JP4239600B2 - ２ｒ−モナティンの製造方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は特定の酵素反応、好ましくはＬ−アミノトランスフェラーゼおよびＬ−アミノ酸オキシダーゼによる反応を利用して、モナティンの異性体混合物から高甘味度異性体である２Ｒ−モナティンを製造する方法に関する。
【従来の技術】
【０００２】
下記式で示される４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−グルタミン酸（３−（１−アミノ−１，３−ジカルボキシ−３−ヒドロキシ−ブタン−４−イル）−インドール）（以下、「モナティン」と称する。）は、植物シュレロチトン イリシホリアス（Sclerochitom ilicifolius）の根に含有されるアミノ酸の一種であり、ショ糖の数百倍の甘味を有していることから、低カロリー甘味料として期待される化合物である（特開昭６４−２５７５７号公報参照）。
【０００３】
【化１】
【０００４】
上記モナティンは２つの不斉部位（２位、４位）が存在し、天然型の立体異性体は、（２Ｓ，４Ｓ）体と報告されていた。その他の立体異性体の存在についても、合成的に調製され３種の立体異性体の存在が確認され、何れもショ糖の数十倍から数千倍の甘味強度を有することが確かめられている。
【０００５】
【表１】
【０００６】
表１に示すように、天然型の（２Ｓ，４Ｓ）体のみならず、その他の立体異性体の何れもがそれぞれ高倍率の甘味強度を有しているが、２Ｒ体は２Ｓ体と比較して甘味度が非常に高い。なかでも、最も甘味度が高い異性体である（２Ｒ，４Ｒ）体は、甘味剤或いは甘味剤成分（甘味料）として期待される化合物である。従って、２Ｒ体、望ましくは（２Ｒ，４Ｒ）体のモナティンを得る方法の開発が望まれる。
【０００７】
モナティンの製造方法については、過去に５例の報告が為されている。詳細は下記の先行技術文献のうち、特許文献１及び非特許文献１〜４に記載の通りである。
【０００８】
【特許文献１】
米国特許第５９９４５５９号明細書
【特許文献２】
欧州特許出願公開第０７３６６０４号明細書
【非特許文献１】
テトラヘドロン レターズ（Tetrahedron Letters）、２００１年、４２巻、３９号、６７９３〜６７９６頁
【非特許文献２】
オーガニック レターズ（Organic Letters）、２０００年、２巻、１９号、２９６７〜２９７０頁
【非特許文献３】
シンセティック コミュニケーション（Synthetic Communication）、１９９４年、２４巻、２２号、３１９７〜３２１１頁
【非特許文献４】
シンセティック コミュニケーション（Synthetic Communication）、１９９３年、２３巻、１８号、２５１１〜２５２６頁
【０００９】
しかしながら、何れの方法も多段階の工程を必要とすることから、工業的な実施が難しい上、これら化学合成法により合成されるモナティンは複数の光学異性体を含む異性体混合物である。
【００１０】
前述の通り、４種の光学異性体においてそれぞれ甘味度が異なることを既に出願人らは見出しているが、工業化に向けては高甘味度異性体である２Ｒ体、望ましくは(２Ｒ，４Ｒ)体を選択的に生成せしめる製法の開発が、単位重量当たりの甘味度および製造コスト面からみても望ましい。
【００１１】
従って、そのようなモナティンを工業的に製造する上で、より簡便かつ高収率な高甘味度異性体である２Ｒ−モナティンの製造方法、さらに望ましくは（２Ｒ、４Ｒ）体の製造方法の開発が求められる。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
本発明が解決しようとする課題は、甘味料等の成分として期待されるモナティンのなかでも甘味度の高い異性体である２Ｒ−モナティンの製造方法を提供することにある。さらに、本発明は、モナティンの異性体混合物の甘味度を改善する方法を提供することを目的とする。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は前記課題を解決すべく鋭意検討した結果、化学合成法などの方法で合成したモナティンの光学異性体の複数の混合物に、特定の酵素反応、好ましくはＬ−トランスアミナーゼおよび／またはＬ−アミノ酸オキシダーゼによる反応を利用して、比較的甘味度が低い２Ｓ体のモナティンを選択的に脱アミノ化することにより、２Ｒ−モナティンを製造する方法を見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１４】
本発明においては、酵素反応を利用して、モナティンの異性体混合物中における２Ｓ体を、下記構造式を有する４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸（以下、ＩＨＯＧと略）に変換させるため、２Ｒ体は反応系に未反応のまま残る。モナティンとＩＨＯＧとは晶析等の方法により容易に分割可能である。従って、反応系に残存するモナティンを回収することにより、高甘味度異性体である２Ｒ体の含有率が高い２Ｒ−モナティンを得ることができる。
【００１５】
【化２】
【００１６】
なお、本願明細書において、「２Ｒ体」とは、２位の不斉についてＲ配置を有するモナティンを意味する。モナティンは２位の他、４位にも不斉を有するので、２Ｒ体には（２Ｒ、４Ｒ）体、（２Ｒ、４Ｓ）体の２つがある。また、「２Ｓ体」とは、２位の不斉についてＳ配置を有するモナティンを意味し、（２Ｓ、４Ｒ）体、（２Ｓ、４Ｓ）体の２つがある。以下、簡便のため、（２Ｒ、４Ｒ）体、（２Ｒ、４Ｓ）体、（２Ｓ、４Ｒ）体、（２Ｓ、４Ｓ）体を、それぞれＲＲ体、ＲＳ体、ＳＲ体、ＳＳ体と称する場合がある。また、本発明の製造方法により得られる「２Ｒ−モナティン」とは、高甘味度異性体である２Ｒ体の含有率が高いモナティンを意味する。
【００１７】
また、もうひとつの本発明であるモナティンの甘味度改善方法は、酵素反応を利用してモナティンの異性体混合物中の２Ｓ体を選択的にＩＨＯＧに変換させ、高甘味度異性体である２Ｒ体の含有率を向上させることにより、モナティンの甘味度を改善する方法である。
【００１８】
即ち、本発明は以下の通りである。
【００１９】
〔１〕 ２Ｓ体および２Ｒ体の双方を含むモナティンの異性体混合物を、２Ｓ体のモナティンに選択的に作用してＩＨＯＧを生成する反応を触媒する酵素を含有する反応系で反応させることにより、２Ｓ体を分解させる工程、および
前記反応系から残存するモナティンを回収して２Ｒ−モナティンを得る工程
を含むことを特徴とする、２Ｒ−モナティンの製造方法。
【００２０】
〔２〕 前記酵素は、Ｌ-アミノトランスフェラーゼおよび／またはＬ−アミノ酸オキシダーゼであることを特徴とする、〔１〕記載の２Ｒ−モナティンの製造方法。
【００２１】
〔３〕 前記Ｌ-アミノトランスフェラーゼはＬ-アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼであることを特徴とする、〔２〕記載の２Ｒ−モナティンの製造方法。
【００２２】
〔４〕 前記Ｌ-アミノトランスフェラーゼは、Aeromonas属、Agrobacterium属、Alcaligenes属、Beijerinckia属、Escherichia属、Proteus属、Morganella属からなる群より選ばれる微生物に由来することを特徴とする、〔２〕または〔３〕記載の２Ｒ−モナティンの製造方法。
【００２３】
〔５〕 前記微生物は、Aeromonas hydrophila、Agrobacterium tumefaciens、Alcaligenes faecalis、Beijerinckia indica、Escherichia coli、Proteus rettgeri及びMorganella morganiiからなる群より選ばれることを特徴とする、〔４〕記載の２Ｒ−モナティンの製造方法。
【００２４】
〔６〕 前記Ｌ-アミノトランスフェラーゼは、Ｌ-アミノトランスフェラーゼ遺伝子を導入した微生物の産生するＬ-アミノトランスフェラーゼであることを特徴とする、〔２〕または〔３〕記載の２Ｒ−モナティンの製造方法。
【００２５】
〔７〕 前記Ｌ-アミノトランスフェラーゼ遺伝子は、Escherichia coliに由来するＬ-アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子であることを特徴とする、〔６〕記載の２Ｒ−モナティンの製造方法。
【００２６】
〔８〕 前記反応系にアミノ基受容体として、α−ケト酸を含有することを特徴とする、〔２〕〜〔７〕のいずれか一つに記載の２Ｒ−モナティンの製造方法。
【００２７】
〔９〕 さらに前記反応系に、前記α−ケト酸から副生するＬ−アミノ酸に対して作用するＬ−アミノ酸オキシダーゼを含有することを特徴とする、〔８〕記載の２Ｒ−モナティンの製造方法。
【００２８】
〔１０〕 前記α−ケト酸は、α−ケトグルタル酸であり、かつ、前記Ｌ−アミノ酸オキシダーゼは、Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼであることを特徴とする、〔９〕記載の２Ｒ−モナティンの製造方法。
【００２９】
〔１１〕 前記Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼは、Streptomyces属またはAzotobacter属に由来することを特徴とする、〔１０〕記載のモナティンの２Ｒ−モナティンの製造方法。
【００３０】
〔１２〕 前記Ｌ−アミノ酸オキシダーゼは、蛇毒由来Ｌ−アミノ酸オキシダーゼであることを特徴とする、〔２〕記載の２Ｒ−モナティンの製造方法。
【００３１】
〔１３〕 前記モナティンの異性体混合物は、（２Ｓ、４Ｓ）体および（２Ｒ、４Ｒ）体を含み、前記酵素は、Escherichia coli由来Ｌ-アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼであることを特徴とする、〔１〕記載の２Ｒ−モナティンの製造方法。
【００３２】
〔１４〕 前記モナティンの異性体混合物は、（２Ｓ、４Ｒ）体および（２Ｒ、４Ｒ）体を含み、前記酵素は、蛇毒由来Ｌ−アミノ酸オキシダーゼであることを特徴とする、〔１〕記載の２Ｒ−モナティンの製造方法。
【００３３】
〔１５〕 さらに前記反応系に、ＩＨＯＧから２Ｒ体のモナティンを生成する反応を触媒するＤ−アミノトランスフェラーゼを含有することを特徴とする〔１〕〜〔１４〕のいずれか一つに記載の２Ｒ−モナティンの製造方法。
【００３４】
〔１６〕 前記Ｄ−アミノトランスフェラーゼは、Bacillus属又はPaenibacillus属に属する微生物に由来することを特徴とする、〔１５〕記載の２Ｒ−モナティンの製造方法。
【００３５】
〔１７〕 前記微生物は、Bacillus sphaericus、Bacillus pulvifaciens、Bacillus macerans、Bacillus lentus、Paenibacillus larvae subsp. pulvifaciens及びPaenibacillus maceransからなる群より選ばれることを特徴とする、〔１６〕記載の２Ｒ−モナティンの製造方法。
【００３６】
〔１８〕 前記Ｄ−アミノトランスフェラーゼは、Ｄ−アミノトランスフェラーゼ遺伝子を導入した微生物の産生する酵素であることを特徴とする、〔１５〕記載の２Ｒ−モナティンの製造方法。
【００３７】
〔１９〕 前記Ｄ−アミノトランスフェラーゼ遺伝子は、Bacillus sphaericus又はBacillus maceransに由来することを特徴とする、〔１８〕記載の２Ｒ−モナティンの製造方法。
【００３８】
〔２０〕 （２Ｓ、４Ｒ）体および(２Ｒ、４Ｒ)体の双方を含むモナティンの異性体混合物を、（２Ｓ、４Ｒ）体のモナティンに選択的に作用して４Ｒ−ＩＨＯＧを生成する反応を触媒する酵素、および、４Ｒ−ＩＨＯＧから(２Ｒ、４Ｒ)体のモナティンを生成する反応を触媒するＤ−アミノトランスフェラーゼを含有する反応系で反応させることにより、（２Ｓ、４Ｒ）体を(２Ｒ、４Ｒ)体に変換する工程、
前記反応系からモナティンを回収して(２Ｒ、４Ｒ)−モナティンを得る工程
を含むことを特徴とする、(２Ｒ、４Ｒ)−モナティンの製造方法。
【００３９】
〔２１〕 ２Ｓ体および２Ｒ体の双方を含むモナティンの異性体混合物を、２Ｓ体のモナティンに選択的に作用してＩＨＯＧを生成する反応を触媒する酵素を含有する反応系で反応させ、２Ｓ体のモナティンの少なくとも一部を分解させることにより、高甘味度異性体である２Ｒ体の含有率を向上させることを特徴とするモナティンの甘味度改善方法。
【００４０】
【発明の実施の形態】
本発明は、２Ｒ体および２Ｓ体の双方を含むモナティンの異性体混合物を、２Ｓ体のモナティンに選択的に作用してＩＨＯＧを生成する反応を触媒する酵素を含有する反応系で反応させ、２Ｓ体を分解させることにより、２Ｒ−モナティンを製造する方法に関する。
【００４１】
本発明の製造方法により得られる「２Ｒ−モナティン」とは、高甘味度異性体である２Ｒ体の含有率が高いモナティンを意味する。２Ｒ体の含有率が高いとは、２Ｒ体含有率が６０％以上であることを意味する。２Ｒ体含有率は、８０％以上であることが好ましく、９０％以上であることがより好ましく、９５％以上であることがさらに好ましく、１００％であることが特に好ましい。また、本発明の製造方法により得られる「２Ｒ−モナティン」のうち、（２Ｒ、４Ｒ）体の含有率が高いモナティンを「（２Ｒ、４Ｒ）−モナティン」と称する場合がある。（２Ｒ、４Ｒ）体の含有率が高いとは、（２Ｒ、４Ｒ）体の含有率が６０％以上であることを意味する。（２Ｒ、４Ｒ）体含有率は、８０％以上であることが好ましく、９０％以上であることがより好ましく、９５％以上であることがさらに好ましく、１００％であることが特に好ましい。
【００４２】
例えば、ＲＲ体、ＲＳ体、ＳＲ体、ＳＳ体の４種異性体混合物を用いて２Ｓ体を選択的に脱アミノ化させると、下記に示すように、２Ｓ体であるＳＲ体、ＳＳ体はそれぞれ４Ｒ−ＩＨＯＧ、４Ｓ−ＩＨＯＧに変換され、２Ｒ体であるＲＲ体、ＲＳ体は未反応のまま反応系に残る。従って、反応系に残存するモナティンを回収することにより高甘味度異性体である２Ｒ体（ＲＲ体、ＲＳ体）を高含有率で含む２Ｒ−モナティンを得ることができる。
【００４３】
ＲＲ体 → 回収
ＲＳ体 → 回収
ＳＲ体 → ４Ｒ−ＩＨＯＧ
ＳＳ体 → ４Ｓ−ＩＨＯＧ
【００４４】
以下、本発明について、下記の順に詳細に説明する。
〔I〕酵素
〔II〕モナティンの異性体混合物
〔III〕反応方法
〔IV〕反応の具体例
【００４５】
〔I〕酵素
本発明においては、２Ｓ体のモナティンに選択的に作用してＩＨＯＧを生成する反応を触媒する酵素を用いる。当該酵素反応により、モナティンの異性体混合物中の２Ｓ体を分解して、高甘味度異性体である２Ｒ−モナティンを製造する。
【００４６】
「２Ｓ体のモナティンに選択的に作用してＩＨＯＧを生成する反応を触媒する酵素」とは、具体的には、２Ｓ体：２Ｒ体＝１：１の異性体混合物を作用させた場合、反応後に残存するモナティンの５０％超、好ましくは８０％超、より好ましくは９０％超が２Ｒ体となる酵素を意味する。好ましくは、２Ｓ体のみに作用し、２Ｒ体には作用しない酵素であることが好ましい。
【００４７】
また、当該酵素は、ＳＲ体およびＳＳ体の少なくとも一方に作用する酵素であれば足りるが、好ましくはＳＲ体およびＳＳ体の双方に対して作用する酵素であることが好ましい。
【００４８】
当該酵素としては、２Ｓ体のモナティンを基質として対応するケト酸であるＩＨＯＧを生成する反応を触媒する酵素であれば特に制限は無く、Ｌ−アミノトランスフェラーゼ、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ、Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ等を使用できる。これらのなかでも、Ｌ−アミノトランスフェラーゼないしＬ−アミノ酸オキシダーゼを使用することが好ましい。また、これらの酵素を複数種類組み合わせて作用させることもできる。
【００４９】
以下、簡便のため、Ｌ−アミノトランスフェラーゼを「ＬＡＴ」、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼを「ＬＡＯ」と略記する場合がある。
【００５０】
（Ａ）Ｌ−アミノトランスフェラーゼ
本発明において２Ｓ体のモナティンを脱アミノ化する酵素としてＬ−アミノトランスフェラーゼ（ＬＡＴ）を用いる場合について説明する。
【００５１】
Ｌ−アミノトランスフェラーゼとはＬ−アミノ酸のアミノ基転移反応を触媒する酵素である。「アミノ基転移反応」とは、アミノ供与体基質であるＬ−アミノ酸をケトン化合物に転化し、アミノ基受容体であるケトン化合物前駆体をその対応するアミノ化合物に転化する反応である。
【００５２】
本発明では、２Ｓ体のモナティンがアミノ供与体基質（Ｌ−アミノ酸）に相当し、２Ｓ体のモナティンのアミノ基をアミノ基受容体へと転移させることによりＩＨＯＧを生成する。
【００５３】
アミノ基受容体（ケトン化合物前駆体）としては、α-ケト酸の１種又は複数種を用いることが好ましい。α-ケト酸の例としては、α-ケトグルタル酸、オキザロ酢酸、ピルビン酸等を挙げることができる。アミノ基転移反応により、これらのα-ケト酸はアミノ化されると、それぞれ、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−アラニンを副生する。
【００５４】
酵素としてＬＡＴを用いる場合、下記反応式に示す反応により、２Ｓ体のモナティンが脱アミノ化され、ＩＨＯＧを生成する。また、α-ケト酸として用いたα-ケトグルタル酸（α-ＫＧ）は、アミノ化されＬ−グルタミン酸を生成する。
【００５５】
【化３】
【００５６】
ＬＡＴとしては２Ｓ体のモナティンを基質としたＬ−アミノトランスフェラーゼ活性作用を有する酵素であれば特に制限は無いが、特に好ましくはＬ−アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡｓｐＡＴ）を用いることができる。
【００５７】
このような酵素は、当該ＬＡＴを生産する微生物を培養することによっても調製することができる。このような微生物としては、例えばアエロモーナス(Aeromonas)属、アグロバクテリウム（Agrobacterium）属、アルカリゲネシス（Alcaligenes）属、バチルス(Bacillus)属、ベイジェリンキア（Beijerinckia）属、エシェリヒア（Escherichia）属、プロテウス（Proteus）属及びモルガネラ（Morganella）属に属する微生物を挙げることができる。
【００５８】
これらの微生物として、具体的には、次のものが例として挙げられる。即ち、２Ｓ体のモナティンからＩＨＯＧへと変換するＬ−アミノトランスフェラーゼ生産菌としては下記の例を挙げることができる。
【００５９】
アエロモーナス ヒドロフィラ Aeromonas hydrophila ＩＦＯ３８２０；
アグロバクテリウム ツメファシエンス Agrobacterium tumefaciens ＩＦＯ３０５８；
アルカリゲネス フェカリスAlcaligenes faecalis ＡＴＣＣ８７５０；
ベイジェリンキア インディカBeijerinckia indica ＡＴＣＣ９０３７；
エシェリヒア コリ Escherichia coli ＡＴＣＣ １２８１４；
プロテウス レットゲリ Proteus rettgeri ＩＦＯ１３５０１；
モルガネラ モルガニイ Morganella morganii ＩＦＯ３８４８。
【００６０】
これらの微生物は、土壌、植物等自然界より新たに分離された菌株であってもよいし、また更に変異導入薬剤処理や組換ＤＮＡ技術等により人為的に育種された菌株であってもよい。
【００６１】
また、ＬＡＴ活性を有する微生物として、ＬＡＴ遺伝子を導入した微生物を使用することができる。このような微生物にはEscherichia coliを使用することができる。
【００６２】
当該ＬＡＴ遺伝子、望ましくはアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子（ａｓｐＣ遺伝子）には、Escherichia coli由来のものを使用することができる。
【００６３】
酵素としてＬＡＴを用いる場合、平衡反応であるアミノ基転移反応を不可逆反応であるＬ−アミノ酸オキシダーゼによる脱アミノ化反応と組み合わせることにより、２Ｓ体のモナティンの脱アミノ化効率を高めることもできる。
【００６４】
すなわち、ＬＡＴによるアミノ基転移反応は一般的に平衡反応であるため、平衡状態に達するとそれ以上脱アミノ化反応は進行しないが、下記反応式に示すように、ＬＡＴ反応により副生するアミノ化合物を脱アミノ化するＬ−アミノ酸オキシダーゼ（ＬＡＯ）を併用することより、平衡状態を脱アミノ化反応側にシフトさせることができる。これにより、２Ｓ体のモナティンの脱アミノ化反応効率を上げることができる。
【００６５】
【化４】
【００６６】
なお、後述の２Ｓ体のモナティンを選択的に脱アミノ化するために用いるＬＡＯは、ＬＡＴ反応により副生するアミノ化合物を脱アミノ化するために用いるＬＡＯとは異なることを明記しておく。２Ｓ−モナティンを選択的に脱アミノ化するために用いるＬＡＯと、ＬＡＴ反応により副生するアミノ化合物を脱アミノ化するために用いるＬＡＯとを区別するために、前者を単に「Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ（ＬＡＯ）」、後者を「アミノ化合物除去用Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ（アミノ化合物除去用ＬＡＯ）」と称することにする。
【００６７】
アミノ化合物除去用ＬＡＯとしては、Ｌ−アミノトランスフェラーゼ反応により副生するアミノ化合物に対して作用する酵素であればよい。
【００６８】
このような２種類の酵素カップリング（ＬＡＴ＋アミノ化合物除去用ＬＡＯ）の一例を挙げると、Ｌ-アミノトランスフェラーゼ反応にアミノ基受容体としてα-ケトグルタル酸を用いた場合には、アミノ化合物としてＬ−グルタミン酸が副生するので、アミノ化合物除去用ＬＡＯとしては、Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼを併用することが好ましい。この場合、用いるＬ−グルタミン酸オキシダーゼとしては、Ｌ−グルタミン酸を脱アミノ化する活性を有する酵素であれば特に制限はないが、一例を挙げると放線菌由来Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼを用いることができる。
【００６９】
これらアミノ化合物除去用ＬＡＯは、ＬＡＴによる２Ｓ−モナティンの脱アミノ化反応開始時に添加してもよいし、ＬＡＴ反応途中から添加してもよい。
【００７０】
前述のアミノ化合物除去用ＬＡＯは、当該酵素を生産する微生物を培養することによっても調製することができる。このような微生物としては、例えばストレプトマイセス(Streptomyces)属、アゾトバクター(Azotobacter)属に属する微生物を挙げることができる（特公昭６１−２６３５７号公報；アンチバイオチキ イ キミオテラピラ (Antibiotiki i Khimioterapiya)、１９９８年、４３巻４号、７〜１３頁；ヨーロピアン ジャーナル オブ バイオケミストリー (European
Journal of Biochemistry)、１９８９年、１８２巻２号、３２７〜３３２頁）。
【００７１】
これらの微生物は、土壌、植物等自然界より新たに分離された菌株であってもよいし、また更に変異導入薬剤処理や組換ＤＮＡ技術等により人為的に育種された菌株であってもよい。
【００７２】
（Ｂ）Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ
次に、２Ｓ体のモナティンを脱アミノ化する酵素としてＬ−アミノ酸オキシダーゼ（ＬＡＯ）を用いる場合について説明する。
【００７３】
Ｌ−アミノ酸オキシダーゼとは、Ｏ2を酸化剤として、Ｌ−アミノ酸を酸化する反応を触媒する酵素である。本発明では、２Ｓ体のモナティンがＬ−アミノ酸に相当し、２Ｓ体のモナティンが酸化されることによりＩＨＯＧを生成する。
【００７４】
本発明において用いるＬＡＯは、２Ｓ体のモナティンを酸化してＩＨＯＧを生成する反応を触媒する酵素であれば限定はないが、好ましくは蛇毒由来ＬＡＯが用いられる。
【００７５】
酵素としてＬＡＯを用いる場合、下記反応式に示す反応により、２Ｓ体のモナティンは酸化され、ＩＨＯＧを生成する。
【００７６】
【化５】
【００７７】
上記反応の際に副生する過酸化水素によって基質（ＩＨＯＧ、モナティン）が分解される場合があるので、これを抑制するため、カタラーゼを反応系に添加して過酸化水素を分解することが好ましい（下記反応式参照）。微生物をＬ−アミノ酸オキシダーゼ源とする場合、微生物自身のカタラーゼ活性により、過酸化水素を十分に除去できることもあるが、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼとして精製酵素を用いる場合は過酸化水素の影響を受けるので、カタラーゼを併用することが好ましい。
【００７８】
【化６】
【００７９】
（Ｃ）その他の酵素
本発明においては、２Ｓ体のモナティンに選択的に作用してＩＨＯＧを生成する反応を触媒する酵素の他、さらに反応系にＩＨＯＧからモナティンの２Ｒ体を生成する反応を触媒するＤ−アミノトランスフェラーゼを含有させることも好ましい。Ｄ−アミノトランスフェラーゼを用いることにより、酵素反応で副生する４Ｒ−ＩＨＯＧ、４Ｓ−ＩＨＯＧをそれぞれＲＲ体、ＲＳ体のモナティンとして再生することができ、コスト面からみても本法は望ましい。
【００８０】
ＲＲ体 → 回収
ＲＳ体 → 回収
ＳＲ体 → ４Ｒ−ＩＨＯＧ → ＲＲ体→ 回収
ＳＳ体 → ４Ｓ−ＩＨＯＧ → ＲＳ体→ 回収
【００８１】
このようなＤ−アミノトランスフェラーゼ産生菌としては、例えば、下記の例を挙げることができる。
【００８２】
バチルス スフェリカス Bacillus sphaericus ＡＴＣＣ１０２０８
パエニバチルス ラバエ サブスピシーズ プルビファシエンス Paenibacillus larvae subsp. pulvifaciens ＡＴＣＣ １３５３７バチルス マセランス Bacillus macerans ＡＪ１６１７
パエニバチルス マセランス Paenibacillus macerans ＡＴＣＣ ８２４４
バチルス レンタス Bacillus lentus ＡＴＣＣ １０８４０
【００８３】
尚、バチルス マセランス Bacillus macerans ＡＪ１６１７については下記の通り寄託されている。
【００８４】
Bacillus macerans ＡＪ１６１７株
(イ)受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−８２４３
(ロ)受託日 ２００１年１２月１３日
(ハ)寄託先 独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東1丁目１番地１中央第６）
【００８５】
これらの微生物は、土壌、植物等自然界より新たに分離された菌株であってもよいし、また更に変異導入薬剤処理や組換ＤＮＡ技術等により人為的に育種された菌株であってもよい。
【００８６】
〔II〕モナティンの異性体混合物
本発明において、出発物質として用いるモナティンの異性体混合物は、２Ｒ体および２Ｓ体の双方を含んでいればよく、その組成比は特に限定されない。
【００８７】
したがって、例え異性体混合物であっても、ＲＲ体とＲＳ体の混合物のように、２Ｓ体を含まない異性体混合物や、ＳＲ体とＳＳ体の混合物ように２Ｒ体を含まない異性体混合物は、本発明における「モナティンの異性体混合物」には該当しない。
【００８８】
出発物質として用いるモナティンの異性体混合物の調製方法は特に限定されず、化学合成法、酵素法等の公知の方法を用いることができるが、一例を挙げれば、下記反応式に示すように、インドール−３−ピルビン酸とピルビン酸（ないしオキサロ酢酸）とのアルドール縮合により前駆体ケト酸（ＩＨＯＧ）を合成し、次いでＩＨＯＧの２位をアミノ化する方法等が挙げられる。
【００８９】
【化７】
【００９０】
化学合成法を用いた場合、モナティンは、ＲＲ、ＲＳ、ＳＲ、ＳＳ体の４種異性体混合物として得られる。ＲＲ、ＲＳ、ＳＲ、ＳＳ体の４種異性体混合物を用いて、酵素反応により２Ｓ体を脱アミノ化させた場合、２Ｓ体であるＳＲ体、ＳＳ体はそれぞれ４Ｒ−ＩＨＯＧ、４Ｓ−ＩＨＯＧに変換され、２Ｒ体であるＲＲ体、ＲＳ体は未反応のまま反応系に残る。従って、反応系に残存するモナティンを回収することにより高甘味度異性体である２Ｒ体（ＲＲ体、ＲＳ体）を高含有率で含む２Ｒ−モナティンを得ることができる。
【００９１】
２Ｓ体であるＳＲ体、ＳＳ体のうち、いずれか一方にのみ作用する酵素を用いる場合、酵素反応で除去できないもう一方の２Ｓ体を、晶析法等の手法を用いて予め除去しておくことが好ましい。すなわち、ＳＳ体にのみ作用する酵素を用いる場合は、出発物質として、ＳＲ体が除去されたモナティンの異性体混合物を用い、ＳＲ体にのみ作用する酵素を用いる場合は、ＳＳ体が除去されたモナティンの異性体混合物を用いることが好ましい。これにより、２Ｒ−モナティン中における２Ｓ体の含有率を下げ、単位重量あたりの甘味度の高いモナティンを得ることができる。
【００９２】
例えば、化学合成法にて合成したモナティンの４種異性体混合物を、参考例１に示すような条件下において、（ＳＳ＋ＲＲ）のラセミ混合物として晶析・分離することにより、異性体混合物からＳＲ体を除去することができる。このＳＲ体を除去した（ＳＳ＋ＲＲ）のラセミ混合物に、ＳＳ体にのみ作用する酵素を作用させることにより、ＲＲ体からなる２Ｒ−モナティンが得られる。
【００９３】
また、参考例２に示すように、モナティンの前駆体である４−ヒドロキシ−４−（３−インドリルメチル）−２−ヒドロキシイミノグルタル酸を４Ｒ体と４Ｓ体に分割し、４Ｒ体のモナティン前駆体から（ＳＲ＋ＲＲ）を合成することにより、ＳＳ体を含まない異性体混合物を調製することができる。このＳＳ体を含まない（ＳＲ＋ＲＲ）の異性体混合物に、ＳＲ体にのみ作用する酵素を作用させることにより、ＲＲ体からなる２Ｒ−モナティンが得られる。なお、ここでいう（ＳＲ＋ＲＲ）の異性体混合物とは、主としてＳＲ体とＲＲ体からなるモナティンの異性体混合物を意味し、不純物レベルでＲＳ体、ＳＳ体を含んでいても良い。不純物レベルとは、含有量が異性体混合物全体の５％未満、好ましくは３％未満であることを意味する。この際、２Ｒ−モナティンの収率を上げるため、ＳＲ体から副生する４Ｒ−ＩＨＯＧをＤ−アミノトランスフェラーゼを用いてＲＲ体のモナティンとして再生させることが好ましい。
【００９４】
可能であれば、酵素反応で除去できなかった２Ｓ体を、酵素反応後に除去してもよい。酵素反応後に未反応の２Ｓ体を除去する方法としては、例えば、４種異性体混合物に対し、ＳＳ体にのみ作用する酵素を用いて反応させ、ＲＲ、ＲＳ、ＳＲ体の３種異性体混合物を得た後、晶析により、母液からＲＲ体を析出させることにより、酵素反応で除去できない２Ｓ体（この場合、ＳＲ体）を除去できる。
【００９５】
〔III〕反応方法
本発明において、酵素は、当該酵素活性を発揮できる状態であれば、いかなる形態で反応系に存在させてもよい。すなわち、ＬＡＴやＬＡＯについては、２Ｓ体のモナティンに選択的に作用してＩＨＯＧを生成できる状態であればよい。また、ＬＡＴと併用するアミノ化合物除去用ＬＡＯ、ＬＡＯと併用するカタラーゼ、ＩＨＯＧを２Ｒ体のモナティンに再生させるためのＤ−アミノトランスフェラーゼについては、それぞれの酵素活性を発揮できる状態であればよい。
【００９６】
例えば、酵素を単体で反応系に添加してもよいし、当該酵素活性を有する微生物（酵素産生菌、組み換えＤＮＡによって形質転換された細胞）、該微生物の培養物（液体培養、固体培養等）、培地（培養物から菌体を除去したもの）、該培養物の処理物を反応系に添加してもよい。微生物の培養物を用いる場合は、微生物を培養させながら同時に反応を進行させてもよいし、予め酵素を得るために培養された培養物を用いて反応を行っても良い。また、ここでの「処理」とは、菌体内の酵素を取り出すことを目的として行う処理を意味し、例えば超音波、ガラスビーズ、フレンチプレス、凍結乾燥処理や溶菌酵素、有機溶剤、界面活性剤等による処理等が挙げられる。また、これ等の処理を行った処理物を、定法（液体クロマトグラフィーや硫安分画等）によって調製した粗分画酵素や精製酵素であって、必要とする能力を有するものであれば、これを用いてもよい。
【００９７】
更に、上記培養物或いはその処理物の利用の際、これ等をカラギーナンゲルやポリアクリルアミドに包括、或いはポリエーテルスルホンや再生セルロース等の膜に固定化して使用することも可能である。
【００９８】
本発明の一つの好ましい様態において、目的とするＬ−アミノトランスフェラーゼやＬ−アミノ酸オキシダーゼをコードする遺伝子を微生物細胞中に組み込むこともできる。尚、組み換えＤＮＡ技術を利用して酵素、生理活性物質等の有用タンパク質を製造する例は数多く知られており、組み換えＤＮＡ技術を用いることで、天然に微量に存在する有用タンパク質を大量生産できる。組み込まれる遺伝子の一例としては、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ａｓｐＣ遺伝子）が挙げられる。遺伝子の由来はこれに限定されるものではなく、目的とする２Ｓ-モナティンを脱アミノ化するようなＬ−アミノトランスフェラーゼ活性を有するような酵素をコードする遺伝子であればよい。
【００９９】
組み換えＤＮＡ技術を用いてタンパク質を大量生産する場合、形質転換される宿主細胞としては、細菌細胞、放線菌細胞、酵母細胞、カビ細胞、植物細胞、動物細胞等を用いることができる。このうち、組換えＤＮＡ操作について知見のある微生物としてはBacillus、Pseudonomas、Brevibacterium、Corynebacterium、Streptomyces、及びEscherichia coli等が挙げられる。一般には、大腸菌を用いてタンパク質を大量生産する技術について数多くの知見があるため、大腸菌、好ましくはEscherichia coliが用いられる。
【０１００】
これら微生物へは、目的とするＬ−アミノトランスフェラーゼ遺伝子やＬ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子を塔載したプラスミド、ファージ等のベクターを用いて導入してもよいし、相同組換えによって該細胞の染色体上に目的遺伝子を組み込んでもよい。好ましくは、いわゆるマルチコピー型のプラスミドベクターが挙げられ、例えばEscherichia coliへのベクターとしてはＣｏｌ Ｅ１由来の複製開始点を有するプラスミド、例えばｐＵＣ系のプラスミドやｐＢＲ３２２系のプラスミド、或いはその誘導体が挙げられる。これらベクターには目的とするアミノ基転移酵素遺伝子を発現させるプロモーターとして、通常大腸菌においてタンパク質生産に用いられるプロモーターを使用することができ、例えば、Ｔ７プロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ＰＬプロモーター等の強力なプロモーターが挙げられる。また、生産量を増大させるためには、タンパク質遺伝子の下流に転写終結配列であるターミネーターを連結することが好ましい。このターミネーターとしては、Ｔ７ターミネーター、ｆｄファージターミネーター、Ｔ４ターミネーター、テトラサイクリン耐性遺伝子のターミネーター、大腸菌ｔｒｐＡ遺伝子のターミネーター等が挙げられる。また、形質転換体を選別するために、該ベクターはアンピシリン耐性遺伝子等のマーカーを有することが好ましく、このようなプラスミドとして、例えば、ｐＵＣ系（宝酒造（株）製）、ｐＰＲＯＫ系（クローンテック製）、ｐＫＫ２３３−２（クローンテック製）等のように強力なプロモーターを持つ発現ベクターが市販されている。
【０１０１】
次に、本発明における微生物の培養方法について説明する。本発明における微生物の培養方法としては、通常この分野において用いられる培地、即ち炭素源、窒素源、無機塩類、微量金属塩類、ビタミン類等を含む培地を用いて行うことができる。また、微生物の種類或いは培養条件によっては、培地中に０.１〜１.０ｇ／ｄｌ程度のアミノ酸等のアミノ化合物を添加することによって、アミノ基転移反応活性を促進することもできる。
【０１０２】
遺伝子組換え細胞を培養する場合は、ベクターの選択マーカーに対応してアンピシリン、カナマイシン、ネオマイシン、クロラムフェニコール等の薬剤を適宜添加することもできる。また、ベクターに塔載されているプロモーターに合わせて、誘導剤を適量添加することによって該組換え遺伝子の発現量を上げることもできる。一例を挙げると、ｌａｃプロモーターの下流に目的とする遺伝子を連結してベクターを構築した場合は、イソプロピル１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を終濃度０．１ｍＭ〜５ｍＭの範囲で適宜添加することも可能であり、また、この代りとしてガラクトースを終濃度０.１〜５ｇ／ｄｌ望ましくは０.５ｇ／ｄｌ〜２ｇ／ｄｌ適宜添加することもできる。
【０１０３】
モナティンの菌体内への透過性を高めるために、トライトン Ｘ（Triton X）やトゥイーン（Tween）等の界面活性剤やトルエン、キシレン等の有機溶媒を利用することもできる。また、反応促進物質として、ピリドキサール−５−リン酸等の補酵素類を上記培地に添加してもよい。上記培地成分として用いる具体的物質として、例えば、炭素源としては、利用する微生物が利用可能であれば制限は無く、例えばグルコース、シュークロース、フルクトース、グリセロール、酢酸等、又はこれらの混合物を使用することができる。窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、尿素、酵母エキス、肉エキス、コーンスティープリカー、カゼイン加水分解物等、或いはこれらの混合物を使用することができる。具体的な培地組成として、例えばフマル酸 ０.５ｇ／ｄｌ、酵母エキス １ｇ／ｄｌ、ペプトン １ｇ／ｄｌ、硫安 ０．３ｇ／ｄｌ、Ｋ2ＨＰＯ4 ０．３ｇ／ｄｌ、ＫＨ2ＰＯ4 ０．１ｇ／ｄｌ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １ｍｇ／ｄｌ、及びＭｎＳＯ4・４Ｈ2Ｏ １ｍｇ／ｄｌ（ｐＨ７．０）を含む培地等が挙げられる。
【０１０４】
培養温度は、通常、利用する微生物が生育する範囲内、即ち１０〜４５℃で行われるが、好ましくは２０℃〜４０℃、更に好ましくは２５〜３７℃の範囲である。また、培地のｐＨ値については、好ましくは２〜１２、より好ましくは３〜１０、更に好ましくは４〜８の範囲で調節される。通気条件については、利用する微生物の生育に適した条件に設定されるが、好気条件が好ましい。培養時間については、通常１２〜１２０時間、好ましくは２４〜９６時間程度である。
【０１０５】
反応温度については、通常、利用する酵素が活性を有する範囲内、即ち好ましくは１０〜５０℃で行われるが、より好ましくは２０〜４０℃、更に好ましくは２５〜３７℃の範囲で行われる。反応溶液のｐＨ値については、通常、２〜１２、好ましくは６〜１１、更に好ましくは７〜９の範囲で調節される。反応時間については、通常１〜１２０時間程度、好ましくは１〜７２時間程度、更に好ましくは１〜２４時間程度が選択される。
【０１０６】
菌体又は菌体処理物の使用量については、所与の反応の場合において目的とする効果を発揮する量（有効量）であればよく、この有効量については当業者であれば簡単な予備実験により容易に求められるが、例えば、洗浄湿潤菌体の場合、反応液１００ｍｌ当たり１〜４０ｇである。
【０１０７】
尚、培養液或いは反応液中のモナティンあるいはＩＨＯＧを定量する場合、周知の方法を用いて速やかに測定することができる。即ち、簡便にはMerck社製「Silica gel 60F254」等を利用した薄層クロマトグラフィーを利用することができ、より分析精度を高めるには、ジーエルサイエンス社製「Inertsil ODS-80A」やダイセル化学工業（株）製「CROWNPAK CR（＋）」等の光学分割カラムを利用した高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を用いればよい。
【０１０８】
このようにして、培養液或いは反応液中に蓄積されたＩＨＯＧおよび残存モナティンは、常法により培養液或いは反応液中より採取して用いることができる。培養液或いは反応液中からの採取は、このような場合に当該分野において通常使用されている周知の手段、例えば濾過、遠心分離、真空濃縮、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、結晶化等の操作が必要に応じて適宜組み合わせて用いられる。
【０１０９】
反応系に残存するモナティンを回収する方法に特に限定はなく、公知の手法を用いることができる。目的とする２Ｒ−モナティンは遊離体の形で取得することができるが、必要により塩の形態で取得することもできる。塩の形態としては、塩基との塩を挙げることができる。例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム等の無機塩基、アンモニア、各種アミン等の有機塩基を挙げることができる。
【０１１０】
〔IV〕具体例
まず、Escherichia coli由来Ｌ−アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼを用いて２Ｒ−モナティンを製造する方法について説明する。当該酵素は、２Ｓ体のうちＳＳ体にのみ作用するので、ＲＲ体、ＲＳ体、ＳＲ体、ＳＳ体の４種異性体混合物に作用させた場合、ＳＳ体が脱アミノ化されて４Ｓ−ＩＨＯＧとなり、ＲＲ体、ＲＳ体、ＳＲ体は未反応のまま残る。
【０１１１】
この際、アミノ基転移反応により副生するアミノ化合物（ここではＬ−Ｇｌｕ）を脱アミノ化するアミノ化合物除去用ＬＡＯ（L-Glu oxidase）を併用して、平衡状態を脱アミノ化反応側にシフトさせることが好ましい。アミノ基転移反応は平衡反応であるが、アミノ化合物除去用ＬＡＯを用いてアミノ化合物を脱アミノ化することにより、Ｌ−アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼによるアミノ基転移反応を１００％進行させることができる。
【０１１２】
【化８】
【０１１３】
Ｌ−アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼを用いた場合、反応系から回収されたモナティンは、ＳＳ体が除去された分、単位重量当たりの甘味度が改善される。
【０１１４】
なお、当該酵素反応によってはＳＲ体は除去できないため、甘味度をより向上させるためには、酵素反応前に予めＳＲ体を除去しておくか、酵素反応後にＳＲ体を除去することが好ましい。
【０１１５】
酵素反応前にＳＲ体を除去する方法としては、例えば、下記▲１▼のように、晶析法によりＳＳ体とＲＲ体のラセミ混合物（ＳＳ＋ＲＲ）を調製し、当該ラセミ混合物にＡｓｐＡＴを作用させて、ＳＳ体を４Ｓ−ＩＨＯＧに変換して、ＲＲ体を製造する方法がある。また酵素反応後にＳＲ体を除去する方法としては、例えば、下記▲２▼のように、まず４種異性体混合物中のＳＳ体のみを４Ｓ−ＩＨＯＧに変換させた後、晶析によってＲＲ体のみ析出させることにより、ＲＲ体を製造できる。これらの方法によれば、最も甘味度の高いＲＲ体が得られるため、単位重量あたりの甘味度が高いモナティンが得ることができ好ましい。
【０１１６】
【化９】
【０１１７】
次に、蛇毒由来Ｌ−アミノ酸オキシダーゼを用いて、２Ｒ−モナティンを製造する場合について説明する。当該酵素は、２Ｓ体のうち、ＳＲ体にのみ作用するので、ＲＲ体、ＲＳ体、ＳＲ体、ＳＳ体の４種異性体混合物に作用させた場合、ＲＲ体、ＲＳ体、ＳＳ体は未反応のまま残る。従って、反応系から回収されたモナティンは、ＳＲ体が除去された分、単位重量当たりの甘味度が改善される。
【０１１８】
蛇毒由来Ｌ−アミノ酸オキシダーゼを用いた場合、酵素反応によってＳＳ体を除去することができないため、甘味度をより向上させるためには、ＳＳ体を除去することが好ましい。
【０１１９】
例えば、下記のように、参考例２の方法を用いて、ＲＲ体とＳＲ体のモナティンの異性体混合物（ＲＲ＋ＳＲ）を合成し、当該異性体混合物に蛇毒由来ＬＡＯを作用させると、ＳＲ体を選択的に４Ｒ−ＩＨＯＧに変換して、ＲＲ体を製造することができる。
【０１２０】
蛇毒由来Ｌ−アミノ酸オキシダーゼを用いる場合、２Ｒ体の収率を上げるため、ＳＲ体から副生する４Ｒ−ＩＨＯＧをＤ−アミノトランスフェラーゼを用いてＲＲ体のモナティンとして再生させることが好ましい。Ｄ−アミノトランスフェラーゼによって４Ｒ−ＩＨＯＧをＲＲ体に変換する反応は、蛇毒由来Ｌ−アミノ酸オキシダーゼによる反応と同時に行っても良いし、蛇毒由来Ｌ−アミノ酸オキシダーゼによる反応と分割して行っても良いが、反応の簡略化の観点からは、前者が好ましい。
【０１２１】
【化１０】
【０１２２】
また、ＳＳ体にのみ作用する酵素と、ＳＲ体にのみ作用する酵素を組み合わせて用いることにより、ＳＳ体とＳＲ体をＩＨＯＧに変換することも好ましい。このような酵素の組み合わせの一例としては、上記Escherichia coli由来ＬＡＯと蛇毒由来ＬＡＯとの組み合わせ酵素を組み合わせが挙げられる。
【０１２３】
この場合、最終生産物として得られる２Ｒ−モナティンは、ＲＳ体とＲＲ体の混合物となる。さらに甘味度を向上させたい場合は、晶析法等の手法を用いて、２Ｒ−モナティンからＲＲ体を単離してもよい。
【０１２４】
【化１１】
【０１２５】
【実施例】
以下に実施例及び参考例を示し本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【０１２６】
尚、実施例１で用いたモナティンの(２Ｓ、４Ｓ)、(２Ｒ、４Ｒ)体は、後述の参考例１により調製したものであり、実施例２、３で用いたモナティンの(２Ｓ、４Ｒ)、(２Ｒ、４Ｒ)体は、後述の参考例２を用いて調整したものである。
【０１２７】
また、本実施例において、モナティンの定量は、ジーエルサイエンス社製「Inertsil ODS-80A 」(5μm, 6X150mm)を利用した高速液体クロマトグラフィーにより行った。分析条件は、以下に示す通りである。
【０１２８】
移動相：12％(v/v) アセトニトリル/0.05%(v/v) トリフルオロ酢酸水溶液；
流速：1.5ml/min；
カラム温度：30℃；及び
検出：UV210nm
【０１２９】
本分析条件により、モナティンの（２Ｓ、４Ｓ）体及び（２Ｒ、４Ｒ）体は１２．１分に、（２Ｓ、４Ｒ）体及び（２Ｒ、４Ｓ）体は９．７分にて分別定量ができる。
【０１３０】
また、必要に応じて、ダイセル化学工業製光学分割カラム「CROWNPAK CR(+)」(4.6X150mm)を利用した高速液体クロマトグラフィーによる分析も行った。分析条件は以下に示す通りである。
【０１３１】
移動相：過塩素酸水溶液（pH1.5）/10%(v/v)メタノール；
流速：0.5ml/min；
カラム温度：30℃；及び
検出：UV210nm。
【０１３２】
本条件によりモナティン光学異性体は（２Ｒ、４Ｓ）体、（２Ｒ、４Ｒ）体、（２Ｓ、４Ｒ）体、及び（２Ｓ、４Ｓ）体の順に４２分、５７分、６４分、及び１２５分のリテンションタイムにて分別定量ができる。
【０１３３】
実施例１ Ｌ−アミノトランスフェラーゼを用いたモナティンの(２Ｓ、４Ｓ)、(２Ｒ、４Ｒ)体混合物からの(２Ｓ、４Ｓ)体の選択的脱アミノ化
（１）aspartate aminotransferase (ａｓｐＣ)高発現Ｅ. ｃｏｌｉの作製
（１−１）ｔｒｐプロモーター及びｒｒｎＢターミネーター搭載プラスミドｐＴｒｐ４の構築
エシェリヒア コリ（Escherichia coli）Ｗ３１１０染色体ＤＮＡ上のｔｒｐオペロンのプロモーター領域を表に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲ（表２：▲１▼と▲２▼の組み合わせ）により目的遺伝子領域を増幅し、得られたＤＮＡ断片をｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙベクター（プロメガ製）にライゲーションした。このライゲーション溶液でＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン耐性株の中からｔｒｐプロモーターの方向がｌａｃプロモーターと反対向きに挿入された目的のプラスミドを有する株を選択した。次にこのプラスミドをＥｃｏＯ１０９Ｉ／ＥｃｏＲＩにて処理して得られるｔｒｐプロモーターを含むＤＮＡ断片と、ｐＵＣ１９（Ｔａｋａｒａ製）のＥｃｏＯ１０９Ｉ／ＥｃｏＲＩ処理物とライゲーションした。このライゲーション溶液でＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択し、プラスミドをｐＴｒｐ１と命名した。次にｐＫＫ２２３−３（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）をＨｉｎｄＩＩＩ／ＨｉｎｃＩＩにて処理し、得られたｒｒｎＢターミネーターを含むＤＮＡ断片とｐＴｒｐ１のＨｉｎｄＩＩＩ／ＰｖｕＩＩ処理物とライゲーションした。このライゲーション溶液でＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択し、プラスミドをｐＴｒｐ２と命名した。次にｐＴｒｐ２を鋳型として表に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲ（表２：▲１▼と▲３▼の組み合わせ）によりｔｒｐプロモーター領域を増幅した。このＤＮＡ断片をＥｃｏＯ１０９Ｉ／ＮｄｅＩにより処理し、ｐＴｒｐ２のＥｃｏＯ１０９Ｉ／ＮｄｅＩ処理物とライゲーションした。このライゲーション溶液でＥ．ｃｏｌｉＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択し、このプラスミドをｐＴｒｐ４と命名した。
【０１３４】
【表２】
【０１３５】
（１−２）ａｓｐＣ遺伝子発現プラスミドｐｔｒｐＡｓｐＣの構築とＥ．ｃｏｌｉでの発現
プライマーａｓｐＣ-5'Nde (5'-CGC AGT CAT ATG TTT GAG AAC ATT ACC GCC GCT -3')およびａｓｐＣ-3'Eco(5'-CGC GAA TTC ATT GTT TTT AAT GCT TAC AGC A -3')を用いてエシェリヒア コリ（Esherichia coli）Ｗ３１１０染色体ＤＮＡより増幅した約１．２ｋｂｐの断片をＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩ消化し、ｐＴｒｐ４のＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩサイトに挿入したプラスミドｐｔｒｐＡｓｐＣを構築した。構築した発現プラスミドをＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９に導入し、形質転換体を５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ培地培地５０ｍｌに接種し、３７℃、１６時間振盪培養した。培養終了後、集菌し、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７．６)に懸濁して洗浄を行い、再度集菌して洗浄菌体を得た。
【０１３６】
（２）ＡｓｐＣ高発現Ｅ．ｃｏｌｉを用いたモナティンの(２Ｓ、４Ｓ)、 (２Ｒ、４Ｒ)体混合物からの(２Ｓ、４Ｓ)-モナティンの選択的脱アミノ化
１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ (２Ｓ、４Ｓ)体モナティン、５０ｍＭ (２Ｒ、４Ｒ)体モナティン、１ｍＭ ＰＬＰ、１％ (w/v)ＡｓｐＣ高発現Ｅ．ｃｏｌｉ洗浄菌体からなる反応液に、アミノ基受容体として２００ ｍＭ ２−ケトグルタル酸ないし２００ ｍＭ オキザロ酢酸をそれぞれ添加した反応区を設定した。反応液１ｍｌを試験管に入れ、３３℃で１６時間振とう反応させた。その結果、２−ケトグルタル酸区において３０ｍＭ相当の(２Ｓ、４Ｓ)体が、オキザロ酢酸区において２６ｍＭ相当の(２Ｓ、４Ｓ)体がそれぞれＩＨＯＧへと変換された。なお、いずれの実験区においても（２Ｒ、４Ｒ）体のモナティンはほぼ分解を受けずに反応系に残存した。
【０１３７】
（３）ＡｓｐＣ高発現Ｅ．ｃｏｌｉとＬ−グルタミン酸オキシダーゼの組み合わせによる(２Ｓ、４Ｓ)、(２Ｒ、４Ｒ)体混合物からの(２Ｓ、４Ｓ)体の選択的脱アミノ化
１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ (２Ｓ、４Ｓ)体モナティン、５０ｍＭ (２Ｒ、４Ｒ)体モナティン、２００ｍＭ ２−ケトグルタル酸、１ｍＭ ＰＬＰ、１％ (w/v) ＡｓｐＣ高発現Ｅ．ｃｏｌｉ洗浄菌体からなる反応液１ｍｌを試験管に入れた。２つの実験区を設定し、一方には反応開始１時間後に ２Ｕ／ｍｌのStreptomyces sp.由来Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ(Sigma社製)および２０００Ｕ／ｍｌ カタラーゼ(Sigma社製)を添加して反応を実施した。３０℃で１６時間振とう反応を実施した結果、Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ無添加区においては３０ｍＭ相当の(２Ｓ、４Ｓ)体モナティンがＩＨＯＧへと変換されたのに対して、Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ添加区においては(２Ｓ、４Ｓ)体モナティンの全量がＩＨＯＧへと変換された。なお、いずれの実験区においても（２Ｒ、４Ｒ）体はほぼ分解を受けずに反応系に残存した。この結果より、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼとＬ−グルタミン酸オキシダーゼをカップリングさせることにより(２Ｓ、４Ｓ)、(２Ｒ、４Ｒ)体混合物より(２Ｓ、４Ｓ)体を選択的に完全に脱アミノ化せしめ、（２Ｒ、４Ｒ）体のモナティンを採取せしめることができた。
【０１３８】
実施例２ Ｌ−アミノ酸オキシダーゼを用いたモナティンの(２Ｓ、４Ｒ)、(２Ｒ、４Ｒ)体混合物からの(２Ｓ、４Ｒ)体の選択的脱アミノ化
１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１Ｕ／ｍｌ 蛇毒由来L−アミノ酸オキシダーゼ（L-amino acid oxidase from Crotalus adamanteus）(Sigma社製)、３０００Ｕ／ml カタラーゼ(Sigma社製)、０．２６ ｇ／ｄｌ (２Ｓ、４Ｒ)体のモナティン、１．７４ ｇ／ｄｌ (２Ｒ、４Ｒ)体のモナティンからなる反応液１ｍｌを試験管に入れ、３０℃で１６時間振とうさせた。反応終了後のモナティン量をＨＰＬＣにて測定したところ、(２Ｓ、４Ｒ)体は完全に４Ｒ-ＩＨＯＧへと脱アミノ化されている一方で、(２Ｒ、４Ｒ) 体は分解を受けずに反応液中に残存し、(２Ｓ、４Ｒ)、(２Ｒ、４Ｒ)体混合物から (２Ｓ、４Ｒ)体を選択的に脱アミノ化し４Ｒ-ＩＨＯＧへと変換せしめた。
【０１３９】
実施例３ L−アミノ酸オキシダーゼを用いたモナティンの(２Ｓ、４Ｒ)、(２Ｒ、４Ｒ)体混合物からの(２Ｓ、４Ｒ)体の４Ｒ-ＩＨＯＧへの選択的脱アミノ化およびＤ−アミノトランスフェラーゼ発現Ｅ．ｃｏｌｉによる４Ｒ-ＩＨＯＧの（２Ｒ、４Ｒ）体モナティンへの変換
（１）Bacillus macerans ＡＪ１６１７株由来Ｄ−アミノトランスフェラーゼ遺伝子(bmdat)のクローニング
（１−１）染色体ＤＮＡの調製
Bacillus macerans ＡＪ１６１７株を５０ｍｌのブイヨン培地を用いて３０℃で一晩培養した（前培養）。この培養液５ｍｌを種菌として、５０ｍｌのブイヨン培地を用いて本培養を行った。対数増殖後期まで培養した後、培養液５０ｍｌを遠心分離操作（12000×ｇ、４℃、１５分間）に供し、集菌した。この菌体を用いて定法に従って染色体ＤＮＡを調製した。
【０１４０】
（１−２）遺伝子ライブラリからのbmdat遺伝子の単離
まず、Bacillus macerans ＡＪ１６１７株の染色体ＤＮＡ３０μｇに制限酵素ＥｃｏＲＩを１Ｕ添加し、３７℃にて３時間反応させて部分消化した。次にこのＤＮＡからアガロースゲル電気泳動にて３〜６ｋｂｐの断片を回収した。これをプラスミドｐＵＣ１１８のＥｃｏＲＩ切断物（ＢＡＰ処理済み・宝酒造製）１μｇとライゲーションさせ、Ｅ. ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換して遺伝子ライブラリを作製した。これをアンピシリンを含むＬＢ培地培地（トリプトン１％、酵母エキス０．５％、塩化ナトリウム１％、寒天２％、ｐＨ７．０）にプレーティングして、コロニーを形成させた。出現したコロニーをアンピシリンとイソブチル−１−チオ-β-Ｄ−アミノトランスフェラーゼ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を０．１ｍＭ含むＬＢ培地液体培地にて３７℃で一晩培養後、遠心・集菌して菌体を得た。得られた菌体を、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ (ｐＨ８．０)、５０ｍＭ ピルビン酸ナトリウム、１００ ｍＭ Ｄ−グルタミン酸、1 ｍＭ ピリドキサール−５´−リン酸、１％ （v/v）トルエンからなる反応液に接種し、３０℃で３０分間反応させた。反応終了後、反応液を遠心分離した上清５μlを２００μｌのピルビン酸定量反応液（１００ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ (ｐＨ ７．６)、１．５ ｍＭ ＮＡＤＨ、５ ｍＭ ＭｇＣｌ2、１６ Ｕ／ｍｌ Lactate dehydrogenase（オリエンタル酵母製））を含む９６ウェルプレートに加え、３０℃で１０分間反応させた後に３４０ｎｍの吸光度をプレートリーダー（SPECTRA MAX１９０、Molecular Device社製）を用いて測定した。同様の反応を終濃度０．２ｍＭ〜１ｍＭのピルビン酸ナトリウムを添加して実施し、これをスタンダードとしてピルビン酸の減少量を定量し、Ｄ−アミノトランスフェラーゼ活性を検出した。
【０１４１】
上記スクリーニングにより、Ｄ−アミノトランスフェラーゼ活性を示すクローンを採取した。これら形質転換体よりＤ−アミノトランスフェラーゼ遺伝子を含むプラスミドを調製し、ｐＵＣＢＭＤＡＴと命名した。プラスミドｐＵＣＢＭＤＡＴをＥｃｏＲＩ処理してアガロースゲル電気泳動に供したところ、挿入断片の長さは約３．３ｋｂｐと見積もられた。
【０１４２】
（１−３）挿入断片の塩基配列
プラスミドｐＵＣＢＭＤＡＴの挿入断片の塩基配列をジデオキシ法によって決定したところ、配列表配列番号６に示す配列のうち、６３０番から１４８１番に対応する約８５０ｂｐからなるＯＲＦを見出した。本ＯＲＦについて既知配列との相同性検索を行ったところ、Bacillus sphaericus ＡＴＣＣ１０２０８株由来のＤ−アミノトランスフェラーゼ遺伝子とアミノ酸配列において９１％の相同性を、Bacillus sp. ＹＭ−１株由来のＤ−アミノトランスフェラーゼ遺伝子とアミノ酸配列において６６％の相同性を、Bacillus licheniformis ＡＴＣＣ１０７１６株由来のＤ−アミノトランスフェラーゼ遺伝子とアミノ酸配列において４２％の相同性を示した。この結果より、本ＯＲＦはＤ−アミノトランスフェラーゼ伝子をコードしていることが明らかとなった。なお、ここでの相同性は、遺伝子解析ソフト「genetyx ver.6」（GENETYX社）を用い、各種パラメータは初期設定の通りとして算出した値である。
【０１４３】
（２）Ｌ−アミノ酸オキシダーゼを用いたモナティンの(２Ｓ、４Ｒ)、(２Ｒ、４Ｒ)体混合物からの(２Ｓ、４Ｒ)体の４Ｒ-ＩＨＯＧへの選択的脱アミノ化およびBacillus macerans由来Ｄ−アミノトランスフェラーゼ（ＢＭＤＡＴ）発現Ｅ．ｃｏｌｉを用いたＩＨＯＧからの２Ｒ体モナティンの生産の組み合わせ反応
（２−１）ＢＭＤＡＴ発現Ｅ．ｃｏｌｉの調製
ｐＵＣＢＭＤＡＴを持つＥ．ｃｏｌｉ 形質転換体０．１ｍｇ／ｍｌ アンピシリンを含むＬＢ培地培地（バクトトリプトン １ｇ／ｄｌ、酵母エキス ０．５ｇ／ｄｌ、及びＮａＣｌ １ｇ／ｄｌ）で３７℃、１６時間シード培養した。ＬＢ培地培地５０ｍｌを張り込んだ５００ｍｌ容坂口フラスコにこのシード培養液を１ｍｌ添加し、３７℃にて本培養を行った。培養開始２．５時間後に、終濃度１ｍＭとなるようにイソプロピル１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加し、更に４時間培養を行った。得られた培養液より集菌、洗浄し、ＢＭＤＡＴ発現Ｅ．ｃｏｌｉを調製した。
【０１４４】
（２−２）Ｌ−アミノ酸オキシダーゼおよびＤ−アミノトランスフェラーゼの組み合わせ反応
１００ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ ８．０）、１ Ｕ／蛇毒由来L−アミノ酸オキシダーゼ（L-amino acid oxidase from Crotalus adamanteus）（Sigma社製）、２０００ Ｕ／ｍｌ カタラーゼ (Sigma社製)、１３．４ ｍＭ (２Ｓ、４Ｒ)体モナティン、８１．４ ｍＭ (２Ｒ、４Ｒ)体モナティン、１ｍＭ ピリドキサール−５´−リン酸、１００ ｍＭ Ｄ−Ａｌａからなる反応液１ｍｌを試験管に入れた。２つの実験区を設定し、一方には上記で作製したＤ−アミノトランスフェラーゼ発現Ｅ．ｃｏｌｉの洗浄菌体を湿菌体重量で約１％(w/v)となるように添加した。これら反応液を、３０℃で１６時間振とうさせ反応を実施した。その結果、Ｄ−アミノトランスフェラーゼ無添加区においては(２Ｓ、 ４Ｒ)体のモナティンが完全に４Ｒ-ＩＨＯＧへと変換された。さらにＤ−アミノトランスフェラーゼ添加区においては（２Ｓ、４Ｒ）体のモナティンが完全に変換された上に、（２Ｒ、４Ｒ）体モナティン量が８１．４ｍＭ から８７．６ｍＭへと増加した。即ち、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼとＤ−アミノトランスフェラーゼを組み合わせることによりモナティンの(２Ｓ、４Ｒ)、(２Ｒ、４Ｒ)体混合物から (２Ｓ、４Ｒ)体を４Ｒ-ＩＨＯＧへと選択的に脱アミノ化し、さらに４Ｒ-ＩＨＯＧから(２Ｒ、４Ｒ)体のモナティンを生成せしめることができた。
【０１４５】
参考例１ モナティンの(２Ｓ、４Ｓ)、(２Ｒ、４Ｒ)体混合物の調製
（１）モナティンの４種立体異性体混合物の合成
（１−１）４−ヒドロキシ−４−（３−インドリルメチル）−２−ヒドロキシイミノグルタル酸の合成
水５０ｍｌに水酸化カリウム（純度８５％）１３．８ｇを溶解した後、インドール−３−ピルビン酸５．０ｇ（２４．６ｍｍｏｌ）及びオキサロ酢酸９．８ｇ（７３．８ｍｍｏｌ）を加えて室温にて７２時間反応を行った。反応液に対してヒドロキシルアミン塩酸塩６．８ｇ（９８．４ｍｍｏｌ）を加えた。その際、４規定水酸化ナトリウム水溶液にて反応液のｐＨ値を７．５に調節した。そのまま室温にて２４時間攪拌した後に、６規定塩酸にて反応液のｐＨ値を２．６に調節した。酢酸エチルを用いて抽出した後に、有機層を飽和食塩水にて洗浄、無水硫酸マグネシウムにて乾燥し、濃縮乾固した。得られた残渣を１４％アンモニア水１０ｍｌに溶解し、エタノール７０ｍｌを徐々に滴下して室温にて３時間攪拌した。得られたスラリーを濾過し、取得した結晶を乾燥することで、４−ヒドロキシ−４−（３−インドリルメチル）−２−ヒドロキシイミノグルタル酸２．７ｇ（７．９ｍｍｏｌ）をアンモニウム塩として得た。
【０１４６】
（ＮＭＲ測定）
1H NMR（DMSO-d6）δ：2.66（s, 2H）, 2.89（d, J= 14.4 Hz, 1H）, 3.04（d, J= 14.4 Hz, 1H）, 6.89−6.94（m, 1H）, 6.97−7.03（m, 1H）, 7.11（d, J= 2.8 Hz, 1H）, 7.27（d, J= 7.8 Hz, 1H）, 7.53（d, J= 7.8 Hz, 1H）, 10.71（br s, 1H）
【０１４７】
（分子量測定）
ESI-MS 計算値C14H14N2O6=306.28, 分析値305.17（MH-）
【０１４８】
（１−２）４−ヒドロキシ−４−（３−インドリルメチル）−２−アミノグルタル酸（モナティン）の合成
４−ヒドロキシ−４−（３−インドリルメチル）−２−ヒドロキシイミノグルタル酸アンモニウム塩０．１３ｇ（０．３８ｍｍｏｌ）を２８％アンモニア水５ｍｌに溶解し、５％ロジウム炭素０．０９ｇを加えて室温にて７．５気圧の水素圧にて反応させた。１４時間後に触媒を濾過し、反応液を濃縮乾固することで（２Ｓ、４Ｓ）/（２Ｒ、４Ｒ）−４−ヒドロキシ−４−（３−インドリルメチル）−２−アミノグルタル酸（モナティン）のアンモニウム塩０．０７５ｇ（０．２３ｍｍｏｌ）及び（２Ｓ、４Ｒ）/（２Ｒ、４Ｓ）−４−ヒドロキシ−４−（３−インドリルメチル）−２−アミノグルタル酸（モナティン）のアンモニウム塩０．０３６ｇ（０．１１ｍｍｏｌ）を混合物として得た。
【０１４９】
（ＮＭＲ測定）
1H NMR (D2O) δ：2.05（dd, J=12.2, 15.1Hz, 0.67H）, 2.21 (dd, J= 9.9, 15.6 Hz, 0.33H) , 2.48 (dd, J= 3.2, 15.6 Hz, 0.33H) , 2.68 (dd, J= 2.2, 15.1 Hz, 0.67H) , 3.08 (d, J= 14.4 Hz, 0.67H) , 3.17 − 3.25 (m, 0.66H) , 3.28 (d, J= 14.4 Hz, 0.67H) , 3.63 (dd, J= 2.2, 12.2 Hz, 0.67H) , 3.98 (dd, J=3.2, 9.9Hz, 0.33H) , 7.12 − 7.18 (m, 1H) , 7.19 − 7.26 (m, 2H)
, 7.45 − 7.51 (m, 1H) , 7.70 − 7.76 (m, 1H)。
【０１５０】
（分子量測定）
ESI-MS 計算値 C14H16N2O5 = 292.29, 分析値 291.28 (MH-)。
【０１５１】
（２）モナティン４種立体異性体混合物のアンモニウム塩の（２Ｓ、４Ｓ）体と（２Ｒ、４Ｒ）体とのラセミ体結晶及び（２Ｓ、４Ｒ）体と（２Ｒ、４Ｓ）体とのラセミ体結晶への分割
（１）に記載の方法を利用して別途合成したモナティンの光学異性体混合物（モナティン［（２Ｓ、４Ｓ）＋（２Ｒ、４Ｒ）］体：モナティン［（２Ｓ、４Ｒ）＋（２Ｒ、４Ｓ）］体＝６：４；1H NMR (D2O)での積分値での比により算出）のアンモニウム塩１０．００ｇ（３２．３３ｍｍｏｌ）を、２．５％アンモニア水１００ｍｌに溶解し、溶液を２０ｍｌになるまで濃縮した。新たに５％アンモニア水３ｍｌを加え均一にした後、室温にて３０分静置した。結晶析出後、５％アンモニア水／エタノール＝２５／７５の水溶液８０ｍｌを加えて均一にし、モナティン［（２Ｓ、４Ｓ）＋（２Ｒ、４Ｒ）］体アンモニウム塩の結晶を濾取した。得られた結晶を再び２．５％アンモニア水３０ｍｌに溶解し濃縮した後、５％アンモニア水０．５ｍｌとエタノール３０ｍｌにて再結晶し、モナティン［（２Ｓ、４Ｓ）＋（２Ｒ、４Ｒ）］体アンモニウム塩結晶 ４．８０ｇ（１５．５２ｍｍｏｌ、ＨＰＬＣ純度９８．０％）を得た。
【０１５２】
1Ｈ ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）δ：１．９５−２．０２（ｍ，１Ｈ），２．５８−２．６２（ｍ，１Ｈ），３．０１−３．０５（ｍ，１Ｈ），３．２１−３．２４（ｍ，１Ｈ），３．５５−３．５８（ｍ，１Ｈ），７．０７−７．１１（ｍ，１Ｈ），７．１４−７．１８（ｍ，２Ｈ），７．４２−７．４４（ｄ，１Ｈ），７．６６−７．６８（ｄ，１Ｈ）
【０１５３】
ＥＳＩ−ＭＳ ２９１．３９（Ｍ−Ｈ）-
【０１５４】
融点 １８２〜１８６℃
【０１５５】
前述の操作で得た濾液（モナティン［（２Ｓ、４Ｓ）＋（２Ｒ、４Ｒ）］体：モナティン［（２Ｓ、４Ｒ）＋（２Ｒ、４Ｓ）］体＝３：１０）を５ｍｌになるまで濃縮した。新たに５％アンモニア水３ｍｌを加えて均一にした後、室温にて１０分静置した。結晶析出後、エタノール８０ｍｌを加えて均一にし、モナティン［（２Ｓ、４Ｒ）＋（２Ｒ、４Ｓ）］アンモニウム塩の結晶を濾取した。得られた結晶を再び２．５％アンモニア水３０ｍｌに溶解し濃縮した後、５％アンモニア水０．５ｍｌとエタノール３０ｍｌによる再結晶を３回おこない、モナティン［（２Ｓ、４Ｒ）＋（２Ｒ、４Ｓ）］体アンモニウム塩結晶 ３．１０ｇ（１０．０２ｍｍｏｌ、ＨＰＬＣ純度９８．２％）を得た。総回収率は７９．０％であった。
【０１５６】
1Ｈ ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）δ：２．１１−２．１７（ｍ，１Ｈ），２．３８−２．４３（ｍ，１Ｈ），３．１６（ｓ，２Ｈ），３．９０−３．９３（ｍ，１Ｈ），７．０６−７．１０（ｍ，１Ｈ），７．１３−７．１７（ｍ，２Ｈ），７．４１−７．４３（ｄ，１Ｈ），７．６６−７．６８（ｄ，１Ｈ）
【０１５７】
ＥＳＩ−ＭＳ ２９１．１９（Ｍ−Ｈ）-
【０１５８】
融点 １６７．２〜１６８．４℃
【０１５９】
参考例２ モナティンの(２Ｓ、４Ｒ)、(２Ｒ、４Ｒ)体混合物の調製
参考例中、光学純度測定は下記条件でＨＰＬＣにて行った。
＜光学異性体分離用カラム＞ （株）住化分析センター製 SUMICHIRAL OA-7100＜溶離液＞ 20ｍM燐酸緩衝液(pH=2.8)：アセトニトリル＝7：3
＜カラム温度＞ 10℃
＜流速＞ 0.6ml/min
【０１６０】
（１）４−ヒドロキシ−４−（３−インドリルメチル）−２−ヒドロキシイミノグルタル酸の製造
１．６ｗｔ％水酸化ナトリウム水溶液９１７ｇに、インドール−３−ピルビン酸７３．８ｇ（３５２ｍｍｏｌ）を加えて溶解した。反応溶液を３５℃とし、３０％水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨ値を１１．１に保ちながら、５０％ピルビン酸水溶液３１０．２ｇ（１７６１ｍｍｏｌ）を２時間かけて滴下した。更に４．５時間反応させて、４−ヒドロキシ−４−（３−インドリルメチル）−２−ケトグルタル酸を含有する反応溶液を得た。これに、３０％水酸化ナトリウム水溶液にてｐＨ値を７に保ちながら、４０％ヒドロキシルアミン塩酸塩水溶液３６７．２ｇ（２１１４ｍｍｏｌ）を加え、５℃にて１７．５時間攪拌した。濃塩酸を用いて反応液のｐＨ値を２にし、有機物を酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、濃縮して残渣を得た。残渣に２８％アンモニア水６０ｍｌと２−プロパノール１３５０ｍｌから再結晶を行い、４−ヒドロキシ−４−（３−インドリルメチル）−２−ヒドロキシイミノグルタル酸の２アンモニウム塩４３．４ｇ（１４２ｍｍｏｌ：収率４０％ 対インドール−３−ピルビン酸）を結晶として得た。
【０１６１】
（２）（４Ｓ）−４−ヒドロキシ−４−（３−インドリルメチル）−２−ヒドロキシイミノグルタル酸の（R）−（＋）−１−フェニルエチルアミン塩の製造
４−ヒドロキシ−４−（３−インドリルメチル）−２−ヒドロキシイミノグルタル酸のアンモニウム塩４４．７ｇ（０.１３１モル）を２５℃で水５００ｍｌに溶解後、３６％塩酸２５．５ｇにてその水溶液のｐＨを２にした。酸性溶液を酢酸エチル１３００ｍｌで抽出し、その酢酸エチル溶液を飽和食塩水２００ｍｌで洗浄した。得られた酢酸エチル溶液に炭酸ナトリウム水溶液５００ｍｌ（炭酸ナトリウム １３.９ｇ ０.１３１モル）を加え攪拌し、アルカリ水溶液と酢酸エチルを分離した。得られたアルカリ水溶液に３６％塩酸２３．１ｇを添加し液のｐＨを２にした。この酸性水溶液に（R）−（＋）−１−フェニルエチルアミン６．９９ｇ（５７．６ｍｍｏｌ）を滴下し２５℃にて１時間攪拌する。得られた結晶をろ過し、減圧乾燥して（４Ｓ）−４−ヒドロキシ−４−（３−インドリルメチル）−２−ヒドロキシイミノグルタル酸の（R）−（＋）−１−フェニルエチルアミン塩２１．８ｇ（４７．８ｍｍｏｌ）を得た。（収率７２．７％ 光学純度８７．４％）
【０１６２】
1H-NMR(400MHz, DMSO-d6)σ：1.48 (d, 3H, J = 6.8 Hz), 2.63(d, 1H, J = 14.0 Hz), 2.70(d, 1H, J= 14.0 Hz), 2.90 (d, 1H, J = 14.1 Hz), 3.06 (d, 1H, J = 14.1 Hz), 4.40 (ｑ, 1H, J = 6.8 Hz), 6.91-7.54 (m, 10H).
【０１６３】
（３）（４Ｒ）−４−ヒドロキシ−４−（３−インドリルメチル）−２−ヒドロキシイミノグルタル酸の（Ｓ）−（−）−１−フェニルエチルアミン塩の製造
（１）で得られた結晶ろ過液に、更に（S）−（−）−１−フェニルエチルアミン７．１２ｇ（５８．７ｍｍｏｌ）を滴下し２５℃にて１時間攪拌した。得られた結晶をろ過し、減圧乾燥して（４Ｒ）−４−ヒドロキシ−４−（３−インドリルメチル）−２−ヒドロキシイミノグルタル酸の（S）−（−）−１−フェニルエチルアミン塩２３．８ｇ（５３．３ｍｏｌ）を得た。（収率８１．１％ 光学純度９２．１％）
【０１６４】
（４）（４Ｓ）−４−ヒドロキシ−４−（３−インドリルメチル）−２−ヒドロキシイミノグルタル酸のアンモニウム塩の製造
２５℃にて、（４Ｓ）−４−ヒドロキシ−４−（３−インドリルメチル）−２−ヒドロキシイミノグルタル酸の（R）−（＋）−１−フェニルエチルアミン塩２１．８ｇ（５１．０ｍｍｏｌ）に水２００ｍｌ及び２８％アンモニア水１８．５ｇを加えて溶解させた後、さらにトルエン２００ｍｌを加えて攪拌した。分層して得られた水層を６０℃に加温し、その水溶液に２−プロパノール９００ｍｌを２時間かけて滴下した。この２−プロパノール水溶液を１０℃まで５時間かけて冷却した後、１０℃で１０時間攪拌した。得られた結晶をろ過し、減圧乾燥して（４Ｓ）−４−ヒドロキシ−４−（３−インドリルメチル）−２−ヒドロキシイミノグルタル酸のアンモニウム塩１４．７５ｇを得た。（収率８５．１％ 光学純度９９．０％）
融点；２０５℃（分解）
比旋光度 [α]20 D +１３．４（ｃ＝1.00, Ｈ2Ｏ）
【０１６５】
（５）（４Ｒ）−４−ヒドロキシ−４−（３−インドリルメチル）−２−ヒドロキシイミノグルタル酸のアンモニウム塩の製造
上記実施例と同様に、（４Ｒ）−４−ヒドロキシ−４−（３−インドリルメチル）−２−ヒドロキシイミノグルタル酸の（R）−（＋）−１−フェニルエチルアミン塩２３．８ｇ（５３．３ｍｍｏｌ）から（４Ｒ）−４−ヒドロキシ−４−（３−インドリルメチル）−２−ヒドロキシイミノグルタル酸のアンモニウム塩１６．２ｇを得た。（収率８９．３％ 光学純度９９．９％）
比旋光度 [α]20 D -１３．６（ｃ＝1.00, Ｈ2Ｏ）
【０１６６】
（６）（２Ｒ、４Ｒ）及び（２Ｓ、４Ｒ）モナティンのアンモニウム塩の製造
（４Ｒ）−４−ヒドロキシ−４−（３−インドリルメチル）−２−ヒドロキシイミノグルタル酸のアミン塩１０．０ｇ（光学純度９４．４％、２２．４ｍｍｏｌ）を２８％アンモニア水１２０ｍｌに溶解し、５％ロジウム炭素（５０％含水品）７．４ｇを加えて室温にて１MPaの水素圧で反応を行った。２４時間後に触媒をろ過し、反応液にトルエン５０ｍｌを添加した。トルエン層と水層を分離し、得られた水層を濃縮した。濃縮物に９０％エタノール水５０ｍｌを加え２５℃で１０時間攪拌した。析出した粗結晶をろ過し、減圧乾燥することにより（２Ｒ、４Ｒ）及び（２Ｓ、４Ｒ）モナティンのアンモニウム塩２．８ｇを得た（収率４２％）
【０１６７】
（２Ｒ、４Ｒ）：（２Ｓ、４Ｒ）：（２Ｓ、４Ｓ）：（２Ｒ、４Ｓ）＝８２．４：１２．３：３：２．３（ＨＰＬＣエリア比）
【０１６８】
【発明の効果】
本発明の２Ｒ−モナティンの製造方法により、モナティン異性体混合物から甘味度の高い異性体である２Ｒ−モナティンを製造することができる。さらに晶析法等を組み合わせることにより最も甘味度の高い（２Ｒ、４Ｒ）−モナティンを製造することができるので、本発明は工業上、特に食品の分野において極めて有用である。
【０１６９】
【配列表】
【発明の属する技術分野】
本発明は特定の酵素反応、好ましくはＬ−アミノトランスフェラーゼおよびＬ−アミノ酸オキシダーゼによる反応を利用して、モナティンの異性体混合物から高甘味度異性体である２Ｒ−モナティンを製造する方法に関する。
【従来の技術】
【０００２】
下記式で示される４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−グルタミン酸（３−（１−アミノ−１，３−ジカルボキシ−３−ヒドロキシ−ブタン−４−イル）−インドール）（以下、「モナティン」と称する。）は、植物シュレロチトン イリシホリアス（Sclerochitom ilicifolius）の根に含有されるアミノ酸の一種であり、ショ糖の数百倍の甘味を有していることから、低カロリー甘味料として期待される化合物である（特開昭６４−２５７５７号公報参照）。
【０００３】
【化１】
上記モナティンは２つの不斉部位（２位、４位）が存在し、天然型の立体異性体は、（２Ｓ，４Ｓ）体と報告されていた。その他の立体異性体の存在についても、合成的に調製され３種の立体異性体の存在が確認され、何れもショ糖の数十倍から数千倍の甘味強度を有することが確かめられている。
【０００５】
【表１】
表１に示すように、天然型の（２Ｓ，４Ｓ）体のみならず、その他の立体異性体の何れもがそれぞれ高倍率の甘味強度を有しているが、２Ｒ体は２Ｓ体と比較して甘味度が非常に高い。なかでも、最も甘味度が高い異性体である（２Ｒ，４Ｒ）体は、甘味剤或いは甘味剤成分（甘味料）として期待される化合物である。従って、２Ｒ体、望ましくは（２Ｒ，４Ｒ）体のモナティンを得る方法の開発が望まれる。
【０００７】
モナティンの製造方法については、過去に５例の報告が為されている。詳細は下記の先行技術文献のうち、特許文献１及び非特許文献１〜４に記載の通りである。
【０００８】
【特許文献１】
米国特許第５９９４５５９号明細書
【特許文献２】
欧州特許出願公開第０７３６６０４号明細書
【非特許文献１】
テトラヘドロン レターズ（Tetrahedron Letters）、２００１年、４２巻、３９号、６７９３〜６７９６頁
【非特許文献２】
オーガニック レターズ（Organic Letters）、２０００年、２巻、１９号、２９６７〜２９７０頁
【非特許文献３】
シンセティック コミュニケーション（Synthetic Communication）、１９９４年、２４巻、２２号、３１９７〜３２１１頁
【非特許文献４】
シンセティック コミュニケーション（Synthetic Communication）、１９９３年、２３巻、１８号、２５１１〜２５２６頁
【０００９】
しかしながら、何れの方法も多段階の工程を必要とすることから、工業的な実施が難しい上、これら化学合成法により合成されるモナティンは複数の光学異性体を含む異性体混合物である。
【００１０】
前述の通り、４種の光学異性体においてそれぞれ甘味度が異なることを既に出願人らは見出しているが、工業化に向けては高甘味度異性体である２Ｒ体、望ましくは(２Ｒ，４Ｒ)体を選択的に生成せしめる製法の開発が、単位重量当たりの甘味度および製造コスト面からみても望ましい。
【００１１】
従って、そのようなモナティンを工業的に製造する上で、より簡便かつ高収率な高甘味度異性体である２Ｒ−モナティンの製造方法、さらに望ましくは（２Ｒ、４Ｒ）体の製造方法の開発が求められる。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
本発明が解決しようとする課題は、甘味料等の成分として期待されるモナティンのなかでも甘味度の高い異性体である２Ｒ−モナティンの製造方法を提供することにある。さらに、本発明は、モナティンの異性体混合物の甘味度を改善する方法を提供することを目的とする。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は前記課題を解決すべく鋭意検討した結果、化学合成法などの方法で合成したモナティンの光学異性体の複数の混合物に、特定の酵素反応、好ましくはＬ−トランスアミナーゼおよび／またはＬ−アミノ酸オキシダーゼによる反応を利用して、比較的甘味度が低い２Ｓ体のモナティンを選択的に脱アミノ化することにより、２Ｒ−モナティンを製造する方法を見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１４】
本発明においては、酵素反応を利用して、モナティンの異性体混合物中における２Ｓ体を、下記構造式を有する４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸（以下、ＩＨＯＧと略）に変換させるため、２Ｒ体は反応系に未反応のまま残る。モナティンとＩＨＯＧとは晶析等の方法により容易に分割可能である。従って、反応系に残存するモナティンを回収することにより、高甘味度異性体である２Ｒ体の含有率が高い２Ｒ−モナティンを得ることができる。
【００１５】
【化２】
なお、本願明細書において、「２Ｒ体」とは、２位の不斉についてＲ配置を有するモナティンを意味する。モナティンは２位の他、４位にも不斉を有するので、２Ｒ体には（２Ｒ、４Ｒ）体、（２Ｒ、４Ｓ）体の２つがある。また、「２Ｓ体」とは、２位の不斉についてＳ配置を有するモナティンを意味し、（２Ｓ、４Ｒ）体、（２Ｓ、４Ｓ）体の２つがある。以下、簡便のため、（２Ｒ、４Ｒ）体、（２Ｒ、４Ｓ）体、（２Ｓ、４Ｒ）体、（２Ｓ、４Ｓ）体を、それぞれＲＲ体、ＲＳ体、ＳＲ体、ＳＳ体と称する場合がある。また、本発明の製造方法により得られる「２Ｒ−モナティン」とは、高甘味度異性体である２Ｒ体の含有率が高いモナティンを意味する。
【００１７】
また、もうひとつの本発明であるモナティンの甘味度改善方法は、酵素反応を利用してモナティンの異性体混合物中の２Ｓ体を選択的にＩＨＯＧに変換させ、高甘味度異性体である２Ｒ体の含有率を向上させることにより、モナティンの甘味度を改善する方法である。
【００１８】
即ち、本発明は以下の通りである。
【００１９】
〔１〕 ２Ｓ体および２Ｒ体の双方を含むモナティンの異性体混合物を、２Ｓ体のモナティンに選択的に作用してＩＨＯＧを生成する反応を触媒する酵素を含有する反応系で反応させることにより、２Ｓ体を分解させる工程、および
前記反応系から残存するモナティンを回収して２Ｒ−モナティンを得る工程
を含むことを特徴とする、２Ｒ−モナティンの製造方法。
【００２０】
〔２〕 前記酵素は、Ｌ-アミノトランスフェラーゼおよび／またはＬ−アミノ酸オキシダーゼであることを特徴とする、〔１〕記載の２Ｒ−モナティンの製造方法。
【００２１】
〔３〕 前記Ｌ-アミノトランスフェラーゼはＬ-アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼであることを特徴とする、〔２〕記載の２Ｒ−モナティンの製造方法。
【００２２】
〔４〕 前記Ｌ-アミノトランスフェラーゼは、Aeromonas属、Agrobacterium属、Alcaligenes属、Beijerinckia属、Escherichia属、Proteus属、Morganella属からなる群より選ばれる微生物に由来することを特徴とする、〔２〕または〔３〕記載の２Ｒ−モナティンの製造方法。
【００２３】
〔５〕 前記微生物は、Aeromonas hydrophila、Agrobacterium tumefaciens、Alcaligenes faecalis、Beijerinckia indica、Escherichia coli、Proteus rettgeri及びMorganella morganiiからなる群より選ばれることを特徴とする、〔４〕記載の２Ｒ−モナティンの製造方法。
【００２４】
〔６〕 前記Ｌ-アミノトランスフェラーゼは、Ｌ-アミノトランスフェラーゼ遺伝子を導入した微生物の産生するＬ-アミノトランスフェラーゼであることを特徴とする、〔２〕または〔３〕記載の２Ｒ−モナティンの製造方法。
【００２５】
〔７〕 前記Ｌ-アミノトランスフェラーゼ遺伝子は、Escherichia coliに由来するＬ-アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子であることを特徴とする、〔６〕記載の２Ｒ−モナティンの製造方法。
【００２６】
〔８〕 前記反応系にアミノ基受容体として、α−ケト酸を含有することを特徴とする、〔２〕〜〔７〕のいずれか一つに記載の２Ｒ−モナティンの製造方法。
【００２７】
〔９〕 さらに前記反応系に、前記α−ケト酸から副生するＬ−アミノ酸に対して作用するＬ−アミノ酸オキシダーゼを含有することを特徴とする、〔８〕記載の２Ｒ−モナティンの製造方法。
【００２８】
〔１０〕 前記α−ケト酸は、α−ケトグルタル酸であり、かつ、前記Ｌ−アミノ酸オキシダーゼは、Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼであることを特徴とする、〔９〕記載の２Ｒ−モナティンの製造方法。
【００２９】
〔１１〕 前記Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼは、Streptomyces属またはAzotobacter属に由来することを特徴とする、〔１０〕記載のモナティンの２Ｒ−モナティンの製造方法。
【００３０】
〔１２〕 前記Ｌ−アミノ酸オキシダーゼは、蛇毒由来Ｌ−アミノ酸オキシダーゼであることを特徴とする、〔２〕記載の２Ｒ−モナティンの製造方法。
【００３１】
〔１３〕 前記モナティンの異性体混合物は、（２Ｓ、４Ｓ）体および（２Ｒ、４Ｒ）体を含み、前記酵素は、Escherichia coli由来Ｌ-アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼであることを特徴とする、〔１〕記載の２Ｒ−モナティンの製造方法。
【００３２】
〔１４〕 前記モナティンの異性体混合物は、（２Ｓ、４Ｒ）体および（２Ｒ、４Ｒ）体を含み、前記酵素は、蛇毒由来Ｌ−アミノ酸オキシダーゼであることを特徴とする、〔１〕記載の２Ｒ−モナティンの製造方法。
【００３３】
〔１５〕 さらに前記反応系に、ＩＨＯＧから２Ｒ体のモナティンを生成する反応を触媒するＤ−アミノトランスフェラーゼを含有することを特徴とする〔１〕〜〔１４〕のいずれか一つに記載の２Ｒ−モナティンの製造方法。
【００３４】
〔１６〕 前記Ｄ−アミノトランスフェラーゼは、Bacillus属又はPaenibacillus属に属する微生物に由来することを特徴とする、〔１５〕記載の２Ｒ−モナティンの製造方法。
【００３５】
〔１７〕 前記微生物は、Bacillus sphaericus、Bacillus pulvifaciens、Bacillus macerans、Bacillus lentus、Paenibacillus larvae subsp. pulvifaciens及びPaenibacillus maceransからなる群より選ばれることを特徴とする、〔１６〕記載の２Ｒ−モナティンの製造方法。
【００３６】
〔１８〕 前記Ｄ−アミノトランスフェラーゼは、Ｄ−アミノトランスフェラーゼ遺伝子を導入した微生物の産生する酵素であることを特徴とする、〔１５〕記載の２Ｒ−モナティンの製造方法。
【００３７】
〔１９〕 前記Ｄ−アミノトランスフェラーゼ遺伝子は、Bacillus sphaericus又はBacillus maceransに由来することを特徴とする、〔１８〕記載の２Ｒ−モナティンの製造方法。
【００３８】
〔２０〕 （２Ｓ、４Ｒ）体および(２Ｒ、４Ｒ)体の双方を含むモナティンの異性体混合物を、（２Ｓ、４Ｒ）体のモナティンに選択的に作用して４Ｒ−ＩＨＯＧを生成する反応を触媒する酵素、および、４Ｒ−ＩＨＯＧから(２Ｒ、４Ｒ)体のモナティンを生成する反応を触媒するＤ−アミノトランスフェラーゼを含有する反応系で反応させることにより、（２Ｓ、４Ｒ）体を(２Ｒ、４Ｒ)体に変換する工程、
前記反応系からモナティンを回収して(２Ｒ、４Ｒ)−モナティンを得る工程
を含むことを特徴とする、(２Ｒ、４Ｒ)−モナティンの製造方法。
【００３９】
〔２１〕 ２Ｓ体および２Ｒ体の双方を含むモナティンの異性体混合物を、２Ｓ体のモナティンに選択的に作用してＩＨＯＧを生成する反応を触媒する酵素を含有する反応系で反応させ、２Ｓ体のモナティンの少なくとも一部を分解させることにより、高甘味度異性体である２Ｒ体の含有率を向上させることを特徴とするモナティンの甘味度改善方法。
【００４０】
【発明の実施の形態】
本発明は、２Ｒ体および２Ｓ体の双方を含むモナティンの異性体混合物を、２Ｓ体のモナティンに選択的に作用してＩＨＯＧを生成する反応を触媒する酵素を含有する反応系で反応させ、２Ｓ体を分解させることにより、２Ｒ−モナティンを製造する方法に関する。
【００４１】
本発明の製造方法により得られる「２Ｒ−モナティン」とは、高甘味度異性体である２Ｒ体の含有率が高いモナティンを意味する。２Ｒ体の含有率が高いとは、２Ｒ体含有率が６０％以上であることを意味する。２Ｒ体含有率は、８０％以上であることが好ましく、９０％以上であることがより好ましく、９５％以上であることがさらに好ましく、１００％であることが特に好ましい。また、本発明の製造方法により得られる「２Ｒ−モナティン」のうち、（２Ｒ、４Ｒ）体の含有率が高いモナティンを「（２Ｒ、４Ｒ）−モナティン」と称する場合がある。（２Ｒ、４Ｒ）体の含有率が高いとは、（２Ｒ、４Ｒ）体の含有率が６０％以上であることを意味する。（２Ｒ、４Ｒ）体含有率は、８０％以上であることが好ましく、９０％以上であることがより好ましく、９５％以上であることがさらに好ましく、１００％であることが特に好ましい。
【００４２】
例えば、ＲＲ体、ＲＳ体、ＳＲ体、ＳＳ体の４種異性体混合物を用いて２Ｓ体を選択的に脱アミノ化させると、下記に示すように、２Ｓ体であるＳＲ体、ＳＳ体はそれぞれ４Ｒ−ＩＨＯＧ、４Ｓ−ＩＨＯＧに変換され、２Ｒ体であるＲＲ体、ＲＳ体は未反応のまま反応系に残る。従って、反応系に残存するモナティンを回収することにより高甘味度異性体である２Ｒ体（ＲＲ体、ＲＳ体）を高含有率で含む２Ｒ−モナティンを得ることができる。
【００４３】
ＲＲ体 → 回収
ＲＳ体 → 回収
ＳＲ体 → ４Ｒ−ＩＨＯＧ
ＳＳ体 → ４Ｓ−ＩＨＯＧ
【００４４】
以下、本発明について、下記の順に詳細に説明する。
〔I〕酵素
〔II〕モナティンの異性体混合物
〔III〕反応方法
〔IV〕反応の具体例
【００４５】
〔I〕酵素
本発明においては、２Ｓ体のモナティンに選択的に作用してＩＨＯＧを生成する反応を触媒する酵素を用いる。当該酵素反応により、モナティンの異性体混合物中の２Ｓ体を分解して、高甘味度異性体である２Ｒ−モナティンを製造する。
【００４６】
「２Ｓ体のモナティンに選択的に作用してＩＨＯＧを生成する反応を触媒する酵素」とは、具体的には、２Ｓ体：２Ｒ体＝１：１の異性体混合物を作用させた場合、反応後に残存するモナティンの５０％超、好ましくは８０％超、より好ましくは９０％超が２Ｒ体となる酵素を意味する。好ましくは、２Ｓ体のみに作用し、２Ｒ体には作用しない酵素であることが好ましい。
【００４７】
また、当該酵素は、ＳＲ体およびＳＳ体の少なくとも一方に作用する酵素であれば足りるが、好ましくはＳＲ体およびＳＳ体の双方に対して作用する酵素であることが好ましい。
【００４８】
当該酵素としては、２Ｓ体のモナティンを基質として対応するケト酸であるＩＨＯＧを生成する反応を触媒する酵素であれば特に制限は無く、Ｌ−アミノトランスフェラーゼ、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ、Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ等を使用できる。これらのなかでも、Ｌ−アミノトランスフェラーゼないしＬ−アミノ酸オキシダーゼを使用することが好ましい。また、これらの酵素を複数種類組み合わせて作用させることもできる。
【００４９】
以下、簡便のため、Ｌ−アミノトランスフェラーゼを「ＬＡＴ」、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼを「ＬＡＯ」と略記する場合がある。
【００５０】
（Ａ）Ｌ−アミノトランスフェラーゼ
本発明において２Ｓ体のモナティンを脱アミノ化する酵素としてＬ−アミノトランスフェラーゼ（ＬＡＴ）を用いる場合について説明する。
【００５１】
Ｌ−アミノトランスフェラーゼとはＬ−アミノ酸のアミノ基転移反応を触媒する酵素である。「アミノ基転移反応」とは、アミノ供与体基質であるＬ−アミノ酸をケトン化合物に転化し、アミノ基受容体であるケトン化合物前駆体をその対応するアミノ化合物に転化する反応である。
【００５２】
本発明では、２Ｓ体のモナティンがアミノ供与体基質（Ｌ−アミノ酸）に相当し、２Ｓ体のモナティンのアミノ基をアミノ基受容体へと転移させることによりＩＨＯＧを生成する。
【００５３】
アミノ基受容体（ケトン化合物前駆体）としては、α-ケト酸の１種又は複数種を用いることが好ましい。α-ケト酸の例としては、α-ケトグルタル酸、オキザロ酢酸、ピルビン酸等を挙げることができる。アミノ基転移反応により、これらのα-ケト酸はアミノ化されると、それぞれ、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−アラニンを副生する。
【００５４】
酵素としてＬＡＴを用いる場合、下記反応式に示す反応により、２Ｓ体のモナティンが脱アミノ化され、ＩＨＯＧを生成する。また、α-ケト酸として用いたα-ケトグルタル酸（α-ＫＧ）は、アミノ化されＬ−グルタミン酸を生成する。
【００５５】
【化３】
ＬＡＴとしては２Ｓ体のモナティンを基質としたＬ−アミノトランスフェラーゼ活性作用を有する酵素であれば特に制限は無いが、特に好ましくはＬ−アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡｓｐＡＴ）を用いることができる。
【００５７】
このような酵素は、当該ＬＡＴを生産する微生物を培養することによっても調製することができる。このような微生物としては、例えばアエロモーナス(Aeromonas)属、アグロバクテリウム（Agrobacterium）属、アルカリゲネシス（Alcaligenes）属、バチルス(Bacillus)属、ベイジェリンキア（Beijerinckia）属、エシェリヒア（Escherichia）属、プロテウス（Proteus）属及びモルガネラ（Morganella）属に属する微生物を挙げることができる。
【００５８】
これらの微生物として、具体的には、次のものが例として挙げられる。即ち、２Ｓ体のモナティンからＩＨＯＧへと変換するＬ−アミノトランスフェラーゼ生産菌としては下記の例を挙げることができる。
【００５９】
アエロモーナス ヒドロフィラ Aeromonas hydrophila ＩＦＯ３８２０；
アグロバクテリウム ツメファシエンス Agrobacterium tumefaciens ＩＦＯ３０５８；
アルカリゲネス フェカリスAlcaligenes faecalis ＡＴＣＣ８７５０；
ベイジェリンキア インディカBeijerinckia indica ＡＴＣＣ９０３７；
エシェリヒア コリ Escherichia coli ＡＴＣＣ １２８１４；
プロテウス レットゲリ Proteus rettgeri ＩＦＯ１３５０１；
モルガネラ モルガニイ Morganella morganii ＩＦＯ３８４８。
【００６０】
これらの微生物は、土壌、植物等自然界より新たに分離された菌株であってもよいし、また更に変異導入薬剤処理や組換ＤＮＡ技術等により人為的に育種された菌株であってもよい。
【００６１】
また、ＬＡＴ活性を有する微生物として、ＬＡＴ遺伝子を導入した微生物を使用することができる。このような微生物にはEscherichia coliを使用することができる。
【００６２】
当該ＬＡＴ遺伝子、望ましくはアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子（ａｓｐＣ遺伝子）には、Escherichia coli由来のものを使用することができる。
【００６３】
酵素としてＬＡＴを用いる場合、平衡反応であるアミノ基転移反応を不可逆反応であるＬ−アミノ酸オキシダーゼによる脱アミノ化反応と組み合わせることにより、２Ｓ体のモナティンの脱アミノ化効率を高めることもできる。
【００６４】
すなわち、ＬＡＴによるアミノ基転移反応は一般的に平衡反応であるため、平衡状態に達するとそれ以上脱アミノ化反応は進行しないが、下記反応式に示すように、ＬＡＴ反応により副生するアミノ化合物を脱アミノ化するＬ−アミノ酸オキシダーゼ（ＬＡＯ）を併用することより、平衡状態を脱アミノ化反応側にシフトさせることができる。これにより、２Ｓ体のモナティンの脱アミノ化反応効率を上げることができる。
【００６５】
【化４】
なお、後述の２Ｓ体のモナティンを選択的に脱アミノ化するために用いるＬＡＯは、ＬＡＴ反応により副生するアミノ化合物を脱アミノ化するために用いるＬＡＯとは異なることを明記しておく。２Ｓ−モナティンを選択的に脱アミノ化するために用いるＬＡＯと、ＬＡＴ反応により副生するアミノ化合物を脱アミノ化するために用いるＬＡＯとを区別するために、前者を単に「Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ（ＬＡＯ）」、後者を「アミノ化合物除去用Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ（アミノ化合物除去用ＬＡＯ）」と称することにする。
【００６７】
アミノ化合物除去用ＬＡＯとしては、Ｌ−アミノトランスフェラーゼ反応により副生するアミノ化合物に対して作用する酵素であればよい。
【００６８】
このような２種類の酵素カップリング（ＬＡＴ＋アミノ化合物除去用ＬＡＯ）の一例を挙げると、Ｌ-アミノトランスフェラーゼ反応にアミノ基受容体としてα-ケトグルタル酸を用いた場合には、アミノ化合物としてＬ−グルタミン酸が副生するので、アミノ化合物除去用ＬＡＯとしては、Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼを併用することが好ましい。この場合、用いるＬ−グルタミン酸オキシダーゼとしては、Ｌ−グルタミン酸を脱アミノ化する活性を有する酵素であれば特に制限はないが、一例を挙げると放線菌由来Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼを用いることができる。
【００６９】
これらアミノ化合物除去用ＬＡＯは、ＬＡＴによる２Ｓ−モナティンの脱アミノ化反応開始時に添加してもよいし、ＬＡＴ反応途中から添加してもよい。
【００７０】
前述のアミノ化合物除去用ＬＡＯは、当該酵素を生産する微生物を培養することによっても調製することができる。このような微生物としては、例えばストレプトマイセス(Streptomyces)属、アゾトバクター(Azotobacter)属に属する微生物を挙げることができる（特公昭６１−２６３５７号公報；アンチバイオチキ イ キミオテラピラ (Antibiotiki i Khimioterapiya)、１９９８年、４３巻４号、７〜１３頁；ヨーロピアン ジャーナル オブ バイオケミストリー (European
Journal of Biochemistry)、１９８９年、１８２巻２号、３２７〜３３２頁）。
【００７１】
これらの微生物は、土壌、植物等自然界より新たに分離された菌株であってもよいし、また更に変異導入薬剤処理や組換ＤＮＡ技術等により人為的に育種された菌株であってもよい。
【００７２】
（Ｂ）Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ
次に、２Ｓ体のモナティンを脱アミノ化する酵素としてＬ−アミノ酸オキシダーゼ（ＬＡＯ）を用いる場合について説明する。
【００７３】
Ｌ−アミノ酸オキシダーゼとは、Ｏ2を酸化剤として、Ｌ−アミノ酸を酸化する反応を触媒する酵素である。本発明では、２Ｓ体のモナティンがＬ−アミノ酸に相当し、２Ｓ体のモナティンが酸化されることによりＩＨＯＧを生成する。
【００７４】
本発明において用いるＬＡＯは、２Ｓ体のモナティンを酸化してＩＨＯＧを生成する反応を触媒する酵素であれば限定はないが、好ましくは蛇毒由来ＬＡＯが用いられる。
【００７５】
酵素としてＬＡＯを用いる場合、下記反応式に示す反応により、２Ｓ体のモナティンは酸化され、ＩＨＯＧを生成する。
【００７６】
【化５】
上記反応の際に副生する過酸化水素によって基質（ＩＨＯＧ、モナティン）が分解される場合があるので、これを抑制するため、カタラーゼを反応系に添加して過酸化水素を分解することが好ましい（下記反応式参照）。微生物をＬ−アミノ酸オキシダーゼ源とする場合、微生物自身のカタラーゼ活性により、過酸化水素を十分に除去できることもあるが、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼとして精製酵素を用いる場合は過酸化水素の影響を受けるので、カタラーゼを併用することが好ましい。
【００７８】
【化６】
（Ｃ）その他の酵素
本発明においては、２Ｓ体のモナティンに選択的に作用してＩＨＯＧを生成する反応を触媒する酵素の他、さらに反応系にＩＨＯＧからモナティンの２Ｒ体を生成する反応を触媒するＤ−アミノトランスフェラーゼを含有させることも好ましい。Ｄ−アミノトランスフェラーゼを用いることにより、酵素反応で副生する４Ｒ−ＩＨＯＧ、４Ｓ−ＩＨＯＧをそれぞれＲＲ体、ＲＳ体のモナティンとして再生することができ、コスト面からみても本法は望ましい。
【００８０】
ＲＲ体 → 回収
ＲＳ体 → 回収
ＳＲ体 → ４Ｒ−ＩＨＯＧ → ＲＲ体→ 回収
ＳＳ体 → ４Ｓ−ＩＨＯＧ → ＲＳ体→ 回収
【００８１】
このようなＤ−アミノトランスフェラーゼ産生菌としては、例えば、下記の例を挙げることができる。
【００８２】
バチルス スフェリカス Bacillus sphaericus ＡＴＣＣ１０２０８
パエニバチルス ラバエ サブスピシーズ プルビファシエンス Paenibacillus larvae subsp. pulvifaciens ＡＴＣＣ １３５３７バチルス マセランス Bacillus macerans ＡＪ１６１７
パエニバチルス マセランス Paenibacillus macerans ＡＴＣＣ ８２４４
バチルス レンタス Bacillus lentus ＡＴＣＣ １０８４０
【００８３】
尚、バチルス マセランス Bacillus macerans ＡＪ１６１７については下記の通り寄託されている。
【００８４】
Bacillus macerans ＡＪ１６１７株
(イ)受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−８２４３
(ロ)受託日 ２００１年１２月１３日
(ハ)寄託先 独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東1丁目１番地１中央第６）
【００８５】
これらの微生物は、土壌、植物等自然界より新たに分離された菌株であってもよいし、また更に変異導入薬剤処理や組換ＤＮＡ技術等により人為的に育種された菌株であってもよい。
【００８６】
〔II〕モナティンの異性体混合物
本発明において、出発物質として用いるモナティンの異性体混合物は、２Ｒ体および２Ｓ体の双方を含んでいればよく、その組成比は特に限定されない。
【００８７】
したがって、例え異性体混合物であっても、ＲＲ体とＲＳ体の混合物のように、２Ｓ体を含まない異性体混合物や、ＳＲ体とＳＳ体の混合物ように２Ｒ体を含まない異性体混合物は、本発明における「モナティンの異性体混合物」には該当しない。
【００８８】
出発物質として用いるモナティンの異性体混合物の調製方法は特に限定されず、化学合成法、酵素法等の公知の方法を用いることができるが、一例を挙げれば、下記反応式に示すように、インドール−３−ピルビン酸とピルビン酸（ないしオキサロ酢酸）とのアルドール縮合により前駆体ケト酸（ＩＨＯＧ）を合成し、次いでＩＨＯＧの２位をアミノ化する方法等が挙げられる。
【００８９】
【化７】
化学合成法を用いた場合、モナティンは、ＲＲ、ＲＳ、ＳＲ、ＳＳ体の４種異性体混合物として得られる。ＲＲ、ＲＳ、ＳＲ、ＳＳ体の４種異性体混合物を用いて、酵素反応により２Ｓ体を脱アミノ化させた場合、２Ｓ体であるＳＲ体、ＳＳ体はそれぞれ４Ｒ−ＩＨＯＧ、４Ｓ−ＩＨＯＧに変換され、２Ｒ体であるＲＲ体、ＲＳ体は未反応のまま反応系に残る。従って、反応系に残存するモナティンを回収することにより高甘味度異性体である２Ｒ体（ＲＲ体、ＲＳ体）を高含有率で含む２Ｒ−モナティンを得ることができる。
【００９１】
２Ｓ体であるＳＲ体、ＳＳ体のうち、いずれか一方にのみ作用する酵素を用いる場合、酵素反応で除去できないもう一方の２Ｓ体を、晶析法等の手法を用いて予め除去しておくことが好ましい。すなわち、ＳＳ体にのみ作用する酵素を用いる場合は、出発物質として、ＳＲ体が除去されたモナティンの異性体混合物を用い、ＳＲ体にのみ作用する酵素を用いる場合は、ＳＳ体が除去されたモナティンの異性体混合物を用いることが好ましい。これにより、２Ｒ−モナティン中における２Ｓ体の含有率を下げ、単位重量あたりの甘味度の高いモナティンを得ることができる。
【００９２】
例えば、化学合成法にて合成したモナティンの４種異性体混合物を、参考例１に示すような条件下において、（ＳＳ＋ＲＲ）のラセミ混合物として晶析・分離することにより、異性体混合物からＳＲ体を除去することができる。このＳＲ体を除去した（ＳＳ＋ＲＲ）のラセミ混合物に、ＳＳ体にのみ作用する酵素を作用させることにより、ＲＲ体からなる２Ｒ−モナティンが得られる。
【００９３】
また、参考例２に示すように、モナティンの前駆体である４−ヒドロキシ−４−（３−インドリルメチル）−２−ヒドロキシイミノグルタル酸を４Ｒ体と４Ｓ体に分割し、４Ｒ体のモナティン前駆体から（ＳＲ＋ＲＲ）を合成することにより、ＳＳ体を含まない異性体混合物を調製することができる。このＳＳ体を含まない（ＳＲ＋ＲＲ）の異性体混合物に、ＳＲ体にのみ作用する酵素を作用させることにより、ＲＲ体からなる２Ｒ−モナティンが得られる。なお、ここでいう（ＳＲ＋ＲＲ）の異性体混合物とは、主としてＳＲ体とＲＲ体からなるモナティンの異性体混合物を意味し、不純物レベルでＲＳ体、ＳＳ体を含んでいても良い。不純物レベルとは、含有量が異性体混合物全体の５％未満、好ましくは３％未満であることを意味する。この際、２Ｒ−モナティンの収率を上げるため、ＳＲ体から副生する４Ｒ−ＩＨＯＧをＤ−アミノトランスフェラーゼを用いてＲＲ体のモナティンとして再生させることが好ましい。
【００９４】
可能であれば、酵素反応で除去できなかった２Ｓ体を、酵素反応後に除去してもよい。酵素反応後に未反応の２Ｓ体を除去する方法としては、例えば、４種異性体混合物に対し、ＳＳ体にのみ作用する酵素を用いて反応させ、ＲＲ、ＲＳ、ＳＲ体の３種異性体混合物を得た後、晶析により、母液からＲＲ体を析出させることにより、酵素反応で除去できない２Ｓ体（この場合、ＳＲ体）を除去できる。
【００９５】
〔III〕反応方法
本発明において、酵素は、当該酵素活性を発揮できる状態であれば、いかなる形態で反応系に存在させてもよい。すなわち、ＬＡＴやＬＡＯについては、２Ｓ体のモナティンに選択的に作用してＩＨＯＧを生成できる状態であればよい。また、ＬＡＴと併用するアミノ化合物除去用ＬＡＯ、ＬＡＯと併用するカタラーゼ、ＩＨＯＧを２Ｒ体のモナティンに再生させるためのＤ−アミノトランスフェラーゼについては、それぞれの酵素活性を発揮できる状態であればよい。
【００９６】
例えば、酵素を単体で反応系に添加してもよいし、当該酵素活性を有する微生物（酵素産生菌、組み換えＤＮＡによって形質転換された細胞）、該微生物の培養物（液体培養、固体培養等）、培地（培養物から菌体を除去したもの）、該培養物の処理物を反応系に添加してもよい。微生物の培養物を用いる場合は、微生物を培養させながら同時に反応を進行させてもよいし、予め酵素を得るために培養された培養物を用いて反応を行っても良い。また、ここでの「処理」とは、菌体内の酵素を取り出すことを目的として行う処理を意味し、例えば超音波、ガラスビーズ、フレンチプレス、凍結乾燥処理や溶菌酵素、有機溶剤、界面活性剤等による処理等が挙げられる。また、これ等の処理を行った処理物を、定法（液体クロマトグラフィーや硫安分画等）によって調製した粗分画酵素や精製酵素であって、必要とする能力を有するものであれば、これを用いてもよい。
【００９７】
更に、上記培養物或いはその処理物の利用の際、これ等をカラギーナンゲルやポリアクリルアミドに包括、或いはポリエーテルスルホンや再生セルロース等の膜に固定化して使用することも可能である。
【００９８】
本発明の一つの好ましい様態において、目的とするＬ−アミノトランスフェラーゼやＬ−アミノ酸オキシダーゼをコードする遺伝子を微生物細胞中に組み込むこともできる。尚、組み換えＤＮＡ技術を利用して酵素、生理活性物質等の有用タンパク質を製造する例は数多く知られており、組み換えＤＮＡ技術を用いることで、天然に微量に存在する有用タンパク質を大量生産できる。組み込まれる遺伝子の一例としては、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ａｓｐＣ遺伝子）が挙げられる。遺伝子の由来はこれに限定されるものではなく、目的とする２Ｓ-モナティンを脱アミノ化するようなＬ−アミノトランスフェラーゼ活性を有するような酵素をコードする遺伝子であればよい。
【００９９】
組み換えＤＮＡ技術を用いてタンパク質を大量生産する場合、形質転換される宿主細胞としては、細菌細胞、放線菌細胞、酵母細胞、カビ細胞、植物細胞、動物細胞等を用いることができる。このうち、組換えＤＮＡ操作について知見のある微生物としてはBacillus、Pseudonomas、Brevibacterium、Corynebacterium、Streptomyces、及びEscherichia coli等が挙げられる。一般には、大腸菌を用いてタンパク質を大量生産する技術について数多くの知見があるため、大腸菌、好ましくはEscherichia coliが用いられる。
【０１００】
これら微生物へは、目的とするＬ−アミノトランスフェラーゼ遺伝子やＬ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子を塔載したプラスミド、ファージ等のベクターを用いて導入してもよいし、相同組換えによって該細胞の染色体上に目的遺伝子を組み込んでもよい。好ましくは、いわゆるマルチコピー型のプラスミドベクターが挙げられ、例えばEscherichia coliへのベクターとしてはＣｏｌ Ｅ１由来の複製開始点を有するプラスミド、例えばｐＵＣ系のプラスミドやｐＢＲ３２２系のプラスミド、或いはその誘導体が挙げられる。これらベクターには目的とするアミノ基転移酵素遺伝子を発現させるプロモーターとして、通常大腸菌においてタンパク質生産に用いられるプロモーターを使用することができ、例えば、Ｔ７プロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ＰＬプロモーター等の強力なプロモーターが挙げられる。また、生産量を増大させるためには、タンパク質遺伝子の下流に転写終結配列であるターミネーターを連結することが好ましい。このターミネーターとしては、Ｔ７ターミネーター、ｆｄファージターミネーター、Ｔ４ターミネーター、テトラサイクリン耐性遺伝子のターミネーター、大腸菌ｔｒｐＡ遺伝子のターミネーター等が挙げられる。また、形質転換体を選別するために、該ベクターはアンピシリン耐性遺伝子等のマーカーを有することが好ましく、このようなプラスミドとして、例えば、ｐＵＣ系（宝酒造（株）製）、ｐＰＲＯＫ系（クローンテック製）、ｐＫＫ２３３−２（クローンテック製）等のように強力なプロモーターを持つ発現ベクターが市販されている。
【０１０１】
次に、本発明における微生物の培養方法について説明する。本発明における微生物の培養方法としては、通常この分野において用いられる培地、即ち炭素源、窒素源、無機塩類、微量金属塩類、ビタミン類等を含む培地を用いて行うことができる。また、微生物の種類或いは培養条件によっては、培地中に０.１〜１.０ｇ／ｄｌ程度のアミノ酸等のアミノ化合物を添加することによって、アミノ基転移反応活性を促進することもできる。
【０１０２】
遺伝子組換え細胞を培養する場合は、ベクターの選択マーカーに対応してアンピシリン、カナマイシン、ネオマイシン、クロラムフェニコール等の薬剤を適宜添加することもできる。また、ベクターに塔載されているプロモーターに合わせて、誘導剤を適量添加することによって該組換え遺伝子の発現量を上げることもできる。一例を挙げると、ｌａｃプロモーターの下流に目的とする遺伝子を連結してベクターを構築した場合は、イソプロピル１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を終濃度０．１ｍＭ〜５ｍＭの範囲で適宜添加することも可能であり、また、この代りとしてガラクトースを終濃度０.１〜５ｇ／ｄｌ望ましくは０.５ｇ／ｄｌ〜２ｇ／ｄｌ適宜添加することもできる。
【０１０３】
モナティンの菌体内への透過性を高めるために、トライトン Ｘ（Triton X）やトゥイーン（Tween）等の界面活性剤やトルエン、キシレン等の有機溶媒を利用することもできる。また、反応促進物質として、ピリドキサール−５−リン酸等の補酵素類を上記培地に添加してもよい。上記培地成分として用いる具体的物質として、例えば、炭素源としては、利用する微生物が利用可能であれば制限は無く、例えばグルコース、シュークロース、フルクトース、グリセロール、酢酸等、又はこれらの混合物を使用することができる。窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、尿素、酵母エキス、肉エキス、コーンスティープリカー、カゼイン加水分解物等、或いはこれらの混合物を使用することができる。具体的な培地組成として、例えばフマル酸 ０.５ｇ／ｄｌ、酵母エキス １ｇ／ｄｌ、ペプトン １ｇ／ｄｌ、硫安 ０．３ｇ／ｄｌ、Ｋ2ＨＰＯ4 ０．３ｇ／ｄｌ、ＫＨ2ＰＯ4 ０．１ｇ／ｄｌ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １ｍｇ／ｄｌ、及びＭｎＳＯ4・４Ｈ2Ｏ １ｍｇ／ｄｌ（ｐＨ７．０）を含む培地等が挙げられる。
【０１０４】
培養温度は、通常、利用する微生物が生育する範囲内、即ち１０〜４５℃で行われるが、好ましくは２０℃〜４０℃、更に好ましくは２５〜３７℃の範囲である。また、培地のｐＨ値については、好ましくは２〜１２、より好ましくは３〜１０、更に好ましくは４〜８の範囲で調節される。通気条件については、利用する微生物の生育に適した条件に設定されるが、好気条件が好ましい。培養時間については、通常１２〜１２０時間、好ましくは２４〜９６時間程度である。
【０１０５】
反応温度については、通常、利用する酵素が活性を有する範囲内、即ち好ましくは１０〜５０℃で行われるが、より好ましくは２０〜４０℃、更に好ましくは２５〜３７℃の範囲で行われる。反応溶液のｐＨ値については、通常、２〜１２、好ましくは６〜１１、更に好ましくは７〜９の範囲で調節される。反応時間については、通常１〜１２０時間程度、好ましくは１〜７２時間程度、更に好ましくは１〜２４時間程度が選択される。
【０１０６】
菌体又は菌体処理物の使用量については、所与の反応の場合において目的とする効果を発揮する量（有効量）であればよく、この有効量については当業者であれば簡単な予備実験により容易に求められるが、例えば、洗浄湿潤菌体の場合、反応液１００ｍｌ当たり１〜４０ｇである。
【０１０７】
尚、培養液或いは反応液中のモナティンあるいはＩＨＯＧを定量する場合、周知の方法を用いて速やかに測定することができる。即ち、簡便にはMerck社製「Silica gel 60F254」等を利用した薄層クロマトグラフィーを利用することができ、より分析精度を高めるには、ジーエルサイエンス社製「Inertsil ODS-80A」やダイセル化学工業（株）製「CROWNPAK CR（＋）」等の光学分割カラムを利用した高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を用いればよい。
【０１０８】
このようにして、培養液或いは反応液中に蓄積されたＩＨＯＧおよび残存モナティンは、常法により培養液或いは反応液中より採取して用いることができる。培養液或いは反応液中からの採取は、このような場合に当該分野において通常使用されている周知の手段、例えば濾過、遠心分離、真空濃縮、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、結晶化等の操作が必要に応じて適宜組み合わせて用いられる。
【０１０９】
反応系に残存するモナティンを回収する方法に特に限定はなく、公知の手法を用いることができる。目的とする２Ｒ−モナティンは遊離体の形で取得することができるが、必要により塩の形態で取得することもできる。塩の形態としては、塩基との塩を挙げることができる。例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム等の無機塩基、アンモニア、各種アミン等の有機塩基を挙げることができる。
【０１１０】
〔IV〕具体例
まず、Escherichia coli由来Ｌ−アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼを用いて２Ｒ−モナティンを製造する方法について説明する。当該酵素は、２Ｓ体のうちＳＳ体にのみ作用するので、ＲＲ体、ＲＳ体、ＳＲ体、ＳＳ体の４種異性体混合物に作用させた場合、ＳＳ体が脱アミノ化されて４Ｓ−ＩＨＯＧとなり、ＲＲ体、ＲＳ体、ＳＲ体は未反応のまま残る。
【０１１１】
この際、アミノ基転移反応により副生するアミノ化合物（ここではＬ−Ｇｌｕ）を脱アミノ化するアミノ化合物除去用ＬＡＯ（L-Glu oxidase）を併用して、平衡状態を脱アミノ化反応側にシフトさせることが好ましい。アミノ基転移反応は平衡反応であるが、アミノ化合物除去用ＬＡＯを用いてアミノ化合物を脱アミノ化することにより、Ｌ−アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼによるアミノ基転移反応を１００％進行させることができる。
【０１１２】
【化８】
Ｌ−アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼを用いた場合、反応系から回収されたモナティンは、ＳＳ体が除去された分、単位重量当たりの甘味度が改善される。
【０１１４】
なお、当該酵素反応によってはＳＲ体は除去できないため、甘味度をより向上させるためには、酵素反応前に予めＳＲ体を除去しておくか、酵素反応後にＳＲ体を除去することが好ましい。
【０１１５】
酵素反応前にＳＲ体を除去する方法としては、例えば、下記▲１▼のように、晶析法によりＳＳ体とＲＲ体のラセミ混合物（ＳＳ＋ＲＲ）を調製し、当該ラセミ混合物にＡｓｐＡＴを作用させて、ＳＳ体を４Ｓ−ＩＨＯＧに変換して、ＲＲ体を製造する方法がある。また酵素反応後にＳＲ体を除去する方法としては、例えば、下記▲２▼のように、まず４種異性体混合物中のＳＳ体のみを４Ｓ−ＩＨＯＧに変換させた後、晶析によってＲＲ体のみ析出させることにより、ＲＲ体を製造できる。これらの方法によれば、最も甘味度の高いＲＲ体が得られるため、単位重量あたりの甘味度が高いモナティンが得ることができ好ましい。
【０１１６】
【化９】
次に、蛇毒由来Ｌ−アミノ酸オキシダーゼを用いて、２Ｒ−モナティンを製造する場合について説明する。当該酵素は、２Ｓ体のうち、ＳＲ体にのみ作用するので、ＲＲ体、ＲＳ体、ＳＲ体、ＳＳ体の４種異性体混合物に作用させた場合、ＲＲ体、ＲＳ体、ＳＳ体は未反応のまま残る。従って、反応系から回収されたモナティンは、ＳＲ体が除去された分、単位重量当たりの甘味度が改善される。
【０１１８】
蛇毒由来Ｌ−アミノ酸オキシダーゼを用いた場合、酵素反応によってＳＳ体を除去することができないため、甘味度をより向上させるためには、ＳＳ体を除去することが好ましい。
【０１１９】
例えば、下記のように、参考例２の方法を用いて、ＲＲ体とＳＲ体のモナティンの異性体混合物（ＲＲ＋ＳＲ）を合成し、当該異性体混合物に蛇毒由来ＬＡＯを作用させると、ＳＲ体を選択的に４Ｒ−ＩＨＯＧに変換して、ＲＲ体を製造することができる。
【０１２０】
蛇毒由来Ｌ−アミノ酸オキシダーゼを用いる場合、２Ｒ体の収率を上げるため、ＳＲ体から副生する４Ｒ−ＩＨＯＧをＤ−アミノトランスフェラーゼを用いてＲＲ体のモナティンとして再生させることが好ましい。Ｄ−アミノトランスフェラーゼによって４Ｒ−ＩＨＯＧをＲＲ体に変換する反応は、蛇毒由来Ｌ−アミノ酸オキシダーゼによる反応と同時に行っても良いし、蛇毒由来Ｌ−アミノ酸オキシダーゼによる反応と分割して行っても良いが、反応の簡略化の観点からは、前者が好ましい。
【０１２１】
【化１０】
また、ＳＳ体にのみ作用する酵素と、ＳＲ体にのみ作用する酵素を組み合わせて用いることにより、ＳＳ体とＳＲ体をＩＨＯＧに変換することも好ましい。このような酵素の組み合わせの一例としては、上記Escherichia coli由来ＬＡＯと蛇毒由来ＬＡＯとの組み合わせ酵素を組み合わせが挙げられる。
【０１２３】
この場合、最終生産物として得られる２Ｒ−モナティンは、ＲＳ体とＲＲ体の混合物となる。さらに甘味度を向上させたい場合は、晶析法等の手法を用いて、２Ｒ−モナティンからＲＲ体を単離してもよい。
【０１２４】
【化１１】
【実施例】
以下に実施例及び参考例を示し本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【０１２６】
尚、実施例１で用いたモナティンの(２Ｓ、４Ｓ)、(２Ｒ、４Ｒ)体は、後述の参考例１により調製したものであり、実施例２、３で用いたモナティンの(２Ｓ、４Ｒ)、(２Ｒ、４Ｒ)体は、後述の参考例２を用いて調整したものである。
【０１２７】
また、本実施例において、モナティンの定量は、ジーエルサイエンス社製「Inertsil ODS-80A 」(5μm, 6X150mm)を利用した高速液体クロマトグラフィーにより行った。分析条件は、以下に示す通りである。
【０１２８】
移動相：12％(v/v) アセトニトリル/0.05%(v/v) トリフルオロ酢酸水溶液；
流速：1.5ml/min；
カラム温度：30℃；及び
検出：UV210nm
【０１２９】
本分析条件により、モナティンの（２Ｓ、４Ｓ）体及び（２Ｒ、４Ｒ）体は１２．１分に、（２Ｓ、４Ｒ）体及び（２Ｒ、４Ｓ）体は９．７分にて分別定量ができる。
【０１３０】
また、必要に応じて、ダイセル化学工業製光学分割カラム「CROWNPAK CR(+)」(4.6X150mm)を利用した高速液体クロマトグラフィーによる分析も行った。分析条件は以下に示す通りである。
【０１３１】
移動相：過塩素酸水溶液（pH1.5）/10%(v/v)メタノール；
流速：0.5ml/min；
カラム温度：30℃；及び
検出：UV210nm。
【０１３２】
本条件によりモナティン光学異性体は（２Ｒ、４Ｓ）体、（２Ｒ、４Ｒ）体、（２Ｓ、４Ｒ）体、及び（２Ｓ、４Ｓ）体の順に４２分、５７分、６４分、及び１２５分のリテンションタイムにて分別定量ができる。
【０１３３】
実施例１ Ｌ−アミノトランスフェラーゼを用いたモナティンの(２Ｓ、４Ｓ)、(２Ｒ、４Ｒ)体混合物からの(２Ｓ、４Ｓ)体の選択的脱アミノ化
（１）aspartate aminotransferase (ａｓｐＣ)高発現Ｅ. ｃｏｌｉの作製
（１−１）ｔｒｐプロモーター及びｒｒｎＢターミネーター搭載プラスミドｐＴｒｐ４の構築
エシェリヒア コリ（Escherichia coli）Ｗ３１１０染色体ＤＮＡ上のｔｒｐオペロンのプロモーター領域を表に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲ（表２：▲１▼と▲２▼の組み合わせ）により目的遺伝子領域を増幅し、得られたＤＮＡ断片をｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙベクター（プロメガ製）にライゲーションした。このライゲーション溶液でＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン耐性株の中からｔｒｐプロモーターの方向がｌａｃプロモーターと反対向きに挿入された目的のプラスミドを有する株を選択した。次にこのプラスミドをＥｃｏＯ１０９Ｉ／ＥｃｏＲＩにて処理して得られるｔｒｐプロモーターを含むＤＮＡ断片と、ｐＵＣ１９（Ｔａｋａｒａ製）のＥｃｏＯ１０９Ｉ／ＥｃｏＲＩ処理物とライゲーションした。このライゲーション溶液でＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択し、プラスミドをｐＴｒｐ１と命名した。次にｐＫＫ２２３−３（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）をＨｉｎｄＩＩＩ／ＨｉｎｃＩＩにて処理し、得られたｒｒｎＢターミネーターを含むＤＮＡ断片とｐＴｒｐ１のＨｉｎｄＩＩＩ／ＰｖｕＩＩ処理物とライゲーションした。このライゲーション溶液でＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択し、プラスミドをｐＴｒｐ２と命名した。次にｐＴｒｐ２を鋳型として表に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲ（表２：▲１▼と▲３▼の組み合わせ）によりｔｒｐプロモーター領域を増幅した。このＤＮＡ断片をＥｃｏＯ１０９Ｉ／ＮｄｅＩにより処理し、ｐＴｒｐ２のＥｃｏＯ１０９Ｉ／ＮｄｅＩ処理物とライゲーションした。このライゲーション溶液でＥ．ｃｏｌｉＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択し、このプラスミドをｐＴｒｐ４と命名した。
【０１３４】
【表２】
（１−２）ａｓｐＣ遺伝子発現プラスミドｐｔｒｐＡｓｐＣの構築とＥ．ｃｏｌｉでの発現
プライマーａｓｐＣ-5'Nde (5'-CGC AGT CAT ATG TTT GAG AAC ATT ACC GCC GCT -3')およびａｓｐＣ-3'Eco(5'-CGC GAA TTC ATT GTT TTT AAT GCT TAC AGC A -3')を用いてエシェリヒア コリ（Esherichia coli）Ｗ３１１０染色体ＤＮＡより増幅した約１．２ｋｂｐの断片をＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩ消化し、ｐＴｒｐ４のＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩサイトに挿入したプラスミドｐｔｒｐＡｓｐＣを構築した。構築した発現プラスミドをＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９に導入し、形質転換体を５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ培地培地５０ｍｌに接種し、３７℃、１６時間振盪培養した。培養終了後、集菌し、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７．６)に懸濁して洗浄を行い、再度集菌して洗浄菌体を得た。
【０１３６】
（２）ＡｓｐＣ高発現Ｅ．ｃｏｌｉを用いたモナティンの(２Ｓ、４Ｓ)、 (２Ｒ、４Ｒ)体混合物からの(２Ｓ、４Ｓ)-モナティンの選択的脱アミノ化
１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ (２Ｓ、４Ｓ)体モナティン、５０ｍＭ (２Ｒ、４Ｒ)体モナティン、１ｍＭ ＰＬＰ、１％ (w/v)ＡｓｐＣ高発現Ｅ．ｃｏｌｉ洗浄菌体からなる反応液に、アミノ基受容体として２００ ｍＭ ２−ケトグルタル酸ないし２００ ｍＭ オキザロ酢酸をそれぞれ添加した反応区を設定した。反応液１ｍｌを試験管に入れ、３３℃で１６時間振とう反応させた。その結果、２−ケトグルタル酸区において３０ｍＭ相当の(２Ｓ、４Ｓ)体が、オキザロ酢酸区において２６ｍＭ相当の(２Ｓ、４Ｓ)体がそれぞれＩＨＯＧへと変換された。なお、いずれの実験区においても（２Ｒ、４Ｒ）体のモナティンはほぼ分解を受けずに反応系に残存した。
【０１３７】
（３）ＡｓｐＣ高発現Ｅ．ｃｏｌｉとＬ−グルタミン酸オキシダーゼの組み合わせによる(２Ｓ、４Ｓ)、(２Ｒ、４Ｒ)体混合物からの(２Ｓ、４Ｓ)体の選択的脱アミノ化
１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ (２Ｓ、４Ｓ)体モナティン、５０ｍＭ (２Ｒ、４Ｒ)体モナティン、２００ｍＭ ２−ケトグルタル酸、１ｍＭ ＰＬＰ、１％ (w/v) ＡｓｐＣ高発現Ｅ．ｃｏｌｉ洗浄菌体からなる反応液１ｍｌを試験管に入れた。２つの実験区を設定し、一方には反応開始１時間後に ２Ｕ／ｍｌのStreptomyces sp.由来Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ(Sigma社製)および２０００Ｕ／ｍｌ カタラーゼ(Sigma社製)を添加して反応を実施した。３０℃で１６時間振とう反応を実施した結果、Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ無添加区においては３０ｍＭ相当の(２Ｓ、４Ｓ)体モナティンがＩＨＯＧへと変換されたのに対して、Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ添加区においては(２Ｓ、４Ｓ)体モナティンの全量がＩＨＯＧへと変換された。なお、いずれの実験区においても（２Ｒ、４Ｒ）体はほぼ分解を受けずに反応系に残存した。この結果より、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼとＬ−グルタミン酸オキシダーゼをカップリングさせることにより(２Ｓ、４Ｓ)、(２Ｒ、４Ｒ)体混合物より(２Ｓ、４Ｓ)体を選択的に完全に脱アミノ化せしめ、（２Ｒ、４Ｒ）体のモナティンを採取せしめることができた。
【０１３８】
実施例２ Ｌ−アミノ酸オキシダーゼを用いたモナティンの(２Ｓ、４Ｒ)、(２Ｒ、４Ｒ)体混合物からの(２Ｓ、４Ｒ)体の選択的脱アミノ化
１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１Ｕ／ｍｌ 蛇毒由来L−アミノ酸オキシダーゼ（L-amino acid oxidase from Crotalus adamanteus）(Sigma社製)、３０００Ｕ／ml カタラーゼ(Sigma社製)、０．２６ ｇ／ｄｌ (２Ｓ、４Ｒ)体のモナティン、１．７４ ｇ／ｄｌ (２Ｒ、４Ｒ)体のモナティンからなる反応液１ｍｌを試験管に入れ、３０℃で１６時間振とうさせた。反応終了後のモナティン量をＨＰＬＣにて測定したところ、(２Ｓ、４Ｒ)体は完全に４Ｒ-ＩＨＯＧへと脱アミノ化されている一方で、(２Ｒ、４Ｒ) 体は分解を受けずに反応液中に残存し、(２Ｓ、４Ｒ)、(２Ｒ、４Ｒ)体混合物から (２Ｓ、４Ｒ)体を選択的に脱アミノ化し４Ｒ-ＩＨＯＧへと変換せしめた。
【０１３９】
実施例３ L−アミノ酸オキシダーゼを用いたモナティンの(２Ｓ、４Ｒ)、(２Ｒ、４Ｒ)体混合物からの(２Ｓ、４Ｒ)体の４Ｒ-ＩＨＯＧへの選択的脱アミノ化およびＤ−アミノトランスフェラーゼ発現Ｅ．ｃｏｌｉによる４Ｒ-ＩＨＯＧの（２Ｒ、４Ｒ）体モナティンへの変換
（１）Bacillus macerans ＡＪ１６１７株由来Ｄ−アミノトランスフェラーゼ遺伝子(bmdat)のクローニング
（１−１）染色体ＤＮＡの調製
Bacillus macerans ＡＪ１６１７株を５０ｍｌのブイヨン培地を用いて３０℃で一晩培養した（前培養）。この培養液５ｍｌを種菌として、５０ｍｌのブイヨン培地を用いて本培養を行った。対数増殖後期まで培養した後、培養液５０ｍｌを遠心分離操作（12000×ｇ、４℃、１５分間）に供し、集菌した。この菌体を用いて定法に従って染色体ＤＮＡを調製した。
【０１４０】
（１−２）遺伝子ライブラリからのbmdat遺伝子の単離
まず、Bacillus macerans ＡＪ１６１７株の染色体ＤＮＡ３０μｇに制限酵素ＥｃｏＲＩを１Ｕ添加し、３７℃にて３時間反応させて部分消化した。次にこのＤＮＡからアガロースゲル電気泳動にて３〜６ｋｂｐの断片を回収した。これをプラスミドｐＵＣ１１８のＥｃｏＲＩ切断物（ＢＡＰ処理済み・宝酒造製）１μｇとライゲーションさせ、Ｅ. ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換して遺伝子ライブラリを作製した。これをアンピシリンを含むＬＢ培地培地（トリプトン１％、酵母エキス０．５％、塩化ナトリウム１％、寒天２％、ｐＨ７．０）にプレーティングして、コロニーを形成させた。出現したコロニーをアンピシリンとイソブチル−１−チオ-β-Ｄ−アミノトランスフェラーゼ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を０．１ｍＭ含むＬＢ培地液体培地にて３７℃で一晩培養後、遠心・集菌して菌体を得た。得られた菌体を、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ (ｐＨ８．０)、５０ｍＭ ピルビン酸ナトリウム、１００ ｍＭ Ｄ−グルタミン酸、1 ｍＭ ピリドキサール−５´−リン酸、１％ （v/v）トルエンからなる反応液に接種し、３０℃で３０分間反応させた。反応終了後、反応液を遠心分離した上清５μlを２００μｌのピルビン酸定量反応液（１００ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ (ｐＨ ７．６)、１．５ ｍＭ ＮＡＤＨ、５ ｍＭ ＭｇＣｌ2、１６ Ｕ／ｍｌ Lactate dehydrogenase（オリエンタル酵母製））を含む９６ウェルプレートに加え、３０℃で１０分間反応させた後に３４０ｎｍの吸光度をプレートリーダー（SPECTRA MAX１９０、Molecular Device社製）を用いて測定した。同様の反応を終濃度０．２ｍＭ〜１ｍＭのピルビン酸ナトリウムを添加して実施し、これをスタンダードとしてピルビン酸の減少量を定量し、Ｄ−アミノトランスフェラーゼ活性を検出した。
【０１４１】
上記スクリーニングにより、Ｄ−アミノトランスフェラーゼ活性を示すクローンを採取した。これら形質転換体よりＤ−アミノトランスフェラーゼ遺伝子を含むプラスミドを調製し、ｐＵＣＢＭＤＡＴと命名した。プラスミドｐＵＣＢＭＤＡＴをＥｃｏＲＩ処理してアガロースゲル電気泳動に供したところ、挿入断片の長さは約３．３ｋｂｐと見積もられた。
【０１４２】
（１−３）挿入断片の塩基配列
プラスミドｐＵＣＢＭＤＡＴの挿入断片の塩基配列をジデオキシ法によって決定したところ、配列表配列番号６に示す配列のうち、６３０番から１４８１番に対応する約８５０ｂｐからなるＯＲＦを見出した。本ＯＲＦについて既知配列との相同性検索を行ったところ、Bacillus sphaericus ＡＴＣＣ１０２０８株由来のＤ−アミノトランスフェラーゼ遺伝子とアミノ酸配列において９１％の相同性を、Bacillus sp. ＹＭ−１株由来のＤ−アミノトランスフェラーゼ遺伝子とアミノ酸配列において６６％の相同性を、Bacillus licheniformis ＡＴＣＣ１０７１６株由来のＤ−アミノトランスフェラーゼ遺伝子とアミノ酸配列において４２％の相同性を示した。この結果より、本ＯＲＦはＤ−アミノトランスフェラーゼ伝子をコードしていることが明らかとなった。なお、ここでの相同性は、遺伝子解析ソフト「genetyx ver.6」（GENETYX社）を用い、各種パラメータは初期設定の通りとして算出した値である。
【０１４３】
（２）Ｌ−アミノ酸オキシダーゼを用いたモナティンの(２Ｓ、４Ｒ)、(２Ｒ、４Ｒ)体混合物からの(２Ｓ、４Ｒ)体の４Ｒ-ＩＨＯＧへの選択的脱アミノ化およびBacillus macerans由来Ｄ−アミノトランスフェラーゼ（ＢＭＤＡＴ）発現Ｅ．ｃｏｌｉを用いたＩＨＯＧからの２Ｒ体モナティンの生産の組み合わせ反応
（２−１）ＢＭＤＡＴ発現Ｅ．ｃｏｌｉの調製
ｐＵＣＢＭＤＡＴを持つＥ．ｃｏｌｉ 形質転換体０．１ｍｇ／ｍｌ アンピシリンを含むＬＢ培地培地（バクトトリプトン １ｇ／ｄｌ、酵母エキス ０．５ｇ／ｄｌ、及びＮａＣｌ １ｇ／ｄｌ）で３７℃、１６時間シード培養した。ＬＢ培地培地５０ｍｌを張り込んだ５００ｍｌ容坂口フラスコにこのシード培養液を１ｍｌ添加し、３７℃にて本培養を行った。培養開始２．５時間後に、終濃度１ｍＭとなるようにイソプロピル１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加し、更に４時間培養を行った。得られた培養液より集菌、洗浄し、ＢＭＤＡＴ発現Ｅ．ｃｏｌｉを調製した。
【０１４４】
（２−２）Ｌ−アミノ酸オキシダーゼおよびＤ−アミノトランスフェラーゼの組み合わせ反応
１００ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ ８．０）、１ Ｕ／蛇毒由来L−アミノ酸オキシダーゼ（L-amino acid oxidase from Crotalus adamanteus）（Sigma社製）、２０００ Ｕ／ｍｌ カタラーゼ (Sigma社製)、１３．４ ｍＭ (２Ｓ、４Ｒ)体モナティン、８１．４ ｍＭ (２Ｒ、４Ｒ)体モナティン、１ｍＭ ピリドキサール−５´−リン酸、１００ ｍＭ Ｄ−Ａｌａからなる反応液１ｍｌを試験管に入れた。２つの実験区を設定し、一方には上記で作製したＤ−アミノトランスフェラーゼ発現Ｅ．ｃｏｌｉの洗浄菌体を湿菌体重量で約１％(w/v)となるように添加した。これら反応液を、３０℃で１６時間振とうさせ反応を実施した。その結果、Ｄ−アミノトランスフェラーゼ無添加区においては(２Ｓ、 ４Ｒ)体のモナティンが完全に４Ｒ-ＩＨＯＧへと変換された。さらにＤ−アミノトランスフェラーゼ添加区においては（２Ｓ、４Ｒ）体のモナティンが完全に変換された上に、（２Ｒ、４Ｒ）体モナティン量が８１．４ｍＭ から８７．６ｍＭへと増加した。即ち、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼとＤ−アミノトランスフェラーゼを組み合わせることによりモナティンの(２Ｓ、４Ｒ)、(２Ｒ、４Ｒ)体混合物から (２Ｓ、４Ｒ)体を４Ｒ-ＩＨＯＧへと選択的に脱アミノ化し、さらに４Ｒ-ＩＨＯＧから(２Ｒ、４Ｒ)体のモナティンを生成せしめることができた。
【０１４５】
参考例１ モナティンの(２Ｓ、４Ｓ)、(２Ｒ、４Ｒ)体混合物の調製
（１）モナティンの４種立体異性体混合物の合成
（１−１）４−ヒドロキシ−４−（３−インドリルメチル）−２−ヒドロキシイミノグルタル酸の合成
水５０ｍｌに水酸化カリウム（純度８５％）１３．８ｇを溶解した後、インドール−３−ピルビン酸５．０ｇ（２４．６ｍｍｏｌ）及びオキサロ酢酸９．８ｇ（７３．８ｍｍｏｌ）を加えて室温にて７２時間反応を行った。反応液に対してヒドロキシルアミン塩酸塩６．８ｇ（９８．４ｍｍｏｌ）を加えた。その際、４規定水酸化ナトリウム水溶液にて反応液のｐＨ値を７．５に調節した。そのまま室温にて２４時間攪拌した後に、６規定塩酸にて反応液のｐＨ値を２．６に調節した。酢酸エチルを用いて抽出した後に、有機層を飽和食塩水にて洗浄、無水硫酸マグネシウムにて乾燥し、濃縮乾固した。得られた残渣を１４％アンモニア水１０ｍｌに溶解し、エタノール７０ｍｌを徐々に滴下して室温にて３時間攪拌した。得られたスラリーを濾過し、取得した結晶を乾燥することで、４−ヒドロキシ−４−（３−インドリルメチル）−２−ヒドロキシイミノグルタル酸２．７ｇ（７．９ｍｍｏｌ）をアンモニウム塩として得た。
【０１４６】
（ＮＭＲ測定）
1H NMR（DMSO-d6）δ：2.66（s, 2H）, 2.89（d, J= 14.4 Hz, 1H）, 3.04（d, J= 14.4 Hz, 1H）, 6.89−6.94（m, 1H）, 6.97−7.03（m, 1H）, 7.11（d, J= 2.8 Hz, 1H）, 7.27（d, J= 7.8 Hz, 1H）, 7.53（d, J= 7.8 Hz, 1H）, 10.71（br s, 1H）
【０１４７】
（分子量測定）
ESI-MS 計算値C14H14N2O6=306.28, 分析値305.17（MH-）
【０１４８】
（１−２）４−ヒドロキシ−４−（３−インドリルメチル）−２−アミノグルタル酸（モナティン）の合成
４−ヒドロキシ−４−（３−インドリルメチル）−２−ヒドロキシイミノグルタル酸アンモニウム塩０．１３ｇ（０．３８ｍｍｏｌ）を２８％アンモニア水５ｍｌに溶解し、５％ロジウム炭素０．０９ｇを加えて室温にて７．５気圧の水素圧にて反応させた。１４時間後に触媒を濾過し、反応液を濃縮乾固することで（２Ｓ、４Ｓ）/（２Ｒ、４Ｒ）−４−ヒドロキシ−４−（３−インドリルメチル）−２−アミノグルタル酸（モナティン）のアンモニウム塩０．０７５ｇ（０．２３ｍｍｏｌ）及び（２Ｓ、４Ｒ）/（２Ｒ、４Ｓ）−４−ヒドロキシ−４−（３−インドリルメチル）−２−アミノグルタル酸（モナティン）のアンモニウム塩０．０３６ｇ（０．１１ｍｍｏｌ）を混合物として得た。
【０１４９】
（ＮＭＲ測定）
1H NMR (D2O) δ：2.05（dd, J=12.2, 15.1Hz, 0.67H）, 2.21 (dd, J= 9.9, 15.6 Hz, 0.33H) , 2.48 (dd, J= 3.2, 15.6 Hz, 0.33H) , 2.68 (dd, J= 2.2, 15.1 Hz, 0.67H) , 3.08 (d, J= 14.4 Hz, 0.67H) , 3.17 − 3.25 (m, 0.66H) , 3.28 (d, J= 14.4 Hz, 0.67H) , 3.63 (dd, J= 2.2, 12.2 Hz, 0.67H) , 3.98 (dd, J=3.2, 9.9Hz, 0.33H) , 7.12 − 7.18 (m, 1H) , 7.19 − 7.26 (m, 2H)
, 7.45 − 7.51 (m, 1H) , 7.70 − 7.76 (m, 1H)。
【０１５０】
（分子量測定）
ESI-MS 計算値 C14H16N2O5 = 292.29, 分析値 291.28 (MH-)。
【０１５１】
（２）モナティン４種立体異性体混合物のアンモニウム塩の（２Ｓ、４Ｓ）体と（２Ｒ、４Ｒ）体とのラセミ体結晶及び（２Ｓ、４Ｒ）体と（２Ｒ、４Ｓ）体とのラセミ体結晶への分割
（１）に記載の方法を利用して別途合成したモナティンの光学異性体混合物（モナティン［（２Ｓ、４Ｓ）＋（２Ｒ、４Ｒ）］体：モナティン［（２Ｓ、４Ｒ）＋（２Ｒ、４Ｓ）］体＝６：４；1H NMR (D2O)での積分値での比により算出）のアンモニウム塩１０．００ｇ（３２．３３ｍｍｏｌ）を、２．５％アンモニア水１００ｍｌに溶解し、溶液を２０ｍｌになるまで濃縮した。新たに５％アンモニア水３ｍｌを加え均一にした後、室温にて３０分静置した。結晶析出後、５％アンモニア水／エタノール＝２５／７５の水溶液８０ｍｌを加えて均一にし、モナティン［（２Ｓ、４Ｓ）＋（２Ｒ、４Ｒ）］体アンモニウム塩の結晶を濾取した。得られた結晶を再び２．５％アンモニア水３０ｍｌに溶解し濃縮した後、５％アンモニア水０．５ｍｌとエタノール３０ｍｌにて再結晶し、モナティン［（２Ｓ、４Ｓ）＋（２Ｒ、４Ｒ）］体アンモニウム塩結晶 ４．８０ｇ（１５．５２ｍｍｏｌ、ＨＰＬＣ純度９８．０％）を得た。
【０１５２】
1Ｈ ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）δ：１．９５−２．０２（ｍ，１Ｈ），２．５８−２．６２（ｍ，１Ｈ），３．０１−３．０５（ｍ，１Ｈ），３．２１−３．２４（ｍ，１Ｈ），３．５５−３．５８（ｍ，１Ｈ），７．０７−７．１１（ｍ，１Ｈ），７．１４−７．１８（ｍ，２Ｈ），７．４２−７．４４（ｄ，１Ｈ），７．６６−７．６８（ｄ，１Ｈ）
【０１５３】
ＥＳＩ−ＭＳ ２９１．３９（Ｍ−Ｈ）-
【０１５４】
融点 １８２〜１８６℃
【０１５５】
前述の操作で得た濾液（モナティン［（２Ｓ、４Ｓ）＋（２Ｒ、４Ｒ）］体：モナティン［（２Ｓ、４Ｒ）＋（２Ｒ、４Ｓ）］体＝３：１０）を５ｍｌになるまで濃縮した。新たに５％アンモニア水３ｍｌを加えて均一にした後、室温にて１０分静置した。結晶析出後、エタノール８０ｍｌを加えて均一にし、モナティン［（２Ｓ、４Ｒ）＋（２Ｒ、４Ｓ）］アンモニウム塩の結晶を濾取した。得られた結晶を再び２．５％アンモニア水３０ｍｌに溶解し濃縮した後、５％アンモニア水０．５ｍｌとエタノール３０ｍｌによる再結晶を３回おこない、モナティン［（２Ｓ、４Ｒ）＋（２Ｒ、４Ｓ）］体アンモニウム塩結晶 ３．１０ｇ（１０．０２ｍｍｏｌ、ＨＰＬＣ純度９８．２％）を得た。総回収率は７９．０％であった。
【０１５６】
1Ｈ ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）δ：２．１１−２．１７（ｍ，１Ｈ），２．３８−２．４３（ｍ，１Ｈ），３．１６（ｓ，２Ｈ），３．９０−３．９３（ｍ，１Ｈ），７．０６−７．１０（ｍ，１Ｈ），７．１３−７．１７（ｍ，２Ｈ），７．４１−７．４３（ｄ，１Ｈ），７．６６−７．６８（ｄ，１Ｈ）
【０１５７】
ＥＳＩ−ＭＳ ２９１．１９（Ｍ−Ｈ）-
【０１５８】
融点 １６７．２〜１６８．４℃
【０１５９】
参考例２ モナティンの(２Ｓ、４Ｒ)、(２Ｒ、４Ｒ)体混合物の調製
参考例中、光学純度測定は下記条件でＨＰＬＣにて行った。
＜光学異性体分離用カラム＞ （株）住化分析センター製 SUMICHIRAL OA-7100＜溶離液＞ 20ｍM燐酸緩衝液(pH=2.8)：アセトニトリル＝7：3
＜カラム温度＞ 10℃
＜流速＞ 0.6ml/min
【０１６０】
（１）４−ヒドロキシ−４−（３−インドリルメチル）−２−ヒドロキシイミノグルタル酸の製造
１．６ｗｔ％水酸化ナトリウム水溶液９１７ｇに、インドール−３−ピルビン酸７３．８ｇ（３５２ｍｍｏｌ）を加えて溶解した。反応溶液を３５℃とし、３０％水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨ値を１１．１に保ちながら、５０％ピルビン酸水溶液３１０．２ｇ（１７６１ｍｍｏｌ）を２時間かけて滴下した。更に４．５時間反応させて、４−ヒドロキシ−４−（３−インドリルメチル）−２−ケトグルタル酸を含有する反応溶液を得た。これに、３０％水酸化ナトリウム水溶液にてｐＨ値を７に保ちながら、４０％ヒドロキシルアミン塩酸塩水溶液３６７．２ｇ（２１１４ｍｍｏｌ）を加え、５℃にて１７．５時間攪拌した。濃塩酸を用いて反応液のｐＨ値を２にし、有機物を酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、濃縮して残渣を得た。残渣に２８％アンモニア水６０ｍｌと２−プロパノール１３５０ｍｌから再結晶を行い、４−ヒドロキシ−４−（３−インドリルメチル）−２−ヒドロキシイミノグルタル酸の２アンモニウム塩４３．４ｇ（１４２ｍｍｏｌ：収率４０％ 対インドール−３−ピルビン酸）を結晶として得た。
【０１６１】
（２）（４Ｓ）−４−ヒドロキシ−４−（３−インドリルメチル）−２−ヒドロキシイミノグルタル酸の（R）−（＋）−１−フェニルエチルアミン塩の製造
４−ヒドロキシ−４−（３−インドリルメチル）−２−ヒドロキシイミノグルタル酸のアンモニウム塩４４．７ｇ（０.１３１モル）を２５℃で水５００ｍｌに溶解後、３６％塩酸２５．５ｇにてその水溶液のｐＨを２にした。酸性溶液を酢酸エチル１３００ｍｌで抽出し、その酢酸エチル溶液を飽和食塩水２００ｍｌで洗浄した。得られた酢酸エチル溶液に炭酸ナトリウム水溶液５００ｍｌ（炭酸ナトリウム １３.９ｇ ０.１３１モル）を加え攪拌し、アルカリ水溶液と酢酸エチルを分離した。得られたアルカリ水溶液に３６％塩酸２３．１ｇを添加し液のｐＨを２にした。この酸性水溶液に（R）−（＋）−１−フェニルエチルアミン６．９９ｇ（５７．６ｍｍｏｌ）を滴下し２５℃にて１時間攪拌する。得られた結晶をろ過し、減圧乾燥して（４Ｓ）−４−ヒドロキシ−４−（３−インドリルメチル）−２−ヒドロキシイミノグルタル酸の（R）−（＋）−１−フェニルエチルアミン塩２１．８ｇ（４７．８ｍｍｏｌ）を得た。（収率７２．７％ 光学純度８７．４％）
【０１６２】
1H-NMR(400MHz, DMSO-d6)σ：1.48 (d, 3H, J = 6.8 Hz), 2.63(d, 1H, J = 14.0 Hz), 2.70(d, 1H, J= 14.0 Hz), 2.90 (d, 1H, J = 14.1 Hz), 3.06 (d, 1H, J = 14.1 Hz), 4.40 (ｑ, 1H, J = 6.8 Hz), 6.91-7.54 (m, 10H).
【０１６３】
（３）（４Ｒ）−４−ヒドロキシ−４−（３−インドリルメチル）−２−ヒドロキシイミノグルタル酸の（Ｓ）−（−）−１−フェニルエチルアミン塩の製造
（１）で得られた結晶ろ過液に、更に（S）−（−）−１−フェニルエチルアミン７．１２ｇ（５８．７ｍｍｏｌ）を滴下し２５℃にて１時間攪拌した。得られた結晶をろ過し、減圧乾燥して（４Ｒ）−４−ヒドロキシ−４−（３−インドリルメチル）−２−ヒドロキシイミノグルタル酸の（S）−（−）−１−フェニルエチルアミン塩２３．８ｇ（５３．３ｍｏｌ）を得た。（収率８１．１％ 光学純度９２．１％）
【０１６４】
（４）（４Ｓ）−４−ヒドロキシ−４−（３−インドリルメチル）−２−ヒドロキシイミノグルタル酸のアンモニウム塩の製造
２５℃にて、（４Ｓ）−４−ヒドロキシ−４−（３−インドリルメチル）−２−ヒドロキシイミノグルタル酸の（R）−（＋）−１−フェニルエチルアミン塩２１．８ｇ（５１．０ｍｍｏｌ）に水２００ｍｌ及び２８％アンモニア水１８．５ｇを加えて溶解させた後、さらにトルエン２００ｍｌを加えて攪拌した。分層して得られた水層を６０℃に加温し、その水溶液に２−プロパノール９００ｍｌを２時間かけて滴下した。この２−プロパノール水溶液を１０℃まで５時間かけて冷却した後、１０℃で１０時間攪拌した。得られた結晶をろ過し、減圧乾燥して（４Ｓ）−４−ヒドロキシ−４−（３−インドリルメチル）−２−ヒドロキシイミノグルタル酸のアンモニウム塩１４．７５ｇを得た。（収率８５．１％ 光学純度９９．０％）
融点；２０５℃（分解）
比旋光度 [α]20 D +１３．４（ｃ＝1.00, Ｈ2Ｏ）
【０１６５】
（５）（４Ｒ）−４−ヒドロキシ−４−（３−インドリルメチル）−２−ヒドロキシイミノグルタル酸のアンモニウム塩の製造
上記実施例と同様に、（４Ｒ）−４−ヒドロキシ−４−（３−インドリルメチル）−２−ヒドロキシイミノグルタル酸の（R）−（＋）−１−フェニルエチルアミン塩２３．８ｇ（５３．３ｍｍｏｌ）から（４Ｒ）−４−ヒドロキシ−４−（３−インドリルメチル）−２−ヒドロキシイミノグルタル酸のアンモニウム塩１６．２ｇを得た。（収率８９．３％ 光学純度９９．９％）
比旋光度 [α]20 D -１３．６（ｃ＝1.00, Ｈ2Ｏ）
【０１６６】
（６）（２Ｒ、４Ｒ）及び（２Ｓ、４Ｒ）モナティンのアンモニウム塩の製造
（４Ｒ）−４−ヒドロキシ−４−（３−インドリルメチル）−２−ヒドロキシイミノグルタル酸のアミン塩１０．０ｇ（光学純度９４．４％、２２．４ｍｍｏｌ）を２８％アンモニア水１２０ｍｌに溶解し、５％ロジウム炭素（５０％含水品）７．４ｇを加えて室温にて１MPaの水素圧で反応を行った。２４時間後に触媒をろ過し、反応液にトルエン５０ｍｌを添加した。トルエン層と水層を分離し、得られた水層を濃縮した。濃縮物に９０％エタノール水５０ｍｌを加え２５℃で１０時間攪拌した。析出した粗結晶をろ過し、減圧乾燥することにより（２Ｒ、４Ｒ）及び（２Ｓ、４Ｒ）モナティンのアンモニウム塩２．８ｇを得た（収率４２％）
【０１６７】
（２Ｒ、４Ｒ）：（２Ｓ、４Ｒ）：（２Ｓ、４Ｓ）：（２Ｒ、４Ｓ）＝８２．４：１２．３：３：２．３（ＨＰＬＣエリア比）
【０１６８】
【発明の効果】
本発明の２Ｒ−モナティンの製造方法により、モナティン異性体混合物から甘味度の高い異性体である２Ｒ−モナティンを製造することができる。さらに晶析法等を組み合わせることにより最も甘味度の高い（２Ｒ、４Ｒ）−モナティンを製造することができるので、本発明は工業上、特に食品の分野において極めて有用である。
【０１６９】
【配列表】
Claims (13)
- ２Ｓ体および２Ｒ体の双方を含むモナティンの異性体混合物を、２Ｓ体のモナティンに選択的に作用して４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸を生成する反応を触媒する酵素を含有する反応系で反応させることにより、２Ｓ体を分解させる工程、および
前記反応系から残存するモナティンを回収して２Ｒ−モナティンを得る工程
を含み、
前記酵素が、エシェリヒア コリ（Escherichia coli）に由来するＬ-アミノトランスフェラーゼおよび／または蛇毒由来Ｌ−アミノ酸オキシダーゼであることを特徴とする、２Ｒ−モナティンの製造方法。 - 前記Ｌ-アミノトランスフェラーゼはＬ-アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼであることを特徴とする、請求項１記載の２Ｒ−モナティンの製造方法。
- 前記Ｌ-アミノトランスフェラーゼは、Ｌ-アミノトランスフェラーゼ遺伝子を導入したエシェリヒア コリ（Escherichia coli）の産生するＬ-アミノトランスフェラーゼであることを特徴とする、請求項１または２記載の２Ｒ−モナティンの製造方法。
- 前記Ｌ-アミノトランスフェラーゼ遺伝子は、エシェリヒア コリ（Escherichia coli）に由来するＬ-アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子であることを特徴とする、請求項３記載の２Ｒ−モナティンの製造方法。
- 前記反応系にアミノ基受容体として、α−ケト酸を含有することを特徴とする、請求項１から４のいずれか一つに記載の２Ｒ−モナティンの製造方法。
- 前記α−ケト酸は、α−ケトグルタル酸であり、さらに前記反応系に、前記α−ケトグルタル酸から副生するＬ−アミノ酸に対して作用するストレプトマイセス エスピー（Streptomyces sp.）由来のＬ−グルタミン酸オキシダーゼを含有することを特徴とする、請求項５記載の２Ｒ−モナティンの製造方法。
- 前記モナティンの異性体混合物は、（２Ｓ、４Ｓ）体および（２Ｒ、４Ｒ）体を含み、前記酵素は、エシェリヒア コリ（Escherichia coli）由来Ｌ-アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼであることを特徴とする、請求項１記載の２Ｒ−モナティンの製造方法。
- 前記モナティンの異性体混合物は、（２Ｓ、４Ｒ）体および（２Ｒ、４Ｒ）体を含み、前記酵素は、蛇毒由来Ｌ−アミノ酸オキシダーゼであることを特徴とする、請求項１記載の２Ｒ−モナティンの製造方法。
- さらに前記反応系に、バチルス マセランス（Bacillus macerans）に由来する酵素であって、４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸から２Ｒ体のモナティンを生成する反応を触媒するＤ−アミノトランスフェラーゼを含有することを特徴とする請求項１から８のいずれか一つに記載の２Ｒ−モナティンの製造方法。
- 前記Ｄ−アミノトランスフェラーゼは、Ｄ−アミノトランスフェラーゼ遺伝子を導入したエシェリヒア コリ（Escherichia coli）の産生する酵素であることを特徴とする、請求項９記載の２Ｒ−モナティンの製造方法。
- 前記Ｄ−アミノトランスフェラーゼ遺伝子は、バチルス マセランス（Bacillus macerans）に由来することを特徴とする、請求項１０記載の２Ｒ−モナティンの製造方法。
- （２Ｓ、４Ｒ）体および(２Ｒ、４Ｒ)体の双方を含むモナティンの異性体混合物を、（２Ｓ、４Ｒ）体のモナティンに選択的に作用して４Ｒ体の４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸を生成する反応を触媒する酵素、および、４Ｒ体の４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸から(２Ｒ、４Ｒ)体のモナティンを生成する反応を触媒するＤ−アミノトランスフェラーゼを含有する反応系で反応させることにより、（２Ｓ、４Ｒ）体を(２Ｒ、４Ｒ)体に変換する工程、
前記反応系からモナティンを回収して(２Ｒ、４Ｒ)−モナティンを得る工程
を含み、
前記４Ｒ体の４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸を生成する反応を触媒する酵素が蛇毒由来Ｌ−アミノ酸オキシダーゼであり、前記Ｄ−アミノトランスフェラーゼがバチルス マセランス（Bacillus macerans）に由来する酵素であることを特徴とする、(２Ｒ、４Ｒ)−モナティンの製造方法。 - ２Ｓ体および２Ｒ体の双方を含むモナティンの異性体混合物を、２Ｓ体のモナティンに選択的に作用して４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸を生成する反応を触媒する酵素を含有する反応系で反応させ、２Ｓ体のモナティンの少なくとも一部を分解させることにより、高甘味度異性体である２Ｒ体の含有率を向上させる工程を含み、
前記酵素が、エシェリヒア コリ（Escherichia coli）に由来するＬ-アミノトランスフェラーゼおよび／または蛇毒由来Ｌ−アミノ酸オキシダーゼであることを特徴とするモナティンの甘味度改善方法。
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