有至少95％的R，R莫那甜或其盐。
25.如权利要求1所述的口香糖组合物，其特征在于，所述莫那甜或其盐含有至少95％的S，S莫那甜或其盐。
26.如权利要求1所述的口香糖组合物，其特征在于，所述莫那甜或其盐以生物合成途径产生。
27.如权利要求1所述的口香糖组合物，其特征在于，所述可溶部分还含有环己氨基磺酸盐。
28.如权利要求1所述的口香糖组合物，其特征在于，所述可溶部分还含有赤藓醇。
29.如权利要求1所述的口香糖组合物，其特征在于，所述部分的所有成分是天然的。
30.如权利要求1所述的口香糖组合物，其特征在于，所述组合物是生物可降解的。
31.如权利要求30所述的口香糖组合物，其特征在于，所述组合物含有选自以下的成分：乳酸共聚物、蛋白质、节路顿胶、派里罗胶、香豆果胶、二齿铁线子木胶、巧克力铁线子木胶、红檀木胶、柔星丁哈胶、糖胶树胶、古塔胶、阿拉伯半乳聚糖、瓜耳胶、黄原胶及其组合。
32.如权利要求1所述的口香糖组合物，其特征在于，所述组合物是不生龋齿的。
33.一种包含胶基部分和可溶部分的口香糖组合物，其中，所述可溶部分含有立体异构富含的莫那甜混合物，其中所述莫那甜混合物由生物合成途径产生。
34.如权利要求33所述的口香糖组合物，其特征在于，所述生物合成途径是多步骤途径并且该多步骤途径的至少一步是化学转化。
35.如权利要求33所述的口香糖组合物，其特征在于，所述混合物主要是R，R莫那甜或其盐。
36.如权利要求33所述的口香糖组合物，其特征在于，所述混合物主要是S，S莫那甜或其盐。
37.一种含有胶基部分和可溶部分的口香糖组合物，其中所述可溶部分含有以生物合成途径产生的莫那甜组合物，并且其中所述莫那甜组合物不含石化、有毒或有害的污染物。
38.一种含有胶基部分和可溶部分的口香糖组合物，其中所述可溶部分含有莫那甜或其盐，其中所述莫那甜或其盐以生物合成途径产生并且从重组细胞中分离，且其中所述重组细胞不含石化、有毒或有害的污染物。
39.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述胶基部分含有3-50重量％的弹性体；0.5-25重量％的软化剂；2-30重量％的乳化剂；5-75重量％的树脂和0-20重量％的填料。
40.如权利要求39所述的口香糖组合物，其特征在于，所述弹性体选自天然橡胶、天然树胶和合成弹性体。
41.如权利要求40所述的口香糖组合物，其特征在于，所述天然橡胶选自烟熏乳胶、液态乳胶和银胶菊。
42.如权利要求40所述的口香糖组合物，其特征在于，所述天然树胶选自节路顿胶、派里罗胶、香豆果胶、二齿铁线子木胶、巧克力铁线子木胶、红檀木胶、柔星丁哈胶、糖胶树胶和古塔胶。
43.如权利要求40所述的口香糖组合物，其特征在于，所述合成弹性体选自丁二烯-苯乙烯共聚物、异丁烯-异戊二烯共聚物、聚丁二烯、聚异丁烯和乙烯基聚合弹性体。
44.如权利要求39所述的口香糖组合物，其特征在于，所述软化剂选自一种或多种以下物质：牛油、氢化牛油、氢化植物油、部分氢化的植物油、可可脂、单硬脂酸甘油酯、三乙酸甘油酯、卵磷脂、单甘油酯、甘油二酯、甘油三酯、乙酰化单甘油酯和脂肪酸。
45.如权利要求39所述的口香糖组合物，其特征在于，所述填料包括一种或多种以下物质：卵磷脂、菊粉、聚糊精、碳酸钙、碳酸镁、硅酸镁、重质碳酸钙、硅酸铝、滑石粉、粘土、氧化铝、二氧化钛和磷酸钙。
46.如权利要求39所述的口香糖组合物，其特征在于，所述乳化剂是单硬脂酸甘油酯、卵磷脂、聚甘油多聚蓖酸或硬脂酸镁。
47.如权利要求39所述的口香糖组合物，其特征在于，所述树脂是松香酯、萜树脂、乙酸聚乙烯醇纤维、聚乙烯醇、乙烯乙酸乙烯酯或乙酸乙烯酯-月桂酸乙烯酯共聚物。
48.如权利要求47所述的口香糖组合物，其特征在于，所述松香酯是部分氢化松香的甘油酯、聚合松香的甘油酯、部分二聚松香的甘油酯、松香的甘油酯、部分氢化松香的季戊四醇酯、松香的甲酯或部分氢化松香的甲酯。
49.如权利要求39所述的口香糖组合物，其特征在于，所述乳化剂和软化剂是不同的化合物。
50.如权利要求39所述的口香糖组合物，其特征在于，所述乳化剂和填料是不同的化合物。
51.如权利要求39所述的口香糖组合物，其特征在于，所述软化剂和填料是不同的化合物。
52.如权利要求1所述的口香糖组合物，其特征在于，所述可溶部分还含有散装甜味剂。
53.如权利要求52所述的口香糖组合物，其特征在于，所述散装甜味剂是玉米甜味剂、蔗糖、右旋糖、转化糖、糊精、果糖、左旋糖、固体玉米糖浆、半乳糖、海藻糖、异麦芽酮糖或其组合。
54.如权利要求1所述的口香糖组合物，其特征在于，所述可溶部分还含有高强度甜味剂或低糖碳水化合物。
55.如权利要求54所述的口香糖组合物，其特征在于，所述高强度甜味剂或低糖碳水化合物选自山梨糖醇、甘露醇、麦芽糖醇、氢化淀粉水解物、木糖醇、阿力甜、索马甜、三氯蔗糖、天冬甜素、丁磺氨K、二氢查尔酮、糖精、纽甜、环己氨基磺酸盐、甜菊苷、罗汉果甙、塔格糖、赤藓糖、异麦芽糖、乳糖醇、甘草甜素、叶甜素、莫内林、马槟榔甜素、布那珍、仙茅甜蛋白、奇果蛋白和倍他丁。
56.如权利要求1所述的口香糖组合物，其特征在于，所述可溶部分还含有调味剂。
57.如权利要求56所述的口香糖组合物，其特征在于，所述调味剂是精油、水果调味剂、合成调味剂或其组合。
58.如权利要求57所述的口香糖组合物，其特征在于，所述精油是薄荷油、留兰香油或冬青油。
59.如权利要求57所述的口香糖组合物，其特征在于，所述调味剂是水果调味剂。
60.如权利要求59所述的口香糖组合物，其特征在于，所述水果调味剂包括柠檬、酸橙、橙、红桔、葡萄柚、香橼、金桔、香蕉、樱桃、苹果、菠萝、葡萄、草莓、什锦水果、西瓜或其组合的提取物、香精或油。
61.如权利要求1所述的口香糖组合物，其特征在于，所述莫那甜或其盐是R，R和S，S莫那甜或其盐的混合物。
62.如权利要求1所述的口香糖组合物，其特征在于，所述可溶部分含有莫那甜或其盐与丁磺氨K的混合物。
63.如权利要求62所述的口香糖组合物，其特征在于，所述组合物含有约0.1-1.1重量％的S，S莫那甜或其盐与约0.1-0.3重量％的丁磺氨K。
64.如权利要求62所述的口香糖组合物，其特征在于，所述组合物含有0.05-0.7重量％的S，S莫那甜或其盐与约0.01-0.2重量％的丁磺氨K。
65.如权利要求62所述的口香糖组合物，其特征在于，所述组合物含有约0.009-0.1重量％的R，R莫那甜或其盐与约0.01-0.3重量％的丁磺氨K。
66.如权利要求1所述的口香糖组合物，其特征在于，所述莫那甜或其盐是包裹化的。
67.如权利要求1所述的口香糖组合物，其特征在于，所述胶基部分占组合物的15-30重量％。
68.如权利要求1所述的口香糖组合物，其特征在于，所述可溶部分还含有散装甜味剂、高强度甜味剂或低糖碳水化合物以及调味剂。
69.一种制备含有莫那甜或其盐的口香糖组合物的方法，其中所述方法包括从至少一种选自葡萄糖、色氨酸、吲哚-3-乳酸、吲哚-3-丙酮酸和莫那甜前体的底物来产生莫那甜或其盐。
70.一种制备含有莫那甜或其盐的口香糖组合物的方法，其中所述方法包括通过生物合成途径产生莫那甜或其盐。
71.一种制备含有莫那甜或其盐的口香糖组合物的方法，其中所述方法包括使用至少一步生物转化产生莫那甜或其盐。
72.如权利要求69所述的方法，其特征在于，所述方法还包括将莫那甜或其盐与至少一种非莫那甜或其盐的其它成分组合起来。
73.如权利要求72所述的方法，其特征在于，所述口香糖组合物含有约0-1.1重量％的S，S莫那甜或其盐与约0-0.1重量％的R，R莫那甜或其盐。
74.一种制备含有莫那甜组合物的口香糖组合物的方法，所述方法包括：(a)通过生物合成途径在重组细胞中产生莫那甜或其盐；(b)从重组细胞中分离莫那甜组合物，其中所述莫那甜组合物由莫那甜或其盐与其它可食用或可饮用的物质组成。
75.一种含有莫那甜或其盐与至少一种选自下列物质的其它成分的口香糖组合物：赤藓醇、海藻糖、山梨醇、甘露醇、麦芽糖醇、木糖醇、阿力甜、索马甜、三氯蔗糖、天冬甜素、丁磺氨K、二氢查尔酮、糖精、纽甜、环己氨基磺酸盐、甜菊苷、罗汉果甙、塔格糖、异麦芽糖、乳糖醇、甘草甜素、叶甜素、莫内林、马槟榔甜素、布那珍、仙茅蛋白、奇果蛋白或倍他丁。
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