JP3698742B2 - 光学活性4−ヒドロキシ−2−ケトグルタル酸の製造法 - Google Patents
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Description
【産業上の利用分野】
本発明は、ピルビン酸とグリオキシル酸から光学活性4−ヒドロキシ−2−ケトグルタル酸を生成する活性を有する生体触媒を用い、ピルビン酸または該生体触媒によってピルビン酸に転換され得る化合物とグリオキシル酸から光学活性4−ヒドロキシ−2−ケトグルタル酸を製造する方法に関する。光学活性4−ヒドロキシ−2−ケトグルタル酸は医薬品の合成原料として有用な化合物である。
【0002】
【従来の技術】
従来の光学活性4−ヒドロキシ−2−ケトグルタル酸の製造法としては、スレオまたはエリスロ−4−ヒドロキシ−L−グルタミン酸を化学的に脱アミノし、L−またはD−ヒドロキシ−2−ケトグルタル酸を各々得る方法〔ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(J.B.C.), 238 ,3660(1963) 〕やオキザロ酢酸とグリオキシル酸から合成したDL−4−ヒドロキシ−2−ケトグルタル酸からDおよびL体を分離する方法〔メソッズ・イン・エンザイモロジー(Methods in Enzymology), 17 partB, 253 〕が知られている。また動物や大腸菌に存在するケトヒドロキシグルタル酸アルドラーゼによって、ピルビン酸とグリオキシル酸から酵素的に4−ヒドロキシ−2−ケトグルタル酸を合成することができるが、いずれの場合も得られる4−ヒドロキシ−2−ケトグルタル酸はD体とL体の混合物であることが知られている〔メソッズ・イン・エンザイモロジー(Methods in Enzymology),41 partB ,115〕。
【0003】
【発明が解決しようとする課題】
従来の製造法は、(1) 原料が高価である、(2) DL体の分離工程を要する、(3) 収率が低い、などの点で、工業的な製法として必ずしも満足できる方法ではなく、工業的に有利に光学活性4−ヒドロキシ−2−ケトグルタル酸を製造する方法の開発が求められている。本発明の目的は工業的に有利に光学活性4−ヒドロキシ−2−ケトグルタル酸を製造する方法を提供することにある。
【0004】
【課題を解決するための手段】
本発明によれば、ピルビン酸とグリオキシル酸から光学活性4−ヒドロキシ−2−ケトグルタル酸を生成する能力を有する生体触媒を、水性媒体中でピルビン酸または該生体触媒によってピルビン酸に転換され得る化合物とグリオキシル酸に作用させ、水性媒体中に生成した光学活性4−ヒドロキシ−2−ケトグルタル酸を採取することを特徴とする光学活性4−ヒドロキシ−2−ケトグルタル酸の製造法を提供することができる。
【0005】
なお、光学活性4−ヒドロキシ−2−ケトグルタル酸とはD−4−ヒドロキシ−2−ケトグルタル酸〔(R)-4-hydroxy-2-ketoglutaric acid 〕またはL−4−ヒドロキシ−2−ケトグルタル酸〔(S)-4-hydroxy-2-ketoglutaric acid 〕のことをいう。
さらに詳しくは、ピルビン酸とグリオキシル酸からD−またはL−4−ヒドロキシ−2−ケトグルタル酸を生成する能力を有する生体触媒を、水性媒体中でピルビン酸または該生体触媒によってピルビン酸に転換され得る化合物とグリオキシル酸に作用させ、水性媒体中に生成したD−またはL−4−ヒドロキシ−2−ケトグルタル酸を採取することを特徴とするD−またはL−4−ヒドロキシ−2−ケトグルタル酸の製造法を提供することができる。
【0006】
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明で用いられる生体触媒としては、微生物、該微生物の培養物、菌体またはそれらの処理物があげられる。
微生物としては、ピルビン酸または該微生物によってピルビン酸に転換され得る化合物とグリオキシル酸から光学活性4−ヒドロキシ−2−ケトグルタル酸を生成する能力を有する微生物であればいずれの微生物でも用いることができる。具体的にはセルビブリオ属、バチルス属、シュウドモナス属、パラコッカス属、プロビデンシア属、リゾビウム属またはモルガネラ属に属する微生物があげられる。
【0007】
D−4−ヒドロキシ−2−ケトグルタル酸を製造する場合にはとくにセルビブリオ属またはバチルス属に属する微生物が好ましい。さらに詳しくはセルビブリオ属またはバチルス属に属し、かつピルビン酸または該微生物によってピルビン酸に転換され得る化合物とグリオキシル酸からD−4−ヒドロキシ−2−ケトグルタル酸を生成する能力を有する微生物が好ましい。
【0008】
具体的にはセルビブリオ ギルバス(Cellvibrio gilvus)ATCC13127 株、バチルス エスピー(Bacillus sp.)OC187 株、バチルス エスピー(Bacillus sp.)S16 株などがあげられる。ATCC13127 株およびOC187 株は60〜90℃、15分〜2時間の熱処理を施すことにより、L−4−ヒドロキシ−2−ケトグルタル酸の生成能を失活させることができる。また、L−4−ヒドロキシ−2−ケトグルタル酸の生成能を失活した株は、セルビブリオ属またはバチルス属に属し、かつピルビン酸または該微生物によってピルビン酸に転換され得る化合物とグリオキシル酸からD−4−ヒドロキシ−2−ケトグルタル酸を生成する能力を有する微生物を通常の変異処理手段、たとえば、N−メチル−N’−ニトロ−N−ニトロソグアニジン(NTG)による通常の変異処理により変異させ、L−4−ヒドロキシ−2−ケトグルタル酸の生成能が失活した変異株を選択することによっても得ることができる。S16 株はOC187 株より変異誘導され、L−4−ヒドロキシ−2−ケトグルタル酸の生成能を失活した変異株である。
【0009】
バチルス エスピー(Bacillus sp.)OC187 株は、本発明者らによって町田市の土壌より新たに分離された菌株であって、その菌学的性質を第1−1表〜第1−6表に詳述する。
(A) 形態
【0010】
【表1】
【0011】
(B) 培養学的性質
【0012】
【表2】
【0013】
(C) 生理学的性質
【0014】
【表3】
【0015】
【表4】
【0016】
(D) その他の諸性質
【0017】
【表5】
【0018】
(E) 化学分類学的性質
【0019】
【表6】
【0020】
OC187 株は、陰性あるいは陽性のグラム染色性を示す桿菌で、周毛による運動性を示し、楕円状の内性胞子を有する通性嫌気性菌であった。O-F テストでは発酵的に糖を分解して酸を生成し、カタラーゼ活性は陽性を、オキシダーゼ活性は陰性を示し、硝酸塩を還元しなかった。また、10%の塩化ナトリウム耐性で、55℃で生育したが10℃および65℃では生育しなかった。
【0021】
また、主要キノン型はMK-7で、細胞壁ペプチドグリカンジアミノ酸組成は、meso-A2pm を示し、DNA のGC含量は45.9 mol% であった。
以上の菌学的性質を有する菌について、バージェイのマニュアル(Bergey's Manual of Systematic Bacteriology) Vol.2(1986年)の記載と照合した結果、該菌株をバチルス属に属する細菌と同定し、OC187 株をバチルス エスピー(Bacillus sp.)OC187 と命名した。
【0022】
バチルス エスピー OC187株および S16株は、ブダペスト条約に基づいて平成6年4月19日付で工業技術院生命工学工業技術研究所に各々FERM BP-4646、FERM BP-4647として寄託されている。
L−4−ヒドロキシ−2−ケトグルタル酸を製造する場合にはとくにシュウドモナス属、パラコッカス属、プロビデンシア属、リゾビウム属またはモルガネラ属に属する微生物が好ましい。さらに詳しくはシュウドモナス属、パラコッカス属、プロビデンシア属、リゾビウム属またはモルガネラ属に属し、ピルビン酸または該微生物によってピルビン酸に転換され得る化合物とグリオキシル酸からL−4−ヒドロキシ−2−ケトグルタル酸を生成する能力を有する微生物であればよい。D−4−ヒドロキシ−2−ケトグルタル酸を実質的に生成しない微生物であればより好ましい。
【0023】
具体的にはシュウドモナス プチダ(Pseudomonas putida)ATCC 795株、シュウドモナス プチダ(Pseudomonas putida)ATCC 4359 株、シュウドモナス サッカロフィラ(Pseudomonas saccharophila)ATCC 9114 株〔=ATCC 15946株;IAM Catalogue of Strains (1993) 〕、シュウドモナス ボレオポリス(Pseudomonas boreopolis)ATCC 15452株、シュウドモナス タエトロレンス(Pseudomonas taetrolens)ATCC 17466株、シュウドモナス オレオボランス(Pseudomonas oleovorans)ATCC 8062 株、パラコッカス デニトリフィカンス(Paracoccus denitrificans)ATCC 19367株、プロビデンシア ルスチギアニ(Providencia r ustigianii)ATCC 13159株、リゾビウム メリロッティ(Rhizobium meliloti)RCR 2001株(FERM BP-4582)、モルガネラ モルガニ(Morganella morganii)ATCC 25830株などがあげられる。
【0024】
リゾビウム メリロッティ(Rhizobium meliloti)RCR 2001株は、ブダペスト条約に基づいて平成6年2月24日付で工業技術院生命工学工業技術研究所にFERM BP-4582として寄託されている。
本発明に用いられる微生物の培養は、通常用いられる合成ないし天然培地を用いて行うことができる。培地中の炭素源としては、セルビブリオ属またはビブリオ属細菌を用いてD−4−ヒドロキシ−2−ケトグルタル酸を合成する場合にはD−ガラクトン酸が使用可能である。その他の微生物を用いてL−4−ヒドロキシ−2−ケトグルタル酸を合成する場合には、用いる微生物が資化しうるかぎり、グルコース、フラクトース、シュークロース、マルトース、澱粉、澱粉加水分解物、糖蜜などの糖類や、酢酸、乳酸、グルコン酸などの有機酸、あるいはエタノールなどのアルコールなどが使用可能である。
【0025】
窒素源としては、用いる微生物が資化しうるかぎり、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウムなどのアンモニウム塩や尿素、硝酸塩ならびにペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーン・スチープリカーなどの各種の窒素含有有機物が使用可能である。
無機塩としては、用いる微生物が利用しうるかぎり、リン酸カリウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガンなどが使用できる。他に微量元素としてカルシウム、亜鉛、ほう素、銅、コバルト、モリブデンなどの塩類を加えてもよい。
【0026】
また必要に応じてチアミン、ビオチンのようなビタミン、グルタミン酸、アスパラギン酸のようなアミノ酸、アデニン、グアニンのような核酸関連物質などを添加してもよい。
ピルビン酸またはピルビン酸に転換され得る化合物とグリオキシル酸から光学活性4−ヒドロキシ−2−ケトグルタル酸を合成する方法は、微生物の培養中に基質を添加する方法を用いてもよいし、培養して得られた微生物の培養物、菌体もしくはそれらの処理物を、基質に作用させて光学活性4−ヒドロキシ−2−ケトグルタル酸を生成させる方法を用いてもよい。
【0027】
処理物としては菌体の乾燥物、凍結乾燥物、界面活性剤処理物、酵素処理物、超音波処理物、機械的磨砕処理物、溶媒処理物などの菌体処理物、菌体の蛋白分画物、菌体および菌体処理物の固定化物などがあげられる。
前者の方法を用いる場合には、ピルビン酸またはピルビン酸に転換され得る化合物およびグリオキシル酸は各々1〜200g/l 、好ましくは20〜200g/l の濃度範囲で培養の初発もしくは途中に添加する。培養時間は用いる微生物によって異なり、10〜100時間程度である。
【0028】
後者の方法を用いる場合には、ピルビン酸またはピルビン酸に転換され得る化合物1〜200g/l 、好ましくは20〜200g/l 、グリオキシル酸1〜200g/l 、好ましくは20〜200g/l 、微生物の菌体またはその処理物0. 1〜200g/l 、好ましくは5〜100g/l (微生物菌体換算)を含む水性媒体中、温度15〜60℃、好ましくは25〜45℃、pH3〜11、好ましくは5〜9の条件で行う。反応時間は30分〜80時間程度である。
【0029】
水性媒体としては、例えばリン酸緩衝液や生理食塩水などが使用できる。また必要に応じてトリトンX−100(ナカライテスク社製)やナイミーン(日本油脂社製)などの界面活性剤や少量のトルエンやキシレンなどの有機溶媒を0.1 〜20g/l 添加してもよい。
ピルビン酸に転換され得る化合物としては、菌体あるいはその処理物によってピルビン酸に変換され得る化合物であれば如何なる物でも使用できるが、通常グルコース、フラクトース、マルトース等の糖類あるいはグリセロール、乳酸などを使用する。
【0030】
水性媒体からの光学活性4−ヒドロキシ−2−ケトグルタル酸の採取は、通常水性媒体から有機酸採取に用いられる方法に従って実施することができる。例えば、遠心分離により菌体もしくはそれらの処理物を除いた反応上清から、イオン交換樹脂あるいは膜処理法などの操作を組み合わせて、光学活性4−ヒドロキシ−2−ケトグルタル酸を単離することができる。
【0031】
本発明で得られる光学活性4−ヒドロキシ−2−ケトグルタル酸は医薬品合成原料として有用であり、たとえば4−ヒドロキシ−2−ケトグルタル酸から4−ヒドロキシプロリンを経て、カルバペネム系抗生物質を合成することができる。4−ヒドロキシ−2−ケトグルタル酸から4−ヒドロキシプロリンへの変換は、特開平3−266995に記載の方法に準じておこなうことができる。カルバペネム系抗生物質は4−ヒドロキシプロリンからヘテロサイクルズ(Heterocycles), 24, p1331 (1986)に記載の方法に準じてN−p−ニトロベンジルオキシカルボニル−3−メルカプトピロリジンを合成し、さらに特開昭58−32879に記載の方法に準じて得ることができる。
【0032】
以下に本発明の実施例を示す。
【0033】
【実施例】
【0034】
実施例1
セルビブリオ ギルバスATCC13127 株を3ml のL培地(バクトペプトン10g 、酵母エキス5gおよびNaCl 10gを水1リットルに含みpH7.0 に調整した培地)に接種し、30℃で16時間振とう培養した。この培養液2mlを下記第2表の組成からなるGNMS培地20mlに接種した。
【0035】
【表7】
【0036】
これを10mlづつ2本の試験管に分注し20時間培養した。培養終了後、1本の試験管には80℃で1時間加温する熱処理を施し、もう一本は30℃に保った。ついで遠心分離操作で各々菌体を集め、滅菌した1mlの反応液(a) 〔KH2PO4 3g 、NaH2PO4 6g、NH4Cl 1g、MgSO4・7H2O 0.16g、NaCl 5g 、CaCl2 11mg、ピルビン酸ナトリウム100mmol およびグリオキシル酸100mmol を純水1リットルに含みNaOHでpH7. 0に調整した反応液〕に懸濁し、ファルコン社製2059チューブ中で37℃で振とうし5時間反応させた。反応終了後、遠心分離操作によって菌体を除き、上清中に生成した4−ヒドロキシ−2−ケトグルタル酸をSUMICHIRAL OA-5000カラム(住友化学社製)を用いたHPLCで定量した。測定結果を第3表に示す。なお、DおよびL−4−ヒドロキシ−2−ケトグルタル酸の標準化合物は各々、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(J.B.C.), 237,476(1962) および同, 238, 3660(1963) に記載の方法によって調製した。
【0037】
【表8】
【0038】
実施例2
L培地3mlを試験管に分注し、滅菌後、第5表に示した微生物を各々接種し、30℃で16時間振とう培養した。この培養液1mlを下記第4表の組成からなるGMS培地10mlに接種し試験管で20時間培養した。
【0039】
【表9】
【0040】
培養終了後、遠心分離操作で各々菌体を集め、滅菌した1mlの反応液(b) 〔KH2PO4 3g 、NaH2PO4 6g、NH4Cl 1g、MgSO4・7H2O 0.16g、NaCl 5g 、CaCl2 11mg、ピルビン酸ナトリウム100mmol 、グリオキシル酸100mmol および亜ひ酸10mmolを純水1リットルに含みNaOHでpH7. 0に調整した反応液〕に懸濁し、ファルコン社製2059チューブ中で30℃で振とうし5時間反応させた。反応終了後、遠心分離操作によって菌体を除き、上清中に生成した4−ヒドロキシ−2−ケトグルタル酸をSUMICHIRAL OA-5000カラム(住友化学社製)を用いたHPLCで定量した。結果を第5表に示す。
【0041】
【表10】
【0042】
実施例3
実施例1で用いた反応液(a) 中のピルビン酸ナトリウム100mmol の代わりにグルコース20g 、グリセロール20g または乳酸アンモニウム20g を含む反応液を各々調製した。この反応液にシュウドモナス プチダ ATCC795株を実施例2と同様に培養して得た菌体を懸濁し、実施例2と同様に30℃で振とうし5時間反応させた。反応終了後、遠心分離操作によって菌体を除き、上清中に生成した4−ヒドロキシ−2−ケトグルタル酸をSUMICHIRAL OA-5000カラム(住友化学社製)を用いたHPLCで定量した。結果を第6表に示す。
【0043】
【表11】
【0044】
実施例4
セルビブリオ ギルバスATCC13127 株をL培地9mlに接種し30℃で16時間振とう培養した。この培養液全量を300ml のGNMS培地に接種し2リットル容の三角フラスコで30℃で20時間振とう培養した。この培養液を80℃で1時間加熱処理した後、遠心分離によって菌体を分離し、反応液(a) 60mlに懸濁し、300ml 容ビーカー中で撹拌しつつ1規定硫酸でpHを6.5 に保って反応を行った。反応開始6時間後にピルビン酸ナトリウム2M溶液3ml とグリオキシル酸ナトリウム2M溶液3ml を添加した。反応開始後24時間目で遠心分離によって反応液から菌体を除き、遠心上清中の4−ヒドロキシ−2−ケトグルタル酸をHPLCによって定量した。L−体は検出されず、125mM のD−4−ヒドロキシ−2−ケトグルタル酸が検出された。
【0045】
ダイヤイオンPA416 (三菱化成社製)を充填したカラムに上記上清のうち50mlを通塔し、0〜6M蟻酸の指数的グラジエントによって溶出した。6〜8カラム容量に溶出される4−ヒドロキシ−2−ケトグルタル酸の溶出画分を減圧濃縮した後、0.01M のCa(OH)2 溶液を加えpH7.5 に調整した。この溶液にアセトンを添加し、D−4−ヒドロキシ−2−ケトグルタル酸のカルシウム塩を晶出させた。このようにしてD−4−ヒドロキシ−2−ケトグルタル酸のカルシウム塩0.5gを得た。
【0046】
実施例5
シュウドモナス プチダATCC795 株をL培地9mlに接種し30℃で16時間振とう培養した。この培養液全量を300ml のGMS培地に接種し2リットル容の三角フラスコで30℃で20時間振とう培養した。得られた培養液から菌体を遠心分離し、反応液(b)60ml に懸濁し、300ml 容ビーカー中で撹拌しつつ1規定硫酸でpHを6.5 に保って反応を行った。反応開始6時間後にピルビン酸ナトリウム2M溶液3ml とグリオキシル酸ナトリウム2M溶液3ml を添加した。反応開始後24時間目で遠心分離によって反応液から菌体を除き、遠心上清中の4−ヒドロキシ−2−ケトグルタル酸をHPLCによって定量した。D−体は検出されず、150mM のL−4−ヒドロキシ−2−ケトグルタル酸が検出された。
【0047】
ダイヤイオンPA416 (三菱化成社製)充填したカラムに上記上清のうち50mlを通塔し、0〜6M蟻酸の指数的グラジエントによって溶出した。6〜8カラム容量に溶出される4−ヒドロキシ−2−ケトグルタル酸の溶出画分を減圧濃縮した後、0.01M のCa(OH)2 溶液を加えpH7.5 に調整した。この溶液にアセトンを添加し、L−4−ヒドロキシ−2−ケトグルタル酸のカルシウム塩を晶出させた。このようにしてL−4−ヒドロキシ−2−ケトグルタル酸のカルシウム塩0.7gを得た。
【0048】
実施例6
セルビブリオ ギルバス ATCC13127株のかわりにバチルス エスピー OC187株を用い、実施例1と同様に培養し、同様に反応を行った。結果を第8表(実施例7参照)に示す。
【0049】
実施例7
バチルス エスピー OC187株をL培地で30℃、6 時間培養した菌体を集め、0.05M トリス−マレイン酸緩衝液(pH6.0 )で洗浄後、菌体濃度が約109 細胞/ml になるように同緩衝液に懸濁し、これにNTG を終濃度が600mg/l になるように加え、30℃、20分間保持して変異処理を行った。この変異処理菌体を第7表の組成からなるMG寒天培地に塗布した。
【0050】
【表12】
【0051】
生じたコロニーをL寒天培地(L培地に寒天2%を加えたもの)に拾い、D−4−ヒドロキシ−2−ケトグルタル酸の生産性を調べた。即ち、各株を実施例1と同様に培養し、同様に反応を行った。ただしいずれの株に対しても熱処理は行わなかった。反応終了後の遠心上清中の4−ヒドロキシ−2−ケトグルタル酸を実施例1と同様に分析した結果、L−4−ヒドロキシ−2−ケトグルタル酸を生成せず、D−4−ヒドロキシ−2−ケトグルタル酸のみを生成する変異株S16 株を得た。S16 株の反応上清の分析結果を第8表に示す。
【0052】
【表13】
【0053】
【発明の効果】
医薬品の合成原料として有用な光学活性4−ヒドロキシ−2−ケトグルタル酸を工業的に有利に得ることができる。
Claims (5)
- セルビブリオ属またはバチルス属に属し、かつピルビン酸または該微生物によってピルビン酸に転換され得る化合物とグリオキシル酸からD−4−ヒドロキシ−2−ケトグルタル酸を生成する能力を有する微生物、該微生物の培養物、菌体またはそれらの処理物から選ばれる生体触媒を、水性媒体中でピルビン酸または該生体触媒によってピルビン酸に転換され得る化合物とグリオキシル酸に作用させ、水性媒体中に生成したD−4−ヒドロキシ−2−ケトグルタル酸を採取することを特徴とするD−4−ヒドロキシ−2−ケトグルタル酸の製造法。
- 該生体触媒によってピルビン酸に転換され得る化合物が、グルコース、フラクトース、マルトース、グリセロールおよび乳酸からなる群より選ばれる化合物である請求項1記載の製造法。
- セルビブリオ属またはバチルス属に属し、かつピルビン酸または該微生物によってピルビン酸に転換され得る化合物とグリオキシル酸からD−4−ヒドロキシ−2−ケトグルタル酸を生成する能力を有する微生物。
- バチルス属に属する微生物が、バチルス エスピー(Bacillus sp.)OC187株(FERM BP-4646)である請求3記載の微生物。
- バチルス属に属する微生物が、バチルス エスピー(Bacillus sp.)S16株(FERM BP-4647)である請求項3記載の微生物。
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