DE602004006141T2

DE602004006141T2 - Monatinhaltige kaugummizusammensetzungen und verfahren zu ihrer herstellung

Info

Publication number: DE602004006141T2
Application number: DE602004006141T
Authority: DE
Inventors: Paula M. Eden Prairie HICKS; Timothy W. Minnetonka ABRAHAM; Douglas C. Plymouth CAMERON; Melanie J. Dayton GOULSON; Michael G. Crowthorne LINDLEY; Sara C. St. Paul MCFARLAN; James R. Plymouth MILLIS; John Iowa City ROSAZZA; Lishan Carlsbad ZHAO; David P. Del Mar WEINER
Original assignee: Cargill Inc
Current assignee: Cargill Inc
Priority date: 2003-08-14
Filing date: 2004-08-16
Publication date: 2007-12-27
Anticipated expiration: 2024-08-17
Also published as: AU2004264949A1; AU2004264949B2; BRPI0413581A; CN1852661A; MXPA06001663A; ATE360370T1; US20050170041A1; KR101194132B1; WO2005016022A1; EP1653810B1; KR20060066090A; ES2285521T3; JP2007502117A; DE602004006141D1; CN1852661B; EP1653810A1; JP2012095663A

Description

QUERVERWEIS AUF VERWANDTE ANMELDUNGEN
Diese Anmeldung nimmt den Vorteil der provisorischen U.S.-Patent-Anmeldung 60/495 191 in Anspruch, welche am 14. August 2003 eingereicht wurde.
GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft neue Kaugummizusammensetzungen, einschließlich funktioneller Gummis oder "Rubble Gum", umfassend Monatin, und Verfahren zur Herstellung derartiger Zusammensetzungen. Die vorliegende Erfindung betrifft des Weiteren Kaugummizusammensetzungen, welche ein spezifisches Monatin-Stereoisomer umfassen, spezifische Mischungen von Monatin-Stereoisomeren und/oder Monatin, welches durch einen biosynthetischen Weg in vivo (z. B. innerhalb von Zellen) oder in vitro hergestellt wird.
HINTERGRUND
Die Verwendung von nicht-kalorienhaltigen intensitätsstarken Süßstoffen nimmt auf Grund von Gesundheitsbedenken zu, welche über Kindheits-Fettleibigkeit, Typ-II-Diabetes und verwandte Krankheiten entstanden sind. Somit existiert ein Bedarf nach Süßstoffen mit einer signifikant höheren Süße als derjenigen in herkömmlichen Süßstoffen, wie granuliertem Zucker (Sucrose bzw. Saccharose). Viele intensitätsstarke Süßstoffe enthalten unangenehme Fehlaromen und/oder unerwartete und geringer-als-erwünschte Süßeprofile. In Bestrebungen, diese Probleme zu überwinden, fährt die Industrie damit fort, bedeutende Forschungsanstrengungen hinsichtlich Bitterkeits-Inhibitoren, Fehlgeschmack-Maskierungstechnologien und Süßstoffmischungen durchzuführen, um ein zu Sucrose ähnliches Süßeprofil zu erzielen.
Monatin (2-Hydroxy-2-(indol-3-ylmethyl)-4-aminoglutarsäure) ist ein natürlich vorkommender intensitätsstarker Süßstoff, welcher aus der Pflanze Sclerochiton ilicifolius isoliert wurde, die in der Transvaal-Region in Südafrika gefunden wird. Monatin enthält kein Kohlenhydrat oder Zucker und fast keine Kalorien, anders als Sucrose oder andere Nährstoff-Süßstoffe bei gleicher Süße.
ZUSAMMENFASSUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Kaugummizusammensetzungen, welche Monatin (2-Hydroxy-2-(indol-3-ylmethyl)-4-aminoglutarsäure – ebenfalls bekannt als 4-Amino-2-hydroxy-2-(1H-indol-3-ylmethyl)-pentandisäure, oder alternativ dazu, basierend auf einem anderen Nummerierungssystem 4-Hydroxy-4-(3-indolylmethyl)-glutaminsäure) umfassen, eine Verbindung mit der Formel:
Monatin ist ein natürlich vorkommender intensitätsstarker Süßstoff. Monatin besitzt vier stereoisomere Formen: 2R, 4R (das "R,R-Stereoisomer" oder "R,R-Monatin"), 2S, 4S (das "S,S-Stereoisomer" oder "S,S-Monatin"), 2R, 4S (das "R,S-Stereoisomer" oder "R,S-Monatin") und 2S, 4R (das "S,R-Stereoisomer" oder "S,R-Monatin"). Wie hierin verwendet, es sei denn es ist anderweitig angegeben, bezieht sich "Monatin" auf alle vier Stereoisomere von Monatin sowie jegliche Mischungen von jedweder Kombination von Monatin-Stereoisomeren (z. B. eine Mischung der R,R- und S,S-Stereoisomeren von Monatin).
Monatin besitzt eine hervorragende Süße-Qualität. Monatin besitzt ein Geschmacksprofil, welches so rein oder reiner wie bei anderen bekannten intensitätsstarken Süßstoffen ist. Die Dosis-Antwort-Kurve von Monatin ist linearer und deshalb ähnlicher zu Sucrose als bei anderen intensitätsstarken Süßstoffen, wie Saccharin. Das ausgezeichnetes Süßeprofil von Monatin macht Monatin wünschenswert zur Verwendung in Kaugummizusammensetzungen, Tafelsüßstoffen, Nahrungsmitteln, Getränken und anderen Produkten.
Verschiedene Stereoisomere von Monatin, einschließlich der R,R- und S,S-Stereoisomere, besitzen ein Potenzial in der Süßmacher-Industrie, entweder als separate Bestandteile oder in Mischungen. Monatin und Mischungen von Stereoisomeren von Mo natin mit anderen Süßstoffen besitzen angenommenermaßen überlegene Geschmacksmerkmale und/oder physikalische Qualitäten, im Vergleich zu anderen intensitätsstarken Süßstoffen. Zum Beispiel ist Monatin stabiler als Aspartam (ebenfalls bekannt als "APM"), besitzt einen reineren Geschmack als Saccharin, und ein Stereoisomer (R,R-Monatin) ist süßer als Sucralose. Dergleichen besitzen Monatin-Süßstoffe nicht den bitteren Nachgeschmack, welcher mit Saccharin assoziiert ist, oder die metallischen, sauren, adstringierenden oder in der Kehle brennenden Nachgeschmäcker von einigen anderen intensitätsstarken Süßstoffen. Darüber hinaus zeigen Monatin-Süßstoffe nicht den Lakritz-Nachgeschmack, welcher mit bestimmten natürlichen Süßstoffen, wie Steviosid und Glycyrrhizin, einhergeht.
Weiterhin, anders als Aspartam-Süßstoffe, erfordern Monatin-Süßstoffe nicht eine Phenylalanin-Warnung für Patienten mit Phenylketonurie. In gleicher Weise wird es erwartet, dass Monatin nicht-kariogen ist (d.h. den Zahnzerfall nicht fördert), weil es keine fermentierbaren Kohlenhydrate enthält. Es wird des Weiteren erwartet, dass Monatin nicht einen Abfall unter pH ~5,7 (welcher schädlich für die Zähne sein kann) verursachen wird, wenn es mit Speichel vermischt wird, wie gemessen in einem pH-Abfalltest. Auf Grund seiner intensiven Süße sollte im Besonderen das R,R-Stereoisomer wirtschaftlich wettbewerbsfähig im Vergleich zu anderen intensitätsstarken Süßstoffen sein.
In einem Aspekt sieht die vorliegende Erfindung eine Kaugummizusammensetzung vor, welche einen Gummigrundstoffanteil und einen löslichen Anteil einschließt, wobei der lösliche Anteil Monatin umfasst, wie R,R-, S,S-, R,S- oder S,R-Monatin oder eine Mischung von verschiedenen Stereoisomeren. In einer Ausführungsform umfasst der Gummigrundstoffanteil 3 bis 50 Gew.-% eines Elastomers; 0,5 bis 25 Gew.-% eines Weichmachers; 2 bis 30 Gew.-% eines Emulgators; 5 bis 75 Gew.-% eines Harzes; und 0 bis 20 Gew.-% eines Füllstoffs. Der Ausdruck "Gew.-%" bedeutet Gewichtsprozent. Zum Beispiel bezieht sich ein Gew.-% auf 1 Gramm je 100 Gramm, oder 10 Gramm je 1 kg. In einer anderen Ausführungsform kann der Gummigrundstoffanteil 15 bis 30 Gew.-% der Zusammensetzung ausmachen. In anderen Ausführungsformen kann das Elastomer aus einem Naturkautschuk, einem Naturgummi, einem biologisch abbaubaren Gummi, einem synthetischen Elastomer und einer Kombination hiervon gewählt werden.
Zum Beispiel kann der Naturkautschuk gewählt werden aus Rauchlatex, Flüssiglatex und Guayule. Das natürliche und/oder biologisch abbaubare Gummi kann gewählt werden aus zum Beispiel Jelutong, Perillo, Sorva, Massaranduba balata, Massaranduba-Schokolade, Nispero, Rosindinha, Chicle, Gutta hang kang, Arabinogalactan, Guar, Xanthan und Gummis, welche aus Proteinen hergestellt sind, wie Gluten und Zein. Der Begriff "natürlich" bedeutet existierend in oder gebildet von der Natur. Der Begriff "biologisch abbaubar" bedeutet fähig zum Zerfall oder zur Zersetzung durch die Wirkung von biologischen Prozessen oder Mitteln, wie lebenden Organismen. In einigen Ausführungsformen ist das biologisch abbaubare Gummi weniger klebrig oder nicht-klebrig. Das synthetische Elastomer kann beispielsweise aus Butadien-Styrol-Copolymeren, Isobutylen-Isopren-Copolymeren, Polybutadien, Polyisobutylen und polymeren Vinylelastomeren gewählt werden.
In manchen Ausführungsformen kann ein Weichmacher (ebenfalls bekannt als ein Plastifizierer) eines oder mehrere aus Talg, hydriertem Talg, hydrierten Pflanzenölen, teilweise hydrierten Pflanzenölen, Kakaobutter, Glycerolmonostearat, Glyceroltriacetat, Lecithin, Monoglyceriden, Diglyceriden, Triglyceriden, acetylierten Monoglyceriden, Fettsäuren, Sirups, wie Polyol-Sirups (z. B. Maltitol-Sirup, Glycerol-Sirup und Glycerol) und gemischten Polyol-Sirups und eine Kombination hiervon einschließen. In anderen Ausführungsformen kann der Füllstoff eines oder mehreres von Lecithin, Inulin, Polydextrin, Calciumcarbonat, Magnesiumcarbonat, Magnesiumsilikat, gemahlenem Kalkstein, Aluminiumsilikat, Talkum, Ton, Aluminiumoxid, Titandioxid und Calciumphosphat sein. In anderen Ausführungsformen kann der Emulgator Glycerolmonostearat, Lecithin, Polyglycerolpolyricinolsäure oder Magnesiumstearat sein. In anderen Ausführungsformen kann es sich bei dem Harz um einen Kolophoniumester, ein Terpenharz, Polyvinylacetat, Polyvinylalkohol, Ethylenvinylacetat oder Vinylacetat-Vinyllaurat-Copolymer handeln. In anderen Ausführungsformen kann der Kolophoniumester ein Glycerolester von teilweise hydriertem Kolophonium, ein Glycerolester von polymerisiertem Kolophonium, ein Glycerolester von teilweise dimerisiertem Kolophonium, ein Glycerolester von Kolophonium, ein Pentaerythritolester von teilweise hydriertem Kolophonium, ein Methylester von Kolophonium oder ein Methylester von teilweise hydriertem Kolophonium sein.
In Ausführungsformen können der Emulgator und der Weichmacher, der Emulgator und der Füllstoff und der Weichmacher und der Füllstoff verschiedene Verbindungen sein.
In anderen Ausführungsformen kann der lösliche Anteil ferner einen Massensüßstoff einschließen, z. B. einen Maissüßstoff, Sucrose, Dextrose, Invertzucker, Dextrin, Fructose, Levulose, Stärkezuckersirup-Feststoffe aus Mais, Galactose, Trehalose, Isomaltulose oder eine Kombination davon. Alternativ dazu kann der lösliche Anteil ferner einen intensitätsstarken Süßstoff oder ein Kohlenhydrat mit einem niedrigeren glykämischen Anteil (d.h. ein solches, welches weniger glykämisch als Sucrose ist) einschließen. Zum Beispiel kann der intensitätsstarke Süßstoff oder das Kohlenhydrat Beispiel kann der intensitätsstarke Süßstoff oder das Kohlenhydrat mit einem niedrigeren glykämischen Anteil aus Sorbitol (einschließlich amorphem und kristallinem Sorbitol) Mannitol, Maltitol, hydrierten Stärkehydrolysaten, Xylitol, Alitam, Thaumatin, Sucralose, Aspartam, Acesulfam K, einem Dihydrochalkon, Saccharin, Neotam, einem Cyclamat, Steviosid, Mogrosid, Tagatose, Erythritol, Isomalt, Lactitol, Glycyrrhizin, Phyllodulcin, Monellin, Mabinlin, Brazzein, Curculin, Miraculin und Pentadin gewählt werden.
Alternativ dazu kann der lösliche Anteil ferner einen Aromastoff einschließen. Zum Beispiel kann der Aromastoff ein essenzielles Öl oder ein synthetischer Aromastoff oder eine Kombination davon sein. Das essenzielle Öl kann zum Beispiel Pfefferminzöl, Spearmintöl oder Öl von Wintergrün sein. Alternativ dazu kann der Aromastoff zum Beispiel ein Frucht-Aromastoff sein (z. B. Orangenöl, Limonenöl, Banane, Kirsche, Apfel, Ananas, Weintraube, Erdbeere, Tutti-frutti, Wassermelone oder Kombinationen hiervon).
In bestimmten Ausführungsformen sieht die vorliegende Erfindung Kaugummiformulierungen vor, umfassend das R,R-Stereoisomer von Monatin, das S,S-Stereoisomer von Monatin und/oder eine Mischung von Stereoisomeren von Monatin. Man kann Monatin bereitstellen, wie in einer Mischung von Stereoisomeren, in fester (z. B. gefriergetrockneter, kristalliner, amorpher und/oder pulvriger) und flüssiger Form. In einer Ausführungsform umfassen Kaugummizusammensetzungen Monatin oder Salz davon in einer Menge, welche eine Süße bereitstellt, die vergleichbar ist mit der Süße, bereitgestellt von der Menge an Sucrose (und/oder anderen Kohlenhydraten), welche in bekannten Kaugummizusammensetzungen präsentiert wird. "Ein vergleichbare Süße" bedeutet, dass eine erfahrene Sensorik-Bewertungsperson durchschnittlich feststellen wird, dass die Süße, vorgelegt in einer ersten Zusammensetzung, innerhalb eines Bereichs von 80% bis 120% der Süße liegt, welche in einer zweiten Zusammensetzung vorgelegt wird. In einer anderen Ausführungsform umfasst eine Kaugummizusammensetzung Monatin oder Salz davon in einer Menge, welche eine verbesserte lang anhaltende Süße bereitstellt. "Verbesserte lang anhaltende Süße" bedeutet eine verbesserte Süße über die Zeit im Vergleich zu der Süße, welche von Aspartam oder Sucralose in ähnlichen Kaugummizusammensetzungen über die Zeit bereitgestellt wird.
In einer Ausführungsform beträgt das R,R-Stereoisomer von Monatin etwa 0,009 bis etwa 0,1 Gew.-% der Zusammensetzung (z. B. etwa 0,015 bis etwa 0,025 Gew.-% der Zusammensetzung). In einer anderen Ausführungsform beträgt das S,S-Stereoisomer von Monatin etwa 0,1 bis etwa 1,1 Gew.-% der Zusammensetzung (z. B. etwa 0,15 bis etwa 0,88 Gew.-% der Zusammensetzung). In anderen Ausführungsformen schließt der lösliche Anteil eine Mischung des S,S-Stereoisomers von Monatin und Acesulfam K (z. B. etwa 0,1 bis etwa 1,1 Gew.-% Monatin und etwa 0,1 bis etwa 0,3 Gew.-% Acesulfam K) ein. In anderen Ausführungsformen ist das Monatin verkapselt, entweder allein oder in Kombination mit anderen Substanzen.
Der Begriff "etwa" beinhaltet den Bereich des experimentellen Fehlers, welcher bei jeder Messung auftreten kann. Es sei denn es ist anderweitig angegeben, wird von allen Mess-Zahienwerten vorausgesetzt, das Wort "etwa" davor aufzuweisen, selbst wenn das Wort "etwa" nicht ausdrücklich verwendet wird. "Verkapselt" bedeutet eingeschlossen oder enthalten innerhalb einer Umhüllung oder Mikrokapsel, wobei zum Beispiel die Mikrokapsel die umhüllte(n) Substanz(n) schützt, wodurch gestattet wird, dass diese beim Kauen langsamer freigegeben wird/werden.
In gewissen Ausführungsformen kann der lösliche Anteil ferner einen Massensüßstoff, einen intensitätsstarken Süßstoff oder ein Kohlenhydrat mit einem niedrigeren glykämischen Anteil und einen Aromastoff einschließen. In anderen Ausführungsformen kann der lösliche Anteil eine Mischung von Monatin und einem Cyclamat einschließen. In anderen Ausführungsformen können mehrere Süßstoffe (einschließlich Monatin), sowie Süßstoff (einschließlich Monatin)/Aromastoff-Mischungen verkapselt und gemeinsam verarbeitet und gemeinsam getrocknet werden.
In manchen Ausführungsformen umfassen die Kaugummizusammensetzungen Monatin, welches im Wesentlichen aus S,S- oder R,R-Monatin besteht. In anderen Ausführungsformen enthalten die Zusammensetzungen vorwiegend S,S- oder R,R-Monatin. "Vorwiegend" bedeutet, dass von den in der Zusammensetzung vorhandenen Monatin-Stereoisomeren das Monatin mehr als 90% eines jeweiligen Stereoisomers enthält. In manchen Ausführungsformen sind die Zusammensetzungen im Wesentlichen frei von S,S- oder R,R-Monatin. "Im Wesentlichen frei" bedeutet, dass, von den in der Zusammensetzung Monatin-Stereoisomeren, die Zusammensetzung weniger als 2% eines jeweiligen Stereoisomers enthält. Zusätzlich oder alternativ, bei Verwendung zur Beschreibung von Monatin, hergestellt in einem biosynthetischen Weg, beinhaltet "im Wesentlichen frei" die Menge eines Stereoisomers (z. B. S,S-Monatin), hergestellt als ein Nebenprodukt in einem biosynthetischen Weg unter Beteiligung von chiral-spezifischen Enzymen (z. B. D-Aminosäure-Dehydrogenasen oder D-Aminosäure-Aminotransferasen) und/oder chiral-spezifischen Substraten (z. B. einem solchen, welches ein Kohlenstoff in der R-Stereokonfiguration aufweist), um ein unterschiedliches spezifisches Stereoisomer (z. B. R,R-Monatin) herzustellen.
In einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Kaugummizusammensetzung bereitgestellt, welche eine stereoisomer angereicherte Monatinmischung einschließt, die auf einem biosynthetischen Weg produziert wird. "Stereoisomer angereicherte Monatinmischung" bedeutet, dass die Mischung mehr als ein Monatin-Stereoisomer enthält, und mindestens 60% der Monatin-Stereoisomere in der Mischung ein besonderes Stereoisomer sind, wie R,R, S,S, S,R oder R,S. In anderen Ausführungsformen enthält die Mischung mehr als 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% oder 99% eines jeweiligen Monatin-Stereoisomers. In einer anderen Ausführungsform umfasst eine Kaugummizusammensetzung ein stereoisomer angereichertes R,R- oder S,S-Monatin. "Stereoisomer angereichertes" R,R-Monatin bedeutet, dass das Monatin wenigstens 60% R,R-Monatin umfasst. "Stereoisomer angereichertes" S,S-Monatin bedeutet, dass das Monatin wenigstens 60% S,S-Monatin umfasst. In anderen Ausführungsformen umfasst "stereoisomer angereichertes" Monatin mehr als 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% oder 99% von R,R- oder S,S-Monatin.
In einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung einer Kaugummizusammensetzung bereitgestellt. Das Verfahren schließt das biosynthetische Produzieren von Monatin entweder in vivo oder in vitro ein. Ein "biosynthetischer Weg" umfasst mindestens einen biologischen Umwandlungsschritt. In manchen Ausführungsformen ist der biosynthetische Weg ein Mehrstufen-Verfahren, und mindestens ein Schritt ist ein biologischer Umwandlungsschritt. In anderen Ausführungsformen ist der biosynthetische Weg ein Mehrstufen-Verfahren, welches sowohl biologische als auch chemische Umwandlungsschritte beinhaltet. In einigen Ausführungsformen ist das produzierte Monatin eine stereoisomer angereicherte Monatinmischung.
In einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung existieren mehrere biosynthetische Wege zur Herstellung von Monatin aus Substraten, welche gewählt werden aus Glucose, Tryptophan, Indol-3-milchsäure sowie Indol-3-pyruvat und 2-Hydroxy-2-(indol-3-ylmethyl)-4-ketoglutarsäure (ebenfalls bekannt als "der Monatinvorläufer", "MP" oder die alpha-Ketoform von Monatin). Beispiele von biosynthetischen Wegen zum Produzieren oder Herstellen von Monatin oder seiner Intermediate werden offenbart in 1-3 und 11-13, welche potenzielle Zwischenprodukte und Endprodukte in Kästen bzw. Rahmen zeigen. Zum Beispiel findet eine Umwandlung von einem Produkt in ein anderes, wie Glucose zu Tryptophan, Tryptophan zu Indol-3-pyruvat, Indol-3-pyruvat zu MP, MP zu Monatin, oder Indol-3-milchsäure (Indollactat) zu Indol-3-pyruvat, in diesen Wegen statt.
Diese Umwandlungen innerhalb der biosynthetischen Wege können erleichtert werden durch chemische und/oder biologische Umwandlungen. Der Begriff "Umwandeln" bezieht sich auf die Verwendung von entweder chemischen Mitteln oder wenigstens einem Polypeptid in einer Reaktion zur Änderung eines ersten Intermediats zu einem zweiten Intermediat. Umwandlungen können in vivo oder in vitro stattfinden. Der Begriff "chemische Umwandlung" bezieht sich auf eine Reaktion, welche nicht aktiv durch ein Polypeptid erleichtert wird. Der Begriff "biologische Umwandlung" bezieht sich auf eine Reaktion, welche aktiv durch ein oder mehrere Polypeptide erleichtert wird. Wenn biologische Umwandlungen verwendet werden, können die Polypeptide und/oder Zellen auf Trägern immobilisiert werden, wie durch chemische Anheftung auf Polymerträgern. Die Umwandlung kann unter Anwendung jedwedes dem Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet bekannten Reaktors bewirkt werden, zum Beispiel in einem Satz- oder einem Fließ-Reaktor.
Beispiele von Polypeptiden und ihrer codierenden Sequenzen, welche verwendet werden können, um biologische Umwandlungen durchzuführen, sind in 1-3 und 11-13 gezeigt. Polypeptide mit einer oder mehreren Punktmutationen, welche gestatten, dass die Substratspezifität und/oder Aktivität der Polypeptide modifiziert werden, können verwendet werden, um Monatin herzustellen. Isolierte und rekombinante Zellen, welche derartige Polypeptide exprimieren, können verwendet werden, um Monatin herzustellen. Diese Zellen können jedwede Zelle sein, wie eine Pflanzen-, Tier-, Bakterien-, Hefe-, Algen-, Archae- oder Pilz-Zelle.
Zum Beispiel können Monatin-produzierende Zellen eine oder mehrere (wie zwei oder mehrere oder drei oder mehrere) der folgenden Aktivitäten einschließen: Tryptophan-Aminotransferase (EC 2.6.1.27), Tyrosin(Aromat)-Aminotransferase (EC 2.6.1.5), Tryptophan-Dehydrogenase (EC 1.4.1.19), Glutamat-Dehydrogenase (EC 1.4.1.2, 1.4.1.3, 1.4.1.4), Phenylalanin-Dehydrogenase (EC 1.4.1.20), Tryptophan-Phenylpyruvat-Transaminase (EC 2.6.1.28), Mehrfach-Substrat-Aminotransferase (EC 2.6.1.-), Aspartat-Aminotransferase (EC 2.6.1.1), L-Aminosäureoxidase (EC 1.4.3.2), Tryptophan-Oxidase (keine FC-Nummer, Hadar et al., J. Bacteriol. 125:1096-1104, 1976, und Furuya et al., Biosci. Biotechnol. Biochem. 64:1486-93, 2000), D-Tryptophan-Aminotransferase (Kohiba und Mito, Proceedings of the 8th International Symposium an Vitamin B₆ und Carbonyl Catalysis, Osaka, Japan 1990), D-Aminosäure-Dehydrogenase (EC 1.4.99.1), D-Aminosäure-Oxidase (EC 1.4.3.3), D-Alanin-Aminotransferase (EC 2.6.1.21), Synthase/Lyase (EC 4.1.3.-), wie 4-Hydroxy-2-oxoglutarat-Aldolase (EC 4.1.3.16) oder 4-Hydroxy-4-methyl-2-oxoglutarat-Aldolase (EC 4.1.3.17) und/oder Synthase/Lyase (4.1.2.-).
In einem anderen Beispiel können Zellen eine oder mehrere (wie zwei oder mehr, oder drei oder mehr) der folgenden Aktivitäten einschließen: Indollacetat-Dehydrogenase (EC 1.1.1.110), R-4-Hydroxyphenyllactat-Dehydrogenase (EC 1.1.1.222), 3-(4)-Hydroxyphenylpyruvat-Reduktase (EC 1.1.1.237), Lactat-Dehydrogenase (EC 1.1.1.27, 1.1.1.28, 1.1.2.3), (3-Imidazol-5-yl)-lactat-Dehydrogenase (EC 1.1.1.111), Lactat-Oxidase (EC 1.1.3.-), Synthase/Lyase (4.1.3.-) wie 4-Hydroxy-2-oxoglutarat-Aldolase (EC 4.1.3.16) oder 4-Hydroxy-4-methyl-2-oxoglutarat-Aldolase (EC 4.1.3.17), Synthase/Lyase (4.1.2.-), Tryptophan-Aminotransferase (EC 2.6.1.27), Tyrosin(Aromat)-Aminotransferase (EC 2.6.1.5), Tryptophan-Dehydrogenase (EC 1.4.1.19), Glutamat-Dehydrogenase (EC 1.4.1.2, 1.4.1.3, 1.4.1.4), Phenylalanin-Dehydrogenase (EC 1.4.1.20), Tryptophan-Phenylpyruvat-Transaminase (EC 2.6.1.28), Mehrfach-Substrat-Aminotransferase (EC 2.6.1.-), Aspartat-Aminotransferase (EC 2.6.1.1), D-Tryptophan-Aminotransferase, D-Aminosäure-Dehydrogenase (EC 1.4.99.1) und/oder D-Alanin-Aminotransferase (EC 2.6.1.21).
Darüber hinaus können die Zellen eine oder mehrere (wie zwei oder mehr, oder drei oder mehr) der folgenden Aktivitäten einschließen: Tryptophan-Aminotransferase (EC 2.6.1.27), Tyrosin(Aromat)-Aminotransferase (EC 2.6.1.5), Tryptophan-Dehydrogenase (EC 1.4.1.19), Glutamat-Dehydrogenase (EC 1.4.1.2, 1.4.1.3, 1.4.1.4), Phenylalanin-Dehydrogenase (EC 1.4.1.20), Tryptophan-Phenylpyruvat-Transaminase (EC 2.6.1.28), Mehrfach-Substrat-Aminotransferase (EC 2.6.1.-), Aspartat-Aminotransferase (EC 2.6.1.1), L-Aminosäureoxidase (EC 1.4.3.2), Tryptophan-Oxidase, D-Tryptophan-Aminotransferase, D-Aminosäure-Dehydrogenase (EC 1.4.99.1), D-Aminosäure-Oxidase (EC 1.4.3.3), D-Alanin-Aminotransferase (EC 2.6.1.21), Indollactat-Dehydrogenase (EC 1.1.1.110), R-4-Hydroxyphenyllactat-Dehydrogenase (EC 1.1.1.222), 3-(4)-Hydroxyphenylpyruvat-Reduktase (EC 1.1.1.237), Lactat-Dehydrogenase (EC 1.1.1.27, 1.1.1.28, 1.1.2.3), (3-Imidazol-5-yl)-lactat-Dehydrogenase (EC 1.1.1.111), Lactat-Oxidase (EC 1.1.3.-), Synthase/Lyase (4.1.3.-), wie 4-Hydroxy-2-oxoglutarat-Aldolase (EC 4.1.3.16) oder 4-Hydroxy-4-methyl-2-oxoglutarat-Aldolase (EC 4.1.3.17) und/oder Synthase/Lyase (4.1.2.-).
Als ein weiteres Beispiel können die Zellen eine oder mehrere der folgenden Aldolase-Aktivitäten einschließen: KHG-Aldolase, ProA-Aldolase, KDPG-Aldolase und/oder verwandte Polypeptide (KDPH), Transcarboxybenzalpyruvat-Hydratase-Aldolase, 4-(2-Carboxyphenyl)-2-oxobut-3-enoat-Aldolase, trans-O-Hydroxybenzylidenpyruvat-Hydratase-Aldolase, 3-Hydroxyaspartat-Aldolase, Benzoin-Aldolase, Dihydroneopterin-Aldolase, L-Threo-3-phenylserin-Benzaldehyd-Lyase (Phenylserin-Aldolase), 4-Hydroxy-2- oxovalerat-Aldolase, 1,2-Dihydroxybenzylpyruvat-Aldolase und/oder 2-Hydroxybenzalpyruvat-Aldolase.
Monatin kann durch Verfahren hergestellt werden, welche das Kontaktieren von Tryptophan und/oder Indol-3-milchsäure mit einem ersten Polypeptid, wobei das erste Polypeptid Tryptophan und/oder Indol-3-milchsäure zu Indol-3-pyruvat umwandelt (entweder die D- oder die L-Form von Tryptophan oder Indol-3-milchsäure kann als das Substrat verwendet werden, welches zu Indol-3-pyruvat umgewandelt wird; ein Fachmann auf dem Gebiet wird es richtig einschätzen, dass die für diesen Schritt ausgewählten Polypeptide idealerweise die geeignete Spezifität aufzeigen), das Kontaktieren des resultierenden Indol-3-pyruvats mit einem zweiten Polypeptid, wobei das zweite Polypeptid das Indol-3-pyruvat zu 2-Hydroxy-2-(indol-3-ylmethyl)-4-ketoglutarsäure) (MP) umwandelt, und das Kontaktieren des MP mit einem dritten Polypeptid, wobei das dritte Polypeptid MP zu Monatin umwandelt, einschließen. Beispielhafte Polypeptide, welche für diese Umwandlungen verwendet werden können, sind in den 2 und 3 gezeigt.
Das Herstellen von Monatin in einem biosynthetischen Weg durch eine oder mehrere biologische Umwandlungen bietet gewisse Vorteile. Zum Beispiel kann man durch Verwenden spezifischer Polypeptide und/oder gewisser Substrate in dem biosynthetischen Weg eine Mischung herstellen, angereichert hinsichtlich eines spezifischen Stereoisomers, und/oder eine Monatinmischung produzieren, welche im Wesentlichen frei von einem oder mehreren Stereoisomeren ist.
Eine Monatin-Zusammensetzung kann Verunreinigungen als eine Folge des für die Monatin-Synthese angewandten Verfahrens einschließen. Monatin-Zusammensetzungen, welche produziert wurden durch rein synthetische Mittel (d.h. nicht unter Beteiligung von wenigstens einer biologischen Umwandlung) werden andere Verunreinigungen enthalten als Monatin-Zusammensetzungen, welche über einen biosynthetischen Weg hergestellt wurden. Zum Beispiel, basierend auf den verwendeten Rohmaterialien, können Monatin-Zusammensetzungen, welche durch rein synthetische Mittel produziert wurden, petrochemische, toxische und/oder andere gefährliche Verunreingungen einschließen, welche für den menschlichen Verzehr ungeeignet sind. Beispiele derartiger Verunreingungen sind gefährliche Chemikalien, wie LDA, Wasserstoff-Pd/C, Diazomethan, KCN, Grignard-Reagenz und Na/Hg. Andererseits wird es erwartet, dass eine Monatin-Zusammensetzung, welche durch einen biosynthetischen Weg hergestellt wurde, essbare oder trinkbare Verunreinigungen enthalten kann, aber kein petrochemisches, toxisches und/oder sonstiges gefährliches Material enthalten wird.
Es wird erwartet, dass ein Verfahren zur Herstellung von Monatin in einem biosynthetischen Weg mittels einer oder mehrerer biologischer Umwandlungen weniger toxische oder gefährliche Verunreinigungen produziert und/oder einen höheren Prozentsatz an einem besonderen Stereoisomer bereitstellen kann, wenn mit rein synthetischen Methoden verglichen wird. Zum Beispiel wird es erwartet, dass man bei Herstellung von Monatin unter Verwendung von D-Aminosäure-Dehydrogenasen, D-Alanin(Aspartat)-Aminotransferasen, D-Aromat-Aminotransferasen oder D-Methionin-Aminotransferasen mindestens 60% R,R-Monatin und weniger als 40% S,S-, S,R- und/oder R,S-Monatin erhalten kann. Es wird zum Beispiel ebenfalls erwartet, dass man, bei Herstellung von Monatin unter Anwendung der oben erwähnten D-Enzyme sowie mindestens eines Substrats (z. B. des Monatinvorläufers) mit einem Kohlenstoff in der R-Stereokonfiguration, mindestens 95% R,R-Monatin und weniger als 5% S,S-, S,R- und/oder R,S-Monatin erhalten kann. Im Gegensatz dazu wird es erwartet, dass man bei Herstellung von Monatin durch rein synthetische Methoden etwa 25%-50% des gewünschten Stereoisomers erhält.
In einer Ausführungsform erzeugt ein Verfahren zur Herstellung von Monatin auf einem biosynthetischen Weg, zum Beispiel unter Beinhaltung einer oder mehrerer biologischer Umwandlungen, keine petrochemischen, toxischen oder gefährlichen Verunreinigungen. "Petrochemische, toxische oder gefährliche Verunreinigungen" bedeutet jedwedes Material, welches petrochemisch, toxisch, gefährlich und/oder anderweitig für den menschlichen Verzehr ungeeignet ist, einschließlich derjenigen Verunreinigungen, welche als Rohmaterial bereitgestellt oder bei der Produktion von Monatin durch rein synthetische Methoden erzeugt werden. In einer anderen Ausführungsform produziert ein Verfahren zur Herstellung von Monatin durch einen biosynthetischen Weg, zum Beispiel unter Beteiligung von einer oder mehreren biologischen Umwandlungen, nur essbares oder trinkbares Material. "Essbares oder trinkbares Material" bedeutet eine oder mehrere Verbindungen oder Material, welche geeignet zum Essen oder Trinken durch Menschen, oder anderweitig sicher für den menschlichen Verzehr sind. Beispiele für essbares oder trinkbares Material beinhalten Monatin, Tryptophan, Pyruvat, Glutamat, andere Aminosäuren, sowie andere Verbindungen oder Material, welche natürlicherweise im Körper vorhanden sind.
In einer Ausführungsform umfasst eine Kaugummizusammensetzung einen Gummigrundstoffanteil und einen löslichen Anteil, wobei der lösliche Anteil Monatin oder Salz davon umfasst. In einer anderen Ausführungsform umfasst der lösliche Anteil ferner ein Citrus-Aroma. In einer anderen Ausführungsform umfasst der lösliche Anteil ferner ein Citrus-Aroma, wobei das Monatin oder Salz davon in einer Menge vorhanden ist, wel che den durch das Citrus-Aroma bereitgestellten Geschmack verstärkt. In anderen Ausführungsformen umfasst der lösliche Anteil ferner ein Cyclamat und/oder Erythritol.
In anderen Ausführungsformen enthält eine Kaugummizusammensetzung, welche Monatin oder Salz davon umfasst, weniger Kalorien und Kohlenhydrate als die gleiche Menge der Kaugummizusammensetzung, welche Sucrose anstelle des Monatins oder Salzes davon enthält. In einer anderen Ausführungsform umfasst die Kaugummizusammensetzung Monatin oder Salz davon und ist nicht-kariogen. In einer anderen Ausführungsform umfasst eine Kaugummizusammensetzung Monatin oder Salz davon, welches in einer Menge vorliegt, die eine länger anhaltende Süße und ein nicht überdecktes oder verstärktes Aroma vorsieht im Vergleich mit anderen für Monatin substituierten intensitätsstarken Süßstoffen in der Kaugummizusammensetzung.
In einer anderen Ausführungsform umfasst ein Verfahren zur Herstellung einer mit Monatin gesüßten Kaugummizusammensetzung mit einer durch Monatin vorgesehenen verbesserten lang anhaltenden Süße die folgenden Schritte: (a) Herstellen von Monatin oder von Salz davon auf biosynthetischem Wege; (b) Kombinieren des Monatins oder Salzes davon mit anderen Bestandteilen; und (c) Bilden der Kaugummizusammensetzung. In einer anderen Ausführungsform umfasst eine Kaugummizusammensetzung Monatin oder Salz davon, wobei das Monatin oder Salz davon in einer Menge vorliegt, die eine verbesserte lang anhaltende Süße vorsieht. In einer Ausführungsform umfasst eine Kaugummizusammensetzung Monatin oder Salz davon in einer Menge, die eine länger anhaltende Süße im Vergleich mit Aspartam oder Sucralose vorsieht.
In einer anderen Ausführungsform umfasst eine Kaugummizusammensetzung etwa 0,001 bis etwa 1,1 Gew.-% Monatin oder Salz davon. Zum Beispiel kann die Kaugummizusammensetzung mehr als etwa 0,25 Gew.-% bis etwa 1,1 Gew.-% Monatin oder Salz davon umfassen. In einer anderen Ausführungsform umfasst eine Kaugummizusammensetzung etwa 0,009 bis etwa 0,1 Gew.-% R,R-Monatin oder Salz davon. Zum Beispiel kann die Kaugummizusammensetzung etwa 0,015 bis etwa 0,025 Gew.-% R,R-Monatin oder Salz davon umfassen. In einer anderen Ausführungsform umfasst eine Kaugummizusammensetzung etwa 0,1 bis etwa 1,1 Gew.-% S,S-Monatin oder Salz davon. Zum Beispiel kann die Kaugummizusammensetzung mehr als etwa 0,25 Gew.-% bis etwa 1,1 Gew.-% S,S-Monatin oder Salz davon umfassen, oder etwa 0,15 bis etwa 0,88 Gew.-% S,S-Monatin oder Salz davon umfassen, oder mehr als etwa 0,25 Gew.-% bis etwa 0,88 Gew.-% S,S-Monatin oder Salz davon umfassen. In einer anderen Ausführungsform umfasst eine Kaugummizusammensetzung etwa 0 bis etwa 1,1 Gew.-% S,S-Monatin oder Salz davon, und etwa 0 bis etwa 0,1 Gew.-% R,R-Monatin oder Salz davon.
In anderen Ausführungsformen umfasst eine Kaugummizusammensetzung Monatin oder Salz davon, welches im Wesentlichen frei von S,S-Monatin oder Salz davon ist, oder im Wesentlichen frei von R,R-Monatin oder Salz davon ist. In anderen Ausführungsformen umfasst die Kaugummizusammensetzung etwa 0,1 oder weniger Gew.-% R,R-Monatin oder Salz davon und ist im Wesentlichen frei von S,S-, S,R- oder R,S-Monatin oder Salz davon. In anderen Ausführungsformen umfasst die Kaugummizusammensetzung etwa 1,1 oder weniger Gew.-% S,S-Monatin oder Salz davon und ist im Wesentlichen frei von R,R-, S,R- oder R,S-Monatin oder Salz davon.
In anderen Ausführungsformen besteht eine Kaugummizusammensetzung im Wesentlichen aus R,R-Monatin oder Salz davon, oder besteht im Wesentlichen aus S,S-Monatin oder Salz davon. In weiteren Ausführungsformen umfasst eine Kaugummizusammensetzung ein stereoisomer angereichertes R,R-Monatin oder Salz davon, oder ein sterioisomer angereichertes S,S-Monatin oder Salz davon. In einer Ausführungsform umfasst ein Monatin oder Salz davon mindestens 95% R,R-Monatin oder Salz davon, oder mindestens 95% S,S-Monatin oder Salz davon.
In einer Ausführungsform umfasst eine Kaugummizusammensetzung Monatin oder Salz davon, das auf biosynthetischem Wege hergestellt wird. In einer Ausführungsform umfasst eine Kaugummizusammensetzung einen Gummigrundstoffanteil und einen löslichen Anteil, welcher Monatin oder Salz davon umfasst, wobei alle Komponenten der Anteile natürlich sind. In einer anderen Ausführungsform ist eine Kaugummizusammensetzung, welche Monatin oder Salz davon umfasst, biologisch abbaubar. Die biologisch abbaubare Kaugummizusammensetzung kann zum Beispiel Milchsäurecopolymere, Proteine, Jelutong, Perillo, Sorva, Massaranduba balata, Massaranduba-Schokolade, Nispero, Rosindinha, Chicle, Gutta hang kang, Arabinogalactan, Guar, Xanthan und eine Kombination davon umfassen.
In anderen Ausführungsformen umfasst eine Kaugummizusammensetzung einen Gummigrundstoffanteil und einen löslichen Anteil, wobei der lösliche Anteil eine stereoisomer angereicherte Monatinmischung umfasst, und wobei die Monatinmischung auf einem biosynthetischen Wege hergestellt wird. In einer anderen Ausführungsform ist der biosynthetische Weg ein mehrstufiger Weg, und mindestens ein Schritt des mehrstufigen Wegs ist eine chemische Umwandlung. In anderen Ausführungsformen handelt es sich bei der Monatinmischung vorwiegend um R,R-Monatin oder Salz davon, oder vorwiegend um S,S-Monatin oder Salz davon. In anderen Ausführungsformen umfasst eine Kaugummizusammensetzung einen Gummigrundstoffanteil und einen löslichen Anteil, wobei der lösliche Anteil eine auf einem biosynthetischen Weg hergestellte Monatin-Zusammensetzung umfasst, und wobei die Monatin-Zusammensetzung keine petrochemischen, toxischen oder gefährlichen Verunreinigungen enthält. In anderen Ausführungsformen umfasst eine Kaugummizusammensetzung Monatin oder Salz davon, welches auf einem biosynthetischen Weg hergestellt wird und von einer rekombinanten Zelle isoliert wird, und wobei die rekombinante Zelle keine petrochemischen, toxischen oder gefährlichen Verunreinigungen enthält.
In gewissen Ausführungsformen umfasst eine Kaugummizusammensetzung einen Gummigrundstoffanteil und einen löslichen Anteil, wobei der Gummigrundstoffanteil 3 bis 50 Gew.-% eines Elastomers; 0,5 bis 25 Gew.-% eines Weichmachers; 2 bis 30 Gew.-% eines Emulgators; 5 bis 75 Gew.-% eines Harzes; und 0 bis 20 Gew.-% eines Füllstoffs umfasst. In einigen Ausführungsformen wird das Elastomer aus der Gruppe gewählt, bestehend aus einem Naturkautschuk, einem Naturgummi und einem synthetischen Elastomer. In manchen Ausführungsformen wird der Naturkautschuk aus der Gruppe, bestehend aus Rauchlatex, Flüssiglatex und Guayule, gewählt. In einigen Ausführungsformen wird das Naturgummi aus der Gruppe, bestehend aus Jelutong, Perillo, Sorva, Massaranduba balata, Massaranduba-Schokolade, Nispero, Rosindinha, Chicle und Gutta hang kang, gewählt. In manchen Ausführungsformen wird das synthetische Elastomer aus der Gruppe, bestehend aus Butadien-Styrol-Copolymeren, Isobutylen-Isopren-Copolymeren, Polybutadien, Polyisobutylen und polymeren Vinylelastomeren, gewählt.
In einigen Ausführungsformen umfasst der Weichmacher eines oder mehrere aus Talg, hydriertem Talg, hydrierten Pflanzenölen, teilweise hydrierten Pflanzenölen, Kakaobutter, Glycerolmonostearat, Glyceroltriacetat, Lecithin, Monoglyceriden, Diglyceriden, Triglyceriden, acetylierten Monoglyceriden und Fettsäuren. In manchen Ausführungsformen umfasst der Füllstoff eines oder mehrere aus Lecithin, Inulin, Polydextrin, Calciumcarbonat, Magnesiumcarbonat, Magnesiumsilikat, gemahlenem Kalkstein, Aluminiumsilikat, Talg, Ton, Aluminiumoxid, Titandioxid und Calciumphosphat. In manchen Ausführungsformen ist der Emulgator Glycerolmonostearat, Lecithin, Polyglycerolpolyricinolsäure oder Magnesiumstearat. In manchen Ausführungsformen ist das Harz ein Kolophoniumester, ein Terpenharz, Polyvinylacetat, Polyvinylalkohol, Ethylenvinylacetat oder Vinylacetat-Vinyllaurat-Copolymer. In manchen Ausführungsformen ist der Kolophoniumester ein Glycerolester von teilweise hydriertem Kolophonium, ein Glycerolester von polymerisiertem Kolophonium, ein Glycerolester von teilweise dimerisiertem Kolophonium, ein Glycerolester von Kolophonium, ein Pentaerythritolester von teilweise hydriertem Kolophonium, ein Methylester von Kolophonium oder ein Methylester von teilweise hydriertem Kolophonium. In einer Ausführungsform sind der Emulgator und der Weichmacher verschiedene Verbindungen. In einer anderen Ausführungsform sind der Emulgator und der Füllstoff verschiedene Verbindungen. In einer anderen Ausführungsform sind der Weichmacher und der Füllstoff verschiedene Verbindungen.
In einer Ausführungsform umfasst der lösliche Anteil ferner einen Massensüßstoff. Der Massensüßstoff kann zum Beispiel ein Maissüßstoff, Sucrose, Dextrose, Invertzucker, Dextrin, Fructose, Levulose, Stärkezuckersirup-Feststoffe aus Mais, Galactose, Trehalose, Isomaltulose oder eine Kombination davon sein. in einer Ausführungsform umfasst der lösliche Anteil ferner einen intensitätsstarken Süßstoff oder Kohlenhydrat mit einem niedrigeren glykämischen Anteil. Der intensitätsstarke Süßstoff oder das Kohlenhydrat mit einem niedrigeren glykämischen Anteil können zum Beispiel Sorbitol, Mannitol, Maltitel, hydrierte Stärkehydrolysate, Xylitol, Alitam, Thaumatin, Sucralose, Aspartam, Acesulfam K, ein Dihydrochalkon, Saccharin, Neotam, ein Cyclamat, Steviosid, Mogrosid, Tagatose, Erythritol, Isomalt, Lactitol, Glycyrrhizin, Phyliodulcin, Monellin, Mabinlin, Brazzein, Curculin, Miraculin oder Pentadin sein.
In einer Ausführungsform umfasst der lösliche Anteil ferner einen Aromastoff. Der Aromastoff kann zum Beispiel ein essenzielles bzw. ätherisches Öl, ein Frucht-Aromastoff, ein synthetischer Aromastoff oder eine Kombination hiervon sein. Das essenzielle 01 kann zum Beispiel Pfefferminzöl, Spearmintöl oder Öl von Wintergrün sein. In einigen Ausführungsformen umfasst der Frucht-Aromastoff Extrakt, Essenz oder Öl von Zitrone, Limette, Orange, Mandarine, Grapefruit, Citrusfrucht, Kumquat, Banane, Kirsche, Apfel, Ananas, Weintraube, Erdbeere, Tuttifrutti, Wassermelone oder Kombinationen hiervon.
In einer Ausführungsform umfasst eine Kaugummizusammensetzung einen Gummigrundstoffanteil und einen löslichen Anteil, wobei der lösliche Anteil eine Mischung von R,R- und S,S-Monatin oder Salz davon umfasst. In anderen Ausführungsformen umfasst der lösliche Anteil eine Mischung von Monatin oder Salz davon und Acesulfam K. In gewissen Ausführungsformen umfasst eine Kaugummizusammensetzung etwa 0,1 bis etwa 1,1 Gew.-% S,S-Monatin oder Salz davon und etwa 0,1 bis etwa 0,3 Gew.-% Acesulfam K, oder umfasst mehr als etwa 0,25 Gew.-% bis etwa 1,1 Gew.-% S,S-Monatin oder Salz davon und etwa 0,10 bis etwa 0,3 Gew.-% Acesulfam K. In anderen Ausführungsformen umfasst eine Kaugummizusammensetzung etwa 0,05 bis etwa 0,7 Gew.-% S,S-Monatin oder Salz davon, und etwa 0,01 bis etwa 0,2 Gew.-% Acesulfam K, oder umfasst etwa 0,009 bis etwa 0,1 Gew.-% R,R-Monatin oder Salz davon und etwa 0,01 bis etwa 0,3 Gew.-% Acesulfam K.
In einer Ausführungsform umfasst eine Kaugummizusammensetzung einen Gummigrundstoffanteil und einen löslichen Anteil, wobei der lösliche Anteil Monatin oder Salz davon umfasst, welches verkapselt ist. In einigen Ausführungsformen macht der Gummigrundstoffanteil 15 bis 30 Gew.-% der Zusammensetzung aus. In anderen Ausführungsformen umfasst der lösliche Anteil ferner einen Massensüßstoff, einen intensitätsstarken Süßstoff oder Kohlenhydrat mit einem niedrigeren glykämischen Anteil und einen Aromastoff.
In einer Ausführungsform umfasst ein Verfahren zur Herstellung einer Kaugummizusammensetzung, umfassend Monatin oder Salz davon, die Herstellung von Monatin oder Salz davon aus mindestens einem Substrat, gewählt aus Glucose, Tryptophan, Indol-3-milchsäure, Indol-3-pyruvat und dem Monatinvorläufer. In gewissen Ausführungsformen umfasst das Verfahren das Kombinieren des Monatins oder Salzes davon mit mindestens einem anderen Bestandteil, welcher nicht Monatin oder Salz davon ist. In bestimmten Ausführungsformen umfasst die durch das Verfahren hergestellte Kaugummizusammensetzung etwa 0 bis etwa 1,1 Gew.-% S,S-Monatin oder Salz davon, und etwa 0 bis etwa 0,1 Gew.-% R,R-Monatin oder Salz davon. In bestimmten Ausführungsformen umfasst die durch das Verfahren hergestellte Kaugummizusammensetzung mehr als etwa 0,25 Gew.-% bis etwa 1,1 Gew.-% Monatin oder Salz davon.
In einer anderen Ausführungsform umfasst ein Verfahren zur Herstellung einer Monatin oder Salz davon umfassenden Kaugummizusammensetzung die Herstellung von Monatin oder Salz davon auf einem biosynthetischen Wege. In einer anderen Ausführungsform umfasst ein Verfahren zur Herstellung einer Kaugummizusammensetzung, umfassend Monatin oder Salz davon, die Herstellung von Monatin oder Salz davon unter Anwendung von wenigstens einer biologischen Umwandlung.
In einer Ausführungsform umfasst ein Verfahren zur Herstellung einer Kaugummizusammensetzung, umfassend eine Monatin-Zusammensetzung, Folgendes: (a) Herstellen von Monatin oder Salz davon auf einem biosynthetischen Weg in einer rekombinanten Zelle; (b) Isolieren der Monatin-Zusammensetzung von der rekombinanten Zelle, wobei die Monatin-Zusammensetzung aus Monatin oder Salz davon und anderem essbaren oder trinkbaren Material besteht. In einer anderen Ausführungsform umfasst eine Kaugummizusammensetzung Monatin oder Salz davon und mindestens einen anderen Bestandteil, gewählt aus Erythritol, Trehalose, Sorbitol, Mannitol, Maltitol, Xylitol, Alitam, Thaumatin, Sucralose, Aspartam, Acesulfam K, einem Dihydrochalkon, Saccharin, Neotam, einem Cyclamat, Steviosid, Mogrosid, Tagatose, Isomalt, Lactitol, Glycyrrhizin, Phyllodulcin, Monellin, Mabinlin, Brazzein, Curculin, Miraculin und Pentadin.
In einer Ausführungsform umfasst ein Verfahren zur Herstellung einer Kaugummizusammensetzung, umfassend eine Monatin-Zusammensetzung, die Herstellung der Monatin-Zusammensetzung auf einem biosynthetischen Wege, und wobei die Monatin-Zusammensetzung keine petrochemischen, toxischen oder gefährlichen Verunreinigungen enthält. In einer anderen Ausführungsform umfasst ein Verfahren zur Herstellung einer Kaugummizusammensetzung, umfassend eine Monatin-Zusammensetzung, die Herstellung der Monatin-Zusammensetzung aus einem Substrat auf einem mehrstufigen Weg, wobei eine oder mehrere Stufen in dem mehrstufigen Weg eine biologische Umwandlung ist/sind, und wobei die Monatin-Zusammensetzung keine petrochemischen, toxischen oder gefährlichen Verunreinigungen enthält.
In einer Ausführungsform umfasst ein Verfahren zur Herstellung einer Kaugummizusammensetzung, umfassend eine Monatin-Zusammensetzung, die Herstellung der Monatin-Zusammensetzung auf einem biosynthetischen Weg, und wobei die Monatin-Zusammensetzung aus Monatin oder Salz davon und anderem essbaren oder trinkbaren Material besteht. In einer anderen Ausführungsform umfasst ein Verfahren zur Herstellung einer Kaugummizusammensetzung, umfassend eine Monatin-Zusammensetzung, die Herstellung der Monatin-Zusammensetzung aus einem Substrat auf einem mehrstufigen Weg, wobei eine oder mehrere Stufe(n) in dem mehrstufigen Weg eine biologische Umwandlung ist, und wobei die Monatin-Zusammensetzung aus Monatin oder Salz davon und anderem essbaren oder trinkbaren Material besteht.
Für den Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet wird es aus den Belehrungen hierin offensichtlich sein, dass spezifische Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung auf einen oder eine Kombination der oben angegebenen Aspekte, sowie auf andere Aspekte gerichtet sein können.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 zeigt biosynthetische Wege, die zur Herstellung von Monatin und/oder Indol-3-pyruvat angewandt werden. Ein Weg erzeugt Indol-3-pyruvat über Tryptophan, während ein anderer Indol-3-pyruvat über Indol-3-milchsäure herstellt. Monatin wird anschließend über ein MP-Intermediat hergestellt.
Verbindungen, welche in Rahmen gezeigt sind, sind Substrate und Produkte, die in den biosynthetischen Wegen hergestellt werden. Zusammensetzungen, benachbart zu den Pfeilen, sind Cofaktoren oder Recktanten, welche während der Umwandlung eines Substrats zu einem Produkt verwendet werden können. Der verwendete Cofaktor oder Reaktant wird von dem für den jeweiligen Schritt des biosynthetischen Wegs eingesetzten Polypeptid abhängen. Der Cofaktor PLP (Pyridoxal-5'-phosphat) kann Reaktionen unabhängig von einem Polypeptid katalysieren, und deshalb kann das bloße Bereitstellen von PLP das Fortschreiten von Substrat zu Produkt gestatten.
2 ist ein ausführlicheres Diagramm des biosynthetischen Wegs, welcher das MP-Intermediat verwendet. Die Substrate für jeden Schritt in den Wegen sind in Kästen gezeigt. Die Polypeptide, welche die Umwandlung zwischen Substraten gestatten, sind benachbart zu den Pfeilen zwischen den Substraten aufgeführt. Jedes Polypeptid wird mit seinem gewöhnlichen Namen und einer Enzymklassen(EC)-Nummer beschrieben.
3 zeigt ein ausführlicheres Diagramm des biosynthetischen Wegs der Umwandlung von Indol-3-milchsäure in Indol-3-pyruvat. Die Substrate sind in Kästen gezeigt, und die Polypeptide, welche die Umwandlung zwischen den Substraten gestatten, sind benachbart zu dem Pfeil zwischen den Substraten aufgeführt. Jedes Polypeptid wird mit seinem gewöhnlichen Namen und einer EC-Nummer beschrieben.
4 zeigt eine mögliche Reaktion zur Herstellung von MP auf chemischem Wege.
5A und 5B sind Chromatogramme, welche die LC/MS-Identifizierung von enzymatisch hergestelltem Monatin zeigen.
6 ist ein Elektronenspray-Massenspektrum von enzymatisch synthetisiertem Monatin.
7A und 7B sind Chromatogramme der LC/MS/MS-Tochterionen-Analysen von in einer enzymatischen Mischung hergestelltem Monatin.
8 ist ein Chromatogramm, welches die Hochauflösungs-Massenmessung von enzymatisch hergestelltem Monatin zeigt.
9A-9C sind Chromatogramme, welche die chirale Trennung von (A) R-Tryptophan, (B) S-Tryptophan und (C) enzymatisch hergestelltem Monatin zeigen.
10 ist eine Säulengrafik, welche die relative Menge von Monatin, hergestellt in Bakterienzellen im Anschluss an IPTG-Induktion zeigt. Das (–) gibt ein Fehlen von Substratzugabe an (kein Tryptophan oder Pyruvat wurde zugegeben).
11-12 sind schematische Diagramme, welche Wege zeigen, die verwendet wurden, um die Ausbeute an Monatin, welches aus Tryptophan oder Indol-3-pyruvat hergestellt wird, zu erhöhen.
13 ist ein schematisches Diagramm, welches einen Weg zeigt, der verwendet werden kann, um die Ausbeute an Monatin, welches aus Tryptophan oder Indol-3-pyruvat hergestellt wird, zu erhöhen.
14 präsentiert eine Dosis-Antwort-Kurve, erhalten mit einem R,R-Stereoisomer von Monatin.
15 präsentiert eine Dosis-Antwort-Kurve, erhalten mit einer R,R/S,S-Stereoisomermischung von Monatin.
16 vergleicht die Dosis-Antwort-Kurve, welche mit einer R,R/S,S-Stereoisomermischung von Monatin erhalten wurde, mit einer Dosis-Antwort-Kurve, die mit Saccharin erhalten wurde.
17 zeigt die Umkehrphasen-Chromatografie von Standards von synthetisch hergestelltem Monatin.
18 zeigt die chirale Chromatografie von Monatinstandards.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG
Überblick über die biosynthetischen Wege für die Monatin-Herstellung
Die folgenden Erläuterungen von Begriffen und Verfahren sind angegeben, um die vorliegende Offenbarung besser zu beschreiben und den Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet in der Ausübung der vorliegenden Offenbarung anzuleiten. Wie hierin verwendet, steht "einschließlich" für "umfassend". Darüber hinaus schließen die Singularformen "ein" oder "eine" oder "der" mehrere Bezüge ein, es sei denn, der Kontext schreibt es anderslautend deutlich vor. Wie hierin verwendet, bezieht sich "Kaugummi" auf alle Typen von Kaugummi, einschließlich funktionellen Gummis und "Bubblegum".
"Funktioneller Gummi" bezieht sich auf einen Kaugummi, welcher mindestens eine funktionelle oder medizinische Komponente umfasst. Zum Beispiel können funktionelle Gummis Medikamente, wie Nikotin, Aspirin oder Reisekrankheits-Medikamente (z. B. Dimenhydrinat) oder Nährstoffe (z. B. Vitamine und/oder Mineralien) oder kosmetische Komponenten (z. B. Zahnweillmacher- und/oder Atemfrische-Bestandteile) abgeben.
Wie gezeigt in 1-3 und 11-13, können viele biosynthetische Wege verwendet werden, um Monatin oder seine Intermediate, wie Indol-3-pyruvat oder MP, zu produzieren. Für die Umwandlung jedes Substrats (z. B. Glucose, Tryptophan, Indol-3-milchsäure, Indol-3-pyruvat und MP) in jedes Produkt (z. B. Tryptophan, Indol-3-pyruvat, MP und Monatin) können mehrere verschiedene Polypeptide verwendet werden. Weiterhin können diese Reaktionen in vivo, in vitro oder durch eine Kombination von In-vivo-Reaktionen und In-vitro-Reaktionen ausgeführt werden, wie etwa In-vitro-Reaktionen, welche nicht-enzymatische chemische Reaktionen einschließen. Deshalb sind die 1-3 und 11-13 exemplarisch und zeigen viele verschiedene Wege, welche verwendet werden können, um gewünschte Produkte zu erhalten.
Glucose zu Tryptophan
Viele Organismen können Tryptophan aus Glucose synthetisieren. Die Konstrukt(e), welche die zum Produzieren von Monatin, MP und/oder Indol-3-pyruvat aus Glucose und/oder Tryptophan notwendigen Gen(e) enthalten, können in derartige Organismen kloniert werden. Es wird hierin gezeigt, dass Tryptophan in Monatin umgewandelt werden kann.
In anderen Beispielen kann ein Organismus unter Anwendung bekannter Polypeptide manipuliert werden, um Tryptophan zu produzieren oder Tryptophan überzuproduzieren. Zum Beispiel beschreibt das U.S.-Patent Nr. 4 371 614 einen E. coli-Stamm, der mit einem Plasmid, welches ein Wildtyp-Tryptophan-Operon enthält, transformiert ist.
Maximumtiter von Tryptophan, welche im U.S.-Patent Nr. 4 371 614 offenbart werden, belaufen sich auf etwa 230 ppm. In ähnlicher Weise beschreibt WO 8701130 einen E. coli-Stamm, welcher genetisch verändert worden ist, um Tryptophan zu produzieren, und erörtert die Erhöhung der fermentativen Produktion von L-Tryptophan. Der Fachmann auf dem Gebiet wird erkennen, dass Organismen, die zum Produzieren von Tryptophan aus Glucose in der Lage sind, ebenfalls in der Lage sind, andere Kohlenstoff- und Energiequellen zu verwerten, welche zu Glucose oder Fructose-6-Phosphat umgewandelt werden können, und zwar mit ähnlichen Ergebnissen. Beispielhafte Kohlen stoff- und Energiequellen schließen, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, Sucrose, Fructose, Stärke, Zellulose oder Glycerol ein.
Tryptophan zu Indol-3-pyruvat
Es können mehrere Polypeptide verwendet werden, um Tryptophan in Indol-3-pyruvat umzuwandeln. Beispielhafte Polypeptide schließen, ohne Einschränkung, Vertreter der Enzymklassen (EC) 2.6.1.27, 1.4.1.19, 1.4.99.1, 2.6.1.28, 1.4.3.2, 1.4.3.3, 2.6.1.5, 2.6.1.-, 2.6.1.1 und 2.6.1.21 ein. Diese Klassen schließen, ohne Einschränkung, Polypeptide ein, welche bezeichnet werden als Tryptophan-Aminotransferase (ebenfalls bezeichnet als L-Phenylalanin-2-oxoglutarat-Aminotransferase, Tryptophan-Transaminase, 5-Hydroxytryptophan-Ketoglutarsäure-Transaminase, Hydroxytryptophan-Aminotransferase, L-Tryptophan-Aminotransferase, L-Tryptophan-Transaminase und L-Tryptophan:2-Oxoglutarat-Aminotransferase), welche L-Tryptophan und 2-Oxoglutarat in Indol-3-pyruvat und L-Glutamat umwandelt; D-Tryptophan-Aminotransferase, welche D-Tryptophan und eine 2-Oxosäure zu Indol-3-pyruvat und einer Aminosäure umwandelt; Tryptophan-Dehydrogenase (ebenfalls bezeichnet als NAD(P)-L-Tryptophan-Dehydrogenase, L-Tryptophan-Dehydrogenase, L-Trp-Dehydrogenase, TDH- und L-Tryptophan: NAD(P)-Oxidoreduktase (desaminierend)), welche L-Tryptophan und NAD(P) zu Indol-3-pyruvat und NH₃ und NAD(P)H umwandelt; D-Aminosäure-Dehydrogenase, welche D-Aminosäuren und FAD in Indol-3-pyruvat und NH₃ und FADH₂ umwandelt; Tryptophan-Phenylpyruvat-Transaminase (ebenfalls bezeichnet als L-Tryptophan-α-Ketoisocaproat-Aminotransferase und L-Tryptophan:Phenylpyruvat-Aminotransferase), welche L-Tryptophan und Phenylpyruvat zu Indol-3-pyruvat und L-Phenylalanin umwandelt; L-Aminosäureoxidase (ebenfalls bezeichnet als Ophio-Aminosäure-Oxidase und L-Amino-Säure:Sauerstoff-Oxidoreduktase (desaminierend)), welche eine L-Aminosäure und H₂O und O₂ zu einer 2-Oxosäure und NH₃ und H₂O₂ umwandelt; D-Aminosäure-Oxidase (ebenfalls bezeichnet als Ophio-Aminosäure-Oxidase und D-Amino-Säure:Sauerstoff-Oxidoreduktase (desaminierend)), welche eine D-Aminosäure und H₂O und O₂ zu einer 2-Oxosäure und NH₃ und H₂O₂ umwandelt; und Tryptophan-Oxidase, welche L-Tryptophan und H₂O und O₂ zu Indol-3-pyruvat und NH₃ und H₂O₂ umwandelt. Diese Klassen enthalten des Weiteren Tyrosin(Aromat)-Aminotransferase, Aspartat-Aminotransferase, D-Aminosäure (oder D-Alanin)-Aminotransferase und Breit(Mehrfach-Substrat)-Aminotransferase, welche mehrere Aminotransferase-Aktivitäten aufweisen, von denen einige Tryptophan und eine 2-Oxosäure in Indol-3-pyruvat und eine Aminosäure umwandeln können.
Elf Mitglieder der Aminotransferase-Klasse, welche eine solche Aktivität aufweisen, werden nachstehend in Beispiel 1 beschrieben, einschließlich einer neuen Aminotransferase, welche in SEQ ID Nr.: 11 und 12 gezeigt wird. Deshalb sieht diese Offenbarung isolierte Nukleinsäure- und Aminosäuresequenzen mit mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98% oder sogar mindestens 99% Sequenzidentität zu den in SEQ ID Nr.: 11 bzw. 12 dargestellten Sequenzen vor. Ebenfalls von dieser Offenbarung beinhaltet sind Fragmente und Fusionen der in SEQ ID Nr.: 11 und 12 dargelegten Sequenzen, welche ein Polypeptid codieren, das Aminotransferase-Aktivität aufweist oder Aminotransferase-Aktivität beibehält. Beispielartige Fragmente schließen, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, mindestens 10, 12, 15, 20, 25, 50, 100, 200, 500 oder 1000 fortlaufende Nukleotide von SEQ ID Nr.: 11 oder mindestens 6, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 200, 300 oder 350 fortlaufende Aminosäuren von SEQ ID Nr.: 12 ein. Die offenbarten Sequenzen (und Varianten, Fragmente und Fusionen davon) können ein Teil eines Vektors sein. Der Vektor kann verwendet werden, um Wirtszellen zu transformieren, wodurch rekombinante Zellen produziert werden, welche Indol-3-pyruvat aus Tryptophan herstellen können, und in einigen Beispielen weiterhin MP und/oder Monatin herstellen können.
L-Aminosäureoxidasen (1.4.3.2) sind bekannt, und Sequenzen können aus mehreren unterschiedlichen Quellen isoliert werden, wie Vipera lebetine (sp P81375), Ophiophagus hannah (sp P81383), Agkistrodon rhodostoma (sp P81382), Crotalus atrox (sp P56742), Burkho/deria cepacia, Arabidopsis thaliana, Caulobacter cresentus, Chlamydomonas reinhardtii, Mus musculus, Pseudomonas syringae, und Rhodococcus str. Darüber hinaus werden Tryptophan-Oxidasen in der Literatur beschrieben und können zum Beispiel isoliert werden aus Coprinus sp. SF-1, Chinakohl mit Kohlhernie (club root disease), Arabidopsis thaliana und Säugetierleber. Ein Vertreter der L-Aminosäureoxidase-Klasse, welcher Tryptophan in Indol-3-pyruvat umwandeln kann, wird nachstehend in Beispiel 3 erörtert, ebenso wie alternative Quellen für das molekulare Klonieren. Viele D-Aminosäure-Oxidase-Gene sind in Datenbanken für molekulare Klonierung verfügbar.
Tryptophan-Dehydrogenasen sind bekannt und können zum Beispiel isoliert werden aus Spinat, Pisum sativum, Prosopis juliflora, Erbse, Mesquite, Weizen, Mais, Tomate, Tabak, Chromobacterium violaceum und Lactobacilli. Viele D-Aminosäure-Dehydrogenase-Gensequenzen sind bekannt.
Wie in 11-13 gezeigt wird, kann, wenn eine Aminosäure-Oxidase, wie Tryptophan-Oxidase, verwendet wird, um Tryptophan zu Indol-3-pyruvat umzuwandeln, Katalase zugesetzt werden, um die Gegenwart von Wasserstoffperoxid zu reduzieren oder sogar zu eliminieren.
Indol-3-lactat zu Indol-3-pyruvat
Die Reaktion, welche Indol-3-lactat zu Indol-3-pyruvat umwandelt, kann katalysiert werden durch eine Vielzahl von Polypeptiden, wie Vertretern der Klassen von Polypeptiden 1.1.1.110, 1.1.1.27, 1.1.1.28, 1.1.2.3, 1.1.1.222, 1.1.1.237, 1.1.3.- oder 1.1.1.111. Die 1.1.1.110-Klasse von Polypeptiden schließt Indollactat-Dehydrogenasen (ebenfalls bezeichnet als Indolmilchsäure:NAD⁺-Oxidoreduktase) ein. Die Klassen 1.1.1.27, 1.1.1.28 und 1.1.2.3 schließen Lactat-Dehydrogenasen (ebenfalls bezeichnet als Milchsäuredehydrogenasen, Lactat:NAD⁺-Oxidoreduktase) ein. Die Klasse 1.1.1.222 enthält (R)-4-Hydroxyphenyllactat-Dehydrogenase (ebenfalls bezeichnet als D-Aromat-Lactat-Dehydrogenase, R-Aromat-Lactat-Dehydrogenase und R-3-(4-Hydroxyphenyl)lactat:NAD(P)⁺-2-Oxidoreduktase), und die Klasse 1.1.1.237 enthält 3-(4-Hydroxyphenylpyruvat)-Reduktase (ebenfalls bezeichnet als Hydroxyphenylpyruvat-Reduktase und 4-Hydroxyphenyllactat:NAD⁺-Oxidoreduktase). Die Klasse 1.1.3.- enthält Lactat-Oxidasen, und die Klasse 1.1.1.111 enthält (3-Imidazol-5-yl)-lactat-Dehydrogenasen (ebenfalls bezeichnet als (S)-3-(Imidazol-5-yl)-lactat:NAD(P)⁺-Oxidoreduktase). Es ist wahrscheinlich, dass mehrere der Polypeptide in diesen Klassen die Produktion von Indol-3-pyruvat aus Indol-3-milchsäure gestatten. Beispiele dieser Umwandlung sind in Beispiel 2 angegeben.
Chemische Reaktionen können ebenfalls verwendet werden, um Indol-3-milchsäure zu Indol-3-pyruvat umzuwandeln. Solche chemischen Reaktionen schließen einen Oxidationsschritt ein, welcher unter Verwendung mehrerer Verfahren bewerkstelligt werden kann, zum Beispiel: Luftoxidation unter Verwendung eines B2-Katalysators (China Chemical Reporter, Band 13, Nr. 28, S. 18(1), 2002), verdünntes Permanganat und Perchlorat, oder Wasserstoffperoxid in Gegenwart von Metallkatalysatoren.
Indol-3-pyruvat zu 2-Hydroxy-2-(indol-3-ylmethyl)-4-ketoglutarsäure (MP)
Mehrere bekannte Polypeptide können verwendet werden, um Indol-3-pyruvat zu MP umzuwandeln. Beispielhafte Polypeptid-Klassen schließen 4.1.3.-, 4.1.3.16, 4.1.3.17 und 4.1.2.- ein. Diese Klassen beinhalten Kohlenstoff-Kohlenstoff-Synthasen/Lyasen, wie Aldolasen, welche die Kondensation von zwei Carbonsäuresubstraten katalysieren. Polypeptid-Klasse EC 4.1.3.- sind Synthasen/Lyasen, welche Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen unter Verwendung von Oxo-Säure-Substraten (wie Indol-3-pyruvat) als dem Elektrophil bilden, wohingegen EC 4.1.2.- Synthasen/Lyasen sind, welche Kohlenstoff- Kohlenstoff-Bindungen unter Verwendung von Aldehydsubstraten (wie Benzaldehyd) als dem Elektrophil bilden.
Zum Beispiel wandelt das Polypeptid, beschrieben in EP 1045-029 (EC 4.1.3.16, 4-Hydroxy-2-oxoglutarat-Glyoxylat-Lyase, ebenfalls bezeichnet als 4-Hydroxy-2-oxoglutarat-Aldolase, 2-Oxo-4-hydroxyglutarat-Aldolase oder KHG-Aldolase) Glyoxylsäure und Pyruvat zu 4-Hydroxy-2-ketoglutarsäure um, und das Polypeptid 4-Hydroxy-4-methyl-2-oxoglutarat-Aldolase (EC 4.1.3.17, ebenfalls bezeichnet als 4-Hydroxy-4-methyl-2-oxoglutarat-Pyruvat-Lyase oder ProA-Aldolase), kondensiert zwei Ketosäuren, wie zwei Pyruvate, zu 4-Hydroxy-4-methyl-2-oxoglutarat. Reaktionen unter Verwendung dieser Lyasen werden hierin beschrieben.
1-2 und 11-13 zeigen schematische Diagramme dieser Reaktionen, in welchen ein 3-Kohlenstoff(C3)-Molekül mit Indol-3-pyruvat kombiniert wird. Viele Vertreter von EC 4.1.2.- und 4.1.3.-, insbesondere PLP-verwendende Polypeptide, können C3-Moleküle verwenden, welche Aminosäuren sind, wie Serin, Cystein und Alanin, oder Derivate davon. Aldolkondensationen, welche katalysiert werden durch Stellvertreter von EC 4.1.2.- und 4.1.3.-, erfordern, dass das 3-Kohlenstoff-Molekül dieses Wegs Pyruvat oder ein Derivat von Pyruvat ist. Allerdings können andere Verbindungen als eine C3-Kohlenstoff-Quelle dienen und zu Pyruvat umgewandelt werden. Alanin kann durch viele PLP-verwendende Transaminasen transaminiert werden, einschließlich vieler von denjenigen, welche oben erwähnt wurden, um Pyruvat zu ergeben. Pyruvat und Ammoniak können erhalten werden durch beta-Eliminierungsreaktionen (wie denjenigen, welche katalysiert werden durch Tryptophanase oder β-Tyrosinase) von L-Serin, L-Cystein und Derivaten von Serin und Cystein mit ausreichenden Austrittsgruppen, wie O-Methyl-L-serin, O-Benzyl-L-serin, S-Methylcystein, S-Benzylcystein, S-Alkyl-L-cystein, O-Acyl-L-serin und 3-Chlor-L-alanin. Aspartat kann als eine Quelle von Pyruvat in PLP-vermittelten beta-Lyase-Reaktionen dienen, wie denjenigen, welche katalysiert werden durch Tryptophanase (EC 4.1.99.1) und/oder β-Tyrosinase (EC 4.1.99.2, ebenfalls bezeichnet als Tyrosin-Phenol-Lyase). Die Rate von beta-Lyase-Reaktionen kann erhöht werden durch Ausführen von ortsgerichteter Mutagenese an den (4.1.99.1-2)-Polypeptiden, wie beschrieben von Mouratou et al. (J. Biol. Chem. 274:1320-5, 1999) und in Beispiel 8. Diese Modifikationen können gestatten, dass die Polypeptide Dicarbon-Aminosäure-Substrate akzeptieren. Lactat kann ebenfalls als eine Quelle von Pyruvat dienen, und wird zu Pyruvat oxidiert durch die Zugabe von Lactat-Dehydrogenase und einem oxidierten Cofaktor oder Lactat-Oxidase und Sauerstoff. Beispiele dieser Reaktionen sind nachstehend beschrieben. Zum Beispiel, wie gezeigt in 2 und 11- 13, kann ProA-Aldolase mit Indol-3-pyruvat kontaktiert werden, wenn Pyruvat als das C3-Molekül verwendet wird.
Das MP kann ebenfalls erzeugt werden unter Anwendung von chemischen Reaktionen, wie den Aldolkondensationen, welche in Beispiel 5 angegeben sind.
MP zu Monatin
Die Umwandlung von MP zu Monatin kann katalysiert werden durch eines oder mehreres von: Tryptophan-Aminotransferasen (2.6.1.27), Tryptophan-Dehydrogenasen (1.4.1.19), D-Aminosäure-Dehydrogenasen (1.4.99.1), Glutamat-Dehydrogenasen (1.4.1.2-4), Phenylalanin-Dehydrogenase (EC 1.4.1.20), Tryptophan-Phenylpyruvat-Transaminasen (2.6.1.28) oder noch allgemeiner Mitgliedern der Aminotransferase-Familie (2.6.1.-), wie Aspartat-Aminotransferase (EC 2.6.1.1), Tyrosin(Aromat)-Aminotransferase (2.6.1.5), D-Tryptophan-Aminotransferase oder D-Alanin(2.6.1.21)-Aminotransferase (2). Elf Mitglieder der Aminotransferase-Klasse sind nachstehend beschrieben (Beispiel 1), einschließlich eines neuen Mitglieds der Klasse, gezeigt in SEQ ID Nr.: 11 und 12, und Reaktionen, welche die Aktivität von Aminotransferase- und Dehydrogenase-Enzymen verdeutlichen, sind im Beispiel 7 angegeben.
Diese Reaktion kann ebenfalls unter Verwendung chemischer Reaktionen durchgeführt werden. Die Aminierung der Ketosäure (MP) wird durch reduktive Aminierung unter Verwendung von Ammoniak und Natriumcyanoborhydrid durchgeführt.
11-13 zeigen zusätzliche Polypeptide, welche verwendet werden können, um MP zu Monatin umzuwandeln, sowie erhöhte Ausbeuten an Monatin aus Indol-3-pyruvat oder Tryptophan bereitzustellen. Wenn zum Beispiel Aspartat als der Aminodonor verwendet wird, kann Aspartat-Aminotransferase verwendet werden, um das Aspartat in Oxalacetat umzuwandeln (11). Das Oxalacetat wird zu Pyruvat und Kohlendioxid durch eine Decarboxylase umgewandelt, wie Oxalacetat-Decarboxylase (11). Darüber hinaus, wenn Lysin als der Aminodonor verwendet wird, kann Lysin-Epsilon-Aminotransferase verwendet werden, um das Lysin zu Allysin umzuwandeln (12). Das Allysin wird spontan zu 1-Piperidein-6-carboxylat umgewandelt (12). Wenn ein Polypeptid, das zum Katalysieren von reduktiven Aminierungsreaktionen in der Lage ist (z. B. Glutamat-Dehydrogenase), verwendet wird, um MP zu Monatin umzuwandeln, kann ein Polypeptid, welches NAD(P)H recyceln und/oder ein flüchtiges Produkt herstellen kann (13), verwendet werden, wie Formiat-Dehydrogenase.
Zusätzliche Erwägungen beim Entwurf der biosynthetischen Wege
Abhängig davon, welche Polypeptide verwendet werden, um Indol-3-pyruvat, MP und/oder Monatin zu erzeugen, können Cofaktoren, Substrate und/oder zusätzliche Polypeptide der Produktionszelle zur Verfügung gestellt werden, um die Produktbildung zu steigern. Darüber hinaus kann genetische Modifikation entworfen werden, um die Produktion von Produkten, wie Indol-3-pyruvat, MP und/oder Monatin zu steigern. In ähnlicher Weise kann eine Wirtszelle, die für die Monatin-Herstellung verwendet wird, optimiert werden.
Entfernung von Wasserstoffperoxid
Wasserstoffperoxid (H₂O₂) ist ein Produkt, welches, falls erzeugt, schädlich für Produktionszellen, Polypeptide oder hergestellte Produkte (z. B. Intermediate) sein kann. Die oben beschriebene L-Aminosäureoxidase erzeugt H₂O₂ als ein Produkt. Wenn L-Aminosäureoxidase verwendet wird, kann deshalb das resultierende H₂O₂ entfernt werden, oder seine Spiegel können vermindert werden, um eine potenzielle Verletzung der Zelle oder des Produkts zu verringern.
Katalasen können verwendet werden, um den Spiegel an H₂O₂ in der Zelle zu reduzieren (11-13). Die Produktionszelle kann ein Gen oder eine cDNA-Sequenz exprimieren, welche eine Katalase (EC 1.11.1.6) codiert, welche die Zersetzung von Wasserstoffperoxid zu Wasser und Sauerstoffgas katalysiert. Zum Beispiel kann eine Katalase von einem Vektor exprimiert werden, welcher in die Produktionszelle hinein transfiziert worden ist. Beispiele von Katalasen, welche verwendet werden können, schließen, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, folgende ein: tr|Q9EV50 (Staphylococcus xylosus), tr|Q9KBE8 (Bacillus halodurans), tr|Q9URJ7 (Candida albicans), tr|P77948 (Streptomyces coelicolor), tr|Q9RBJ5 (Xanthomonas campestris) (SwissProt-Zugangs-Nummern). Biokatalytische Reaktoren unter Verwendung von L-Aminosäureoxidase, D-Aminosäure-Oxidase oder Tryptophan-Oxidase können ebenfalls ein Katalase-Polypeptid enthalten.
Modulierung von Pyridoxal-5'-phosphat (PLP)-Verfügbarkeit
Wie gezeigt in 1, kann PLP in einem oder mehreren der hierin beschriebenen Biosyntheseschritte verwendet werden. Die Konzentration von PLP kann supplementiert werden, so dass PLP nicht zu einer Limitierung hinsichtlich der Gesamteffizienz der Reaktion wird.
Der biosynthetische Weg für Vitamin B₆ (der Vorläufer von PLP) ist in E. coli eingehend untersucht worden, und manche der Proteine sind kristallisiert worden (Laber et al., FEBS Letters, 449:45-8, 1999). Zwei der Gene (epd oder gapB und serC) werden in anderen metabolischen Wegen erfordert, wohingegen drei Gene (pdxA, pdxB und pdxJ) für die Pyridoxalphosphat-Biosynthese einzigartig sind. Eines der Ausgangsmaterialien im E. coli-Weg ist 1-Desoxy-D-xylulose-5-phosphat (DXP). Die Synthese dieses Vorläufers aus gewöhnlichen 2- und 3-Kohlenstoff-Zentralmetaboliten wird katalysiert von dem Polypeptid 1-Desoxy-D-xylulose-5-phosphat-Synthase (DXS). Der andere Vorläufer ist ein Threoninderivat, welches aus dem 4-Kohlenstoff-Zucker D-Erythrose-4-phosphat gebildet wird. Die Gene, welche für die Umwandlung zu Phospho-4-hydroxy-4-threonin (HTP) erforderlich sind, sind epd, pdxB und serC. Die letzte Reaktion für die Bildung von PLP ist eine komplexe intramolekulare Kondensations- und Ringschlussreaktion zwischen DXP und HTP, welche von den Genprodukten von pdxA und pdxJ katalysiert wird.
Wenn PLP ein limitierender Nährstoff während der Fermentation zur Herstellung von Monatin wird, kann eine erhöhte Expression von einem oder mehreren der Weg-Gene in einer Produktionswirtszelle verwendet werden, um die Ausbeute an Monatin zu erhöhen. Ein Wirtsorganismus kann mehrere Kopien seiner Nativ-Weg-Gene enthalten, oder Kopien von Nicht-Nativ-Weg-Genen können in das Genom des Organismus eingebracht werden. Zusätzlich dazu können mehrere Kopien der Wiederverwertungsweg-Gene in den Wirtsorganismus kloniert werden.
Ein Wiederverwertungsweg, welcher in allen Organismen konserviert ist, recycelt die verschiedenen Derivate von Vitamin B₆ zu der aktiven PLP-Form. Die in diesem Weg beteiligten Polypeptide sind pdxK Kinase, pdxH Oxidase und pdxY Kinase. Überexpression von einem oder mehreren dieser Gene kann die PLP-Verfügbarkeit erhöhen.
Die Vitamin B₆-Spiegel können erhöht werden durch Eliminierung oder Repression der metabolischen Regulierung der nativen Biosyntheseweg-Gene in dem Wirtsorganismus. PLP unterdrückt Polypeptide, welche an der Biosynthese des Vorläufer-Threoninderivats im Bakterium Flavobacterium sp.-Stamm 238-7 beteiligt sind. Dieser Bakterienstamm, befreit von einer metabolischen Regulierung, zeigt eine Überproduktion von Pyridoxalderivaten und kann bis zu 20 mg/l PLP ausscheiden. Die genetische Manipulierung des Wirtsorganismus, welcher Monatin in einer ähnlichen Weise produziert, wird die erhöhte Produktion von PLP ohne Überexpression der Biosyntheseweg-Gene zulassen.
Ammonium-Verwendung
Tryptophanase-Reaktionen können zur synthetischen Richtung (Herstellung von Tryptophan aus Indol) getrieben werden, indem Ammoniak stärker verfügbar gemacht wird oder durch Entfernen von Wasser. Reduktive Aminierungsreaktionen, wie diejenigen, welche von Glutamat-Dehydrogenase katalysiert werden, können ebenfalls durch einen Überschuss an Ammonium vorwärts getrieben werden.
Ammoniak kann verfügbar gemacht werden als ein Ammoniumcarbonat- oder Ammoniumphosphat-Salz in einem Carbonat- oder Phosphat-gepufferten System. Ammoniak kann ebenfalls als Ammoniumpyruvat oder Ammoniumformiat bereitgestellt werden. Alternativ dazu kann Ammoniak zugeführt werden, wenn die Reaktion mit einer Reaktion gekoppelt wird, welche Ammoniak erzeugt, wie Glutamat-Dehydrogenase oder Tryptophan-Dehydrogenase. Ammoniak kann erzeugt werden durch Zugabe der natürlichen Substrate von EC 4.1.99.- (Tyrosin oder Tryptophan), welche hydrolysiert werden zu Phenol oder Indol, Pyruvat und NH₃. Dies gestattet ebenfalls eine erhöhte Ausbeute an synthetischem Produkt gegenüber der normalen Gleichgewichts-Menge durch Zulassen, dass das Enzym sein bevorzugtes Substrat hydrolysiert.
Entfernung von Produkten und Nebenprodukten
Die Umwandlung von Tryptophan zu Indol-3-pyruvat durch eine Tryptophan-Aminotransferase kann die Herstellungsgeschwindigkeit von Indol-3-pyruvat nachteilig beeinflussen, weil die Reaktion Glutamat erzeugt und das Cosubstrat 2-Oxoglutarat (α-Ketoglutarat) erfordert. Glutamat kann die Inhibition der Aminotransferase verursachen, und die Reaktion kann große Mengen des Cosubstrats verbrauchen. Darüber hinaus können hohe Glutamatkonzentrationen schädlich für stromabwärts erfolgende Trennungsverfahren sein.
Das Polypeptid Glutamat-Dehydrogenase (GLDH) konvertiert Glutamat zu 2-Oxoglutarat, wodurch das Cosubstrat in der von Tryptophan-Aminotransferase katalysierten Reaktion recycelt wird. GLDH erzeugt des Weiteren Reduktionsäquivalente (NADH oder NADPH), welche verwendet werden können, um unter aeroben Bedingungen Energie für die Zelle (ATP) zu erzeugen. Die Verwertung von Glutamat durch GLDH vermindert des Weiteren die Nebenproduktbildung. Darüber hinaus erzeugt die Reaktion Ammoniak, welcher als eine Stickstoffquelle für die Zelle oder als ein Substrat in einer reduktiven Aminierung für den in 1 gezeigten letzten Schritt dienen kann. Deshalb kann eine Produktionszelle, welche ein GLDH-Polypeptid überexprimiert, verwendet werden, um die Ausbeute zu erhöhen und die Kosten von Medien und/oder Trennungsverfahren zu reduzieren.
In dem Tryptophan-zu-Monatin-Weg kann der Aminodonor von Schritt drei (z. B. Glutamat oder Aspartat) zurück in den Amino-Akzeptor umgewandelt werden, welcher für den Schritt 1 erfordert wird (z. B. 2-Oxoglutarat oder Oxalacetat), wenn eine Aminotransferase aus den geeigneten Enzymklassen verwendet wird. Die Verwendung von zwei getrennten Transaminasen für diesen Weg, in welchem das Substrat von einer Transaminase die Aktivität der anderen Transaminase nicht kompetitiv inhibiert, kann die Effizienz dieses Wegs erhöhen.
Viele der Reaktionen in den beschriebenen Wegen sind reversibel und können daher ein Gleichgewicht zwischen Substraten und Produkten erreichen. Die Ausbeute des Wegs kann erhöht werden durch kontinuierliches Entfernen der Produkte von den Polypeptiden. Zum Beispiel wird die Sekretion von Monatin in die Fermentationsnährlösung unter Verwendung einer Permease oder eines anderen Transportproteins oder die selektive Kristallisierung von Monatin aus einem biokatalytischen Reaktorstrom mit einhergehendem Recyceln von Substraten die Reaktionsausbeute erhöhen.
Das Entfernen von Nebenprodukten durch zusätzliche enzymatische Reaktionen oder durch Substitution von Aminodonorgruppen ist ein anderer Weg, um die Reaktionsausbeute zu erhöhen. Mehrere Beispiele werden im Beispiel 13 erörtert und sind in 11-13 gezeigt. Zum Beispiel kann ein Nebenprodukt hergestellt werden, welches für eine Reaktion in der Rückwärtsrichtung nicht verfügbar ist, entweder durch Phasenänderung (Verdampfen) oder durch spontane Umwandlung in ein nichtreaktives Endprodukt, wie Kohlendioxid.
Modulation der Substrat-Pools
Der Indol-Pool kann moduliert werden durch Erhöhen der Herstellung von Tryptophanvorläufern und/oder Ändern von katabolischen Wegen, welche Indol-3-pyruvat und/oder Tryptophan beinhalten. Zum Beispiel kann die Herstellung von Indol-3-essigsäure aus Indol-3-pyruvat durch funktionelles Deletieren des EC 4.1.1.74 codierenden Gens in der Wirtszelle reduziert oder eliminiert werden. Die Produktion von Indol aus Tryptophan kann durch funktionelles Deletieren des für EC 4.1.99.1 codierenden Gens in der Wirtszelle reduziert oder eliminiert werden. Alternativ dazu kann ein Überschuss an Indol als ein Substrat in einem In-vitro- oder In-vivo-Verfahren in Kombination mit erhöhten Men gen des für EC 4.1.99.1 codierenden Gens verwendet werden (Kawasaki et al., J. Ferm. and Bioeng., 82:604-6, 1996). Darüber hinaus können genetische Modifikationen vorgenommen werden, um den Spiegel an Intermediaten, wie D-Erythrose-4-phosphat und Chorismat, zu erhöhen.
Die Tryptophanherstellung ist in den meisten Organismen reguliert. Ein Mechanismus erfolgt durch Rückkopplungs-Inhibition von bestimmten Enzymen in dem Weg; wenn Tryptophan-Spiegel ansteigen, verringert sich die Herstellungsrate von Tryptophan. Somit, wenn eine Wirtszelle verwendet wird, die manipuliert wurde, um Monatin über ein Tryptophan-Intermediat herzustellen, kann ein Organismus verwendet werden, welcher gegenüber Tryptophan-Konzentrationen nicht empfindlich ist. Zum Beispiel wurde ein Stamm von Catharanthus roseus, welcher resistent gegenüber Wachstums-Inhibition durch verschiedene Tryptophananaloga ist, durch wiederholtes Aussetzen an hohe Konzentrationen von 5-Methyltryptophan selektiert (Schallenberg und Berlin, Z. Naturforsch. 34:541-5, 1979). Die resultierende Tryptophan-Synthase-Aktivität des Stamms wurde weniger durch Produkt-Inhibition beeinflusst, wahrscheinlich auf Grund von Mutationen in dem Gen. In ähnlicher Weise kann eine für Monatin-Produktion verwendete Wirtszelle optimiert werden.
Tryptophan-Produktion kann optimiert werden durch die Anwendung von gerichteter Evolution, um Polypeptide zu entwickeln, welche weniger empfindlich gegenüber Produkt-Inhibition sind. Zum Beispiel kann ein Screening auf Platten durchgeführt werden, welche kein Tryptophan im Medium enthalten, jedoch mit hohen Spiegeln an nicht-metabolisierbaren Tryptophananaloga. Die U.S.-Patente Nr. 5 756 345; 4 742 007 und 4 371 614 beschreiben Verfahren, welche angewandt werden, um Tryptophan-Produktivität in einem Fermentationsorganismus zu erhöhen. Der letzte Schritt der Tryptophan-Biosynthese ist die Addition von Serin an Indol; deshalb kann die Verfügbarkeit von Serin erhöht werden, um die Tryptophan-Produktion zu steigern.
Die durch einen Fermentationsorganismus produzierte Menge an Monatin kann erhöht werden durch Erhöhen der Menge an Pyruvat, welche vom Wirtsorganismus produziert wird. Bestimmte Hefen, wie Trichosporon cutaneum (Wang et. al., Lett. Appl. Microbiol. 35:338-42, 2002) und Torulopsis glabrata (Li et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 57:451-9, 2001) zeigen eine Überproduktion von Pyruvat und können verwendet werden, um die hierin offenbarten Verfahren auszuüben. Darüber hinaus können genetische Modifikationen an Organismen vorgenommen werden, um Pyruvinsäure-Produktion zu fördern, wie diejenigen im E. coli-Stamm W1485lip2 (Kawasaki et al., J. Ferm. and Bioeng. 82:604-6, 1996).
Steuern der Chiralität
Das Geschmacksprofil von Monatin kann verändert werden durch Steuern seiner Stereochemie (Chiralität). Zum Beispiel können verschiedene Monatin-Stereoisomere in unterschiedlichen Mischungen von Konzentrationen für unterschiedliche Lebensmittelsysteme gewünscht werden. Die Chiralität kann durch eine Kombination von pH-Wert und Polypeptiden reguliert werden.
Eine Razemisierung an der C-4-Position von Monatin (siehe obenstehendes nummeriertes Molekül) kann durch Deprotonierung und Reprotonierung des alpha-Kohlenstoffs stattfinden, welche durch eine Verschiebung im pH-Wert oder durch Reaktion mit dem Cofaktor PLP, der an ein Enzym, wie Razemase, gebunden ist oder frei in Lösung ist, stattfinden können. In einem Mikroorganismus ist es unwahrscheinlich, dass sich der pH-Wert genügend verschiebt, um die Razemisierung zu verursachen, aber PLP ist reichlich vorhanden. Verfahren zum Steuern der Chiralität mit Polypeptiden hängen von der für die Monatin-Produktion verwendeten biosynthetischen Route ab.
Wenn Monatin unter Verwendung des in 2 gezeigten Wegs gebildet wird, kann Folgendes in Betracht gezogen werden. In einer biokatalytischen Reaktion kann die Chiralität von Kohlenstoff-2 bestimmt werden durch ein Enzym, welches Indol-3-pyruvat zu MP umwandelt. Mehrere Enzyme (z. B. aus EC 4.1.2.-, 4.1.3.-) können Indol-3-pyruvat zu MP umwandeln, und daher kann das Enzym, welches das gewünschte Stereoisomer bildet, ausgewählt werden. Alternativ dazu kann die Enantiospezifität des Enzyms, welches Indol-3-pyruvat zu MP umwandelt, durch die Verwendung von gerichteter Evolution modifiziert werden, oder katalytische Antikörper können konstruiert werden, um die gewünschte Reaktion zu katalysieren. Sobald MP (entweder enzymatisch oder durch chemische Kondensation) hergestellt ist, kann die Aminogruppe stereospe zifisch unter Verwendung einer Transaminase angefügt werden, wie denjenigen, welche hierin beschrieben werden. Es kann entweder die R- oder S-Konfiguration von Kohlenstoff-4 erzeugt werden, abhängig davon, ob eine D- oder L-Aromat-Saure-Aminotransferase verwendet wird. Die meisten Aminotransferasen sind spezifisch für das L-Stereoisomer; allerdings existieren D-Tryptophan-Aminotransferasen in bestimmten Pflanzen (Kohiba und Mito, "Proceedings of the 8th International Symposium an Vitamin B₆ and Carbonyl Catalysis", Osaka, Japan 1990). Darüber hinaus sind D-Alanin-Aminotransferasen (2.6.1.21), D-Methionin-Pyruvat-Aminotransferasen (2.6.1.41) und sowohl (R)-3-Amino-2-methylpropanoat-Aminotransferase (2.6.1.61) als auch (S)-3-Amino-2-methylpropanoat-Aminotransferase (2.6.1.22) identifiziert worden. Bestimmte Aminotransferasen können nur das Substrat für diese Reaktion mit einer bestimmten Konfiguration am C2-Kohlenstoff akzeptieren. Deshalb kann, selbst wenn die Umwandlung zu MP nicht stereospezifisch ist, die Stereochemie des Endprodukts durch die geeignete Wahl einer Transaminase gesteuert werden. Da die Reaktionen reversibel sind, kann das nicht-umgesetzte MP (unerwünschtes Stereoisomer) zurück zu seinen Bestandteilen recycelt werden, und eine razemische Mischung von MP kann reformiert werden.
Aktivieren von Substraten
Phosphorylierte Substrate, wie Phosphoenolpyruvat (PEP), können in den hierin offenbarten Reaktionen verwendet werden. Phosphorylierte Substrate können energetisch günstiger sein und können deshalb verwendet werden, um die Reaktionsraten und/oder Erträge zu erhöhen. In Aldolkondensationen stabilisiert die Addition einer Phosphatgruppe das Enol-Tautomer des nukleophilen Substrats, wobei dieses reaktiver gemacht wird. In anderen Reaktionen kann ein phosphoryliertes Substrat eine bessere Austrittsgruppe bereitstellen. In ähnlicher Weise können Substrate aktiviert werden durch Umwandlung zu CoA-Derivaten oder Pyrophosphat-Derivaten.
Verwendung von Monatin in einer Kaugummizusammensetzung
Das S,S-Stereoisomer von Monatin ist ungefähr 50-200-mal süßer als Sucrose, bezogen auf das Gewicht. Das R,R-Stereoisomer von Monatin ist ungefähr 2000-2400-fach süßer als Sucrose, bezogen auf Gewicht. Die Süße des Monatins wird berechnet unter Einsatz von erfahrenen Sensorik-Bewertungspersonen in einer Süßevergleich-Vorgehensweise, worin eine Test-Süßstofflösung hinsichtlich der Süßeintensität gegenüber einer aus einer Serie von Referenzlösungen zugeordnet wird.
Spezifisch kann man die Süße eines Süßstoffs relativ zu Sucrose durch Verwenden eines Gremiums von trainierten Sensorik-Bewertungspersonen einschätzen, welche hinsichtlich der Süßeabschätzungs-Vorgehensweise erfahren sind. Alle Proben (in den gleichen Puffern) werden in zweifacher Ausfertigung bei einer Temperatur von 22°C ± 1°C serviert. Probelösungen können hergestellt werden, zum Beispiel unter Verwendung eines Puffers, umfassend 0,16% (v/w) Zitronensäure und 0,02% (v/w) Natriumcitrat bei ~pH 3,0. Testlösungen, codiert mit 3-Ziffer-Zufallsnummer-Codes, werden individuell an die Bewertungspersonen in statistischer Reihenfolge präsentiert. Sucrose-Referenzstandards im Bereich von 2,0-10,0% (w/v) Sucrose, anwachsend in Stufen von 0,5% (w/v) Sucrose, werden ebenfalls bereitgestellt. Die Bewertungspersonen werden ersucht, die Süße durch Vergleichen der Süße der Testlösung mit den Sucrose-Standards einzuschätzen. Dies wird durchgeführt durch Einnehmen von 3 Schlücken der Testlösung, gefolgt von einem Schluck Wasser, gefolgt von 3 Schlücken Sucrose-Standard, gefolgt von einem Schluck Wasser, etc. Die Bewertungspersonen schätzen die Süße auf eine Dezimalstelle, z. B. 6,8, 8,5. Eine fünfminütige Ruheperiode wird zwischen dem Auswerten der Testlösungen eingelegt. Die Bewertungspersonen werden ebenfalls ersucht, gut auszuspülen und einen Cracker bzw. Keks zu essen, um jedwede potenziellen Übertragseffekte zu reduzieren.
Der Sucrose-Äquivalent-Wert (SEV) (z. B. % Sucrose), bestimmt durch die Auswahl von trainierten Sensorik-Bewertungspersonen, wird als eine Funktion der Monatin-Konzentration aufgetragen, um eine Dosis-Antwort-Kurve zu erhalten. Eine Polynom-Kurvenanpassung wird auf die Dosis-Antwort-Kurve angewandt und verwendet, um die Süßeintensität oder -wirkkraft an einem besonderen Punkt zu berechnen, z. B. 8% SEV, durch Dividieren des Sucrose-Äquivalenz-Werts (SEV) durch die Monatin-Konzentration (z. B. % Monatin). Siehe z. B. 15 (R,R/S,S-Monatin-Dosis-Antwort-Kurve); 14 (R,R-Monatin-Dosis-Antwort-Kurve).
Monatin ist in wässerigen Lösungen in Konzentrationen löslich, welche für den Verzehr geeignet sind. Verschiedene Mischungen von Monatin-Stereoisomeren können in bestimmten Matrizes, oder bei der Vermischung mit anderen Süßstoffen, qualitativ besser sein. Mischungen von Monatin mit anderen Süßstoffen können verwendet werden, um die Süßeintensität und/oder das Süße-Profil zu maximieren und die Kosten zu minimieren. Monatin kann in Kombination mit anderen Süßstoffen und/oder anderen Bestandteilen zum Erzeugen eines Zeitprofils, welches ähnlich zu Sucrose ist, oder für andere nutzbringende Zwecke verwendet werden.
Zum Beispiel kann Monatin mit anderen nährstoffartigen und nicht-nährstoffartigen Süßstoffen vermischt werden, um besondere Geschmacksprofile oder Kalorien-Ziele zu erreichen. Somit können Süßstoff-Zusammensetzungen Kombinationen von Monatin mit einem oder mehreren der folgenden Süßstofftypen einschließen: (1) Zuckeralkohole (wie Erythritol, Sorbitol, Maltitol, Mannitol, Lactitol, Xylitol, Isomalt, Sirups mit niedrigem glykämischen Anteil etc.); (2) andere intensitätsstarke Süßstoffe (wie Aspartam, Sucralose, Saccharin, Acesulfam-K, Steviosid, Cyclamat, Neotam, Thaumatin, Alitam, Dihydrochalkon, Monellin, Glycyrrihizin, Mogrosid, Phyllodulcin, Mabinlin, Brazzein, Circulin, Pentadin etc.) und (3) nährstoffartige Süßstoffe (wie Sucrose, Tagatose, Invertzucker, Fructose, Maissirup, Maissirup mit hohem Fructosegehalt (HFCS, high fructose corn syrup), Glucose/Dextrose, Trehalose, Isomaltulose etc.). Monatin kann in derartigen Mischungen als ein Geschmacksmodifizierer zum Unterdrücken von Nachgeschmack verwendet werden, andere Aromastoffe, wie Zitrone verstärken, oder das zeitmäßige Geschmacksprofil verbessern. Die Daten zeigen ebenfalls an, dass Monatin quantitativ synergistisch mit Cyclamaten (welche in Europa verwendet werden) ist, aber es wurde keine signifikante quantitative Synergie mit Aspartam, Saccharin, Acesulfam-K, Sucralose oder Kohlenhydrat-Süßstoffen bemerkt.
Weil Monatin kein Kohlenhydrat ist, kann Monatin verwendet werden, um den Kohlenhydratgehalt in Kaugummizusammensetzungen zu senken. In einer Ausführungsform enthält eine Menge (z. B. ein Streifen) einer Monatin-Kaugummizusammensetzung weniger Kalorien und Kohlenhydrate als die gleiche Menge einer Kaugummizusammensetzung, welche Zucker (z. B. Sucrose oder Maissirup mit hohem Fructosegehalt) enthält. In anderen Ausführungsformen liefern Kaugummizusammensetzungen, die Monatin umfassen (z. B. Monatin und ein oder mehrere Kohlenhydrate umfassen), ein Mund-Gefühl, einen Geschmack und eine Süße über die Zeit, welche vergleichbar zu derjenigen ist, die von ähnlichen Gummizusammensetzungen bereitgestellt wird, welche lediglich Kohlenhydrate als den Süßstoff enthalten. In einer Ausführungsform enthält eine Menge einer Kaugummizusammensetzung, welche Monatin umfasst, weniger Kalorien und Kohlenhydrate als die gleiche Menge der Kaugummizusammensetzung, welche Sucrose anstelle des Monatins enthält.
Monatin ist in einer trockenen Form stabil und besitzt ein wünschenswertes Geschmacksprofil allein oder bei Mischung mit Kohlenhydraten. Es scheint nicht irreversibel zu zerfallen, sondern bildet eher Lactone und/oder Lactame bei niedrigen pH-Werten (in wässerigen Puffern) und erreicht ein Gleichgewicht. Es kann an der 4-Position langsam mit der Zeit in Lösung razemisieren, aber dies findet typischerweise bei hohen pH-Werten statt. Im Allgemeinen ist die Stabilität von Monatin vergleichbar zu oder besser als Aspartam, und das Geschmacksprofil von Monatin ist vergleichbar zu oder besser als andere Qualitätssüßstoffe, wie Aspartam, Alitam und Sucralose. Monatin besitzt nicht den unerwünschten Nachgeschmack, der mit einigen anderen intensitätsstarken Süßstoffen, wie Saccharin und Steviosid, assoziiert ist.
In gewissen Ausführungsformen schließen die Kaugummizusammensetzungen der Erfindung einen Gummigrundstoffanteil und einen löslichen Anteil ein, welcher Monatin einschließt. Der Begriff "löslich" in dem Ausdruck "löslicher Anteil" bedeutet, dass dieser Anteil sich im Mund und/oder in Speichel auflösen kann. Der Gummigrundstoffanteil wird im Mund zurückgehalten während des gesamten Kauens, wohingegen sich der lösliche Anteil mit einem Teil des Aromas während des Kauens über die Zeit hinweg zerstreut. In einigen Ausführungsformen enthält der lösliche Anteil zusätzliche Komponenten, wie Aromastoffe, Färbemittel, andere Süßstoffe und/oder einen Überzug.
Einige gezuckerte Gummiausführungsformen umfassen einen Überzug, bei welchem es sich um Sucrose handelt. In anderen Ausführungsformen sind die Kaugummizusammensetzungen so formuliert, dass sie als zuckerfrei angesehen werden. Bestimmte zuckerfreie Gummiausführungsformen umfassen einen Überzug (in Sirup- oder kristalliner Form), welcher Sorbital-Maltitol, Isolmalt, Xylitol oder Erythritol ist. Gegebenenfalls können die Kaugummizusammensetzungen einen Überzug umfassen, welcher ein Aromastoff, eine lyophilisierte Frucht und/oder ein Färbemittel ist.
In bestimmten Ausführungsformen ist Monatin in einer Menge vorhanden, welche im Bereich von 0,001 bis 1,1 Gew.-% der Kaugummizusammensetzung liegt (z. B. 0,009 bis 1 Gew.-%, 0,01 bis 0,3 Gew.-%, 0,01 bis 0,04 Gew.-% oder 0,02 bis 0,1 Gew.-%), einschließlich jedweden besonderen Werts innerhalb dieses Bereichs (z. B. 0,001 Gew.-%, 0,005 Gew.-%, 0,01 Gew.-%, 0,015 Gew.-%, 0,02 Gew.-% oder 0,025 Gew.-% der Kaugummizusammensetzung). Das Monatin kann ein besonderes Stereoisomer oder eine Mischung von unterschiedlichen Stereoisomeren sein. Zum Beispiel können 0,009 bis 0,1 Gew.-% (z. B. 0,015 bis 0,025 Gew.-%) des R,R-Stereoisomers von Monatin oder 0,1 bis 1,1 Gew.-% (z. B. 0,15 bis 0,88 Gew.-%) des S,S-Stereoisomers von Monatin in einer Kaugummizusammensetzung verwendet werden.
Gummigrundstoff
Die Zusammensetzung des Gummigrundstoffs bestimmt typischerweise, ob das Gummi als Kaugummi, Bubblegum oder ein funktionelles Gummi angesehen wird. In bestimmten Ausführungsformen ist der Gummigrundstoff inert und nicht-nährstoffhaltig und ist aus Kombinationen der folgenden Komponenten hergestellt: Elastomere, Weichmacher (Plastifizierer), Emulgatoren, Harz und Füllstoffe.
Bestandteile innerhalb der Zusammensetzungen werden im Allgemeinen als von Lebensmittel-Güte angesehen, im Allgemeinen als sicher anerkannt (GRAS) und/oder sind von der U.S. "Food and Drug Administration" (FDA) zugelassen. Elastomere stellen die gummiartige, kohäsive Natur für die Gummis bereit und können zum Beispiel einen oder mehrere Naturkautschuke (z. B. Rauchlatex, Flüssiglatex oder Guayule), Naturgummis oder synthetische Elastomere einschließen. In manchen Ausführungsformen schließen Naturgummis Jelutong, Perillo, Sorva, Massaranduba balata, Massaranduba-Schokolade, Nispero, Rosindinha, Chicle und Gutta hang kang ein. Zum Beispiel ist Chicle ein besonders nützliches Naturgummi. In anderen Ausführungsformen schließen synthetische Elastomere Butadien-Styrol-Copolymere, Isobutylen-Isopren-Copolymere, Polybutadien, Polyisobutylen und polymere Vinylelastomere ein. In bestimmten Ausführungsformen ist ein Elastomer in einem Gummigrundstoff in einer Menge innerhalb des Bereichs von 3 bis 70 Gew.-% vorhanden (z. B. 3 bis 60 Gew.-%, 3 bis 50 Gew.-%, 5 bis 45 Gew.-%, 10 bis 50 Gew.-%, 15 bis 45 Gew.-% oder 20 bis 40 Gew.-% des Gummigrundstoffs) einschließlich jedweden besonderen Werts innerhalb des Bereichs (z. B. 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 oder 65 Gew.-%).
Harze können verwendet werden, um die Festigkeit des Gummigrundstoffs zu variieren und bei der Erweichung der Elastomerkomponente des Gummigrundstoffs zu helfen. Nichteinschränkende Beispiele von geeigneten Harzen schließen ein oder mehrere der Folgenden ein: einen Kolophoniumester, ein Terpenharz, wie ein Terpenharz aus α-Pinen, β-Pinen und/oder d-Limonen, Polyvinalacetat, Polyvinylalkohol, Ethylenvinylacetat und Vinylacetat-Vinyllaurat-Copolymer. In bestimmten Ausführungsformen kann ein Kolophoniumester ein Glycerolester von teilweise hydriertem Kolophonium, ein Glycerolester von polymerisiertem Kolophonium, ein Glycerolester von teilweise dimerisiertem Kolophonium, ein Glycerolester von Kolophonium, ein Pentaerythritolester von teilweise hydriertem Kolophonium, ein Methylester von Kolophonium oder ein Methylester von teilweise hydriertem Kolophonium sein. In einigen Ausführungsformen ist das Harz in einer Menge vorhanden, welche im Bereich von etwa 5 bis 75 Gew.-% des Gummigrundstoffs liegt, einschließlich jedweden besonderen Werts innerhalb dieses Bereichs. Zum Beispiel kann das Harz in einer Menge vorhanden sein, welche im Bereich von etwa 5 bis 45 Gew.-%, 10 bis 75 Gew.-%, 10 bis 30 Gew.-%, 15 bis 60 Gew.-% oder 20 bis 50 Gew.-% des Gummigrundstoffs liegt.
Weichmacher (ebenfalls bekannt als Plastifizierer) können verwendet werden, um die Einfachheit des Kauens und/oder das Mundgefühl der Kaugummizusammensetzung zu modifizieren. In bestimmten Ausführungsformen schließen Weichmacher Öle, Fette, Wachse und Emulgatoren ein. Nicht-einschränkende Beispiele, welche verwendet werden können, schließen zum Beispiel Talg, hydrierten Talg, Schmalz, hydrierte oder teilweise hydrierte Pflanzenöle, wie Sojabohnen-, Canola-, Baumwollsamen-, Sonnenblumen-, Palmen-, Kokosnuss-, Mais-, Saflor- oder Palmkern-Öl, Kakaobutter, Glycerolmonostearat, Glyceroltriacetat, Glycerolabietat, Lecithin, Monoglyceride, Diglyceride, Triglyceride, acetylierte Monoglyceride und freie Fettsäuren ein. Üblicherweise verwendete Wachse schließen zum Beispiel Polypropylen/Polyethylen/Fisher-Tropsch-Wachse, Paraffin, mikrokristalline und natürliche Wachse, wie Candelilla, Bienenwachs und Carnauba, ein. Mikrokristalline Wachse, insbesondere diejenigen mit einem hohen Grad an Kristallinität, können ebenfalls als Verdickungsmittel oder Texturmodifikatoren betrachtet werden. In bestimmten Ausführungsformen ermöglichen gewisse Maissirups, wie Globe, das Erweichen des Gummigrundstoffs vor Mischung mit anderen Zuckern, sowie die Verdickung und das Feuchthaltevermögen. In anderen Ausführungsformen sind Weichmacher in einer Menge vorhanden, welche im Bereich von etwa 0,5 bis 30 Gew.-% (z. B. 0,5 bis 25 Gew.-%, 0,5 bis 15 Gew.-% oder 1 bis 7 Gew.-%) des Gummigrundstoffs liegt, einschließlich jedweden besonderen Werts innerhalb des Bereichs.
Emulgatoren helfen bei der Bildung einer gleichmäßigen Dispersion der nicht löslichen/löslichen Phasen und können ebenfalls weichmachende Eigenschaften aufweisen. In bestimmten Ausführungsformen schließen geeignete Emulgatoren Glycerolmonostearat (GMS), Lecithin (Phosphatidylcholin), Polyglycerolpolyricinolsäure (PPGR), Mono- und Diglyceride von Fettsäuren, Glyceroldistearat, Triacetin, acetyliertes Monoglycerid, Glyceroltriacetat und Magnesiumstearat ein. In anderen Ausführungsformen können Emulgatoren in einer Menge vorhanden sein, welche von etwa 1 bis 30 Gew.-% eines Gummigrundstoffs beträgt, z. B. 2 bis 30 Gew.-%, 3 bis 20 Gew.-% oder 5 bis 15 Gew.-% des Gummigrundstoffs, einschließlich jedweden besonderen Werts innerhalb des Bereichs (z. B. 5, 10, 15, 20 oder 25 Gew.-%).
Darüber hinaus kann die Kaugummizusammensetzung gegebenenfalls Hilfsstoffe oder Füllstoffe in entweder dem Gummigrundstoff und/oder dem löslichen Anteil der Zusammensetzung einschließen. Geeignete Hilfsstoffe oder Füllstoffe schließen beispielsweise Lecithin, Inulin, Polydextrin, Calciumcarbonat, Magnesiumcarbonat, Magnesiumsilikat, gemahlenen Kalkstein, Aluminiumhydroxid, Aluminiumsilikat, Talk, Ton, Aluminiumoxid, Titandioxid und Calciumphosphat ein. In bestimmten Ausführungsformen kann Lecithin als ein inerter Füllstoff verwendet werden, um den Betrag der Klebrigkeit zu verringern. In anderen Ausführungsformen können Milchsäurecopolymere, Proteine (wie Gluten und/oder Zein) und/oder Guar auch verwendet werden, um ein Gummi zu erzeugen, welches leichter biologisch abbaubar ist. In weiteren Ausführungsformen können Hilfsstoffe oder Füllstoffe in einer Menge vorhanden sein, welche im Bereich bis zu 20 Gew.-% des Gummigrundstoffs liegt (z. B. 1 bis 20 Gew.-%, 1 bis 15 Gew.-%, 1 bis 10 Gew.-%, 2 bis 18 Gew.-% oder 5 bis 15 Gew.-% des Gummigrundstoffs), einschließlich jedweden besonderen Werts innerhalb des Bereichs.
In ähnlicher Weise können Färbemittel und Weißmacher gegebenenfalls der Kaugummizusammensetzung zugegeben werden und können beispielsweise Pigmentfarben der FD&C-Typen, Frucht- und Pflanzen-Extrakte, Titandioxid, hitzemodifizierte Aminosäuren, Kakaopulver oder Mischungen davon einschließen. In bestimmten Ausführungsformen können Färbemittel und Weißmacher in einer Menge vorhanden sein, welche im Bereich von 0 bis 5 Gew.-% (z. B. 0 bis 1 Gew.-%) des Gummigrundstoffs liegt, einschließlich jedweden besonderen Werts innerhalb des Bereichs.
Zusätzliche Komponenten des Gummigrundstoffs können gegebenenfalls ein oder mehrere Antioxidationsmittel oder Konservierungsmittel, wie butyliertes Hydroxyanisol (BHA), butyliertes Hydroxytoluol (BHT), Tocopherole, β-Carotine, Propylgallat und Säuerungsmittel (z. B. Vitamin C) einschließen. In gewissen Ausführungsformen können Antioxidationsmittel oder Konservierungsstoffe 0 bis 0,2 Gew.-% des Gummigrundstoffs betragen (z. B. 0 bis etwa 0,05 Gew.-%, 0 bis 0,08 Gew.-%, 0,05 Gew.-% oder 0,1 Gew.-%).
In manchen Ausführungsformen schließt ein Gummigrundstoffanteil einer Zusammensetzung 3 bis 50 Gew.-% eines Elastomers, 0,5 bis 25 Gew.-% eines Weichmachers, 2 bis 30 Gew.-% eines Emulgators, 5 bis 75 Gew.-% eines Harzes und 0 bis 20 Gew.-% eines Füllstoffs ein, wobei sich die Gesamt-Gew.-% des Gummigrundstoffanteils auf 100 belaufen. Der Gummigrundstoff kann zum Beispiel 30 Gew.-% Terpenharz, 15 Gew.-% hydriertes Pflanzenöl (z. B. hydriertes Baumwollsamenöl), 2 Gew.-% Lecithin, 2,5 Gew.-% Polyisobutylen, 27 Gew.-% Polyvinylacetat; 12,45 Gew.-% Calciumcarbonat, 11 Gew.-% Isobutylen-Isopren-Copolymer und 0,05 Gew.-% BHT einschließen.
In gewissen Ausführungsformen kann der Gummigrundstoffanteil etwa 5 bis 95 Gew.-% der Kaugummizusammensetzung ausmachen, wobei die insgesamten Gew.-% der Zusammensetzung gleich 100 sind. Zum Beispiel kann der Gummigrundstoff etwa 5 bis 80 Gew.-%, 10 bis 50 Gew.-%, 15 bis 30 Gew.-% oder etwa 20 bis 35 Gew.-% der Kaugummizusammensetzung ausmachen.
Löslicher Anteil
In einigen Ausführungsformen der Erfindung schließt der lösliche Anteil des Kaugummis, zusätzlich zu Monatin, Massensüßstoffe, Weichmacher, intensitätsstarke Süßstoffe, Aromastoffe, Färbemittel, Hilfsstoffe, Füllstoffe, Komponenten eines funktionellen Gummis (z. B. Nikotin) oder Kombinationen davon ein. Zum Beispiel können Massensüßstoffe verwendet werden, um Dicke oder Viskosität vorzusehen sowie einen gewünschten Spiegel an Süße zu vermitteln. In bestimmten Ausführungsformen schließen Massensüßstoffe sowohl Zucker als auch zuckerlose und Kohlenhydrat-Komponenten mit einem niedrigeren glykämischen Anteil ein und machen zwischen etwa 5 bis 95 Gew.-% der Kaugummizusammensetzung (z. B. 20 bis 80 Gew.-% oder 30 bis 60 Gew.-%) des Kaugummis aus. In anderen Ausführungsformen schließen Zuckersüßstoffe Sucrose, Dextrose (z. B. Cerelose-Dextrose), Maltose, Dextrin, getrockneten Invertzucker, Fructose, Maissirup mit hohem Fructosegehalt, Levulose, Galactose, Maissirup-Feststoffe und dergleichen, allein oder in Kombination, ein. Zuckerlose Süßstoffe und Kohlenhydrat-Komponenten mit einem niedrigeren glykämischen Anteil können, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, Tagatose und Zuckeralkohole wie Sorbitol, Mannitol, Xylitol, Lactitol, Erythritol, Maltitol, hydrierte Stärkehydrolysate, Isomalt, Trehalose und dergleichen, allein oder in Kombination, einschließen.
In bestimmten Ausführungsformen umfassen die Monatin-Kaugummizusammensetzungen andere intensitätsstarke Süßstoffe und/oder zuckerlose Süßstoffe. Eine Anzahl von intensitätsstarken Süßstoffen sind mindestens 20-mal süßer als Sucrose. Diese schließen, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, Sucralose, Aspartam, Salze von Acesulfam (z. B. Acesulfam-K), Alitam, Saccharin und seine Salze, Cyclaminsäure und ihre Salze, Glycyrrhizin, Dihydrochalkone (z. B. Neohesperidin-dihydrochalkon), Thaumatin, Monellin, Neotam, Steviosid (extrahiert aus den Blättern von Stevia rebaudiana), Mogrosid (extrahiert aus der Lo Han Guo-Frucht), Phyllodulcin (extrahiert aus den Blättern von Hydrangea macrophylla, etwa 400- bis 600-mal süßer als Sucrose), Mabinlin, Brazzein, Pentadin und dergleichen, allein oder in Kombination, ein. In manchen Ausführungsformen liegen intensitätsstarke Süßstoffe im Bereich von 0,001 bis 5 Gew.-% der Kaugummizusammensetzung (z. B. 0,009 bis 1 Gew.-% der Kaugummizusammensetzung), einschließlich jedweden besonderen Werts innerhalb des Bereichs. Zum Beispiel können intensitätsstärkere Süßstoffe, wie Alitam (2000-mal süßer als Sucrose, 2000 X Sucrose) und Thaumatin (1600-3000 X Sucrose) bei etwa 0,02 bis 0,10 Gew.-% der Kaugummizusammensetzung vorhanden sein; Aspartam und ähnliche Verbindungen (200 X Sucrose) können bei etwa 0,1 bis 0,3 Gew.-% der Kaugummizu sammensetzung vorhanden sein. In anderen Ausführungsformen können Monatin und ein intensitätsstarker Süßstoff, wie Cyclamat oder Acesulfam K, in einer Kaugummizusammensetzung verwendet werden. Zum Beispiel können 0,05 bis 0,7 Gew.-% Monatin (z. B. das S,S-Stereoisomer von Monatin) und 0,01 bis 0,2 Gew.-% Acesulfam K in einer Kaugummizusammensetzung verwendet werden.
In bestimmten Ausführungsformen können auch Süße-Verstärker, welche nur süß in Gegenwart von anderen Verbindungen, wie Säuren, sind, in einer Kaugummizusammensetzung verwendet werden. Nicht-einschränkende Beispiele von Süße-Verstärkern schließen Curculin und Miraculin (100 X Sucrose) ein.
In anderen Ausführungsformen können auch wässerige Süßmacher-Lösungen, wie diejenigen, enthaltend Sorbitol, hydrierte Stärkehydrolysate, Maissirup, Polyolsirup (z. B. Maltitol-Sirup) oder Kombinationen davon, als Weichmacher und Bindemittel in der Gummizusammensetzung verwendet werden.
In anderen Ausführungsformen umfassen die Monatin-Kaugummizusammensetzungen Aromastoffe, einschließlich natürlicher oder künstlicher Aromen und Kombinationen hiervon. Zum Beispiel können Aromastoffe in einer Menge innerhalb des Bereichs von etwa 0,1 bis 15 Gew.-% der Kaugummizusammensetzung vorhanden sein (z. B. 0,1 bis 10 Gew.-%, 0,2 bis 5 Gew.-% oder 0,5 bis 3 Gew.-% der Kaugummizusammensetzung). In bestimmten Ausführungsformen ist der Aromastoff ein essenzielles Öl, wie ein Öl, das abgeleitet wird aus einer Pflanze oder einer Frucht, Pfefferminzöl, Spearmintöl, andere Minzöle, Nelkenöl, Zimtöl, Öl von Wintergrün, Lorbeer, Thymian, Zedernblatt, Muskatnuss, Allerleigewürz, Salbei, Muskatblüte, Mandeln, Anis und dergleichen). In anderen Ausführungsformen ist der Aromastoff ein Pflanzenextrakt oder eine Fruchtessenz, wie Apfel, Banane, Wassermelone, Birne, Pfirsich, Weintraube, Erdbeere, Himbeere, Kirsche, Pflaume, Ananas und Aprikose, oder eine Kombination von Fruchtaromen (z. B. Tutti frutti). In weiteren Ausführungsformen ist der Aromastoff ein Citrus-Aroma, wie Extrakt, Essenz oder Öl aus Zitrone, Limette, Orange, Mandarine, Grapefruit, Citrusfrucht oder Kumquat. In Ausführungsformen können diese Aromastoffe in flüssiger oder fester Form verwendet werden und können einzeln oder in Mischung verwendet werden.
Wahlfreie Bestandteile, wie Färbemittel, Emulgatoren, pharmazeutische Mittel (z. B. Nikotin, Aspirin, Dimenhydrinat, Koffein) oder Nährstoffe (z. B. Calcium oder Vitamine) können ebenfalls in Kaugummi eingeschlossen werden. Geeignete Färbemittel und Emulgatoren sind oben beschrieben.
In bestimmten Ausführungsformen können eine oder mehrere der Komponenten der Kaugummizusammensetzung verkapselt sein. Zum Beispiel können Monatin und/oder andere intensitätsstarke Süßstoffe, Färbemittel und/oder Aromastoffe verkapselt sein. Das Verkapseln von Monatin und/oder intensitätsstarken Süßstoffen kann die Voraus-Süße-Intensität verstärken, die Süßedauer verlängern und den Schutz und die Stabilität des Süßstoffs verbessern. Die Verkapselung kann des Weiteren Aromastoffe schützen; siehe zum Beispiel die U.S.-Patente Nr. 4 981 698, 5 004 595 und 5 266 335 für Verfahren zur Verkapselung derartiger Komponenten.
Jedwede Gummizusammensetzung kann Monatin einschließen. In einigen Ausführungsformen schließen Gummizusammensetzungen ungefähr 17 bis 23 Gew.-% Gummigrundstoff (z. B. 20 Gew.-%), 55 bis 65 Gew.-% Massensüßstoff (z. B. 60 Gew.-%), 15 bis 21 Gew.-% Glucosesirup (z. B. 18 Gew.-%), 0,05 bis 0,15 Gew.-% Aromastoff (z. B. 0,1 Gew.-%) und 0,05 bis 0,15 Gew.-% sonstige Zusatzstoffe (z. B. 0,1 Gew.-%) ein. In einer Ausführungsform enthält eine Kaugummizusammensetzung etwa 20 Gew.-% Gummigrundstoff, etwa 3 Gew.-% Glycerin, etwa 8 Gew.-% Glucose, etwa 0,5 Gew.-% Lecithin, etwa 1% Fruchtaroma (z. B. Erdbeere), etwa 0,07 Gew.-% Färbemittel (z. B. rotes Färbemittel), etwa 47 Gew.-% Zucker, etwa 20 Gew.-% Inulin- oder Polydextrin-Füllstoff, etwa 0,15 Gew.-% Acesulfam K und 0,5 Gew.-% S,S-Monatin. In gewissen Ausführungsformen kann das R,R-Monatin anstelle des Acesulfam K/S,S-Monatin-Gemischs verwendet werden durch Substituieren von ungefähr 0,02 Gew.-% Monatin, und der Rest kann mit Massenzucker oder Füllstoff aufgefüllt werden.
In einer anderen Ausführungsform schließt eine zuckerfreie Gummizusammensetzung etwa 21 bis 27 Gew.-% (z. B. 24,5 Gew.-%) einer zuckerfreien Gummibasis, etwa 13 bis 19 Gew.-% (z. B. 16,1 Gew.-%) einer Sorbitollösung, etwa 0,5 bis 2,0 Gew.-% (z. B. 1,5 Gew.-%) eines Aromastoffs, wie ein Minzaroma, etwa 2 bis 3,5 Gew.-% (z. B. 2,8 Gew.-%) Glycerin und etwa 0,009 bis 1,1 Gew.-% Monatin, abhängig von der Mischung von Monatin-Stereoisomeren, welche verwendet wird, und etwa 50 bis 60 Gew.-% (z. B. 55 Gew.-%) Sorbitolpulver ein.
Herstellung von Kaugummizusammensetzungen
Kaugummizusammensetzungen können unter Anwendung bekannter Techniken hergestellt werden. Im Allgemeinen kann Kaugummi hergestellt werden durch sequenzielles Zugeben der verschiedenen Kaugummibestandteile zu jedwedem kommerziell verfügbaren Mischer, der im Fachgebiet bekannt ist (z. B. einem Sigma-Klingen-Mischer).
Siehe zum Beispiel die U.S.-Patente Nr. 5 334 397 und 5 800 848. Nachdem die Bestandteile gründlich vermischt worden sind, kann die Gummimasse aus dem Mischer entnommen und zu den gewünschten Formen gestaltet werden, wie durch Auswalzen zu Blättern und Schneiden zu Streifen, Extrudieren zu Klumpen oder Formung zu Pellets oder Tabletten. Eine Vielzahl von Kaugummi- und Bubblegum-Formen sind möglich, einschließlich Streifen, Klumpen, Tabletten, Formen mit gefüllter Mitte, Kugeln, Fruchtformen, Zigarettenformen, Münzen, Schlauchformen und komprimierten Pulver-Gummis.
In einer Ausführungsform wird der Gummigrundstoff zuerst geschmolzen (z. B. bei einer Temperatur im Bereich von 80 bis 125°C), und in den laufenden Mischer zugegeben. Alternativ dazu kann der Grundstoff im Mischer selbst geschmolzen werden. Farbe kann ebenfalls zu dieser Zeit zugesetzt werden. Ein Weichmacher kann als Nächstes zusammen mit dem Sirup und einem Teil des Füllstoffmittels zugegeben werden. Weitere Anteile der Füllstoffmittel können dann in den Mischer zugesetzt werden. In bestimmten Ausführungsformen werden Aromabestandteile der Gummimischung nahe dem Ende des Mischvorgangs zugesetzt. Kaugummis können in einer kontinuierlichen oder satzweisen Art hergestellt werden. Maisstärke oder Talk kann verwendet werden, um Kaugummiprodukte vor dem Verpacken einzustäuben.
Sensorische Tests bewerten den Geschmack und die Textur von Kaugummizusammensetzungen und/oder ihrer Komponenten, wie einem Überzug. Beispiele von sensorischen Tests schließen orale Bewertungstests und Dreieckstests ein. In oralen Bewertungstests werden Kaugummizusammensetzungen, welche gleiche Formulierungen aufweisen aber unterschiedliche Süßstoffe umfassen, Seite an Seite von drei oder mehr Bewertungspersonen ausgewertet. Die Bewertungspersonen bewerten die Süßheitsintensität jeder Zusammensetzung. In Dreieckstests erhalten drei oder mehr Bewertungspersonen drei Proben von Kaugummizusammensetzungen, wobei zwei Proben die gleiche Formulierung aufweisen, und eine dritte Referenz/Vergleichsprobe eine unterschiedliche Formulierung aufweist. Die Bewertungspersonen werden ersucht, zu bestimmen, welche der Formulierungen eine Süße oder sonstige sensorische Kennzeichen aufweist, welche sich von den anderen beiden unterscheiden.
Es wird erwartet, dass Monatin-haltiger Kaugummi, im Vergleich zu Gummis, welche andere Süßstoffe enthalten, eine längere Süße während des Kauens, eine längere Haltbarkeitsdauer, größere Wärme- und Säurestabilität sowie bessere Geschmackscharakteristika und Marktvorteile aufzeigen wird.
BEISPIELE
BEISPIEL 1
Klonierung und Expression von Tryptophan-Aminotransferasen
Dieses Beispiel beschreibt Verfahren, welche angewandt wurden, um Tryptophan-Aminotransferasen zu klonieren, welche verwendet werden können, um Tryptophan in Indol-3-pyruvat umzuwandeln.
Experimenteller Überblick
Elf Gene, welche Aminotransferasen codieren, wurden in E. coli kloniert. Diese Gene waren Bacillus subtilis-D-Alanin-Aminotransferase (dat, Genbank-Zugangs-Nr. Y14082.1, bp 28622-29470 und Genbank Zugangs-Nr. NP_388848.1, Nukleinsäuresequenz bzw. Aminosäuresequenz), aus Sinorhizobium meliloti (ebenfalls bezeichnet als Rhizobium meliloti) stammende Tyrosin-Aminotransferase (tatA, SEQ ID Nr.: 1 und 2, Nukleinsäuresequenz bzw. Aminosäuresequenz), Rhodobacter sphaeroides-Stamm 2.4.1-Tryosin-Aminotransferase (tatA, bestätigt durch Homologie, SEQ ID Nr.: 3 und 4, Nukleinsäuresequenz bzw. Aminosäuresequenz), aus R. sphaeroides 35053 stammende Tyrosin-Aminotransferase (bestätigt durch Homologie, SEQ ID Nr.: 5 und 6, Nukleinsäuresequenz bzw. Aminosäuresequenz), aus Leishmania major stammende Breit-Substrat-Aminotransferase (bsat, bestätigt durch Homologie zu Peptidfragmenten aus L. mexicana, SEQ ID Nr.: 7 und 8, Nukleinsäuresequenz bzw. Aminosäuresequenz), Bacillus subtilis-Aromat-Aminotransferase (araT, bestätigt durch Homologie, SEQ ID Nr.: 9 und 10, Nukleinsäuresequenz bzw. Aminosäuresequenz), Lactobacillus amylovorus-Aromat-Aminotransferase (araT, bestätigt durch Homologie, SEQ ID Nr.: 11 und 12, Nukleinsäuresequenz bzw. Aminosäuresequenz), R. sphaeroides 35053-Mehrfachsubstrat-Aminotransferase (bestätigt durch Homologie, SEQ ID Nr.: 13 und 14, Nukleinsäuresequenz bzw. Aminosäuresequenz), Rhodobacter sphaeroides-Stamm 2.4.1.-Mehrfachsubstrat-Aminotransferase (msa, bestätigt durch Homologie, Genbank Zugangs-Nr. AAAE01000093.1, bp 14743-16155, und Genbank Zugangs-Nr. ZP00005082.1, Nukleinsäuresequenz bzw. Aminosäuresequenz), Escherichia coli-Aspartat-Aminotransferase (aspC, Genbank Zugangs-Nr. AE000195.1, bp 2755-1565, und Genbank Zugangs-Nr. AAC74014.1, Nukleinsäuresequenz bzw. Aminosäuresequenz) und E. coli-Tyrosin-Aminotransferase (tyrB, SEQ ID Nr.: 31 und 32,, Nukleinsäuresequenz bzw. Aminosäuresequenz). Die Gene wurden kloniert, exprimiert und hinsichtlich Aktivität bei der Umwandlung von Tryptophan zu Indol-3-pyruvat, neben kommerziell verfügbaren Enzymen, getestet. Alle elf Klone besaßen Aktivität.
Identifikation von Bakterienstämmen, welche Polypeptide mit der gewünschten Aktivität enthalten können
Keine Gene in der NCBI (National Center for Biotechnology Information)-Datenbank wurden als Tryptophan-Aminotransferasen bezeichnet. Allerdings sind Organismen mit dieser enzymatischen Aktivität identifiziert worden. L-Tryptophan-Aminotransferase-(TAT)-Aktivität ist in Zellextrakten oder aus gereinigtem Protein aus den folgenden Quellen gemessen worden: Rhizobakterien-Isolat aus Festuca octoflora, Erbsen-Mitochondrien und -Cytosol, Sonnenblumen-Kronengallen-Zellen, Rhizobium leguminosarum biovar trifoli, Erwinia herbicola pv gypsophilae, Pseudomonas syringae pv. savastanoi, Agrobacterium tumefaciens, Azospirillum lipferum & brasilense, Enterobacter cloacae, Enterobacter agglomerans, Bradyrhizobium elkanii, Candida maltosa, Azotobacter vinelandii, Rattengehirn, Rattenleber, Sinorhizobium meliloti, Pseudomonas fluorescens CHA0, Lactococcus lactis, Lactobacillus casei, Lactobacillus helveticus, Weizenkeimlinge, Gerste, Phaseolus aureus (Mung-Bohne), Saccharomyces uvarum (carlsbergensis), Leishmania sp., Mais, Tomatenkeimlinge, Erbsenpflanzen, Tabak, Schwein, Clostridium sporogenes und Streptomyces griseus.
BEISPIEL 2
Umwandlung von Indol-3-lactat zu Indol-3-pyruvat
Wie gezeigt in 1 und 3, kann Indol-3-milchsäure verwendet werden, um Indol-3-pyruvat herzustellen. Die Umwandlung zwischen Milchsäure und Pyruvat ist eine reversible Reaktion, wie es auch die Umwandlung zwischen Indol-3-pyruvat und Indol-3-lactat ist. Die Oxidation von Indollactat wurde typischerweise verfolgt, auf Grund des hohen Betrags an Hintergrund bei 340 nm von Indol-3-pyruvat.
Die Standard-Assay-Mischung enthielt 100 mM Kaliumphosphat, pH 8,0, 0,3 mM NAD⁺, 7 Units Lactate-Dehydrogenase (LDH) (Sigma-L2395, St. Louis, MO), und 2 mM Substrat in 0,1 ml. Der Assay wurde in zweifacher Ausfertigung in einer UV-transparenten Mikrotiterplatte unter Verwendung eines Plattenlesegeräts "Molecular Devices SpectraMax Plus" durchgeführt. Polypeptid und Puffer wurden gemischt und in Vertiefungen pipettiert, welche die Indol-3-milchsäure und NAD⁺ enthielten, und die Extinktion bei 340 nm von jeder Vertiefung wurde bei Intervallen von 9 Sekunden nach kurzem Mischen abgelesen. Die Reaktion wurde 5 Minuten lang bei 25°C gehalten. Die Erhöhung der Extinktion bei 340 nm folgt der Produktion von NADH aus NAD⁺. Getrennte Negativkontrollen wurden ohne NAD⁺ und ohne Substrat durchgeführt. D-LDH aus Leuconostoc mesenteroides (Sigma-Katalog-Nr. 12395) schien mehr Aktivität mit den Indol-Derivat-Substraten aufzuweisen, als dies bei L-LDH aus Bacillus stearothermophilus (Sigma-Katalog-Nr. 15275) der Fall war.
Ähnliche Verfahren wurden mit D-Milchsäure und NAD⁺ oder NADH und Pyruvat, den natürlichen Substraten von D-LDH-Polypeptiden, angewandt. Die V_max für die Reduktion von Pyruvat war 100-1000-fach höher als die V_max für die Oxidation von Lactat. Die V_max für die Oxidationsreaktion von Indol-3-milchsäure mit D-LDH war ungefähr ein Fünftel von derjenigen mit Milchsäure. Das Vorhandensein von Indol-3-pyruvat wurde ebenfalls gemessen durch Verfolgen der Änderung der Extinktion bei 327 (das Enol-Borat-Derivat) unter Verwendung von 50 mM Natriumboratpuffer, welcher 0,5 mM EDTA und 0,5 mM Natriumarsenat enthielt. Kleine, aber wiederholbare Extinktionsänderungen wurden beobachtet, im Vergleich zu den Negativkontrollen für sowohl L- als auch D-LDH-Polypeptide.
Zusätzlich dazu können Breitspezifitäts-Lactatdehydrogenasen (Enzyme mit Aktivität, assoziiert mit EC 1.1.1.27, EC 1.1.1.28 und/oder EC 1.1.2.3) kloniert und verwendet werden, um Indol-3-pyruvat aus Indol-3-milchsäure herzustellen. Quellen für Breitspezifitäts-Dehydrogenasen schließen E. coli, Neisseria gonorrhoeae und Lactobacillus plantarum ein.
Alternativ dazu kann Indol-3-pyruvat hergestellt werden durch Kontaktieren von Indol-3-lactat mit Zellextrakten aus Clostridium sporogenes, welche eine Indollactat-Dehydrogenase (EC 1.1.1.110) enthalten; oder Trypanosoma cruzi epimastigotes-Zellextrakten, welche p-Hydroxyphenylacetat-Dehydrogenase (EC 1.1.1.222) enthalten, welche bekanntermaßen Aktivität gegenüber Indol-3-pyruvat aufweist; oder Pseudomonas acidovorans- oder E. coli-Zellextrakten, welche eine Imidazol-5-yl-lactat-Dehydrogenase (EC 1.1.1.111) enthalten; oder Coleus blumei, welcher eine Hydroxyphenylpyruvat-Reduktase (EC 1.1.1.237) enthält; oder Candida maltosa, welches eine D-Aromat-Lactat-Dehydrogenase (EC 1.1.1.222) enthält. Bezugsstellen, welche derartige Aktivitäten beschreiben, schließen Nowicki et al. (FEMS Microbiol. Lett. 71:119-24, 1992), Jean und DeMoss (Canadian J. Microbiol. 14 1968, Coote und Hassall (Biochem. J. 111: 237-9, 1969), Cortese et al. (C.R. Seances Soc. Biol. Fil. 162 390-5, 1968), Petersen und Alfermann (Z. Naturforsch. C: Biosci. 43 501-4, 1988) und Bhatnagar et al. (J. Gen. Microbiol. 135:353-60, 1989) ein. Darüber hinaus kann eine Lactat- Oxidase, wie diejenige aus Pseudomonas sp. (Gu et al., J. Mol. Catalysis B: Enzymatic: 18:299-305, 2002), für die Oxidation von Indol-3-milchsäure zu Indol-3-pyruvat verwendet werden.
BEISPIEL 3
Umwandlung von L-Tiyptophan zu Indol-3-pyruvat unter Verwendung von L-Aminosäure-Oxidase
Dieses Beispiel beschreibt Verfahren, welche verwendet werden, um Tryptophan zu Indol-3-pyruvat mittels einer Oxidase (EC 1.4.3.2) umzuwandeln, als eine Alternative zur Verwendung einer Tryptophan-Aminotransferase, wie beschrieben in Beispiel 1. L-Aminosäureoxidase wurde gereinigt aus Crotalus durissus (Sigma, St. Louis, MO, Katalog-Nr. A-2805). Die Zugangsnummern von L-Aminosäureoxidasen für molekulare Klonierung beinhalten: CAD21325.1, AAL14831, NP_490275, BAB78253, A38314, CAB71136, JE0266, T08202, S48644, CAC00499, P56742, P81383, 093364, P81382, P81375, 562692, P23623, AAD45200, AAC32267, CAA88452, AP003600 und Z48565.
Reaktionen wurden in Mikrozentrifugenröhrchen in einem Gesamtvolumen von 1 ml durchgeführt und 10 Minuten lang unter Schütteln bei 37°C inkubiert. Die Reaktionsmischung enthielt 5 mM L-Tryptophan, 100 mM Natriumphosphatpuffer pH 6,6, 0,5 mM Natriumarsenat, 0,5 mM EDTA, 25 mM Natriumtetraborat, 0,016 mg Katalase (83 U, Sigma C-3515), 0,008 mg FAD (Sigma) und 0,005-0,125 Units L-Aminosäureoxidase. Negativkontrollen enthielten alle Komponenten außer Tryptophan, und Leerproben enthielten alle Komponenten außer der Oxidase. Katalase wurde verwendet, um das Wasserstoffperoxid zu entfernen, welches während der oxidativen Desaminierung gebildet wurde. Das Natriumtetraborat und -arsenat wurden verwendet, um die Enol-Borat-Form von Indol-3-pyruvat zu stabilisieren, welche eine maximale Extinktion bei 327 nm zeigt. Indol-3-pyruvat-Standards wurden bei Konzentrationen von 0,1-1 mM in der Reaktionsmischung hergestellt.
Die gekaufte L-Aminosäureoxidase wies eine spezifische Aktivität von 540 μg Indol-3-pyruvat, erzeugt pro Minute pro mg Protein, auf. Dies ist die gleiche Größenordnung, wie die spezifische Aktivität von Tryptophan-Aminotransferase-Enzymen.
BEISPIEL 4
Umwandeln von Indol-3-pyruvat zu 2-Hydroxy-2-(indol-3-ylmethyl)-4-ketoglutarsäure mit einer Aldolase
Dieses Beispiel beschreibt Verfahren, welche angewandt werden können, um Indol-3-pyruvat unter Verwendung einer Aldolase (Lyase) in MP umzuwandeln (2). Aldol-Kondensationen sind Reaktionen, welche Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen zwischen dem β-Kohlenstoffatom eines Aldehyds oder Ketons und dem Carbonylkohlenstoffatom eines anderen Aldehyds oder Ketons bilden. Ein Carbanion wird auf dem Kohlenstoffatom gebildet, das zu der Carbonylgruppe eines Substrats benachbart ist, und dient als ein Nukleophil, welches das Carbonylkohlenstoffatom des zweiten Substrats (den elektrophilen Kohlenstoff) angreift. Am üblichsten ist das elektrophile Substrat ein Aldehyd, sodass die meisten Aldolasen in die Kategorie EC 4.1.2.- fallen. Ziemlich häufig ist das nukleophile Substrat Pyruvat. Für Aldolasen ist es weniger üblich, die Kondensation zwischen zwei Ketosäuren oder zwei Aldehyden zu katalysieren.
Allerdings sind Aldolasen, welche die Kondensation von zwei Carbonsäuren katalysieren, identifiziert worden. Zum Beispiel beschreibt EP 1045-029 die Produktion von 1-4-Hydroxy-2-ketoglutarsäure aus Glyoxylsäure und Pyruvat unter Verwendung einer Pseudomonas-Kultur (EC 4.1.3.16). Darüber hinaus kann 4-Hydroxy-4-methyl-2-oxoglutarat-Aldolase (4-Hydroxy-4-methyl-2-oxoglutarat-Pyruvat-Lyase, EC 4.1.3.17) die Kondensation von zwei Ketosäuren katalysieren. Deshalb wurden ähnliche Aldolasepolypeptide verwendet, um die Kondensation von Indol-3-pyruvat mit Pyruvat zu katalysieren.
Klonierung
4-Hydroxy-4-methyl-2-oxoglutarat-Pyruvat-Lyasen (ProA-Aldolase, EC 4.1.3.17) und 4-Hydroxy-2-oxoglutarat-Glyoxylat-Lyase (KHG-Aldolase, EC 4.1.3.16) katalysieren Reaktionen, die sehr ähnlich zu der Aldolasereaktion von 2 sind. Primer wurden mit kompatiblen Überhängen für den pET30 Xa/LIC-Vektor (Novagen, Madison, WI) entworfen.
Aktivtätsergebnisse mit proA-Genprodukten
Sowohl die C. testosteroni proA- als auch S. meliloti SMc00502-Genkonstrukte wiesen hohe Expressionsspiegel bei Induktion mit IPTG auf. Die rekombinanten Proteine waren in hohem Maße löslich, wie bestimmt mittels SDS-PAGE-Analyse von Gesamtprotein- und Zellextrakt-Proben. Das C. testosteroni-Genprodukt wurde zu > 95% Reinheit aufgereinigt. Weil die Ausbeute des S. meliloti-Genprodukts nach Affinitätsreinigung unter Verwendung einer His-Bind-Patrone sehr niedrig war, wurde Zellextrakt für die enzymatischen Assays verwendet.
Beide rekombinanten Aldolasen katalysierten die Bildung von MP aus Indol-3-pyruvat und Pyruvat. Die Gegenwart von sowohl zweiwertigem Magnesium als auch Kaliumphosphat war für enzymatische Aktivität erforderlich. Es war kein Produkt offensichtlich, als Indol-3-pyruvat, Pyruvat oder Kaliumphosphat abwesend war. Eine kleine Menge des Produkts wurde auch in Abwesenheit von Enzym gebildet (typischerweise eine Größenordnung weniger, als wenn Enzym vorhanden war).
Der Produkt-Peak eluierte aus der Umkehrphasen-C18-Säule etwas später als der Indol-3-pyruvat-Standard, das Massenspektrum dieses Peaks zeigte ein Kollisionsinduziertes Elternion ([M + H]+) von 292,1, das Elternion, welches für das Produkt MP erwartet wurde. Die hauptsächlichen Tochterfragmente, welche im Massenspektrum vorhanden waren, schlossen diejenigen mit m/z = 158 (1H-Indol-3-carbaldehyd-Carboniumion), 168 (3-Buta-1,3-dienyl-1H-indol-Carboniumion), 274 (292 – H₂O), 256 (292 – 2 H₂O), 238 (292 – 3 H₂O), 228 (292 – CH4O3) und 204 (Verlust von Pyruvat) ein. Das Produkt zeigte ebenfalls ein UV-Spektrum auf, welches charakteristisch für andere Indol-enthaltende Verbindungen, wie Tryptophan, war, mit dem λ_max von 279-280 und einer kleinen Schulter bei ungefähr 290 nm.
Die Menge an MP, welche von der C. testosteroni-Aldolase produziert wurde, stieg mit einem Anstieg der Reaktionstemperatur von Raumtemperatur auf 37°C, der Menge an Substrat und der Menge an Magnesium. Die synthetische Aktivität des Enzyms sank mit steigendem pH-Wert, wobei das Maximum-Produkt bei pH 7 beobachtet wurde. Basierend auf Tryptophan-Standards belief sich die Menge an MP, welche unter einem Standard-Assay unter Verwendung von 20 μg gereinigtem Protein hergestellt wurde, ungefähr auf 10-40 μg pro einem ml Reaktion.
Auf Grund des hohen Ausmaßes an Homologie der S. meliloti- und C. testosteroni-ProA-Aidolase-codierenden Sequenzen mit den anderen, oben beschriebenen, Genen, wird es erwartet, dass alle der rekombinanten Genprodukte diese Reaktion katalysieren können. Weiterhin wird es erwartet, dass Aldolasen, welche Threonin (T) bei den Positionen 59 und 87, Arginin (R) bei 119, Aspartat (D) bei 120 und Histidin (H) bei 31 und 71 aufweisen (basierend auf dem Nummerierungssystem von C. testosteroni) ähnliche Aktivität aufweisen werden.
Aktivitätsergebnisse mit khg-Genprodukten
Beide, die B. subtilis- und E. coli-khg-Genkonstrukte, besaßen hohe Spiegel an Expression von Protein, wenn sie mit IPTG induziert wurden, wohingegen die S. meliloti-khg einen niedrigeren Expressionsspiegel aufwieß. Die rekombinanten Proteine waren in hohem Maße löslich, wie beurteilt durch SDS-PAGE-Analyse von Gesamtproteinen und zellulären Extrakten. Die B. subtilis- und E. coli-khg-Genprodukte wurden zu > 95% Reinheit aufgereinigt; die Ausbeute des S. meliloti-Genprodukts war nach Affinitätsreinigung unter Verwendung einer His-Bind-Patrone nicht so hoch.
Es gibt keinen Beweis, dass Magnesium und Phosphat für die Aktivität für dieses Enzym erfordert werden. Allerdings berichtet die Literatur über die Durchführung der Assays in Natriumphosphat-Puffer, und das Enzym ist berichtetermaßen bifunktionell und weist eine Aktivität auf phosphorylierte Substrate, wie 2-Keto-3-desoxy-6-phosphogluconat (KDPG) auf. Die enzymatischen Assays wurden durchgeführt, wie oben beschrieben, und in einigen Fällen wurde das Phosphat weggelassen. Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass die rekombinanten KHG-Aldolasen MP produzierten, aber nicht so aktiv wie die ProA-Aldolasen waren. In einigen Fällen war der Spiegel an von KHG produziertem MP nahezu identisch zu der Menge, welche von Magnesium und Phosphat allein produziert wurde. Phosphat schien die KHG-Aktivitäten nicht zu erhöhen. Das Bacillus-Enzym wies die höchste Aktivität auf, ungefähr 20-25% höhere Aktivität als das Magnesium und Phosphat allein, wie durch SRM ermittelt wurde (siehe Beispiel 10). Das Sinorhizobium-Enzym wies den geringsten Aktivitäts-Betrag auf, was mit Faltungs- und Löslichkeitsproblemen assoziiert sein kann, die in der Expression bemerkt wurden. Alle drei Enzyme weisen das Glutamat der aktiven Stelle (Position 43 im B. subtilis-Nummerierungssystem) sowie das Lysin auf, welches für die Schiff-Basen-Bildung mit Pyruvat erforderlich ist (Position 130); allerdings enthält das B. subtilis-Enzym ein Threonin in der Position 47, einem Rest der aktiven Stelle, anstatt von Arginin. Die B. subtilis-KHG ist kleiner und scheint in einem Cluster zu sein, welcher unterschiedlich von den S. meliloti- und E. coli-Enzymen ist, wobei die anderen Enzyme an der aktiven Stelle Threonin aufweisen. Die Unterschiede in der aktiven Stelle können der Grund für die erhöhte Aktivität des B. subtilis-Enzyms sein.
Verbesserung von Aldolase-Aktivität
Katalytische Antikörper können so effizient wie natürliche Aldolasen sein, einen weiten Spielraum von Substraten akzeptieren, und können verwendet werden, um die in 2 gezeigte Reaktion zu katalysieren.
Aldolasen können auch durch gerichtete Evolution verbessert werden, wie es zum Beispiel früher beschrieben wurde für eine KDPG-Aldolase (in hohem Maße homolog zur oben beschriebenen KHG), welche durch DNA-Shuffling und fehleranfällige PCR evolviert wurde, um das Erfordernis für Phosphat zu beseitigen und die Enantioselektivität umzukehren. Die KDPG-Aldolase-Polypeptide sind nützlich in biochemischen Reaktionen, da sie hochspezifisch für das Donorsubstrat (hierin Pyruvat) sind, aber relativ flexibel in Hinsicht auf das Akzeptorsubstrat (d. h. Indol-3-pyruvat) sind (Koeller & Wong, Nature 409:232-9, 2001). KHG-Aldolase weist Aktivität für die Kondensation von Pyruvat mit einer Anzahl von Carbonsäuren auf. Säuger-Versionen der KHG-Aldolase besitzen angenommenermaßen eine breitere Spezifität als bakterielle Versionen, einschließlich einer höheren Aktivität auf 4-Hydroxy-4-methyl-2-oxoglutarat und der Akzeptanz von beiden Stereoisomeren von 4-Hydroxy-2-ketoglutarat. Bakterielle Quellen scheinen eine 10-fache Präferenz für das R-Stereoisomer aufzuweisen. Es sind nahezu 100 KHG-Homologe in genomischen Datenbanken verfügbar, und Aktivität ist in Pseudomonas, Paracoccus, Pro videncia, Sinorhizobium, Morganella, E. coli und Säuger-Geweben gezeigt worden. Diese Enzyme können als Ausgangspunkt zum Maßschneidern der Enantiospezifität, welche für Monatin-Herstellung gewünscht wird, verwendet werden.
Aldolasen, welche Pyruvat und ein anderes Substrat, welches entweder eine Ketosäure ist und/oder eine sperrige hydrophobe Gruppe, wie Indol, aufweist, verwenden, können "evolviert" werden, um die Spezifität, Geschwindigkeit und Selektivität des Polypeptids maßzuschneidern. Zusätzlich zu den hierin verdeutlichten KHG- und ProA-Aldolasen, schließen Beispiele dieser Enzyme, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, Folgendes ein: KDPG-Aldolase und verwandte Polypeptide (KDPH); Transcarboxybenzalpyruvat-Hydratase-Aldolase aus Nocardloides st; 4-(2-Carboxyphenyl)-2-oxobut-3-enoat-Aldolase (2'-Carboxybenzalpyruvat-Aldolase), welche Pyruvat und 2-Carboxybenzaldehyd (ein Substrat, das einen aromatischen Ring enthält) kondensiert; trans-O-Hydroxybenzylidenpyruvat-Hydratase-Aldolase aus Pseudomonas putida und Sphingomonas aromaticivorans, welche ebenfalls Pyruvat und ein aromathaltiges Aldehyd als Substrate verwendet; 3-Hydroxyaspartat-Aldolase (Erythro-3-hydroxy-L-aspartat-Glyoxylat-Lyase), welche 2-Oxo-Säuren als die Substrate verwendet und angenomme nermaßen in dem Organismus Micrococcus denitrificans vorliegt; Benzoin-Aldolase (Benzaldehyd-Lyase), welche Substrate verwendet, die Benzylgruppen enthalten; Dihydroneopterin-Aldolase; L-Threo-3-phenylserin-Benzaldehyd-Lyase (Phenylserin-Aldolase), welche Glycin mit Benzaldehyd kondensiert; 4-Hydroxy-2-oxovalerat-Aldolase; 1,2-Dihydroxylbenzylpyruvat-Aldolase; und 2-Hydroxybenzalpyruvat-Aldolase.
Ein Polypeptid mit der gewünschten Aktivität kann selektiert werden durch Screenen von Klonen von Interesse unter Anwendung der folgenden Verfahren. Tryptophan-Auxotrophe werden mit Vektoren transformiert, welche die Klone von Interesse auf einer Expressionskassette tragen, und werden auf einem Medium, welches kleine Mengen von Monatin oder MP enthält, wachsen gelassen. Da Aminotransferasen und Aldolase-Reaktionen reversibel sind, sind die Zellen in der Lage, Tryptophan aus einem razemischen Gemisch von Monatin zu produzieren. In ähnlicher Weise können Organismen (sowohl rekombinant als auch Wildtyp) durch die Fähigkeit, MP oder Monatin als eine Kohlenstoff- und Energiequelle zu verwenden, gescreent werden. Eine Quelle von Ziel-Aldolasen besteht in Expressionsbibliotheken von verschiedenen Pseudomonas- und rhizobakteriellen Stämmen. Pseudomonaden besitzen viele ungewöhnliche katabolische Wege zum Abbau von aromatischen Molekülen und sie enthalten ebenfalls viele Aldolasen; wohingegen die Rhizobakterien Aldolasen enthalten, bekanntermaßen in der Pflanzen-Rhizosphäre wachsen und viele der Gene aufweisen, welche für die Konstruktion eines biosynthetischen Wegs für Monatin beschrieben wurden.
BEISPIEL 5
Chemische Synthese des Monatin-Vorläufers
Das Beispiel 4 beschrieb ein Verfahren zur Verwendung einer Aldolase, um Indol-3-pyruvat zu MP zu konvertieren. Dieses Beispiel beschreibt ein alternatives Verfahren zum chemischen Synthetisieren von MP. MP kann gebildet werden unter Verwendung einer typischen Kondensation vom Aldol-Typ (4). Kurz gesagt beinhaltet eine typische Reaktion vom Aldol-Typ die Erzeugung eines Carbanions des Pyruvatesters unter Verwendung einer starken Base, wie LDA (Lithiumdiisopropylamid), Lithiumhexamethyldisilazan oder Butyllithium. Das Carbanion, welches erzeugt wird, reagiert mit dem Indol-Pyruvat unter Bildung des gekoppelten Produkts.
Schutzgruppen, welche zum Schützen des Indol-Stickstoffs verwendet werden können, schließen, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, ein: t-Butyloxycarbonyl (Boc) und Benzyloxycarbonyl (Cbz). Blockierungsgruppen für Carbonsäuren schließen, ohne je doch darauf eingeschränkt zu sein, Alkylester (zum Beispiel Methyl-, Ethyl-, Benzylester) ein. Wenn derartige Schutzgruppen verwendet werden, ist es nicht möglich, die Stereochemie des Produkts, welches gebildet wird, zu steuern. Wenn jedoch R2 und/oder R3 chirale Schutzgruppen sind (4), wie (S)-2-Butanol, Menthol oder ein chirales Amin, kann dies die Bildung eines MP-Enantiomeren gegenüber dem anderen bevorzugen.
BEISPIEL 6
Umwandlung von Tryptophan oder Indol-3-pyruvat zu Monatin
Ein In-vitro-Verfahren unter Verwendung von zwei Enzymen, einer Aminotransferase und einer Aldolase, erzeugte Monatin aus Tryptophan und Pyruvat. Im ersten Schritt war alpha-Ketoglutarat der Akzeptor der Aminogruppe von Tryptophan in einer Transaminierungsreaktion, welche Indol-3-pyruvat und Glutamat erzeugte. Eine Aldolase katalysierte die zweite Reaktion, in welcher Pyruvat mit Indol-3-pyruvat umgesetzt wurde, in Gegenwart von Mg²⁺ und Phosphat, wobei das alpha-Keto-Derivat von Monatin (MP), 2-Hydroxy-2-(indol-3-ylmethyl)-4-ketoglutarsäure, erzeugt wurde. Der Transfer der Aminogruppe von dem in der ersten Reaktion gebildeten Glutamat erzeugte das gewünschte Produkt, Monatin. Die Reinigung und Charakterisierung des Produkts belegte, dass das gebildete Stereoisomer S,S-Monatin war. Alternative Substrate, Enzyme und Bedingungen werden beschrieben, ebenso wie Verbesserungen, welche an diesem Verfahren vorgenommen wurden.
Enzyme
Die Aldolase 4-Hydroxy-4-methyl-2-oxoglutarat-Pyruvat-Lyase (ProA-Aldolase, proA-Gen) (EC 4.1.3.17) aus Comamonas testosteroni wurde kloniert, exprimiert und gereinigt, wie in Beispiel 4 beschrieben. Die 4-Hydroxy-2-oxoglutarat-Glyoxylat-Lyasen (KHG-Aldolasen) (EC 4.1.3.16) aus B. subtilis, E. coli und S. meliloti wurden kloniert, exprimiert und gereinigt, wie in Beispiel 4 beschrieben.
Die zusammen mit den Aldolasen zum Herstellen von Monatin verwendeten Aminotransferasen waren L-Aspartat-Aminotransferase, die von dem E. coli aspC-Gen codiert wird, die Tyrosin-Aminotransferase, welche von dem E. coli tyrB-Gen codiert wird, das S. meliloti-TatA-Enzym, die Breit-Substrat-Aminotransferase, welche von dem L. major-bsat-Gen codiert wird, oder die Glutaminsäure-Oxalessigsäure-Transaminase aus Schweineherz (Typ IIa). Die Klonierung, Expression und Reinigung der Nicht- Säuger-Proteine werden in Beispiel 1 beschrieben. Glutaminsäure-Oxalessigsäure-Transaminase aus Schweineherz (Typ IIa) wurde von Sigma (# G7005) erhalten.
Verfahren unter Verwendung von ProA-Aldolase und L-Aspartat-Aminotransferase
Die Reaktionsmischung enthielt 50 mM Ammoniumacetat, pH 8,0, 4 mM MgCl₂, 3 mM Kaliumphosphat, 0,05 mM Pyridoxalphosphat, 100 mM Ammoniumpyruvat, 50 mM Tryptophan, 10 mM alpha-Ketoglutarat, 160 mg rekombinante C. testosteroni-ProA-Aldolase (ungereinigter Zellextrakt, ~30% Aldolase), 233 mg rekombinante E. coli-L-Aspartat-Aminotransferase (ungereinigter Zellextrakt, ~40% Aminotransferase) in einem Liter. Alle Komponenten, außer den Enzymen, wurden miteinander vermischt und bei 30°C inkubiert, bis sich das Tryptophan aufgelöst hatte. Die Enzyme wurden dann zugesetzt, und die Reaktionslösung wurde bei 30°C unter vorsichtigem Schütteln (100 U/min) 3,5 Stunden lang inkubiert. 0,5 und 1 Stunde nach der Zugabe der Enzyme wurden Aliquots von festem Tryptophan (jeweils 50 mMol) zu der Reaktion zugesetzt. Das gesamte zugesetzte Tryptophan löste sich nicht auf, aber die Konzentration wurde bei 50 mM oder höher gehalten. Nach 3,5 Stunden wurde das feste Tryptophan abfiltriert. Die Analyse der Reaktionsmischung durch LC/MS unter Verwendung einer definierten Menge an Tryptophan als Standard zeigte, dass die Konzentration an Tryptophan in der Lösung 60,5 mM betrug und die Konzentration von Monatin 5,81 mM (1,05 g) betrug.
Die folgenden Verfahren wurden angewandt, um das Endprodukt zu reinigen. Neunzig Prozent der klaren Lösung wurden auf eine Säule von BioRad AG50W-X8-Harz aufgetragen (225 ml; Bindungskapazität 1,7 mÄq/ml). Die Säule wurde mit Wasser gewaschen, wobei 300-ml-Fraktionen aufgefangen wurden, bis die Absorption bei 280 nm <5% der ersten Durchflussfraktion war. Die Säule wurde dann eluiert mit 1 M Ammoniumacetat, pH 8,4, wobei 4 300-ml-Fraktionen aufgefangen wurden. Alle vier Fraktionen enthielten Monatin und wurden unter Verwendung eines Rotationsverdampfers mit einem lauwarmen Wasserbad zu 105 ml eingedampft. Ein Präzipitat bildete sich, als sich das Volumen reduzierte, und wurde über den Verlauf des Eindampfverfahrens hinweg abfiltriert.
Die Analyse der Säulenfraktionen durch LC/MS zeigte, dass 99% des Tryptophans und Monatins an die Säule gebunden hatten. Das Präzipitat, welches sich während des Eindampfverfahrens bildete, enthielt >97% Tryptophan und <2% an Monatin. Das Verhältnis von Tryptophan zu Produkt im Überstand belief sich auf ungefähr 2:1.
Der Überstand (7 ml) wurde auf eine 100 ml große Fast Flow DEAE-Sepharose-Säule (Amersham Biosciences) aufgetragen, welche zuvor durch Waschen mit 0,5 l 1 M Na-OH, 0,2 l Wasser, 1,0 l 1,0 M Ammoniumacetat, pH 8,4, und 0,5 l Wasser in die Acetatform umgewandelt worden war. Der Überstand wurde bei <2ml/min aufgetragen, und die Säule wurde mit Wasser bei 3-4 ml/min gewaschen, bis die Absorption bei 280 nm ~0 betrug. Monatin wurde mit 100 mM Ammoniumacetat, pH 8,4, eluiert, wobei vier 100-ml-Fraktionen aufgefangen wurden.
Die Analyse der Fraktionen zeigte, dass das Verhältnis von Tryptophan zu Monatin in den Durchflussfraktionen 85:15 betrug, und das Verhältnis in den Eluatfraktionen 7:93 betrug. Unter der Annahme, dass der Extinktionskoeffizient bei 280 nm von Monatin der Gleiche wie von Tryptophan ist, enthielten die Eluatfraktionen 0,146 mMol Produkt. Eine Extrapolation auf die gesamte 1-Liter-Reaktion würde ~2,4mMol (~710 mg) Monatin ergeben, entsprechend einer Ausbeute von 68%.
Die Eluatfraktionen aus der DEAE-Sepharose-Säule wurden zu <20 ml eingedampft. Ein Aliquot des Produkts wurde weiter gereinigt durch Auftragen auf eine präparative C₈-Umkehrphasen-Säule unter Anwendung der gleichen chromatographischen Bedingungen, wie denjenigen, die in Beispiel 10 für die Charakterisierung von Monatin im analytischen Maßstab beschrieben wurden. Die Fractionlynx^TM-Software von Waters wurde eingesetzt, um das automatische Fraktionsauffangen von Monatin basierend auf der Detektion des m/z = 293-Ions auszulösen. Die Fraktion aus der C₈-Säule mit dem entsprechenden protonierten molekularen Ion für Monatin wurde aufgefangen, bis zur Trockenheit eingedampft und dann in einem kleinen Wasservolumen gelöst. Diese Fraktion wurde für die Charakterisierung des Produkts verwendet.
Das resultierende Produkt wurde unter Anwendung der folgenden Verfahren charakterisiert.
UV/Sichtbar-Spektroskopie. UV/Sichtbar-Spektroskopie-Messungen von Monatin, das enzymatisch erzeugt worden war, wurden unter Verwendung eines Cary 100 Bio "UV/visible"-Spektrophotometers durchgeführt. Das gereinigte Produkt, welches im Wasser gelöst war, zeigte ein Absorptionsmaximum von 280 nm mit einer Schulter bei 288 nm, was Merkmale sind, die typisch für Indol enthaltende Verbindungen sind.
LC/MS-Analyse. Analysen von Mischungen hinsichtlich Monatin, das aus den biochemischen in-vitro-Reaktionen abgeleitet wurde, wurden durchgeführt, wie beschrieben in Beispiel 10. Eine typische LC/MS-Analyse von Monatin in einer enzymatischen synthetischen in-vitro-Mischung wird in der 5 veranschaulicht. Die untere Tafel von 5 veranschaulicht ein ausgewähltes Ionenchromatogramm für das protonierte Molekülion von Monatin bei m/z = 293. Diese Identifikation von Monatin in der Mischung wurde durch das Massenspektrum, welches in 6 veranschaulicht ist, bestätigt. Eine Analyse des gereinigten Produkts durch LC/MS zeigte einen einzelnen Peak mit einem Molekülion von 293 und Absorption bei 280 nm. Das Massenspektrum war identisch zu demjenigen, welches in 6 gezeigt wird.
MS/MS-Analyse. LC/MS/MS-Tochterionen-Experimente, wie beschrieben in Beispiel 10, wurden ebenfalls an Monatin durchgeführt. Ein Tochterionen-Massenspektrum von Monatin wird in der 7 veranschaulicht. Vorläufige Strukturzuweisungen aller Fragmentionen, die in 7 markiert sind, wurden vorgenommen. Diese schließen Fragmentionen von m/z = 275 (293 – H₂O), 257 (293-(2 × H₂O)), 230 (275-COOH), 212 (257-COOH), 168 (3-Buta-1,3-dienyl-1H-indolcarboniumion), 158 (1H-Indol-3-carbaldehydcarboniumion), 144 (3-Ethyl-1H-indolcarboniumion), 130 3-Methylen-1H-indolcarboniumion) und 118 (Indolcarboniumion) ein. Viele von diesen sind die gleichen, wie diejenigen, welche für MP erhalten werden (Beispiel 4), wie erwartet, wenn sie aus dem Indol-Teil des Moleküls abgeleitet werden. Einige sind 1 Masseneinheit höher als diejenigen, welche für MP beobachtet werden, und zwar auf Grund des Vorhandenseins einer Aminogruppe anstatt eines Ketons.
Akkurate Massenmessung von Monatin. 8 veranschaulicht das Massenspektrum, welches für gereinigtes Monatin erhalten wurde unter Verwendung eines Applied Biosystems-Perkin Elmer Q-Star-Hybrid-Quadrupol/Flugzeit-Massenspektrometers. Die gemessene Masse für protoniertes Monatin unter Verwendung von Tryptophan als einem internen Massenkalibrierungsstandard belief sich auf 293,1144. Die berechnete Masse von protoniertem Monatin, basierend auf der Elementzusammensetzung C₁₄H₁₇N₂O₅ beträgt 293,1137. Dies ist ein Massenmessfehler von weniger als 2 Teilen pro Million (ppm), was einen schlüssigen Beweis für die Elementzusammensetzung von enzymatisch hergestelltem Monatin bereitstellt.
NMR-Spektroskopie. Die NMR-Experimente wurden auf einem Varian Inova 500 MHz-Instrument durchgeführt. Die Probe von Monatin (~3 mg) wurde in 0,5 ml D₂O gelöst. Anfänglich wurde das Lösungsmittel (D₂O) als die interne Referenz bei 4,78 ppm verwendet. Da der Peak für Wasser groß war, wurde die ¹H-NMR mit einer Unterdrückung des Peaks für Wasser durchgeführt. Anschließend, aufgrund der Breite des Wasser-Peaks, wurde das C-2-Proton von Monatin als der Referenz-Peak verwendet, und bei dem veröffentlichten Wert von 7,192 ppm festgelegt.
Für ¹³C-NMR zeigte ein anfänglicher Durchlauf von mehreren hundert Scans, dass die Probe zu verdünnt war, um ein adäquates ¹³C-Spektrum in der zugewiesenen Zeit zu erhalten. Deshalb wurde ein heteronukleares Mehrfach-Quanten-Kohärenz (HMQC)-Experiment durchgeführt, welches die Korrelation der Wasserstoffe und der Kohlenstoffe, an welche sie gebunden waren, ermöglichte und des Weiteren Information über die chemischen Verschiebungen der Kohlenstoffe lieferte.
Eine Zusammenfassung der ¹H- und HMQC-Daten wird in den Tabellen 1 und 2 gezeigt. Durch Vergleich mit veröffentlichten Werten zeigten die NMR-Daten, dass das enzymatisch hergestellte Monatin entweder (S,S), (R,R) oder eine Mischung von beiden war.
Chirale LC/MS-Analyse. Um zu belegen, dass das in vitro hergestellte Monatin ein Stereoisomer und nicht eine Mischung der (R,R)- und (S,S)-Enantiomere war, wurden chirale LC/MS-Analysen unter Verwendung der in Beispiel 10 beschriebenen Instrumentierung durchgeführt.
Chirale LC-Auftrennungen wurden unter Verwendung einer chiralen Chromatographie-Säule Chirobiotic T (Advanced Separations Technology) bei Raumtemperatur vorgenommen. Die Trennung und der Nachweis, basierend auf veröffentlichten Protokollen des Lieferanten, wurden hinsichtlich der R(D)- und S(L)-Stereoisomere von Tryptophan optimiert. Die mobile Phase bei der Flüssigkeitschromatographie bestand aus A) Wasser, welches 0,05% (v/v) Trifluoressigsäure enthielt; B) Methanol, welches 0,05% (v/v) Trifluoressigsäure enthielt. Die Flution war bei 70% A und 30% B isokratisch. Die Fließgeschwindigkeit belief sich auf 1,0 ml/min, und die PDA-Absorption wurde von 200 nm bis 400 nm überwacht. Die instrumentellen Parameter, die für die chirale LC/MS-Analyse von Tryptophan und Monatin verwendet wurden, sind identisch zu denjenigen, welche in Beispiel 10 für LC/MS-Analyse beschrieben werden. Die Erfassung von Massenspektren für die Region m/z 150-400 wurde angewandt. Ausgewählte Ionenchromatogramme für protonierte Molekülionen ([M + H]⁺ = 205, für sowohl R- als auch S-Tryptophan, und [M + H]⁺ = 293 für Monatin) gestatteten die direkte Identifizierung dieser Analyten in den Mischungen.
Die Chromatogramme von R- und S-Tryptophan und Monatin, welche durch chirale Chromatographie getrennt und durch MS überwacht wurden, sind in der 9 gezeigt. Der einzelne Peak im Chromatogramm von Monatin weist darauf hin, dass es sich bei der Verbindung um ein Stereoisomer handelt, mit einer Retentionszeit, die nahezu identisch zu S-Tryptophan ist.
Tabelle 1 ¹H-NMR-Daten

¹ Vleggaar et al. (J.C.S Perkin Trans. 1:3095-8, 1992).
² Takeschi and Shusuke ( JP2002060382 , 2002-02-26).

Tabelle 2 ¹³H-NMR-Daten (aus HMQC-Spektrum)

¹ Vleggaar et al. (J.C.S Perkin Trans. 1:3095-8, 1992).

Polarimetrie. Die optische Rotation wurde auf einem Rudolph Autopol III-Polarimeter gemessen. Das Monatin wurde hergestellt als eine 14,6 mg/ml-Lösung in Wasser. Die erwartete spezifische Rotation ([α]_D20) für S,S-Monatin (Salzform) beträgt –49,6 für eine Lösung von 1 g/ml in Wasser (Vleggaar et al). Die beobachtete [α]_D20 belief sich auf –28,1 für das gereinigte, enzymatisch hergestellte Monatin, was anzeigt, dass es sich um das S,S-Stereoisomer handelte.
Verbesserungen
Die Reaktionsbedingungen, einschließlich Reagenz- und Enzymkonzentrationen, wurden optimiert, und Erträge von 5-10 mg/ml wurden unter Verwendung der folgenden Reagenzienmischung produziert:
50 mM Ammoniumacetat, pH 8,3, 2 mM MgCl₂, 200 mM Pyruvat (Natrium- oder Ammoniumsalz), 5 mM alpha-Ketoglutarat (Natriumsalz), 0,05 mM Pyridoxalphosphat, entlüftetes Wasser, zum Erreichen eines Endvolumens von 1 ml nach der Zugabe der Enzyme, 3 mM Kaliumphosphat, 50 μg/ml rekombinante ProA-Aldolase (Zellextrakt; Gesamtprotein-Konzentration von 167 μg/ml), 1000 μg/ml L-Aspartat-Aminotransferase, welche vom E. coli aspC-Gen codiert wird (Zellextrakt; Gesamtprotein-Konzentration 2500 μg/ml), und festes Tryptophan zum Ergeben einer Konzentration von > 60 mM (gesättigt; ein gewisser Teil während der gesamten Reaktion nicht gelöst). Die Mischung wurde bei 30°C 4 Stunden lang unter vorsichtigem Rühren oder Mischen inkubiert.
Substitutionen
Die Konzentration von alpha-Ketoglutarat kann auf 1 mM reduziert und mit 9 mM Aspartat bei einer äquivalenten Ausbeute an Monatin ergänzt werden. Alternative Aminosäure-Akzeptoren können im ersten Schritt verwendet werden, wie Oxalacetat.
Als rekombinante L.major-Breitsubstrat-Aminotransferase anstelle der E. coli-L-Aspartat-Aminotransferase verwendet wurde, wurden ähnliche Ausbeuten an Monatin erzielt. Allerdings wurde auch ein zweites nicht-identifiziertes Produkt (3-10% des Hauptprodukts) mit einer Molekülmasse von 292 durch LC-MS-Analyse nachgewiesen. Monatin-Konzentrationen von 0,1-0,5 mg/ml wurden hergestellt, wenn das E. coli tyrB-codierte Enzym, das von S. meliloti tat A codierte Enzym oder die Glutamin-Oxalessigsäure-Transaminase aus Schweineherz (Typ IIa) als die Aminotransferase zugesetzt wurde. Beim Starten der Reaktion von Indol-3-pyruvat aus, kann eine reduktive Aminierung für den letzten Schritt mit Glutamatdehydrogenase und NADH durchgeführt werden (wie in Beispiel 7).
Die KHG-Aldolasen von B. subtilis, E. coli und S. meliloti wurden auch mit der E. coli-L-Aspartat-Aminotransferase verwendet, um Monatin enzymatisch herzustellen. Die folgenden Reaktionsbedingungen wurden angewandt: 50 mM NH₄-OAc, pH 8,3, 2mM MgCl₂, 200 mM Pyruvat, 5 mM Glutamat, 0,05 mM Pyridoxalphosphat, entlüftetes Wasser, zum Erzielen eines Endvolumens von 0,5 ml nach der Zugabe der Enzyme, 3 mM Kaliumphosphat, 20 μg/ml rekombinante B. subtilis-KHG-Aldolase (gereinigt), ca. 400 μg/ml E. coli-L-Aspartat-Aminotransferase (AspC), ungereinigt aus Zellextrakt, und 12 mM Indol-3-pyruvat. Die Reaktionen wurden bei 30°C während 30 Minuten mit Schütteln inkubiert. Die unter Verwendung des B. subtilis-Enzyms hergestellte Menge an Monatin belief sich auf 80 ng/ml und stieg mit steigenden Mengen an Aldolase. Wenn Indol-3-pyruvat und Glutamat durch sättigende Mengen an Tryptophan und 5 mM alpha-Ketoglutarat ersetzt wurden, wurde die Herstellung von Monatin auf 360 ng/ml erhöht. Die Reaktionen wurden mit 30 μg/ml von jedem der drei KHG-Enzyme in 50 mM Tris pH 8,3, mit sättigenden Mengen an Tryptophan wiederholt und wurden eine Stunde lang fortschreiten gelassen, um den Nachweis zu erhöhen. Das Bacillus-Enzym wies die höchste Aktivität auf, wie in Beispiel 4, wobei es ungefähr 4000 ng/ml Monatin herstellte. Die E. coli-KHG erzeugte 3000 ng/ml Monatin, und das S. meliloti-Enzym stellte 2300 ng/ml her.
BEISPIEL 7
Wechselseitige Umwandlung zwischen MP und Monatin
Die Aminierung von MP zur Bildung von Monatin kann katalysiert werden durch Aminotransferasen, wie denjenigen, die in den Beispielen 1 und 6 identifiziert werden, oder durch Dehydrogenasen, welche einen reduzierenden Cofaktor wie NADH oder NADPH erfordern. Diese Reaktionen sind reversibel und können in jeder Richtung gemessen werden. Die Direktionalität bei der Verwendung eines Dehydrogenase-Enzyms kann in großem Maße durch die Konzentration an Ammoniumsalzen gesteuert werden.
Dehydrogenase-Aktivität. Die oxidative Desaminierung von Monatin wurde überwacht durch Verfolgen der Erhöhung der Absorption bei 340 nm, als NAD(P)⁺ umgewandelt wurde in das stärker chromophore NAD(P)H. Monatin wurde enzymatisch hergestellt und gereinigt, wie beschrieben in Beispiel 6.
Eine typische Assay-Mischung enthielt 50 mM Tris-HCl, pH 8,0 bis 8,9, 0,33 mM NAD⁺ oder NADP⁺, 2 bis 22 Units Glutamatdehydrogenase (Sigma) und 10-15 mM Substrat in 0,2 ml. Der Assay wurde in zweifacher Ausfertigung in einer UV-transparenten Mikroti terplatte auf einem Plattenlesegerät "Molecular Devices SpectraMax Plus" durchgeführt. Eine Mischung des Enzyms, von Puffer und NAD(P)⁺ wurde in die Vertiefungen, welche das Substrat enthielten, pipettiert, und die Erhöhung der Absorption bei 340 nm wurde bei 10-Sekunden-Intervallen nach kurzem Mischen überwacht. Die Reaktion wurde bei 25°C während 10 Minuten inkubiert. Negativ-Kontrollen wurden durchgeführt ohne die Zugabe von Substrat, und Glutamat wurde als eine Positiv-Kontrolle verwendet. Die Typ-III-Glutamatdehydrogenase aus Rinderleber (Sigmar # G-7882) katalysierte die Umwandlung des Monatins in den Monatin-Vorläufer bei einer Umwandlungsrate, welche ungefähr ein Hundertstel der Umwandlungsrate von Glutamat zu alpha-Ketoglutarat war.
Transaminierungs-Aktivität. Monatin-Aminotransferase-Assays wurden durchgeführt mit der Aspartat-Aminotransferase (AspC) von E. coli, der Tyrosin-Aminotransferase (TyrB) von E. coli, der Breitsubstrat-Aminotransferase (BSAT) von L. major, und den zwei kommerziell verfügbaren Schweine-Glutamat-Oxalacetat-Aminotransferasen, welche in Beispiel 1 beschrieben wurden. Sowohl Oxalacetat als auch alpha-Ketoglutarat wurden als der Amino-Akzeptor getestet. Die Assay-Mischung enthielt (in 0,5 ml) 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,05 mM PLP, 5 mM Amino-Akzeptor, 5 mM Monatin und 25 μg Aminotransferase. Die Assays wurden bei 30°C während 30 Minuten inkubiert, und die Reaktionen wurden durch Zugeben von 0,5 ml Isopropylalkohol gestoppt. Der Verlust an Monatin wurde durch LC/MS überwacht (Beispiel 10). Das höchste Ausmaß an Aktivität wurde mit L. major-BSAT mit Oxalacetat als dem Amino-Akzeptor bemerkt, gefolgt von dem gleichen Enzym mit alpha-Ketoglutarat als dem Amino-Akzeptor. Die relative Aktivität mit Oxalacetat war: BSAT > AspC > Schweine-Typ IIa > Schweine-Typ I = TyrB. Die relative Aktivität mit alpha-Ketoglutarat war: BSAT > AspC > Schweine-Typ I > Schweine-Typ IIa > TyrB.
BEISPIEL 8
Herstellung von Monatin aus Tryptophan und anderen C3-Quellen als Pyruvat
Wie oben in Beispiel 6 beschrieben wurde, kann Indol-3-pyruvat oder Tryptophan umgewandelt werden zu Monatin, unter Verwendung von Pyruvat als dem C3-Molekül. Allerdings kann in manchen Fällen Pyruvat nicht ein erwünschtes Rohmaterial sein. Zum Beispiel kann Pyruvat kostspieliger als andere C3-Kohlenstoff-Quellen sein, oder kann nachteilige Auswirkungen auf Fermentationen besitzen, wenn es dem Medium zugegeben wird. Alanin kann durch viele PLP-Enzyme unter Erzeugung von Pyruvat transaminiert werden.
Tryptophanase-ähnliche Enzyme vollführen beta-Eliminierungs-Reaktionen bei schnelleren Geschwindigkeiten als andere PLP-Enzyme, wie Aminotransferasen. Enzyme aus dieser Klasse (4.1.99.-) können Ammoniak und Pyruvat aus Aminosäuren, wie L-Serin, L-Cystein und Derivaten von Serin und Cystein mit guten Austrittsgruppen, wie O-Methyl-L-serin, O-Benzyl-L-serin, S-Methylcystein, S-Benzylcystein, S-Alkyl-L-cystein, O-Acyl-L-serin, 3-Chlor-L-alanin, herstellen.
Verfahren zur Herstellung von Monatin unter Verwendung von "EC 4.1.99.-"-Polypeptiden können durch Mutieren der β-Tyrosinase (TPL) oder Tryptophanase gemäß des Verfahrens von Mouratou et al. (J. Biol. Chem 274:1320-5, 1999) verbessert werden. Mouratou et al. beschreiben die Fähigkeit, die β-Tyrosinase in eine Dicarboxylaminosäure-β-Lyase umzuwandeln, welche berichtetermaßen in der Natur nicht vorkommt. Die Änderung der Spezifität wurde bewirkt durch Konvertieren von Valin (V) 283 zu Arginin (R) und Arginin (R) 100 zu Threonin (T). Diese Aminosäure-Austausche gestatten, dass die Lyase eine Dicarboxylaminosäure für die hydrolytische Desaminierungsreaktion akzeptiert (wie Aspartat). Aspartat kann deshalb auch als eine Quelle für Pyruvat für nachfolgende Aldolkondensationsreaktionen verwendet werden.
Darüber hinaus können Zellen oder enzymatische Reaktoren mit Lactat und einem Enzym, welches Lactat zu Pyruvat umwandelt, versorgt werden. Beispiele für Enzyme, die zum Katalysieren dieser Reaktion fähig sind, schließen Lactat-Dehydrogenase und Lactat-Oxidase ein.
Die Reaktionsmischung bestand aus 50 mM Tris-Cl, pH 8,3, 2 mM MgCl₂, 200 mM C3-Kohlenstoff-Quelle, 5 mM alpha-Ketoglutarat, Natriumsalz, 0,05 mM Pyridoxalphosphat, entlüftetem Wasser, zum Erzielen eines Endvolumens von 0,5 ml nach der Zugabe der Enzyme, 3 mM Kaliumphosphat, pH 7,5, 25 μg unreiner rekombinanter C. testosteroni-ProA-Aldolase, wie hergestellt wie in Beispiel 4, 500 μg unreiner L-Aspartat-Aminotransferase (AspC), wie hergestellt in Beispiel 1, und festem Tryptophan, zum Erzielen einer Konzentration von > 60 mM (gesättigt; ein gewisser Teil während der gesamten Reaktion nicht aufgelöst). Die Reaktionsmischung wurde bei 30°C während 30 Minuten unter Mischen inkubiert. Serin, Alanin und Aspartat wurden als 3-Kohlenstoff-Quellen zugeführt. Assays wurden durchgeführt mit und ohne sekundäre PLP-Enzyme (gereinigt), welche zur Durchführung von beta-Eliminierungs- und beta-Lyase-Reaktionen fähig sind (Tryptophanase (TNA), doppelmutante Tryptophanase, β-Tyrosinase (TPL)). Die Ergebnisse sind in der Tabelle 3 gezeigt:
Tabelle 3 Herstellung von Monatin unter Verwendung von alternativen C3-Kohlenstoff-Quellen
Das aus Alanin und Serin als 3-Kohlenstoff-Quellen hergestellte Monatin wurde bestätigt durch LC/MS/MS-Tochter-Abtast-Analyse, und war identisch zu dem in Beispiel 6 hergestellten, charakterisierten Monatin. Alanin war die beste getestete Alternative und wurde durch das AspC-Enzym transaminiert. Die Menge an hergestelltem Monatin wurde gesteigert durch Zugeben der Tryptophanase, welche fähig zur Transaminierung als einer Sekundäraktivität ist. Die Menge an mit Serin als einer Kohlenstoffquelle produzierte Monatin verdoppelte sich nahezu bei Zugabe der Tryptophanase-Enzyme, selbst obwohl nur ein Fünftel der Menge an Tryptophanase im Vergleich zur Aminotransferase zugesetzt worden war. AspC allein ist fähig zu einem gewissen Maß an beta-Eliminierungs-Aktivität. Die Ergebnisse mit Aspartat weisen darauf hin, dass die Tryptophanase-Aktivität auf Aspartat nicht mit denselben ortsgerichteten Mutationen, wie zuvor für β-Tyrosinase vorgeschlagen, ansteigt. Es wird erwartet, dass die Mutanten-β-Tyrosinase eine höhere Aktivität für die Herstellung von Monatin aufweisen wird.
BEISPIEL 9
Chemische Synthese von Monatin
Die Zugabe von Alanin zu Indol-3-pyruvinsäure erzeugt Monatin, und diese Reaktion kann synthetisch mit einem Grignard- oder Organolithium-Reagenz durchgeführt werden.
Zum Beispiel wird zu 3-Chlor- oder 3-Bromalanin, welches in geeigneter Weise an den Carboxyl- und Aminogruppen blockiert worden ist, Magnesium unter wasserfreien Bedingungen zugegeben. Indol-3-pyruvat (geeignet blockiert) wird dann zugegeben, um das gekoppelte Produkt zu bilden, gefolgt von Entfernen der Schutzgruppen unter Bildung von Monatin. Schutzgruppen, welche besonders nützlich sind, schließen THP (Tetrahydropyranylether) ein, welcher leicht angeheftet und entfernt wird.
BEISPIEL 10
Detektion von Tryptophan, Monatin und MP
Dieses Beispiel beschreibt Verfahren, angewandt zum Detektieren des Vorhandenseins von Monatin oder seines Vorläufers 2-Hydroxy-2-(indol-3-ylmethyl)-4-ketoglutarsäure.
LC/MS-Analyse
Analysen von Mischungen hinsichtlich Monatin, MP und/oder Tryptophan, welche aus biochemischen Reaktionen in vitro oder in vivo abgeleitet werden, wurden durchgeführt unter Verwendung eines Waters/Micromass-Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektometrie(LC/MS/MS)-Instruments, einschließlich eines Waters 2690-Flüssigkeitschromatographen mit einem Waters 996 Photo-Dioden-Array(PDA)-Absorptionsmonitor, welcher in Reihe eingebracht war zwischen dem Chromatograph und einem Micromass-Quattro Ultima-Triple-Quadrupol-Massenspektrometer. LC-Trennungen wurden unter Verwendung einer Supelco Discovery C₁₈-Umkehrphasen-Chromatographie-Säule, 2,1 mm × 150 mm, oder einer Xterra MS C₈-Umkehrphasen-Chromatographie-Säule, 2,1 mm × 250 mm, bei Raumtemperatur vorgenommen. Die mobile Phase in der LC bestand aus A) Wasser, welches 0,05% (v/v) Trifluoressigsäure enthielt, und B) Methanol, der 0,05% (v/v) Trifluoressigsäure enthielt.
Die Gradienten-Elution war linear von 5% B bis 35% B, 0-9 Minuten, linear von 35% B zu 90% B, 9-16 Minuten, isokratisch bei 90% B, 16-20 Minuten, linear von 90% B zu 5% B, 20-22 Minuten, mit einer 10-minütigen Reäquilibrierungsperiode zwischen den Durchlaufen. Die Fließgeschwindigkeit betrug 0,25 ml/min, und die PDA-Absorption wurde von 200 nm bis 400 nm verfolgt. Alle Parameter des ESI-MS wurden auf Basis der Erzeugung der protonierten Molekülionen ([M + H]⁺) der Analyten von Interesse und der Herstellung von charakteristischen Fragmentionen optimiert und ausgewählt.
Die folgenden Instrumentenparameter wurden für LC/MS-Analyse von Monatin verwendet:
Kapillare: 3,5 kV; Konus: 40 V; Hex 1: 20 V; Apertur: 0 V; Hex 2: 0 V; Quellen-Temperatur: 100°C; Desolvationstemperatur: 350°C; Desolvationsgas: 500 l/h; Konus-Gas: 50 l/h; Nieder-Massenauflösung (Q1): 15,0; Hoch-Massenauflösung (Q1): 15,0; Ionenenergie: 0,2; Eingang: 50V; Kollisionsenergie: 2; Ausgang: 50V; Nieder-Massenauflösung (Q2): 15; Hoch-Massenauflösung (Q2): 15; Ionenenergie (Q2): 3,5; Multiplikator: 650. Unsicherheiten für berichtete Massen/Ladungs-Verhältnisse (m/z) und Molekül-Massen belaufen sich auf ± 0,01%. Die anfängliche Detektion der alpha-Ketosäureform von Monatin (MP) und Monatin in den Mischungen wurde bewerkstelligt durch LC/MS-Überwachung mit Erfassung von Massenspektren für die Region m/z 150-400. Ausgewählte Ionenchromatogramme für protonierte Molekülionen ([M + H]⁺ = 292 für MP [M + H]⁺ = 293 für Monatin) ermöglichten die direkte Identifizierung dieser Analyten in den Mischungen.
MS/MS-Analyse
LC/MS/MS-Tochterionen-Experimente wurden an Monatin wie folgend durchgeführt. Eine Tochterionen-Analyse beinhaltet die Transmission des Elternions (z. B. m/z = 293 für Monatin) von Interesse aus dem ersten Massen-Analysator (Q1) in die Kollisionszelle des Massenspektrometers, wo Argon eingeführt wird und die Elternform chemisch in Fragment(Tochter)-Ionen dissoziiert. Diese Fragmentionen werden dann mit dem zweiten Massenanalysator (Q2) detektiert und können verwendet werden, um die Strukturzuweisung der Elternform zu bestätigen. Tryptophan wurde auf die gleiche Weise durch Transmission und Fragmentation von m/z = 205 charakterisiert und quantifiziert.
Die folgenden instrumentellen Parameter wurden für die LC/MS/MS-Analyse von Monatin verwendet:
Kapillare: 3,5 kV; Konus: 40 V; Hex 1: 20 V; Apertur: 0 V; Hex 2: 0 V; Quellen-Temperatur: 100°C; Desolvationstemperatur: 350°C; Desolvationsgas: 500 l/h; Konus-Gas: 50 l/h; Nieder-Massenauflösung (Q1): 13,0; Hoch-Massenauflösung (Q1): 13,0; Ionenenergie: 0,2; Eingang: –5 V; Kollisionsenergie: 14; Ausgang: 1 V; Nieder-Massenauflösung (Q2): 15; Hoch-Massenauflösung (Q2): 15; Ionenenergie (Q2): 3,5; Multiplikator: 650.
Hochdurchsatz-Bestimmung von Monatin und Tryptophan
Hochdurchsatz-Analysen (< 5 min/Probe) von aus In-vitro- oder In-vivo-Reaktionen abgeleiteten Mischungen für Monatin und Tryptophan wurden durchgeführt unter Anwendung der oben beschriebenen Instrumentierung und der gleichen Parameter, wie beschrieben für LC/MS/MS. LC-Trennungen wurden vorgenommen unter Verwendung einer 4,6 mm × 50 mm Advanced Separation Technologies Chirobiotic T-Säule bei Raumtemperatur. Die mobile Phase bei LC bestand aus A) Wasser, welches 0,25% Essigsäure enthielt; B) Methanol, welcher 0,25% Essigsäure enthielt. Die isokratische Flution erfolgte bei 50% B, 0-5 Minuten. Die Fließgeschwindigkeit belief sich auf 0,6 ml/min. Alle Parameter des ESI-MS/MS-Systems wurden basierend auf einer optimalen In-Quellen-Erzeugung des protonierten Molekülions von Tryptophan und dem internen Standard ²H₅-Tryptophan, sowie der Kollisionsinduzierten Produktion von Aminosäurespezifischen Fragmentionen für Mehrfach-Reaktionsüberwachungs(Multipie Reaction Monitoring, MRM)-Experimente optimiert und ausgewählt. Die folgenden instrumentellen Parameter wurden für die LC/MS/MS-Analyse von Monatin und Tryptophan im positiven Ionen-Mehrfach-Reaktionsüberwachungs(MRM)-Modus verwendet:
Kapillare: 3,5 kV; Konus: 20 V; Hex 1: 15 V; Apertur: 1 V; Hex 2: 0 V; Quellen-Temperatur: 100°C; Desolvationstemperatur: 350°C; Desolvationsgas: 500 l/h; Konus-Gas: 40 l/h; Nieder-Massenauflösung (Q1): 12,0; Hoch-Massenauflösung (Q1): 12,0; Ionenenergie: 0,2; Eingang: –5 V; Kollisionsenergie: 14; Ausgang: 1 V; Nieder-Massenauflösung (Q2): 15; Hoch-Massenauflösung (Q2): 15; Ionenenergie (Q2): 0,5; Multiplikator: 650. MRM-Parameter: Kanallücken-Verzögerung: 0,03 s; Interscan-Verzögerung: 0,03 s; Verweilzeit: 0,05 s.
Exakte Massenmessung von Monatin.
Hochauflösungs-MS-Analyse wurde unter Verwendung eines Applied Biosystems-Perkin Elmer Q-Star-Hybrid-Quadrupol/Flugzeit-Massenspektrometers durchgeführt. Die gemessene Masse für protoniertes Monatin verwendete Tryptophan als einen internen Massen-Kalibrierungsstandard. Die berechnete Masse von protoniertem Monatin, basierend auf der Elementzusammensetzung C₁₄H₁₇N₂O₅ beträgt 293,1137. Unter Anwendung des in Beispiel A beschriebenen biokatalytischen Verfahrens hergestelltes Monatin zeigte eine gemessene Masse von 293,1144. Dies ist ein Massenmessfehler von weniger als 2 Teilen pro Million (ppm), was einen schlüssigen Beweis für die Elementzusammensetzung von enzymatisch hergestelltem Monatin erbringt.
BEISPIEL 11
Herstellung von Monatin in Bakterien
Dieses Beispiel beschreibt Verfahren, die verwendet wurden, um Monatin in E. coli-Zellen herzustellen. Der Fachmann auf dem Gebiet wird verstehen, dass ähnliche Verfahren angewandt werden können, um Monatin in anderen Bakterienzellen herzustellen. Darüber hinaus können Vektoren, welche andere Gene im Monatin-Synthese-Weg (2) enthalten, verwendet werden.
Trp-1 + Glucose-Medium, ein Minimalmedium, welches für die erhöhte Produktion von Tryptophan in E. coli-Zellen verwendet worden ist (Zeman et al. Folia Microbiol. 35:200-4, 1990) wurde wie folgend hergestellt. Zu 700 ml nanoreinem Wasser wurden die folgenden Reagenzien zugegeben: 2 g (NH₄)₂SO₄, 13,6 g KH₂PO₄, 0,2 g MgSO₄·7H₂O, 0,01 g CaCl₂·2H₂O und 0,5 mg FeSO₄·7H₂O. Der pH-Wert wurde auf 7,0 eingestellt, das Volumen wurde auf 850 ml erhöht, und das Medium wurde autoklaviert. Eine 50%ige Glucoselösung wurde separat hergestellt und sterilfiltriert. Vierzig ml wurden zu dem Basismedium (850 ml) für ein Endvolumen von 1 Liter zugegeben.
Eine 10 g/l L-Tryptophan-Lösung wurde hergestellt in 0,1 M Natriumphosphat, pH 7, und steril-filtriert. Ein zehntel Volumen wurde typischerweise zu Kulturen zugegeben, wie nachstehend angegeben. Eine 10%ige Natriumpyruvat-Lösung wurde ebenfalls hergestellt und sterilfiltriert. Ein 10-ml-Aliquot wurde typischerweise je Liter Kultur verwendet. Stammlösungen von Ampicillin (100 mg/ml), Kanamycin (25 mg/ml) und IPTG (840 mM) wurden hergestellt, sterilfiltriert und bei –20°C vor der Verwendung aufbewahrt. Tween 20 (Polyoxyethylen 20-Sorbitan-Monolaurat) wurde bei einer Endkonzentration von 0,2% (vol/vol) verwendet. Ampicillin wurde bei nicht-letalen Konzentrationen, typischerweise 1-10 μg/ml Endkonzentration, verwendet.
Frische Platten von E. coli BL21(DE3)::C.testosteroni proA/pET 30 Xa/LIC (beschrieben in Beispiel 4) wurden hergestellt auf LB-Medium, enthaltend 50 μg/ml Kanamycin. Übernacht-Kulturen (5 ml) wurden aus einer Einzelkolonie inokuliert und bei 30°C in LB-Medium mit Kanamycin wachsen gelassen. Typischerweise wurde ein 1-zu-50-Inokulum zur Induktion in trp-1 + Glucose-Medium verwendet. Frisches Antibiotikum wurde zu einer Endkonzentration von 50 mg/l zugegeben. Schüttelflaschen wurden bei 37°C kultiviert, vor der Induktion.
Von den Zellen wurde jede Stunde eine Probe entnommen, bis eine OD₆₀₀ von 0,35-0,8 erhalten wurde. Die Zellen wurden dann mit 0,1 mM IPTG induziert, und die Temperatur auf 34°C reduziert. Proben (1 ml) wurden aufgefangen, vor der Induktion (Null-Zeitpunkt) und bei 5000 × g zentrifugiert. Der Überstand wurde bei –20°C für eine LC/MS-Analyse eingefroren. Vier Stunden nach der Induktion wurde eine andere 1-ml-Probe aufgefangen und zentrifugiert, um das Nährmedium von dem Zellpellet zu trennen. Tryptophan, Natriumpyruvat, Ampicillin und Tween wurden zugesetzt, wie oben beschrieben.
Die Zellen wurden 48 Stunden lang nach der Induktion wachsen gelassen, und eine weitere 1-ml-Probe wurde entnommen und präpariert, wie oben. Nach 48 Stunden wurden ein weiteres Aliquot von Tryptophan und Pyruvat zugegeben. Das gesamte Kultur-Volumen wurde zentrifugiert nach ungefähr 70 Stunden Wachstum (Nach-Induktion), während 20 Minuten bei 4°C und 3500 U/min. Der Überstand wurde dekantiert und sowohl das Nährmedium als auch die Zellen wurden bei –80°C eingefroren. Die Nährmedium-Fraktionen wurden filtriert und mittels LC/MS analysiert. Die Höhen und Flächen der Peaks von [M + H]⁺ = 293 wurden verfolgt, wie beschrieben in Beispiel 10. Der Hintergrundspiegel des Mediums wurde subtrahiert. Die Daten wurden des Weiteren hinsichtlich Zellwachstum durch Auftragen der Höhe des Peaks von [M + H]⁺ = 293, dividiert durch die optische Dichte der Kultur bei 600 nm, normiert.
Höhere Spiegel an Monatin wurden hergestellt, als Pyruvat, Ampicillin und Tween 4 Stunden nach der Induktion anstatt bei der Induktion zugegeben wurden. Andere Zusatzstoffe, wie PLP, zusätzliches Phosphat oder zusätzliches MgCl₂ erhöhten die Produktion von Monatin nicht. Höhere Titer an Monatin wurden erhalten, als Tryptophan anstelle von Indol-3-pyruvat verwendet wurde, und als das Tryptophan nach der Induktion anstatt bei der Inokulierung, oder bei Induktion, zugegeben wurde. Vor der Induktion und 4 Stunden nach Induktion (zur Zeit der Substratzugabe) gab es typischerweise keinen detektierbaren Spiegel an Monatin in der Fermentations-Nährlösung oder zellulären Extrakten. Negativ-Kontrollen wurden vorgenommen unter Verwendung von Zellen mit lediglich pET30a-Vektor, sowie Kulturen, worin Tryptophan und Pyruvat nicht zugegeben wurden. Ein Eltern-MS-Scan demonstrierte, dass die Verbindung mit (m+1)/z = 293 nicht von größeren Molekülen abgeleitet wurde, und Tochter-Scans (durchgeführt wie in Beispiel 10) waren ähnlich zu in vitro hergestelltem Monatin.
Der Effekt von Tween wurde durch Verwenden von 0, 0,2% (vol/vol) und 0,6% Endkonzentrationen von Tween-20 untersucht. Die höchste Menge an Monatin, welche durch Schüttelkolben hergestellt wurde, war bei 0,2% Tween. Die Ampicillinkonzentration wurde zwischen 0 und 10 μg/ml variiert. Die Menge an Monatin im Zell-Nährmedium erhöhte sich rasch (2,5 X) zwischen 0 und 1 μg/ml, und erhöhte sich 1,3 X, als die Ampicillinkonzentration von 1 auf 10 μg/ml erhöht wurde.
Ein Zeitverlauf-Experiment, welches typische Ergebnisse zeigt, wird in 10 gezeigt. Die Menge von Monatin, welches in das Zell-Nährmedium sezerniert wurde, stieg, sogar wenn die Werte hinsichtlich des Zellwachstums normiert werden. Durch Verwenden des molaren Extinktionskoeffizienten von Tryptophan wurde die Menge an Monatin im Nährmedium auf weniger als 10 μg/ml geschätzt. Das gleiche Experiment wurde mit den Zellen, welche Vektor ohne proA-Insert enthalten, wiederholt. Viele der Zahlen waren negativ, was darauf hinweist, dass die Peak-Höhe bei m/z=293 in diesen Kulturen geringer war als in dem Medium allein (10). Die Zahlen waren konsistent niedriger, wenn Tryptophan und Pyruvat abwesend waren, was anzeigt, dass die Monatin-Produktion ein Ergebnis einer enzymatischen Reaktion ist, welche durch das Aldolase-Enzym katalysiert wird.
Die In-vivo-Produktion von Monatin in Bakterienzellen wurde in 800-ml-Schüttelkolben-Experimenten und in Fermentern wiederholt. Eine 250-ml-Probe von Monatin (in zellfreiem Nährmedium) wurde gereinigt durch Anionenaustausch-Chromatographie und präparative Umkehrphasen-Flüssigkeitschromatographie. Diese Probe wurde eingedampft und der Hochauflösungs-Massenanalyse zugeführt (beschrieben in Beispiel 6). Das Hochauflösungs-MS zeigte an, dass der Metabolit, der hergestellt wird, Monatin ist.
In-vitro-Assays weisen darauf hin, dass Aminotransferase bei höheren Spiegeln als Aldolase vorhanden sein muss (siehe Beispiel 6), weshalb die Aspartat-Aminotransferase aus E. coli in Kombination mit dem Aldolase-Gen überexprimiert wurde, um die Menge an erzeugtem Monatin zu erhöhen. Primer wurden entworfen, um C. testosteroni-proA in ein Operon mit aspC/pET30 Xa/LIC einzuführen, wie folgend: 5'-Primer:
ACTCGGATCCGAAGGAGATATACATATGTACGAACTGGGACT (SEQ ID Nr.: 67) und 3'-Primer: CGGCTGTCGACCGTTAGTCAATATATTTCAGGC (SEQ ID Nr.: 68). Der 5'-Primer enthält eine BamHI-Stelle, der 3'-Primer enthält eine SalI-Stelle zur Klonierung. PCR wurde durchgeführt, wie beschrieben in Beispiel 4, und über ein Gel gereinigt. Das aspC/pET30 Xa/LIC-Konstrukt wurde verdaut mit BamHI und SalI, ebenso wie das PCR-Produkt. Die Verdaus wurden unter Anwendung einer Qiagen-Zentrifugations-Säule gereinigt. Das proA-PCR-Produkt wurde an den Vektor ligiert unter Verwendung des Roche "Rapid DNA Ligation"-Kits (Indianapolis, IN) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Chemische Transformationen wurden durchgeführt unter Verwendung von Novablues Singles (Novagen), wie beschrieben in Beispiel 1. Kolonien wurden in LB-Medium, welches 50 mg/l Kanamycin enthielt, herangezogen, und Plasmid-DNA wurde gereinigt unter Verwendung des Qiagen-Zentrifugations-Minipräp-Kits. Klone wurden gescreent durch Restriktionsverdau-Analyse und die Sequenz wurde durch Seqwright (Houston, TX) bestätigt. Konstrukte wurden in BLR(DE3), BLR(DE3)pLysS, BL21(DE3) und BL21(DE3)pLysS (Novagen) subkloniert. Das proA/pET30 Xa/LIC-Konstrukt wurde auch in BL21(DE3)pLysS transformiert.
Anfängliche Vergleiche von BLR(DE3)-Schüttelkolben-Proben unter den oben beschriebenen Standardbedingungen zeigten, dass die Hinzufügung des zweiten Gens (aspC) die Menge an produziertem Monatin um das Siebenfache verbesserte. Um das Wachstum zu beschleunigen, wurden BL21(DE3)-abgeleitete Wirtsstämme verwendet. Die proA-Klone und die Zwei-Gen-Operon-Klone wurden in Trp-1-Medium wie oben induziert, wobei bei den pLysS-Wirten ebenfalls Chloramphenicol (34 mg/l) dem Medium zugesetzt worden war. Schüttelkolben-Experimente wurden durchgeführt mit und ohne Zugabe von 0,2% Tween-20 und 1 mg/l Ampicillin. Die Menge an Monatin im Nährmedium wurde berechnet unter Verwendung von in vitro hergestelltem gereinigtem Monatin als einem Standard. SRM-Analysen wurden durchgeführt, wie beschrieben in Beispiel 10. Proben der Zellen wurden bei null, 4 Stunden, 24 Stunden, 48 Stunden, 72 Stunden und 96 Stunden Wachstum entnommen.
Die Ergebnisse sind in der Tabelle 4 für die Maximum-Mengen, welche in den Kultur-Nährmedien produziert wurden, gezeigt. In den meisten Fällen ergab das Zwei-Gen-Konstrukt höhere Werte als das proA-Konstrukt allein. Die pLysS-Stämme, welche löchrigere Zellhüllen aufweisen sollten, wiesen höhere Spiegel an sezerniertem Monatin auf, selbst obwohl diese Stämme typischerweise bei einer langsameren Geschwindigkeit wachsen. Die Zugaben von Tween und Ampicillin waren nutzbringend.
Tabelle 4 Menge an von E. coli-Bakterien produziertem Monatin
BEISPIEL 12
Herstellung von Monatin in Hefe
Dieses Beispiel beschreibt Verfahren, welche verwendet werden, um Monatin in eukaryotischen Zellen zu produzieren. Der Fachmann auf dem Gebiet wird verstehen, dass ähnliche Verfahren angewandt werden können, um Monatin in jedweder Zelle von Interesse zu produzieren. Darüber hinaus können andere Gene verwendet werden (z. B. diejenigen, welche in 2 aufgelistet wurden), zusätzlich zu oder alternativ zu denjenigen, welche in diesem Beispiel beschrieben sind.
Das pESC-"Hefe-Epitop-Tagging-Vektor-System" (Stratagene, La Jolla, CA) wurde eingesetzt, um die E. coli-aspC- und C. testosteroni-proA-Gene in Saccharomyces cerevisiae zu klonieren und zu exprimieren. Die pESC-Vektoren enthalten sowohl den GAL1- als auch den GAL10-Promotor auf gegenüberliegenden Strängen, mit zwei getrennten Mehrfach-Klonierungsstellen, was die Expression von zwei Genen zur gleichen Zeit gestattet. Der pESC-His-Vektor enthält des Weiteren das His3-Gen zur Komplementierung von Histidin-Auxotrophie im Wirt (YPH500). Die GAL1- und GAL10-Promotoren werden durch Glucose reprimiert und durch Galactose induziert; eine Kozak-Sequenz wird für eine optimale Expression in Hefe verwendet. Die pESC-Plasmide sind Shuttle-Vektoren, was zulässt, dass das anfängliche Konstrukt in E. coli hergestellt wird (mit dem bla-Gen zur Selektion); allerdings sind keine bakteriellen Ribosomenbindungsstellen in den Mehrfach-Klonierungsstellen vorhanden.
Die folgenden Primer wurden zur Klonierung in pESC-His entworfen (Restriktionsstellen sind unterstrichen, die Kozak-Sequenz ist in Fettdruck dargestellt): aspC (BamHI/SalI), GAL1: 5'-CGCGGATCCATAATGGTTGAGAACATTACCG-3' (SEQ ID Nr.: 69) und 5'-ACGCGTCGACTTACAGCACTGCCACAATCG-3' (SEQ ID Nr.: 70). proA (EcoRI/NotI), GAL10: 5'-CCGGAATTCATAATGGTCGAACTGGGAGTTGT-3' (SEQ ID Nr.: 71) und 5'-GAATGCGGCCGCTTAGTCAATATATTTCAGGCC-3' (SEQ ID Nr.: 72).
Das zweite Codon für beide reifen Proteine wurde von einer aromatischen Aminosäure zu Valin wegen der Einführung der Kozak-Sequenz geändert. Die Gene von Interesse wurden unter Verwendung von pET30 Xa/LIC-Minipräp-DNA von den Klonen, welche in Beispielen 1 und Beispiel 4 beschrieben wurden, als Matrize amplifiziert. PCR wurde unter Verwendung eines Eppendorf-"Master Cycler"-Gradienten-Thermozyklers und des folgenden Protokolls für eine 50-μl-Reaktion durchgeführt: 1,0 μl Matrize, 1,0 μM jedes Primers, 0,4 mM jedes dNTPs, 3,5 U "Expand High Fidelity"-Polymerase (Roche, Indianapolis, IN) und 1X Expand^TM Puffer mit Mg. Das verwendete Thermozykler-Programm bestand aus einem Warmstart bei 94°C während 5 Minuten, gefolgt von 29 Wiederholungen der folgenden Schritte: 94°C während 30 Sekunden, 50°C während 1 Minute 45 Sekunden, und 72°C während 2 Minuten 15 Sekunden. Nach den 29 Wiederholungen wurde die Probe 10 Minuten lang bei 72°C gehalten und dann bei 4°C aufbewahrt. Die PCR-Produkte wurden durch Trennung auf einem 1%igen TAE-Agarosegel gereinigt, gefolgt von Rückgewinnung unter Verwendung eines QIAquick-Gel-Extraktions-Kit (Qiagen, Valencia, CA).
Die pESC-His-Vektor-DNA (2,7 μg) wurde mit BamHI/SalI verdaut und über einem Gel gereinigt, wie oben erwähnt. Das aspC-PCR-Produkt wurde mit BamHI/SalI verdaut und mit einer QIAquick PCR-Reinigungs-Säule gereinigt. Ligationen wurden mit dem "Rapid DNA Ligation Kit" von Roche gemäß den Protokollen des Herstellers durchgeführt. Entsalzte Ligationen wurden in 40 μl kompetente Electromax DH10B-Zellen (Invitrogen) in einer 0,2 cm großen Einweg-Küvette von Biorad unter Verwendung eines Biorad "Gene Pulser II" mit "Puls-Controller plus" gemäß den Anweisungen des Herstellers elektroporiert. Nach einer Stunde Erholung in 1 ml SOC-Medium wurden die Transformanten auf LG-Medium ausplattiert, welches 100 μg/ml Ampicillin enthielt. Plasmid-DNA-Präparationen für Klone wurden unter Verwendung von QIAprep-Zentrifugen-Minipräp-Kits durchgeführt. Die Plasmid-DNA wurde durch Restriktionsverdau gescreent und zur Bestätigung unter Verwendung von für den Vektor entworfenen Primern sequenziert (Seqwright).
Der aspC/pESC-His-Klon wurde mit EcoRl und NotI verdaut, ebenso wie das proA-PCR-Produkt. DNA wurde wie oben gereinigt und wie oben ligiert. Das Zwei-Gen-Konstrukt wurde in DH10B-Zellen transformiert und durch Restriktionsverdau und DNA-Sequenzierung gescreent.
Das Konstrukt wurde in den S. cerevisiae-Stamm YPH500 unter Verwendung des S.c. EasyComp^TM Transformations-Kits (Invitrogen) transformiert. Transformationsreaktionen wurden auf SC-His-Minimalmedium (Invitrogen pYES2-Handbuch), welches 2% Glucose enthielt, ausplattiert. Individuelle Hefekulturen wurden hinsichtlich des Vorhandenseins der proA und aspC-Gene durch Kolonie-PCR unter Verwendung der oben genannten PCR-Primer gescreent. Pelletierte Zellen (2 μl) wurden in 20 μl Y-Lyse-Puffer (Zymo Research), welcher 1 μl Zymolase enthielt, suspendiert und 10 Minuten lang bei 37°C erwärmt. Vier μl dieser Suspension wurden dann in einer 50-μl-PCR- Reaktion unter Anwendung der PCR-Reaktionsmischung und des oben beschriebenen Programms verwendet.
Fünf-ml-Kulturen wurden über Nacht auf SC-His + Glucose bei 30°C und 225 U/min wachsen gelassen. Die Zellen wurden schrittweise an das Wachstum auf Raffinose angepasst, um die "Verzögerungs"-Periode vor Induktion mit Galactose zu minimieren. Nach ungefähr 12 Stunden Wachstum wurden Absorptionsmessungen bei 600 nm vorgenommen, und ein geeignetes Volumen an Zellen wurde abzentrifugiert und resuspendiert, um eine CD von 0,4 in dem frischen SC-His-Medium zu ergeben. Die folgenden Kohlenstoffquellen wurden aufeinander folgend verwendet: 1 % Raffinose + 1 % Glucose, 0,5% Glucose + 1,5% Raffinose, 2% Raffinose und schließlich 1% Raffinose + 2% Galactose zur Induktion.
Nach ungefähr 16 Stunden Wachstum im Induktionsmedium wurden die 50-ml-Kulturen zu zweifachen 25-ml-Kulturen aufgeteilt, und Folgendes wurde zu lediglich einem der Duplikat-Ansätze zugegeben (Endkonzentrationen): 1 g/l L-Tryptophan, 5 mM Natriumphosphat, pH 7,1, 1 g/l Natriumpyruvat, 1 mM MgCl₂. Proben von Nährlösungen und Zellpellets aus dem Nicht-Induktionsmedium, und aus den 16-Stunden-Kulturen vor der Zugabe von Substraten für den Monatin-Weg, wurden als Negativkontrollen aufbewahrt. Darüber hinaus wurden Konstrukte, enthaltend lediglich ein funktionelles aspC-Gen (und ein trunkiertes proA-Gen) als eine andere Negativkontrolle verwendet. Die Zellen wurden insgesamt 69 Stunden nach der Induktion wachsen gelassen. Gelegentlich wurden die Hefezellen bei einer niedrigeren CD induziert und lediglich 4 Stunden lang vor der Zugabe von Tryptophan und Pyruvat wachsen gelassen. Allerdings scheinen diese Monatin-Substrate das Wachstum zu inhibieren, und die Zugabe bei einer höheren CD war effektiver.
Die Zellpellets aus den Kulturen wurden mit 5 ml YeastBuster^TM + 50 μl THP (Novagen) pro Gramm (Nassgewicht) an Zellen unter Befolgung der Protokolle des Herstellers lysiert, mit Zugabe von Protease-Inhibitoren und Benzonase-Nuklease, wie beschrieben in früheren Beispielen. Die Kultur-Nährlösung und Zellextrakte wurden filtriert und durch SRM analysiert, wie beschrieben in Beispiel 10. Unter Verwendung dieses Verfahrens wurde kein Monatin in den Nährlösungs-Proben nachgewiesen, was darauf hinweist, dass die Zellen Monatin unter diesen Bedingungen nicht sezernieren konnten. Die Protonen-bewegende Kraft kann unter diesen Bedingungen ungenügend sein, oder die allgemeinen Aminosäure-Transporter können mit Tryptophan gesättigt sein. Die Protein-Expression war nicht auf einem Niveau, welches den Nachweis von Änderungen unter Verwendung von SDS-PAGE gestattete.
Monatin war vorübergehend nachweisbar (ungefähr 60 ng/ml) in Zellextrakten der Kultur mit zwei funktionellen Genen, wenn Tryptophan und Pyruvat zu dem Medium zugefügt wurden. Monatin wurde nicht in irgendeinem der Negativkontrollen-Zellextrakte nachgewiesen. In-vitro-Assays für Monatin wurden in zweifacher Ausfertigung mit 4,4 mg/ml Gesamtprotein (etwa das Doppelte, was typischerweise für E. coli- Zellextrakte verwendet wird) unter Verwendung des optimierten Assays, welcher in Beispiel 6 beschrieben wird, durchgeführt. Andere Assays wurden mit der Zugabe von entweder 32 μg/ml C.testosteroni-ProA-Aldolase oder 400 μg/ml AspC-Aminotransferase durchgeführt, um zu ermitteln, welches Enzym im Zellextrakt limitierend war. Negativkontrollen wurden ohne Zugabe von Enzym durchgeführt, oder mit Zugabe von lediglich AspC-Aminotransferase (die Aldolkondensation kann zu einem gewissen Ausmaß ohne Enzym stattfinden). Positivkontrollen wurden mit teilweise reinen Enzymen (30-40 %) unter Verwendung von 16 μg/ml Aldolase und 400 μg/ml Aminotransferase durchgeführt.
In-vitro-Ergebnisse wurden mittels SRM analysiert. Die Analyse von Zellextrakten zeigte, dass Tryptophan effektiv in die Zellen transportiert wurde, wenn es dem Medium nach der Induktion zugesetzt wurde, was zu Tryptophan-Spiegeln von zwei Größenordnungen höher als denjenigen resultiert, bei welchen kein zusätzliches Tryptophan zugegeben wurde. Die Ergebnisse für die In-vitro-Monatin-Analyse sind in der Tabelle 5 gezeigt (die Zahlen geben ng/ml an).
Tabelle 5 Monatin-Produktion mit Hefe-Zellextrakten
Positive Ergebnisse wurden mit den vollständigen Zwei-Gen-Konstrukt-Zellextrakten mit und ohne dem Wachstumsmedium zugesetzten Substrat erhalten. Diese Ergebnisse, im Vergleich zu den Positiv-Kontrollen, weisen darauf hin, dass die Enzyme bei Spiegeln nahe 1% des Gesamtproteins in Hefe exprimiert wurden. Die Menge an Monatin, welche hergestellt wurde, wenn der Zellextrakt des aspC-Konstrukts (mit trunkiertem proA) mit Aldolase geassayt wurde, war signifikant größer, als wenn Zellextrakte allein geassayt wurden, und weist darauf hin, dass die rekombinante AspC-Aminotransferase ungefähr 1-2% des Hefe-Gesamtproteins ausmacht. Die Zellextrakte von nicht-induzierten Kulturen wiesen eine kleine Menge an Aktivität auf, wenn sie mit Aldolase geassayt wurden, auf Grund des Vorhandenseins von nativen Aminotransferasen in den Zellen. Wenn mit AspC-Aminotransferase geassayt wurde, stieg die Aktivität der Extrakte aus nicht-induzierten Zellen zu der Menge von Monatin, welche durch die Negativ-Kontrolle mit AspC hergestellt wurde (ca. 200 ng/ml). Im Gegensatz dazu steigt die Aktivität, welche beobachtet wird beim Assay des Zwei-Gen-Konstrukt-Zellextrakts, mehr, wenn Aminotransferase ergänzend hinzugefügt wird, als wenn Aldolase zugesetzt wird. Da beide Gene auf dem gleichen Niveau exprimiert werden sollten, weist dies darauf hin, dass die produzierte Menge an Monatin maximiert wird, wenn der Spiegel an Aminotransferase höher ist als derjenige von Aldolase, in Übereinstimmung mit Ergebnissen, die in Beispiel 6 gezeigt werden.
Die Zugabe von Pyruvat und Tryptophan inhibiert nicht nur das Zellwachstum, sondern inhibiert anscheinend auch die Proteinexpression. Die Zugabe des pESC-Trp-Plasmids kann verwendet werden, um eine Korrektur hinsichtlich Tryptophan-Auxotrophie der YPH500-Wirtszellen vorzunehmen, um ein Mittel zur Zuführung von Tryptophan mit weniger Auswirkungen auf Wachstum, Expression und Sekretion vorzusehen.
BEISPIEL 13
Verbesserung der enzymatischen Verfahren unter Verwendung gekoppelter Reaktionen
In der Theorie ist, wenn keine Seitenreaktionen oder kein Abbau von Substraten oder Intermediaten stattfindet, die Maximalmenge an Produkt, welche aus der in 1 veranschaulichten enzymatischen Reaktion gebildet wird, direkt proportional zu den Gleichgewichtskonstanten jeder Reaktion und den Konzentrationen von Tryptophan und Pyruvat. Tryptophan ist kein hochlösliches Substrat, und Konzentrationen von Pyruvat, welche größer als 200 mM sind, scheinen einen negativen Effekt auf die Ausbeute zu besitzen (siehe Beispiel 6).
Idealerweise wird die Konzentration an Monatin in Hinsicht auf Substrate maximiert, um die Kosten der Trennung zu verringern. Physikalische Trennungen können so durchgeführt werden, dass das Monatin aus der Reaktionsmischung entfernt wird, wodurch das Auftreten von Rückwärts-Reaktionen verhindert wird. Die Rohmaterialien und Katalysa toren können dann regeneriert werden. Auf Grund der Ähnlichkeit von Monatin hinsichtlich Größe, Ladung und Hydrophobizität zu mehreren Reagenzien und Intermediaten werden physikalische Abtrennungen schwierig sein, es sei denn es besteht ein hohes Maß an Affinität für Monatin (wie eine Affinitätschromatographie-Technik). Allerdings können die Monatin-Reaktionen an andere Reaktionen gekoppelt sein, sodass das Gleichgewicht des Systems in Richtung zur Monatin-Produktion verschoben wird. Die nachstehenden Beispiele sind Beispiele für Verfahren zur Verbesserung der Ausbeute von Monatin, welches aus Tryptophan oder Indol-3-pyruvat erhalten wird.
Gekoppelte Reaktionen unter Verwendung von Oxalacetat-Decarboxylase (EC 4.1.1.3)
11 ist eine Veranschaulichung der Reaktion. Tryptophanoxidase und Katalase werden verwendet, um die Reaktion in die Richtung von Indol-3-pyruvat-Produktion zu lenken. Katalase wird im Überschuss verwendet, sodass Wasserstoffperoxid nicht verfügbar ist, um in der Rückwärtsrichtung zu reagieren oder die Enzyme oder Intermediate zu beschädigen. Sauerstoff wird während der Katalase-Reaktion regeneriert. Alternativ dazu kann Indol-3-pyruvat als das Substrat verwendet werden.
Aspartat wird als der Aminodonor für die Aminierung von MP verwendet, und eine Aspartat-Aminotransferase wird eingesetzt. In idealer Weise wird eine Aminotransferase, welche eine niedrige Spezifität für die Tryptophan/Indol-3-pyruvat-Reaktion im Vergleich zu der MP-zu-Monatin-Reaktion aufweist, verwendet, sodass Aspartat nicht verwertet wird, um das Indol-3-pyruvat zu reaminieren. Oxalacetat-Decarboxylase (aus Pseudomonas sp.) kann zugegeben werden, um das Oxalacetat in Pyruvat und Kohlendioxid umzuwandeln. Da CO₂ flüchtig ist, ist es nicht für eine Reaktion mit den Enzymen verfügbar, was die Rückwärtsreaktionen vermindert oder sogar verhindert. Das in diesem Schritt hergestellte Pyruvat kann auch in der Aldolkondensations-Reaktion verwendet werden. Andere Decarboxylase-Enzyme können verwendet werden, und Homologe existieren bekanntermaßen in Actinobacillus actinomycetemcomitans, Aquifex aeolicus, Archaeoglobus fulgidus, Azotobacter vinelandii, Bacteroides fragilis, mehreren Bordetella-Spezies, Campylobacter jejuni, Chlorobium tepidum, Chloroflexus aurantiacus, Enterococcus faecalis, Fusobacterium nucleatum, Klebsiella pneumoniae, Legionella pneumophila, Magnetococcus MC-1, Mannheimia haemolytica, Methylobacillus flagellatus KT, Pasteurella multocida Pm70, Petrotoga miotherma, Porphyromonas gingivalis, mehreren Pseudomonas-Spezies, mehreren Pyrococcus-Spezies, Rhodococcus, mehreren Salmonella-Spezies, mehreren Streptococcus-Spezies, Thermochromatium tepidum, Thermotoga maritima, Treponema pallidum, und mehreren Vibrio-Spezies.
Tryptophan-Aminotransferase-Assays wurden durchgeführt mit der Aspartat-Aminotransferase (AspC) aus E. coli, der Tyrosin-Aminotransferase(TyrB) aus E. coli, der Breit-Substrat-Aminotransferase (BSAT) aus L. major und den zwei kommerziell verfügbaren Schweine-Glutamat-Oxalacetat-Aminotransferasen, wie beschrieben in Beispiel 1. Sowohl Oxalacetat als auch alpha-Ketoglutarat wurden als der Amino-Akzeptor getestet. Das Verhältnis der Aktivität unter Verwendung von Monatin (Beispiel 7) gegenüber der Aktivität unter Verwendung von Tryptophan wurde verglichen, um zu bestimmen, welches Enzym die höchste Spezifität für die Monatin-Aminotransferase-Reaktion aufwies. Diese Ergebnisse wiesen darauf hin, dass das Enzym mit der höchsten Spezifität für die Monatin-Reaktion gegenüber der Tryptophan-Reaktion die Typ II-A-Glutamat-Oxalacetat-Aminotransferase aus Schwein, GOAT (Sigma G7005) ist. Diese Spezifität war unabhängig davon, welcher Amino-Akzeptor verwendet wurde. Deshalb wurde dieses Enzym in den gekoppelten Reaktionen mit Oxalacetat-Decarboxylase verwendet.
Eine typische Reaktion, welche von Indol-3-pyruvat aus startet, beinhaltete (Endkonzentrationen) 50 mM Tris-Cl, pH 7,3, 6 mM Indol-3-pyruvat, 6 mM Natriumpyruvat, 6 mM Aspartat, 0,05 mM PLP, 3 mM Kaliumphosphat, 3 mM MgCl₂, 25 μg/ml Aminotransferase, 50 μg/ml C. testosteroni-ProA-Aldolase und 3 Units/ml Decarboxylase (Sigma 04878). Die Reaktionen wurden 1 Stunde lang bei 26°C fortschreiten gelassen. In manchen Fällen wurde die Decarboxylase weggelassen, oder das Aspartat wurde mit alpha-Ketoglutarat ersetzt (als Negativ-Kontrollen). Die oben beschriebenen Aminotransferase-Enzyme wurden auch anstatt der GOAT getestet, um frühere Spezifitätsexperimente zu bestätigen. Proben wurden filtriert und mittels LC/MS analysiert, wie beschrieben in Beispiel 10. Die Ergebnisse zeigen, dass das GOAT-Enzym die höchste Menge an Monatin pro mg Protein erzeugte, und zwar mit der geringsten Menge an Tryptophan, welches als ein Nebenprodukt erzeugt wurde. Darüber hinaus gab es einen 2-3-fachen Vorteil aus der Zugabe des Decarboxylase-Enzyms. Das E.coli-AspC-Enzym produzierte des Weiteren große Mengen an Monatin im Vergleich zu den anderen Aminotransferasen.
Die Monatin-Produktion wurde erhöht durch: 1) periodisches Zusetzen von 2 mM Zugaben von Indol-Pyruvat, Pyruvat und Aspartat (jede halbe Stunde bis Stunde), 2) Durchführen der Reaktionen in einer anaeroben Umgebung oder mit entgasten Puffern, 3) Zulassen des Fortschreitens der Reaktionen über Nacht, und 4) Verwenden von frisch hergestellter Decarboxylase, welche nicht mehrmals eingefroren/aufgetaut worden ist. Die Decarboxylase wurde durch größere Konzentrationen an Pyruvat als 12 mM inhi biert. Bei höheren Konzentrationen von Indol-3-pyruvat als 4 mM wurden Seitenreaktionen mit Indol-3-pyruvat beschleunigt. Die in der Reaktion verwendete Menge an Indol-3-pyruvat konnte erhöht werden, wenn die Menge an Aldolase ebenfalls erhöht wurde. Hohe Spiegel an Phosphat (50 mM) und Aspartat (50 mM) waren festgestelltermaßen für das Decarboxylase-Enzym inhibierend. Die Menge an zugesetztem Decarboxylase-Enzym konnte auf 0,5 U/ml verringert werden, ohne Verringerung der Monatin-Produktion in einer einstündigen Reaktion. Die erzeugte Menge an Monatin stieg, als die Temperatur von 26°C auf 30°C und von 30°C auf 37°C erhöht wurde; allerdings wurden bei 37°C die Seitenreaktionen von Indol-3-pyruvat ebenfalls beschleunigt. Die Menge an produziertem Monatin stieg mit steigendem pH von 7 bis 7,3 und war relativ stabil von pH 7,3-8,3.
Eine typische Reaktion, welche mit Tryptophan startet, beinhaltete (Endkonzentrationen) 50 mM Tris-Cl, pH 7,3, 20 mM Tryptophan, 6 mM Aspartat, 6 mM Natriumpyruvat, 0,05 mM PLP, 3 mM Kaliumphosphat, 3 mM MgCl₂, 25 μg/ml Aminotransferase, 50 μg/ml C.testosteroni-ProA-Aldolase, 4 Units/ml Decarboxylase, 5-200 mU/ml L-Aminosäure-Oxidase (Sigma A-2805), 168 U/ml Katalase (Sigma C-3515) und 0,008 mg FAD. Reaktionen wurden während 30 Minuten bei 30°C durchgeführt. Eine Verbesserung wurde mit der Zugabe von Decarboxylase beobachtet. Die größte Menge an Monatin wurde hergestellt, als 50 mU/ml Oxidase verwendet wurden. Die Verbesserungen waren ähnlich zu denjenigen, welche beobachtet wurden, als Indol-3-pyruvat als das Substrat verwendet wurde. Darüber hinaus stieg die Menge an produziertem Monatin, wenn 1) der Tryptophan-Spiegel niedrig war (d.h. unter der Km des Aminotransferase-Enzyms, und deshalb unfähig, mit MP in der aktiven Stelle zu kompetieren), und 2) das Verhältnis von Oxidase zu Aldolase und Aminotransferase bei einem solchen Spiegel gehalten wurde, dass Indol-3-pyruvat sich nicht akkumulieren konnte.
Ungeachtet dessen, ob entweder mit Indol-3-pyruvat oder Tryptophan begonnen wurde, stieg die Menge an produziertem Monatin in Assays mit Inkubationszeiten von 1-2 Stunden, wenn das 2-4-Fache der Mengen aller Enzyme verwendet wurde, während dasselbe Enzym-Verhältnis aufrechterhalten wurde. Unter Verwendung jedes Substrats wurden Konzentrationen von ungefähr 1 mg/ml Monatin erzielt. Die Menge an hergestelltem Tryptophan, bei Start von Indol-Pyruvat, war typischerweise geringer als 20% der Menge des Produkts, was den Vorteil des Verwendens von gekoppelten Reaktionen zeigt. Mit einer weiteren Optimierung und Steuerung der Konzentrationen von Intermediaten und Seitenreaktionen konnten die Produktivität und Ausbeute in großem Maße verbessert werden.
Gekoppelte Reaktionen unter Verwendung von Lysin-epsilon-Aminotransferase (EC 2.6.1.36)
Lysin-epsilon-Aminotransferase (L-Lysin-o-Transaminase) wird in mehreren Organismen gefunden, einschließlich Rhodococcus, Mycobacterium, Streptomyces, Nocardia, Flavobacterium, Candida utilis und Streptomyces. Sie wird von Organismen als der erste Schritt in der Produktion einiger beta-Lactam-Antibiotika verwendet (Rius und Demain, J. Microbiol. Biotech., 7:95-100, 1997). Dieses Enzym wandelt Lysin zu L-2-Aminoadipat-6-semialdehyd (Allysin) um durch eine PLP-vermittelte Transaminierung des C-6 von Lysin unter Verwendung von alpha-Ketoglutarat als dem Amino-Akzeptor. Allysin ist instabil und durchläuft spontan eine intramolekulare Dehydratation unter Bildung von 1-Piperidin-6-carboxylat, einem zyklischen Molekül. Dieses inhibiert wirksam das Stattfinden jedweder Rückwärtsreaktion. Das Reaktionsschema ist in der 12 abgebildet. Ein alternatives Enzym, Lysin-Pyruvat-6-Transaminase (EC 2.6.1.71) kann ebenfalls verwendet werden.
Eine typische Reaktion enthielt, in 1 ml: 50 mM Tris-HCl, pH 7,3, 20 mM Indol-3-pyruvat, 0,05 mM PLP, 6 mM Kaliumphosphat pH 8, 2-50 mM Natriumpyruvat, 1,5 mM MgCl₂, 50 mM Lysin, 100 μg Aminotransferase (Lysin-epsilon-Aminotransferase LAT-101, BioCatalytics Pasadena, CA) und 200 μg C. testosteroni-ProA-Aldolase. Die Menge an produziertem Monatin stieg mit steigenden Konzentrationen an Pyruvat. Die Maximummenge unter Verwendung dieser Reaktionsbedingungen (bei 50 mM Pyruvat) war 10-fach geringer als diejenige, welche beobachtet wurde mit gekoppelten Reaktionen unter Verwendung von Oxalacetat-Decarboxylase (ungefähr 0,1 mg/ml).
Ein Peak mit [M + H]⁺ = 293 eluierte bei der erwarteten Zeit für Monatin, und das Massenspektrum enthielt mehrere derselben Fragmente, welche mit anderen enzymatischen Verfahren beobachtet wurden. Ein zweiter Peak mit dem korrekten Masse-zu-Ladungs-Verhältnis (293) eluierte geringfügig früher als derjenige, der typischerweise für das S,S-Monatin, welches in Beispiel 6 hergestellt wird, beobachtet wird, und kann auf das Vorhandensein eines anderen Stereoisomers von Monatin hindeuten. Von diesem Enzym wurde sehr wenig Tryptophan produziert. Allerdings besteht wahrscheinlich eine gewisse Aktivität gegenüber Pyruvat (unter Produktion von Alanin als Nebenprodukt). Des Weiteren ist das Enzym bekanntermaßen instabil. Verbesserungen können vorgenommen werden mittels Durchführung von gerichteten Evolutions-Experimenten zur Erhöhung der Stabilität, Verringerung der Aktivität mit Pyruvat und Erhöhung der Aktivität mit MP. Diese Reaktionen können auch an L-Aminosäure-Oxidase/Katalase gekoppelt werden, wie oben beschrieben.
Andere gekoppelte Reaktionen
Eine andere Kopplungsreaktion, welche die Monatin-Ausbeute aus Tryptophan oder Indol-Pyruvat verbessern kann, ist in der 13 gezeigt. Formiat-Dehydrogenase (EC 1.2.1.2 oder 1.2.1.43) ist ein übliches Enzym. Manche Formiat-Dehydrogenasen erfordern NADH, während andere NADPH verwenden können. Glutamatdehydrogenase katalysierte die wechselseitige Umwandlung zwischen dem Monatin-Vorläufer und Monatin in früheren Beispielen unter Verwendung von Puffern auf Ammoniumbasis. Das Vorhandensein von Ammoniumformiat und Formiat-Dehydrogenase ist ein effizientes System zur Regenerierung von Cofaktoren, und die Produktion von Kohlendioxid ist ein effizienter Weg, um die Rate der Rückwärtsreaktionen zu senken (Bommarius et al., Biocatalysis 10:37, 1994, und Galkin et al., Appl. Environ. Microbiol. 63:4651-6, 1997). Darüber hinaus können große Mengen an Ammoniumformiat in dem Reaktionspuffer gelöst werden. Die Ausbeute an Monatin, welches produziert wurde durch Glutamatdehydrogenase-Reaktionen (oder ähnliche reduktive Aminierungen), kann durch die Zugabe von Formiat-Dehydrogenase und Ammoniumformiat verbessert werden.
Andere Verfahren können angewandt werden, um das Gleichgewicht in Richtung zur Monatin-Produktion zu steuern. Zum Beispiel, wenn Aminopropan als der Aminosäure-Donor bei der Umwandlung von MP zu Monatin mit einer omega-Aminosäure-Aminotransferase (EC 2.6.1.18) verwendet wird, wie diejenigen, welche beschrieben werden in den U.S.-Patenten 5 360 724 und 5 300 437, wird eines der resultierenden Produkte Aceton sein, ein flüchtigeres Produkt als das Substrat Aminopropan. Die Temperatur kann periodisch während kurzen Perioden erhöht werden, um das Aceton abzudunsten, wodurch der Gleichgewichtszustand erleichtert wird. Aceton besitzt einen Siedepunkt von 47°C, eine Temperatur, bei der nicht wahrscheinlich ist, dass die Intermediate abgebaut werden, falls sie während kurzer Zeitdauern angewandt wird. Die meisten Aminotransferasen, welche Aktivität auf alpha-Ketoglutarat besitzen, weisen ebenfalls Aktivität auf den Monatin-Vorläufer auf. In ähnlicher Weise, wenn eine Glyoxylat/Aromatische Säure-Aminotransferase (EC 2.6.1.60) mit Glycin als dem Aminodonor verwendet wird, wird Glyoxylat hergestellt, welches relativ instabil ist und einen in hohem Maße reduzierten Siedepunkt im Vergleich zu Glycin aufweist.
BEISPIEL 14
Eine Kaugummizusammensetzung mit Erdbeergeschmack wird hergestellt unter Verwendung der in Tabelle 6 aufgelisteten Bestandteile. Das R,R-Stereoisomer von Monatin kann für Acesulfam K und das S,S-Stereoisomer von Monatin substituiert werden.
Tabelle 6
Der Gummigrundstoff besteht aus 30% Terpenharz, 15% hydriertem Baumwollsamenöl, 2% Lecithin, 2,5% Polyisobutylen, 27% Polyvinylacetat, 12,45% Calciumcarbonat, 11% Isobutylen-Isopren-Copolymer und 0,05% BHT.
Der Gummigrundstoff wird vorerwärmt, in einen Sigma-Klingen-Mischer zugegeben und gemischt, bis er weich und formbar ist. Eine Sorbitollösung und Glycerin werden auf 50°C erwärmt und dem Mischer gemeinsam mit den restlichen Bestandteilen zugegeben. Nachdem das Mischen vollständig ist, wird das Gummi zu einer Dicke von 1,5 mm Dicke ausgewalzt, mit Talkum eingestäubt, geschnitten und eingewickelt.
Es wird erwartet, dass der Erdbeergeschmack weniger maskiert werden wird, und dass die Süße in dieser Kaugummizusammensetzung, welche Monatin enthält, länger anhalten wird im Vergleich zu ähnlichen Kaugummizusammensetzungen, welche von Monatin verschiedene intensitätsstarke Süßstoffe enthalten.
BEISPIEL 15: Kaugummi-Formulierungen, welche Monatin umfassen, und Verfahren zur Herstellung dieser
Im Folgenden finden sich mehrere Beispielformulierungen von Kaugummizusammensetzungen, welche Monatin umfassen, sowie ein Beispielverfahren zur Verarbeitung der Zusammensetzungen.
Formulierung A

200 g Gummigrundstoff
340 g Sorbitolpulver (Cerestar P16616)
7g Kreide
3,6 g Maltitol-Sirup (Cerestar 16303, konzentriert zu 80 Brix)
2 g Menthol
1,5 g S,S-Monatin

Formulierung B

200 g Gummigrundstoff
340 g Sorbitolpulver (Cerestar P16616)
7 g Kreide
3,6 g Maltitol-Sirup (Cerestar 16303, konzentriert zu 80 Brix)
2 g Menthol
0,05 g R,R-Monatin

Formulierung C

200 g Gummigrundstoff
340 g Sorbitolpulver (Cerestar P16616)
7 g Kreide
3,6 g Maltitol-Sirup (Cerestar 16303, konzentriert zu 80 Brix)
2 g Menthol
0,038 g S,S-Monatin
0,038 g R,R-Monatin

Formulierung D

320 g Gummigrundstoff
400 g Sorbitolpulver (Cerestar P16616)
100 g Maltitol-Sirup (Cerestar 16303)
40 g Mannitol (Cerestar 16700)
10g Isomalt
14 g Menthol
18 g Minzaroma
1 g S,S-Monatin
1 g Acesulfam K
0,075 g R,R-Monatin

Formulierung E

200 g Gummigrundstoff
400 g Sorbitol (kristallin)
46 g Maltitol-Sirup (80% ds)
Zugeben von 2% Kirscharoma + 0,02% R,R-Monatin

Formulierung F

211 g zuckerfreier Gummigrundstoff
420 g Sorbitol
14 g Glycerol
Zugeben von 2% Aroma + 0,2% S,S-Monatin + 0,015% R,R-Monatin

Formulierung G

270 g Gummigrundstoff
340 g Sorbitol
34 g Sorbitol-Sirup (70% ds)
Zugeben von 2% Aroma + 0,15% S,S-Monatin + 0,05% R,R-Monatin

Formulierung H

300 g Gummigrundstoff
550 g Erythritol
100 g Maltitol-Sirup
49,5 g Glycerin
0,5 g S,S-Monatin

Wie das Gummi verarbeitet wird:
Der Gummigrundstoff wird mittels Extrusion verarbeitet und in ein Wasserbad zum Kühlen und Verfestigen gebracht. Pellets von ungefähr 1/2 cm mal 1/2 cm werden bis zur weiteren Verwendung aufbewahrt. Die Pellets werden unter Verwendung eines Z-(Hochscher-)Mischers gemischt, und Temperaturen von bis zu 60°C werden erreicht, wodurch die Mischung erweicht wird. Talkum wird zugesetzt, falls es nicht bereits in dem Gummigrundstoff ist. Der kristalline Süßstoff (z. B. Sorbitol) und der Weichma cher/Plastifizierer (z. B. flüssiges Sorbitol, flüssiges Maltitol oder Glycerol) werden schrittweise in einer abwechselnden Weise während des Mischens zugegeben, um eine Überhitzung des Mischermotors zu vermeiden. Aromastoffe, Färbemittel und Süßstoffe werden zugegeben und vermischt. Die Mischung wird aus dem Mischer entnommen, eine typische Ansatzgröße beträgt mehrere hundert Kilogramm. Die Mischung wird durch einen Extruder gedrückt, welcher das Gummi homogenisiert und formt. Die Blätter werden flach gemacht und geschnitten, und die Stücke werden für Streifengummi verpackt oder für pelletierte Gummis überzogen.
BEISPIEL 16: Formulierung und Verfahren zur Herstellung von zuckerfreiem Kaugummi Eine Beispiel-Formulierung:
Beispielhafte Herstellungsverfahrensweise:

1. Vorwärmen des Gummigrundstoffs in der Mikrowelle, danach Zugeben zum Z-Klingenmischer und Mischen bis weich und formbar.
2. Erwärmen der Sorbitollösung und des Glycerins in der Mikrowelle bis 50°C.
3. Zugeben aller restlichen Bestandteile zum Z-Klingenmischer. Mischen während 20 Minuten, Überprüfen der Temperatur der Mischung alle 5 Minuten.
4. Nachdem das Mischen abgeschlossen ist, Entnehmen des Gummis aus dem Mischer und Auswalzen zu 1,5 mm Dicke. Einstäuben mit Talkum, Schneiden und Einwickeln.

BEISPIEL 17: Auswertung von Monatin.
Monatin-Formulierungen, beinhaltend R,R-Monatin oder R, R-Monatin/Erythritol-Kombinationen, wurden relativ zu anderen bekannten Süßstoffen (Aspartam und Sucralose) in Eistee ausgewertet. Die Schlüssel-Sensorikparameter, die überprüft wurden, schlossen Süßequalität, Nachgeschmack, Bittergeschmack und dessen Nachgeschmack ein. Eine qualitative Auswertung ist durchgeführt worden.
Produkt-Formulierungen-Eistee
Eine Eistee-Formulierung wurde entwickelt, um die Süßstoffleistung zu bewerten (Tabelle 7).
Tabelle 7. Eistee-Formulierung
Süßstoffe wurden dem Tee bei den folgenden Konzentrationen zugesetzt:

Aspartam 0,0450% (w/v)

Sucralose 0,0170% (w/v)

R,R-Monatin 0,0030, 0,0035, 0,0040% (w/v) plus 1 g Maltodextrin

R,R-Monatin/Erythritol 0,0030, 0,0035, 0,0040% (w/v) plus 1 g Erythritol
Sensorische Auswertung
Die Auswertung von Eistee-Getränken wurde durchgeführt durch eine Auswahl (n = 6) von erfahrenen Sensorik-Bewertungspersonen. Die Ergebnisse dieser Bewertungen sind in der Tabelle 8 zusammengefasst.
Tabelle 8. Sensorische Auswertung von Tee (200 ml Portionsgröße)
Erörterung
Monatin ergab unerwartete Leistungsvorteile, einschließlich deutlicher sensorischer Vorteile, in Süßmacher-Formulierungen. In Eistee und insbesondere angesäuertem Säure-Tee (d.h. mit Zitrone) erhöhte Monatin die Zitronen-Geschmacksnoten. Dieser Vorteil wurde weiter verstärkt durch Zugabe von niedrigen Konzentrationen an Erythritol, welche in der Lage waren, den Geschmack auszugleichen und abzurunden und die Süße-Ausbruch-Zeiten zu beschleunigen. In Getränken, wie Tee, lieferte Monatin verbesserte sensorische Eigenschaften (z. B. weniger Nachgeschmack, weniger Fehlgeschmack) und/oder verbesserte Löslichkeits- und Stabilitätsmerkmale. Zur Süßung von Eistee verwendetes Monatin enthält nahezu 0 Kalorien, im Vergleich zu 32 Kalorien in 2 Teelöffeln (~8 g) Sucrose, welche zum Süßen von Eistee verwendet werden.
Es wird erwartet, dass in Kaugummizusammensetzungen, wie in Getränken, Monatin eine Verstärkung von Citrus-Aromastoffen aufzeigt, sowie ein günstigeres Zeit/-Intensitäts-Profil für die Süße, im Vergleich zu Aspartam oder Sucralose, bereitstellt. Es wird ferner erwartet, dass in Kaugummizusammensetzungen, eine Mischung von Monatin und Erythritol Citrus-Aromen weiter verstärkt und günstigere Süße-Profile bereitstellt, im Vergleich zu Aspartam oder Sucralose.
BEISPIEL 18 Auswertung von Monatin in Kaugummi
Einleitung
Kaugummis, welche individuell mit Monatin, Aspartam und Sucralose gesüßt waren, wurden im Streifen-Gummiformat mit Minzgeschmack hergestellt. Die Gummis wurden hergestellt, um iso-süß zu sein und hinsichtlich der Qualität des süßen Geschmacks und der Zeitintensität der Süße-Abgabe ausgewertet.
Gummi-Formulierungen und Herstellung
Die in dieser Auswertung verwendeten Formulierungen sind in der Tabelle 9 angegeben. Ein Standardverfahren zur Herstellung wurde für alle drei Gummi-Formulierungen angenommen, wie beschrieben.
Tabelle 9. Kaugummi-Formulierungen
Das Verfahren zur Gummiherstellung war wie folgend:

– Vorwärmen des Gummigrundstoffs auf 40-45°C und dann Zugeben in den Z-Klingen-Mixer und Mischen
– Sieben von Sorbitolpulver
– Entfernen eines Teils des Sorbitols, Verteilen des Süßstoffs in diesem Teil und gründliches Mischen
– Zurückführen der Süßstoff/Sorbitol-Mischung zur verbleibenden Masse des Sorbitolpulvers und gründliches Mischen
– Mischen von Lycasin und Glycerol in einer Schale und Vorwärmen auf 50°C
– Zugeben von Sorbitolpulver in den Z-Klingen-Mischer, welcher den Gummigrundstoff enthält
– Zugeben von Lycasin/Glycerol und Aroma in den Z-Klingen-Mischer und Mischen während 20 Minuten
– Entnehmen des Gummis aus dem Z-Klingen-Mischer
– Walzen zu einer Dicke von 1,5 mm unter Verwendung einer mechanischen Walze
– Einstäuben mit Talk im Verhältnis von 3 g Talk zu 100 g Gummi
– Schneiden zu Streifen mit Abmessungen von 19 mm × 73 mm
– Einwickeln einzelner Streifen in Folie

Sensorische Auswertung
Kaugummizusammensetzungen wurden von einer Auswahl von trainierten Sensorik-Bewertungspersonen (n = 4) bewertet, welche alle sehr erfahren in der formellen sensorischen Auswertung von Kaugummis waren, einschließlich einer Auswertung hinsichtlich Zeit/Intensitäts-Parametern. Qualitative und zeitmäßige Charakteristika des Geschmacks und der Süße des Gummis wurden ausgewertet.
Die Ergebnisse der Auswertungen sind in der Tabelle 10 angegeben. In diesen Auswertungen ergab Monatin deutliche sensorische Vorteile in den Kaugummizusammensetzungen, wobei ein klares Gleichgewicht zwischen Süße und Geschmack es zuließ, dass beide zum maximalen sensorischen Nutzen wahrgenommen werden können. Das Zeit/Intensitäts-Profil für die Süße durch Monatin war ebenfalls sehr deutlich beiden, Aspartam oder Sucralose, überlegen. Die Süße wurde während einer signifikant längeren Zeit wahrgenommen, wenn der Monatin-gesüßte Gummi verzehrt wurde.
Tabelle 10. Sensorische Auswertung von Kaugummis
BEISPIEL 19: Süße-Dosis-Antwort-Kurve von Monatin und Saccharin
Die Süße von Monatin und Saccharin wurde unter Verwendung von 20 trainierten Sensorik-Bewertungspersonen ausgewertet, welche Beurteilungen in zweifacher Ausfertigung erstellten. Test- und Referenzlösungen wurden in Zitronensäure/Citrat-Puffer bei pH 3,2 hergestellt; Siehe 16. Die linearere Antwort von R,R/S,S-Monatin im Vergleich zu Saccharin ist konsistent mit der Zuführung eines stärker zuckerähnlichen Geschmackscharakters. Das Plateau über 10% SEV weist auf die Abwesenheit/geringe Spiegel an "Mischungs-unterdrückenden" Fehlgeschmäcken und Nachgeschmäcken hin. Die Form der Dosis-Antwort-Kurve von Monatin ist ähnlich zu denjenigen von Aspartam, Sucralose und Alitam, welche alle "Qualitäts"-Süßstoffe sind.
Mit R,R/S,S-Monatin als einem einzigen Süßstoff im Modellsystem (pH 3,2) wurden die folgenden Charakteristika beobachtet: (1) Geringe Verzögerung im Süßegeschmack-Ausbruch; (2) Verfall des Süßegeschmacks erfolgte ziemlich rasch; (3) geringer "Aspartam-artiger" Nachgeschmack, geringfügiger süßer Nachgeschmack, keine Bitterkeit im Nachgeschmack; und (4) restliche bzw. verbleibende Kühlungs-Empfindung in nicht-aromahaltigen Systemen.
BEISPIEL 20: Stabilität von Monatin bei pH 3 mit steigenden Temperaturen
Eine Probe von synthetischem Monatin wurde unter pH 3 bei Temperaturen von 25°C, 50°C und 100°C unterzogen. Bei Raumtemperatur und pH 3 wurde ein 14%iger Verlust hinsichtlich Monatin über eine Zeitdauer von 48 Stunden hinweg beobachtet. Dieser Verlust war der Lactonbildung zuzuschreiben. Bei 50°C und pH 3 wurde ein 23%iger Verlust hinsichtlich Monatin über eine Zeitdauer von 48 Stunden beobachtet. Dieser Verlust wurde der Lactonbildung und dem Aufbau einer unbekannten Verbindung nach etwa 15,5 Minuten zugeschrieben. Bei 100°C und pH 3 ging nahezu alles Monatin nach 24 Stunden verloren. Die hauptsächliche nachweisbare Komponente war eine Unbekannte nach 15,5 Minuten.
BEISPIEL 21: Sensorische Stabilität von Monatin und Aspartam bei pH 2,5, 3,0, 4,0 bei 40°C
Die sensorische Stabilität von Monatinlösungen, die bei pH 2,5, 3,0 und 4,0 hergestellt und bei 40°C aufbewahrt wurden, wurde 100 Tage lang überwacht. Der Verlust an Sü ße aus diesen Lösungen wurde mit den Verlusten von Süße aus Aspartamlösungen, welche unter identischen Bedingungen hergestellt und aufbewahrt wurden, verglichen.
Die sensorische Stabilität von Monatin (8% SEV, ~55 ppm, synthetisches Gemisch, enthaltend ungefähr 96% des 2R,4R/2S,4S-Enantiomerenpaars und 4% des 2R,4S/2S,4R-Enantiomerenpaars) in Phosphat/Citrat-Puffern mit einem pH von 2,5, 3,0 und 4,0 wurde nach Aufbewahrung bei 40°C untersucht. Die Stabilität von Monatin wurde mit derjenigen von Aspartam (400 ppm) in denselben Puffern verglichen. Drei Sucrose-Referenzlösungen wurden in den gleichen Phosphat/Citrat-Puffern wie die Monatin- und Aspartamlösungen hergestellt. Alle hergestellten Lösungen wurden im Dunklen aufbewahrt.
Pufferzusammensetzungen:

pH 2,5 Phosphorsäure (75%ige Lösung) 0,127% (w/v) Tri-Natriumcitrat-Monohydrat 0,005% (w/v)
pH 3,0 Phosphorsäure (75%ige Lösung) 0,092% (w/v) Tri-Natriumcitrat-Monohydrat 0,031% (w/v)
pH 4,0 Phosphorsäure (75%ige Lösung) 0,071% (w/v) Tri-Natriumcitrat-Monohydrat 0,047% (w/v)

Die Süße von jedem Süßstoff relativ zu Sucrose wurde in zweifacher Ausfertigung durch eine Auswahl (n = 8) von geschulten Sensorik-Bewertungspersonen ausgewertet, welche hinsichtlich des Süße-Abschätzungsvorgehens erfahren waren. Alle Proben (in den gleichen Puffern) wurden in zweifacher Ausfertigung bei einer Temperatur von 22°C ± 1°C serviert. Monatin(Test)-Lösungen, welche mit 3-Ziffer-Zufallsnummer-Codes codiert waren, wurden einzeln an die Bewertungspersonen präsentiert, und zwar in zufälliger Reihenfolge. Sucrose-Referenzstandards, im Bereich von 4,0 – 10,0% (w/v) Sucrose, welche in Schritten von 0,5% (w/v) Sucrose anstiegen, wurden ebenfalls bereitgestellt. Die Bewertungspersonen wurden ersucht, die Süße durch Vergleichen der Süße der Testlösung zu den Sucrose-Standards abzuschätzen. Dies wurde ausgeführt durch Einnehmen von 3 Schlücken der Testlösung, gefolgt von einem Schluck Wasser, gefolgt von 3 Schlücken Sucrose-Standard, gefolgt von einem Schluck Wasser etc. Die Bewertungspersonen wurden ermuntert, die Süße auf eine Dezimalstelle genau, Z. B. 6,8, 8,5, abzuschätzen. Eine 5-minütige Ruhedauer wurde zwischen dem Auswerten der Testlösungen verordnet. Die Bewertungspersonen wurden ebenfalls ersucht, gut auszuspülen und einen Cracker zu essen, um jedwede potenziellen Übertrageffekte zu reduzieren.
Die Tabellen 11 und 12 präsentieren die Ergebnisse der Stabilitätsuntersuchungen in den Phosphat-Citrat-Puffern. Bei jedem pH-Wert und nach 100 Tagen Aufbewahrung bei 40°C im Dunklen war die prozentuale Beibehaltung der Monatin-Süße größer als diejenige, welche mit Aspartam beibehalten wurde. Bei pH 4,0 schien der Verlust der Süße der Monatinlösung sich beinahe stabilisiert zu haben, da eine sehr kleine Änderung in der gemessenen Süßintensität zwischen den Tagen 17 und 100 bestand, wohingegen die Aspartamlösung fortgesetzt an Süße verlor.
Tabelle 11
Sensorische Stabilität von Monatin: Süße nach 100 Tagen Aufbewahrung bei 40°C A.
B.
C.
Tabelle 12

Stabilität: Ausmaß an Süße, welche nach 100 Tagen Aufbewahrung beim angegebenen pH bei 40°C verbleibt

Die jeweiligen Puffer waren effektiv zur Aufrechterhaltung des pH-Werts, wie ersichtlich in der Tabelle 13: Tabelle 13
Wenn eine Zerfalls-Reaktion von pseudoerster Ordnung angenommen wird, gestattet eine Auftragung des log_n des Prozentsatzes der Retention gegen die Zeit (log_⊓⁣%RTN geg. t) die Abschätzung der Halbwertszeit (t½) und der Geschwindigkeitskonstante (k) der des Süße-Verlusts unter jedwedem gegebenen Satz von Bedingungen. Wenn man so verfährt, kann die Kinetik des Monatin- und Aspartam-Süßeverlusts wie folgend in der Tabelle 14 zusammengefasst werden.
Tabelle 14
Bei jedem pH-Wert und nach 100 Tagen Aufbewahrung beim 40°C ist die prozentuale Retention von Monatin-Süße größer als diejenige, welche von Aspartam zurückgehalten wird. Bei pH 4,0 scheint der Verlust der Süße der Monatinlösung sich beinahe stabilisiert zu haben, da hier eine sehr geringe Änderung hinsichtlich der gemessenen Süße-Intensität zwischen den Tagen 17 und 100 vorlag, wohingegen die Aspartamlösung fortgesetzt an Süße verliert.
Schätzungen der Halbwertszeit von Monatin und Aspartam zeigen, dass die von Monatin abgeleitete Süße bei einer langsameren Geschwindigkeit verloren geht als jene von Aspartam. Halbwertszeit-Schätzungen für die Monatin-Süße bei pH 2,5, 3,0 und 4,0 beliefen sich auf 65 Tage, 115 Tage bzw. 230 Tage. Aspartam-Halbwertszeit-Schätzungen beliefen sich auf 55 Tage, 75 Tage und 140 Tage unter den gleichen Bedingungen.
Somit liefert Monatin, unter sauren Bedingungen und Aufbewahrung bei 40°C eine stabilere Süße, als dies bei Aspartam der Fall ist.
BEISPIEL 22: Chromatographie von Stereoisomeren von Monatin
Probenherstellung – Ungefähr 50-75 μg lyophilisiertes Material wurden in ein Mikrozentrifugenröhrchen eingebracht. Hierzu wurden 1,0 ml Methanol von HPLC-Güteklasse zugesetzt. Die Lösung wurde 30 Minuten lang per Vortex verwirbelt, zentrifugiert und ein Aliquot des Überstands wurde zur Analyse entnommen.
Umkehrphasen-HPLC – Chromatographie von zwei verschiedenen Diastereomeren-Peaks (R,R/S,S und R,S/S,R) wurde bewerkstelligt unter Verwendung einer 2,1 × 250 mm großen HPLC-Säule Xterra^TM MS C₈ 5 μm (Waters Corporation). Der Nachweis wurde unter Verwendung eines Ultima^TM Triple-Quadrupol-Massenspektrometers von Micromass durchgeführt. Die mobile Phase wurde durch den folgenden Gradienten zugeführt:
Chirale HPLC – Chromatographie von zwei verschiedenen Monatin-Stereoisomeren (R,R und S,S) wurde unter Verwendung einer 250 × 4,6 mm großen HPLC-Säule Chirobiotic T (Advanced Separations Technologies, Inc.) bewerkstelligt. Der Nachweis wurde unter Verwendung eines Ultima^TM Triple-Quadrupol-Massenspektrometers von Micromass durchgeführt. Die mobile Phase bestand aus Methanol mit 0,2% Essigsäure und 0,05% Ammoniumhydroxid.
Massenspektrometrie (MS/MS) – Das Vorhandensein von Monatin wurde nachgewiesen durch ein "Selected Reaction Monitoring"(SRM)-Experiment. Das protonierte Molekülion von Monatin ([M + H]⁺) weist ein m/z=293,3 auf. Die Fragmentierung dieses Molekülions erzeugt ein signifikantes Ion bei m/z=257,3, welches aus mehreren Dehydratationen des Molekülions entsteht. Von diesem Übergang wurde gezeigt, dass er sehr spezifisch für Monatin ist, und er wurde als der Übergang (293,3 zu 257,3) zur Überwachung während des SRM-Experiments ausgewählt. Dieses Nachweisverfahren wurde sowohl für Umkehrphasen- als auch chirale Trennungen von Monatin angewandt.
Ergebnisse – Die Standardproben von R,S/S,R und S,S/R,R wurden unter Umkehrphasen-HPLC ausgewertet. Die Proben wurden hergestellt durch Derivatisierung und enzymatische Auflösung. Chromatogramme für Standardlösungen sind in der 17 dargestellt. Im Anschluss an die Umkehrphasen-Analyse wurde eine chirale Chromatographie ausgeführt, um in den Proben vorhandene, spezifische Stereoisomere auszuwerten. Eine chirale Chromatographie von S,S- und R,R-Monatin-Standardlösungen wird in 18 gezeigt.
BEISPIEL 23: Stabilität von Monatin bei hoher Temperatur (80°C) und neutralem pH-Wert
Eine 100-Milliliter-Lösung von 75 ppm Monatin bei pH 7 wurde als eine Stammlösung verwendet. Die synthetische Monatin-Probe enthielt ungefähr 96% des 2R,4R/2S,4S- Enantiomerenpaars und 4% des 2R,4S/2S,4R-Enantiomerenpaars. Proben wurden bei 80°C und pH 7 während der Dauer des Experiments inkubiert, und Proben wurden bei 0, 1, 2, 3, 4 Stunden und 1, 2, 4, 7, 14, 21 und 35 Tagen entnommen. Alle experimentellen Bedingungen wurden in zweifacher Ausfertigung durchgeführt.
Trennung und Quantifizierung unter Verwendung von LC-MS unter Einsatz von Umkehrphasenchromatographie –
Eine Antwort-Kurve wurde für beide nachgewiesenen Diastereomer-Peaks des synthetischen Monatins aufgestellt. Ein Spielraum von 5 – 150 ppm wurde mit dem in DI-Wasser gelösten synthetischen Monatinstandard eingeklammert. Die Trennung der zwei Diastereomer-Peaks wurde unter Verwendung einer 3,9 × 150 mm großen HPLC-Säule Novapak C18 (Waters Corporation) bewirkt. Ultraviolett-Sichtbar(UV)- und Massenspektrometer(MS)-Dektoren wurden in Reihe für den Nachweis und die Quantifizierung eingesetzt. Monatin und sein Lacton-Peak besitzen jeweils ein UV_max bei 279 nm, welches beim präzisen Nachweis half. Die Quantifizierung wurde vorgenommen durch Erfassen des "Selected Ion Monitoring"(SIM)-Scans von 293,3 m/z und 275,3 m/z im Positivionen-Elektronenspray-Modus.
Ergebnisse – Bei einem neutralen pH-Wert wurde ermittelt, dass das Ausmaß des Abbaus von Monatin selbst nach 7-35 Tagen unbedeutend war. Das Verschwinden von Monatin mit der Zeit ist in hohem Maße vom pH-Wert abhängig, da die primären Nebenprodukte in Zyklisierung und möglicherweise sehr geringen Spiegeln an Razemisierung bestehen. Während des Experiments bei 80°C und pH 7 wurde keine Änderung hinsichtlich der Konzentration von razemischem RR/SS-Monatin oder Lactonen davon innerhalb der Genauigkeitsgrenzen nachgewiesen, welche durch Verwendung von LC-MS für die Quantifizierung gegeben waren. Wegen der thermischen Stabilität von Monatin bei neutralem pH-Wert, wird es erwartet, dass Monatin eine geeignete Stabilität für Gummi-Verarbeitungstemperaturen aufweist und eine längere Haltbarkeitsdauer in Kaugummizusammensetzungen besitzt, wenn mit anderen intensitätsstarken Süßstoffen, wie Aspartam, verglichen wird.
In Hinsicht auf die vielen möglichen Ausführungsformen, auf welche die Prinzipien dieser Offenbarung angewandt werden können, sollte es erkannt werden, dass die veranschaulichten Ausführungsformen lediglich besondere Beispiele der Offenbarung sind und nicht als eine Einschränkung hinsichtlich des Umfangs der Offenbarung ausgelegt werden sollten.
SEQUENZAUFLISTUNG

Claims

Kaugummizusammensetzung, umfassend einen Gummigrundstoffanteil und einen löslichen Anteil, wobei der lösliche Anteil Monatin oder Salz davon umfasst.
Kaugummizusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei eine Menge der Zusammensetzung weniger Kalorien und Kohlenhydrate als die gleiche Menge der Sucrose an Stelle des Monatin oder Salzes davon enthaltenden Kaugummizusammensetzung enthält.
Kaugummizusammensetzung, umfassend Monatin oder Salz davon, wobei das Monatin oder Salz davon in einer Menge vorliegt, die eine länger anhaltende Süße und ein nicht überdecktes oder verstärktes Aroma vorsieht im Vergleich mit anderen für Monatin oder Salz davon substituierten intensitätsstarken Süßstoffen in der Kaugummizusammensetzung.
Kaugummizusammensetzung gemäß Anspruch 3, wobei die anderen intensitätsstarken Süßstoffe aus Aspartam und Sucralose gewählt werden.
Verfahren zur Herstellung einer mit Monatin gesüßten Kaugummizusammensetzung mit einer durch Monatin oder Salz davon vorgesehenen verbesserten lang anhaltenden Süße, umfassend die Schritte: (a) Herstellen von Monatin oder von Salz davon auf biosynthetischem Wege; (b) Kombinieren des Monatins oder Satzes davon mit anderen Bestandteilen; und (c) Bilden der Kaugummizusammensetzung.
Kaugummizusammensetzung, umfassend Monatin oder Salz davon, wobei das Monatin oder Salz davon in einer Menge vorliegt, die eine verbesserte lang anhaltende Süße vorsieht.
Kaugummizusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei das Monatin oder Salz davon in einer Menge vorliegt, die eine lang anhaltende Süße im Vergleich mit Aspartam oder Sucralose vorsieht.
Kaugummizusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei der lösliche Anteil ferner ein Citrus-Aroma umfasst.
Kaugummizusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei der lösliche Anteil ferner ein Citrus-Aroma umfasst und wobei das Monatin oder Salz davon in einer Menge vorliegt, die das durch das Citrus-Aroma vorgesehene Aroma verstärkt.
Kaugummizusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei die Zusammensetzung etwa 0,001 bis etwa 1,1 Gew.-% Monatin oder Salz davon umfasst.
Kaugummizusammensetzung gemäß Anspruch 10, wobei die Zusammensetzung im Wesentlichen frei von S,S-Monatin oder von Salz davon ist.
Kaugummizusammensetzung gemäß Anspruch 10, wobei die Zusammensetzung im Wesentlichen frei von R,R-Monatin oder von Salz davon ist.
Kaugummizusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei die Zusammensetzung etwa 0,009 bis etwa 0,1 Gew.-% R,R-Monatin oder Salz davon umfasst.
Kaugummizusammensetzung gemäß Anspruch 13, wobei die Zusammensetzung etwa 0,015 bis etwa 0,025 Gew.-% R,R-Monatin oder Salz davon umfasst.
Kaugummizusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei die Zusammensetzung etwa 0,1 bis etwa 1,1 Gew.-% S,S-Monatin oder Salz davon umfasst.
Kaugummizusammensetzung gemäß Anspruch 15, wobei die Zusammensetzung etwa 0,15 bis etwa 0,88 Gew.-% S,S-Monatin oder Salz davon umfasst.
Kaugummizusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei die Zusammensetzung etwa 0 bis etwa 1,1 Gew.-% S,S-Monatin oder Salz davon und etwa 0 bis etwa 0,1 Gew.-% R,R-Monatin oder Salz davon umfasst.
Kaugummizusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei die Zusammensetzung etwa 0,1 Gew.-% oder weniger R,R-Monatin oder Salz davon umfasst und wobei das Monatin oder Salz davon im Wesentlichen frei von S,S-, S,R- oder R,S-Monatin oder Salz davon ist.
Kaugummizusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei die Zusammensetzung etwa 1,1 Gew.-% oder weniger S,S-Monatin oder Salz davon umfasst und wobei das Monatin oder Salz davon im Wesentlichen frei von R,R-, S,R- oder R,S-Monatin oder Salz davon ist.
Kaugummizusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei das Monatin oder Salz davon im Wesentlichen aus R,R-Monatin oder Salz davon besteht.
Kaugummizusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei das Monatin oder Salz davon im Wesentlichen aus S,S-Monatin oder Salz davon besteht.
Kaugummizusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei das Monatin oder Salz davon ein stereoisomer angereichertes R,R-Monatin oder Salz davon ist.
Kaugummizusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei das Monatin oder Salz davon ein stereoisomer angereichertes S,S-Monatin oder Salz davon ist.
Kaugummizusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei das Monatin oder Salz davon mindestens 95 % R,R-Monatin oder Salz davon umfasst.
Kaugummizusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei das Monatin oder Salz davon mindestens 95 % S,S-Monatin oder Salz davon umfasst.
Kaugummizusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei das Monatin oder Salz davon auf biosynthetischem Wege hergestellt wird.
Kaugummizusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei der lösliche Anteil ferner ein Cyclamat umfasst.
Kaugummizusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei der lösliche Anteil ferner Erythritol umfasst.
Kaugummizusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei alle Komponenten der Anteile natürlich sind.
Kaugummizusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei die Zusammensetzung biologisch abbaubar ist.
Kaugummizusammensetzung gemäß Anspruch 30, wobei die Zusammensetzung eine Komponente, gewählt aus Milchsäurecopolymeren, Proteinen, Jelutong, Perillo, Sorva, Massaranduba balata, Massaranduba-Schokolade, Nispero, Rosindinha, Chicle, Gutta hang kang, Arabinogalactan, Guar, Xanthan und einer Kombination davon, umfasst.
Kaugummizusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei die Zusammensetzung nicht-kariogen ist.
Kaugummizusammensetzung, umfassend einen Gummigrundstoffanteil und einen löslichen Anteil, wobei der lösliche Anteil eine stereoisomer angereicherte Monatinmischung umfasst, wobei die Monatinmischung auf einem biosynthetischen Wege hergestellt wird.
Kaugummizusammensetzung gemäß Anspruch 33, wobei der biosynthetische Weg ein mehrstufiger Weg ist und mindestens ein Schritt des mehrstufigen Wegs eine chemische Umwandlung ist.
Kaugummizusammensetzung gemäß Anspruch 33, wobei die Mischung vorwiegend R,R-Monatin oder Salz davon ist.
Kaugummizusammensetzung gemäß Anspruch 33, wobei die Mischung vorwiegend S,S-Monatin oder Salz davon ist.
Kaugummizusammensetzung, umfassend einen Gummigrundstoffanteil und einen löslichen Anteil, wobei der lösliche Anteil eine auf einem biosynthetischen Weg hergestellte Monatin-Zusammensetzung umfasst und wobei die Monatin-Zusammensetzung keine petrochemischen, toxischen oder gefährlichen Verunreinigungen enthält.
Kaugummizusammensetzung, umfassend einen Gummigrundstoffanteil und einen löslichen Anteil, wobei der lösliche Anteil Monatin oder Salz davon umfasst, wobei das Monatin oder Salz davon auf einem biosynthetischen Weg hergestellt wird und von einer rekombinanten Zelle isoliert wird, und wobei die rekombinante Zelle keine petrochemischen, toxischen oder gefährlichen Verunreinigungen enthält.
Kaugummizusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei der Gummigrundstoffanteil 3 bis 50 Gew.-% eines Elastomers; 0,5 bis 25 Gew.-% eines Weichmachers; 2 bis 30 Gew.-% eines Emulgators; 5 bis 75 Gew.-% eines Harzes; und 0 bis 20 Gew.-% eines Füllstoffs umfasst.
Kaugummizusammensetzung gemäß Anspruch 39, wobei das Elastomer aus der Gruppe, bestehend aus einem Naturkautschuk, einem Naturgummi und einem synthetischen Elastomer, gewählt wird.
Kaugummizusammensetzung gemäß Anspruch 40, wobei der Naturkautschuk aus der Gruppe, bestehend aus Rauchlatex, Flüssiglatex und Guayule, gewählt wird.
Kaugummizusammensetzung gemäß Anspruch 40, wobei das Naturgummi aus der Gruppe, bestehend aus Jelutong, Perillo, Sorva, Massaranduba balata, Massaranduba-Schokolade, Nispero, Rosindinha, Chicle und Gutta hang kang, gewählt wird.
Kaugummizusammensetzung gemäß Anspruch 40, wobei das synthetische Elastomer aus der Gruppe, bestehend aus Butadien-Styrol-Copolymeren, Isobutylen-Isopren-Copolymeren, Polybutadien, Polyisobutylen und polymeren Vinylelastomeren, gewählt wird.
Kaugummizusammensetzung gemäß Anspruch 39, wobei der Weichmacher eines oder mehrere aus Talg, hydriertem Talg, hydrierten Pflanzenölen, teilweise hydrierten Pflanzenölen, Kakaobutter, Glycerolmonostearat, Glyceroltriacetat, Lecithin, Monoglyceriden, Diglyceriden, Triglyceriden, acetylierten Monoglyceriden und Fettsäuren umfasst.
Kaugummizusammensetzung gemäß Anspruch 39, wobei der Füllstoff eines oder mehrere aus Lecithin, Inulin, Polydextrin, Calciumcarbonat, Magnesiumcarbonat, Magnesiumsilikat, gemahlenem Kalkstein, Aluminiumsilikat, Talk, Ton, Aluminiumoxid, Titandioxid und Calciumphosphat umfasst.
Kaugummizusammensetzung gemäß Anspruch 39, wobei der Emulgator Glycerolmonostearat, Lecithin, Polyglycerolpolyricinolsäure oder Magnesiumstearat ist.
Kaugummizusammensetzung gemäß Anspruch 39, wobei das Harz ein Kolophoniumester, ein Terpenharz, Polyvinylacetat, Polyvinylalkohol, Ethylenvinylacetat oder Vinylacetat-Vinyllaurat-Copolymer ist.
Kaugummizusammensetzung gemäß Anspruch 47, wobei der Harzester ein Glycerolester von teilweise hydriertem Kolophonium, ein Glycerolester von polymerisiertem Kolophonium, ein Glycerolester von teilweise dimerisiertem Kolophonium, ein Glycerolester von Kolophonium, ein Pentaerythritolester von teilweise hydrier tem Kolophonium, ein Methylester von Kolophonium oder ein Methylester von teilweise hydriertem Kolophonium ist.
Kaugummizusammensetzung gemäß Anspruch 39, wobei der Emulgator und der Weichmacher verschiedene Verbindungen sind.
Kaugummizusammensetzung gemäß Anspruch 39, wobei der Emulgator und Füllstoff verschiedene Verbindungen sind.
Kaugummizusammensetzung gemäß Anspruch 39, wobei der Weichmacher und Füllstoff verschiedene Verbindungen sind.
Kaugummizusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei der lösliche Anteil ferner einen Massensüßstoff umfasst.
Kaugummizusammensetzung gemäß Anspruch 52, wobei der Massensüßstoff ein Maissüßstoff, Sucrose, Dextrose, Invertzucker, Dextrin, Fructose, Levulose, Stärkezuckersirup-Feststoffe aus Mais, Galactose, Trehalose, Isomaltulose oder eine Kombination davon ist.
Kaugummizusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei der lösliche Anteil ferner einen intensitätsstarken Süßstoff oder Kohlenhydrat mit einem niedrigeren glykämischen Anteil umfasst.
Kaugummizusammensetzung gemäß Anspruch 54, wobei der intensitätsstarke Süßstoff oder das Kohlenhydrat mit einem niedrigeren glykämischen Anteil aus Sorbitol, Mannitol, Maltitol, hydrierten Stärkehydrolysaten, Xylitol, Alitam, Thaumatin, Sucralose, Aspartam, Acesulfam K, einem Dihydrochalkon, Saccharin, Neotam, einem Cyclamat, Steviosid, Mogrosid, Tagatose, Erythritol, Isomalt, Lactitol, Glycyrrhizin, Phyllodulcin, Monellin, Mabinlin, Brazzein, Curculin, Miraculin und Pentadin gewählt wird.
Kaugummizusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei der lösliche Anteil ferner einen Aromastoff umfasst.
Kaugummizusammensetzung gemäß Anspruch 56, wobei der Aromastoff ein essenzielles Öl, ein Frucht-Aromastoff, ein synthetischer Aromastoff oder eine Kombination hiervon ist.
Kaugummizusammensetzung gemäß Anspruch 57, wobei das essenzielle Öl Pfefferminzöl, Spearmintöl oder Öl von Wintergrün ist.
Kaugummizusammensetzung gemäß Anspruch 57, wobei der Aromastoff ein Frucht-Aromastoff ist.
Kaugummizusammensetzung gemäß Anspruch 59, wobei der Frucht-Aromastoff Extrakt, Essenz oder Öl von Zitrone, Limette, Orange, Mandarine, Grapefruit, Citrusfrucht, Kumquat, Banane, Kirsche, Apfel, Ananas, Weintraube, Erdbeere, Tuttifrutti, Wassermelone oder Kombinationen hiervon umfasst.
Kaugummizusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei das Monatin oder Salz davon eine Mischung von R,R- oder S,S-Monatin oder Salz davon ist.
Kaugummizusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei der lösliche Anteil eine Mischung von Monatin oder Salz davon und Acesulfam K umfasst.
Kaugummizusammensetzung gemäß Anspruch 62, wobei die Zusammensetzung etwa 0,1 bis etwa 1,1 Gew.-% S,S-Monatin oder Salz davon und etwa 0,1 bis etwa 0,3 Gew.-% Acesulfam K umfasst.
Kaugummizusammensetzung gemäß Anspruch 62, wobei die Zusammensetzung etwa 0,05 bis etwa 0,7 Gew.-% S,S-Monatin oder Salz davon und etwa 0,01 bis etwa 0,2 Gew.-% Acesulfam K umfasst.
Kaugummizusammensetzung gemäß Anspruch 62, wobei die Zusammensetzung etwa 0,009 bis etwa 0,1 Gew.-% R,R-Monatin oder Salz davon und etwa 0,01 bis etwa 0,3 Gew.-% Acesulfam K umfasst.
Kaugummizusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei das Monatin oder Salz davon verkapselt ist.
Kaugummizusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei der Gummigrundstoffanteil 15 bis 30 Gew.-% der Zusammensetzung ausmacht.
Kaugummizusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei der lösliche Anteil ferner einen Massensüßstoff, einen intensitätsstarken Süßstoff oder Kohlenhydrat mit einem niedrigeren glykämischen Anteil und einen Aromastoff umfasst.
Verfahren zur Herstellung einer Kaugummizusammensetzung, umfassend Monatin oder Salz davon, wobei das Verfahren die Herstellung von Monatin oder Salz davon aus mindestens einem Substrat, gewählt aus Glucose, Tryptophan, Indol-3-milchsäure, Indol-3-pyruvat und dem Monatinvorläufer, umfasst.
Verfahren zur Herstellung einer Kaugummizusammensetzung, umfassend Monatin oder Salz davon, wobei das Verfahren die Herstellung von Monatin oder Salz davon auf einem biosynthetischen Wege umfasst.
Verfahren zur Herstellung einer Kaugummizusammensetzung, umfassend Monatin oder Salz davon, wobei das Verfahren die Herstellung von Monatin oder Salz davon unter Anwendung von wenigstens einer biologischen Umwandlung umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 69, wobei das Verfahren ferner das Kombinieren des Monatins oder Salzes davon mit mindestens einem anderen Bestandteil, welcher nicht Monatin oder Salz davon ist, umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 72, wobei die Kaugummizusammensetzung etwa 0 bis etwa 1,1 Gew.-% S,S-Monatin oder Salz davon und etwa 0 bis etwa 0,1 Gew.-% R,R-Monatin oder Salz davon umfasst.
Verfahren zur Herstellung einer Kaugummizusammensetzung, umfassend eine Monatinzusammensetzung, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: (a) Herstellen von Monatin oder von Salz davon auf einem biosynthetischen Weg in einer rekombinanten Zelle; (b) Isolieren der Monatin-Zusammensetzung von der rekombinanten Zelle, wobei die Monatin-Zusammensetzung aus Monatin oder Salz davon und anderem essbaren oder trinkbaren Material besteht.
Verfahren zur Herstellung einer Kaugummizusammensetzung, umfassend Monatin oder Salz davon und mindestens einen anderen Bestandteil, gewählt aus Erythritol, Trehalose, Sorbitol, Mannitol, Maltitol, Xylitol, Alitam, Thaumatin, Sucralose, Aspartam, Acesulfam K, einem Dihydrochalkon, Saccharin, Neotam, einem Cyclamat, Steviosid, Mogrosid, Tagatose, Isomalt, Lactitol, Glycyrrhizin, Phyllodulcin, Monellin, Mabinlin, Brazzein, Curculin, Miraculin und Pentadin.