JP2007502117A - モナチンを含有するチューインガムとその製造法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、モナチン(monatin)を含んでなる機能的ガムまたは風船ガムを含む新規チューインガム組成物、およびかかる組成物の製造法に関する。本発明はまた、特定のモナチン立体異性体を含むチューインガム組成物、モナチン立体異性体の特定の混合物、および/またはインビボ(例えば細胞内)もしくはインビトロで生合成経路により産生されるモナチンに関する。
本出願は、2003年8月14日に出願された米国仮特許出願第60/495,191号(これは文献によりその全体が本明細書に組み込まれる)の利益を請求する。
小児肥満、II型糖尿病、および関連疾患に対する健康意識の高まりにより、低カロリーの強力な甘味剤の使用が増加している。すなわち、グラニュー糖(ショ糖)のような従来の甘味剤よりはるかに強い甘みを有する甘味剤に対する需要がある。多くの強力甘味剤は、不快な異臭および/または予想外の好ましくない甘味プロフィールを含む。これらの問題を克服するために、業界ではショ糖に似た甘みプロフィールを達成するための、苦み抑制剤、異臭隠蔽技術、および甘味剤混合物に対する多くの研究が続いている。
本発明は、下記式:
モナチン産生のための生合成経路の概説
用語と方法の以下の説明は、本開示をより詳細に説明し、本開示の実施において当業者を助けるように提供される。本明細書において「含む」は「含んでなる」を意味する。さらに単数形「a」または「an」または「the」は、特に明記しない場合は複数形も含む。本明細書において「チューインガム」はすべてのタイプのチューインガムに言及し、機能性ガムおよび風船ガムを含む。「機能性ガム」は、少なくとも1つの機能的または医学的成分を含むチューインガムを意味する。例えば機能性ガムは薬物(例えばニコチン、アスピリン、または乗り物酔い治療薬(例えば、ジメンヒドリネート))、または栄養物質(例えばビタミンおよび/またはミネラル))、または化粧品成分(例えば、歯の白化および/または息清涼化成分)を与えることができる。
多くの生物はグルコースからトリプトファンを合成することができる。グルコースおよび/またはトリプトファンからモナチン、MP、および/またはインドール-3-ピルビン酸を産生するのに必要な遺伝子を含有する構築体を、かかる生物中にクローニングすることができる。トリプトファンはモナチンに変換できることが本明細書で証明される。
トリプトファンをインドール-3-ピルビン酸に変換するのにいくつかのポリペプチドを使用することができる。ポリペプチドの例には、特に限定されないが、酵素分類(EC)2.6.1.27、1.4.1.19、1.4.99.1、2.6.1.28、1.4.3.2、1.4.3.3、2.6.1.5、2.6.1.-、2.6.1.1、および2.6.1.21のメンバーがある。これらのクラスには特に限定されないが、トリプトファンアミノ転移酵素と呼ぶポリペプチド(L-フェニルアラニン-2-オキソグルタル酸アミノ転移酵素、トリプトファントランスアミナーゼ、5-ヒドロキシトリプトファン-ケトグルタル酸トランスアミナーゼ、ヒドロキシトリプトファンアミノ転移酵素、L-トリプトファンアミノ転移酵素、L-トリプトファントランスアミナーゼ、およびL-トリプトファン:2-オキソグルタル酸アミノ転移酵素とも呼ばれる)、これはL-トリプトファンおよび2-オキソグルタル酸をインドール-3-ピルビン酸とL-グルタミン酸に変換する;D-トリプトファンアミノ転移酵素、これはD-トリプトファンと2-オキソ酸をインドール-3-ピルビン酸とアミノ酸に変換する;トリプトファン脱水素酵素(NAD(P)-L-トリプトファン脱水素酵素、L-トリプトファン脱水素酵素、L-Trp-脱水素酵素、TDHおよびL-トリプトファン:NAD(P)酸化還元酵素(脱アミノ化)とも呼ばれる)、これはL-トリプトファンとNAD(P)をインドール-3-ピルビン酸とNH3およびNAD(P)Hに変換する;D-アミノ酸脱水素酵素、これはD-アミノ酸とFADをインドール-3-ピルビン酸とNH3およびFADH2に変換する;トリプトファン-フェニルアラニントランスアミナーゼ(L-トリプトファン-α-ケトイソカプロン酸アミノ転移酵素およびL-トリプトファン:フェニルピルビン酸アミノ転移酵素とも呼ばれる)、これはL-トリプトファンとフェニルピルビン酸をインドール-3-ピルビン酸とL-フェニルアラニンに変換する;L-アミノ酸酸化酵素(オフィオ-アミノ酸酸化酵素およびL-アミノ酸:酸素酸化還元酵素(脱アミノ化)とも呼ばれる)、これはL-アミノ酸およびH2OおよびO2を2-オキソ酸およびNH3およびH2O2に変換する;D-アミノ酸酸化酵素(オフィオ-アミノ酸酸化酵素およびD-アミノ酸:酸素酸化還元酵素(脱アミノ化)とも呼ばれる)、これはD-アミノ酸およびH2OおよびO2を2-オキソ酸およびNH3およびH2O2に変換する;およびトリプトファン酸化酵素、これはL-トリプトファンおよびH2OおよびO2をインドール-3-ピルビン酸およびNH3およびH2O2に変換する。これらのクラスはまた、チロシン(芳香族)アミノ転移酵素、アスパラギン酸アミノ転移酵素、D-アミノ酸(またはD-アラニン)アミノ転移酵素、および広域(多基質)アミノ転移酵素を含有し、これらは複数のアミノ転移酵素活性を有し、その一部はトリプトファンと2-オキソ酸とインドール-3-ピルビン酸とアミノ酸に変換することができる。
インドール-3-乳酸をインドール-3-ピルビン酸に変換する反応は、種々のポリペプチド(例えば1.1.1.110、1.1.1.27、1.1.1.28、1.1.2.3、1.1.1.222、1.1.1.237、1.1.3.-、または1.1.1.111クラスのポリペプチドのメンバー)により触媒される。1.1.1.110クラスのポリペプチドには、インドール乳酸脱水素酵素(インドール乳酸:NAD+酸化還元酵素とも呼ばれる)がある。1.1.1.27、1.1.1.28および1.1.2.3クラスには、乳酸脱水素酵素(乳酸脱水素酵素、乳酸塩:NAD+酸化還元酵素とも呼ばれる)。1.1.1.222クラスは、(R)-4-ヒドロキシフェニル乳酸脱水素酵素(D-芳香族乳酸脱水素酵素、R-芳香族乳酸脱水素酵素、およびR-3-(4-ヒドロキシフェニル)乳酸:NAD(P)+2-酸化還元酵素とも呼ばれる)を含み、1.1.1.237クラスは、3-(4-ヒドロキシフェニルピルビン酸)還元酵素(ヒドロキシフェニルピルビン酸還元酵素および4-ヒドロキシフェニル乳酸:NAD+酸化還元酵素とも呼ばれる)を含む。1.1.3.-クラスは乳酸酸化酵素を含み、1.1.1.111クラスは(3-イミダゾール-5-イル)乳酸脱水素酵素((S)-3-(イミダゾール-5-イル)乳酸:NAD(P)+酸化還元酵素とも呼ばれる)を含む。これらのクラスのポリペプチドのいくつかのは、インドール-3-乳酸からのインドール-3-ピルビン酸の産生を可能にする。本変換の例は実施例2に提供される。
いくつかの公知のポリペプチドを使用して、インドール-3-ピルビン酸をMPに変換することができる。ポリペプチドクラスの例には、4.1.3.-、4.1.3.16、4.1.3.17、および4.1.2.-がある。これらのクラスは、炭素−炭素シンターゼ/リアーゼ(例えば2つのカルボン酸基質の変換を触媒するアルドラーゼ)がある。ポリペプチドクラスEC4.1.3.-は、求電子体としてオキソ酸基質(例えばインドール-3-ピルビン酸)を使用して炭素−炭素結合を形成するシンターゼ/リアーゼであり、EC4.1.2.-は、求電子体としてアルデヒド基質(例えばベンズアルデヒド)を使用して炭素−炭素結合を形成するシンターゼ/リアーゼである。
MPからモナチンへの変換は以下の1つ以上により触媒することができる:トリプトファンアミノ転移酵素(2.6.1.27)、トリプトファン脱水素酵素(1.4.1.19)、D-アミノ酸脱水素酵素(1.4.99.1)、グルタミン酸脱水素酵素(1.4.1.2-4)、フェニルアラニン脱水素酵素(EC1.4.1.20)、トリプトファン−フェニルピルビン酸トランスアミナーゼ(2.6.1.28)、またはより一般的にアミノ転移酵素ファミリー(2.6.1.-)のメンバー、例えばアスパラギン酸アミノ転移酵素(EC2.6.1.1)、チロシン(芳香族)アミノ転移酵素(2.6.1.5)、D-トリプトファンアミノ転移酵素、またはD-アラニン(2.6.1.21)アミノ転移酵素(図2)。アミノ転移酵素クラスの11個のメンバーは後述され(実施例1)、配列番号11と12に示すクラスの新規メンバーを含み、アミノ転移酵素および脱水素酵素の活性を証明する反応を実施例7に示す。
インドール-3-ピルビン酸、MP、および/またはモナチンを作製するのにどのポリペプチドが使用されるかに依存して、生成物生成を増強させるために産生株に補助因子、基質、および/または追加のポリペプチドを提供することができる。さらに遺伝子修飾を設計して、インドール-3-ピルビン酸、MP、および/またはモナチンのような生成物の産生を増強することができる。同様にモナチン産生に使用される宿主細胞を最適化することができる。
過酸化水素(H2O2)は、生成した場合、産生細胞、産生されるポリペプチドまたは生成物(例えば、中間体)を傷害する可能性がある。上記のL-アミノ酸酸化酵素はH2O2を生成物として産生する。従ってL-アミノ酸酸化酵素が使用されるなら、生じるH2O2を除去しそのレベルを低下させて、細胞または生成物への傷害の可能性を低下させるすることができる。
図1に示すように、PLPは本明細書に記載の生合成工程の1つ以上で使用することができる。PLPの濃度は、PLPが反応の全体効率の律速にならないように補足することができる。
トリプトファナーゼ反応は、アンモニアをより利用し易くし水を除去することにより、合成方向(インドールからトリプトファンの合成)に向かわせることができる。例えばグルタミン酸脱水素酵素により触媒されるような還元アミノ化反応はまた、過剰のアンモニウムにより前進させられる。
トリプトファンアミノ転移酵素を介するトリプトファンからインドール-3-ピルビン酸への変換は、グルタミン酸を産生し同時基質である2-オキソグルタル酸(α-ケトグルタル酸)を必要とするため、インドール-3-ピルビン酸の産生速度に悪影響を与える。グルタミン酸は、アミノ転移酵素の阻害を引き起こし、反応は多量の同時基質を消費する。さらにグルタミン酸の高濃度は下流の分離プロセスに有害である。
トリプトファン前駆体の産生を上昇させるかおよび/またはインドール-3-ピルビン酸および/またはトリプトファンが関与する分解経路を改変することにより、インドールプールを調節することができる。例えば、インドール-3-ピルビン酸からのインドール-3-酢酸の産生は、宿主細胞中のEC4.1.1.74をコードする遺伝子を機能的に欠失させることにより低下または排除することができる。トリプトファンからのインドールの産生は、宿主細胞中のEC4.1.99.1をコードする遺伝子を機能的に欠失させることにより低下または排除することができる。あるいは過剰のインドールを、EC4.1.99.1をコードする増加した量の遺伝子(Kawasakiら、J. Ferm. and Bioeng., 82:604-6, 1996)と組合せて、インビトロまたはインビボプロセスの基質として利用することができる。さらに遺伝子修飾を行って、D-エリトロース-4-リン酸およびコリスミ酸のような中間体のレベルを上昇させることができる。
モナチンの味プロフィールは、その立体化学(キラリティ)を制御することにより改変できる。例えば異なる食物系について異なる混合物の濃度中で、異なるモナチン立体異性体が好ましい。キラリティは、pHとポリペプチドの組合せを介して制御することができる。
本明細書に開示の反応にホスホエノールピルビン酸(PEP)のようなリン酸化基質を使用することができる。リン酸化基質はエネルギー的により好ましく、従って反応速度および/または収率を上昇させるのに使用することができる。アルドール縮合では、リン酸基の付加は求核性基質のエノール互変異性を安定化させ、こうしてより反応性にする。他の反応ではリン酸化基質は良好な脱離基を提供する。同様に基質は、CoA誘導体またはピロリン酸誘導体への変換により活性化することができる。
モナチンのS,S立体異性体はショ糖より重量で約50〜200倍甘い。モナチンのR,R立体異性体はショ糖より重量で約2000〜2400倍甘い。モナチンの甘味は甘味比較法(試験甘味溶液は、一連の標準溶液の1つに対して甘味強度を一致させる)により熟練した官能評価者を使用して計算される。
ガム基剤の組成は典型的には、ガムがチューインガムであるか、風船ガムであるか、または機能性ガムであるかを決定する。ある実施態様においてガム基剤は不活性で非栄養性であり、以下の成分の組合せから作製される:エラストマー、軟化剤(可塑剤)、乳化剤、樹脂、および充填剤。組成物内の成分は一般に食物等級であると考えられ、一般に安全(GRAS)であるか、および/または米国食品医薬品局(FDA)認可されている。エラストマーはガムにゴム様の粘性を与え、例えば1つ以上の天然ゴム(例えば、スモークラテックス、液体ラテックス、およびグアユールゴム)、天然ガム、または合成エラストマーを含む。ある実施態様において天然ガムは、ジェルトン、ペリロ、ソルバ、マッサランズババラタ、マッサランズバチョコレート、ニスペロ、ロシンヂンハ、チクル、およびグッタハンカンを含む。例えばチクルは特に有用な天然ガムである。別の実施態様において合成エラストマーは、ブタジエン−スチレン共重合体、イソブチレン−イソプレン共重合体、ポリブタジエン、ポリイソブチレン、およびビニルポリマー性エラストマーを含む。ある実施態様においてエラストマーはガム基剤中に3〜70wt%(例えば、ガム基剤の3〜60wt%、3〜50wt%、5〜45wt%、10〜50wt%、15〜45wt%、または20〜40wt%)の範囲の量で存在し、その範囲内の特定の値を含む(例えば、3、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、または65wt%)。
本発明のある実施態様においてチューインガム組成物の可溶性部分は、モナチン以外に、バルク甘味剤、軟化剤、強力甘味剤、風味剤、着色剤、アジュバント、充填剤、機能性ガムの成分(例えばニコチン)、またはこれらの組合せを含む。例えばバルク甘味剤は、こくと粘度ならびに所望のレベルの甘味を提供するのに使用することができる。ある実施態様においてバルク甘味剤は、糖有りと糖無しの両方があり、低血糖性炭水化物成分を含み、チューインガムのチューインガム組成物の約5〜95wt%(例えば、20〜80wt%、または30〜60wt%)を構成する。別の実施態様において糖甘味剤には、ショ糖、デキストロース(例えばセレロース(Cerelose)デキストロース)、マルトース、デキストリン、乾燥転化糖、フルクトース、高フルクトースコーンシロップ、レブロース、ガラクトース、コーンシロップ固体などの単独または組合せがある。無糖の甘味剤および低血糖性炭水化物成分には特に限定されないが、タガトース、および糖アルコール、例えばソルビトール、マンニトール、キシリトール、ラクチトール、エリスリトール、マルチトール、水素化デンプン加水分解物、イソマルト、トレハロースなどの単独または組合せがある。
チューインガム組成物は公知の方法を使用して調製することができる。一般にチューインガムは、当該分野で公知の市販のミキサー(例えばシグマ(sigma)ブレードミキサー)に種々のチューインガム成分を順に加えることにより製造することができる。例えば米国特許第5,334,397号および5,800,848号を参照されたい。成分を完全に混合した後、ガムの塊をミキサーから出して、例えばシート中でころがしてスティック状に切断するか、塊中に押しだすか、またはペレットまたは錠剤に成形することにより、所望の形に成形することができる。種々のチューインガムおよび風船ガムの形が可能であり、例えばスティック、塊、錠剤、中央充填、ボール、果実形、タバコ形、コイン、チューブガム、および圧縮粉末ガムがある。
トリプトファンアミノ転移酵素のクローニングと発現
本例は、トリプトファンをインドール-3-ピルビン酸に変換するのに使用できるトリプトファンアミノ転移酵素をクローニングする方法を記載する。
アミノ転移酵素をコードする11個の遺伝子を大腸菌(E.coli)中にクローニングした。これらの遺伝子は、枯草菌(Bacillus subtilis)D-アラニンアミノ転移酵素(dat、ジーンバンク(GenBank)受け入れ番号Y14082.1 bp28622-29470、およびジーンバンク(GenBank)受け入れ番号NP_388848.1、それぞれ核酸配列とアミノ酸配列)、シノリゾビウム・メリロチ(Sinorhizobium meliloti)(リゾビウム・メリロチ(Rhizobium meliloti)とも呼ばれる)チロシンアミノ転移酵素(tatA、配列番号1と2、それぞれ核酸配列とアミノ酸配列)、ロードバクター・スフェロイデス(Rhodobacter sphaeroides)2.4.1株チロシンアミノ転移酵素(tatA、相同性により確認される、配列番号3と4、それぞれ核酸配列とアミノ酸配列)、アール・スフェロイデス(R. sphaeroides)35053チロシンアミノ転移酵素(相同性により確認される、配列番号5と6、それぞれ核酸配列とアミノ酸配列)、リーシュマニア・メージャー(Leishmania major)広域基質アミノ転移酵素(bsat、エル・メキシカーナ(L. mexicana)からのペプチド断片との相同性により確認される、配列番号7と8、それぞれ核酸配列とアミノ酸配列)、枯草菌(Bacillus subtilis)芳香族アミノ転移酵素(araT、相同性により確認される、配列番号9と10、それぞれ核酸配列とアミノ酸配列)、ラクトバシルス・アミロボルス(Lactobacillus amylovorus)芳香族アミノ転移酵素(araT、相同性により確認される、配列番号11と12、それぞれ核酸配列とアミノ酸配列)、アール・スフェロイデス(R. sphaeroides)35053 多基質アミノ転移酵素(相同性により確認される、配列番号13と14、それぞれ核酸配列とアミノ酸配列)、ロードバクター・スフェロイデス(Rhodobacter sphaeroides)2.4.1株多基質アミノ転移酵素(msa、相同性により確認される、ジーンバンク(GenBank)受け入れ番号AAAE01000093.1、bp14743-16155およびジーンバンク(GenBank)受け入れ番号ZP00005082.1、配列番号3と4、それぞれ核酸配列とアミノ酸配列)、大腸菌(Escherichia coli)アスパラギン酸アミノ転移酵素(aspC、ジーンバンク(GenBank)受け入れ番号AE000195.1 bp2755-1565およびジーンバンク(GenBank)受け入れ番号AAC74014.1、それぞれ核酸配列とアミノ酸配列)、および大腸菌(E.coli)チロシンアミノ転移酵素(tyrB、配列番号31と32、それぞれ核酸配列とアミノ酸配列)であった。遺伝子をクローニングし、発現させ、トリプトファンのインドール-3-ピルビン酸への変換活性について、市販の酵素とともに試験した。すべての11個のクローンは活性があった。
NCBI(ナショナルセンター・フォー・バイオテクノロジーインフォメーション(National Center for Biotechnology Information))データベース中の遺伝子は、トリプトファンアミノ転移酵素と指定されたものはなかった。しかしこの酵素活性を有する生物が同定されている。L-トリプトファンアミノ転移酵素(TAT)活性は、以下の供給源からの細胞抽出物または精製タンパク質で測定されている:フェスツカ・オクトフローラ(Festuca octoflora)からのリゾバクテリア分離株、エンドウマメのミトコンドリアとサイトゾル、ヒマワリのクラウンゴール細胞、リゾビウム・レグミノサルム(Rhizobium leguminosarum)次亜種トリフォリ(trifoli)、エルウィニア・ヘルビコーラ(Erwinia herbicola)pvジプソフィリー(gypsophilae)、シュードモナス・シリンジー(Pseudomonas syringae)pv.サバスタノイ(savastanoi)、アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)、アゾスピリルム・リプフェルム(Azospirillum lipferum)とブラシレンス(brasilense)、エンテロバクター・クロアカエ(Enterobacter cloacae)、エンテロバクター・アグロメランス(Enterobacter agglomerans)、ブラディリゾビウム・エルカニイ(Bradyrhizobium elkanii)、カンジダ・マルトーサ(Candida maltosa)、アゾトバクター・ビネランヂイ(Azotobacter vinelandii)、ラット脳、ラット肝臓、シノリゾビウム・メリロチ(Sinorhizobium meliloti)、シュードモナス・フルオレセンス(Pseudomonas fluorescens)CHA0、ラクトコッカス・ラクティス(Lactococcus lactis)、ラクトバシルス・カゼイ(Lactbacullus casei)、ラクトバシルス・ヘルベチクス(Lactbacullus helveticus)、コムギ実生、オオムギ、ファセオルス・アウレウス(Phaseolus aureus)(ヤエナリ(mung bean))、サッカロミセス・ウバルム(Saccharomyces uvarum)(カールスベルゲンシス(carlsbergensis))、リーシュマニア(Leishmania)種、トウモロコシ、トマト苗条、エンドウマメ植物、タバコ、ブタ、クロストリジウム・スポロゲネス(Clostridium sporogenes)、およびストレプトミセス・グリセウス(Streptomyces griseus)。
インドール-3-乳酸からインドール-3-ピルビン酸への変換
図1と3に示すようにインドール-3-乳酸を使用してインドール-3-ピルビン酸を製造することができる。乳酸とピルビン酸の間の変換は、インドール-3-ピルビン酸とインドール-3-乳酸との変換のように可逆的反応である。インドール乳酸の酸化は典型的には、インドール-3-ピルビン酸からの340nmでの多量のバックグランドにより起きる。
L-アミノ酸酸化酵素を使用するL-トリプトファンからインドール-3-ピルビン酸への変換
本例は、実施例1に記載したトリプトファンアミノ転移酵素を使用する代わりとして、酸化酵素(EC1.4.3.2.)を介してトリプトファンをインドール-3-ピルビン酸に変換するのに使用される方法を記載する。L-アミノ酸酸化酵素は、クロタルス・ヅリスス(Crotalus durissus)から精製された(シグマ(Sigma)、セントルイス、ミズーリ州、カタログ番号A-2805)。分子クローニングのためのL-アミノ酸酸化酵素の受け入れ番号は以下を含む:CAD21325.1、AAL14831、NP_490275、BAB78253、A38314、CAB71136、JE0266、T08202、S48644、CAC00499、P56742、P81383、O93364、P81382、P81375、S62692、P23623、AAD45200、AAC32267、CAA88452、AP003600、およびZ48565。
アルドラーゼを用いるインドール-3-ピルビン酸の2-ヒドロキシ2-(インドール-3-イルメチル)-4-ケトグルタル酸(MP)への変換
本例は、アルドラーゼ(リアーゼ)を使用してインドール-3-ピルビン酸をMPに変換するのに使用できる方法を記載する(図2)。アルドール縮合は、アルデヒドまたはケトンのβ炭素と他のアルデヒドまたはケトンのカルボニル炭素との間で炭素−炭素結合を生成する反応である。1つの基質のカルボニル基に隣接する炭素上にカルボアニオンが形成され、第2の基質のカルボニル炭素(求電子性炭素)を攻撃する求核体として機能する。より一般的には求電子性基質はアルデヒドであり、従ってほとんどのアルドラーゼはEC4.1.2.-分類に分類される。求核性基質はしばしばピルビン酸である。アルドラーゼが2つのケト酸または2つのアルデヒド間の縮合を触媒することは、あまり一般的ではない。
4-ヒドロキシ-4-メチル-2-オキソグルタル酸ピルビン酸リアーゼ(ProAアルドラーゼ、EC4.1.3.17)と4-ヒドロキシ-2-オキソグルタル酸グリオキザル酸リアーゼ(KHGアルドラーゼ、EC4.1.3.16)は、図2のアルドラーゼ反応に非常によく似た反応を触媒する。pET30 Xa/LICベクター(ノバゲン(Novagen)、マジソン、ウィスコンシン州)のための適合性のあるオーバーハングを有するプライマーを設計した。
シー・テストステロニ(C. testosteroni)proAとエス・メリロチ(S. meliloti)SMc00502遺伝子構築体はいずれも、IPTGで誘導すると高レベルの発現を有した。総タンパク質と細胞抽出試料をSDS-PAGE分析により測定すると、組換えタンパク質は高度に可溶性であった。シー・テストステロニ(C. testosteroni)遺伝子生成物を>95%の純度まで精製した。ヒス−バインド(His-Bind)カートリッジを使用して親和性精製した後は、エス・メリロチ(S. meliloti)遺伝子生成物の収率は非常に低かったため、酵素アッセイ用に細胞抽出物を使用した。
枯草菌(B. subtilis)と大腸菌(E.coli)のkhg遺伝子構築体はいずれも、IPTGで誘導すると高レベルの発現を有したが、エス・メリロチ(S. meliloti)のkhgは低レベルの発現を有した。総タンパク質と細胞抽出物をSDS-PAGE分析により判断すると、組換えタンパク質は高度に可溶性であった。枯草菌(B. subtilis)と大腸菌(E.coli)のkhg遺伝子生成物を>95%の純度まで精製した;ヒス−バインド(His-Bind)カートリッジを使用して親和性精製した後はエス・メリロチ(S. meliloti)遺伝子生成物の収率はそれほど高くなかった。
触媒性抗体は、天然のアルドラーゼのように効率的であり、広範囲の基質を受容し、図2に示す反応を触媒するのに使用することができる。
モナチン前駆体の化学合成
実施例4は、インドール-3-ピルビン酸をMPに変換するためのアルドラーゼの使用を記載した。本例は、MPを化学合成するための代替法を記載する。MPは典型的なアルドール型縮合を使用して生成される(図4)。簡単に説明すると、典型的なアルドール型反応は、LDA(リチウムジイソプロピルアミド)、リチウムヘキサメチルジシラザンまたはブチルリチウムのような強い塩基を使用してピルビン酸エステルのカルボアニオンの生成を含む。生成されるカルボアニオンはインドール−ピルビン酸と反応して共役生成物を形成する。
トリプトファンまたはインドール-3-ピルビン酸のモナチンへの変換
2つの酵素(アミノ転移酵素とアルドラーゼ)を利用するインビトロ法は、トリプトファンとピルビン酸からモナチンを産生した。第1の工程でアルファケトグルタル酸は、インドール-3-ピルビン酸とグルタミン酸を生成するアミノ転移反応でトリプトファンからのアミノ基のアクセプターであった。アルドラーゼは第2の反応を触媒し、ここでピルビン酸はMg2+とリン酸塩の存在下でインドール-3-ピルビン酸と反応し、モナチン(MP)のアルファケトグルタル酸である2-ヒドロキシ2-(インドール-3-イルメチル)-4-ケトグルタル酸を生成した。第1の反応で生成したグルタミン酸からアミノ基の移動は、所望の生成物であるモナチンを産生した。生成物の精製と性状解析により、生成された立体異性体はS,Sモナチンであることが確定された。代替基質、酵素、および条件、ならびにこのプロセスを可能にした改良が記載される。
コマモナス・テストステロニ(Comamonas testosteroni)からアルドラーゼ、4−ヒドロキシ-4-メチル-2-オキソグルタル酸ピルビン酸リアーゼ(ProAアルドラーゼ、proA遺伝子)(EC4.1.3.17)が、実施例4に記載のようにクローニングされ、発現され、精製された。枯草菌(B. subtilis)、大腸菌(E.coli)、およびエス・メリロチ(S. meliloti)から4−ヒドロキシ-2-ケトグルタル酸グリオキシル酸リアーゼ(KHGアルドラーゼ)(EC4.1.3.16)が、実施例4に記載のようにクローニングされ、発現され、精製された。
反応混合物は、1リットル中に50mM 酢酸アンモニウム(pH8.0)、4mM MgCl2、3mM リン酸カリウム、0.05mM リン酸ピリドキサール、100mM ピルビン酸アンモニウム、50mM トリプトファン、10mM アルファケトグルタル酸、160mgの組換えシー・テストステロニ(C. testosteroni)ProAアルドラーゼ(未精製細胞抽出物、約30%アルドラーゼ)、233mgの組換え大腸菌(E.coli)L-アスパラギン酸アミノ転移酵素(未精製細胞抽出物、約40%アミノ転移酵素)を含有した。酵素以外のすべての成分は一緒に混合し、トリプトファンが溶解するまで30℃でインキュベートした。次に酵素を加え、反応溶液を30℃で静かに振盪(100rpm)しながら3.5時間インキュベートした。酵素添加の0.5時間と1時間後に、固体トリプトファンのアリコート(各50mmol)を反応物に加えた。添加したトリプトファンのすべてが溶解することはなかったが、濃度は50mMまたはそれ以上に維持した。3.5時間後、固体トリプトファンをろ別した。標準物質として規定量のトリプトファンを使用してLC/MSにより反応混合物を分析すると、溶液中のトリプトファンの濃度は60.5mMであり、モナチンの濃度は5.81mM(1.05g)であることが証明された。
得られた生成物を以下の方法を使用して性状解析した。
酵素的に産生したモナチンのUV/可視スペクトル測定は、キャリー100バイオ(Cary 100 Bio)UV/可視分光光度計を使用して行った。水に溶解した精製した生成物は、288nmにショルダーを有して280nmで吸収極大を示し、これはインドール含有化合物に典型的な特徴である。
インビトロの生化学的反応から得られたモナチンの混合物の分析は、実施例10に記載のように行った。インビトロの酵素合成混合物中のモナチンの典型的なLC/MS分析を図5に示す。図5の下のパネルは、m/z=293のモナチンのプロトン化分子イオンの選択されたイオンクロマトグラムを示す。混合物中のモナチンの同定は、図6に示す質量スペクトルにより確認された。LC/MSによる精製生成物の分析は、293の分子イオンと280nmでの吸収を有する単一のピークを示した。この質量スペクトルは図6に示したものと同じであった。
実施例10に記載のようなLC/MS/MS娘イオン実験をモナチンについても行った。モナチンの娘イオン質量スペクトルを図7に示す。図7に記載のすべての断片イオンの一時的構造割り当てを行った。これらには、m/z=275(293-H2O)、257(293-(2×H2O))、230(275-COOH)、212(257-COOH)、168(3-ブタ-1,3-ジエニル-1H-インドールカルボニウムイオン)、158(1H-インドール-3-カルボアルデヒドカルボニウムイオン)、144(3-エチル-1H-インドールカルボニウムイオン)、130(3-メチレン-1H-インドールカルボニウムイオン)、および118(インドールカルボニウムイオン)の断片イオンを含む。これらの多くは、分子のインドール部分から得られる場合に予測されるように、MP(実施例4)について得られたものと同じである。ケトンの代わりにアミノ基が存在するために、いくつかのものはMPで見られるものより1質量単位大きい。
図8は、アプライドバイオシステムズ−パーキンエルマー(Applied Biosystems-Perkin Elmer)キュースター(Q-Star)ハイブリッド四極子/飛行時間型質量スペクトル計を使用して得られた質量スペクトルを示す。内部質量較正基準としてトリプトファンを使用したプロトン化モナチンの測定された質量は293.1144であった。元素組成C14H17N2O5に基づいてプロトン化モナチンの計算された質量は、293.1137であった。これは、2百万分率(ppm)未満の測定誤差であり、酵素的に産生されたモナチンの元素組成の決定的な証拠を提供する。
バリアニノーバ(Varian Inova)500MHz装置でNMR実験を行った。モナチンの試料(約3mg)を0.5mlのD2Oに溶解した。まず溶媒(D2O)を4.78ppmで内部標準として使用した。水のピークは大きいため、水のピークを抑制して1H NMRを行った。次に水のピークが広いため、モナチンのC-2プロトンを参照ピークとして使用し、公表された7.192ppmの値に設定した。
インビトロで産生されたモナチンが1つの立体異性体であり、(R,R)や(S,S)エナンチオマーの混合物ではないことを確立するために、実施例10に記載の装置を使用してキラルLC/MS分析を行った。
旋光度はルドルフオートポル(Rudolph Autopol)III旋光計を使用して測定した。モナチンは14.6mg/mlの水溶液として調製した。S,Sモナチン(塩型)の予測される比旋光度([α]D 20)は1g/mlの水溶液について-49.6である(ブレガー(Vleggaar)ら)。観察された[α]D 20は、精製されている酵素的に産生されたモナチンについて-28.1であり、これがS,S立体異性体であることを示す。
反応条件(試薬と酵素濃度を含む)を最適化し、以下の試薬ミックスを使用して5〜10mg/mlの収率が得られた:50mM 酢酸アンモニウム(pH8.3)、2mM MgCl2、200mM ピルビン酸塩(ナトリウムまたはアンモニウム塩)、5mM アルファケトグルタル酸塩(ナトリウム塩)、0.05mM リン酸ピリドキサール、酵素添加後に1mlの最終容量を達成するために脱気した水、3mM リン酸カリウム、50μg/mlの組換えProAアルドラーゼ(細胞抽出物:総タンパク質濃度 167μg/ml)、大腸菌(E.coli)aspC遺伝子によりコードされた1000μg/mlのL-アスパラギン酸アミノ転移酵素(細胞抽出物;総タンパク質濃度 2500μg/ml)、および>60mMの濃度を得るための固体トリプトファン(飽和;一部は反応の間溶解しなかった)。静かに攪拌または混合しながら混合物を30℃で4時間インキュベートした。
アルファケトグルタル酸塩の濃度を1mMに低下させ、9mMのアスパラギン酸を補足して、同等の収率のモナチンが得られた。最初の工程で代替アミノ酸アクセプター(例えばオキサロ酢酸)を使用することができる。
MPとモナチンとの相互変換
モナチンを生成するためのMPのアミノ化は、実施例1と6に記載のようなアミノ転移酵素、またはNADHもしくはNADPHのような還元性補助因子を必要とする脱水素酵素により触媒することができる。これらの反応は可逆性であり、いずれの方向にも測定することができる。脱水素酵素を使用する時は、方向性は大体アンモニウム塩の濃度により制御することができる。
モナチンのオキシダーゼ脱アミノ化は、NAD(P)+がより発色性のNAD(P)Hに変換される時の340nmの吸光度の上昇により追跡した。モナチンが酵素的に産生され、実施例6に記載のように精製した。
モナチンアミノ転移酵素アッセイを、大腸菌(E.coli)のアスパラギン酸アミノ転移酵素(AspC)、大腸菌(E.coli)のチロシンアミノ転移酵素(TyrB)、エル・メージャー(L. major)の広域基質アミノ転移酵素(BSAT)、および実施例1に記載の市販のブタグルタミン酸−オキサロ酢酸アミノ転移酵素を用いて行った。オキサロ酢酸とアルファケトグルタル酸の両方をアミノアクセプターとして試験した。アッセイ混合物は(0.5ml中)50mM トリス塩酸(pH8.0)、0.05mM PLP、5mM アミノアクセプター、5mM モナチン、および25mM アミノ転移酵素を含有した。アッセイを30℃で30分間インキュベートし、0.5mlのイソプロピルアルコールを加えて反応を停止させた。モナチンの消失をLC/MSにより追跡した(実施例10)。エル・メージャー(L. major)BSATでアルファケトグルタル酸をアミノアクセプターとして使用して最も高い活性が観察され、次に高い活性が同じ酵素でアルファケトグルタル酸をアミノアクセプターとして使用して観察された。オキサロ酢酸を用いる相対活性は以下の通りである:BSAT>AspC>ブタIIa型>ブタI型=TyrB。アルファケトグルタル酸を用いる相対活性は以下の通りである:BSAT>AspC>ブタI型>ブタIIa型>TyrB。
トリプトファンとピルビン酸以外のC3源とからのモナチンの産生
上記実施例6に記載したように、インドール-3-ピルビン酸またはトリプトファンはピルビン酸をC3分子として使用することによりモナチンに変換することができる。しかしある場合には、ピルビン酸は好適な原料ではない。例えばピルビン酸は他のC3炭素源より高価であり、培地に加えられた場合発酵に悪影響を与えることがある。アラニンは多くのPLP酵素によりアミノ転移されてピルビン酸を産生する。
モナチンの化学合成
インドール-3-ピルビン酸へのアラニンの添加はモナチンを産生させ、この反応は、グリニャール試薬または有機リチウム試薬を用いて合成的に行うことができる。例えばカルボキシル基およびアミノ基が適切にブロックされた3-クロロまたは3-ブロモ-アラニンに、無水条件下でマグネシウムを加える。次にインドール-3-ピルビン酸(適切にブロックされている)を加えて共役生成物を形成し、次に保護基を除去してモナチンを生成する。特に有用な保護基には、容易に結合および除去できるTHP(テトラヒドロピラニルエーテル)がある。
トリプトファン、モナチン、およびMPの検出
本例は、モナチン、またはその前駆体2-ヒドロキシ2-(インドール-3-イルメチル)-4-ケトグルタル酸の存在を検出するのに使用される方法を記載する。
インビトロまたはインビボで生化学的反応により得られたモナチン、MP、および/またはトリプトファンの混合物の分析は、クロマトグラフ装置とマイクロマスクアトロウルチマ(Micromass Quattro Ultima)3重の四極子質量スペクトル計の間で位置するウォーターズ(Waters)996フォトダイオードアレイ(PDA)吸光度モニターを有するウォーターズ(Waters)2690液体クロマトグラフ装置を含むウォーターズ/マイクロマス(Waters/Micromass)液体クロマトグラフィータンデム質量スペクトル(LC/MS/MS)装置を使用して行った。LC分離は、スペルコディスカバリー(Supelco Discovery)C18逆相クロマトグラフィーカラム(2.1mm×150mm)またはゼテラ(Xterra)MS C8逆相クロマトグラフィーカラム(2.1mm×250mm)を使用して室温で行った。LC移動相は、A)0.05(v/v)トリフルオロ酢酸を含有する水;B)0.05(v/v)トリフルオロ酢酸を含有するメタノールからなった。
以下のようにLC/MS/MS娘イオン実験を行った。娘イオン分析は、第1の質量アナライザー(Q1)から質量スペクトル計の衝突セルへの目的の親イオン(例えばモナチンについてm/z=293)の透過を含み、ここでアルゴンが導入され、親イオンを断片(娘)イオンに化学的に分解する。これらの断片は次に第2の質量アナライザー(Q2)により検出され、親の構造割り当てを確認するために使用することができる。トリプトファンは、m/z=205の透過と断片化により同じ方法で性状解析し定量された。
インビトロまたはインビボ反応で得られたモナチンとトリプトファンの混合物の高スループット分析(<5分間/試料)を、上記の装置とLC/MS/MSについて記載したものと同じパラメータを使用して行った。LC分離は、4.6mm×50mmのアドバンストセパレーションズテクノロジーズ(Advanced Separations Technologies))キロビオティックT(Chirobiotic T)を使用して室温で行った。LC移動相は、A)0.25(v/v)酢酸を含有する水;B)0.25(v/v)酢酸を含有するメタノールからなった。均一溶媒溶出は50%Bで0〜5分間行った。流速は0.6ml/分であった。ESI-MS/MSシステムのすべてのパラメータは、トリプトファンと内部標準物質2H5-トリプトファンのプロトン化分子イオンの最適ソース内生成、ならびに多重反応モニタリング(MRM)実験のアミノ酸特異的断片イオンの衝突誘導性産生に基づいて、最適化され選択された。陽性イオン多重反応モニタリング(mrm)モードでモナチンとトリプトファンのLC/MS/MS分析について、以下の装置パラメータを使用した:毛細管:3.5kV;コーン電圧:20V;Hex1:15V;アパチャー:1V;Hex2;0V;ソース温度:100℃;脱溶媒温度:350℃;脱溶媒ガス:500L/h;コーンガス:40L/h;低質量分解能(Q1):12.0;高質量分解能(Q1):12.0;イオンエネルギー:0.2;入り口:-5V;衝突エネルギー:14;出口:1V;低質量分解能(Q2):15;高質量分解能(Q2):15;イオンエネルギー(Q2):0.5;マルチプライヤー:650。MRMパラメータ:チャネル間遅延:0.03s;スキャン間遅延:0.03s;滞留:0.05s。
高分解能MS分析は、アプライドバイオシステムズ−パーキンエルマー(Applied Biosystems-Perkin Elmer)キュースター(Q-Star)ハイブリッド四極子/飛行時間型質量スペクトル計を使用して行った。プロトン化モナチンの測定された質量は、内部質量較正基準としてトリプトファンを使用した。プロトン化モナチンの計算された質量は元素組成C14H17N2O5に基づいて293.1137であった。例Aに記載した生物触媒プロセスを使用して産生されたモナチンの測定質量は293.1144を示した。これは、2百万分率(ppm)未満の測定誤差であり、酵素的に産生されたモナチンの元素組成の決定的な証拠を提供する。
細菌中のモナチンの産生
本例は、大腸菌(E.coli)細胞中でモナチンを産生するのに使用した方法を記載する。他の細菌細胞でモナチンを産生するのに同様の方法が使用できることを、当業者は理解するであろう。さらに、モナチン合成経路(図2)中の他の遺伝子を含有するベクターを使用することができる。
酵母中のモナチンの産生
本例は、真核細胞中でモナチンを産生するのに使用される方法を記載する。当業者は、任意の目的の細胞中でモナチンを産生するのに同様の方法が使用できることを理解するであろう。さらに、本例に記載したもの以外に、またはこの代わりに、他の遺伝子を使用することができる(例えば、図2に記載のもの)。
共役反応を使用する酵素的方法の改良
理論的には、基質もしくは中間体の複反応もしくは分解が起きないなら、図1に記載の酵素反応から生成される生成物の最大量は、各反応の平衡定数とトリプトファンとピルビン酸の濃度に正比例する。トリプトファンは可溶性が高くない基質であり、200nMを超えるピルビン酸の濃度は収率に負の影響を有するようである(実施例6を参照)。
図11は反応の例示である。トリプトファンオキシダーゼとカタラーゼは、インドール-3-ピルビン酸産生の方向に反応を向けるのに使用される。逆方向に反応したりまたは酵素や中間体を傷害する過酸化水素が利用できないようにするために、カタラーゼは過剰で使用される。カタラーゼ反応中に酸素が再生される。あるいはインドール-3-ピルビン酸が基質として使用できる。
リジンイプシロンアミノ転移酵素(L-リジン6-トランスアミナーゼ)は、ロードコッカス(Rhodococcus)、マイコバクテリウム(Mycobacterium)、ストレプトミセス(Streptomyces)、ノカルディア(Nocardia)、フラボバクテリム(Flavobacterium)、カンジダ・ユティリス(Candida utilis)、およびストレプトミセス(Streptomyces)を含むいくつかの微生物で見いだされる。これはいくつかのベータラクタム抗生物質の産生の第1工程として生物により利用される(RiusとDemain、J. Microbiol. Biotech. 7:95-100, 1997)。この酵素は、アルファケトグルタル酸をアミノアクセプターとして使用してリジンのC-6のPLP介在アミノ転移により、リジンをL-2-アミノアジペート6-セミアルデヒド(アリシン)に変換する。アリシンは不安定であり、自発的に分子内分解を受けて1-ピペリデイン6-カルボキシレート(環状分子)を生成する。これは逆反応が起きることを有効に阻害する。この反応スキームを図12に示す。代替酵素であるリジン−ピルビン酸6-アミノ転移(EC2.6.1.71)も使用できる。
図13に示すようにトリプトファンまたはインドール-ピルビン酸からのモナチンの収率を改良することができる。ギ酸脱水素酵素(EC1.2.1.2または1.2.1.43)は一般的な酵素である。いくつかのギ酸脱水素酵素はNADHを必要とし、他はNADPHを利用する。グルタミン酸脱水素酵素は前の例で、アンモニウムベースの緩衝液を使用してモナチン前駆体とモナチンとの相互変換を触媒した。ギ酸アンモニウムとギ酸脱水素酵素の存在は補助因子の再生のための効率的なシステムであり、二酸化炭素の産生は逆反応速度を低下させるための効率的な方法である(Bommariusら、Biocatalysis 10:37, 1994およびGalkinら、Appl. Environ. Microbiol. 63:4651-6, 1997)。さらに多量のギ酸アンモニウムを反応緩衝液に溶解することができる。グルタミン酸脱水素酵素反応(または同様の還元アミノ化)により産生されるモナチンの収率は、ギ酸脱水素酵素とギ酸アンモニウムの添加により改良することができる。
表6に記載の成分を使用して、イチゴ風味のチューインガム組成物が調製される。アセスルフェムKとモナチンのS,S立体異性体の代わりにモナチンのR,R立体異性体を使用することができる。
以下はモナチンを含むチューインガム組成物のいくつかの調製物例、ならびに組成物を加工する方法の例である。
200g ガム基剤
340g ソルビトール粉末(セレスター(Cerestar)P16616)
7g チョーク
3.6g マルチトールシロップ(80brixに濃縮したセレスター(Cerestar)16303)
2g メントール
1.5g S,Sモナチン
200g ガム基剤
340g ソルビトール粉末(セレスター(Cerestar)P16616)
7g チョーク
3.6g マルチトールシロップ(80brixに濃縮したセレスター(Cerestar)16303)
2g メントール
0.05g R,Rモナチン
200g ガム基剤
340g ソルビトール粉末(セレスター(Cerestar)P16616)
7g チョーク
3.6g マルチトールシロップ(80brixに濃縮したセレスター(Cerestar)16303)
2g メントール
0.038g S,Sモナチン
0.038g R,Rモナチン
320g ガム基剤
400g ソルビトール粉末(セレスター(Cerestar)P16616)
100g マルチトールシロップ(セレスター(Cerestar)16303)
40g マンニトール(セレスター(Cerestar)16700)
10g イソマルト
14g メントール
18g ミント風味
1g S,Sモナチン
1g アセスルフェムK
0.075g R,Rモナチン
200g ガム基剤
400g ソルビトール(結晶性)
46g マルチトールシロップ(80%ds)
2%イチゴ風味+0.02% R,Rモナチンを加える。
211g 無糖ガム基剤
420g ソルビトール
14g グリセロール
2%イチゴ風味+0.02% S,Sモナチン+0.015% R,Rモナチンを加える。
270g ガム基剤
340g ソルビトール
34g ソルビトールシロップ(70%ds)
2%風味+0.15% S,Sモナチン+0.05% R,Rモナチンを加える。
300g ガム基剤
550g ソルビトール
100g ソルビトールシロップ
49.5g グリセリン
0.5g S,Sモナチン
ガム基剤は押出しにより加工され、水浴に入れて冷却され固化される。約1/2cm×1/2cmのペレットを使用するまで保存する。ペレットをZブレンダー(高剪断力)を使用して混合し、温度が最大60℃まで達し、混合物を軟化させる。まだガム基剤中に無いなら、タルカムを加える。結晶性甘味剤(例えばソルビトール)と軟化剤/可塑剤(例えば液体ソルビトール、液体マルチトール、またはグリセロール)を、段階的に交互に攪拌しながら加えて、ブレンダーのモーターが加熱するのを防ぐ。風味剤、着色剤、および甘味剤を加え、混合する。混合物をブレンダーから取り出し、典型的なバッチサイズは数百kgである。混合物を押しだし機から押出すと、これはガムをホモジナイズし成形する。シートに平らにし、切断し、切片をスティックガムとして包装するか、ペレット化ガムとしてコーティングする。
調製物の例
1. ガム基剤を電子レンジ中で前加熱し、次にZブレードミキサーに加え、柔らかく曲げやすくなるまで混合する。
2. 電子レンジ中でソルビトール溶液とグリセリンを50℃に加熱する。
3. すべての残りの成分をZブレードに加える。20分混合し、ミックスの温度を5分毎にチェックする。
4. 混合が完了後、ミキサーからガムを取り出し、1.5mmの厚さまで広げる。タルクを散布し、切断し、包装する。
R,RモナチンまたはR,Rモナチン/エリスリトール組合せを含むモナチン調製物を、氷冷したお茶中の他の公知の甘味剤(アスパルタームとスクラロース)に対して評価した。評価した主要な官能パラメータは、甘味品質、あと味、苦み、およびそのあと味である。定性的評価を行った。
氷冷お茶調製物を開発して甘味剤性能を評価した(表7)。
アスパルターム 0.0450%(w/v)
スクラロース 0.0170%(w/v)
R,Rモナチン 0.0030, 0.0035, 0.0040%(w/v)+1g マルトデキストリン
R,Rモナチン/エリスリトール 0.0030, 0.0035, 0.0040%(w/v)+1g エリスリトール
氷冷お茶飲料の評価は、熟練官能評価者のパネル(n=6)により行った。これらの評価の結果を表8に要約する。
モナチンは、甘味剤調製物の予想外の性能の利点(明瞭な官能利点)を示した。氷冷茶および特に酸性化茶(すなわちレモンを有する)では、モナチンはレモン風味を増強した。この利点は、低濃度のエリスリトールの添加によりさらに増強され、これは風味をバランスさせて丸め、甘味剤の開始時間を速めた。飲料(例えば茶)では、モナチンは改良された官能性(例えば、あと味が少ない、異味が少ない)、および/または溶解度と安定性を改良した。氷冷茶を甘くするのに使用されるモナチンは、ほぼ0カロリーを含み、これは氷冷茶を甘くするのに使用される茶さじ2杯分のショ糖中の32カロリーとは対照的である。
緒言
モナチン、アスパルタームおよびスクラロースで個別に甘くしたチューインガムをミント味のスティック型で調製した。ガムをイソスイートに調製し、甘味のスティックガムフォーマットで調製した。ガムを調製してイソ甘味とし、甘味味と甘味性質と甘味の時間−強度の品質について評価した。
この評価で使用した調製物を表9に示す。記載のようにすべての3つのガム調製物について標準的製造法を採用した。
・ガム基剤を40〜45℃に前加熱し、次にZブレードミキサーに加え、混合する。
・ソルビトール粉末を篩にかける。
・ソルビトールの部分を取り出し、甘味剤をその部分に分散させ、完全に混合する。
・甘味剤/ソルビトールミックスを、ソルビトール粉末の残りのブロックに戻し、完全に混合する。
・リカシン(lycasin)とグリセロールをボウルに混合し、50℃に前加熱する。
・ソルビトール粉末を、ガム基剤を含有するZブレードミキサーに加える。
・リカシン(lycasin)/グリセロールと風味剤とをZブレードに加え、20分混合する。
・Zブレードミキサーからガムを取り出す。
・機械的ローラーを使用して厚さ1.5mmに巻く。
・比率3g タルク対100gガム中のタルクで散布する。
・スティックを19mm×73mmにスティックを切断する。
・個々のスティックを箔に包む。
チューインガム組成物は、すべてがチューインガムの正式な官能評価(時間/強度パラメータを含む)に経験豊かな熟練官能評価者(n=4)のパネルにより評価された。ガム風味と甘味の定性的および一時的特性を評価した。
モナチンとサッカリンの甘味を、20人の熟練官能評価者を使用して、判定を二重測定で評価した。試験溶液と参照溶液をクエン酸/クエン酸塩緩衝液(pH3.2)で調製した。図16を参照されたい。サッカリンと比較してR,R/S,Sモナチンのより直線的な応答は、より糖のような味の放出に一致する。10%SEVより上のプラトーは「混合物を抑制する」異味およびあと味が無いか/低レベルであることを示す。モナチンの用量応答曲線の形は、アスパルターム、スクラロース、およびアリテーム(これらのすべてが「高品質」甘味剤である)と似ている。
合成モナチンの試料を25℃、50℃、および100℃でpH3に付した。室温かつpH3で48時間にわたってモナチンの14%の消失が観察された。この消失はラクトン生成が原因であった。50℃でpH3では、48時間にわたってモナチンの23%の消失が観察された。この消失はラクトン生成と約15.5分後の未知の化合物の蓄積が原因であった。100℃とpH3では、24時間後にほとんどすべてのモナチンが消失した。15.5分に大きな検出可能な成分は未知であった。
pH2.5、3.0、4.0で調製され40℃で保存されたモナチン溶液の官能安定性を、100日間追跡した。これらの溶液からの甘味の消失を、同一条件下で調製し保存したアスパルターム溶液からの甘味の消失と比較した。
pH2.5 リン酸(75%溶液)0.127%(w/v)
三ナトリウムクエン酸1水和物 0.005%(w/v)
pH3.0 リン酸(75%溶液)0.092%(w/v)
三ナトリウムクエン酸1水和物 0.031%(w/v)
pH4.0 リン酸(75%溶液)0.071%(w/v)
三ナトリウムクエン酸1水和物 0.047%(w/v)
試料調製−約50〜75μgの凍結乾燥物質をマイクロ遠心分離管に入れた。ここに1.0mlのHPLCグレードのメタノールを加えた。溶液を30分間ボルテックス混合し、遠心分離し、上清のアリコートを分析のためにとった。
時間(分) 0 9 16 20 21
0.05% TFA A% 95 65 10 10 95
メタノール、0.05% TFA B% 5 35 90 90 5
流速 ml/分 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25
pH7の75ppmモナチンの100ml溶液をストック溶液として使用した。合成モナチン試料は96%の2R,4R/2S,4Sエナンチオマー対と4%の2R,4S/2S,4Rエナンチオマー対を含有した。試料を80℃でpH7で実験の時間中インキュベートし、0、1、2、3、4時間目と1、2、4、7、14、21および35日目に試料を取った。すべての実験条件は二重測定で行った。
合成モナチンの両方の有向ジアステレオ異性体ピークについて応答曲線を確立した。DI水に溶解した合成モナチン標準物質で5〜150ppmの範囲の限界を定めた。2つのジアステレオ異性体ピークの分離は、3.9×150mmのノバパック(Novapak)C18(ウォーターズ社(Waters, Corporation))HPLCカラムを使用して行った。検出と定量のために紫外線−可視(UV)と質量スペクトル(MS)検出器を直列で使用した。モナチンとそのラクトンピークはそれぞれ279nmでUVmaxを有し、これは正確な検出を助けた。定量は、陽性イオン電子噴霧モードで293.3m/zと275.3m/zの選択されたイオンモニタリング(SIM)スキャンを獲得することにより行った。
中性pHでは、モナチンの分解の程度は7〜35日後でも無視できるものであった。1次副産物は環化とおそらく非常に低レベルのラセミ化であるため、経時的なモナチンの消失はpHに大きく依存した。80℃でpH7で実験中に、定量のためにLC-MSを使用することにより得られる正確性の限界内でラセミRR/SSモナチンまたはそのラクトンの濃度の変化は検出されなかった。中性pHでのモナチンの熱安定性のために、他の強力甘味剤(例えばアスパルターム)と比較して、モナチンはガム加工温度で適当な安定性を有し、チューインガム組成物中で長い半減期を有すると予測される。
Claims (75)
- ガム基剤部分と可溶性部分とを含むチューインガム組成物であって、当該可溶性部分はモナチンまたはその塩を含む、前記組成物。
- 前記組成物の量は、モナチンまたはその塩の代わりにショ糖を含有する同じ量のチューインガム組成物より、少ないカロリーと炭水化物とを含む、請求項1のチューインガム組成物。
- モナチンまたはその塩を含むチューインガム組成物であって、当該モナチンまたはその塩は、チューインガム組成物中にモナチンまたはその塩の代わりの他の強力甘味剤と比較して、長期の甘味と明らかなまたは増強された風味を与える量で存在する、前記組成物。
- 前記他の強力甘味剤は、アスパルタームまたはスクラロースから選択される、請求項3のチューインガム組成物。
- モナチンまたはその塩により与えられる増強された長期の甘味を有するモナチンで甘くしたチューインガム組成物の製造法であって、
(a)生合成経路を介してモナチンまたはその塩を産生するステップ;
(b)当該モナチンまたはその塩を他の成分と組合せるステップ;および
(c)チューインガム組成物を生成するステップ、
をむ、前記方法。 - モナチンまたはその塩を含むチューインガム組成物であって、当該モナチンまたはその塩は増強された長期の甘味を与える量で存在する、前記組成物。
- 前記モナチンまたはその塩は、アスパルタームまたはスクラロースと比較して、長期の甘味を与える量で存在する、請求項1のチューインガム組成物。
- 前記可溶性部分は柑橘類風味をさらに含む、請求項1のチューインガム組成物。
- 前記可溶性部分は柑橘類風味をさらに含み、かつ前記モナチンまたはその塩は柑橘類風味により提供される風味を増強する量で存在する、請求項1のチューインガム組成物。
- 前記組成物は、約0.001〜約1.1wt%のモナチンまたはその塩を含む、請求項1のチューインガム組成物。
- 前記組成物は、S,Sモナチンまたはその塩を実質的に含まない、請求項10のチューインガム組成物。
- 前記組成物は、R,Rモナチンまたはその塩を実質的に含まない、請求項10のチューインガム組成物。
- 前記組成物は、約0.009〜約0.1wt%のR,Rモナチンまたはその塩を含む、請求項1のチューインガム組成物。
- 前記組成物は、約0.015〜約0.025wt%のR,Rモナチンまたはその塩を含む、請求項13のチューインガム組成物。
- 組前記成物は、約0.1〜約1.1wt%のS,Sモナチンまたはその塩を含む、請求項1のチューインガム組成物。
- 前記組成物は、約0.15〜約0.88wt%のS,Sモナチンまたはその塩を含む、請求項15のチューインガム組成物。
- 前記組成物は、約0〜約1.1wt%のS,Sモナチンまたはその塩と、約0〜約0.1wt%のR,Rモナチンまたはその塩とを含有する、請求項1のチューインガム組成物。
- 組成物は、約0.1wt%以下のR,Rモナチンまたはその塩を含み、かつS,S、S,R、またはR,Sモナチンまたはその塩を実質的に含まない、請求項1のチューインガム組成物。
- 組成物は、約1.1wt%またはそれ以下のS,Sモナチンまたはその塩を含み、かつR,R、S,R、またはR,Sモナチンまたはその塩を実質的に含まない、請求項1のチューインガム組成物。
- 前記モナチンまたはその塩は、基本的にR,Rモナチンまたはその塩からなる、請求項1のチューインガム組成物。
- 前記モナチンまたはその塩は、基本的にS,Sモナチンまたはその塩からなる、請求項1のチューインガム組成物。
- 前記モナチンまたはその塩は、立体異性体的に過剰のR,Rモナチンまたはその塩を含む、請求項1のチューインガム組成物。
- 前記モナチンまたはその塩は、立体異性体的に過剰のS,Sモナチンまたはその塩を含む、請求項1のチューインガム組成物。
- 前記モナチンまたはその塩は、少なくとも95%のR,Rモナチンまたはその塩を含む、請求項1のチューインガム組成物。
- 前記モナチンまたはその塩は、少なくとも95%のS,Sモナチンまたはその塩を含む、請求項1のチューインガム組成物。
- 前記モナチンまたはその塩は生合成経路により産生される、請求項1のチューインガム組成物。
- 前記可溶性部分はシクラメートをさらに含む、請求項1のチューインガム組成物。
- 前記可溶性部分はエリスリトールをさらに含む、請求項1のチューインガム組成物。
- 前記部分のすべての成分は天然のものである、請求項1のチューインガム組成物。
- 前記組成物は生体分解性である、請求項1のチューインガム組成物。
- 前記組成物は、乳酸共重合体、タンパク質、ジェルトン、ペリロ、ソルバ、マッサランズババラタ、マッサランズバチョコレート、ニスペロ、ロシンヂンハ、チクル、グッタハンカン、アラビノガラクタン、アラビアゴム、キサンタン、またはこれらの組合せから選択される成分を含む、請求項30のチューインガム組成物。
- 前記組成物は非う食原生(non-cariogenic)である、請求項1のチューインガム組成物。
- ガム基剤部分と可溶性部分とを含むチューインガム組成物であって、当該可溶性部分は立体異性体的に過剰のモナチン混合物を含み、かつ当該モナチン混合物は生合成経路により産生される、前記組成物。
- 前記生合成経路は多工程経路であり、かつ多工程経路の少なくとも1つの工程は化学的変換である、請求項33のチューインガム組成物。
- 前記混合物は主にR,Rモナチンまたはその塩である、請求項33のチューインガム組成物。
- 前記混合物は主にS,Sモナチンまたはその塩である、請求項33のチューインガム組成物。
- ガム基剤部分と可溶性部分とを含むチューインガム組成物であって、当該可溶性部分は生合成経路により製造されるモナチン組成物を含み、かつ当該モナチン組成物は石油化学的、毒性の、または有害な汚染物質を含有しない、上記組成物。
- ガム基剤部分と可溶性部分とを含むチューインガム組成物はであって、ここで可溶性部分はモナチンまたはその塩を含み、モナチンまたはその塩は、生合成経路により産生され、組換え細胞から単離され、当該組換え細胞は石油化学的、毒性の、または有害な汚染物質を含有しない、上記組成物。
- 前記ガム基剤部分は3〜50wt%のエラストマー;0.5〜25wt%の軟化剤;2〜30wt%の乳化剤;5〜75wt%の樹脂;および0〜20wt%の充填剤を含む、請求項1のチューインガム組成物。
- 前記エラストマーは、天然ゴム、天然ガム、および合成エラストマーよりなる群から選択される、請求項39のチューインガム組成物。
- 前記天然ゴムは、スモークラテックス、液体ラテックス、およびグアユールゴムから選択される、請求項40のチューインガム組成物。
- 前記天然ガムは、ジェルトン、ペリロ、ソルバ、マッサランズババラタ、マッサランズバチョコレート、ニスペロ、ロシンヂンハ、チクル、およびグッタハンカンよりなる群から選択される、請求項40のチューインガム組成物。
- 前記合成エラストマーは、ブタジエン−スチレン共重合体、イソブチレン−イソプレン共重合体、ポリブタジエン、ポリイソブチレン、およびビニルポリマー性エラストマーよりなる群から選択される、請求項40のチューインガム組成物。
- 前記軟化剤は、1つ以上のタロー、水素化タロー、水素化植物油、部分水素化植物油、ココアバター、モノステアリン酸グリセロール、トリ酢酸グリセロール、レシチン、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、アセチル化モノグリセリド、および脂肪酸を含む、請求項39のチューインガム組成物。
- 前記充填剤は、1つ以上のレシチン、イヌリン、ポリデキストリン、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム、ケイ酸マグネシウム、研摩石灰石、ケイ酸アルミニウム、タルク、粘土、アルミナ、二酸化チタン、およびリン酸カルシウムを含む、請求項39のチューインガム組成物。
- 前記乳化剤は、モノステアリン酸グリセロール、レシチン、ポリグリセロールポリリシノール酸、またはステアリン酸マグネシウムである、請求項39のチューインガム組成物。
- 前記樹脂は、ロジンエステル、テルペン樹脂、酢酸ポリビニル、ポリビニルアルコール、エチレン酢酸ビニル、または酢酸ビニル−ラウリル酸ビニル共重合体である、請求項39のチューインガム組成物。
- 前記ロジンエステルは、部分的水素化ロジンのグリセロールエステル、重合ロジンのグリセロールエステル、部分的ダイマー化ロジンのグリセロールエステル、ロジンのグリセロールエステル、部分的水素化ロジンのペンタエリスリトールエステル、ロジンのメチルエステル、または部分的水素化ロジンのメチルエステルである、請求項47のチューインガム組成物。
- 前記乳化剤と前記軟化剤とは異なる化合物である、請求項39のチューインガム組成物。
- 前記乳化剤と前記充填剤とは異なる化合物である、請求項39のチューインガム組成物。
- 前記軟化剤と前記充填剤とは異なる化合物である、請求項39のチューインガム組成物。
- 前記可溶性部分はバルク甘味剤をさらに含む、請求項1のチューインガム組成物。
- 前記バルク甘味剤は、トウモロコシ甘味剤、ショ糖、ブドウ糖、転化糖、デキストリン、フルクトース、レブロース、コーンシロップ固体、ガラクトース、トレハロース、イソマルツロース、またはこれらの組合せである、請求項52のチューインガム組成物。
- 前記可溶性部分は強力甘味剤または低血糖性炭水化物をさらに含む、請求項1のチューインガム組成物。
- 前記強力甘味剤または前記低血糖性炭水化物は、ソルビトール、マンニトール、マルチトール、水素化デンプン加水分解物、キシリトール、アリテーム、タウマチン、スクラロース、アスパルターム、アセスルフェムK、ジヒドロカルコン、サッカリン、ネオテーム、シクラメート、ステビオシド、モグロシド、タガトース、エリスリトール、イソマルト、ラクチトール、グリチルリチン、フィロヅルシン、モネリン、マビンリン、ブラゼイン、クルクリン、ミラクリン、およびペンタジンから選択される、請求項54のチューインガム組成物。
- 前記可溶性部分は風味剤をさらに含む、請求項1のチューインガム組成物。
- 前記風味剤は、精油、果実風味剤、合成風味、またはこれらの組合せである、請求項56のチューインガム組成物。
- 前記精油は、ペパーミント油、スペアミント油、またはウインターグリーン油である、請求項57のチューインガム組成物。
- 前記風味剤は果実風味剤である、請求項57のチューインガム組成物。
- 前記果実風味剤は、レモン、ライム、オレンジ、タンジェリン、グレープフルーツ、シトロン、キンカン、バナナ、サクランボ、リンゴ、パイナップル、ブドウ、イチゴ、トゥッティフルッティ、スイカ、またはこれらの組合せの、抽出物、エッセンスまたは油を含む、請求項59のチューインガム組成物。
- 前記モナチンまたはその塩は、R,RとS,Sモナチンまたはその塩の混合物である、請求項1のチューインガム組成物。
- 前記可溶性部分は、モナチンまたはその塩とアセスルフェムKとの混合物を含む、請求項1のチューインガム組成物。
- 前記組成物は、約0.1〜約1.1wt%のS,Sモナチンまたはその塩と約0.1〜約0.3wt%のアセスルフェムKとを含む、請求項62のチューインガム組成物。
- 前記組成物は、約0.05〜約0.7wt%のS,Sモナチンまたはその塩と約0.01〜約0.2wt%のアセスルフェムKとを含む、請求項62のチューインガム組成物。
- 前記組成物は、約0.009〜約0.1wt%のR,Rモナチンまたはその塩と約0.01〜約0.3wt%のアセスルフェムKとを含む、請求項62のチューインガム組成物。
- 前記モナチンまたはその塩は封入されている、請求項1のチューインガム組成物。
- 前記ガム基剤部分は15〜30wt%の組成物を含む、請求項1のチューインガム組成物。
- 前記可溶性部分は、バルク甘味剤、強力甘味剤、または低血糖性炭水化物、および風味剤をさらに含む、請求項1のチューインガム組成物。
- モナチンまたはその塩を含むチューインガム組成物の製造方法であって、グルコース、トリプトファン、インドール-3-乳酸、インドール-3-ピルビン酸、およびモナチン前駆体から選択される少なくとも1つの基質から、モナチンまたはその塩を製造することを含む、前記方法。
- モナチンまたはその塩を含むチューインガム組成物の製造方法であって、生合成経路を介してモナチンまたはその塩を製造することを含む、前記方法。
- モナチンまたはその塩を含むチューインガム組成物の製造方法であって、少なくとも1つの生物学的変換を使用してモナチンまたはその塩を製造することを含む、前記方法。
- 前記モナチンまたはその塩を、モナチンまたはその塩ではない少なくとも1つの他の成分と組合せるステップをさらに含む、請求項69の方法。
- 前記チューインガム組成物が、約0〜約1.1wt%のS,Sモナチンまたはその塩と、約0〜約0.1wt%のR,Rモナチンまたはその塩とを含む、請求項72の方法。
- モナチン組成物を含むチューインガム組成物の製造方法であって、(a)組換え細胞中で生合成経路を介してモナチンまたはその塩を製造するステップ;(b)当該組換え細胞から当該モナチン組成物を単離するステップ、を含み、ここで当該モナチン組成物はモナチンまたはその塩と他の食用または飲用の物質とからなる、前記方法。
- モナチンまたはその塩と、エリスリトール、トレハロース、ソルビトール、マンニトール、マルチトール、キシリトール、アリテーム、タウマチン、スクラロース、アスパルターム、アセスルフェムK、ジヒドロカルコン、サッカリン、ネオテーム、シクラメート、ステビオシド、モグロシド、タガトース、イソマルト、ラクチトール、グリチルリチン、フィロヅルシン、モネリン、マビンリン、ブラゼイン、クルクリン、ミラクリン、およびペンタジンから選択される少なくとも1つの他の成分とを含む、チューインガム組成物。
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