CN101223444B - 在体内分泌莫纳甜的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了在体内生产莫纳甜甜味剂的产品和方法。该产品包括经基因修饰以分泌莫纳甜或促进莫纳甜分泌的微生物；经基因修饰以生产莫纳甜的微生物；以及经基因修饰以同时分泌莫纳甜或促进莫纳甜分泌的微生物并生产莫纳甜的微生物。该方法包括在这种基因工程微生物中生产莫纳甜。

Description

在体内分泌莫纳甜的方法

发明背景 

发明领域

本发明一般涉及在体内生产莫纳甜(monatin)甜味剂的产品和方法。更具体地说，本发明涉及在体内分泌莫纳甜甜味剂的产品和方法。 

相关领域 

莫纳甜是一种具有以下化学结构的高强度甜味剂： 

莫纳甜包含两个手性中心从而导致四种可能的立体异构构型：R，R构型(“R，R立体异构体”或“R，R莫纳甜”)；S，S构型(“S，S立体异构体”或“S，S莫纳甜”)；R，S构型(“R，S立体异构体”或“R，S莫纳甜”)；以及S，R构型(“S，R立体异构体”或“S，R莫纳甜”)。本文中，除非另有说明，术语“莫纳甜”是指包含莫纳甜所有四种立体异构体的组合物、包含莫纳甜立体异构体任何组合的组合物(例如，仅包含莫纳甜的R，R和S，S立体异构体的组合物)以及单个同分异构形式。 

出于本公开的目的，莫纳甜的碳主链将如按上图所示编号，与醇基相连的碳被定义为2-位碳，而与氨基直接共价结合的碳被定义为4-位碳。因此，除非另有说明，文中提及R，R莫纳甜、S，S莫纳甜、R，S莫纳甜和S，R莫纳甜时分别表示：2R，4R莫纳甜、2S，4S莫纳甜、2R，4S莫纳甜和2S，4R莫纳甜。 

注意，在文献中，莫纳甜的碳主链也可能已经用另一种约定来编号，其中与醇基相连的碳被定义为4-位碳，而与氨基相连的碳被定义为4-位碳。因此，例如，本公开中提到的2S，4R莫纳甜与采用另一种编号约定的文献中的2R，4S莫纳甜是相同的。 

此外，由于存在各种命名约定，已知莫纳甜有许多可替换使用的化学名，其中包括：2-羟基-2-(吲哚-3-基甲基)-4-氨基戊二酸；4-氨基-2-羟基-2-(1H-吲哚-3-基甲基)-戊二酸；4-羟基-4-(3-吲哚基甲基)谷氨酸；和3-(1-氨基-1，3-二羧基-3-羟基-丁-4-基)吲哚。 

至少部分由于其甜味特征，具有莫纳甜的经济来源是理想的。在生长在南非德兰士瓦省地区的植物Schlerochiton ilicifolius的根树皮中可发现莫纳甜的某些同分异构形式。然而，干燥树皮中存在的莫纳甜的浓度以吲哚的酸性形式表示约为0.007质量％。见美国专利No.4,975,298。此外，在植物中生产莫纳甜的方法目前还是未知的。另一方面，美国专利申请号10/422,366(“’366申请”)中公开了在体内和体外生产莫纳甜的多肽、途径和微生物，该申请通过引用纳入本文。 

发明概述 

莫纳甜的产生被认为是一种平衡的过程。为使莫纳甜的产量超过平衡量，并且有可能使莫纳甜的生产更经济，从制备莫纳甜的反应中去除产物或者增加反应中所添加的底物的量是理想的。因此对于体内生产来说，以去除产物和促使平衡前进的方式从细胞中分泌莫纳甜是理想的。为本说明书之目的，术语“细胞”、“生物”和“微生物”可互换，除非特别指明，其中包括而不限于细菌、真菌如酵母和霉菌、藻类、原生动物、微生物和病毒。 

发明者已开发出一种利用转运蛋白从细胞中去除莫纳甜使之进入周围环境中的新方法，此前还不知道该转运蛋白可与莫纳甜相互作用。转运蛋白是细胞膜蛋白，它可促使某些溶质转运通过一层或多层细胞膜。例如，已对抗生素产生临床耐药性的某些种类的细菌可利用转运蛋白将药物或其他毒性物质泵出细胞膜而进入到介质中。这些流出(efflux)泵利用来自于ATP水解的能量或者利用质子动力势能来促使毒性物质外流。目前还未报道有野生型的微生物可以天然生产莫纳甜，同样此前也未报道可利用转运蛋白来分泌莫纳甜。 

根据一些实施方式，本发明提供了一种体内生产莫纳甜(即，莫纳甜的所有四种立体异构体或其亚型，其中包括单个同分异构形式)的方法，该方法包括利用一种或多种类型的转运系统将定位在细胞内的莫纳甜分泌出细胞使之进入到介质如培养基中。合适的转运系统的非限制性例子包括AcrAB系统、EmrAB系统和包含AcrAB或EmrAB同源物的系统。在一种情况中，莫纳甜是在一种微生物中产生的，并且其中至少有一部分可被微生物分泌出来，该微生物经基因修 饰以使其能够生产莫纳甜，其相应的野生型形式包含一种或多种能够分泌莫纳甜但是其自身不能生产莫纳甜的转运系统。在一种情况中，莫纳甜是在一种微生物中产生的，并且其中至少有一部分可被微生物分泌出来，该微生物在天然状态下能够生产莫纳甜，但是经过基因修饰以使其表达或过表达能够分泌莫纳甜的一种或多种转运系统或者转运系统的一种或多种组分。在一种情况中，莫纳甜是在一种微生物中产生的，并且其中至少有一部分可被微生物分泌出来，该微生物经过基因修饰以使其表达参与分泌莫纳甜的转运蛋白或转运系统的组分。在一种情况中，莫纳甜是在一种微生物中产生的，并且其中至少有一部分可被微生物分泌出来，该微生物经过基因修饰以使其表达能够分泌莫纳甜的转运蛋白组分。例如，微生物可经过基因修饰以使其过表达转运系统的通道形成蛋白组分，如AcrAB和/或EmrAB。另外一个例子是，微生物可经过基因修饰以使其表达对于微生物来说是异源的或者是天然的转运蛋白的组分，或者是二者的组合。 

根据一些实施方式，本发明提供了经过基因修饰以使其表达或过表达一种或多种能够使溶质在微生物和其环境之间直接交换的转运系统的微生物。在一些实施方式中，微生物经过基因改造可表达或过表达转运蛋白的微生物，其中的转运蛋白可选择性地转运莫纳甜，例如使其越过莫纳甜通路上的中间体。 

根据一些实施方式，莫纳甜是在与合适的对照相比转运蛋白活性升高的细胞内生产的，例如本文实施例中所描述的。在一种情况下，莫纳甜是在经过基因修饰可表达一种或多种类型的能够分泌莫纳甜的转运系统的微生物中生产的。在一种情况下，莫纳甜是在经过基因修饰可过表达转运系统的一个或多个组分的微生物中生产的。例如，莫纳甜可在经过基因修饰可过表达转运系统的通道蛋白形成组分(如AcrAB或EmrAB)的微生物中生产。另一个例子是，莫纳甜可以在还过表达转运系统的外膜因子组分(如TolC)的微生物中生产。在一种情况中，莫纳甜可在暴露于诱导化合物(即，可激发转运系统或其组分表达或者刺激分泌活性的化合物)的微生物中生产。例如，在生产莫纳甜的微生物的生长培养基中可加入癸酸钠、羰基氰3-氯苯腙(“CCCP”)或水杨酸。“生长培养基”、“培养基”和“发酵培养基”可替换使用。在一种情况下，诱导化合物的存在可使在没有诱导化合物的情况下不分泌莫纳甜的微生物发生莫纳甜的转运。在一种情况下，诱导化合物的存在可导致微生物所分泌的莫纳甜相对于合适对照所分泌的量来说增加。 

根据本发明的一些实施方式，本发明提供了证明转运蛋白分泌莫纳甜的效率的 方法。在一种情况下，该方法包括将含有莫纳甜操作子基因的质粒转化到靶转运蛋白已被删除的宿主微生物内，然后根据莫纳甜转运/分泌相对于野生型对照的丢失情况进行筛选。在一种情况中，通过如下过程使转运蛋白基因过表达：将转运蛋白基因克隆到多拷贝质粒内，按照上述方法转化经遗传改造的宿主使其产生莫纳甜，以及根据与不过表达各种转运蛋白基因的野生型对照相比莫纳甜转运增加的情况进行筛选。在一种情况中，莫纳甜分泌可通过使用诱导子以增强转运蛋白的活性并与合适的未诱导对照比较莫纳甜的生产和/或分泌来评价。 

根据一些实施方式，莫纳甜可在缺乏一种或多种转运蛋白的微生物内生产，例如缺乏四种被命名为YhcP(AaeB)、YccS、YjcQ和YhfK的特殊的推测的流出转运蛋白。 

根据一些实施方式，莫纳甜可在谷氨酸营养缺陷型中生产。在一种情况中，莫纳甜是在经基因工程修饰而能够产生莫纳甜的谷氨酸营养缺陷型中生产的。在一种情况中，莫纳甜可在经基因工程改造而过表达一种或多种类型的能够分泌莫纳甜的转运系统或这种转运系统的一种或多种组分的谷氨酸营养缺陷型中生产。在一种情况中，莫纳甜可在增强氨基酸转运的发酵条件下培养的微生物内生产。 

根据一些实施方式，莫纳甜可在包含在交换苹果酸时能够转移谷氨酸或其结构相似分子的转运系统或系统的微生物内生产。在一种情况下，莫纳甜可在包含在交换苹果酸时能够转移谷氨酸或其结构相似分子的转运系统或系统并且经过基因修饰能够产生莫纳甜的微生物内生产。在一种情况下，莫纳甜可在包含在交换苹果酸时能够转移谷氨酸或其结构相似分子的转运系统或系统并经基因工程改造成为谷氨酸营养缺陷型的微生物内生产。 

本领域的普通技术人员通过阅读本公开后应当清楚，本发明的特殊实施方式可包含所提及的一个、一些或所有情况和实施方式，或者另外包含或还包含虽未明确说明但是从本公开中能够清楚的情况或实施方式。例如，利用在公开中清楚描述的化合物(如癸酸钠和/或CCCP和/或水杨酸)以及本公开中可能未描述的化合物诱导转运蛋白表达也被认为包含在本发明的范围之内。 

同样，根据本发明的实施方式可包含未清楚描述的情况/实施方式的组合。例如，同时进行多种用于独立增强莫纳甜分泌的处理被认为包含在被发明范围之内。例如，氨苄青霉素和/或吐温20的提供可与癸酸钠的提供组合使用。实施例7提供了包含根据本发明的情况/实施方式组合的合适实施方式的另一种说明。在实施例 7中，莫纳甜在通过给生长培养基提供癸酸钠以诱导转运蛋白表达同时又经基因工程改造而能过表达TolC的微生物内生产。 

因此，应当从本文的描述中认识到，可在各个方面对本发明作出修改，只要不偏离本发明的精神和范围。因此，描述在性质上应当被认为是说明性的，而不是限制性的，虽然公开了多个实施方式/情况，但是本领域的技术人员根据本文的描述还可以理解其他实施方式/情况，它显示和描述了本发明的说明性实施方式/情况。相应的，除非特别说明，所有实施例都是非限制性的，无论是否作了这样的清楚描述。 

附图简述 

图1(A-D)是一个序列比对图，显示了生长素转运蛋白AtPGP1和7种不同蛋白质之间的同源性，这是对NCBI数据库进行BLAST分析所得到的一组结果。这些蛋白质被命名为AtPGP1(SEQ ID NO：40)、BrABB97035(SEQ ID NO：41)、StAAD10836(SEQ ID NO：42)、SbAAR10387(SEQ ID NO：44)、OsXP_483819(SEQID NO：45)、OS_CAD59580(SEQ ID NO：46)、ZMPGP1_AAR00316(SEQ ID NO：43)和AtPGP19(SEQ ID NO：47)。共有序列为SEQ ID NO：48。 

发明详述 

本公开涉及微生物分泌出莫纳甜并进入介质如培养基中的方法和产品。更具体地说，本公开涉及莫纳甜分泌出宿主微生物并进入到所期望的环境中，如介质中，其中包括培养基，所需要的转运蛋白的开发和应用。从微生物中分泌出的莫纳甜的这种转运还可以使莫纳甜生产的数量和/或速度都较合适的对照增加，例如本文实施例所描述的。 

在本文中，“包括”是指“包含”。另外，单数形式的“一个”或“一种”或“该”也包括复数，除非在上下文中特别指明。例如，提及“包含一个蛋白质”时包含一个或多个这种蛋白质，提及“包含该细胞”时包含一个或多个细胞以及本领域技术人员所熟知的其等价物等等。 

在本文中，术语“约”包括任何检测中所发生的试验误差范围。除非特别说明，所有的测量数据都被认为在其前面有单词“约”，即使单词“约”未明确写出。 

在本文中，术语“增强的转运蛋白活性”包括莫纳甜生产或分泌的数量和/或速率高于莫纳甜从合适对照中所生产的数量和/或速率。 

在本文中，术语“分泌的”和“排出的”可替换使用，包括通过将物质从细胞内移去使之进入到胞质周围空间或进入到细胞外的环境如周围介质中而从那些细胞中制备和分离物质。 

在本文中，术语“部分分泌的”和“部分排出的”可替换使用，包括从细胞中制备和分离特殊物质的一部分而不是全部。在一些方面，在细胞内还保留一些物质。 

在本文中，术语“莫纳甜操纵子基因”和“莫纳甜操纵子基因”包括合成莫纳甜时所使用的一个或多个酶的编码基因。 

在本文中，术语“泵”、“多个泵”、“泵系统”、“多个泵系统”、“流出系统”和“多个流出系统”可替换使用，包括能够将物质从细胞内移送到理想环境如细胞周围环境中和/或能够将物质从细胞周围区域移送到细胞内的一种或多种转运蛋白。 

在本文中，术语“异源的”包括对于所列举元件来说是外源的或是非天然的元件。例如，转运系统的异源组分包括为该系统的非天然组分的组分。 

在本文中，术语“与...协作”包括以一种方式与另一种分子相互作用、共价结合和/或调节另一种分子以完成或增强该分子的功能的分子。另外，该术语包括能够启动调节途径从而导致下游另一种分子活化或抑制的分子。 

在本文中，术语“分离”包括将物质从其环境或宿主中去除的过程、除非特别说明不会生产出具有一定纯度的物质的过程。 

在本文中，术语“游离的”包括已被从其环境或宿主中去除但还不是纯化的物质。 

在本文中，术语“转运系统的一个或多个组分”包括完整的转运系统本身。 

在微生物中生产莫纳甜 

如WO 03/091396 A2所描述(见例如图1-3和11-13)，莫纳甜可通过多步骤途径从色氨酸制备，其中包括生物转换(即，利用多肽促使底物向产物转换的反应)。所描述的途径包括将色氨酸生物转换为吲哚-3-丙酮酸、将吲哚-3-丙酮酸生物转换为2-羟基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸(“MP”)以及将MP生物转换为莫纳甜。 

用于将色氨酸转换为吲哚-3-丙酮酸的酶包括能够将氨基从供体分子上转移到 受体分子上或者产生氨或氨离子的酶家族的成员。可用于这种反应的典型酶包括酶分类(“EC”)2.6.1.27、1.4.1.19、1.4.99.1、2.6.1.28、1.4.3.2、1.4.3.3、2.6.1.5、2.6.1.-、2.6.1.1、2.6.1.21和3.5.1.-的成员。这些分类包括多肽如色氨酸氨基转移酶，可将L-色氨酸和α-KG(即，α-酮戊二酸，也叫2-氧代戊二酸)转化成吲哚-3-丙酮酸和L-谷氨酸；D-色氨酸氨基转移酶，可将D-色氨酸和2-含氧酸转化成吲哚-3-丙酮酸和氨基酸；色氨酸脱氢酶，可将L-色氨酸和NAD(P)转化成吲哚-3-丙酮酸和NH₃ 及NAD(P)H；D-氨基酸脱氢酶，可将D-氨基酸和FAD转化成吲哚-3-丙酮酸和NH₃ 及FADH₂；色氨酸-苯丙酮酸转氨酶，可将L-色氨酸和苯丙酮酸转化成吲哚-3-丙酮酸和L-苯丙氨酸；L-氨基酸氧化酶，可将L-氨基酸和H₂O和O₂转化成2-含氧酸和NH₃和H₂O₂；D-氨基酸氧化酶，可将D-氨基酸和H₂O和O₂转化成2-含氧酸和NH₃和H₂O₂；以及色氨酸氧化酶，可将L-色氨酸和H₂O和O₂转化成吲哚-3-丙酮酸和NH₃和H₂O₂。这些类的酶还包括酪氨酸(芳香族)氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、D-氨基酸(或D-丙氨酸)氨基转移酶，以及具有多种氨基转移酶活性的广谱(多底物)氨基转移酶，这类酶中的一些酶可将色氨酸和2-含氧酸转化成吲哚-3-丙酮酸和氨基酸。另外，这些类的酶还包括苯丙氨酸脱氨酶，在水存在的情况下可将色氨酸转化成吲哚-3-丙酮酸和铵。 

可用于将吲哚-3-丙酮酸转化成MP的酶包括可催化醛醇缩合反应的酶家族的成员。可用于这种反应的典型酶包括酶分类4.1.3.-、4.1.3.16、4.1.3.17和4.1.2.-的成员。这些类的酶包括碳-碳合成酶/裂解酶，如能催化两个羧酸底物缩合的醛缩酶。肽类EC 4.1.3.-是能够利用酮酸底物(如吲哚-3-丙酮酸)作为亲电子体形成碳-碳键的合成酶/裂解酶，而EC 4.1.2.-是能够利用醛底物(如苯甲醛)作为亲电子体形成碳-碳键的合成酶/裂解酶。例如，已知KHG醛缩酶(EC 4.1.3.16)和ProA醛缩酶(EC4.1.3.17)可将吲哚-3-丙酮酸和丙酮酸转化成MP。MP也可以利用化学反应制备，如醛醇缩合。 

可用于将MP转化成莫纳甜的酶包括能将氨基从供体分子上转移到受体分子上或者能产生氨/铵离子的酶家族的成员。可用于这种反应的典型酶包括下列酶分类的成员：色氨酸氨基转移酶(2.6.1.27)、色氨酸脱氢酶(1.4.1.19)、D-氨基酸脱氢酶(1.4.99.1)、谷氨酸脱氢酶(1.4.1.2-4)、苯丙氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.20)、色氨酸-苯丙酮酸转氨酶(2.6.1.28)，或者氨基转移酶家族(2.6.1.-)如天冬氨酸氨基转移酶(EC2.6.1.1)、酪氨酸(芳香族)氨基转移酶(2.6.1.5)、D-色氨酸氨基转移酶或D-丙氨酸 (2.6.1.21)氨基转移酶的多个普通成员(见WO 03/091396 A2的图2)。这个反应也可以利用化学反应完成。酮酸(MP)的氨基化可利用氨和硼氢化氰通过还原氨基化来完成。WO 03/091396A2的图11-13显示的是可用于将MP转化成莫纳甜的其他多肽，以及从吲哚-3-丙酮酸或色氨酸生产莫纳甜的产量得以提高。 

在本文中，可利用经基因修饰从而能够生产莫纳甜的生物在体内生产莫纳甜，例如，利用上述途径或者在合适的条件下通过给能表达上述酶的生物提供合适的底物。例如，可利用生物生产莫纳甜，该生物的野生型形式可产生色氨酸、表达至少一种WO 03/091396所描述的途径中所公开的酶，该生物经过基因修饰后可表达野生型形式内所不存在但是却能用于莫纳甜生产途径中的其他酶。 

根据本发明的一些实施方式，可在表达一种或多种能够表达分泌莫纳甜的转运系统的生物(如宿主细胞)内生产莫纳甜。根据一些实施方式，莫纳甜可在表达野生型形式的转运系统的生物内生产。根据一些实施方式，莫纳甜可在经过基因修饰从而能够表达对于微生物来说是异源的一种或多种转运系统的生物内生产。根据一些实施方式，莫纳甜可在经过基因修饰从而能够表达用于将莫纳甜转运到外部介质内的转运系统的一个或多个组分的生物内生产。 

编码具有转运蛋白活性的多肽的所有核酸都可以从任何生物中分离并克隆到所选择的宿主生物内。编码具有转运蛋白活性的多肽的基因的例子包括而不限于(1)来自根瘤菌(Rhizobium)的Aap和Bra基因，(2)阿布属(Arabidopsis)的AUX1基因或PIN1多肽(通透酶，生长素分泌)，(3)深红丙二酸单胞菌(Malonomonas rubra)的MadN(一种醋酸流出泵)，(4)乳酸菌(L.lactis)的有机阴离子转运蛋白，类似于哺乳动物多药耐药多肽和酵母Pdr12，对阴离子而不是阳离子或疏水分子具有特异性，(5)多药耐药多肽Mrp2，可从肝脏内分泌非胆汁有机阴离子，以及(6)天冬氨酸/谷氨酸载体(AGC)多肽。根瘤菌的Aap和Bra基因是主要参与类菌体内谷氨酸和天冬氨酸摄取的通用氨基酸转运蛋白。但是，当介质内存在高水平的异源氨基酸时它们也可流出其他氨基酸。实施例25显示阿布属生长素转运蛋白基因的过表达可导致莫纳甜的产量增加。 

另外，生长素转运蛋白同源物的表达或过表达预计也可以增加莫纳甜的产量。这种同源物的例子包括那些含有如图1所示的生长素转运蛋白保守区的同源物。例如，生长素转运蛋白的同源物可包含选自以下的一个或多个氨基酸序列：PXGKTXAXVGXSGSGKSTVVSLXERFYXPXXGXXXLDG(SEQ ID NO：1)、LXLXXLRXQIGLVXQEPXLFATXIXENXLXG(SEQ ID NO：2)和QVGERGXQLSGGQKQRIAIARAMLXXPXILLLDEATSALD(SEQ ID NO：3)，其中X是在与同源物的氨基酸序列一起比对时位于AtPGP1、BrABB97035、StAAD10836、ZmPGP1_AAR00316、SbAAR10387、OsXP_483819、OS_CAD59580和AtPGP19中任意一个的指定位置上的氨基酸，如图1B所示。生长素转运蛋白的其他合适同源物可包含选自LPXGYXTXVGERGVQLSGGQXQRIAIARA(SEQID NO：4)和LLDEATSALDAESEXXXQEAL(SEQ ID NO：5)的一个或多个氨基酸序列，其中X是在与同源物的氨基酸序列一起比对时位于AtPGP1、BrABB97035、StAAD10836、ZmPGP1_AAR00316、SbAAR10387、OsXP_483819、OS_CAD59580和AtPGP19中任意一个的指定位置上的氨基酸，如图1D所示。 

能够分泌莫纳甜的转运蛋白的非限制性例子包括AcrAB流出系统和EmrAB流出系统。实施例1证明AcrAB泵能够分泌莫纳甜。实施例2证明EmrAB泵能够分泌莫纳甜。实施例3还说明AcrAB和EmrAB流出系统都可用于分泌莫纳甜。 

基于AcrAB和EmrAB的阳性试验结果，可以预计某些其他转运蛋白也能够分泌莫纳甜。一般来说，AcrAB和EmrAB系统属于已知为多药转运蛋白的转运蛋白家族。多药转运蛋白被认为是能够通过将毒性分子主动排出以保护细胞抵抗各种毒性分子的转运蛋白。基于多药转运蛋白所排出的分子类型有很宽广的重叠以及AcrAB和EmrAB转运系统的类型为多药转运蛋白，可以预见其他多药转运蛋白应该能够分泌莫纳甜。特别是RND家族(包括AcrAB的多药转运蛋白的一个亚类)的其他转运蛋白以及MF家族(多药转运蛋白的另一个亚类，但是该亚类包括EmrAB)的其他转运蛋白预计能够分泌莫纳甜。预计所检测转运蛋白的同源物也可以分泌莫纳甜。以AcrA、AcrB、EmrA、EmrB或TolC多肽为饵对微生物数据库ERGO进行BLAST检索可分别鉴定出154、213、231、236和115个同源物。 

更具体的是，AcrEF是与AcrAB高度同源的流出泵，因此AcrEF系统预计也能够分泌莫纳甜。实施例24提供了一个大肠杆菌(E.coli)突变株，其中编码转运系统的基因已被敲除。 

转运蛋白的其他非限制性例子预计也可用于分泌莫纳甜，因为它们与AcrAB是同源的，其中包括： 

·绿脓假单孢菌Pseudomonas aeruginosa)来源的AcrA同源物MexA。Fernandez-Recio，J.等，“来源于革兰氏阴性菌的跨膜药物流出泵模型(A modelof a transmembrane drug-efflux pump from Gram-negative bacteria)”，FEBS Lett.578：5-9，(2004)； 

·淋病奈瑟球菌(Neisseria gonorrhoeae)来源的多药转运系统，该细菌含有基因mtrRCD，其产物是与AcrRAB相关的。Pan，W.，和Spratt，B.G.，“mtr系统对淋球菌包膜通透性的调节(Regulation of the permeability of the gonococcalenvelope by the mtr system)”，Mol.Microbiol.11：769-775，(1994)； 

·基因ameB的产物，该产物与RND-型转运蛋白的成员同源。其中包括大肠杆菌的AcrB、绿脓假单孢菌的MexD和mexF、恶臭假单孢菌(Pseudomonasputida)的TtgB、TtgE和SrpB； 

·AcrEF流出泵参与多药耐药，其底物范围与AcrAB相似(也转运新生霉素)。AcrEF系统在吲哚流出中发挥重要作用。AcrEF流出泵参与大肠杆菌内的溶剂耐受，可利用TolC提高溶剂耐受性。 

·被重新命名为mdtABCD的yegMNOB操纵子的产物，其中mdt代表多药耐药蛋白。Baranova N.和Nikaido H.，“baeSR二组分调节系统可活化大肠杆菌内yegMNOB(mdtABCD)转运蛋白基因簇的转录并增强其对新生霉素和脱氧胆酸的耐受性(The baeSR two-component regulatory system activates transcription ofthe yegMNOB(mdtABCD)transporter gene cluster in Escherichia coli andincreases its resistance to novobiocin and deoxycholate)”，J Bacteriol.184：4168-4176(2002)。由于AcrAB也是多药转运蛋白并且也能够流出新生霉素，因此mdtABCD操纵子也可能是莫纳甜转运蛋白的候选者。 

·yhiU/V基因产物。Ma，D.等，“基因acrA和acrB编码大肠杆菌的应激诱导流出(Genes acrA and acrB encode a stress-induced efflux of Escherichia coli)”，Mol.Microbiol.16：45-55，(1995)；Ma，D.等，“革兰氏阴性菌内的流出泵和药物耐受性(Efflux pumps and drug resistance in gram negative bacteria)”，TrendsMicrobiol.2：489-493，(1994)。 

·AcrB和AcrD属于耐药结节分化(“RND”)超家族，它们具有相似的拓朴学 结构，包括一对大的胞质环，每个环所含有的氨基酸残基在300以上。环区域的交换伴随着底物范围的改变说明底物识别(以及可能的结合)主要是由两个胞质环所决定的。Elkins，C.A.和Nikaido，H.，“大肠杆菌RND型多药流出泵AcrB和AcrD的底物特异性主要是由两个大的胞质环决定的(Substratespecificity of the RND-type multidrug efflux pumps AcrB and AcrD of Escherichiacoli is determined predominantly by two large periplasmic loops)”，J Bacteriol.184：6490-6498，(2002)。在两个胞质环上进行突变可能会对AcrAB转运蛋白所运输的底物的特异性产生影响，增加对莫纳甜的选择性同时减少对莫纳甜中间体的运输。 

由于和EmrAB同源而被预计能够分泌莫纳甜的转运蛋白的非限制性例子包括： 

·MdeA(多药流出A)是在金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)内鉴定出的染色体编码的多药耐受流出蛋白。MdeA属于主要易化超家族，在已知的流出蛋白中与大肠杆菌的LmrB和枯草芽孢杆菌的LmrB关系最密切。MdeA与蛋白质序列数据库比较发现它与推测的和已知的MDR蛋白具有明显的残基一致性。在标准BLASTP检索(2002年6月)的头100次采样中，只有5个经试验证明是流出蛋白或MDR蛋白： 

·枯草芽孢杆菌(B.subtilis)(O35018)的LmrB，与MdeA有37％的一致性(Kumano M.等，“来自于枯草芽孢杆菌染色体的林可霉素耐药基因区(22度-25度)的一个32kb核苷酸序列及lin-2突变位点的鉴定(A 32 kb nucleotidesequence from the region of the lincomycin-resistance gene(22 degrees-25 degrees)of the Bacillus subtilis chromosome and identification of the site of the lin-2mutation)”，Microbiology 143：2775-2782，(1997))； 

·淋病奈瑟球菌的FarB(AAD54074)，与MdeA有24％的一致性(Lee E.H.和Shafer W.M.，“farAB编码的流出泵介导淋球菌对长链抗菌脂肪酸的耐药性(The farAB-encoded efflux pump mediates resistance of gonococci to long-chainedantibacterial fatty acids)”，Mol Microbiol.33：839-845(1999))； 

·淡青链霉菌(Streptomyces glaucescens)的TcmA(P39886)，与MdeA有24％的一致性(Guilfoile P.G.和Hutchinson C.R.，“淡青链霉菌的TcmR蛋白通过与基因见操纵区的结合来抑制不同方向的tcmR和tcmA基因的转录(The Streptomyces glaucescens TcmR protein represses transcription of the divergentlyoriented tcmR and tcmA genes by binding to an intergenic operator region)”，JBacteriol.174：3659-3666(1992))； 

·环圈链霉菌(Streptomyces anulatus)的Pur8(P42670)，与MdeA有25％的一致性(Tercero J.A.等，“来自于白黑链霉菌的pur簇的pur8基因编码赋予嘌呤霉素耐药性的高度疏水多肽(The pur8 gene from the pur cluster of Streptomycesalboniger encodes a highly hydrophobic polypeptide which confers resistance topuromycin)”，Eur J Biochem.218：963-971(1993))。上面所提到的LmrB、TcmA、Pur8和EmrB蛋白赋予对疏水化合物或抗生素的耐药性，而FarB蛋白孵育对抗菌脂肪酸的耐药性。 

·金黄色葡萄球菌(S.aureus)的QacA，与MdeA有23％的一致性，在功能上与葡萄球菌流出蛋白最相关。Mitchell B.A.等，“来自于金黄色葡萄球菌的QacA多药流出泵：对二脒、双胍和丙咪腙的耐药性比较分析(QacA multidrug effluxpump from Staphylococcus aureus：comparative analysis of resistance todiamidines，biguanidines，and guanylhydrazones)”，Antimicrob Agents Chemother.42：475-477，(1998)。MdeA与其6个已知MDR的多重比对证明了在细菌MDR蛋白上鉴定出的许多基序的保守性。Putman M.等，“细菌多药转运蛋白的分子特性(Molecular properties of bacterial multidrug transporters)”，Microbiol MolBiol Rev.64：672-693(2000)。预测MdeA有14个TMS，MdeA和QacA序列的比对显示预测的和试验证明的TMS区各自吻合。(Huang J.等，“金黄色葡萄球菌内的染色体编码的新型多药流出转运蛋白MdeA(Novel chromosomallyencoded multidrug efflux transporter MdeA in Staphylococcus aureus)”，Antimicrob Agents Chemother.48：909-917(2004)。 

实施例4中的方法可用于证明给定转运蛋白如上面所鉴定的那些转运蛋白分泌莫纳甜的能力。另外，实施例4中的方法可用于筛选能用于分泌莫纳甜的其他转运蛋白。鉴定能够转运莫纳甜的转运蛋白的策略可将实施例4的筛选方法运用到能转运谷氨酸、色氨酸、吲哚化合物的任何生物上，或者运用到具有与分泌莫纳甜的能力相一致的其他特征的任何生物上。这种生物包括而不限于(1)据推测具有大量次级转运蛋白的生物如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、泛菌属(Pantoea)和立克次氏体，(次级主动转运蛋白可利用电化学梯度，一般含有多个(＞7)跨膜区以及位 于胞浆和细胞外间隙的区域)，(2)分泌谷氨酸的生物如棒状菌(Corynebacteria)和短杆菌(Brevibacteria)，(3)植物和含有种子如大豆、豌豆、花生和黄豆的豆荚，(4)根瘤菌属细菌，(5)对酸高度耐受的生物如乳酸菌、醋酸杆菌属(Acetobacter)菌株、科普属(Kluyveromyces)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和黑曲霉(Aspergillusniger)，(6)分泌吲哚-丙酮酸的生物如灰黄链霉菌(Streptomyces griseoflavus)和斯氏泛菌(P.stewartii)，(7)GRAS生物(公认为无毒的)，其中包括而不限于纳塔尔链霉菌(Streptomyces natalensis)、恰塔努加链霉菌(Streptomyces chattanoogensis)、酿酒酵母、脆弱链霉菌(Saccharomyces fragilis)、产朊假丝酵母(Candida utilis)、Gigartinaceae和Soliericeae家族的成员、Furcellaria fastigiata、高里假丝酵母(Candida guilliermondii)、解脂假丝酵母(Candidalipolytica)，以及(8)能够合成氨基酸的生物，其中包括而不限于大肠杆菌和其他肠杆菌科的细菌(如克雷白杆菌属(Klebsiella)、泛菌属和i菌株)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)、短杆菌属(Brevibacterium)菌株、杆菌属(Bacillus)菌株和酵母菌属(Saccharomyces)菌株。还可以根据生物利用富含谷氨酸的合成多肽或天然多肽(如，GLURP，来自于恶性疟原虫的富含谷氨酸的多肽)作为唯一氮源的能力来筛选生物。这种生物能够分泌谷氨酸，使其能够在含有高水平胞内谷氨酸生物的情况下存活，胞内谷氨酸是有毒性的，或者会对细胞渗透势造成不利影响。实施例15显示泛菌，特别是斯氏泛菌(Pantoea stewartii)能够生产和排出莫纳甜。 

几种类型的转运蛋白多肽可识别莫纳甜作为底物，如通用氨基酸/多胺输出蛋白多肽、二羧酸输出蛋白多肽、生长素分泌多肽和多药耐药多肽。另外，几个超家族包含能完成莫纳甜流出的转运蛋白多肽。这些超家族包括2.A.1(MFS)、2.A.6(RND)、2.A.7(SMR)、2.A.67(MATE)、CAAT(TC 2.A.78和2.A.69(AEC)。这些超家族包含能识别植物生长激素(结构与莫纳甜衍生物相似)、药物、抗菌素和各种有机分子相关的底物的流出转运蛋白多肽。例如，大肠杆菌的AcrEF多肽(以及其他RND成员如AcrAB和MexAB)是能够排出吲哚及其他多种含疏水区的化合物的多重流出泵。另外，5个ABC输出蛋白家族包含能够行使分泌分子如多肽功能的多肽。这些ABC家族多肽可用于转运莫纳甜。 

根据本发明的一些实施方式，莫纳甜可在与合适对照相比转运蛋白活性升高的微生物内生产，如本文实施例所描述的。“转运蛋白活性升高”可通过莫纳甜生产和分泌的数量和/或速度的增加来测定。如果不受现有理论的束缚，可以认为过表 达泵组分可增加组分的利用度、转化成功能性转运蛋白系统形成的可能性和/或利用度升高，因此可以提高合成增多的莫纳甜相应的分泌。 

根据一些实施方式，转运蛋白活性升高可通过基因修饰微生物使其过表达一种或多种类型的能够分泌莫纳甜的转运系统如AcrAB和/或EmrAB系统来实现。 

根据一些实施方式，活性升高可通过基因修饰微生物使其过表达能够分泌莫纳甜的转运系统的一个或多个组分来实现。例如，莫纳甜可在经基因修饰从而能够过表达RND家族多药转运蛋白的通道形成蛋白组分的微生物内生产，例如过表达通道形成蛋白(如AcrAB和/或EmrAB)，或者例如过表达该系统的不同组分，如AcrA和AcrB。 

转运系统的表达或过表达可通过各种方法实现。一种通用的方法是本领域普通技术人员所熟知的，用于提高参与莫纳甜转运的基因的表达来增加该基因的拷贝数。增加基因的拷贝数可通过用携带所需转运蛋白基因的载体/质粒转化合适的宿主微生物来实现，其中所需基因连接到载体的调节元件上。这种含转运蛋白/转运蛋白组分基因的载体可使宿主微生物过表达各自的转运蛋白或组分。增加生物内的转运系统的另一种方法是利用调节分子如诱导子或抑制子。 

AcrAB转运系统或其组分的表达或过表达可通过如下方法实现： 

·RamA是一种含有113个氨基酸的调节蛋白，属于AraC-XylS转录活化因子家族，位于产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)ATCC 13048型菌株内。RamA的过表达可增加AcrA的产生，而AcrA是AcrAB-TolC药物流出泵的一个组分。实施例17说明RamA的过表达可导致莫纳甜排出增多。 

·另外有报道显示RamA是marRAB操纵子的转录活化因子，MarA是由marRAB操纵子编码的活化蛋白。Chollet，R.等，“RamA是产气肠杆菌内多药耐药级联的另一种活化因子(RamA is an alternate activator of the multidrugresistance cascade in Enterobacter aerogenes)”，Antimicrob Agents Chemother.48：2518-2523，(2004)。据报道marRAB操纵子主要通过AcrAB-TolC流出泵上调毒性化合物的流出来介导耐药性。 

·据报道，两个组分信号转导系统的某些反应调节因子过表达可上调药物转运蛋白基因的数目，其中包括acrD、emrKY、mdtABC和mdtEF。Hirakawa，H.等，“吲哚在大肠杆菌内诱导多药转运蛋白基因的表达(Indole induces theexpression of multidrug transporter genes in Escherichia coli)”，Molecular Microbiology，55：113-1126，(2005)。这些都是莫纳甜的候选转运系统。 

·baeSR两组分调节系统可活化大肠杆菌内yegMNOB(mdtABCD)转运蛋白基因簇的转录，该基因与AcrAB转运系统同源。Baranova，N.和Nikaido，H.，“baeSR两组分调节系统活化大肠杆菌内yegMNOB(mdtABCD)转运蛋白基因簇的转录并且提高其对新生霉素和脱氧胆酸的耐药性(The baeSR two-componentregulatory system activates transcription of the yegMNOB(mdtABCD)transportergene cluster in Escherichia coli and increases its resistance to novobiocin anddeoxycholate)”，J.Bacteriol.184：4168-4176，(2002)。 

·BaeSR两组分调节系统还控制大肠杆菌内赋予药物耐受性的输出蛋白基因的表达。Nagakubo，S.等，J.Bacteriol.184：4161-4167，(2002)；Baranova，N.和Nikaido，H.，J.Bacteriol.184：4168-4176，(2002)。BaeR在缺乏大肠杆菌多药输出蛋白AcrB的情况下过表达可赋予细菌对多种毒性底物的耐受性，其中包括抗生素新生霉素。由于AcrAB可转运新生霉素和莫纳甜，因此这说明有能够转运新生霉素也可能能够转运莫纳甜的其他转运蛋白被BaeR活化。Nishino K.等，“在基因组范围分析响应于BaeSR两组分调节系统的大肠杆菌基因的表达(Genome-wide analyses of Escherichia coli gene expression responsiveto the BaeSR two-component regulatory system)”，J.Bacteriol.187：1763-1772，(2005年3月)。实施例19说明BaeR的过表达可导致莫纳甜排出增多。 

·marR发生突变可导致acrAB基因表达升高。(Ma，D.等，“基因acrA和acrB编码大肠杆菌的应激诱导流出系统(Genes acrA and acrB encode a stress-inducedefflux system of E.coli)”，Mol.Microbiol.16：45-55，(1995))和在携带多拷贝质粒表达marA的菌株内。Miller，P.F.和Sulavik，M.C，“大肠杆菌内在的多抗生素耐药性调节的重叠与平行(Overlaps and parallels in the regulation ofintrinsic multiple-antibiotic resistance in Escherichia coli)”，Mol.Microbiol.21：441-448(1996)。因此，marA基因的过表达或marR基因的灭活可导致AcrAB转运系统表达升高。 

·MarA、SoxS和SidA(转录调节因子XylS/AraC家族的成员)是通用调节因子，可活化AcrAB转运系统的表达。AcrAB和其他三个参与多药耐药的大肠杆菌基因(和莫纳甜转运的候选者)tolC、acrEF和acrD还可被SdiA活化。Baranova，N.和Nikaido，H.，“baeSR两组分调节系统活化大肠杆菌内 yegMNOB(mdtABCD)转运蛋白基因簇的转录并且提高其对新生霉素和脱氧胆酸的耐药性(The baeSR two-component regulatory system activates transcriptionof the yegMNOB(mdtABCD)transporter gene cluster in Escherichia coli andincreases its resistance to novobiocin and deoxycholate)”，J.Bacteriol.184：4168-4176，(2002)。实施例18说明MarA的过表达可导致莫纳甜排出增多。 

根据一些实施方式，与AcrAB高度同源因而预计可分泌莫纳甜的泵AcrEF的活性升高可通过如下修饰来实现： 

·含有推测启动子序列的插入元件IS1和IS10的存在可导致这些插入突变体内acrF的表达升高8到10倍，因此可增强AcrEF的活性并且可能提高能产生莫纳甜的宿主内的莫纳甜的转运。Olliver A.等，“在肠沙门氏菌血清型typhimurium DT204 acrB突变株内通过IS1或IS10元件的插入活化使多药流出操纵子acrEF过表达并用氟奎诺酮筛选(Overexpression of the multidrug effiuxoperon acrEF by insertional activation with IS1 or IS10 elements in Salmonellaenterica serovar typhimurium DT204 acrB mutants selected withfluoroquinolones)”，AntimicrobAgents Chemother.49：289-301(2005年1月)。在不同情况下，acrEF操纵子上游有IS1或IS2插入的大肠杆菌菌株可产生高水平的AcrE和AcrF蛋白。Kobayashi K.等，“大肠杆菌acrB突变体对有机溶剂的超敏反应可被IS1或IS2元件对acrEF操纵子的插入活化所抑制(Suppressionof hypersensitivity of Escherichia coli acrB mutant to organic solvents byintegrational activation of the acrEF operon with the IS1 or IS2 element)”，JBacteriol.183：2646-2653(2001)。上述实施例描述了过表达AcrEF转运系统的某些方式，该转运系统因为与AcrAB转运系统高度同源因此能够转运莫纳甜； 

·EnvR(以前被称为envCD)是acrEF操纵子的转录抑制因子。因而，非功能性的EnvR调节因子可增强acrEF的转录。AcrEF的转录增强可导致AcrEF转运系统的过表达，该转运系统因为与AcrAB转运系统高度同源因此能够转运莫纳甜； 

根据一些实施方式，转运蛋白活性升高可通过如下方法实现：过表达RND家族多药转运蛋白的外膜因子组分，如TolC；在野生型形式表达TolC的生物体内过表达能与TolC协作因而能形成功能性转运蛋白的其他转运系统组分；或者其组合。 能与TolcC协作的转运系统组分可以是未经过基因修饰的。本领域所熟知的用于筛选微生物是否存在功能性TolC的任何方法都可以使用。见，例如，Werner，J.等，“大肠杆菌K-12的一个结构独特且具有多种功能的外膜蛋白TolC的装配(Assembly of TolC，a structurally unique and multifunctional outer membrane proteinof Escherichia coliK-12)”，J.Bact.185：6540-6547(2003)。另外，实施例5描述了能用于克隆和过表达TolC的方法，但是本领域所熟知的任何方法都可以使用。实施例6证明TolC的过表达可增加莫纳甜的分泌。由于TolC可与几种不同的流出泵协调发挥功能，因此TolC的过表达可能会导致转运蛋白活性升高，其水平大于通过过表达差异水平更大的转运蛋白的其他组分而产生的转运蛋白活性升高的水平。 

TolC依赖性机制普遍存在病毒蛋白和抗菌药物的排出途径。Koronakis，V.，“TolC-细菌排出蛋白和药物的通道(TolC--the bacterial exit duct for proteins anddrugs)”，FEBSLett.555：66-71，(2003)。根据实施例6的结果，能够产生莫纳甜并且含有能与TolC协同工作的流出泵/转运系统(例如AcrAB和EmrAB)的任何宿主菌株都可能表现出因TolC通道的存在量增加而发生莫纳甜的转运增多。这种其他转运系统的非限制性例子包括： 

·霍乱弧菌(Vibrio cholerae)内由rtxB、rtxD、rtxE和tolC编码的四组分I型分泌系统(TISS)。Boardman，B.K.和Satchell，K.J.，“非典型性的I型分泌系统发生突变的霍乱弧菌菌株可在细胞内积聚RTX毒素(Vibrio cholerae strainswith mutations in an atypical type I secretion system accumulate RTX toxinintracellularly)”，J Bacteriol.186：8137-8143，(2004)。 

·EmrKY和YhiUV是活性需要TolC的三组分流出泵。Fralick，J.A.，“大肠杆菌Mar/AcrAB流出泵发挥功能需要TolC的现象(Evidence that TolC isrequired for functioning of the Mar/AcrAB efflux pump of E.coli.)”，J.Bact.178：5803-5805，(1996)；Nishino，K.和Yamaguchi，A.，“二组分信号转导系统的EvgA可调节大肠杆菌内YhiUV多药转运蛋白的合成(EvgA of thetwo-component signal transduction system modulates production of the YhiUVmultidrug transport in Escherichia coli)”，J.Bact.184：2319-2323，(2002)。 

同样，TolC同源物还可以和AcrAB系统协作以改善莫纳甜的生产速度或产量。TolC家族成员之间的全面比较证明其特征性的结构元件是保守的。这强烈暗示所 有同源物都具有相似的折叠和特性。TolC同源物之间关键结构氨基酸的保守性确立了包含TolC家族蛋白的输出和流出系统的通用机制。据报道，人们可以肯定运输通道的核心功能在所有革兰氏阴性细菌中都是一样的。Andersen，C.等，“通道景象。通过细菌运输通道输出和外排(Chunnel vision.Export and effiux throughbacterial channel-tunnels)”，EMBO Rep.1：313-8，(2000)。可用于莫纳甜分泌的同源物的非限制性例子还包括： 

·在超过30种细菌内有将近100个同源物符合TolC家族成员在革兰氏阴性细菌中间是广泛存在的这一报道。Dinh，T.等，“允许大分子通过革兰氏阴性细菌外膜的细胞质外蛋白家族(A family of extracytoplasmic proteins that allowtransport of large molecules across the outer membranes of gram-negativebacteria)”，J Bacteriol.176：3825-3831，(1994)；Andersen，C.等，“通道景象。 

通过细菌运输通道输出和外排(Chunnel vision.Export and effiux throughbacterial channel-tunnels)”，EMBO Rep.1：313-8，(2000)。 

·大肠杆菌基因组编码三个tolC同源物和ABC、MFS(EmrAB)和RND(AcrAB)家族的约30个内膜移位酶。 

·绿脓假单孢菌具有4个主要的流出(Mex)系统和RNA质子反向转运蛋白以及三种TolC同源物OprM、OprJ和OprN中的一种。这些现象与报道过的细菌有几种TolC同源物的实时相符合，其中TolC同源物与多种流出泵平行发挥功能，这些流出泵具有较广的并且有时是重叠的特性。Koronakis V.等，“TolC的结构和功能：细菌排出蛋白和药物的通道(Structure and function of TolC：thebacterial exit duct for proteins and drugs)”，Annu Rev Biochem.73：467-489，(2004)。 

·参与药物流出(以及可能参与莫纳甜流出)的某些TolC同源物是：FusA、OprA、OpcM、NodT3、NodT2、NodT1、SmeC、SrpC、TtgC、MtrE。Andersen，C.等，“通道景象。通过细菌运输通道输出和外排(Chunnel vision.Export andefflux through bacterial channel-tunnels)”，EMBO Rep.1：313-8，(2000)。 

TolC的活性还可以被提高以增强莫纳甜的分泌。增强TolC活性的可能方法的非限制性例子包括： 

·利用MarA上调TolC。大肠杆菌和沙门氏菌的多抗生素耐药(mar)基因座可能是描述最详细的参与MarA诱导的这类耐药的例子，MarA是由marRAB基 因座编码的活化蛋白。据报道，mar基因座主要通过AcrAB-TolC流出泵上调某些抗生素、消毒剂和有机溶剂的流出来介导耐药性。Randall，L.P.和Woodward，M.J.，“多抗生素耐药(mar)基因座及其意义(The multiple antibioticresistance(mar)locus and its significance)”，Res Vet Sci.72：87-93，(2002)。 

·除了MarA之外，Rob或SoxS也可上调TolC水平。在The tolC基因上游可能存在一个mar-rob-sox盒序列。有机溶剂耐药水平升高的大肠杆菌突变株具有高水平的外膜蛋白ToLC和内膜蛋白AcrA。Aono，R.等，“mar-sox调节子的一个可能成员-外膜蛋白TolC参与大肠杆菌K-12对有机溶剂耐受的维持和上升(Involvement of outer membrane protein TolC，a possible member of themar-sox regulon，in maintenance and improvement of organic solvent tolerance ofEscherichia coli K-12)”，J Bacteriol.180：938-944(1998)。 

·RamA是一种能够增强marA转录然后导致tolC过表达的调节蛋白。Chollet，R.等，“RamA是产气肠杆菌内多药耐药级联的另一个活化因子(RamA is analternate activator of the multidrug resistance cascade in Enterobacteraerogenes)”，Antimicrob Agents Chemother.48：2518-2523，(2004)。实施例17说明RamA的过表达可导致莫纳甜分泌的增加。 

根据一些实施方式，增加转运蛋白的活性可通过将表达能够分泌莫纳甜的泵的微生物暴露于诱导化合物(即，可激发转运系统或其组分表达的化合物)来实现。例如，可使表达AcrAB系统的微生物暴露于癸酸钠或水杨酸。实施例1证明癸酸钠可用于诱导AcrAB泵分泌莫纳甜。另一个例子是，可使表达EmrAB系统的微生物在其生长培养基中暴露于羰基氰3-氯苯腙(“CCCP”)。实施例2证明CCCP可诱导莫纳甜转运增加。实施例14证明水杨酸可诱导莫纳甜转运增加。 

AcrAB的其他潜在诱导子包括而不限于： 

·植物抗毒素是AcrAB转运系统的诱导子。Burse，A.等，“植物抗毒素可诱导的多药流出泵AcrAB对火疫病原体解淀粉欧文氏菌的毒力有贡献(Thephytoalexin-inducible multidrug efflux pump AcrAB contributes to virulence in thefire blight pathogen，Erwinia amylovora)”，Mol Plant Microbe Interact.17：43-54，(2004)。 

·限制作为AcrAB转运系统过表达诱导条件的营养素如葡萄糖、铁或氮。据报道，acrAB是作为大肠杆菌在分批培养和恒化培养期间的生长速率功能来调 节的。在恒化培养中，无论是否限制营养素，acrAB都与生长速率负相关。与限制铁或氮相比，在限制葡萄糖的条件下acrAB的表达都要高。acrAB转录的慢生长速率调节不需要静止期σ因子的存在。在acrAB启动子的-10区有一个推测的变速箱共有序列。Rand，J.D.等，“多药流出基因acrAB的表达升高发生在大肠杆菌的缓慢生长期/静止期(Increased expression of the multidrug effluxgenes acrAB occurs during slow growth/stationary phase of Escherichia coli)”，FEMS Microbiol Lett.207：91-95(2002)。 

·RobA是DNA结合蛋白XylS/AraC亚科的成员，可活化AcrAB转运系统。当robA过表达时，可以诱导大肠杆菌产生多抗生素耐药。据报道，RobA过表达所诱导的多抗生素耐药主要依赖于AcrAB流出的活化以及micF的活化。Tanaka，T.等，“RobA诱导的多抗生素耐药主要依赖于AcrAB流出的活化(RobA-induced multiple antibiotic resistance largely depends on the activation ofthe AcrAB efflux)”，Microbiol Immunol.41：697-702，(1997)。实施例6说明RobA的过表达可导致莫纳甜的排出。 

·cysH、icdA(异柠檬酸脱氢酶)、metE或purB(腺苷酸琥珀酸裂解酶)突变可导致AcrAB转运系统的活化。据报道，当用低水平的萘啶酸在营养素平板上筛选大肠杆菌和其他细菌的突变株时，不同基因位点上的突变可导致耐药。在转座诱导文库中约有10％的萘啶酸耐药(Nal^r)突变株表现出需要生长因子，这是cysH、icdA(异柠檬酸脱氢酶)、metE或purB(腺苷酸琥珀酸裂解酶)突变的结果。所有这些突变株的耐药性都需要功能性的AcrAB-TolC流出泵。AcrAB的转录在每一种类型的Nal(r)突变株中都有升高。在icdA和purB突变株中，每一个已知的信号途径都可用于活化AcrAB-TolC泵。由突变引起的代谢物在上游积聚而造成的阻塞可提高AcrAB-TolC泵的水平，从而能够从生物中去除萘啶酸。Helling等，“大肠杆菌内的毒性废物处理(Toxic waste disposal inEscherichia coli)”，J Bacteriol.184：3699-3703，(2002)。上述每个突变株都能够在产生莫纳甜的宿主菌株内制备以便于通过AcrAB转运蛋白增加莫纳甜的转运。实施例23说明删除cysH基因可导致莫纳甜产量增加。 

·水杨酸至少通过两种机制诱导AcrAB-TolC流出泵，其中一个包括Mar。Cohen，S.P.等，“水杨酸在大肠杆菌中诱导抗生素耐药：mar操纵子的活化和mar无关途径(Salicylate induction of the antibiotic resistance in Escherichia coli： activation of the mar operon and mar-independent pathway)”，J.Bacteriol.175：7856-7862，(1993)。 

·几种通用应激信号如4％乙醇、脂肪酸样癸酸或高渗介质(0.4M NaCl)可增强AcrAB转运系统的表达。因此人们可以利用环境条件间接影响AcrAB转运系统的表达。Ma D等，“革兰氏阴性菌中的流出泵和药物耐受(Efflux pumps anddrug resistance in gram-negative bacteria)”，Trends Microbiol.2：489-493(1994)。 

·本领域技术人员所熟知的一种增加参与莫纳甜转运的基因表达水平的通用方法可增加基因的拷贝数。这可通过用用携带所需转运蛋白基因的载体/质粒转化合适的能够转运莫纳甜的宿主微生物来实现，其中所需基因连接到载体的调节元件上。这种含转运蛋白/转运蛋白组分基因的载体可使宿主微生物过表达各自的转运蛋白或组分。 

根据本发明的另一个实施方式包含在谷氨酸营养缺陷型生产莫纳甜，谷氨酸营养缺陷型是一种因发生突变而失去合成谷氨酸的能力的生物。不被现有理论所束缚，发明者假设用于分泌谷氨酸的转运蛋白也可以分泌莫纳甜。谷氨酸营养缺陷型可能还含有谷氨酸转运蛋白，但是因为细胞内有过多的碳源可以用来制备莫纳甜(因为它不是被消耗用于合成谷氨酸)和/或因为没有谷氨酸转运蛋白竞争谷氨酸，因此谷氨酸营养缺陷型适用于生产和分泌莫纳甜。 

Eikmanns，B.J.等“编码异柠檬酸脱氢酶的棒状杆菌谷氨酸基因的克隆、序列分析和灭活以及该酶的生化特征(Cloning，sequence analysis，and inactivation of theCorynebacterium glutamicum icd gene encoding isocitrate dehydrogenase andbiochemical characterization of the enzyme)”，J Bacteriol.，177：774-782，(1995)提供了一种制备谷氨酸营养缺陷型的方法。然而，本领域所熟知的任何方法都可以使用。 

实施例8提供了一个宿主菌株的例子-已被突变成谷氨酸营养缺陷型的谷氨酸棒状杆菌ATCC菌株13032，该实施例证明该菌株中莫纳甜的排出增多。实施例9提供了一个菌株的例子，大肠杆菌谷氨酸营养缺陷型(icdA缺陷型)，预计该菌株具有莫纳甜排出增加的潜能。 

需要注意的是适于生产莫纳甜的谷氨酸营养缺陷型可与一种或多种其他方法组合以提供莫纳甜的分泌从而进一步提高莫纳甜的转运。用生产莫纳甜所需的基因转化谷氨酸营养缺陷型(用灭活的icd基因)，结合其他预计或显示可增加莫纳甜产量和/或转运的处理和细胞修饰可进一步增加莫纳甜的产量/转运。例如，将谷氨酸营养缺陷型暴露于AcrAB和/或EmrAB转运蛋白诱导子；或者将谷氨酸营养缺陷型进行改造以使其过表达转运蛋白或转运蛋白组分如TolC；或者改变发酵培养基组分使其包含去污剂如吐温20/40/60和/或氨苄青霉素(10μg/mL)；或其组合。 

根据本发明，用于分泌莫纳甜的另一个实施方式包括基因修饰能够转位谷氨酸或氧代戊二酸以交换苹果酸的微生物使其能够生产莫纳甜。一个相关的实施方式包括在这种微生物内生产莫纳甜，其中的生物还可以经过基因修饰以使其称为谷氨酸营养缺陷型。实施例10说明使用微生物能够在生产莫纳甜时用谷氨酸交换苹果酸。 

不受现有理论的束缚，莫纳甜具有谷氨酸主链，或者被认为是4-取代谷氨酸衍生物。因此莫纳甜可被转位谷氨酸以交换底物如苹果酸的转运蛋白转运出细菌细胞。阿布属质粒中的谷氨酸/苹果酸转运蛋白是由DiT2基因编码的，可以反向转运的方式转位谷氨酸和苹果酸。Renne，P.等，“阿布属突变株dct是质粒谷氨酸/苹果酸转位子DiT2缺陷的(The Arabidopsis mutant dct is deficient in the plastidicglutamate/malate translocator DiT2)”，Plant J.35：316-331，(2003)；Taniguchi，M.等，“拟南芥内质粒2-氧代戊二酸/苹果酸和二羧酸转运蛋白的鉴定和特征(Identifying and Characterizing Plastidic 2-Oxoglutarate/Malate and DicarboxylateTransporters in Arabidopsis thaliana)”，Plant and Cell Physiology 43：706-717，(2002)。谷氨酸/苹果酸转运蛋白家族与菠菜光合小体中的2-氧代戊二酸/苹果酸转运蛋白同源的，与大肠杆菌内的CitT转运蛋白相关，被认为是柠檬酸和琥珀酸的反向转运蛋白。Pos，K.M.等，“大肠杆菌柠檬酸载体CitT：与菠菜光合小体来源的2-氧代戊二酸/苹果酸转位分子相关的新型真细菌转运蛋白家族的一个成员(TheEscherichia coli Citrate Carrier CitT：a Member of a Novel Eubacterial TransporterFamily Related to the 2-Oxoglutarate/Malate Translocator from SpinachChloroplasts)”，Journal of Bacteriology 180：4160-4165，(1998)。有一种可能是这个转运蛋白可允许宿主摄取苹果酸，同时排出谷氨酸或莫纳甜进入上清。苹果酸发挥增强莫纳甜转运的功能的另一种可能是由于苹果酸可作为替代碳源来影响生长速度和碳在代谢途径中的分布，这种代谢途径与葡萄糖明显不同。苹果酸还可以被两个基因编码的苹果酸酶内在转化成丙酮酸(Fischer，E.和Sauer，U.，“利用GC-MS研究大肠杆菌突变株在中央碳代谢中的代谢流通特征(Metabolic flux profiling of Escherichia coli mutants in central carbon metabolism using GC-MS)”，Eur.J.Biochem.270：880-891，(2003))，以及由于丙酮酸是莫纳甜的一个前体，因此更高的丙酮酸利用度可使莫纳甜的产量增加，进而莫纳甜的分泌增多(见在微生物中诱导转运蛋白以去除积聚的代谢物的其他参考文献)。以苹果酸作为主要碳源的大肠杆菌的生长可使分泌到介质如培养基中的莫纳甜增多。 

在本发明的另一实施方式中，莫纳甜的产量可被温度和/或一种或多种其他化合物的处理所影响，如那些干扰细胞膜的化合物(氨苄青霉素和吐温)。另外，通过选择最佳温度和/或用一种或多种其他化合物处理来增加莫纳甜从微生物的流出，如那些干扰细胞膜的化合物(氨苄青霉素和吐温)。可产生这些效应的合适化合物的例子包括乙胺丁醇、氨苄青霉素、吐温和/或生物素。例如，实施例20说明温度升高以及提供给谷氨酸棒状杆菌细胞的丙酮酸钠的量增加可导致莫纳甜流出增多。另外，实施例21说明单独用氨苄青霉素处理或者和生物素组合在一起处理可导致莫纳甜的流出增多。另外，实施例22证明用乙胺丁醇单独处理或者用乙胺丁醇组合吐温和氨苄青霉素处理可对棒状杆菌科的莫纳甜流出产生正面影响。 

根据本发明的另一个实施方式包括在微生物中生产莫纳甜，其中微生物因不表达某些转运蛋白而被筛选出来，或者经过改造使其不表达某些转运蛋白。实施例11证明缺乏某些转运蛋白-被鉴定为YhcP(AaeB)、YccS、YjcQ和YhfK的四种推测的流出转运蛋白-会导致莫纳甜的产量增加。如果不被现有理论所束缚，可以认为某些泵还可以利用生产莫纳甜的通路转运形成的中间体，这些中间体的排出可导致莫纳甜合成速度变慢或下降。因此，缺少这些泵可导致莫纳甜的合成速度变快或升高。 

根据本发明的另一个实施方式包括在微生物中生产莫纳甜，其中微生物经过改造后具有经修饰的细胞被膜，例如，经过改造缺乏或抑制分支菌酸(mycoloic acid)的微生物。如果不被现有理论所束缚，可以认为这种方法可使莫纳甜流出增多，因为外膜通透性屏障被弱化。更具体的是，发现棒状杆菌属(Corynebacterineae)的细胞被膜的主要脂质成分分枝菌酸被发现与细胞壁的阿拉伯半乳糖或酯化的海藻糖和甘油共价相连。含分支菌酸的组分被认为在这种细胞包被的结构和功能中扮演关键角色，主要因为它们被其他脂质有机化而形成了流动性极低的外膜通透性屏障，该屏障使这些细菌的通透性极低；这可以解释分枝杆菌对许多抗生素内在的耐药性。Kacem，R.等，“分支菌酸转移酶在谷氨酸棒状杆菌生理中的重要性 (Importance of mycoloyltransferases on the physiology of Corynebacteriumglutamicum)”，Microbiology 150：73-84，(2004)。 

微生物所产生的莫纳甜在其被分泌后可从介质中收集。另外，微生物所产生的莫纳甜在其被分泌后可从介质中分离。分离方法是本领域技术人员所熟知的，用于从发酵介质中分离有机酸，该方法通常依赖于色谱方法和/或提取。莫纳甜与谷氨酸类似。用于从发酵培养基中纯化谷氨酸的许多方法都是本领域所熟知的。以前已经公开了从复杂生物介质中分离莫纳甜的描述(见WO03091396实施例6)。可用于从介质中收集和/或分离莫纳甜的方法的一个例子是在低pH条件下利用强阳离子交换层析，如Bio-Rad的AG50WX-8树脂(H型)。在这种方法中，化合物莫纳甜的氨基是带电荷的，可与树脂结合。任何被污染的有机酸都不能与树脂结合，在低pH条件下会流过树脂。然后在中性pH条件下利用阴离子交换层析如DEAE树脂将氨基酸彼此分开(如从丙氨酸和莫纳甜中分离色氨酸)。 

下面的实施例有意帮助普通技术人员实施、利用和/或理解本发明。这些实施例并不意味着以任何方式限制本公开的范围。例如，用于实施例中的莫纳甜主要是S，S莫纳甜。然而，实施例中转运蛋白的特异性预计不是基于转运分子的手性确定的。因此，被证明可转运S，S莫纳甜的系统应该能够有效转运莫纳甜的所有四种立体异构体。 

实施例 

实施例1 

诱导AcrAB流出泵以增加莫纳甜的转运 

大肠杆菌的AcrAB TolC系统是一种由胞浆膜组分/质子反向转运蛋白AcrB和胞质辅助蛋白AcrA所组成的多药流出泵。AcrA和AcrB的登录号是AcrA(蛋白质，NP_414996，DNA，NC_000913)和AcrB(蛋白质，NP_414995，DNA，NC_000913)。细胞利用这个系统泵出各种抗微生物化合物，其中包括抗生素、去污剂、染料和有机溶剂，使其通过外膜通道TolC直接进入介质。通过加入癸酸钠可诱导AcrAB基因。Zgurskaya，H.I.和Nikaido，H.，Proc Natl Acad Sci USA 96：7190-7195，(1999)。 

已进行的一项有关大肠杆菌BL21 DE3的初步研究证明2.5mM癸酸钠加入到介质内可导致对80-160μg/ml的新生霉素耐受。这是因为acrAB基因被加入的癸酸钠诱导，并赋予对新生霉素的耐药性。Rosenberg，E.Y.等，Molecular Mcrobiol. 48：1609-1619，(2003)。 

用于本试验的微生物菌株是大肠杆菌BL21(DE3)::aspC/proA/pET32(WO030913961。符号::代表“转化的”，这是本领域所熟知的。实施例12提供了一个用于转化微生物的非限制性的典型方法。为了进行接种，大肠杆菌菌株在含100μg/mL氨苄青霉素的Luria-Bertani(″LB″)培养基内、37℃、250rpm振荡培养过夜。为了进行试验处理，按照如下方法制备用于提高色氨酸在大肠杆菌内的产量的基本培养基Trp-1+葡萄糖培养基(Zeman等，Folia Microbiol.35：200-204，(1990))。向800mL纳米纯的水中加入下列试剂：2g(NH₄)₂SO₄和13.6g KH₂PO₄。PH调至7.0，体积增加到948mL，并对培养基进行高压灭菌。灭菌后在1.8mL体积的培养基中加入0.2g MgSO_4*7H₂O、0.01g CaCl_2*2H₂O和0.5mg FeSO_4*7H₂O，然后加入0.2mL Neidhardt微量营养素溶液。Neidhardt，F.C.等，“肠道细菌培养基(Culturemedium for Enterobacteria)”，J.Bacteriol.119：736-746(1974)。Neidhardt培养基包含(每升)：0.18g(NH₄)₆(MO₇)₂₄-4H₂O、1.24g H₃BO₃、0.36g CoCl₂-6H₂O、0.12gCuSO₄(无水的)、0.8g MnCl₂-4H₂O和0.14g ZnSO₄-7H₂O。单独制备50％的葡萄糖溶液并通过过滤除菌。将40mL葡萄糖溶液和10mL 1M 3-吗啉代丙磺酸(“MOPS”)缓冲液加入到基础培养基(950mL)中，最后体积为1L。将2-5v/v％大肠杆菌接种物加入到含100μg/mL氨苄青霉素的在500mL带挡板摇瓶内的100mL培养基中。摇瓶在37℃孵育，以250rpm振荡直到进行诱导。在0.6OD_600nm时，开始利用0.5mM IPTG诱导pET32载体上的莫纳甜操纵子基因(aspC和proA)。在诱导时加入0.5mM维生素B6和0.2mL Balch维生素(Balch，W.E.等，“产甲烷菌：对独特生物群的重新评价(Methanogens：reevaluation of a unique biological group)”，Microbiol.Rev.43：260-296，(1979))，在诱导后孵育温度要低于30℃。在开始诱导后3.5小时加入1gL-色氨酸、5g/L丙酮酸钠、0.04mM吡哆醛-5’-磷酸(“PLP”)和0.2％吐温20(聚氧乙烯20-失水山梨糖醇单月桂酸酯)。一些处理包括在诱导开始后3.5小时加入2.5mM癸酸钠。在24和30小时采集用于莫纳甜分析和确定细胞干重的样品。按照实施例13所描述的进行莫纳甜分析。 

表1.1 

大肠杆菌所流出的莫纳甜/细胞干重 

	运行时间点上的莫纳甜/dcw.：
				处理编号	处理	24	30
1	2.5mM癸酸钠	17.0	17.4
				2	无癸酸盐	1.3	1.3
3	2.5mM癸酸钠	14.7	14.3
				4	无癸酸盐	1.7	1.6
5	2.5mM癸酸钠	12.0	13.8
				6	无癸酸盐	1.8	1.8

莫纳甜/dcw＝莫纳甜(mg)/dcw(g) 

表1.2 

大肠杆菌所流出的平均莫纳甜/细胞干重 

	运行时间点上的莫纳甜/dcw.：
			处理	24	30
2.5mM癸酸钠	14.6	15.2
			无癸酸盐	1.58	1.57

莫纳甜/dcw＝莫纳甜(mg)/dcw(g) 

n＝3 

通过用2.5mM能诱导AcrAB流出系统的癸酸钠处理大肠杆菌BL21(DE3)::aspC/proA/pET32可以观察到分泌的莫纳甜/细胞干重(“dcm”)增加了9倍多(莫纳甜(mg)/dcw(g)为14.6-1.58或15.2-1.57)。因此通过开启或上调AcrAB流出系统的表达可以增加莫纳甜的排出。当暴露于合适的诱导物时，AcrAB转运系统的转运系统同源物也可以增加莫纳甜的转运。 

实施例2 

诱导EmrAB流出泵可增加莫纳甜的转运-大肠杆菌和谷氨酸棒状杆菌多药流出泵EmrB流出泵是由emrB基因编码的(GenBank登录号NP_417171，DNA NC_000913)。Lomovskaya，O.和Lewis，K，“emr，负责多药耐药的大肠杆菌基因座(emr，an E.coli locus for multidrug resistance)”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：8938-8942，(1992)。通过向生长/发酵培养基内加入诱导子羰基氰3-氯(″CCCP″)可上调emrB基因。Lomovskaya O.等，“大肠杆菌mcb和emr操纵子的差异调节：mcb在多药耐药中的作用(Differential regulation of the mcb and emr operons of E.coli：Role of mcb in multidrug resistance)”，Antimicrob Agents Chemother.40：1050-1052，(1996)。这个实施例说明莫纳甜流出增多是CCCP出来的结果。 

用于本试验的菌株是大肠杆菌MG1655::aspC/proA/pProNde和大肠杆菌BL21(DE3)::aspC/proA/pET30。为了进行接种，大肠杆菌菌株在含50μg/mL卡那 霉素的Luria-Bertani(″LB″)培养基内、37℃、250rpm振荡培养过夜。 

为了进行试验处理，按照如下方法制备用于提高色氨酸在大肠杆菌细胞内的产量的基本培养基Trp-1+葡萄糖培养基(Zeman等，Folia Microbiol.35：200-204，(1990))。向800mL纳米纯的水中加入下列试剂：2g(NH₄)₂SO₄和13.6g KH₂PO₄。PH调至7.0，体积增加到948mL，并对培养基进行高压灭菌。灭菌后在1.8mL体积的培养基中加入0.2g MgSO_4*7H₂O、0.01g CaCl_2*2H₂O和0.5mg FeSO_4*7H₂O，然后加入0.2mL Neidhardt微量营养素溶液。Neidhardt，F.C.等，“肠道细菌培养基”，J.Bacteriol.119：736-746(1974)。Neidhardt培养基包含(每升)：0.18g(NH₄)₆(MO₇)₂₄ -4H₂O、1.24g H₃BO₃、0.36g CoCl₂-6H₂O、0.12g CuSO₄(无水的)、0.8g MnCl₂-4H₂O和0.14g ZnSO₄-7H₂O。单独制备50％的葡萄糖溶液并通过过滤除菌。将40mL葡萄糖溶液和10mL 1M 3-吗啉代丙磺酸(“MOPS”)缓冲液加入到基础培养基(950mL)中，最后体积为1L。 

为了处理，将2-5v/v％接种物加入到含50μg/mL卡那霉素的在500mL带挡板摇瓶内的100mL培养基中。处理条件包括以250rpm振荡，在37℃孵育直到进行诱导，然后30℃孵育，随后进行诱导。在0.5-0.6OD_600nm时，开始质粒基因的诱导。在诱导时，加入0.5mM IPTG、0.5mM维生素B6和0.2mL Balch维生素。在开始诱导后3.5小时加入1gL-色氨酸、5g/L丙酮酸钠、0.04mM吡哆醛-5’-磷酸(“PLP”)和0.2％吐温20(聚氧乙烯20-失水山梨糖醇单月桂酸酯)。一种处理包括在诱导开始后3.5小时再加入10μM CCCP。CCCP可诱导EmrB流出系统。在10、15.5、25.6和31小时采集用于莫纳甜分析和确定细胞干重的样品。按照实施例13所描述的进行莫纳甜分析。 

表2.1 

大肠杆菌MG1655和BL21(DE3)所流出的莫纳甜/细胞干重 

菌株	处理	*运行时间点上的    莫纳甜/细胞干重：
								10	15.5	25.6	31
大肠杆菌MG1655::aspCproApProNde	对照(无CCCP**)		0.5	3.3	6.2
						大肠杆菌MG1655::aspCproApProNde	10μM CCCP		0.7	6.7	12.4
大肠杆菌BL21(DE3)::aspCproApET30	对照(无CCCP**)	3.9	9.6	19.1	18.1
						大肠杆菌BL21(DE3)::aspCproApET30	10μM CCCP	6.4	22.5	34.3	33.0
大肠杆菌BL21(DE3)::aspCproApET30	10μM CCCP+10μM CCCP	16.2	38.0	52.1	64.2

^*莫纳甜/dcw(mg/g) 

^**CCCP是羰基氰3-氯苯腙 

对于大肠杆菌BL21(DE3)::aspC proA pET30菌株来说，在用一次(10μM)或两次(20μM)CCCP处理摇瓶后31小时，莫纳甜/dcw上升超过1.8或3.5倍(33.0/18.1或64.2/18.1)。对于大肠杆菌MG1655::aspC proA pProNde菌株来说，在31小时时莫纳甜/dcw上升2倍。因此通过启动或上调EmrAB流出泵的表达可以使莫纳甜的流出至少升高2倍。通过与增加莫纳甜转运的其他处理组合使用可进一步增加莫纳甜的流出。 

实施例3 

敲除大肠杆菌emrB和acrAB基因对EmrAB和AcrAB转运蛋白分别介导的莫纳甜转运的影响 

所设计的引物用于通过从模板pKD3 PCR扩增来产生所期望的敲除产物，如Datsenko K.A.和Wanner，B.L.，“利用PCR产物一步灭活大肠杆菌K-12的染色体基因(One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCRproducts)”，Proceed.Natl.Acad.Sci.USA，97：6640-6645，(2000)。 

emrB敲除引物序列： 

大肠杆菌EmrBF 

(5’AAGCTAACGCTGGCTAATCCAGAGGTGCGTGTGATGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3’(SEQ ID NO：6))； 

大肠杆菌EmrBR 

(5’-AAAGCCAGTTCAAATGAACTGGCTTAGTTGTACTTACATATGAATATCCTCCTTA-3’(SEQ ID NO：7))； 

acrAB敲除引物序列： 

大肠杆菌AcrAF 

(5’-GACCAATTTGAAATCGGACACTCGAGGTTTACATATGAGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3’(SEQ ID NO：8))； 

大肠杆菌AcrBR 

(5’-CTTACGCGGCCTTAGTGATTACACGTTGTATCAATGATGCATATGAATATCCTCCTTA-3’(SEQ ID NO：9)) 

通过如下PCR过程扩增删除了emrB和acrAB基因的PCR产物。在100μL反应体系中，加入100ng模板(pKD3)(Datsenko，K.A.和Wanner，B.L.，“利用PCR 产物一步灭活大肠杆菌K-12的染色体基因(One-step inactivation of chromosomalgenes in Escherichia coli K-12 using PCR products)”，Proceed.Natl.Acad.Sci.USA，97：6640-6645，(2000))、0.4μM各引物、0.4mM各dNTP、5.6U Expand HighFidelity^TM聚合酶(罗氏(Roche)，Indianapolis，IN)、1.0U Pfu聚合酶(斯加特基因公司(Stratagene)，La Jolla，CA)和含Mg的1×Expand^TM缓冲液。所使用的热循环程序包括94℃热启动3分钟，如下步骤重复8次：94℃30秒，50℃30秒和72℃1分30秒，然后如下步骤重复22次：94℃30秒，58℃30秒和72℃1分30秒。完成22个循环以后使样品在72℃保持7分钟，然后储存于4℃。这个PCR过程可制备出emrB和acrAB敲除引物对的1.1-Kb产物。 

利用Qiagen凝胶提取试剂盒(Valencia，CA)从0.8％TAE-琼脂糖凝胶中凝胶纯化PCR产物。利用SmartSpec 3000^TM分光光度计定量PCR产物。 

凝胶纯化的PCR产物用于转化大肠杆菌菌株BW25113/pKD46。Datsenko K.A.和Wanner，B.L.，“利用PCR产物一步灭活大肠杆菌K-12的染色体基因(One-stepinactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products)”，Proceed.Natl.Acad.Sci.USA，97：6640-6645，(2000)。1μL各产物加到40μl细胞中，利用BioRad Gene Pulsar II在下列条件下通过电穿孔转化细胞：在0.2cm槽内2.5kV，25μF，200ohm。细胞在1mL SOC中37℃、225rpm振荡4小时使其恢复，然后置于室温下过夜(不振荡)。细胞接种到含氯霉素(10μg/mL)LB平板上，37℃孵育过夜。在非选择性的LB培养基(在42℃生长)上单集落纯化氯霉素耐药转化子，检测单个集落是否保留了氯霉素耐药性并且丢失了氨苄青霉素耐药性(说明pKD46得以恢复)。利用位于缺失位点上游和下游的引物通过集落PCR来确定emrB或acrAB基因是否被正确删除： 

EmrB上游正向引物：5’-GTATCGGTCAGCCGGTCACT-3’(SEQ ID NO：10) 

EmrB下游反向引物：5’-TGTTCGATCTGCGCTTCTGC-3’(SEQ ID NO：11) 

AcrA上游正向引物：5’-TAATCGACGCCGTTCTTCTG-3’(SEQ ID NO：12) 

AcrB下游反向引物：5’-GCGGTTGAACTAACGGACAC-3’(SEQ ID NO：13) 

为了删除emrB，利用EmrB上游正向引物和EmrB下游反向引物引物可以得到一个比野生型2.4kb产物短的截短的1.9kb PCR产物。为了删除acrAB，利用AcrA上游正向引物和AcrB下游反向引物引物可以得到一个比野生型5.679kb产物短的截短的1.9kb PCR产物。 

裂解物制备：为了生产BW25113ΔEmrB和BW25113ΔAcrAB菌株，制备p1噬菌体裂解物以使敲除分别转移到大肠杆菌BL21DE3或MG1655生产宿主内。供体菌株在含10μg/mL氯霉素的LB培养基内孵育过夜。培养物用于接种含5mMCaCl₂的新鲜LB培养基，稀释度为1∶10，在37℃孵育70分钟。1mL每种培养物用3μL或5μL噬菌体储存液(ATCC 25404-B1)接种，37℃20分钟。然后噬菌体/培养物与4mL含5mM CaCl₂的软琼脂混合，覆盖在LB培养基上。对照试验用无噬菌体的溶液进行。平板右侧向上在37℃孵育5小时，然后所有含噬菌体的平板上都可以看到有融合裂解；对照平板如预期一样有细胞菌苔。平板在37℃孵育过夜，然后如预期一样在试验平板上看到有噬菌体耐受集落。用无菌的可处理接种环从每个平板上刮下软琼脂放到离心管内。用2mL LB冲洗平板，冲洗液与离心管中的软琼脂混合。在管中加入5滴氯仿，温和振荡，在室温下孵育20分钟。混合物10000g离心10分钟，用0.2μm注射器式滤器过滤上清，得到噬菌体裂解物。所有噬菌体裂解物都储存于4℃。 

转导入生产宿主：通过P1转导分别制备菌株BL21DE3ΔemrB和MG1655ΔacrAB，从而使emrB敲除子转移到菌株大肠杆菌BL21DE3内，使acrAB敲除子转移到菌株大肠杆菌MG1655内。BL21DE3ΔemrB和MG1655ΔacrAB在含10μg/mL氯霉素的LB培养基内孵育过夜。培养物用于接种5mL含5mM CaCl₂ 的新鲜LB培养基，稀释度为1∶10。亚培养物在37℃孵育60分钟。培养物离心，重悬于500μLMC缓冲液(0.1M MgSO₄，5mM CaCl₂)中，室温下孵育20分钟。各种稀释度的供体裂解物(1∶100到1×，用MC缓冲液稀释)以相等体积加入到100μL培养物中。混合物37℃孵育20分钟，然后每管加入200μL柠檬酸盐缓冲液(0.1M柠檬酸和220mM NaOH，pH5.5)和1mL LB。培养物在37℃孵育1小时，以200rpm振荡，然后离心得到细胞团。细胞团重悬于100μL柠檬酸盐缓冲液中，接种到含10μg/mL氯霉素的LB平板上。 

通过在合适的选择培养基上重新接种来纯化单个的氯霉素耐药集落，按照以前所描述的用于BW25113敲除株的方法通过PCR检测单集落以证明是否存在emrB和acrAB敲除子。emrB和acrAB敲除对EmrAB和AcrAB转运系统的影响分别利用合适的抗生素并与野生型对照微生物比较通过评价转运突变株的表型来确定，如表3.1和表3.2所示。 

表3.1 

处理	吸光度  600nM
					菌株	菌株类型	CCCP*    (μM)	6小时	24小时
大肠杆菌BL21DE3ΔemrB::aspCproApET30	emrB敲除突变株	20	0.024	0.014
					大肠杆菌BL21DE3::aspCproApet30	野生型对照	20	0.034	1.113
大肠杆菌BL21DE3ΔemrB::aspCproApET30	emrB敲除突变株	0	0.787	1.452
					大肠杆菌BL21DE3::aspCproApET30	野生型对照	0	1.021	1.597

^*羰基氰3-氯苯腙 

因此，根据表3.1所示的数据可以确认EmrAB转运系统负责CCCP的流出。在缺少CCCP(0μM)的情况下，在24小时时野生型菌株和用pET30载体上的莫纳甜操纵子(aspC，proA)转化的ΔemrB大肠杆菌菌株的生长是相似的。但是，当加入20μM CCCP时，缺失菌株大肠杆菌BL21DE3ΔemrB::aspCproApET30的生长下降了80倍/99％，估计这可能是因为无法流出毒性分析CCCP所导致的。这些数据证明了EmrAB系统在转运CCCP中的主要作用。 

表3.2 

AcrAB敲除确认	处理
				菌株	癸酸钠    (mM)	新生霉素  (ppm)	19小时时的    OD 600nm
大肠杆菌MG1655 ΔAcrAB 6-16::aspCproAproNde	0	0	1.436
				大肠杆菌MG1655 ΔAcrAB 6-16::aspCproAproNde	0	40	0.007
大肠杆菌MG1655 ΔAcrAB 6-16::aspCproAproNde	0	80	0.006
大肠杆菌MG1655::aspCproApProNde(对照)	0	0	1.556
				大肠杆菌MG1655::aspCproApProNde(对照)	0	40	1.407
大肠杆菌MG1655::aspCproApProNde(对照)	0	80	0.793
大肠杆菌MG1655 ΔAcrAB 6-16::aspCproAproNde	2.5	0	0.885
				大肠杆菌MG1655 ΔAcrAB 6-16::aspCproAproNde	2.5	40	0.008
大肠杆菌MG1655ΔAcrAB 6-16::aspCproAproNde	2.5	80	0.008
大肠杆菌MG1655::aspCproApProNde(对照)	2.5	0	1.396
				大肠杆菌MG1655::aspCproApProNde(对照)	2.5	40	1.395
大肠杆菌MG1655::aspCproApProNde(对照)	2.5	80	1.374

因此，根据表3.2所示的数据可以确认EmrAB转运系统负责新生霉素的流出，该系统可被癸酸钠诱导。在缺少新生霉素(0μM)的情况下，在24小时时野生型菌 株和用pProNde载体上的莫纳甜操纵子(aspC，proA)转化的ΔacrAB大肠杆菌菌株的生长是相似的。但是，在存在40或80 ppm新生霉素的情况下，ΔacrAB大肠杆菌菌株的生长被完全抑制，而相应的对照却只有轻微的生长抑制。在存在AcrAB诱导物癸酸钠的情况下，相应的对照菌株生长所达到的光密度与0ppm、40ppm或80ppm新生霉素相似，而ΔacrAB大肠杆菌菌株的生长被完全抑制。 

实施例4 

鉴定大肠杆菌、棒状杆菌属或其他微生物来源的莫纳甜转运蛋白的策略来自本申请其他实施例的数据显示AcrAB和EmrAB多药流出泵能够转运莫纳甜。用癸酸诱导AcrAB转运系统可导致莫纳甜流出进一步增多。除了acrAB和emrAB转运系统基因以为，利用膜拓朴学推测理论和生物信息学方法还可以鉴定出许多转运蛋白基因。据报道，大肠杆菌基因组至少编码20种在过表达时能赋予药物耐受性的药物转运系统。 

一种可能的情况是这些转运蛋白中的一些可能无法从其天然启动子表达，或者在天然宿主内其表达被通用的或特殊的抑制分子所抑制。Nishino，K.和Yamaguchi，A.，“大肠杆菌内推测的药物转运蛋白基因的完全文库的分析(Analysis of acomplete library of putative drug transporter genes in Escherichia coli)”，J.Bacteriol.183：5803-5812，(2001)。还有报道显示，除acrAB外，这些转运蛋白中的一些在正常发酵/培养条件下未达到最佳表达(Sulavik，M.C.等，“缺乏多药流出泵的大肠杆菌菌株的抗生素敏感性概况(Antibiotic susceptibility profiles of Escherichia colistrains lacking multidrug efflux pump genes)”，Antimicrob.Agents Chemother.45：1126-1136，(2001))，因此需要用特殊的方法来检测这些转运蛋白的活性。根据上述信息，大肠杆菌及其他微生物内的其他转运蛋白可能能够转运莫纳甜，只是其效率和选择性不同而已。 

生物信息学方法(搜索特殊的转运蛋白特征、跨膜区等)、公用文献检索等可用于鉴定转运蛋白基因候选者的来源，还可以提供转运蛋白诱导子有关的信息。转运蛋白可被分组到上升类别中(被专家所承认)。可以鉴定每个分类中的一个或两个成员以确定它们在莫纳甜转运中的作用。这个策略可能能够允许从已检测的代表来源的数据外推到整个转运蛋白类别。 

例如，莫纳甜操纵子(aspC，proA)可被克隆到载体内，并转化到特定转运蛋白 或转运系统或者不同转运蛋白组分缺失的宿主微生物内。可以根据与合适的野生型对照相比莫纳甜转运功能丧失的情况来筛选具有制备莫纳甜能力的特殊转运蛋白突变体。转运蛋白缺失导致莫纳甜转运减少或丧失说明各个转运蛋白在莫纳甜流出中可能扮演角色。 

例如，莫纳甜操纵子(aspC，proA)可被克隆到载体内，并转化到经过基因修饰可过表达特定转运蛋白或转运系统或不同转运蛋白组分的宿主微生物内。与未过表达转运蛋白基因的野生型对照相比莫纳甜转运增多的微生物菌株可证明各个转运蛋白在莫纳甜流出中可能扮演角色。 

特殊的生长条件或通用诱导子可增强转运系统的莫纳甜流出活性。诱导子可以是转运蛋白特异性的，也可以是通用的，诱导子是有益的，因为这些诱导子可增强转运蛋白的活性，使之更容易根据莫纳甜的转运活性来筛选。例如，吲哚可促进许多转运蛋白基因的表达，其中包括acrD、acrE、cusB、emrK、mdtA、mdtE和yceL。Hirakawa，H.等，“吲哚诱导大肠杆菌内多药转运蛋白基因的表达(Indoleinduces the expression of multidrug transporter genes in Escherichia coli)”，MolecularMicrobiology 55：113-1126，(2005)。比较被诱导系统内的与相应的非诱导对照内的莫纳甜流出可用于评价能够转运莫纳甜的转运系统和诱导子。参见，例如，实施例1、2和14。 

例如，莫纳甜操纵子(aspC，proA)可被克隆到载体内，并转化到合适的宿主微生物内。莫纳甜生产菌株用合适的诱导子处理，检测莫纳甜流出的增加。微矩阵分析可用于鉴定在可导致莫纳甜流出增多的诱导条件下过表达的转运蛋白基因。这些转运蛋白基因候选者可以被过表达以确定其在莫纳甜流出中的作用，如上所述。 

例如，莫纳甜操纵子(aspC，proA)可被克隆到载体内，并转化到一个或多个已知的莫纳甜转运蛋白如AcrAB或EmrAB系统缺失的宿主微生物内。在缺乏某些主要的已知转运蛋白的宿主背景中诱导莫纳甜转运可用于检测野生型微生物内的或经过基因修饰过表达特定转运蛋白、转运系统或不同转运蛋白组分的菌株内的其他莫纳甜转运蛋白。在同样的诱导条件下，与合适的对照菌株相比莫纳甜转运增加的微生物菌株可说明各个诱导子/转运蛋白在莫纳甜流出中扮演角色。 

除了本申请实施例中所观察到的莫纳甜流出以外，我们还观察到在培养基上有红色形成物，我们推测这可能是由于培养基上发生了有莫纳甜中间体如吲哚-3-丙酮酸(″I3P″)参与的反应，说明莫纳甜中间体也可以被转运。

吲哚-3-丙酮酸流出并生成有色形成物(由于I3P复合物形成)可作为I3P转运的筛选标记。假设莫纳甜与莫纳甜中间体如吲哚-3-丙酮酸结构类似，那么能够转运I3P的转运系统可能会是莫纳甜转运的候选者(假定转运蛋白不能区分I3P和莫纳甜)。例如，灰黄链霉菌(Streptomyces griseoglavus)是细胞和细胞外吲哚-3-丙酮酸的主动制造者，是用于筛选I3P和莫纳甜转运蛋白的极佳候选生物。E1-Abyad，M.S.和Farid，M.，“灰黄链霉菌生产吲哚-3-丙酮酸所需培养条件的优化(Optimization ofculture conditions for indole-3-pyruvic acid production by Streptomyces griseoflavus)”，Can.J.Microbio.40：754-760，(1994)。增加莫纳甜流出的效率需要修饰候选转运蛋白以便于通过降低莫纳甜中间体/前体如吲哚-3-丙酮酸和莫纳甜以及初始底物如色氨酸或丙酮酸的转运来增加其对莫纳甜转运的特异性。 

实施例5 

TolC的克隆和过表达 

本实施例描述了可用于克隆和过表达大肠杆菌tolC基因的方法。 

聚合酶链式反应过程：根据5’限制性酶切位点涉及引物，其突出部分用于克隆到pProNco载体(克隆科技公司(Clontech)，Palo Alto，CA)内。引物：N端：5′-GGCCTTGGCCATGGAAATGAAGAAATTGCTCCCC-3′(SEQ ID NO：14)和C端：5′-CCGGCCAAGCTTTCAGTTACGGAAAGGGTTAT-3′(SEQ ID NO：15)。通过如下PCR过程扩增tolC基因。在50μL反应体系中加入0.150μg模板(大肠杆菌MG1655)、1.6μM各引物、0.4mM各dNTP、2.8U Expand High Fidelity^TM聚合酶(罗氏(Roche)，Indianapolis，IN)、0.5U Pfu聚合酶(斯加特基因公司(Stratagene)，La Jolla，CA)、含Mg的1×Expand^TM缓冲液和2.5μL DMSO。所使用的热循环程序包括94℃热启动3分钟，如下步骤重复8次：94℃ 30秒，52℃ 45秒和72℃ 2分30秒，然后如下步骤重复18次：94℃ 30秒，59℃ 45秒和72℃ 2分30秒。完成22个循环以后使样品在72℃保持7分钟，然后储存于4℃。这个PCR过程可制备出1475bp的产物。 

tolC基因的克隆：利用Qiagen凝胶提取试剂盒(Valencia，CA)从0.8％TAE-琼脂糖凝胶中凝胶纯化PCR产物。利用SmartSpec 3000^TM分光光度计定量PCR产物。根据厂商推荐的方法(因维曲根公司(Invitrogen)，Carlsbad，CA)对产物进行TOPO Blunt处理。利用上述方法PCR筛选转化子以确定TolC是否插入。按厂商(新英格兰生物实验室公司(New England Biolabs)，Beverly，MA)推荐的方法用限制性内切酶Ncol和HindIII消化经验证的TOPO克隆。利用Qiagen凝胶提取试剂盒从0.8％TAE-琼脂糖凝胶中凝胶纯化1.475kb条带。通过用限制性内切酶Ncol和HindIII消化、然后再用虾碱性磷酸酶处理来制备载体pProNco，利用Qiagen凝胶提取试剂盒从0.8％TAE-琼脂糖凝胶中纯化载体。 

被消化的载体和插入片段用Rapid^TM DNA连接试剂盒(罗氏(Roche)，Indianapolis，IN)连接。约50ng被处理插入片段、100ng被处理载体(插入片段与载体的摩尔比为3∶1)、5U T4 DNA连接酶和1×连接缓冲液在室温下共孵育5分钟。利用高纯度PCR产物纯化试剂盒(罗氏(Roche))清理连接反应液，用于转化大肠杆菌DH10B电感受态细胞(因维曲根公司(Invitrogen)，Carlsbad，CA)。在40μLDH10B细胞中加入10μL各连接反应液，利用BioRad Gene Pulsar II在下列条件下通过电穿孔转化细胞：在0.2cm槽内，2.5kV，25μF，200ohm。细胞在1mL室温SOC中37℃、225rpm振荡4小时使其恢复。细胞接种到含卡那霉素(50μg/mL)LB平板上，37℃孵育过夜。 

利用Qiagen自旋小量制备试剂盒从得到的转化子中纯化质粒DNA，通过用限制性内切酶Ncol和HindIII消化来筛选正确的插入。通过双脱氧链终止DNA测序反应验证具有正确插入的质粒序列。 

tolC基因表达：经序列分析验证的质粒DNA亚克隆到大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)(诺佛根公司(Novagen)，Madison，WI)内。扩增培养物，用Qiagen小量制备试剂盒分离质粒，通过限制性酶切分析以确定其一致性。培养物在含卡那霉素(50mg/mL)的50mL LB培养基中生长，30℃、225rpm直到OD₆₀₀达到0.5-0.6，与100mM IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)和0.5％阿拉伯糖共孵育使其过表达tolC基因。TolC过表达对莫纳甜转运的影响见下面实施例6和7的描述。 

实施例6 

大肠杆菌内tolC的过表达使莫纳甜排出增多 

在革兰氏阴性细菌中，药物耐受的部分原因是跨膜流出泵的活性，跨膜流出泵由三种类型的蛋白质组成。大肠杆菌来源的典型泵是由三聚体的外膜蛋白TolC、三聚体的内膜质子反向转运蛋白AcrB和胞质蛋白AcrA装配而成的，其中TolC 组成一个别构通道。泵可利用质子电化学势能将底物从细菌内转运出去。Fernandez-Recio，J.等，“一个来源于革兰氏阴性菌的跨膜药物流出泵模型(Amodelof a transmembrane drug-efflux pump from Gram-negative bacteria)”，FEBS Lett.578：5-9，(2004)。 

大肠杆菌内的tolC基因编码外膜蛋白，它可以和几种不同的外流泵协同发挥功能。TolC在革兰氏阴性细菌如大肠杆菌和绿脓假单孢菌的各种底物的转运中发挥重要作用。TolC的同源物在革兰氏阴性细菌中间普遍存在，现已鉴定出大约100各TolC同源物。Dinh，T.等，J.Bacteriol.176：3825-3831，(1994)；Johnson，J.和Church，M.J.Mol.Biol.287：695-715，(1999)；Anderson，C.等，EMBO Rep.1：313-318，(2000)。tolC基因在大肠杆菌内过表达可用于确定TolC通道的利用度上升是否能够增加莫纳甜的转运。 

含有莫纳甜操纵子(aspC，天冬氨酸氨基转移酶和proA，醛缩酶基因)的大肠杆菌菌株BL21(DE3)和带有或不带有tolC基因的pProNde质粒(pProLAR，来自克隆科技公司(Clontech)，按照US20040235123所描述的进行修饰)用于检测莫纳甜的转运。 

用于试验的菌株包括大肠杆菌BL21(DE3)::aspCproApET32和tolC pProNde或不带tolC的pProNde。为了进行接种，大肠杆菌菌株在含100μg/mL氨苄青霉素和50μg/mL卡那霉素的Luria-Bertani(″LB″)培养基内、37℃、250rpm振荡培养过夜。 

为了进行试验处理，按照如下方法制备用于提高色氨酸在大肠杆菌细胞内的产量的基本培养基Trp-1+葡萄糖培养基(Zeman等，Folia Microbiol.35：200-204，(1990))。向800mL纳米纯的水中加入下列试剂：2g(NH₄)₂SO₄和13.6g KH₂PO₄。PH调至7.0，体积增加到948mL，并对培养基进行高压灭菌。灭菌后在1.8mL体积的培养基中加入0.2g MgSO_4*7H₂O、0.01g CaCl_2*2H₂O和0.5mg FeSO_4*7H₂O，然后加入0.2mL Neidhardt微量营养素溶液。Neidhardt，F.C.等，“肠道细菌培养基”，J.Bacteriol.119：736-746(1974)。Neidhardt培养基包含(每升)：0.18g(NH₄)₆(MO₇)₂₄ -4H₂O、1.24g H₃BO₃、0.36g CoCl₂-6H₂O、0.12g CuSO₄(无水的)、0.8g MnCl₂-4H₂O和0.14g ZnSO₄-7H₂O。单独制备50％的葡萄糖溶液并通过过滤除菌。将40mL葡萄糖溶液和10mL 1M 3-吗啉代丙磺酸(“MOPS”)缓冲液加入到基础培养基(950mL)中，最后体积为1L。 

为了处理，将3-4v/v％接种物加入到含100μg/mL氨苄青霉素的在500mL带挡板摇瓶内的100mL培养基中。处理条件包括整个试验温度为30℃、以250rpm振荡。在0.4 OD_600nm时，开始质粒基因的诱导。在诱导时，加入0.5mM IPTG、0.5％阿拉伯糖、0.5mM维生素B6和0.2mL Balch维生素(Balch，W.E.等，“产甲烷菌：对独特生物群的重新评价”，Microbiol.Rev.43：260-296，(1979))。在开始诱导后3小时加入1gL-色氨酸、5g/L丙酮酸钠、0.04mM吡哆醛-5’-磷酸(“PLP”)和0.2％吐温20(聚氧乙烯20-失水山梨糖醇单月桂酸酯)。某些处理包括在诱导开始后3小时加入2.5mM癸酸钠。在6.5、25和50小时采集用于莫纳甜分析和确定细胞干重的样品。 

利用实施例13所描述的方法确定莫纳甜流出的量。 

表6.1 

大肠杆菌排出的莫纳甜/细胞干重 

	莫纳甜/细胞干重    (莫纳甜(mg)/dcw(g))
			菌株	25小时	50小时
大肠杆菌BL21 DE3 aspCproApET32和pProNde w/otolC(对照)	nd	nd
			大肠杆菌BL21 DE3 aspCproApET32和pProNde w/o tolC(对照)	0.11	0.09
大肠杆菌BL21 DE3 aspCproApET32和tolCpProNde	0.69	0.50
			大肠杆菌BL21 DE3 aspCproApET32和tolCpProNde	1.18	0.86

nd：未检测到 

表6.2 

大肠杆菌排出的平均莫纳甜/细胞干重 

	莫纳甜/细胞干重(莫纳甜(mg)/dcw(g))
			菌株	25小时	50小时
大肠杆菌BL21 DE3 aspCproApET32和pProNde w/o tolC(对照)	0.056	0.043
			大肠杆菌BL21 DE3 aspCproApET32和tolCpProNde	0.939	0.679

如上所述，在25小时采样点上，过表达TolC的菌株排出0.939莫纳甜(mg)/g细胞干重，而没有TolC过表达的菌株是0.056mg/g。TolC通道利用度上升的菌株内莫纳甜的转运升高了16.8倍。在50小时采样点上观察到了同样的趋势，转运的 莫纳甜升高了15.8倍。这些数据说明有tolC基因过表达的大肠杆菌菌株内被转运的莫纳甜更多。 

实施例7 

在大肠杆菌内tolC过表达结合诱导AcrAB流出泵可增加莫纳甜的排出试验证明，在大肠杆菌内通过加入2.5mM癸酸钠可诱导AcrAB多药流出泵。在本实施例中，评价了诱导AcrAB流出泵与增加TolC通道利用度的组合。另外还用2.5mM癸酸钠处理过表达tolC基因的大肠杆菌菌株以同时诱导AcrAB泵。 

利用实施例13所描述的方法确定莫纳甜流出的量。 

表7.1 

2.5mM癸酸钠处理：大肠杆菌排出的莫纳甜/细胞干重 

	莫纳甜/细胞干重(莫纳甜    (mg)/dcw(g))
			菌株	25小时	50小时
大肠杆菌BL21 DE3 aspCproApET32和pProNde w/o tolC(对照)	0.17	0.11
			大肠杆菌BL21 DE3 aspCproApET32和pProNde w/o tolC(对照)	0.19	0.09
大肠杆菌BL21 DE3 aspCproApET32和tolCpProNde	8.88	7.99
			大肠杆菌BL21 DE3 aspCproApET32和tolCpProNde	12.19	10.23

表7.2 

2.5mM癸酸钠处理：大肠杆菌排出的平均莫纳甜/细胞干重 

	莫纳甜/细胞干重(莫纳甜(mg)/dcw(g))
			菌株	25小时	50小时
大肠杆菌BL21 DE3 aspCproApET32和pProNde w/o tolC(对照)	0.18	0.10
			大肠杆菌BL21 DE3 aspCproApET32和tolCpProNde	10.53	9.11

n＝2处理的平均值 

如上表所述，在通过癸酸钠处理来诱导AcrAB转运系统的条件下，与未有与tolC基因过表达的处理相比，25和50小时时间点上，与tolC基因过表达组合的癸酸钠处理可使大肠杆菌内莫纳甜的转运分别升高58.5和91.1倍。这些数据说明tolC基因过表达与诱导AcrAB转运系统的组合对增加莫纳甜流出更有利。 

实施例8 

谷氨酸棒状杆菌谷氨酸营养缺陷型(缺陷的)菌株内莫纳甜的排出和/或生产增多 

谷氨酸棒状杆菌ATCC株13032是谷氨酸生产菌株。NADP⁺-依赖性的异柠檬酸脱氢酶基因(ICD；EC 1.1.1.42，Gen bank登录号X71489)是三羧酸循环的关键酶之一，可将D-异柠檬酸转化成2-氧代戊二酸、CO₂和NADPH。2-氧代戊二酸可进一步还原胺化形成谷氨酸。Icd基因的灭活可导致谷氨酸营养缺陷型。Eikmanns，B.J.等“编码异柠檬酸脱氢酶的谷氨酸棒状杆菌icd基因的克隆、序列分析和灭活以及该酶的生化特征(Cloning，sequence analysis，and inactivation of theCorynebacterium glutamicum icd gene encoding isocitrate dehydrogenase andbiochemical characterization of the enzyme)”，J Bacteriol.，177：774-782，(1995)。从Hermann Sahm教授处(Institut fur Biotechnologie des Forschungszentrums Julich，德国)获得了两个icd突变株。根据icd突变株无法在未添加谷氨酸的基本培养基上生长的特性可以确认谷氨酸营养缺陷型。用位于pEKEX-2载体(Eikmanns等，Gene102：93-98，(1991))上的莫纳甜操纵子(aspC/proA)转化icd突变株。诱导莫纳甜操纵子可导致莫纳甜合成并排出细胞。 

用APpEKEX-2转化的谷氨酸棒状杆菌13032菌株(带或不带灭活的icd基因)在添加5μg/mL氯霉素的LB培养基中培养过夜，培养条件为30℃、250rpm振荡。对于试验处理摇瓶来说，每个摇瓶加入100mL Kraemer A培养基。Hoisted C.和Kraemer，R.，“流出载体系统参与谷氨酸棒状杆菌内谷氨酸排出的证据(Evidencefor an efflux carrier system involved in the secretion of glutamate by Corynebacteriumglutamicum)”，Arch.Microbiol 151：342-347，(1989)。KraemerA培养基包含(每升)：5g(NH₄)₂SO₄、5g尿素、2g KH₂PO₄、1.53 K₂HPO₄、0.249g MgSO_4*7H₂O、50g葡萄糖、0.01g FeSO₄-7H₂O、0.01g MnSO₄-H₂O、0.01g CaCl₂-2H₂O、0.03mgZnSO₄-7H₂O、0.1mg H₃BO₃、0.07mg CaCl₂-6H₂O、0.01mg NiCl₂-2H₂O、0.03mgCuCl₂-2H₂O、0.1mg来自(NH₄)₆Mo₇O₂₄-4H₂O的Mo⁺⁶和1μg生物素。PH调至7.0。所有摇瓶(盛有谷氨酸营养缺陷型菌株(icd2)以及野生型对照)都添加5mM谷氨酸。 

为了处理，将4-7 v/v％接种物加入到500mL带挡板摇瓶内的100mL培养基中。处理条件包括整个试验温度为30℃、以250rpm振荡。在0.4-0.7 OD_600nm时，开始莫纳甜操纵子的诱导。0.5mM IPTG用于诱导，在诱导时，加入0.5mM维生素B6和0.04mM吡哆醛-5’-磷酸(“PLP”)。在开始诱导后3小时加入1gL-色氨 酸、5g/L丙酮酸钠和10μg/mL氨苄青霉素。在接种后约24和48小时(运行时间)采集用于莫纳甜分析和确定细胞干重的样品。 

表8.1 

谷氨酸营养缺陷型和对照的莫纳甜/单位生物量 

	运行时间
				菌株	菌株类型	24.5	48
谷氨酸棒状杆菌13032 icd2 no76::APpEKEX2	谷氨酸营养缺陷型	4.01	15.97
				谷氨酸棒状杆菌13032对照/APpEKEx2(5mM谷氨酸)	野生型对照	0.16	0.28

结果表示为莫纳甜/细胞干重(莫纳甜(mg)/dcw(g)) 

在所有采样时间点上两种处理都是n＝3 

由于莫纳甜具有谷氨酸主链，将莫纳甜转运出细胞的一个可能候选者是谷氨酸流出转运蛋白。然而，到目前为止，在棒状杆菌内还未鉴定出谷氨酸转运蛋白。在谷氨酸转运蛋白能够转运莫纳甜的事件中，如果不被现有理论所束缚，那么预计在谷氨酸营养缺陷型中如果没有对谷氨酸转运的竞争，就会有更多的莫纳甜被转运蛋白流出。另外，在谷氨酸棒状杆菌中，丙酮酸是谷氨酸和莫纳甜合成的中间体。由于在谷氨酸产生细菌内有较高的碳流向谷氨酸，因此使用谷氨酸合成缺陷的棒状杆菌菌株可导致丙酮酸向莫纳甜的转化增加。ICD酶在能量产生和中间代谢中都发挥作用(Eikmanns，B.J.等“编码异柠檬酸脱氢酶的谷氨酸棒状杆菌icd基因的克隆、序列分析和灭活以及该酶的生化特征(Cloning，sequence analysis，andinactivation of the Corynebacterium glutamicum icd gene encoding isocitratedehydrogenase and biochemical characterization of the enzyme)”，J Bacteriol.，177：774-782，(1995))，因此在含有灭活icd基因的菌株内生产莫纳甜将更有优势。另外一种可能是ICD上游反应所积聚的中间体可活化流出泵的形成，这样就会阻止这些中间体的积聚，这个流出泵能够转运莫纳甜。 

用莫纳甜操纵子(aspCproApEKEX-2)转化的谷氨酸棒状杆菌13032 icd2谷氨酸营养缺陷型生产的莫纳甜平均达到每克细胞干重15.97毫克，而含有莫纳甜操纵子的野生型对照所生产的莫纳甜只有每克细胞干重0.28毫克。这些结果说明含有灭活icd基因并用莫纳甜操纵子转化的谷氨酸棒状杆菌13032谷氨酸营养缺陷型所排出的莫纳甜比含有功能性icd基因的野生型菌株高57倍。 

实施例9 

大肠杆菌谷氨酸营养缺陷型(icdA缺陷)菌株应该具有莫纳甜排出升高的潜能 

在用低水平的萘啶酸在营养平板上筛选大肠杆菌和其他细菌的突变株时，据报道，耐药的发生是因为在不同遗传位点上发生的突变。一个这种位点是编码异柠檬酸脱氢酶的icdA基因。在icdA基因上的一个突变可导致谷氨酸营养缺陷型和大量柠檬酸和异柠檬酸积聚，二者都是IcdA所催化反应之前的中间体。根据如下现象可以预测中间体的积聚与萘啶酸耐受之间的关系：代谢产物/中间体活化流出泵的形成，其中流出泵可将萘啶酸从细胞去除从而防止其毒性。据报道，icdA突变株内的acrAB转录升高，证明在大肠杆菌icdA突变株内，萘啶酸耐受的表达需要AcrAB-TolC流出泵。Helling，R.B.等，“大肠杆菌内的毒性废物处理(Toxic wastedisposal in Escherichia coli)”，J Bacteriol.184：3699-3703，(2002)。因此，在含有icdA突变并且被莫纳甜生产所需基因转化的大肠杆菌菌株内，预计会因为AcrAB-TolC转运蛋白的诱导而使莫纳甜转运增多。 

实施例10 

在大肠杆菌内以苹果酸为碳底物可增加莫纳甜排出/流出莫纳甜含有谷氨酸的主链，或者被认为是4-取代谷氨酸衍生物。因此莫纳甜可被转位谷氨酸以交换底物如苹果酸的转运蛋白转运出细胞如细菌细胞。阿布属质粒内的谷氨酸/苹果酸转运蛋白由DiT2基因编码，可以反向转运的方式转位谷氨酸和苹果酸。Renne，P.等，“阿布属突变株dct在质粒谷氨酸/苹果酸转位分子DiT2中是缺失的(The Arabidopsis mutant dct is deficient in the plastidic glutamate/malatetranslocator DiT2)”，Plant J.35：316-331，(2003)；Taniguchi，M.等，“拟南芥内质粒2-氧代戊二酸/苹果酸和二羧酸转运蛋白的鉴定和特征(Identifying andCharacterizing Plastidic 2-Oxoglutarate/Malate and Dicarboxylate Transporters inArabidopsis thaliana)”，Plant and Cell Physiology 43：706-717，(2002)。谷氨酸/苹果酸转运蛋白家族与菠菜光合小体中的2-氧代戊二酸/苹果酸转运蛋白同源的，与大肠杆菌内的CitT转运蛋白相关，被认为是柠檬酸和琥珀酸的反向转运蛋白。Pos，K.M.等，“大肠杆菌柠檬酸载体CitT：与菠菜光合小体来源的2-氧代戊二酸/苹果酸转位分子相关的新型真细菌转运蛋白家族的一个成员(The Escherichia colicitrate carrier CitT：a member of a novel eubacterial transporter family related to the2-oxoglutarate/malate translocator from spinach chloroplasts)”，Journal of Bacteriology180：4160-4165，(1998)。据报道，大肠杆菌CitT蛋白是参与二羧酸和三羧酸转运 的真细菌转运蛋白新型家族的一个成员。有一种可能是这个转运蛋白可允许宿主摄取苹果酸，同时排出谷氨酸或莫纳甜进入上清。苹果酸发挥增强莫纳甜转运的功能的另一种可能是由于苹果酸可作为替代碳源来影响生长速度和碳在代谢途径中的分布，这种代谢途径与葡萄糖明显不同。苹果酸还可以被两个基因编码的苹果酸酶内在转化成丙酮酸(Fischer，E.和Sauer，U.，“利用GC-MS研究大肠杆菌突变株在中央碳代谢中的代谢流通特征(Metabolic flux profiling of Escherichia colimutants in central carbon metabolism using GC-MS)”，Eur.J.Biochem.270：880-891，(2003))，以及由于丙酮酸是莫纳甜的一个前体，因此更高的丙酮酸利用度可使莫纳甜的产量增加，进而莫纳甜的分泌增多。以苹果酸作为主要碳源的大肠杆菌的生长可使分泌到培养基中的莫纳甜增多。 

为了进行接种，大肠杆菌BL21 DE3 aspC/proA/pET30菌株在含50μg/mL卡那霉素的LB培养基内、37℃、250rpm振荡培养过夜。为了进行试验处理，使用如实施例6所描述的Trp-1培养基(Zeman等，Folia Microbiol.35：200-204，(1990))和50μg/mL卡那霉素。苹果酸和葡萄糖在各自的处理中起始浓度都是4g/L。为了处理摇瓶，将2.2 v/v％接种物加入到250mL带挡板摇瓶内的50mL培养基中。为了进行葡萄糖处理，在0.8 OD_600nm开始诱导莫纳甜操纵子。为了进行苹果酸处理，在0.25 OD时开始诱导。在诱导时，加入0.5mM IPTG、0.5mM维生素B6和0.2mL Balch维生素(Balch，W.E.等，“产甲烷菌：对独特生物群的重新评价(Methanogens：reevaluation of a unique biological group)”，Microbiol.Rev.43：260-296，(1979))。在诱导时温度降低到30℃。在开始诱导后3小时加入1gL-色氨酸、5g/L丙酮酸钠、0.04mM吡哆醛-5’-磷酸(“PLP”)、10μg/mL氨苄青霉素和0.2％吐温20(聚氧乙烯20-失水山梨糖醇单月桂酸酯)。在诱导后24小时采集用于莫纳甜分析和确定细胞干重的样品。 

表10.1 

以葡萄糖或苹果酸作为碳源的大肠杆菌总结表 

	莫纳甜/dcw(mg/g)
				处理编号	碳源	24小时	24小时平均
1	葡萄糖	6.39
				2	葡萄糖	6.17	6.28
3	苹果酸	7.19
				4	苹果酸	8.25	7.72

从上述结果可以看出，与葡萄糖处理相比，用苹果酸处理可使转运的莫纳甜/ 单位生物量上升(7.72到6.28)。苹果酸作为主要碳源可使转运的莫纳甜/单位生物量升高23％。利用苹果酸作为主要碳源或补充碳源结合所描述的已证明或预计能增加莫纳甜流出的其他条件可导致莫纳甜的合成和排出进一步增加。 

实施例11 

通过在大肠杆菌内删除推测的流出转运蛋白(″PET″)Aae转运蛋白 

可增加莫纳甜的排出 

已有报道证实在细菌、酵母和植物内存在一个推测的流出转运蛋白家族(″PET″)。已在大肠杆菌中鉴定出的带登录号的PET家族成员包括YjcQ(P32715)、YccS(P75870)、YhfK(P45537)和YhcP(P46481)。到目前为止，PET家族成员中只有一个AaeAB/YhcP的功能被确定。Van Dyk，T.K.等，“大肠杆菌AaeAB流出泵的特征：代谢减压阀？(Characterization of the Escherichia coli AaeAB efflux pump：ametabolic reliefvalve？)”，J Bacteriol.2004 Nov；186：7196-7204，(2004)。细菌和酵母蛋白含有一个重复的内部重复元件，该元件含有一个约含170个残基的N端疏水序列、6个推测的α螺旋跨膜扳手(TMS)，随后是一个大的C端疏水胞浆区。植物蛋白只有一个这样的单位，但是它们有较大的C端胞浆区。拟南芥(Arabidopsisthaliana)至少编码7个PET家族的类似物。革兰氏阴性细菌的蛋白有时由也包含编码膜融合蛋白的基因的操纵子中发现的基因编码。这个事实强烈暗示PET家族的蛋白是流出泵。Harley，K.T.和Saier，M.H.Jr.，“一个新的普遍存在的推测流出转运蛋白家族(A novel ubiquitous family of putative efflux transporters)”，J MolMicrobiol Biotechnol.2：195-198，(2000)。 

用于本试验的PET突变株得自位于圣地亚哥的哥伦比亚大学的Milton Saier教授，包括大肠杆菌BW 25113野生型和4个单敲除突变株大肠杆菌BW 25113ΔyhcP、大肠杆菌BW 25113ΔyccS、大肠杆菌BW 25113 ΔyjcQ、大肠杆菌BW 25113ΔyhfK和四突变株大肠杆菌BW 25113 ΔyhcP ΔyccS ΔyjcQ ΔyhfK。所有菌株都用pProNde载体上的莫纳甜操纵子基因转化，如本申请的其他实施例所描述。菌株在含50μg/mL卡那霉素的Luria-Bertani(″LB″)培养基内、37℃、250rpm振荡培养过夜。 

为了进行试验处理，按照如下方法制备用于提高色氨酸在大肠杆菌细胞内的产量的基本培养基Trp-1+葡萄糖培养基(Zeman等，Folia Microbiol.35：200-204， (1990))。向800mL纳米纯的水中加入下列试剂：2g(NH₄)₂SO₄和13.6g KH₂PO₄。PH调至7.0，体积增加到948mL，并对培养基进行高压灭菌。灭菌后在1.8mL体积的培养基中加入0.2g MgSO_4*7H₂O、0.01g CaCl_2*2H₂O和0.5mg FeSO_4*7H₂O，然后加入0.2mL Neidhardt微量营养素溶液(Neidhardt，F.C.等，“肠道细菌培养基(Culture medium for Enterobacteria)”，J.Bacteriol.119：736-746(1974))。Neidhardt培养基包含(每升)：0.18g(NH₄)₆(MO₇)₂₄-4H₂O、1.24g H₃BO₃、0.36g CoCl₂-6H₂O、0.12g CuSO₄(无水的)、0.8g MnCl₂-4H₂O和0.14g ZnSO₄-7H₂O。单独制备50％的葡萄糖溶液并通过过滤除菌。将40mL葡萄糖溶液和10mL 1M 3-吗啉代丙磺酸(“MOPS”)缓冲液加入到基础培养基(950mL)中，最后体积为1L。 

对于莫纳甜生产摇瓶，将3-4 v/v％接种物加入到含50μg/mL卡那霉素的在500mL带挡板摇瓶内的100mL培养基中。处理条件包括整个试验以250rpm振荡、温度为37℃直到开始诱导，然后温度降到30℃，随后开始诱导。在0.6 OD_600nm 时，开始质粒基因的诱导。在诱导时，加入0.5mM IPTG、0.5％阿拉伯糖、0.5mM维生素B6和0.2mL Balch维生素。在开始诱导后3.5小时加入1gL-色氨酸、5g/L丙酮酸钠、0.04mM吡哆醛-5’-磷酸(“PLP”)、10μg/mL氨苄青霉素和0.2％吐温20(聚氧乙烯20-失水山梨糖醇单月桂酸酯)。在24和30或31小时采集用于莫纳甜分析和确定细胞干重的样品。按照实施例13的描述通过LC/MS/MS检测莫纳甜。结果显示如下。 

表11.1 

30小时样品的莫纳甜平均值/细胞干重 

菌株	30小时莫纳甜平均值/dcw(mg/g)
		E coli BW 25113野生型::aspCproApProNde	1.81
大肠杆菌BW 25113 ΔyhcP::aspCproApProNde	2.02
		大肠杆菌BW 25113 ΔyccS::aspCproApProNde	1.86
大肠杆菌BW 25113 ΔyjcQ::aspCproApProNde	1.92
		大肠杆菌BW 25113 ΔyhfK::aspCproApProNde	1.60
大肠杆菌BW 25113 ΔyhcP ΔyccS ΔyjcQ ΔyhfK::aspCproApProNde	6.16

所有6个菌株都是n＝2 

四PET突变株大肠杆菌BW 25113 ΔyhcP(aaeB)ΔyccS ΔyjcQ ΔyhfK排出的莫纳甜/细胞干重为6.16，明显高于野生型或四个单突变株，其中莫纳甜/g细胞干重的 范围平均为1.6-2.02mg。 

据报道，YhcP流出系统对某些羧基化的芳香族羧酸具有较高的特异性。AaeAB(YhcP)流出系统的狭窄特异性与多药流出系统如AcrAB-TolC明显不同。Van Dyk，T.K.等，“大肠杆菌AaeAB流出泵的特征：代谢减压阀？”，J.Bacteriol.186：7196-7204，(2004)。已有研究表明AaeAB流出系统是“代谢减压阀”，估计代谢紊乱/内部应激如果发生(如莫纳甜或莫纳甜中间体积聚)，则流出系统的表达将被激活。 

在四PET(Aae)转运蛋白缺失的背景下可以观察到莫纳甜流出这一事实说明一个或多个PET转运蛋白在一个或多个莫纳甜中间体的流出中可能发挥作用。因此，在经改造后可产生莫纳甜但是却含有这四个PET/Aae转运蛋白联合灭活的菌株中，可能会有莫纳甜产物丢失的减少，从而有更多的莫纳甜被细胞生产出来并被转运系统AcrAB TolC/EmrAB TolC等转运。另外一个可能是在四PET突变的背景下，会有更多的可能与莫纳甜生物合成相关或不相关的代谢物积聚，这又会诱导莫纳甜转运蛋白，导致莫纳甜的流出增多。 

不同PET转运蛋白的各种缺失组合可能和四PET转运蛋白缺失菌株一样有效或者更有效。四PET突变背景与增加莫纳甜转运的其他任何转运蛋白或条件组合可产生出莫纳甜转运潜能更高的菌株。 

上述结果证明，与相应的野生型对照菌株相比，含有YhcP(AaeB)、YccS、YjcQ和YhfK推测流出转运蛋白(PET)缺失组合的大肠杆菌菌株可通过直接或间接机制排出更高的莫纳甜/细胞干重。 

实施例12 

谷氨酸棒状杆菌的转化 

在说明书提到转化谷氨酸棒状杆菌的地方，使用的是下列方法。 

谷氨酸棒状杆菌的电感受态细胞通过将起始培养物(培养过夜)接种到200mlMB培养基(5g/L酵母提取物，15g/L胰蛋白胨，5g/L大豆胨(soytone)，5g/L氯化钠)中使初始OD_600nm达到0.1来制备。培养物在200 rpm振荡条件下孵育，直到OD_600nm达到0.7，4℃离心收集细胞。细胞团用40m1用冰预冷的缓冲液(20mMHEPES，pH 7.2，含5％甘油)洗涤三次。然后用20ml用冰预冷的10％v/v甘油洗涤2次，细胞团重悬于1ml 10％v/v甘油中。经洗涤的电感受态细胞按每150μL/ 管冷冻储存于-80℃。 

在转化电感受态谷氨酸棒状杆菌细胞之前，在冰上冻溶150μL电感受态细胞。将1μg所需质粒加入到细胞内，在冰上孵育5分钟，然后转移到冷冻的0.2cm槽内。在细胞悬液上覆盖0.8mL用冰预冷的10％甘油，小心避免各层混合，在200ohm、25 uFd、12.5 kV/cm条件下电穿孔。将细胞悬液转移到4 mL 46℃预热的MB培养基内，46℃孵育6分钟，不振荡。细胞悬液在20℃、200rpm条件下孵育50分钟，然后接种到含合适筛选抗生素的MB平板上，30℃孵育使转化的谷氨酸棒状杆菌菌株生长。 

实施例13 

检测莫纳甜和莫纳甜立体异构体的方法 

本实施例描述了用于检测莫纳甜、色氨酸和谷氨酸是否存在的方法。本实施例还描述了分离和检测莫纳甜的四种立体异构体的方法。 

用LC/MS/MS多反应监测(″MRM″)分析莫纳甜和色氨酸 

利用Waters/Micromass液相色谱串联质谱(“LC/MS/MS”)仪对体外或体内生化反应所生产的莫纳甜和色氨酸的混合物进行分析，该设备包括一个Waters 2795液相色谱仪和一个Waters 996光电二极管阵列(PDA)吸光度检测仪，后者位于色谱仪和Micromass Quattro Ultima三联四极质谱仪之间起串联作用。利用2.1mm×250mm的Xterra MS C₈反向色谱柱在40℃进行LC分离。LC流动相包含A)含0.05％(v/v)三氟乙酸的水和B)含0.05％(v/v)三氟乙酸的甲醇。 

梯度洗脱为：0-4分钟5％B到35％B线性梯度，4-6.5分钟35％B到60％B线性梯度，6.5-7分钟60％B到90％B线性梯度，7-11分钟在90％B等度，11-12分钟90％B到95％B线性梯度，12-13分钟95％B到5％B线性梯度，各轮之间有5分钟的重平衡期。流速为0.25毫升/分钟，监测200nm到400nm之间的PDA吸光度。ESI-MS的所有参数都根据目的分析物的质子化分子离子([M+H]⁺)的生成情况和特征性碎片离子的生成情况进行了优化和筛选。下面的设备参数用于莫纳甜和色氨酸的LC/MS/MS多反应监测(“MRM”)分析：毛细管：3.5kV；圆锥(Cone)：40V；六角形(Hex)1：20V；孔径：0V；六角形(Hex)2：0V；来源温度：100℃；去溶剂化温度：350℃；去溶剂化气体：500L/h；圆锥气体：50L/h；低质量分辨率(Q1)：12.0；高质量分辨率(Q1)：12.0；离子能量：0.2；入口：-5V；碰撞能量： 8；出口：1V；低质量分辨(Q2)：15；高质量分辨(Q2)：15；离子能量(Q2)：3.5；倍增器：650。5个莫纳甜特异性亲本到女儿(parent-to daughter)MRM跃迁用于体外和体内反应中莫纳甜的特异性监测。所监测到的跃迁是293.1到158.3、293.1到168.2、293.1到211.2、293.1到230.2以及293.1到257.2。监测到的色氨酸的MRM跃迁为204.7到146.4。为了内标定量莫纳甜和色氨酸，分析了四个校正标准，其中包含四个不同比例的分析物与d5-色氨酸和d5-莫纳甜的混合物。这些数据进行线性最小二乘法分析形成莫纳甜和色氨酸的校正曲线。每个样品中加入固定量的d5-色氨酸和d5-莫纳甜，反应比例(莫纳甜/d5-莫纳甜；色氨酸/d5-色氨酸)与上述校正曲线结合用于计算混合物中每种分析物的量。 

莫纳甜的手性LC/MS/MS(MRM)检测 

体外和体内反应中莫纳甜立体异构体分布的确定通过1-氟-2-4-二硝基苯基-5-L-丙氨酸酰胺(“FDAA”)的衍生化再用反相LC/MS/MS MRM检测来完成。 

用FDAA衍生化莫纳甜 

在50μtL样品或标准物中加入200μL1％的FDAA丙酮溶液。加入40μL 1.0M的碳酸氢钠，混合物在40℃孵育1小时，偶尔加以搅拌。取出样品并冷却，用20μL2.0M HCl中和(要影响缓冲的生物混合物的中和可能需要更多的盐酸)。除气完成后，样品可用于LC/MS/MS分析。 

LC/MS/MS多反应监测用于确定体外和体内反应中莫纳甜立体异构体的分布 

利用上面章节中所描述的LC/MS/MS设备完成分析。能够分离莫纳甜所有四种立体异构体(特别是FDAA-莫纳甜)的LC分离在40℃的Phenomenex Luna2.0×250mm(3μm)C18反相色谱柱上完成。LC流动相包含A)含0.05％(质量/体积)醋酸铵的水和B)乙睛。洗脱条件为0-2分钟13％B等度，2-15分钟13％B到30％B线性梯度，15-16分钟30％B到80％B线性梯度，16-21分钟80％B等度，和21-22分钟80％B到13％B线性梯度，各轮之间有8分钟的重平衡期。流速为0.23毫升/分钟，监测200nm到400nm之间的PDA吸光度。ESI-MS的所有参数都根据FDAA-莫纳甜的质子化分子离子([M-H]^-)的生成情况和特征性碎片离子的生成情况进行了优化和筛选。 

下列设备参数用于以阴离子ESI/MS模式进行的莫纳甜LC/MS分析：毛细管：2.0kV；圆锥：25V；六角形1：10V；孔径：0V；六角形2：0V；来源温度：100℃；去溶剂化温度：350℃；去溶剂化气体：500L/h；圆锥气体：50L/h；低质 量分辨率(Q1)：12.0；高质量分辨率(Q1)：12.0；离子能量：0.2；入口：-5V；碰撞能量：20；出口：1V；低质量分辨(Q2)：12；高质量分辨(Q2)：12；离子能量(Q2)：3.0；倍增器：650。3个FDAA-莫纳甜特异性亲本到女儿MRM跃迁用于体外和体内反应中FDAA-莫纳甜的特异性监测。跃迁为543.6到268.2、543.6到499.2以及543.6到525.2。根据与纯化的莫纳甜立体异构体比较的色谱保留时间和质谱数据鉴定FDAA-莫纳甜立体异构体。 

实施例14 

用水杨酸诱导可增加莫纳甜的转运 

用aspCProApEKEX-2谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032菌株在添加25μg/mL卡那霉素的LB培养基中培养过夜，培养条件为37℃、250rpm振荡。对于试验处理摇瓶来说，每个摇瓶加入100mL KraemerA培养基。Hoisted C.和Kraemer，R.，“流出载体系统参与谷氨酸棒状杆菌内谷氨酸排出的证据(Evidence for an efflux carriersystem involved in the secretion of glutamate by Corynebacterium glutamicum)”，Arch.Microbiol 151：342-347，(1989)。Kraemer A培养基包含(每升)：5g(NH₄)₂SO₄、5g尿素、2g KH₂PO₄、1.53 K₂HPO₄、0.249g MgSO_4*7H₂O、50g葡萄糖、0.01gFeSO₄-7H₂O、0.01g MnSO₄-H₂O、0.01g CaCl₂-2H₂O、0.03mg ZnSO₄-7H₂O、0.1mgH₃BO₃、0.07mg CaCl₂-6H₂O、0.01mg NiCl₂-2H₂O、0.03mg CuCl₂-2H₂O、0.1mg来自(NH₄)₆Mo₇O₂₄-4H₂O的Mo⁺⁶和1μg生物素。PH调至7.0。 

为了处理，将4.2v/v％接种物加入到在500mL带挡板摇瓶内的100mL培养基中。处理条件包括全程37℃孵育并以250rpm振荡。在接种后1小时加入水杨酸钠(0、1或2mM)。在0.45-0.6 OD_600nm时，开始莫纳甜操纵子的诱导。0.5mM IPTG用于诱导，在诱导时加入0.5mM维生素B6和0.04mM吡哆醛-5’-磷酸(“PLP”)。在开始诱导后3小时加入1gL-色氨酸、5g/L丙酮酸钠和10μg/mL氨苄青霉素。在23.5和48小时采集用于莫纳甜分析和确定细胞干重的样品。 

表14.1 

水杨酸的诱导可提高莫纳甜/细胞干重 

	莫纳甜/dcw(mg/g)
			水杨酸钠(mM)	23.5小时	48小时
0	4.34	9.30
			1	7.41	9.94
2	7.54	9.82

[0286] MarA可活化mar调节子的表达，其中包括acrAB、tolC和marRAB，而MarR可通过抑制MarA的合成来下调这个反应。试验证实，加入某些抗生素、弱的芳香酸如水杨酸以及结构各不相同的其他化合物如解偶联剂羰基氰氯苯腙(″CCCP″)可引起mar调节子的诱导，进而导致AcrAB和TolC的表达。Grkovic，S.等，“细菌药物外排系统的调节(Regulation of Bacterial Drug Export Systems)”，Microbiologyand Molecular Biology Reviews 66：671-701，(2002)。 

另外，在存在CCCP、弱酸水杨酸和许多结构不相关的其他药物时大肠杆菌的EmrAB多药泵可被诱导。去阻遏是由MarR型的抑制蛋白EmrR控制的。Cohen，S.P.等，“水杨酸诱导大肠杆菌内的抗生素耐药性：mar操纵子和非mar-依赖型途径的活化(Salicylate induction of antibiotic resistance in Escherichia coli：activation ofthe mar operon and a mar-independent pathway)”，J.Bacteriol.175：7856-7862，(1993)；Lomovskaya，O.等，“EmrR是大肠杆菌多药耐药泵EmrAB的负调节因子(EmrR is a negative regulator of the Escherichia coli multidrug resistance pumpEmrAB)”，J.Bacteriol.177：2328-2334，(1995)。因此，加入水杨酸可提高大肠杆菌内AcrAB和emrAB转运系统的活性。给棒状杆菌添加水杨酸可诱导AcrAB/EmrAB的同源物或其他转运蛋白，导致莫纳甜的转运增多。 

因此用1mM或2mM水杨酸钠处理谷氨酸棒状杆菌可导致莫纳甜的转运增多。按照实施例13的描述进行莫纳甜分析。在48小时时可以看到莫纳甜的流出增加7％，而23.5小时时被转运莫纳甜的增加70％。 

实施例15 

斯氏泛菌内莫纳甜产生和排出的证明 

通过将1％斯氏泛菌细胞接种物在营养肉汤内培养过夜来制备点感受态的斯氏泛菌(ATCC 8200)。细胞在26℃孵育，250rpm振荡，直到OD 600达到约0.6。离心(10分钟，10,000×g)使细胞成团，用50ml 10mM HEPES(pH 7.0)洗涤。用25ml 10mM HEPES缓冲液(pH 7.0)重复洗涤一次，然后进行和上面一样的离心。细胞再用25ml 10％甘油洗涤一次。离心以后，细胞重悬于500μL10％甘油中。每管40μL冷冻，储存于-80℃直到使用。 

按照Stratagene QuikChange位点特异性突变试剂盒(斯加特基因公司(Stratagene)，Inc.)所描述的方法，利用诱变寡核苷酸(下划线是Nde I基因座)，可以通过位点特异性的突变改变pPROLarA.122(克隆科技实验室有限公司(ClonTechLaboratories，Inc.))，在bp 132(克隆科技实验室有限公司所描述的核苷酸编号)处引入Nde I限制性酶切位点，形成载体pPRONde： 

5’-GAGGAGAAAGGTACATATGGGTGAACAGAAAC-3’(SEQ ID NO：16) 

5’CAGTTTCTGTTCACCCATATGTACCTTTCTCC-3’(SEQ ID NO：17) 

热循环条件： 

1)96℃ 5分钟 

2)96℃ 30秒 

3)55℃ 45秒 

4)72℃ 3分钟 

5)重复步骤2-4；24次 

6)72℃ 10分钟 

配方： 

10×扩展聚合酶缓冲液       5μL 

dNTP(各10mM)               1μL 

pPRONde(约50ng/uL)         0.1μL 

PCR引物(各)                0.5μL 

扩展聚合酶                 0.5μL 

水                         42.4μL 

共计                       50μL 

得到的PCR产物用PCR提纯试剂盒(恰根公司(Qiagen))纯化，并用Nde I限制性内切酶消化。然后在0.8％琼脂糖凝胶上凝胶纯化被消化的DNA并连接起来。通过乙醇沉淀法沉淀连接混合物，再用KpnI限制性内切酶消化以使所有亲本质粒都线性化。反应混合物转化到大肠杆菌电感受态细胞DH10B内。通过用KpnI限制性内切酶消化根据KpnI基因座的去除来筛选转化子。 

利用Quikchange定点诱变试剂盒(斯加特基因公司(Strategene)，La Jolla，CA)删除pPRONde载体上一个29bp的片段，已有报道表明载体内该片段的重复性可使载体在应激条件下不稳定。诱变所用引物为： 

5’-ACGTCTGTGTGGAATTCTCGGACACCGAGGAG-3’(SEQ ID NO：18)和 

5’-CTCCTCGGTGTCCGAGAATTCCACACAGACGT-3’(SEQ ID NO：19)。 

 按照厂商的说明书进行诱变。通过用EcoRI限制性内切酶消化来筛选克隆， 因为删除预期的DNA片段会产生一个新的EcoRI限制性酶切位点，突变体通过测序来确认。得到的载体命名为pPRONdeDel。利用限制性酶切位点NdeI和BamHI将aspC基因插入载体pPRONdeDel。随后利用限制性酶切位点BamHI和NotI将proA基因插入载体pPRONdeDel，得到载体aspC/proA/pPRONdeDel(APpPRONdeDel)。 

按照Bio-Rad电穿孔操作手册所描述的利用0.2cm槽和Bio-Rad Gene Pulser II系统将载体APpPRONdeDel转化到斯氏泛菌内。细胞在900μL SOC培养基中26℃孵育1小时，250rpm振荡，使细胞恢复。细胞接种到含卡那霉素(25μg/mL)的LB-琼脂平板上。 

为了进行接种，斯氏泛菌在含25μg/mL卡那霉素的Luria-Bertani(″LB″)培养基内、30℃、250rpm振荡培养过夜。为了进行试验处理，按照如下方法制备trp-1+葡萄糖培养基(Zeman等，Folia Microbiol.35：200-204，(1990))。向800mL纳米纯的水中加入下列试剂：2g(NH₄)₂SO₄和13.6g KH₂PO₄。PH调至7.0，体积增加到948mL，并对培养基进行高压灭菌。灭菌后在1.8mL体积的培养基中加入0.2gMgSO_4*7H₂O、0.01g CaCl_2*2H₂O和0.5mg FeSO_4*7H₂O，然后加入0.2mLNeidhardt微量营养素溶液。Neidhardt，F.C.等，“肠道细菌培养基”，J.Bacteriol.119：736-746(1974)。Neidhardt培养基包含(每升)：0.18g(NH₄)₆(MO₇)₂₄-4H₂O、1.24gH₃BO₃、0.36g CoCl₂-6H₂O、0.12g CuSO₄(无水的)、0.8g MnCl₂-4H₂O和0.14gZnSO₄-7H₂O。单独制备50％的葡萄糖溶液并通过过滤除菌。将40mL葡萄糖溶液和10mL 1M 3-吗啉代丙磺酸(“MOPS”)缓冲液加入到基础培养基(950mL)中，最后体积为1L。 

为了处理，将3.5-5.0 v/v％接种物加入到含25μg/mL卡那霉素的在500mL带挡板摇瓶内的100mL培养基中。处理条件包括整个试验以250rpm振荡，温度为37℃直到接种，然后降到30℃，随后诱导。在0.35-0.50 OD_600nm时，开始质粒基因的诱导。在诱导时，加入0.5mM IPTG、0.5％阿拉伯糖、0.5mM维生素B6和0.2mL Balch维生素。在开始诱导后3.0小时加入10g L-色氨酸、10g/L丙酮酸钠、0.04mM吡哆醛-5’-磷酸(“PLP”)和0.2％吐温20(聚氧乙烯20-失水山梨糖醇单月桂酸酯)。某些处理包括在诱导开始后3.0小时加入2.5mM癸酸钠和/或10μg/ml氨苄青霉素。在24、30和48小时采集用于莫纳甜分析和确定细胞干重的样品。 

表15.1 

斯氏泛菌排出的莫纳甜/细胞干重 

斯氏泛菌内莫纳甜操纵子、aspC-氨基转移酶和proA-醛缩酶的过表达可导致莫纳甜的流出(莫纳甜/细胞干重)升高。当培养基中加入吐温20和氨苄青霉素时，48小时的莫纳甜排出增加4到5倍。据报道，吐温和氨苄青霉素可通过影响细胞被膜从而辅助代谢物转运出细胞而使细胞应激。 

这是首次报道泛菌属和斯氏泛菌种内有莫纳甜的产生和排出。 

实施例16 

RobA蛋白的过表达可增加莫纳甜的排出 

RobA是DNA结合蛋白XylS/AraC亚科的成员，试验表明当其过表达时可诱导大肠杆菌对多种抗生素的耐药。据报道，RobA的过表达所诱导的多重抗生素耐药主要依赖于AcrAB流出泵的活化以及micF的活化。Tanaka T.等，“RobA诱导的多重抗生素耐药主要依赖于AcrAB流出泵的活化(RobA-induced multipleantibiotic resistance largely depends on the activation of the AcrAB efflux)”，MicrobiolImmunol.41：697-702，(1997)。MicF小RNA是由编码OmpC外膜孔道蛋白的基因分散编码的，可抑制另一种外面孔道蛋白OmpF的表达。MicF在莫纳甜流出中所扮演的确切角色还有待于证实。 

用于本试验的菌株包括大肠杆菌MG1655::aspC/proA/pProNdeDel，该菌株带有pUC19载体，大肠杆菌的robA基因被克隆到该载体内。对照菌株是带pUC19载体的大肠杆菌MG1655::aspC/proA/pProNde。robA基因扩增自大肠杆菌W3110，所用引物为5’TTAAGGCCGTCGACATGGATCAGGCCGGCATTAT3’(SEQ ID NO：20)和5’TTCCAAGGTTGGATCCCTAAACGATGCGGCAGGC3’(SEQ ID NO：21)，该引物可将SalI和BamHI基因座引入到扩增片段的末端。PCR片段克隆在载体pUC19(GenBank/EMBL登录号L09137)的SalI和BamHI基因座之间。为了进行接种，大肠杆菌菌株在含100μg/mL氨苄青霉素和50μg/mL卡那霉素的 Luria-Bertani(″LB″)培养基内、37℃、250rpm振荡培养过夜。 

为了进行试验处理，按照如下方法制备用于提高色氨酸在大肠杆菌内产量的基本培养基Trp-1+葡萄糖培养基(Zeman等，Folia Microbiol.35：200-204，(1990))。向800mL纳米纯的水中加入下列试剂：2g(NH₄)₂SO₄和13.6g KH₂PO₄。PH调至7.0，体积增加到948mL，并对培养基进行高压灭菌。灭菌后在1.8mL体积的培养基中加入0.2g MgSO_4*7H₂O、0.01g CaCl_2*2H₂O和0.5mg FeSO_4*7H₂O，然后加入0.2mL Neidhardt微量营养素溶液。Neidhardt，F.C.等，“肠道细菌培养基”，J.Bacteriol.119：736-746(1974)。Neidhardt培养基包含(每升)：0.18g(NH₄)₆(MO₇)₂₄ -4H₂O、1.24g H₃BO₃、0.36g CoCl₂-6H₂O、0.12g CuSO₄(无水的)、0.8g MnCl₂-4H₂O和0.14g ZnSO₄-7H₂O。单独制备50％的葡萄糖溶液并通过过滤除菌。将40mL葡萄糖溶液和10mL 1M 3-吗啉代丙磺酸(“MOPS”)缓冲液加入到基础培养基(950mL)中，最后体积为1L。 

为了处理，将3.5-5.0 v/v％接种物加入到含100μg/mL氨苄青霉素的在500mL带挡板摇瓶内的100mL培养基中。处理条件包括整个试验以250rpm振荡，温度为37℃直到接种，然后降到30℃，随后诱导。在0.35-0.50 OD_600nm时，开始质粒基因的诱导。在诱导时，加入1.0mM IPTG、0.5％阿拉伯糖、0.5mM维生素B6和0.2mL Balch维生素。在开始诱导后3小时加入10g L-色氨酸、10g/L丙酮酸钠、0.04mM吡哆醛-5’-磷酸(“PLP”)和0.2％吐温20(聚氧乙烯20-失水山梨糖醇单月桂酸酯)。某些处理包括在诱导开始后3小时加入2.5mM癸酸钠。在24、30和48小时采集用于莫纳甜分析和确定细胞干重的样品。 

表16.1 

大肠杆菌排出的莫纳甜/细胞干重 

	莫纳甜/dcw(mg/g)
					癸酸钠(mM)	30小时	48小时
大肠杆菌MG1655::aspCproA pProNdedel，pUC19(对照)	0	2.59	2.94
				大肠杆菌MG1655::aspCproA pProNdedel，robA pUC19	0	3.11	10.41

所有处理都是n＝2 

在48小时时，未用癸酸钠处理的RobA过表达可导致莫纳甜流出增多。当RobA过表达时，48小时的莫纳甜/细胞干重平均为10.41mg/g，而无RobA过表达时仅为2.94mg/g。RobA的过表达可使莫纳甜的流出升高3.5倍。这说明RobA的过表达对AcrAB的表达或micF有正面影响，导致莫纳甜的流出增多。MicF在莫纳甜流出中所扮演的确切角色还有待于证实。 

表16.2 

大肠杆菌排出的莫纳甜/细胞干重 

	莫纳甜/dcw(mg/g)
					癸酸钠(mM)	30小时	48小时
大肠杆菌MG1655::aspCproA pProNdedel pUC19(对照)	2.5	4.66	4.31
				大肠杆菌MG1655::aspC proA pProNdedel，robA pUC19	2.5	6.91	25.62

所有处理都是n＝2 

在48小时时，用2.5mM癸酸钠处理的RobA过表达可导致莫纳甜流出增多。当RobA过表达时，48小时的莫纳甜/细胞干重平均为25.62mg/g，而无RobA过表达时仅为4.31mg/g。在有癸酸钠存在的条件下RobA的过表达可使莫纳甜的流出升高超过5倍。这说明RobA的过表达和癸酸盐的加入对AcrAB的表达或micF有正面的并且可能是协同的影响，导致莫纳甜的流出增多。MicF在莫纳甜流出中所扮演的确切角色还有待于证实。 

表16.3 

大肠杆菌ΔacrAB排出的莫纳甜/细胞干重 

	莫纳甜/dcw(mg/g)
				24小时	30小时	48小时
大肠杆菌MG1655 deltaAcrAB::aspCproApProNdedel，pUC19(对照)	10.7	29.7	39.3
				大肠杆菌MG1655 deltaAcrAB::aspC proApProNde del robA pUC 19	45.7	58.6	81.7

所有处理都是n＝2 

所有处理中加入2.5mM癸酸钠 

在24、30和48小时时，添加2.5mM癸酸钠和RobA过表达可导致大肠杆菌MG1655 ΔAcrAB菌株的莫纳甜流出增多。当RobA过表达时，48小时ΔAcrAB菌株的莫纳甜/细胞干重平均为81.7mg/g，而无RobA过表达时仅为39.3mg/g。在有癸酸钠存在的条件下RobA在ΔAcrAB菌株内的过表达可使莫纳甜的流出升高超过2倍。这说明ΔAcrAB菌株内RobA的过表达和癸酸盐的加入可导致莫纳甜的流出增多，这可能是由对micF或AcrAB转运系统之外的转运系统的作用造成的。 

根据上述结果可以得出结论，RobA对莫纳甜流出有正面影响，这可能是通过AcrAB或其他转运系统的活化实现的。 

实施例17 

RamA蛋白的过表达可增加莫纳甜的排出 

RamA是产气肠杆菌内的一个含113个氨基酸的调节蛋白，属于AraC-XylS转录活化因子家族。据报道，RamA在药物敏感的大肠杆菌JM109和产气肠杆菌ATCC 13048内诱导出MDR表型，导致AcrA的合成增多，AcrA是AcrAB-TolC药物流出泵的一个组分。研究表明RamA步进可以增强marRAB操纵子的转录，而且能够在mar-缺陷的菌株内诱导多药耐药(“MDR”)表型。因此，RamA除了是一个MDR级联的自治活化因子之外，还是Mar操纵子的转录活化因子。CholletR.等，“RamA是产气肠杆菌内的多药耐药级联的另一个活化因子(RamA is analternate activator of the multidrug resistance cascade in Enterobacter aerogenes)”，Antimicrob Agents Chemother.48：2518-2523，(2004)。 

用于本试验的菌株包括大肠杆菌MG1655::aspC/proA/pProNdeDel，该菌株带有pUC19载体(GenBank/EMBL登录号L09137)，产气肠杆菌的ramA基因被克隆到该载体内。对照菌株是带pUC19载体的大肠杆菌MG1655::aspC/proA/pProNde。ramA基因扩增自产气肠杆菌ATCC13048，所用引物为5’GGCCGGTTAAGTCGACATGAATATATCCGCTCAGG3’(SEQ ID NO：22)和5’TTAACCTTGGATCCTCAGTGCGCGCGGCTGT3’(SEQ ID NO：23)，该引物可将SalI和BamHI基因座引入到扩增片段的末端。PCR片段克隆在载体pUC19(GenBank/EMBL登录号L09137)的SalI和BamHI基因座之间。为了进行接种，大肠杆菌菌株在含100μg/mL氨苄青霉素和50μg/mL卡那霉素的Luria-Bertani(″LB″)培养基内、37℃、250rpm振荡培养过夜。 

为了进行试验处理，按照如下方法制备用于提高色氨酸在大肠杆菌内产量的基本培养基Trp-1+葡萄糖培养基(Zeman等，Folia Microbiol.35：200-204，(1990))。向800mL纳米纯的水中加入下列试剂：2g(NH₄)₂SO₄和13.6g KH₂PO₄。PH调至7.0，体积增加到948mL，并对培养基进行高压灭菌。灭菌后在1.8mL体积的培养基中加入0.2g MgSO_4*7H₂O、0.01g CaCl_2*2H₂O和0.5mg FeSO_4*7H₂O，然后加入0.2mL Neidhardt微量营养素溶液。Neidhardt，F.C.等，“肠道细菌培养基”，J.Bacteriol.119：736-746(1974)。Neidhardt培养基包含(每升)：0.18g(NH₄)₆(MO₇)₂₄-4H₂O、1.24g H₃BO₃、0.36g CoCl₂-6H₂O、0.12g CuSO₄(无水的)、0.8g MnCl₂-4H₂O和0.14g ZnSO₄-7H₂O。单独制备50％的葡萄糖溶液并通过过滤除菌。将40mL葡萄糖溶液和10mL 1M3-吗啉代丙磺酸(“MOPS”)缓冲液加入到基础培养基(950mL)中，最后体积为1L。 

为了处理，将3.5-5.0 v/v％接种物加入到含100μg/mL氨苄青霉素的在500mL带挡板摇瓶内的100mL培养基中。处理条件包括整个试验以250rpm振荡，温度为37℃直到接种，然后降到30℃，随后诱导。在0.30-0.50 OD_600nm时，开始质粒基因的诱导。在诱导时，加入1.0mM IPTG、0.5％阿拉伯糖、0.5mM维生素B6和0.2mL Balch维生素。在开始诱导后3小时加入10gL-色氨酸、10g/L丙酮酸钠、0.04mM吡哆醛-5’-磷酸(“PLP”)和0.2％吐温20(聚氧乙烯20-失水山梨糖醇单月桂酸酯)。某些处理包括在诱导开始后3小时加入2.5mM癸酸钠。在24、30和48小时采集用于莫纳甜分析和确定细胞干重的样品。 

表17.1 

大肠杆菌排出的莫纳甜/细胞干重 

	莫纳甜/dcw(mg/g)
					癸酸钠(mM)	30小时	48小时
大肠杆菌MG1655::aspCproA pProNdedel，pUC19(对照)	0	2.59	2.94
				大肠杆菌MG1655::aspCproA pProNdedel，ramA pUC19	0	4.31	5.92

所有处理都是n＝2 

在30和48小时时，未用癸酸钠处理的RamA过表达都可导致莫纳甜流出增多。当RamA过表达时，48小时的莫纳甜/细胞干重平均为5.92mg/g，而无RobA过表达时仅为2.94mg/g。RamA的过表达可使莫纳甜的流出升高2倍。这说明RamA的过表达对mar操纵子或多药耐药转运蛋白基因或二者有正面影响，导致莫纳甜的流出增多。 

表17.2 

大肠杆菌排出的莫纳甜/细胞干重 

	莫纳甜/dcw(mg/g)
					癸酸钠(mM)	30小时	48小时
大肠杆菌MG1655::aspCproA pProNdedel pUC19(对照)	2.5	4.66	4.31
				大肠杆菌MG1655::aspCproA pProNdedel，ramA pUC19	2.5	3.69	13.90

所有处理都是n＝2 

在30和48小时时，用2.5mM癸酸钠处理的RamA过表达都可导致莫纳甜流出增多。当RamA过表达时，48小时的莫纳甜/细胞干重平均为13.90mg/g，而无RamA过表达时仅为4.31mg/g。在有癸酸钠存在的条件下RamA的过表达可使莫纳甜的流出升高超过3.2倍。这说明在有癸酸钠存在的条件下，RamA可作用于 mar操纵子或多药耐药转运蛋白基因或二者，导致莫纳甜的流出增多。 

表17.3 

大肠杆菌ΔacrAB排出的莫纳甜/细胞干重 

	莫纳甜/dcw(mg/g)
				24小时	30小时	48小时
大肠杆菌MG1655 ΔAcrAB::aspC proA pProNde del，pUC19(对照)	10.7	29.7	39.3
				大肠杆菌MG1655ΔAcrAB::aspCproA pProNde del，ramA pUC19	32.3	41.7	61.1

所有处理都是n＝2 

所有处理中加入2.5mM癸酸钠 

RamA在带有莫纳甜操纵子的大肠杆菌ΔAcrAB内的过表达可使莫纳甜的排出高于无RamA过表达的同一菌株。在48小时时，RamA过表达可导致莫纳甜/细胞干重达到61.1mg/g，而无RamA过表达时仅为39.3 mg/g。这代表RamA的过表达可使莫纳甜的流出升高1.5倍。这些数据说明在没有AcrAB转运蛋白参与时RamA的过表达可使莫纳甜的排出增多。这种对莫纳甜流出的正面影响可能是由于mar操纵子或AcrAB之外的其他转运蛋白基因/系统的活化引起的。 

因此，我们已经证明ramA基因在大肠杆菌内的过表达可导致莫纳甜的流出增多。在AcrAB系统缺失的宿主背景中也观察到了莫纳甜流出的增多。这说明对莫纳甜流出的正面影响也可能是由于其对AcrAB转运系统之外的转运系统的影响造成的。 

实施例18 

MarA蛋白的过表达可增加莫纳甜的排出 

acrAB表达的转录活化是导致过表达MarA的菌株产生多药耐药的主要原因，MarA是转录活化因子AraC家族的成员。MarA通过结合到被称为mar盒的位于各种靶基因启动子附近的DNA区活化其自身的转录和许多mar调节子基因的转录。AcrAB也与mar盒相邻，试验证明MarA可与mar盒结合并活化转录。Alekshun，M.N.和Levy，S.B.，“染色体介导的多药抗生素耐药性的调节：mar调节子(Regulation of chromosomally mediated multiple antibiotic resistance：the marregulon)”，Antimicrob.Agents Chemother.41：2067-2075，(1997)。 

另外，试验还证明MarA的过表达可导致AcrAB-TolC泵复合体的TolC组分的 合成增加，结合鉴定出的位于tolC基因上游的推测的mar/rob/sox盒，强烈暗示tolC也属于mar调节子。Aono，R.等，“mar-sox调节子的一个可能成员-外膜蛋白TolC参与大肠杆菌K-12对有机溶剂耐受的维持和上升(Involvement of outer membraneprotein TolC，a possible member of the mar-sox regulon，in maintenance andimprovement of organic solvent tolerance of Escherichia coli K-12)”，J Bacteriol.180：938-944(1998)。 

据报道，MarA的转录活化功能在自然界中是普遍存在的，因为MarA在体内和体外都能启动具有不同功能的蛋白的编码基因的转录。对组成性表达MarA的菌株进行的基因芯片分析表明超过60个大肠杆菌基因可被此蛋白调节，但调节效应不同(Barbosa，T.M.和Levy，S.B.，“MarA的组成性表达可导致大肠杆菌内60个以上的基因发生差异表达(Differential expression of over 60 chromosomal genes inEscherichia coli by constitutive expression of MarA)”，J.Bacteriol.182：3467-3474，(2000))，而利用可诱导的MarA表达系统进行的第二项研究鉴定出了另外67个MarA调节的基因。Pomposiello，P.J.等.，“超氧化物和水杨酸钠对大肠杆菌基因组范围的转录情况的影响(Genome-wide transcriptional profiling of the Escherichia coliresponses to superoxide stress and sodium salicylate)”，J.Bacteriol.183：3890-3902，(2001)。据报道，MarA还能够活化带有mar盒的基因，该盒与共有序列具有实质的差异。Barbosa，T.M.和S.B.Levy，“MarA通过II类启动子上高度差异的mar盒活化大肠杆菌的nfnB基因(Activation of the Escherichia coli nfnB gene by MarAthrough a highly divergent marbox in a class II promoter)”，Mol.Microbiol.45：191-202，(2002)。 

总之，MarA可活化mar调节子的表达，其中包括acrAB、tolC和marRAB，而MarR的作用是通过抑制MarA的合成来下调这个反应。虽然质粒来源的MarA的过表达足以活化mar调节子基因，但是试验证实，加入抗生素四环素和氯霉素、弱芳香酸如水杨酸以及具有不同结构的其他化合物如解偶联剂羰基氰氯苯腙和氧化还原循环化合物维生素K3和蓝雪醌都可以引起mar调节子表达的诱导。GrkovicS等，“细菌药物外排系统的调节(Regulation of bacterial drug export systems)”，Microbiol Mol Biol Rev.66：671-701，(2002)。 

用于本试验的菌株包括大肠杆菌MG1655::aspC/proA/pProNdeDel，该菌株带有pUC19载体(GenBank/EMBL登录号L09137)，大肠杆菌的marA基因被克隆到该 载体内。对照菌株是带pUC19载体的大肠杆菌MG1655::aspC/proA/pProNde。利用PCR技术(本领域技术人员所熟知的)从大肠杆菌W3110扩增marA基因，所用引物为E.coliMarASalIF-5’TTAAGGCCGTCGACATGACGATGTCCAGACGCAATA3’(SEQ ID NO：24)和E.coliMarABamHIR-5’GCAGTGCCGGATCCCTAGCTGTTGTAATGATTTA3’(SEQ ID NO：25)。为了进行接种，大肠杆菌菌株在含100μg/mL氨苄青霉素和50μg/mL卡那霉素的Luria-Bertani(″LB″)培养基内、37℃、250rpm振荡培养过夜。 

为了进行试验处理，按照如下方法制备用于提高色氨酸在大肠杆菌内产量的基本培养基Trp-1+葡萄糖培养基(Zeman等，Folia Microbiol.35：200-204，(1990))。向800mL纳米纯的水中加入下列试剂：2g(NH₄)₂SO₄和13.6g KH₂PO₄。PH调至7.0，体积增加到948mL，并对培养基进行高压灭菌。灭菌后在1.8mL体积的培养基中加入0.2g MgSO_4*7H₂O、0.01g CaCl_2*2H₂O和0.5mg FeSO_4*7H₂O，然后加入0.2mL Neidhardt微量营养素溶液。Neidhardt，F.C.等，“肠道细菌培养基”，J.Bacteriol.119：736-746(1974)。Neidhardt培养基包含(每升)：0.18g(NH₄)₆(MO₇)₂₄-4H₂O、1.24g H₃BO₃、0.36g CoCl₂-6H₂O、0.12g CuSO₄(无水的)、0.8g MnCl₂-4H₂O和0.14g ZnSO₄-7H₂O。单独制备50％的葡萄糖溶液并通过过滤除菌。将40mL葡萄糖溶液和10mL 1 M3-吗啉代丙磺酸(“MOPS”)缓冲液加入到基础培养基(950mL)中，最后体积为1L。 

为了处理，将3.2-3.6v/v％接种物加入到含100μg/mL氨苄青霉素的在500mL带挡板摇瓶内的100mL培养基中。处理条件包括整个试验以250rpm振荡，温度为37℃直到接种，然后降到30℃，随后诱导。在0.35-0.50 OD_600nm时，开始质粒基因的诱导。在诱导时，加入1.0mM IPTG、0.5％阿拉伯糖、0.5mM维生素B6和0.2mL Balch维生素。在开始诱导后3.0小时加入10gL-色氨酸、10g/L丙酮酸钠、0.04mM吡哆醛-5’-磷酸(“PLP”)和0.2％吐温20(聚氧乙烯20-失水山梨糖醇单月桂酸酯)。在接种后24小时，每个摇瓶内再加入10g/L丙酮酸钠。某些处理包括在诱导开始后3.0小时加入2.5mM癸酸钠。在24、30和72小时采集用于莫纳甜分析和确定细胞干重的样品。 

表18.1 

大肠杆菌排出的莫纳甜/细胞干重 

	平均莫纳甜/细胞干重  (mg/g)
				菌株	处理  (加入的癸酸钠，mM)	30小时	72小时
大肠杆菌MG1655 aspC proA pProNde del，pUC19(对照)	0	2.2	2.3
				大肠杆菌MG1655 aspC proA pProNde del，MarApUC19	0	2.7	23.4

所有处理都是n＝2 

在未添加上述的癸酸钠时，marA的过表达可导致莫纳甜的流出增多(莫纳甜/细胞干重)。因MarA基因的过表达，莫纳甜(mg)/g细胞干重增加了10倍。MarA对AcrAB转运系统的影响、与多重转运系统相互作用的tolC基因的转录增强和/或在莫纳甜流出中发挥作用的其他转运蛋白的可能上调都可以解释这种明显增加。 

表18.2 

大肠杆菌排出的莫纳甜/细胞干重 

	平均莫纳甜/细胞干重  (mg/g)
				菌株	处理  (加入的癸酸钠，mM)	30小时	72小时
大肠杆菌MG1655 aspC proApProNde，del pUC19(对照)	2.5	2.4	2.7
				大肠杆菌MG1655 AspC ProA pProNde，del MarA pUC19	2.5	8.5	51.9

所有处理都是n＝2 

在如上述添加癸酸钠的情况下，marA的过表达可导致莫纳甜的流出进一步增多(莫纳甜/细胞干重)。加入2.5mM癸酸钠后，在72小时时，marA菌株所排出的莫纳甜/细胞干重平均值达到51.9mg/g，而对照菌株只有2.7mg/g，这表示莫纳甜的流出升高了19倍。这说明marA的过表达对流出莫纳甜的转运蛋白有实质影响。癸酸钠与marA的过表达显示有协同作用。 

表18.4 

带莫纳甜操纵子的大肠杆菌ΔacrAB排出的莫纳甜/细胞干重 

	平均莫纳甜/细胞干重  (mg/g)
					菌株	菌株/插入片段	24	30	72
大肠杆菌MG1655 ΔAcrAB AspCProA pProNde del pUC19(对照)	ΔAcrAB	22.2	20.6	62.6
					大肠杆菌MG1655ΔAcrAB AspCProA pProNde del MarA pUC19	带marA插入片段的ΔAcrAB	54.6	56.0	209.0

所有处理都是n＝2 

所有处理中加入2.5mM癸酸钠 

marA的过表达与acrAB敲除突变的组合可导致72小时时的莫纳甜/细胞干重达到209mg/g，而不含marA质粒的acrAB敲除突变株只有62.6mg/g。甚至到24小时时，acrAB敲除/marA过表达菌株超过对照2倍以上(54.6到22.2莫纳甜(mg)/dcw(g))。这是一个AcrAB转运蛋白缺失和调节基因如marA过表达的组合对莫纳甜流出有协同效应的例子。 

已知MarA可活化acrAB的表达，但是在acrAB敲除株中，莫纳甜的排出比正常株甚至更高。据报道，除了acrA如mtr(色氨酸-特异性转运蛋白)、ompX(外膜蛋白X)和yadG(推测的转运系统的ATP结合组分)之外，MarA的表达还可提高参与转运的多个基因的表达。因此，这个效应可能是由参与莫纳甜排出的除AcrAB之外的转运蛋白的诱导所引起的。已知MarA还可活化tolC的转录，这是多重转运系统的一个组分。因此，莫纳甜转运的增加可能是由需要TolC的多重转运蛋白的作用引起的。 

这些结果证明MarA对大肠杆菌内的莫纳甜流出有很强的正面影响。 

实施例19 

BaeR蛋白的过表达可增加莫纳甜的排出 

BaeSR二组分调节系统控制输出基因的表达，赋予大肠杆菌耐药性。Nagakubo，S.等，J.Bacteriol.184：4161-4167，(2002)；Baranova，N.和Nikaido，H.，“baeSR二组分调节系统可活化大肠杆菌内yegMNOB(mdtABCD)转运蛋白基因簇的转录并增强其对新生霉素和脱氧胆酸的耐受性(The baeSR two-component regulatorysystem activates transcription of the yegMNOB(mdtABCD)transporter gene cluster in Escherichia coli and increases its resistance to novobiocin and deoxycholate)”，JBacteriol.184：4168-4176(2002)。据报道，BaeSR二组分系统通过调节药物转运蛋白基因的表达调节大肠杆菌的药物耐药性。Baranova，N.和Nikaido，H.，“baeSR二组分调节系统可活化大肠杆菌内yegMNOB(mdtABCD)转运蛋白基因簇的转录并增强其对新生霉素和脱氧胆酸的耐受性”，J Bacteriol.184：4168-4176(2002)。Nagakubo，S.K.等，“推测的反应调节因子BaeR通过新型多药输出蛋白系统MdtABC刺激大肠杆菌的多药耐药性(The putative response regulator BaeRstimulates multidrug resistance of Escherichia coli via a novel multidrug exportersystem，MdtABC)”，J.Bacteriol.184：4161-4167，(2002)。反应调节因子BaeR调节编码多药输出蛋白系统的mdtABC和acrD的表达。Hirakawa，H.K.等，“大肠杆菌内二组分信号转导系统的反应调节因子的过表达所介导的药物耐药性的综合研究”，J.Bacteriol.185：1851-1856，(2003)；Hirakawa，H.K.等，“大肠杆菌内二组分信号转导系统的反应调节因子的过表达所调节的β-内酰胺耐药性(Comprehensivestudies on the drug resistance mediated by the overexpression of response regulators oftwo-component signal transduction systems in Escherichia coli)”，J.Antimicrob.Chemother.52：576-582，(2003)。据报道，在大肠杆菌的主要耐药输出蛋白AcrB缺失的背景下，BaeR的过表达可赋予抗β-内酰胺、新生霉素、十二烷基硫酸钠和牛胆酸钠的耐药性。还有报道显示，BaeR可提高外膜通道tolC基因的表达，tolC基因是MdtABC、AcrD和其他转运系统发挥功能所必需的。Nishino，K.等，“TolC依赖性的转运蛋白在大肠杆菌对β-内酰胺的耐药性中的作用(Roles ofTolC-dependent multidrug transporters of Escherichia coli in resistance to β-lactams)”，Antimicrob.Agents Chemother.47：3030-3033，(2003)；Nishino，K.和Yamaguchi，A.，“大肠杆菌内推测的药物转运蛋白基因的完全文库的分析(Analysis of acomplete library of putative drug transporter genes in Escherichia coli)”，J.Bacteriol.183：5803-5812，(2001)。 

用于本试验的菌株是大肠杆菌MG1655::aspC/proA/pProNdeDel，该菌株带有pUC19载体，pUC19载体内插入或未插入baeR基因。baeR基因扩增自大肠杆菌W3110，所用引物为E.colibaeRSalIF 5’GGCCTTCCGTCGACATGACCGAGTTACCAATC3’(SEQ ID NO：26)和E.colibaeRBamHIR5’TTCCAAGGTTGGATCCCTAAACGATGCGGCAGGC 3’(SEQ ID NO：27)， 

该引物可将SalI和BamHI基因座引入到扩增片段的末端。PCR片段克隆在载体pUC19(GenBank/EMBL登录号L09137)的SalI和BamHI基因座之间。为了进行接种，大肠杆菌菌株在含100μg/mL氨苄青霉素和50μg/mL卡那霉素的Luria-Bertani(″LB″)培养基内、37℃、250rpm振荡培养过夜。 

为了进行试验处理，按照如下方法制备用于提高色氨酸在大肠杆菌内产量的基本培养基trp-1+葡萄糖培养基(Zeman等，Folia Microbiol.35：200-204，(1990))。向800mL纳米纯的水中加入下列试剂：2g(NH₄)₂SO₄和13.6g KH₂PO₄。PH调至7.0，体积增加到948mL，并对培养基进行高压灭菌。灭菌后在1.8mL体积的培养基中加入0.2g MgSO_4*7H₂O、0.01g CaCl_2*2H₂O和0.5mg FeSO_4*7H₂O，然后加入0.2mLNeidhardt微量营养素溶液。Neidhardt，F.C.等，“肠道细菌培养基”，J.Bacteriol.119：736-746(1974)。Neidhardt培养基包含(每升)：0.18g(NH₄)₆(MO₇)₂₄-4H₂O、1.24gH₃BO₃、0.36g CoCl₂-6H₂O、0.12g CuSO₄(无水的)、0.8g MnCl₂-4H₂O和0.14gZnSO₄-7H₂O。单独制备50％的葡萄糖溶液并通过过滤除菌。将40mL葡萄糖溶液和10mL 1M 3-吗啉代丙磺酸(“MOPS”)缓冲液加入到基础培养基(950mL)中，最后体积为1L。 

为了处理，将3.5-5.0 v/v％接种物加入到含100μg/mL氨苄青霉素的在500mL带挡板摇瓶内的100mL培养基中。处理条件包括整个试验以250rpm振荡，温度为37℃直到接种，然后降到30℃，随后诱导。在0.35-0.38 OD_600nm时，开始质粒基因的诱导。在诱导时，加入1.0mM IPTG、0.5％阿拉伯糖、0.5mM维生素B6和0.2mL Balch维生素。在开始诱导后3.5小时加入10gL-色氨酸、10g/L丙酮酸钠、0.04mM吡哆醛-5’-磷酸(“PLP”)和0.2％吐温20(聚氧乙烯20-失水山梨糖醇单月桂酸酯)。在接种后24小时，每个摇瓶内再加入10g/L丙酮酸钠。某些处理包括在诱导开始后3.5小时加入2.5mM癸酸钠。在24、30和72小时采集用于莫纳甜分析和确定细胞干重的样品。 

表19.1 

大肠杆菌排出的莫纳甜/细胞干重 

	平均莫纳甜/细胞干重(mg/g)
				菌株	处理(加入癸酸钠，mM)	30小时	72小时
大肠杆菌MG1655 AspC ProApProNde del pUC19	0	2.2	2.3
				大肠杆菌MG1655 AspC ProApProNde del BaeR pUC19	0	2.5	24.9

所有处理都是n＝2 

在不加入癸酸钠时，baeR的过表达使莫纳甜的流出比无baeR过表达的对照菌株明显增多。在72小时时，baeR过表达的菌株所积聚的莫纳甜/细胞干重平均值达到24.9mg/g，而无baeR的对照菌株在相同条件下只有2.3mg/g。这说明无癸酸盐处理的baeR过表达可使莫纳甜的流出升高约11倍。这个效应可能是由mdtABCD或acrD或这两个转运系统的活化造成的。天然的AcrAB系统在莫纳甜转运中可能也发挥作用。另外，已知BaeR可促进tolC基因的表达，该基因是好几种排出系统发挥功能所必须的。 

表19.2 

大肠杆菌排出的莫纳甜/细胞干重 

	平均莫纳甜/细胞干重  (mg/g)
				菌株	处理  (加入癸酸钠，mM)	30小时	72小时
大肠杆菌MG1655 AspC ProApProNde del pUC19	2.5	2.4	2.7
				大肠杆菌MG1655 AspC ProApProNde del BaeR pUC19	2.5	16.2	66.8

所有处理都是n＝2 

在加入2.5mM癸酸钠时，baeR的过表达使莫纳甜的流出比无baeR过表达的对照菌株明显增多。在72小时时，baeR过表达的菌株所积聚的莫纳甜/细胞干重平均值达到66.8mg/g，而无baeR的对照菌株在相同条件下只有2.7mg/g。这说明baeR的过表达加上癸酸盐的处理可使莫纳甜的流出比无癸酸盐处理的对照升高约25倍。已知癸酸钠可活化AcrAB转运系统。另外，已知BaeR可促进tolC基因的表达，该基因是好几种排出系统发挥功能所必须的。莫纳甜流出的这种升高可能是由于mdtABCD和/或acrD的活化以及癸酸钠加入导致的AcrAB转运系统活化引起的。 

表19.3 

大肠杆菌排出的莫纳甜/细胞干重 

	平均莫纳甜/细胞干重  (mg/g)
				菌株	24小时	30小时	48小时
大肠杆菌MG1655 ΔacrAB AspC ProA pProNde del pUC19(对照)	10.7	29.7	39.3
				大肠杆菌MG1655 ΔacrAB AspC ProA pProNde del BaeR pUC19	34.4	85.0	137.3

所有处理都是n＝2 

所有处理中加入2.5mM癸酸钠 

据报道，天然的多药输出蛋白AcrB的表达可屏蔽baeR过表达的效应。为了确定baeR过表达在无AcrAB转运系统的情况下的作用，使用了acrAB基因缺失的宿主菌株。在ΔacrAB宿主菌株中，baeR基因的过表达可导致莫纳甜的排出比对照的ΔacrAB菌株增加3.5倍(137.3到39.3莫纳甜(mg)/dcw(g))。这清楚地说明除了AcrAB之外还有其他转运蛋白参与莫纳甜的转运。另外，已知BaeR可促进tolC基因的表达，除了MdtABCD或AcrD多药转运系统之外，该基因还是另外几种排出系统发挥功能所必须的。Nishino K.等，“在基因组范围分析响应于BaeSR两组分调节系统的大肠杆菌基因的表达(Genome-wide analysis of Escherichia coli geneexpression responsive to the BaeSR two-component regulatory system)”，J.Bacteriol.187：1763-1772，(2005年3月)。因此，MdtABCD或AcrD或者这两个转运系统都参与acrAB敲除株中的莫纳甜转运。 

因此，我们可以得出结论，BaeR对莫纳甜的流出有正面影响。据报道，吲哚可通过BaeSR两组分信号转导系统诱导mdtABCD和acrD基因的表达。Nishino K.等，“在基因组范围分析响应于BaeSR两组分调节系统的大肠杆菌基因的表达”，J.Bacteriol.187：1763-1772，(2005年3月)。有理由预计吲哚的处理也应该对莫纳甜的流出有正面影响。据报道，调节物SdiA可控制acrAB和acrD的表达。Wei，Y.等，“大肠杆菌完整基因表达谱所揭示的sdiA扩增的全面效应(Global impact ofsdiA amplification revealed by comprehensive gene expression profiling of Escherichiacoli)”，J.Bacteriol.183：2265-2272，(2001)。因此也有理由预计SdiA对莫纳甜的流出有正面影响。 

实施例20 

提高温度和用丙酮酸钠处理可使谷氨酸棒状杆菌内的莫纳甜流出增加用aspCProA pEKEX-2转化的谷氨酸棒状杆菌13032菌株在添加25μg/mL卡那霉素的LB培养基内30℃、250rpm振荡孵育过夜。对于试验处理摇瓶来说，每个摇瓶加入100mL KraemerA培养基。Hoisted C.和Kraemer，R.，“流出载体系统参与谷氨酸棒状杆菌内谷氨酸排出的证据(Evidence for an efflux carrier systeminvolved in the secretion of glutamate by Corynebacterium glutamicum)”，Arch.Microbiol 151：342-347，(1989)。Kraemer A培养基包含(每升)：5g(NH₄)₂SO₄、5g尿素、2g KH₂PO₄、1.53 K₂HPO₄、0.249g MgSO_4*7H₂O、50g葡萄糖、0.01gFeSO₄-7H₂O、0.01g MnSO₄-H₂O、0.01g CaCl₂-2H₂O、0.03mg ZnSO₄-7H₂O、0.1mg H₃BO₃、0.07mg CaCl₂-6H₂O、0.01mg NiCl₂-2H₂O、0.03mg CuCl₂-2H₂O、0.1mg来自(NH₄)₆Mo₇O₂₄-4H₂O的Mo⁺⁶和1μg生物素。PH调至7.0。 

为了处理，将3.5-5.0 v/v％接种物加入到在500mL带挡板摇瓶内的100mL培养基中。处理条件包括整个试验以250rpm振荡、温度为30或35℃。在0.45-0.51OD_600nm时，开始莫纳甜操纵子的诱导。1.0mM IPTG用于诱导，在诱导时，加入0.2mL Balch维生素1000×储存液和0.5mM维生素B6。在开始诱导后的3小时和24小时加入10gL-色氨酸、10或15g/L丙酮酸钠、0.04mM吡哆醛-5’-磷酸(“PLP”)。在两个添加点上添加10或15g/L丙酮酸钠到每个摇瓶中，使丙酮酸钠的总量达到20或30g/L。在24、30和48小时采集用于莫纳甜分析和确定细胞干重的样品。 

表20.1 

温度升高和丙酮酸可导致流出的莫纳甜/细胞干重升高 

	莫纳甜/细胞干重(mg/g)
					处理	24小时	31小时	48小时	54小时
30℃，20g/L丙酮酸	0.2	2.1	2.7	2.7
					30℃，30g/L丙酮酸	0.3	1.8	4.3	4.7
35℃，20g/L丙酮酸	5.4	14.7	23.5	23.8
					35℃，30g/L丙酮酸	5.8	18.1	29.4	35.2

在30℃时，提高丙酮酸钠的水平可导致莫纳甜/细胞干重升高(在54小时时为4.7mg/g和2.7mg/g)。在35℃时，加入丙酮酸可使莫纳甜/细胞干重从23.8mg/g进一步升高到35.2mg/g。温度提高5℃导致莫纳甜/细胞干重升高7到9倍。稳定从30℃升高到35℃还可以使细胞干重从7.48g/L降到2.50g/L。稳定和丙酮酸钠在包含16组处理的因子设计试验中都是莫纳甜/细胞干重的具有较高统计学意义的因子。莫纳甜产量的升高与生物量的下降说明碳流分布发生了改变。Ohnishi，J.等，Appl Microbiol Biotechnol 62：69-75，(2003)。 

因此，我们的试验证明了通过改变加入的丙酮酸钠的量以及改变生物的孵育温度可使莫纳甜的流出增加。虽然从理论上推测莫纳甜流出的这种增加伴随着莫纳甜合成的增多，但是莫纳甜流出本身的影响因素的作用也不能排除。继续利用本领域熟知的统计学试验设计改变生长介质组合物和生长条件可用于提高莫纳甜的产量和流出出细胞的量。通过使用乙胺丁醇结合，但不限于，一种或多种已知能够影响棒状杆菌分枝菌酸层的下列试剂，其中包括吐温、生物素和/或氨苄青霉素，可能能够使莫纳甜的流出进一步升高。 

实施例21 

生物素和氨苄青霉素处理可增加谷氨酸棒状杆菌中莫纳甜的流出用aspCProA pEKEX-2转化的谷氨酸棒状杆菌13032菌株在添加50μg/mL卡那霉素的LB培养基内30℃、250rpm振荡孵育过夜。对于试验处理摇瓶来说，每个摇瓶加入100mL KraemerA培养基。Hoisted C.和Kraemer，R.，“流出载体系统参与谷氨酸棒状杆菌内谷氨酸排出的证据(Evidence for an efflux carrier systeminvolved in the secretion of glutamate by Corynebacterium glutamicum)”，Arch.Microbiol 151：342-347，(1989)。Kraemer A培养基包含(每升)：5g(NH₄)₂SO₄、5g尿素、2g KH₂PO₄、1.53 K₂HPO₄、0.249g MgSO_4*7H₂O、50g葡萄糖、0.01gFeSO₄-7H₂O、0.01g MnSO₄-H₂O、0.01g CaCl₂-2H₂O、0.03mg ZnSO₄-7H₂O、0.1mgH₃BO₃、0.07mg CaCl₂-6H₂O、0.01mg NiCl₂-2H₂O、0.03mg CuCl₂-2H₂O、0.1mg来自(NH₄)₆Mo₇O₂₄-4H₂O的Mo⁺⁶和1μg生物素。PH调至7.0。 

为了处理，将接种物加入到在500mL带挡板摇瓶内的100mL培养基中，吸光度为0.100(600nm)。处理条件包括整个试验以250rpm振荡、温度为37℃。在0.26-0.33 OD_600nm时，开始莫纳甜操纵子的诱导。0.5mM IPTG用于诱导，在诱导时，再加入1.0mM维生素B 6和0.04mM吡哆醛-5’-磷酸(“PLP”)。在开始诱导后的3小时加入10gL-色氨酸和5g/L丙酮酸钠以及氨苄青霉素(0或10μg/ml)。在24和48小时采集用于莫纳甜分析和确定细胞干重的样品。 

表21.1 

添加氨苄青霉素和减少生物素可使流出的莫纳甜/细胞干重升高 

	莫纳甜/细胞干重(mg/g)
					处理组合	氨苄青霉素(μg/mL)	生物素(μg/L)	24小时	48小时
1	0	200	0.9	1.7
					2	0	1	1.9*	4.5
3	10	200	12.1	9.3
					4	10	1	16.2	13.5

根据处理组合不同n＝2或3 

^*n＝1 

在诱导后的3小时加入氨苄青霉素可使莫纳甜/细胞干重升高3到12倍。初始培养基中的生物素从200μg/L降到1μg/L可使莫纳甜/细胞干重从1.0mg/g升高到4.2mg/g。氨苄青霉素和生物素(分别为10μg/mL和1μg/L)的处理组合可使莫纳甜 /细胞干重升高7.9到18倍(13.5/1.7和16.2/0.9)。 

因此，我们的试验证明了通过改变宿主生物所接触的生物素和氨苄青霉素的量可使莫纳甜的流出增加。虽然从理论上推测莫纳甜流出的这种增加伴随着莫纳甜合成的增多，但是生物素和/或氨苄青霉素对莫纳甜流出本身的直接影响也不能排除。 

继续利用本领域熟知的统计学试验设计改变生长介质组合物和生长条件可用于提高莫纳甜的产量和流出出细胞的量。通过使用乙胺丁醇结合，但不限于，一种或多种已知能够影响棒状杆菌分枝菌酸层的下列试剂，其中包括吐温、生物素和/或氨苄青霉素，可能能够使莫纳甜的流出进一步升高。Eggeling，L.和Sahm，H.，“谷氨酸棒状杆菌和氨基酸流出的细胞壁屏障(The Cell Wall Barrier ofCorynebacterium glutamicum and Amino Acid Efflux)”，J.BioSci.and BioEng.92：201-213，(2001)。 

实施例22 

使用乙胺丁醇可增加棒状杆菌内莫纳甜的流出 

据报道，向谷氨酸棒状杆菌的生长培养物中加入乙胺丁醇(“EMB”)可导致L-谷氨酸的流出，但是在没有EMB时，没有流出发生。Radmacher，E.等，“结核分支杆菌的细胞壁抑制剂乙胺丁醇可刺激谷氨酸棒状杆菌的L-谷氨酸流出(Ethambutol，a cell wall inhibitor of Mycobacterium tuberculosis，elicits L-glutamateefflux of Corynebacterium glutamicum)”，Microbiology 151：1359-1368，(2005-5)。据报道，EMB在分子水平上的靶位是一系列阿拉伯糖基转移酶(EmbCAB)。编码单个阿拉伯糖基转移酶的谷氨酸棒状杆菌的emb基因位于Tet抑制子(“TetR”)的控制之下。利用这个菌株以及emb-过表达的菌株所进行的试验结合生化分析表明，emb的表达与L-谷氨酸的流出及EMB耐药性相关。另外，EMB可导致沉淀于细胞壁阿拉伯糖半乳糖中的阿拉伯糖减少，使细胞壁结合的分枝菌酸的含量下降。因此，添加EMB可导致细胞被膜出现明显紊乱，通过细胞形态学检查也可以观察到这一点。 

由于已知改变谷氨酸棒状杆菌胞浆膜的脂质组成可导致L-谷氨酸流出，因此可以推断细胞被膜的主要结构改变可传递到细胞膜上，这反过来又可能会通过升高细胞膜的电压来活化排出系统。Radmacher，E.等，“结核分支杆菌的细胞壁抑制 剂乙胺丁醇可刺激谷氨酸棒状杆菌的L-谷氨酸流出”，Microbiology151：1359-1368，(2005-5)。 

用aspCProA pEKEX-2转化的谷氨酸棒状杆菌13032菌株在添加25μg/mL卡那霉素的LB培养基内30℃、250rpm振荡孵育过夜。对于试验处理摇瓶来说，每个摇瓶加入100mL KraemerA培养基。Hoisted C.和Kraemer，R.，“流出载体系统参与谷氨酸棒状杆菌内谷氨酸排出的证据(Evidence for an efflux carrier systeminvolved in the secretion of glutamate by Corynebacterium glutamicum)”，Arch.Microbiol 151：342-347，(1989)。Kraemer A培养基包含(每升)：5g(NH₄)₂SO₄、5g尿素、2g KH₂PO₄、1.53 K₂HPO₄、0.249g MgSO_4*7H₂O、50g葡萄糖、0.01gFeSO₄-7H₂O、0.01g MnSO₄-H₂O、0.01g CaCl₂-2H₂O、0.03mg ZnSO₄-7H₂O、0.1mgH₃BO₃、0.07mg CaCl₂-6H₂O、0.01mg NiCl₂-2H₂O、0.03mg CuCl₂-2H₂O、0.1mg来自(NH₄)₆Mo₇O₂₄-4H₂O的Mo⁺⁶和1μg生物素。PH调至7.0。 

为了处理，将3.5-5.0 v/v％接种物加入到在500mL带挡板摇瓶内的100mL培养基中。处理条件包括整个试验以250rpm振荡、温度为30℃。在摇瓶接种前或者在首次加入色氨酸和丙酮酸时加入乙胺丁醇(10mg/L)。在0.40-0.51 OD_600nm时，开始莫纳甜操纵子的诱导。1.0mM IPTG用于诱导，在诱导时，加入0.2mL Balch维生素和0.5mM维生素B6。在开始诱导后的3小时加入1gL-色氨酸、10g/L丙酮酸钠、0.04mM吡哆醛-5’-磷酸(“PLP”)。在24、30/31和48小时采集用于莫纳甜分析和确定细胞干重的样品。 

表22.1 

添加乙胺丁醇可使莫纳甜/细胞干重升高 

	莫纳甜/细胞干重(mg/g)
					菌株	乙胺丁醇(mg/L)	24小时	31小时	48小时
谷氨酸棒状杆菌13032::aspC/proA/pEKEX2-2	0	0.43	0.47	0.51
					谷氨酸棒状杆菌13032::aspC/proA/pEKEX2-2	10	1.16	1.15	1.06

所有处理都是n＝2 

添加乙胺丁醇可使莫纳甜流出(mg/g细胞干重)升高。在48小时时，10mg/l乙胺丁醇处理可使莫纳甜/细胞干重平均值达到1.06mg/g，而无乙胺丁醇的对照平均只有每克细胞干重0.51毫克莫纳甜。 

表22.2 

添加乙胺丁醇和丙酮酸钠可使莫纳甜/细胞干重升高 

	莫纳甜/细胞干重(mg/g)
					菌株	乙胺丁醇  (mg/l)	24小时	31小时	48小时
谷氨酸棒状杆菌13032::AspC/ProA/pEKEX2-2	0	0.43	0.47	0.51
					谷氨酸棒状杆菌13032::AspC/ProA/pEKEX2-2	10	1.04	1.53	2.19

所有处理都是n＝2 

在接种后24小时再加入10g/L丙酮酸钠可使莫纳甜的产生/排出进一步增多。在48小时时，10mg/L乙胺丁醇处理加上再添加的丙酮酸钠可使莫纳甜/细胞干重平均达到2.19mg/g，而在24小时时间点上，加入相同的乙胺丁醇但是未额外添加丙酮酸时莫纳甜/细胞干重只有1.06mg/g。 

表22.3 

添加乙胺丁醇结合吐温/氨苄青霉素处理可使莫纳甜/细胞干重进一步升高 

	莫纳甜/细胞干重(mg/g)
					菌株	乙胺丁醇(mg/L)	24小时	30小时	48小时
谷氨酸棒状杆菌13032::AP pEKEX2-2	0	0.30	0.33	0.74
					谷氨酸棒状杆菌13032::AP pEKEX2-2	10	6.94	8.80	9.14

所有处理都是n＝2 

在添加试剂的时间(诱导后3小时)加入0.2％吐温20(聚氧乙烯20-失水山梨糖醇单月桂酸酯)和10μg/ml氨苄青霉素再加上乙胺丁醇处理，可以看到莫纳甜的排出上升的更高。吐温、氨苄青霉素和乙胺丁醇处理之间具有协同效应，对莫纳甜的流出有利。吐温/氨苄青霉素处理结合10mg/l乙胺丁醇可导致流出的莫纳甜/细胞干重比进行了相同处理但未添加乙胺丁醇的对照升高12倍(分别为每克细胞干重9.14毫克莫纳甜/和每克细胞干重0.74毫克莫纳甜)。 

因此，我们可以得出结论，添加乙胺丁醇对棒状杆菌内的莫纳甜流出有正面影响。这些数据还说明莫纳甜可通过与谷氨酸相同的转运蛋白流出，因为有报道证明乙胺丁醇只影响谷氨酸的流出而不会影响其他氨基酸的流出。Radmacher，E.等，“结核分支杆菌的细胞壁抑制剂乙胺丁醇可刺激谷氨酸棒状杆菌的L-谷氨酸流出(Ethambutol，a cell wall inhibitor of Mycobacterium tuberculosis，elicits L-glutamateefflux ofCorynebacterium glutamicum)”，Microbiology 151：1359-68，(2005-5)。另外，我们还证明乙胺丁醇处理的正效应与吐温和氨苄青霉素组合可导致棒状杆菌内的莫纳甜流出反应放大，明显高于单独用乙胺丁醇处理所看到的。 

实施例23 

缺失cysH的宿主菌株内莫纳甜的流出升高。 

据报道，CysH(磷酸腺苷硫酸(″PAPS″)脱氢酶)、icdA(异柠檬酸脱氢酶)、metE或purB(腺苷酸琥珀酸裂解酶)突变可导致AcrAB转运系统的活化。突变导致代谢物积聚在上游，可使AcrAB-TolC泵的表达水平升高。Helling R.B.等，“大肠杆菌内的毒性废物处理(Toxic waste disposal in Escherichia coli)”，J Bacteriol.184：3699-3703，(2002)。我们检测了cysH缺失对莫纳甜流出的影响。 

所设计的引物用于通过PCR从所述的pKD4制备所希望的大肠杆菌基因敲除。Datsenko，K.A.和Wanner，B.L.，“利用PCR产物一步灭活大肠杆菌K-12的染色体基因(One-step inactivaion of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 usingPCR products)”，Proceed.Natl.Acad.Sci.USA 97：6640-6645，(2000)。 

cysH敲除引物序列： 

大肠杆菌cysHKO-正向引物 

5′CGCGTGAGCGTCGCATCAGGCAAGGCAAACAGTGAGGAATCTATGTCCAAAGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC 3′(SEQ ID NO：28) 

大肠杆菌cysHKO-反向引物 

5′CGCCCCCATCATTTCTGACAGAGGCGTTTAATTTGTCCGGCAATATTTACCCTTCCATATGAATATCCTCCTTAG3′(SEQ ID NO：29) 

通过如下PCR过程扩增PCR产物以删除了cysH。在100μL反应体系中，加入1μL模板(pKD4)(Datsenko，K.A.和Wanner，B.L.，“利用PCR产物一步灭活大肠杆菌K-12的染色体基因(One-step inactivation of chromosomal genes inEscherichia coli K-12 using PCR products)”，Proceed.Natl.Acad.Sci.USA，97：6640-6645，(2000))、0.4μM各引物、0.4mM各dNTP、1×PCR缓冲液和2μL PfuTurbo聚合酶(斯加特基因公司(Stratagene)，La Jolla，CA)。所使用的热循环程序包括94℃热启动30秒，如下步骤重复30次：94℃1分钟，55℃1分钟和72℃4分钟。完成30个循环以后使样品在72℃保持10分钟，然后储存于4℃。这个PCR过程可制备出1.6Kb的产物。 

利用Qiagen PCR提纯试剂盒(Valencia，CA)纯化PCR产物。利用SmartSpec3000^TM分光光度计定量PCR产物。 

纯化的PCR产物用于转化大肠杆菌菌株BW25113/pKD46。Datsenko K.A.和Wanner，B.L.，“利用PCR产物一步灭活大肠杆菌K-12的染色体基因(One-stepinactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products)”，Proceed.Natl.Acad.Sci.USA，97：6640-6645，(2000)。1μLPCR产物加到40μl细胞中，利用BioRad Gene Pulsar II在下列条件下通过电穿孔转化细胞：在0.2cm槽内2.5kV，25μF，200ohm。细胞在500μL SOC中37℃、225rpm振荡3小时使其恢复。细胞接种到含卡那霉素(50μg/mL)LB平板上，37℃孵育过夜。挑出5个卡那霉素耐药转化子进行集落PCR筛选以确定产物。 

裂解物制备：为了生产BW25113ΔcysH菌株，制备P1噬菌体裂解物以使敲除转移到大肠杆菌BL21DE3生产宿主内。供体菌株在含25μg/mL卡那霉素的LB培养基内孵育过夜。培养物用于接种含5mM CaCl₂的新鲜LB培养基，稀释度为1∶10，在37℃孵育70分钟。1mL每种培养物用3μL或5μL噬菌体储存液(ATCC25404-B1)接种，37℃20分钟。然后噬菌体/培养物与4mL含5mM CaCl₂的软琼脂混合，覆盖在LB培养基上。对照试验用无噬菌体的溶液进行。平板右侧向上在37℃孵育5小时，然后所有含噬菌体的平板上都可以看到有融合裂解；对照平板如预期一样有细胞菌苔。平板在37℃孵育过夜，然后如预期一样在试验平板上看到有噬菌体耐受集落。用无菌的可处理接种环从每个平板上刮下软琼脂放到离心管内。用2mL LB冲洗平板，冲洗液与离心管中的软琼脂混合。在管中加入5滴氯仿，温和振荡，在室温下孵育20分钟。混合物10000×g离心10分钟，用0.2μm注射器式滤器过滤上清，得到噬菌体裂解物。所有噬菌体裂解物都储存于4℃。 

转导入生产宿主：通过P1转导制备菌株BL21DE3ΔcysH，从而使cysH敲除子转移到菌株大肠杆菌BL21DE3内。大肠杆菌BL21DE3ΔcysH在含25μg/mL氯霉素的LB培养基内孵育过夜。培养物用于接种5mL含5 mM CaCl₂的新鲜LB培养基，稀释度为1∶10。亚培养物在37℃孵育60分钟。培养物离心，重悬于500μLMC缓冲液(0.1M MgSO₄，5mM CaCl₂)中，室温下孵育20分钟。各种稀释度的供体裂解物(1∶100到1×，用MC缓冲液稀释)以相等体积加入到100μL培养物中。混合物37℃孵育20分钟，然后每管加入200μL柠檬酸盐缓冲液(0.1M柠檬酸和220mM NaOH，pH5.5)和1mL LB。培养物在37℃孵育1小时，以200rpm振荡，然后离心得到细胞团。细胞团重悬于100μL柠檬酸盐缓冲液中，接种到含25μg/mL卡那霉素的LB平板上。通过在合适的选择培养基上重新接种来纯化单个的卡那霉素耐药集落。 

通过在添加L半胱氨酸和/或L蛋氨酸的M9培养基上培养来检测单个卡那霉素耐药集落是否是半胱氨酸和蛋氨酸营养缺陷型(有该表型则证明cysH已缺失)。 

为了进行接种，大肠杆菌菌株BL21 DE3 aspC proA pET32和BL21 DE3ΔcysH::aspCproA pET32在含100μg/mL氨苄青霉素的Luria-Bertani(″LB″)培养基内、37℃、250rpm振荡培养过夜。 

为了进行试验处理，按照如下方法制备用于提高色氨酸在大肠杆菌内产量的基本培养基Trp-1+葡萄糖培养基(Zeman等，Folia Microbiol.35：200-204，(1990))。向800mL纳米纯的水中加入下列试剂：2g(NH₄)₂SO₄和13.6g KH₂PO₄。PH调至7.0，体积增加到948mL，并对培养基进行高压灭菌。灭菌后在1.8mL体积的培养基中加入0.2g MgSO_4*7H₂O、0.01g CaCl_2*2H₂O和0.5mg FeSO_4*7H₂O，然后加入0.2mL Neidhardt微量营养素溶液。Neidhardt，F.C.等，“肠道细菌培养基”，J.Bacteriol.119：736-746(1974)。Neidhardt培养基包含(每升)：0.18g(NH₄)₆(MO₇)₂₄ -4H₂O、1.24g H₃BO₃、0.36g CoCl₂-6H₂O、0.12g CuSO₄(无水的)、0.8g MnCl₂-4H₂O和0.14g ZnSO₄-7H₂O。单独制备50％的葡萄糖溶液并通过过滤除菌。将40mL葡萄糖溶液和10mL 1M 3-吗啉代丙磺酸(“MOPS”)缓冲液加入到基础培养基(950mL)中，最后体积为1L。 

为了处理，将3.0-5.0 v/v％接种物加入到含100μg/mL氨苄青霉素的在500mL带挡板摇瓶内的100mL培养基中。处理条件包括整个试验以250rpm振荡，温度为37℃直到接种，然后降到30℃，随后诱导。在0.44-0.52 OD_600nm时，开始质粒基因的诱导。在诱导时，加入1.0mM IPTG、0.5mM维生素B6和0.2mL Balch维生素。在开始诱导后3.0小时加入10gL-色氨酸、10g/L丙酮酸钠、0.04mM吡哆醛-5’-磷酸(“PLP”)和0.2％吐温20(聚氧乙烯20-失水山梨糖醇单月桂酸酯)。在初次加入丙酮酸喉小时向每个摇瓶内再加入10g/L丙酮酸钠。某些处理包括在诱导开始后3.0小时加入2.5mM癸酸钠(或无菌蒸馏水，作为0mM癸酸盐处理)。在24、30和48小时采集用于莫纳甜分析和确定细胞干重的样品。 

表23.1 

未添加癸酸盐时大肠杆菌排出的莫纳甜/细胞干重 

	莫纳甜/细胞干重(mg/g)
					菌株	癸酸钠(mM)	24小时	30小时	48小时
大肠杆菌BL21 DE3 aspCproA pET32	0	4.6	5.2	4.2
					大肠杆菌BL21 DE3 cysH::aspCproA pET32	0	6.8	10.8	21.4

n＝2 

在未添加癸酸钠时，ΔcysH突变株48小时所排出的莫纳甜/细胞干重超过对照菌株5倍以上(21.4对4.2mg/g)。这些结果证明ΔcysH突变株可排出更多的莫纳甜。这个效应很可能是由于AcrAB和/或其他转运系统的诱导引起的。 

表23.2 

添加癸酸盐时大肠杆菌排出的莫纳甜/细胞干重 

	莫纳甜/细胞干重(mg/g)
					菌株	癸酸钠    (mM)	24小时	30小时	48小时
大肠杆菌BL21 DE3 aspCproA pET32	2.5	70.9	75.0	44.0
					大肠杆菌BL21 DE3 ΔcysH::aspCproA pET32	2.5	115.0	103.1	73.3

n＝2 

加入AcrAB转运系统的诱导剂癸酸钠，ΔcysH突变株排出的莫纳甜的量更高。24小时时突变株排出的莫纳甜/细胞干重超过100mg/g。这比对照菌株高出60％(115.0对70.9莫纳甜(mg)/g细胞干重)。这些结果说明ΔcysH突变株可排出更大的莫纳甜。这个效应很可能是由于AcrAB和/或其他转运系统的诱导引起的。ΔcysH突变与添加癸酸钠组合时所观察到的莫纳甜流出达到最大这一事实说明有AcrAB转运系统和/或其他转运系统的参与。 

由于已有报道证明cysH、icdA(异柠檬酸脱氢酶)、metE或purB(腺苷酸琥珀酸裂解酶)突变可导致AcrAB转运系统的活化(Helling，R.B.等，“大肠杆菌内的毒性废物处理”，J.Bacteriol.184：3699-3703，(2002))，因此我们预计删除下列基因中的一个或多个可以增加莫纳甜的流出：cysH、icdA、metE或purB。 

实施例24 

AcrEF转运系统可影响莫纳甜的流出 

大肠杆菌在某些生理条件下可产生色氨酸代谢物吲哚。AcrEF基因的产物是能量依赖型的多药流出泵，研究表明该基因的灭活可使吲哚的流出减少。从新导入acrEF基因可恢复吲哚的排出。据报道，ΔacrEF突变株比其亲本菌株能够积聚更多的胞内吲哚。这个突变株比其亲本菌株对吲哚的生长抑制效应更敏感。这些结果说明AcrEF系统在吲哚流出中发挥重要作用。Kawamura-Sato，K等，“大肠杆菌内的多重流出泵在吲哚排出中的作用(Role of multiple efflux pumps inEscherichia coli in indole expulsion)”，FEMS Microbiol Lett.179：345-352，(1999)。EnvR基因的灭活可导致AcrEF转运系统的过表达。 

所设计的引物用于通过PCR从模板pKD3制备ΔenvR基因敲除。Datsenko，K.A.和Wanner，B.L.，“利用PCR产物一步灭活大肠杆菌K-12的染色体基因(One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCRproducts)”，Proceed.Natl.Acad.Sci.USA 97：6640-6645，(2000)。 

以pKD3(Datsenko K.A.和Wanner，B.L.，“利用PCR产物一步灭活大肠杆菌K-12的染色体基因(One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coliK-12 using PCR products)”，Proceed.Natl.Acad.Sci.USA，97：6640-6645，(2000))为模板，利用Pfu Turbo DNA聚合酶(斯加特基因公司(Stratagene)，La Jolla，CA)以及引物ENVR1(5’-CACTCTGTGTCGAATATATTTATTTCCTGAATAATTAATCTGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3’(SEQ ID NO：30))和ENVR2(5’-ACTGTGACGAACTGAATTTTCAGGACAGAATGTGAATTTACATATGAATATCCTCCTTA-3’(SEQ ID NO：31))构建和扩增ΔenvR敲除产物。所使用的热循环程序包括95℃热启动2分钟，10个循环的95℃ 30秒，50℃ 30秒和72℃ 2分钟，然后是25个循环的95℃ 30秒，58℃ 30秒和72℃ 2分钟。最后一步是在70℃孵育7分钟。按照厂商的说明书利用QIAquick凝胶提取试剂盒(恰根公司(Qiagen Hilden)，德国)从两个PCR反应液(共200μL)中纯化PCR产物。ΔenvR敲除PCR产物用10μL双蒸水洗脱。 

按照厂商推荐的方法，利用Gene Pulsar II电穿孔系统(Bio-Rad，Hercules，CA)通过电穿孔用1μL PCR产物(250ng)转化菌株BW25113/pKD46(Datsenko K.A.和Wanner，B.L.，“利用PCR产物一步灭活大肠杆菌K-12的染色体基因(One-stepinactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products)”，Proceed.Natl.Acad.Sci.USA，97：6640-6645，(2000))，细胞在SOC培养基(《分子克隆，实验室手册》(Molecular Cloning，A Laboratory Manual)，第三版，2001，Sambrook和Russell，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，NY USA)中自然生长150分钟，然后接种到含10μg/mL氯霉素的LB固体培养基上。平板37℃孵育过夜。 

通过PCR筛选氯霉素耐药克隆以确定envR基因座的情况。如果envR被氯霉素耐药基因打断，那么利用引物ENVR3(5’CCTCTCGTATAAATACACATTAGGTGATAGATTAACCTTCG 3’(SEQ ID NO：32))和ENVR4(5’GCAACAGAAACAGACAAATGCCGCAATATG 3’(SEQ ID NO：33)) 进行集落PCR可产生一个1.2Kb的条带，否则就会产生一个0.8kb的条带。鉴定ΔenvR缺失的菌株，命名为BW25113 ΔEnvR。 

为了制备裂解物，按照实施例13的描述从BW25113 ΔenvR制备P1噬菌体裂解物以使敲除转移到大肠杆菌MG1655莫纳甜生产菌株内。 

为了将envR缺失导入到生产宿主内，按照实施例3关于emrB和acrAB敲除的描述将envR缺失转移到含质粒paspCproA ProNdede的1菌株大肠杆菌MG1655内。删除了envR基因的菌株通过接种到含25μg/mL氯霉素和50μg/mL卡那霉素的LB平板上进行筛选。鉴定ΔenvR缺失菌株并命名为MG1165 ΔEnvRpApProNdedel。 

为了打断MG1165 ΔEnvRpApProNdedel背景上的其他基因，从envR基因座上切下氯霉素耐药标记。按照厂商推荐的转化和储存溶液方法(TSS，震源生物技术公司(Epicentre Biotechnologies)，Madison，WI)用15ng pCP20转化MG1165 ΔEnvRpApProNdede(Datsenko K.A.和Wanner，B.L.，“利用PCR产物一步灭活大肠杆菌K-12的染色体基因(One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coliK-12 using PCR products)”，Proceed.Natl.Acad.Sci.USA，97：6640-6645，(2000))。在30℃自然生长30分钟后，细胞接种到含50μg/mL氨苄青霉素和25μg/mL卡那霉素的LB平板上，30℃孵育过夜。挑出单集落重新接种到含25μg/mL卡那霉素的LB平板上，42℃孵育过夜以获得单个集落。上述步骤所得到的单个集落复制接种到含25μg/mL卡那霉素和25μg/mL氯霉素的LB平板上。利用上述ENV3和ENVR4引物通过集落PCR检测氯霉素敏感而卡那霉素耐药的菌株，以确定envR基因座上氯霉素耐药标记的丢失情况。扩增氯霉素耐药标记已丢失的envR基因座可得到一个0.3Kb的条带，而扩增含有氯霉素耐药标记的envR基因座可产生一个1.2Kb的条带。得到的菌株命名为MG1165 ΔEnvRpApProNdedel CanS。EmrB和/或acrAB基因现在可能以实施例3所描述的相同方式被打断。 

由于AcrAB和emrAB转运系统液可以转运莫纳甜，因此envR缺失及其所导致的AcrEF转运系统的活化对莫纳甜转运的影响在AcrAB和emrAB转运系统中的一个或两个缺失的宿主菌株内可能是最主要的。 

由于吲哚和莫纳甜的结构相似，因此可以预计AcrEF转运蛋白也可以发挥吲哚-3-丙酮酸流出的功能。因此，删除编码AcrEF转运蛋白的基因以防止莫纳甜中间体漏出细胞从而使中间体更多流向莫纳甜的生产是可能的。同时，AcrEF转运蛋白可发挥莫纳甜流出的功能。实施例25说明流出吲哚-3-丙酮酸的转运蛋白也能够发挥流出莫纳甜的功能。决定灭活还是过表达AcrEF转运系统要根据莫纳甜转运与吲哚-3-丙酮酸转运的相对比例而定。 

实施例25 

阿布属生长素转运蛋白的过表达可增加莫纳甜的排出 

生长素(主要是吲哚-3-丙酮酸，IAA)是植物激素。研究表明生长素的定向转运是维持植物正常生长所必需的并主要由流出载体复合物介导，流出载体复合物具有PIN-FORMED(PIN)蛋白家族的特征。哺乳动物多药耐药/P-糖蛋白(MDR/PGP)的植物类似物在生长素流出中也发挥功能。据报道，MDR/PGP可稳定胞浆膜上的流出复合物，发挥ATP依赖性的生长素转运蛋白的功能。据报道，转运的特异性和方向是由相互作用的PIN蛋白决定的。Blakeslee J.J.等，“生长素转运(Auxintransport)”，Curr.Opin.Plant Biol.8：494-500，(2005年10月)。其他研究者证明MDR/PGP样ABC转运蛋白参与生长素和AtPGP1(NP_181228)的转运与主要的生长素主动流出直接相关(MDR样ABC转运蛋白AtPGP4参与植物生长素介导的侧根和根毛发育。Santelia D.等，FEBS Lett.579：5399-5406，(200年10月)；Geisler M.等，“细胞流出生长素由阿布属MDR/PGP转运蛋白AtPGP1催化(Cellular efflux ofauxin catalyzed by the Arabidopsis MDR/PGP transporter AtPGP1)”，The PlantJournal 44：179(2005))。由于莫纳甜的结构在某些方面与植物生长素有相似性，因此我们研究了利用生长素转运蛋白来流出莫纳甜。 

拟南芥mRNA(Cat # M1634310)得自生物链公司(Biochain)(Hayward，CA)。mRNA用无RNA酶的水稀释10倍，终浓度到50ng/μL。利用所述的反转录系统(帕玛咖公司(Promega)，Madison，WI)和随机引物从mRNA制备cDNA，模板为100ngmRNA而不是1μg总RNA。 

通过PCR在三个部分扩增AtPGP1基因，使用的聚合酶是Pfu Turbo DNA聚合酶(斯加特基因公司(Stratagene)，La Jolla，CA)，以拟南芥cDNA为模板。利用引物PGP1(5’-CATATGATGGATAATGACGGTGGTGCTCCTCCTCC-3’(SEQ ID NO：34))和PGP2(5’-CATTTGCGACTCGAGCAGCCTCCTCTATCTC-3’(SEQ IDNO：35))扩增开放阅读框架的1到1453位碱基。这可将Nde I限制性酶切位点引入开放阅读框架的5’端。退火温度为63℃，延伸时间2分钟。利用琼脂糖凝胶电泳纯化PCR片段，按照厂商推荐的方法利用QIAquick凝胶提取试剂盒(恰根公司(Qiagen Hilden)，德国)提取。按照厂商推荐的方法将纯化的PCR产物克隆到pCR4.0Blunt-TOPO(因维曲根公司(Invitrogen)Carlsbad，CA)中。通过直接测序(埃金科特公司(Agencourt)，Beverly MA)验证序列的正确性。得到的质粒命名为pAtPGP1-5’。利用引物PGP3(5’-GAGATAGAGGAGGCTGCTCGAGTCGCAAATG-3’(SEQ IDNO：36))和PGP4(5’-GAGAGCATAAGATGCATAAAGACAGAACTGAGCTACACC-3’(SEQ ID NO：37))扩增开放阅读框架的1423到2829位碱基。退火温度为55℃，延伸时间2分钟。按照上述方法将PCR片段纯化，克隆到pCR4.0 Blunt-TOPO内，并进行序列正确性的验证。得到的质粒命名为pAtPGP1-C。利用引物PGP5(5’-GCGGCCGCCTAAGCATCATCTTCCTTAACCCTAGAACTTGAACCTGAC-3’(SEQ ID NO：38))和引物PGP6(5’-GGTGTAGCTCAGTTCTGTCTTTATGCATCTTATGCTCTC-3’(SEQ ID NO：39))扩增开放阅读框架的2791到3861位碱基。退火温度为55℃，延伸时间2分钟。这可将Not I限制性酶切位点引入开放阅读框架的末端。按照上述方法将PCR片段纯化，克隆到pCR4.0 Blunt-TOPO内，并进行序列正确性的验证。得到的质粒命名为pAt-PGP1-3’。 

三个片段分别克隆以后，将3’片段和中间片段连接起来。得到的片段与5’片段连接起来形成完整的开放阅读框架，插入到最后的质粒中。pAtPGP1-C、pAtPGP1-3’和pBluescript SK-(斯加特基因公司(Stratagene)，La Jolla，CA)分别用Xho I和NsiI、Nsi I和Not I或者Xho I和Not I消化。按照上面所描述的方法通过琼脂糖凝胶电泳纯化1.4kb(pAtPGP1-C)、1.0Kb(pAtPGP1-3’)和3.0Kb(pBluescript SK-)片段并提取。按照厂商的说明书利用快速连接连接酶(新英格兰生物实验室公司(NewEngland Biolabs)，Ipswich，MA)将纯化的片段连接起来。得到的质粒命名为pAtPGP1-C3’。pAtPGP1-C3’、pAtPGP1-5’和pProNdedel分别用Xho I和Not I、NdeI和Not I或者Nde I和Not I消化。按照上面所描述的方法通过琼脂糖凝胶电泳纯化2.4 kb(pAtPGP1-C3’)、1.4Kb(pAtPGP1-5’)和2.6Kb(pProNdedel-我们有一种方法描述了pProNdedel的构建，见实施例15)的片段并提取。按照上述方法将纯化的片段连接起来。得到的质粒命名为pPro-AtPGP1，通过限制性酶切分析进行 确认。 

利用转化和储存溶液(TSS，震源生物技术公司(Epicentre Biotechnologies))制备感受态的大肠杆菌B121-DE3::aspCproApET32。按照厂商推荐的方法将pPro-AtPGP1转化到感受态的大肠杆菌B121-DE3::aspCproApET32内，然后接种到含100μg/mL氨苄青霉素和50μg/mL卡那霉素的LB平板上。含第二质粒pPro-AtPGP1的大肠杆菌B121-DE3::aspCproApET32转化子通过PCR扩增AtPGP1的3’区和5’区来验证，所用引物分别为上述的PGP1和PGP2或PGP5和PGP6。 

为了进行接种，大肠杆菌菌株在含100μg/mL氨苄青霉素和50μg/mL卡那霉素的Luria-Bertani(″LB″)培养基内、37℃、250rpm振荡培养过夜。为了进行试验处理，按照如下方法制备用于提高色氨酸在大肠杆菌内产量的基本培养基trp-1+葡萄糖培养基(Zeman等，Folia Microbiol.35：200-204，(1990))。向800mL纳米纯的水中加入下列试剂：2g(NH₄)₂SO₄和13.6g KH₂PO₄。PH调至7.0，体积增加到948mL，并对培养基进行高压灭菌。灭菌后在1.8mL体积的培养基中加入0.2gMgSO_4*7H₂O、0.01g CaCl_2*2H₂O和0.5mg FeSO_4*7H₂O，然后加入0.2mL Neidhardt微量营养素溶液。Neidhardt，F.C.等，“肠道细菌培养基”，J.Bacteriol.119：736-746(1974)。Neidhardt培养基包含(每升)：0.18g(NH₄)₆(MO₇)₂₄-4H₂O、1.24g H₃BO₃、0.36g CoCl₂-6H₂O、0.12g CuSO₄(无水的)、0.8g MnCl₂-4H₂O和0.14gZnSO₄-7H₂O。单独制备50％的葡萄糖溶液并通过过滤除菌。将40mL葡萄糖溶液和10mL 1M 3-吗啉代丙磺酸(“MOPS”)缓冲液加入到基础培养基(950mL)中，最后体积为1L。 

为了处理，将3.5 v/v％接种物加入到含100μg/mL氨苄青霉素和50μg/mL卡那霉素的在500mL带挡板摇瓶内的100mL培养基中。处理条件包括整个试验以250rpm振荡，温度为37℃直到接种，然后降到30℃，随后诱导。在0.54-0.62 OD_600nm 时，开始质粒基因的诱导。在诱导时，加入1.0mM IPTG、0.5％L-阿拉伯糖、0.5mM维生素B6和0.2mL Balch维生素。在开始诱导后3小时加入10gL-色氨酸、10g/L丙酮酸钠、0.04mM吡哆醛-5’-磷酸(“PLP”)和0或0.2％吐温20(聚氧乙烯20-失水山梨糖醇单月桂酸酯)。在24、30和48小时采集用于莫纳甜分析和确定细胞干重的样品。 

表25.1 

大肠杆菌流出的莫纳甜/细胞干重增加是由于生长素基因的表达 

除了^*n＝2之外所有处理都是n＝3 

与用空白载体(无生长素基因)处理的对照相比，利用质粒上的莫纳甜操纵子诱导阿布属生长素转运蛋白基因在菌株内表达可导致莫纳甜/细胞干重升高。24小时的莫纳甜/细胞干重结果平均为9.6mg/g，而无生长素基因的空白载体对照只有1.5mg/g。另外，在诱导后3小时用吐温20处理可导致莫纳甜/细胞干重平均值在24小时时升高到29.4mg/g，而空白载体对照只有2.2mg/g。这表示表达AtPGP1生长素转运蛋白基因的菌株所流出的莫纳甜/细胞干重升高了13倍。 

据报道，生长素转运蛋白AtPGP19(Q9LJX0)的功能与AtPGP1类似，预计也能够转运莫纳甜。另外，文献还报道了基于对阿布属PGP的种系发生(phyogenetic)分析所发现的三个p-糖蛋白(PGP)簇/进化枝。At PGP1是I类分子的原型，可催化生长素的转运。除了AtPGP1和AtPGP19之外，预计能在生长素转运中发挥作用的I类PGP的其他成员包括：阿布属的AtPGP13、AtPGP14、AtPGP10、AtPGP2以及稻(Oryza sativa)(水稻)的OsPGP9、OsPGP8、OsPGP7和OsPGP6(Geisler，M.和A.S.Murphy，“生长素转运的初步知识：p-糖蛋白在植物发育中的作用(The ABC ofauxin transport：The role of p-glycoproteins in plant development)”，FEBS Letters580：1094-1102，(2006))。上面所提到的I类PGP预计都具有转运莫纳甜的某些能力。 

另外，利用AtPGP1蛋白序列作为关键词对NCBI数据库进行的BLAST分析表明，有许多同源物，例如而不限于BrABB97035、StAAD10836、SbAAR10387、OsXP_483819、Os_CAD59580和ZMPGP1_AAR00316，都能在莫纳甜转运中发挥作用。所有这些同源物的序列比对显示在图1中。 

因此，我们所提供的证据支持生长素转运蛋白在莫纳甜流出中的作用。 

Claims (26)

1.一种生产莫纳甜的方法，所述方法包括：培养基因工程改造的革兰氏阴性细菌，所述细菌经基因工程改造能够分泌莫纳甜，并包含将色氨酸生物转换为吲哚-3-丙酮酸的酶，将吲哚-3-丙酮酸生物转换为2-羟基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸的酶，和将2-羟基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸转换成莫纳甜的酶，以及一种或多种能分泌莫纳甜的TolC多肽。

2.如权利要求1所述的方法，所述细菌还包含选自AcrAB转运系统和EmrAB转运系统的一个或多个组分。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述将色氨酸生物转换为吲哚-3-丙酮酸的酶选自酶分类EC2.6.1.27、EC1.4.1.19、EC1.4.99.1、EC2.6.1.28、EC1.4.3.2、EC1.4.3.3、EC2.6.1.5、EC2.6.1.-、EC2.6.1.1、EC2.6.1.21和EC3.5.1.-的成员。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述将吲哚-3-丙酮酸生物转换为2-羟基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸的酶选自酶分类EC4.1.3.-、EC4.1.3.16、EC4.1.3.17和EC4.1.2.-的成员。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述将色氨酸生物转换为吲哚-3-丙酮酸的酶和将2-羟基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸转换成莫纳甜的酶是相同的。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述将2-羟基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸转换成莫纳甜的酶选自酶分类EC2.6.1.27、EC2.6.1.5、EC1.4.1.19、EC2.6.1.1、EC1.4.1.2-4、EC1.4.1.20、EC1.4.99.1、EC2.6.1.21、EC2.6.1.28和2.6.1.-的成员。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细菌是大肠杆菌。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细菌是泛菌科的一员。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细菌是棒状杆菌科的一员。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，使所述细菌暴露于与合适对照相比能提高莫纳甜产量、莫纳甜流出量，或者同时提高莫纳甜产量和莫纳甜流出量的化合物。

11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述化合物选自氨苄青霉素、乙胺丁醇、丙酮酸、吐温及其组合。

12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述基因工程改造的细菌缺乏选自YhcP(AaeB)、YccS、YjcQ和YhfK的一种或多种转运蛋白。

13.一种生产莫纳甜的方法，所述方法包括：培养基因工程改造的革兰氏阴性细菌，所述细菌经基因工程改造能够分泌莫纳甜，并包含将色氨酸生物转换为吲哚-3-丙酮酸的酶，将吲哚-3-丙酮酸生物转换为2-羟基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸的酶，和将2-羟基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸转换成莫纳甜的酶，所述细菌还包含选自AcrAB转运系统和EmrAB转运系统的一个或多个组分。

14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述转运系统是AcrAB转运系统，且该方法还包括诱导步骤，所述诱导步骤包括在培养基中提供癸酸钠。

15.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述转运系统是EmrAB转运系统，且该方法还包括诱导步骤，所述诱导步骤包括在培养基中提供羰基氰3-氯苯腙。

16.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述细菌包含一个或多个AcrA,AcrB,EmrA和EmrB。

17.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述将色氨酸生物转换为吲哚-3-丙酮酸的酶选自酶分类EC2.6.1.27、EC1.4.1.19、EC1.4.99.1、EC2.6.1.28、EC1.4.3.2、1.4.3.3、EC2.6.1.5、EC2.6.1.-、EC2.6.1.1、EC2.6.1.21和EC3.5.1.-的成员。

18.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述将吲哚-3-丙酮酸生物转换为2-羟基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸的酶选自酶分类EC4.1.3.-、EC4.1.3.16、EC4.1.3.17和EC4.1.2.-的成员。

19.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述将色氨酸生物转换为吲哚-3-丙酮酸的酶和将2-羟基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸转换成莫纳甜酶是相同的。

20.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述将2-羟基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸转换成莫纳甜酶选自酶分类EC2.6.1.27、EC2.6.1.5、EC1.4.1.19、EC 2.6.1.1、EC1.4.1.2-4、EC1.4.1.20、EC1.4.99.1、EC2.6.1.21、EC2.6.1.28和EC2.6.1.-的成员。

21.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述细菌还含有一种或多种TolC多肽。

22.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述细菌是大肠杆菌。

23.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述细菌是泛菌科的一员。

24.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述细菌是棒状杆菌科的一员。

25.如权利要求13所述的方法，其特征在于，使所述细菌暴露于与合适对照相比能提高莫纳甜产量、莫纳甜流出量，或者同时提高莫纳甜产量和莫纳甜流出量的化合物。

26.如权利要求25所述的方法，其特征在于，所述化合物选自氨苄青霉素、乙胺丁醇、丙酮酸、吐温及其组合。

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