EA009284B1

EA009284B1 - Полипептиды и пути биосинтеза

Info

Publication number: EA009284B1
Application number: EA200401228A
Authority: EA
Inventors: Тимоти В. Абрахам; Дуглас С. Камерон; Джозеф Даллуге; Паула М. Хикс; Рассел Дж. Ховсон; Сара С. Макфарлан; Джим Миллис; Джон Розацца; Лишэн Жао; Давид П. Вейнер
Original assignee: Каргилл, Инкорпорейтед
Priority date: 2002-04-23
Filing date: 2003-04-23
Publication date: 2007-12-28
Also published as: IL164548A0; ES2356132T3; BRPI0309527B1; CN100516043C; GEP20084387B; RS92604A; WO2003091396A3; ECSP045381A; JP2010004896A; NO20045029L; JP5351230B2; EP1503985A2; SG146453A1; NZ535297A; JP2011250806A; DE60335361D1; AU2010201699A1; PL373423A1; PL208998B1; EP2354240A1

Abstract

Содержанием данного изобретения являются полипептиды, а также пути биосинтеза, которые могут найти применение при производстве индол-3-пирувата, 2-гидрокси 2-(индол-3илметил)-4-кетоглутаровой кислоты (ПМ) и/или монатина. Приведены способы и соединения, которые могут быть использованы для получения монатина из глюкозы, триптофана, индол-3-лактата, индол-3-пирувата и 2-гидрокси 2-(иридол-3-илметил)-4-кетоглутаровой кислоты. Представлены также способы получения промежуточных продуктов индол-3-пирувата, 2-гидрокси 2-(индол-3-илметил)-4-кетоглутаровой кислоты. Представленные соединения содержат молекулы нуклеиновой кислоты, полипептиды, химические структуры и клетки. Способы включают процессы in vitro и in vivo, и способы in vitro включают химические реакции. Настоящее изобретение предназначено для использования в растениеводстве, а также в фармацевтике и медицине.

Description

Содержанием данного изобретения являются полипептиды, а также пути биосинтеза, которые могут найти применение при производстве индол-3-пирувата, 2-гидрокси 2-(индол-3илметил)-4кетоглутаровой кислоты (ПМ) и/или монатина.

Предпосылки

Индол-пируват.

Индол-3-пируват является сильным антиоксидантом, который считается хорошей защитой от окислительного стресса в тканях с высокими концентрациями кислорода (Ροϊίΐί с соавт. ЯсесШ абуапсек ίη ТгурЮрйап Векеагсй, под ред. С. Α. Είϊίρρίηί и др., Р1епит Ргекк, Нью-Йорк, 1996, стр. 291-298). Кроме того, индолпируват является промежуточным продуктом при получении индол-уксусной кислоты (ИУК), первичного гормона роста растений ауксина (фактор диффузного роста). ИУК проявляет активность в микрограммовых количествах в широком диапазоне физиологических процессов, таких как верхушечное доминирование, тропизм, удлинение боковых ветвей, индукция деления клеток камбия и инициация укоренения. Синтетические ауксины используются в садоводстве для индукции укоренения, стимулирования посадочного материала и формирования плодов. В высоких концентрациях синтетические ауксины являются эффективными гербицидами в отношении широколиственных растений. Натуральные ауксины, полученные путем ферментации, можно считать с экологической точки зрения более безопасными по сравнению с гербицидами, полученными в результате химического синтеза. Мировой объем продаж регуляторов роста составил в 1999 году 0,4 миллиарда фунтов (1,4 миллиарда долларов США).

Среди примеров патентов на индол-уксусную кислоту и ее производные можно назвать следующие: патент США Νο. 5843782 «Микрометод размножения розовых кустов с использованием ауксина в культуральных средах» и патент США Νο. 5952231 «Микрометод размножения розовых кустов».

Помимо использования в растениеводстве производные индол уксусной кислоты находят применение и в фармацевтике. Например, патент США Νο. 5173497 Метод получения альфа-оксопирроло-[2,3В]-индол-уксусных кислот и их производных предлагает применять эти соединения при лечении нарушений памяти, таких как при болезни Альцгеймера и сенильной деменции. Механизм действия, изложенный в патенте США Νο. 5173497, заключается в том, что эти соединения подавляют активность полипептида ацетилхолинэстеразы и повышают содержание ацетилхолина в головном мозге.

Индол-3-карбинол получается из индол-3-уксусной кислоты в результате реакции окисления, катализируемой пероксидазой, и может быть легко превращен в дииндолилметан. Имеются сообщения, что оба эти соединения выводят токсины и способствуют синтезу гормонов, полезных для здоровья женщин.

Производные триптофана

Обнаружено, что хлорпроизводные Ό-триптофана являются некалорийными заменителями сахара, и в мире сохраняется повышенный интерес к поиску других соединений с подобными свойствами. Монатин является природным заменителем сахара, который по структуре похож на аминокислоту триптофан.

Его можно экстрагировать из коры южно-африканского кустарника ЗскгосЬИцп ШсНЫшк, и он имеет многообещающие перспективы на применение в качестве высокоэффективного заменителя сахара в пищевой промышленности, в частности при производстве напитков. В качестве примеров патентов на монатин можно привести: патент США Νο. 5994559 Синтез монатина-А - высокоэффективного заменителя сахара, патент США Νο. 4975298 Соединения 3-(1-амино-1,3-дикарбокси-3-гидрокси-бут-4-ил)индола, патент США Νο. 5128164 Композиция для питания человека, содержащая соединения 3-(1амино-1,3-дикарбокси-3-гидрокси-бут-4-ил)-индола и патент США Νο. 5128482 Процесс получения 3(1-амино-1,3-дикарбокси-3-гидрокси-бут-4-ил)-индола.

Некоторые из описанных предшественников монатина могут оказаться полезными в качестве синтетических заменителей сахара или промежуточных продуктов при синтезе производных монатина.

Краткое описание

Настоящее изобретение посвящено способам биосинтеза, применяемым для получения монатина из глюкозы, триптофана, индол-3-лактата, и/или через такие предшественники монатина, как индол-3пируват и 2-гидрокси-2-(индол-3-илметил)-4-кетоглутаровая кислота. Кроме того, в состав изобретения входят полипептиды и нуклеотидные последовательности могут быть использованы при получении монатина, индол-3-пирувата и 2-гидрокси-2-(индол-3-илметил)-4- кетоглутаровой кислоты.

Монатин можно получить через индол-3-пируват, 2-гидрокси-2-(индол-3-илметил)-4-кетоглутарат (предшественник монатина, ПМ, альфа-кетоформа монатина), индол-3-лактат, триптофан, и/или глюкозу (фиг. 1). Раскрываются методы получения или синтеза монатина или его производных, показанные на фиг. 1-3 и 11-13, которые включают превращение субстрата в первый продукт, затем первого продукта во второй продукт и так далее, до получения нужного конечного продукта.

На фиг. 1-3 и 11-13 в прямоугольных рамках показаны потенциальные промежуточные и конечные продукты. Так, превращение одного продукта в другой, например глюкозы в триптофан, триптофана в индол-3-пируват, индол-3-пирувата в ПМ, ПМ в монатин или индол-3-лактата (индол-лактата) в индол-3пируват, может быть осуществлено с применением этих методов. Эти превращения можно упростить химическими или биологическими способами. Термин превратить относится к применению или химических средств, или полипептидов в реакции, которая приводит к получению из первого промежуточного

- 1 009284 соединения второго промежуточного соединения. Термин химическое превращение относится к реакциям, в которых полипептиды не принимали активного участия. Термин биологическое превращение относится к реакциям, в которых активно участвовали полипептиды. Превращения могут проходить как ίη νίνο, так и ίη νίίτο. Если применялись биологические превращения, то полипептиды и/или клетки могут быть иммобилизованы на различных носителях, например, с помощью химической связи с полимерным носителем. Превращение может осуществляться с помощью любого реактора, известного и применяемого в соответствующей области, например в смесителе или реакторе непрерывного действия.

Кроме того, представлены методы, которые включают контактирование первого полипептида с субстратом и получение первого продукта, затем контактирование первого продукта со вторым полипептидом и получение второго продукта, а затем контактирование полученного второго продукта с третьим полипептидом с получением третьего продукта, например монатина.

Используемые полипептиды и получаемые продукты представлены на фиг. 1-3 и 11-13.

Раскрываются полипептиды, которые можно использовать для проведения превращений, представленных фиг. 1-3 и 11-13, а также кодирующие их последовательности. В некоторых случаях для получения монатина используются полипептиды, имеющие одну или несколько точковых мутаций, которые позволяют модифицировать субстратную специфичность и/или активность полипептидов.

В формулу изобретения входят выделенные и рекомбинантные клетки, которые продуцируют монатин. Этими клетками могут быть клетки любого происхождения: растительного, животного, бактериального, дрожжевого, из водорослей, архей или грибов. В одном из примеров патентуемые клетки включают одну или несколько следующих активностей, например две или более или три или более следующих активностей: триптофан аминотрансфераза (ЕС 2.6.1.27), тирозин (ароматическая) аминотрансфераза (ЕС 2.6.1.5), аминотрансфераза множественных субстратов (ЕС 2.6.1.-), аспартат аминотрансфераза (ЕС 2.6.1.1), триптофан-дегидрогеназа (ЕС 1.4.1.19), триптофан-фенилпируват трансаминаза (ЕС 2.6.1.28), оксидаза Ь-аминокислот (ЕС 1.4.3.2), триптофан оксидаза (нет номера ЕС, Набаг с соавт., 1. Вас1егю1 125:1096-1104, 1976 и Еигцуа с соавт., Вюка Вю1ес11по1 Вюсйет 64:1486-1493, 2000), Όаминокислот дегидрогеназа (ЕС 1.4.99.1), оксидаза Ό-аминокислот (ЕС 1.433), Ό-аланин аминотрансфераза (ЕС 2.6.1.21), синтаза/лиаза (ЕС 4.1.3.-), например 4-гидрокси-4-метил-2-оксоглутарат-альдолаза (ЕС 4.1.3.17) или 4-гидрокси-2-оксоглутарат-альдолаза (ЕС 4.1.3.16), синтаза/лиаза (4.1.2.-), Ό-триптофан аминотрансфераза (КоЫЬа & Мйо, Ргосеебтдк о£ 1йе 8'¹' 1п1егпаОопа1 8утро8шт οη Уйатш В₆ и СагЬопу1 Са1а1у818, Осака, Япония, 1990), фенилаланин-дегидрогеназа (ЕС 1.4.1.20) и/или глутамат-дегидрогеназа (ЕС 1.4.1.2, 1.4.1.3, 1.4.1.4).

В другом примере клетки содержат одну или несколько, например две или более или три или более, следующих активностей: индоллактат-дегидрогеназа (ЕС 1.1.1.110), Κ.-4-гидроксифениллактатдегидрогеназа (ЕС 1.1.1.222), 3-(4)-гидроксифенилпируват редуктаза (ЕС 1.1.1.237), лактатдегидрогеназа (ЕС 1.1.1.27, 1.1.1.28, 1.1.2.3), (3-имидазол-5-ил)-лактатдегидрогеназа (ЕС 1.1.1.111), лактат-оксидаза (ЕС

1.1.3.-), синтаза/лиаза (4.1.3.-), например, 4-гидрокси-4-метил-2-оксоглутарат-альдолаза (ЕС 4.1.3.17) или 4-гидрокси-2-оксоглутарат-альдолаза (ЕС 4.13.16), синтаза/лиаза (4.12.-), триптофан-дегидрогеназа (ЕС

1.4.1.19) , триптофан-фенилпируват трансаминаза (ЕС 2.6.1.28), триптофан аминотрансфераза (ЕС 2.6.127), тирозин (ароматическая) аминотрансфераза (ЕС 2.6.1.5), аминотрансфераза множественных субстратов (ЕС 2.6.1.-), аспартат-аминотрансфераза (ЕС 2.6.1.1) фенилаланин-дегидрогеназа (ЕС

1.4.1.20) , глутаматдегидрогеназа (ЕС 1.4.12, 1.4.1.3, 1.4.1.4), дегидрогеназа Ό-аминокислот (ЕС 1.4.99.1), Ό-триптофан аминотрансфераза, и/или Ό-аланин аминотрансфераза (ЕС 2.6.121).

Кроме того, патентуемые могут содержать одну или несколько следующих активностей, например две или более или три или более следующих активностей: триптофан аминотрансфераза (ЕС 2.6.127), тирозин (ароматическая) аминотрансфераза (ЕС 2.6.1.5), аминотрансфераза множественных субстратов (ЕС 2.6.1.-), аспартат аминотрансфераза (ЕС 2.6.1.1), триптофан-дегидрогеназа (ЕС 1.4.1.19), триптофанфенилпируват трансаминаза (ЕС 2.6.1.28), оксидаза Ь-аминокислот (ЕС 1.4.3.2), триптофан-оксидаза (нет номера ЕС), дегидрогеназа Ό-аминокислот (ЕС 1.4.99.1), оксидаза Ό-аминокислот (ЕС 1.4.33), Ό-аланин аминотрансфераза (ЕС 2.6.1.21), индоллактат-дегидрогеназа (ЕС 1.1.1.110), Κ-4-гидроксифениллактатдегидрогеназа (ЕС 1.1.1.222), 3-(4)-гидроксифенилпируват редуктаза (ЕС 1.1.1.237), лактатдегидрогеназа (ЕС 1.1.1.27, 1.1.1.28, 1.1.23), (3-имидазол-3-ил)-лактатдегидрогеназа (ЕС 1.1.1. 111), лактат-оксидаза (ЕС

1.1.3.-), синтаза/лиаза (4.1.3.-), например, 4-гидрокси-4-метил-2-оксоглутарат-альдолаза (ЕС 4.1.3.17) или 4-гидрокси-2-оксоглутарат-альдолаза (ЕС 4.13.16), синтаза/лиаза (4.1.2.-), глутамат-дегидрогеназа (ЕС 1.4.1.2, 1.4.1.3, 1.4.1.4), фенилаланин-дегидрогеназа (ЕС 1.4.1.20), и/или Ό-триптофан аминотрансфераза.

Монатин можно получить методом, который включает контактирование триптофана и/или индол-3лактата с первым полипептидом, при этом первый полипептид превращает триптофан и/или индол-3лактат в индол-3-пируват (можно использовать или Ό-, или Ь-форму триптофана или индол-3-лактата в качестве субстрата, превращаемого в индол-3-пируват; требуется особое мастерство, чтобы выбранные на этом этапе полипептиды идеально проявляли соответствующую специфичность), контактирование полученного индол-3-пирувата со вторым полипептидом, при этом второй полипептид превращает индол-3-пируват в 2-гидрокси 2-(индол-3-илметил)-4-кетоглутаровую кислоту (ПМ), и контактирование ПМ с третьим полипептидом, при котором третий полипептид превращает ПМ в монатин. Примеры по

- 2 009284 липептидов, которые могут использоваться для этих превращений, приведены на фиг. 2 и 3.

Еще один аспект изобретения касается таких композиций, как ПМ, клеток, которые содержат не менее двух полипептидов или иногда не менее трех или не менее четырех полипептидов, которые кодируются по крайней мере одной экзогенной последовательностью нуклеотидов.

Эти и другие аспекты изобретения разъясняются в приведенных ниже детальном описании и иллюстративных примерах.

Краткое описание иллюстраций

Фиг. 1 показывает различные пути биосинтеза, используемые для получения монатина и/или индол3-пирувата. При одном из них получают индол-3-пируват через триптофан, тогда как при другом индол3-пируват получают через индол-3-лактат. Монатин впоследствии получают через промежуточное соединение 2-гидрокси-2-(индол-3-илметил)-4-кетоглутарат (ПМ).

Соединения, указанные в прямоугольных рамках, являются субстратами и продуктами, получаемыми в результате биосинтетических реакций.

Вещества, указанные рядом со стрелками, это кофакторы, или реагенты, которые могут быть использованы в процессе превращения субстрата в продукт. Использование того или иного кофактора или реагента зависит от полипептида, применяемого для проведения конкретного этапа в последовательности биосинтетических реакций. Кофактор ПФ (пиридоксаль-5'-фосфат) может катализировать реакции независимо от полипептида, и поэтому наличие одного ПФ может обеспечить переход субстрата в продукт.

Фиг. 2 представляет более подробную диаграмму пути биосинтеза, при котором в качестве промежуточного продукта используется ПМ. Субстраты для каждого этапа показаны в прямоугольных рамках. Полипептиды, осуществляющие превращения между субстратами, указаны рядом со стрелками между субстратами. Для каждого полипептида указано его название и номер по Международной классификации ферментов (ЕС).

Фиг. 3 представляет более подробную диаграмму пути биосинтеза, при котором происходит превращение индол-3-лактата в индол-3-пируват. Субстраты для каждого этапа представлены в прямоугольных рамках, а полипептиды, осуществляющие превращения между субстратами, указаны рядом со стрелками между субстратами. Для каждого полипептида указано его название и номер по Международной классификации ферментов (ЕС).

На фиг. 4 представлена одна из возможных реакций получения ПМ химическим способом.

На фиг. 5А и 5В представлены хроматограммы, показывающие результаты качественного определения монатина, полученного с применением ферментов, методами ЖХ/МС.

На фиг. 6 представлен полученный с помощью электрораспылителя масс-спектр монатина, синтезированного с помощью ферментов.

На фиг. 7А и 7В представлены хроматограммы, показывающие результаты ЖХ/МС/МС-дочернего ионного анализа монатина, полученного с применением смеси ферментов.

На фиг. 8 представлена хроматограмма, показывающая результаты высокоточного измерения массы монатина, полученного с применением ферментов.

На фиг. 9А-9С представлены хроматограммы, показывающие результаты хирального разделения (А) К-триптофана, (В) 8-триптофана и (С) монатина, полученного с применением ферментов.

На фиг. 10 представлена гистограмма, показывающая относительное содержание монатина, продуцируемого бактериальными клетками после индукции 1РТС. Знаком (-) обозначено отсутствие добавления субстрата (не было добавлено ни триптофана, ни пирувата).

На фиг. 11-12 показаны схематические диаграммы, демонстрирующие пути, используемые для увеличения выхода монатина, синтезируемого из триптофана или индол-3-пирувата.

На фиг. 13 представлена схематическая диаграмма, показывающая способ увеличения выхода монатина, получаемого из триптофана или индол-3-пирувата.

Список последовательностей

Нуклеотидные и аминокислотные последовательности, перечисленные в прилагаемом списке последовательностей, представлены с помощью стандартных однобуквенных сокращений для оснований нуклеотидов и трехбуквенных сокращений для аминокислот. Представлена только одна цепочка для каждой нуклеиновой кислоты, но подразумевается, что комплементарная цепочка включается при ссылке на представленную последовательность.

8ЕО ΙΌ №: 1 и 2 представляют нуклеотидную и аминокислотную последовательности аминотрансферазы из ЗшогЫюЬшт теШой, соответственно (ген 1а1А. называемый в литературе тирозин аминотрансфераза или ароматическая аминотрансфераза).

8ЕО ΙΌ №: 3 и 4 представляют нуклеотидную и аминокислотную последовательности тирозин аминотрансферазы из В1тобоЬас1ег врйаегоИек (2.4.1), соответственно (по гомологии с геном 1а1А (8ЕО ΙΌ №: 1 и 2), предсказанным как аспартат аминотрансфераза с помощью компьютерных программ для геномного анализа).

8ЕО ΙΌ №: 5 и 6 представляют нуклеотидную и аминокислотную последовательности аминотрансферазы из К1юбоЬас1ег врйаегоПек (35053), соответственно (новый ген, клонированный на основе после

- 3 009284 довательности для 2.4.1 8ЕР ГО № 3 и 4).

8ЕР ГО №: 7 и 8 представляют нуклеотидную и аминокислотную последовательности аминотрансферазы широкого спектра действия (Ька() из Ьещбташа та)ог. соответственно.

8ЕР ГО №: 9 и 10 представляют нуклеотидную и аминокислотную последовательности ароматической аминотрансферазы (ога1) из ВасШик киЬббк. соответственно.

8ЕР ГО №: 11 и 12 представляют новые нуклеотидную и аминокислотную последовательности ароматической аминотрансферазы (ога1) из Ьас1оЬасШик ату1оуогик. соответственно (идентифицированной по гомологии как ароматическая аминотрансфераза).

8ЕР ГО №: 13 и 14 представляют нуклеотидную и аминокислотную последовательности аминотрансферазы множественных субстратов (таг) из В. крбаегоИек (35053). соответственно (идентифицированной как аминотрансфераза множественных субстратов по гомологии с АС №. АААЕ01000093.1. н.п.14743-16155 и АС №. ΖΡ00005082.1).

8ЕР ГО №: 15 и 16 представляют праймеры. использованные для клонирования последовательности Ό-аланин-аминотрансферазы (йо1) из В. киЬббк.

8ЕР ГО №: 17 и 18 представляют праймеры. использованные для клонирования последовательности 1а1А из 8. теб1об.

8ЕР ГО №: 19 и 20 представляют праймеры. использованные для клонирования последовательности ога1 аминотрансферазы из В. киЬббк.

8ЕР ГО №: 21 и 22 представляют праймеры. использованные для клонирования последовательностей (2.4.1 и 35053) аминотрансферазы множественных субстратов из ВбобоЬас1ег крбаегоИек.

8ЕР ГО №: 23 и 24 представляют праймеры. использованные для клонирования последовательности Ька! из ЬеЦбташа та.)ог.

8ЕР ГО №: 25 и 26 представляют праймеры. использованные для клонирования последовательности агаТ из БасЮЬасШик ату1оуогик.

8ЕР ГО №: 27 и 28 представляют праймеры. использованные для клонирования последовательностей из В. крбаегойек (и 2.4.1. и 35053).

8ЕР ГО №: 29 и 30 представляют праймеры. использованные для клонирования последовательности акрС из Е.соб (нуклеотидная последовательность зарегистрирована в СепЬапк под АС №.: АЕ000195.1; белковая последовательность зарегистрирована в СепЬапк под АС №.: ААС74014.1).

8ЕР ГО №: 31 и 32 представляют нуклеотидную и аминокислотную последовательности ароматической аминотрансферазы ЦугВ) из Е.соб. соответственно.

8ЕР ГО №: 33 и 34 представляют праймеры для клонирования последовательности (угВ из Е. сой.

8ЕР ГО №: 35-40 представляют праймеры. использованные для клонирования полипептидов с активностью 4-гидрокси-2-оксоглутарат-альдолазы (КНС) (ЕС 4.1.3.16).

8ЕР ГО №: 41 и 42 представляют нуклеотидные последовательности триптофаназы (1иа) из Е.соб и тирозин фенол-лиазы (1р1) из СбгоЬос1ег Ггеипбб. кодирующих белки Р00913 (С1:401195) и Р31013 (С1:401201). соответственно.

8ЕР ГО №: 43-46 представляют праймеры. использованные для клонирования последовательности полипептидов триптофаназы и полипептидов р-тирозиназы (тирозин фенол-лиазы).

8ЕР ГО №: 47-54 представляют праймеры. использованные для мутационной модификации полипептидов триптофаназы и полипептидов р-тирозиназы.

8ЕР ГО №: 55-64 представляют праймеры. использованные для клонирования полипептидов с активностью 4-гидрокси-4-метил-2-оксоглутарат-альдолазы (ЕС 4.13.17).

8ЕР ГО №: 65 и 66 представляют нуклеотидную и аминокислотную последовательности 4гидрокси-4-метил-2-оксоглутарат-альдолазы (ргоА) из С. 1ек1ок1егопг соответственно.

8ЕР ГО №: 67-68 представляют праймеры. использованные для клонирования последовательности 4-гидрокси-4-метил-2-оксоглутарат-альдолаза (ргоА) из С. 1ек1ок1егопе в опероне с акрС из Е. сой в рЕТ30 Ха/ЫС.

8ЕР ГО №: 69-72 представляют праймеры. использованные для клонирования последовательностей акрС из Е. соб и ргоА из С. 1ек1ок1егопе в рЕ8С-б1к.

8ЕР ГО №: 73-74 представляют последовательности. добавленные к 5'-концу праймеров. использованных для клонирования генов. о которых идет речь в настоящем документе.

Подробное описание некоторых примеров осуществления

Сокращения и термины

Представленные ниже объяснения терминов и методов приведены для того. чтобы лучше описать данное изобретение и ознакомить квалифицированных специалистов с приложениями данного изобретения. В настоящем документе термин «содержащий» означает «включающий». а существительные в единственном числе включают множественные объекты. если их в контексте явно не указывается другое. Например. выражение «содержащий белок» подразумевает один или множество таких белков. а выражение «содержащий клетку» подразумевает наличие одной или многих клеток и соответствующие эквиваленты. известные квалифицированным специалистам. и т. д.

Если не объясняется иное. все используемые в настоящем документе технические и научные тер

- 4 009284 мины имеют то же значение, которое подразумевается специалистами, имеющими достаточную квалификацию в области, к которой относится данное изобретение. Хотя методы и материалы, аналогичные или эквивалентные описанным в настоящем документе, можно применять в практике или при тестировании данного изобретения, ниже описываются соответствующие методы и материалы. Примеры, методы и материалы приведены исключительно в иллюстративных целях и не предусматривают каких бы то ни было ограничений. Из дальнейшего подробного описания и пунктов заявки станут ясными другие особенности и преимущества данного изобретения.

кДНК (комплементарная ДНК): фрагмент ДНК, лишенный внутренних, некодирующих участков (интронов) и регуляторных последовательностей, которые определяют транскрипцию. кДНК можно синтезировать и в лабораторных условиях методом обратной транскрипции с матричной РНК, выделенной из клеток.

Консервативная замена: одна или более аминокислотных замен (например, 2, 5, или 10 остатков) на аминокислотные остатки со сходными бихимическими свойствами. Обычно консервативные замены мало влияют на активность полученного полипептида. Например, в идеале, полипептид триптофанаминотрансфераза, содержащий одну или несколько консервативных замен, сохраняет триптофанаминотрансферазную активность. В результате модификации нуклеотидной последовательности, например, с помощью таких стандартных методов, как направленный мутагенез или ПЦР, можно получить полипептид, содержащий одну или несколько консервативных замен.

Замещенные варианты полипептидов - это те, у которых по крайней мере один остаток в аминокислотной последовательности удален и на его место вставлен другой остаток. Ниже приведены примеры аминокислот, которые могут заместить оригинальную аминокислоту в белковой последовательности, и считаются консервативными заменами: А1а замещается на зег или !Ы; агд замещается на д1п, Ыз или 1уз; азп замещается на д1и, д1п, 1уз, Ыз, азр; азр замещается на азп, д1и или д1п; суз замещается на зег или а1а; д1п замещается на азп, д1и, 1уз, Ыз, азр или агд; д1и замещается на азп, д1п, 1уз или азр; д1у замещается на рго; Ыз замещается на азп, 1уз, д1п, агд, !уг, Не замещается на 1еи, ше1, уа1, рке; 1еи замещается на Не, ше1, уа1, рке; 1уз замещается на азп, д1и, д1п, Ыз, агд; те! замещается на Не, !еп, уа1, рке; рке замещается на 1гр, !уг, те!, 11е или 1еи; зе! замещается на !Ы, а1а; !Ы замещается на зег или а1а; Ир замещается на рке, !уг; !уг замещается на Ыз, рке или !1р; и уа1 замещается на те!, Не; 1еи замещается на рго; Ыз замещается на азп, 1уз, д1п, агд, !уг, 11е замещается на 1еи, те!, уа1, рке; 1еи замещается на Не, те!, уа1, рке; 1уз замещается на азп, д1и, д1п, Ыз, агд; те! замещается на Не, !еп, уа1, рке; рке замещается на !гр, !уг, те!, Не или 1еи; зег замещается на !Ы, а1а; !Ы замещается на зег или а1а; !гр замещается на рке, !уг; !уг замещается на Ыз, рке или !гр; и уа1 замещается на те!, Не, 1еи.

Дополнительная информация о консервативных заменах может быть найдена в других источниках, в частности Веп-Вазза! с соавт., (1. Вас!епо1 169:751-7,1987), 0'К.едап с соавт., (Оепе 77:237-51,1989), 8аЫп-То!й с соавт., (Рго!еш 8з1. 3:240-7,1994), Ноский е! а1., (Вю/Тесйпо1оду 6:1321-5,1988), \У0 00/67796 (Сигб с соавт.) и в стандартных учебниках генетики и молекулярной биологии.

Экзогенный: термин «экзогенный», используемый в настоящем документе в отношении нуклеиновой кислоты и конкретной клетки, указывает на то, что нуклеиновая кислота происходит не из данной клетки в результате естественных процессов. Так, нуклеиновая кислота неприродного происхождения считается экзогенной по отношению к клетке, как только она введена в клетку. Нуклеиновая кислота естественного происхождения также может быть экзогенной для данной клетки. Например, целая хромосома, полученная из клетки человека X, является экзогенной для клетки из организма человека Υ, как только эта хромосома окажется в клетке Υ.

Функциональный эквивалент: имеющий эквивалентную функцию. Так, в число функционально эквивалентных молекул какого-либо фермента входят разные молекулы, которые сохраняют функцию этого фермента. Например, функциональные эквиваленты можно получить путем изменения последовательности фермента, если пептид с одной или несколькими модификациями последовательности сохраняет функцию неизмененного пептида. В частности, функциональный эквивалент триптофанаминотрансферазы сохраняет способность превращать триптофан в индол-3-пируват.

В число примеров изменения последовательности входят (но без ограничений) консервативные замены, делеции, мутации, сдвиги рамки считывания и инсерции. Например, какой-либо полипептид связывает антитела, тогда его функциональный эквивалент - полипептид, который связывается с теми же антителами. То есть понятие функциональный эквивалент включает пептиды, которые имеют ту же специфичность связывания, что и основной полипептид, и которые могут использоваться в качестве реагента вместо этого полипептида. Так, в одном из примеров функциональным эквивалентом является полипептид, у которого связывающая последовательность прерывается, при этом антитела связываются с линейным эпитопом. То есть, если последовательность пептида - ΜΡΕΕΑΝΏΕΟΕ (аминокислоты 1-10 последовательности 8ΕΟ ГО №: 12), то функциональный эквивалент содержит эпитопы, расположенные прерывисто, и его последовательность выглядит следующим образом (** - вставка из любого числа аминокислот): ΝΗ₂-**-Μ**Ρ**Ε**Ε**Α**Ν**Ό**Ε**6**Ε^ΟΟΗ. В этом примере полипептид является функционально эквивалентным аминокислотам 1-10 последовательности 8ΕΟ ГО №: 12, если трехмерная структура этого полипептида позволяет ему связывать моноклональные антитела, которые связываются с

- 5 009284 аминокислотами 1-10 о£ последовательности 8ЕС ГО №: 12.

Гибридизация: термин гибридизация, используемый в настоящем документе, относится к методу тестирования комплементарности по нуклеотидной последовательности двух молекул нуклеиновой кислоты, основанный на способности комплементарной одноцепочечной ДНК и/или РНК образовывать двойную молекулу (дуплекс). Метод гибридизации нуклеиновых кислот можно использовать для получения изолированной нуклеиновой кислоты в рамках данного изобретения. Практически любую нуклеиновую кислоту, имеющую определенную гомологию с последовательностью, представленную под 8ЕС ГО №:11, можно использовать для выявления похожей нуклеиновой кислоты с помощью гибридизации в условиях умеренной или высокой жесткости.

После выявления нуклеиновую кислоту можно очистить, секвенировать и проанализировать, чтобы определить, входит ли она в рамки данного изобретения.

Гибридизацию можно проводить по Саузерну или методом нозерн-гибридизации для выявления последовательности ДНК или РНК, соответственно, которая гибридизуется с выбранным зондом. Зонд можно пометить биотином, диоксигенином, полипептидом или радиоизотопом, например Р³². Анализируемая ДНК или РНК может быть выделена методом электрофореза на агарозе или в полиакриламидном геле, перенесена на нитроцеллюлозу, нейлон или другую подходящую мембрану, а затем гибридизована с соответствующим зондом с помощью стандартного метода, хорошо известного специалисту, например, одного из описанных в разделах 7.39-7.52 книги ЗашЬгоок с соавт., (1989) Мо1еси1аг С1ошид, второе издание, Со1б 8ргшд НагЬог ЬаЬога1огу, Р1а1иу1ете, ΝΥ. Как правило, длина зонда составляет около 20 нуклеотидов. Например, зонд, соответствующий непрерывной 20-нуклеотидной последовательности, представленной под 8ЕС ГО №: 11, можно использовать для идентификации идентичной или похожей нуклеиновой кислоты. Кроме того, можно использовать зонды длиннее или короче 20 нуклеотидов.

Изобретение включает также выделенные нуклеотидные последовательности, которые имеют не менее 12 нуклеотидов в длину (то есть, по крайней мере, около 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 100, 250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000 или 5000 оснований в длину) и гибридизуются при соответствующих условиях гибридизации со смысловой или антисмысловой цепью нуклеиновой кислоты, представленной в 8ЕС ГО №: 11. Условия гибридизации могут быть умеренно или высоко жесткими.

Для целей данного изобретения умеренно жесткие условия гибридизации означают, что гибридизация проводится при температуре около 42°С в гибридизационном растворе, содержащем 25 мМ КРО₄(рН 7,4), 5Х 88С, 5Х раствор Денхарта, 50 мкг/мл денатурированной обработанной ультразвуком ДНК спермы лосося, 50% формамид, 10% декстран-сульфат и 1-15 нг/мл зонда (около 5 х 10⁷ квм/мкг), при этом отмывание проводится при температуре около 50°С промывающим раствором, содержащим 2Х 88С и 0,1% додецилсульфат натрия.

Гибридизация в жестких условиях означает, что гибридизация проводится при температуре около 42°С в гибридизационном растворе, содержащем 25 мМ КРО₄ (рН 7,4), 5Х 88С, 5Х раствор Денхарта, 50 мкг/мл денатурированной обработанной ультразвуком ДНК спермы лосося, 50% формамид, 10% декстран-сульфат и 1-15 нг/мл зонда (около 5 х 10⁷ квм/мкг), при этом отмывание проводится при температуре около 65°С промывающим раствором, содержащим 0,2Х 88С и 0,1% додецилсульфат натрия.

Изолированная: термин изолированная, применяемый в настоящем документе по отношению к нуклеиновой кислоте, означает, что имеющая природное происхождение нуклеиновая кислота не примыкает непосредственно к обеим последовательностям, с которыми она непосредственно граничила (с одной на 5'-конце и с другой на 3'-конце) в природных условиях генома того организма, из которого она происходит. Например, изолированная нуклеиновая кислота может быть, без ограничений, рекомбинантной молекулой ДНК любой длины при условии, что одна из фланкирующих нуклеотидных последовательностей такой рекомбинантной молекулы ДНК удалена или отсутствует. Таким образом, под изолированной нуклеиновой кислотой понимается, без ограничений, рекомбинантная ДНК, которая представлена в виде отдельной молекулы (например, кДНК или фрагмент геномной ДНК, полученный с помощью ПЦР или обработки рестрикционной эндонуклеазой), независимой от других последовательностей, а также рекомбинантная ДНК, которая встроена в вектор, автономно реплицирующуюся плазмиду, вирус (например, ретровирус, аденовирус или вирус герпеса) или в геномную ДНК прокариот или эукариот. Кроме того, изолированная нуклеиновая кислота может включать рекомбинантную молекулу ДНК, которая является частью гибридной или сшитой нуклеотидной последовательности.

Термин изолированная, применяемый в настоящем документе по отношению к нуклеиновой кислоте, включает также любую нуклеиновую кислоту неприродного происхождения, так как нуклеотидные последовательности неприродного происхождения не встречаются в природе и не ограничены другими последовательностями в составе природного генома. Так, нуклеиновая кислота неприродного происхождения, например, полученная методами генной инженерии, считается изолированной нуклеиновой кислотой. Сконструированная нуклеиновая кислота может быть получена обычными методами молекулярного клонирования или химическими методами синтеза нуклеиновых кислот.

Нуклеиновая кислота неприродного происхождения может быть независимой от других последовательностей, или встроена в вектор, автономно реплицирующуюся плазмиду, вирус (например, ретровирус, аденовирус или вирус герпеса) или в геномную ДНК прокариот или эукариот. Кроме того, нуклеи

- 6 009284 новая кислота неприродного происхождения может включать молекулу нуклеиновой кислоты, которая является частью гибридной или сшитой нуклеотидной последовательности.

Квалифицированным специалистам понятно, что нуклеиновая кислота, существующая среди сотен или миллионов других молекул нуклеиновых кислот, например в составе библиотек кДНК, или геномных ДНК, или гелевых пластин, содержащих набор рестрикционных фрагментов геномной ДНК, не считается изолированной нуклеиновой кислотой.

Нуклеиновая кислота: термин нуклеиновая кислота, применяемый в настоящем документе, относится и к РНК, и к ДНК, включая, без ограничений, кДНК, геномной ДНК и синтетической (т.е. химически синтезированной) ДНК. Нуклеиновая кислота может быть двухцепочечной или одноцепочечной. В случае одноцепочечной, нуклеиновая кислота может быть смысловой или антисмысловой. Кроме того, нуклеиновая кислота может быть кольцевой или линейной.

Оперативно сцеплена: первая последовательность нуклеотидов считается оперативно сцепленной со второй последовательностью нуклеотидов, если первая последовательность нуклеотидов находится в функциональной связи со второй последовательностью нуклеотидов. Например, промотор считается оперативно сцепленным с кодирующей последовательностью, если этот промотор влияет на ее транскрипцию. Как правило, оперативно сцепленные последовательности ДНК непосредственно граничат друг с другом и если необходимо соединить два полипептид-кодирующих региона в пределах одной рамки считывания.

Пептидные модификации: в формулу настоящего изобретения входят ферменты, а также синтетические гомологи. Кроме того, аналоги (органические молекулы непептидной природы), производные (химически функциональные пептидные молекулы, полученные на основе раскрываемых пептидных последовательностей), и варианты (гомологи), обладающие нужной ферментной активностью, могут быть использованы в методах, описанных в настоящем документе. Представленные в настоящем документе пептиды включают последовательность аминокислот, которые могут быть Ь- и/или Όаминокислотами, естественного или иного происхождения.

Пептиды могут быть модифицированы разными химическими методами с получением производных, которые обладают в сущности той же активностью, что и немодифицированные пептиды, а иногда и дополнительно приобретают другие полезные свойства. Например, карбоксильные группы белков, как терминальные, так и боковых цепей, могут быть представлены в виде соли или фармацевтически приемлемого катиона или этерифицированы с образованием С1-С16 эфира или превращены в амид с формулой ΝΚ.1Κ.2, где Ы и Р2 независимо друг от друга Н- или С1-С16-алкильная группа, или соединены с образованием гетероциклического кольца, например, 5- или 6-звенного кольца. Аминогруппы этого пептида, как терминальная, так и аминогруппы боковых цепей, могут быть в форме фармацевтически приемлемой соли таких кислот, как НС1, НВг, уксусная, бензойная, толуол-сульфоновая, малеиновая, винная и другие органические кислоты, или могут быть модифицированы С1-С16-алкильными или диалкиламиногруппами или превращены в амид.

Гидроксильные группы боковых цепей пептидов могут быть превращены в С1-С 16-алкоксигруппы или в С1-С16-эфирные группы с помощью хорошо известных методов. Фенильные и фенольные кольца боковых цепей пептидов могут быть замещены одним или несколькими атомами галогенов, такими как Г, С1, Вг или I, или С1-С16-алкильными, С1-С16-алкоксигруппами, карбоксильными кислотами и их эфирами или амидами таких карбоксильных кислот. Метиленовые группы боковых цепей пептидов могут быть увеличены до гомологичных С2-С4-алкиленов. Тиоловые группы можно защитить любой из числа хорошо известных защитных групп, например ацетамидными группами. Кроме того, специалисты узнают методы введения циклических структур в пептиды, входящие в формулу этого изобретения, чтобы выбирать и создавать конформационные связки в структуре, что повышает ее стабильность. Например, С- или Т-терминальный цистеин можно присоединить к пептиду таким образом, чтобы при окислении пептид содержал пептидную связь и превращался в циклический пептид. Циклизацию пептидов можно провести и другими способами, например через образование тиоэфиров и карбоксильных и амино-терминальных амидов и эфиров.

Пептидомиметические и органомиметические аналоги также входят в формулу настоящего изобретения, в связи с чем трехмерное расположение химических компонентов таких пептидо- и органомиметиков повторяет трехмерное расположение пептида боковых цепей аминокислот, что приводит к наличию у таких пептидо- и органомиметиков белков, входящих в формулу данного изобретения, значимой ферментативной активности. При компьютерном моделировании фармакофор является идеальным трехмерным определением структурных требований к биологической активности. Пептидо- и органомиметики можно сконструировать таким образом, чтобы каждый фармакофор соответствовал текущему программному обеспечению для компьютерного моделирования (используя систему конструирования лекарств с помощью компьютера, или СЛЭЭ). См. описания подходов, используемых в САЭО, в статьях: ^а11сг5. Сотри1сг-Л551йс6 Мобейид о£ Огидк, в кн.: К1едегтап & Сгосек (ред.), Рйагтасеийса1 Вю1есйио1оду, 1993, 1и1егрйагт Ргекк: Вийа1о Огоуе, 1Ь, стр. 165-174 и Главе 102 в кн.: Миикои (ред.), Рппс1р1е8 о£ Рйагтасо1оду, 1995, Сйартаи & На11. Кроме того, в формулу данного изобретения включаются миметики, полученные с использованием таких подходов. В одном из примеров миметик имитирует фермент

- 7 009284 ную активность, которую демонстрирует фермент или его вариант, фрагмент или фузионный продукт.

Зонды и праймеры: Нуклеотидные зонды и праймеры можно легко приготовить на основе аминокислотных и нуклеотидных последовательностей, представленных в данном документе. Понятие зонд включает изолированную нуклеиновую кислоту, содержащую определяемую меченую или репортерную молекулу. Примером метки могут служить, без ограничений, радиоактивные изотопы, лиганды, хемилюминесцентные агенты и полипептиды. Способы мечения и рекомендации по выбору меток, соответствующих различным целям, обсуждаются, например, в следующих источниках: 8атЬгоок с соавт. (еб.), Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬога1огу Мапиа1 2пб еб., νοί. 1-3, Со1б 8ргшд НагЬог ЬаЬога1огу Ргезз, Со1б 8ргшд НагЬог, Ν.Υ., 1989, и Аи8иЬе1 е! а1. (еб) Сштеп! Рго1осок ίη Мо1еси1аг Вю1оду, Сгеепе РиЬБзЫпд и \УПеу1п1ег8С1епсе, Нью-Йорк (с периодическими обновлениями), 1987.

Праймеры - это типичные молекулы нуклеиновых кислот, содержащие 10 и более нуклеотидов (например, молекулы нуклеиновой кислоты длиной примерно от 10 до 100 нуклеотидов). Праймер может быть получен в результате отжига с комплементарной цепью нужной нуклеиновой кислоты путем гибридизации с образованием гибрида между праймером и цепочкой нужной нуклеиновой кислоты, а затем удлинен вдоль нужной нуклеиновой кислотой, например, с помощью полипептида ДНК-полимеразы. Можно использовать пары праймеров для амплификации последовательности нуклеотидов, например, способом полимеразной цепной реакции (ПЦР) или другим способом амплификации нуклеиновых кислот, известных специалистам.

Способы получения и применения зондов и праймеров описаны, например, в таких источниках, как: 8атЬгоок и др., (ред.), Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬога1огу Мапиа1, 2-ое изд., тт. 1-3, Со1б 8ргшд НагЬог ЬаЬога!огу Ргезз, Со1б 8ргшд НагЬог, Ν.Υ., 1989; АизиЬе1 е! а1., Сштеп! Рго1осо1з ш Мо1еси1аг Вю1оду, Сгеепе РиЬБзЫпд % ^11еу-1п1ег8с1епсе, Нью-Йорк (с периодическими обновлениями), 1987; и 1пшз и др. (ред.), ПЦР Рго1осо1з: А Сшбе !о Ме1йобз и Аррйсабопз, Асабеннс Ргезз: Сан-Диего, 1990. Пары праймеров для ПЦР могут быть получены на основе известной последовательности, например, с помощью компьютерных программ, предназначенных для таких целей, таких как Рптег (версия 0,5, ©1991, \У1Ше11еаб 1пз1йи1е Гог Вютебюа1 Везеагсй, Кембридж, штат Массачусетс). Квалифицированный специалист согласится с тем, что специфичность конкретного зонда или праймера увеличивается с длиной, и в то же время длина зонда или праймера колеблется в диапазоне от полноразмерной последовательности до всего лишь пяти последовательно расположенных нуклеотидов. Так, например, праймер из 20 последовательно расположенных нуклеотидов можно отжечь с более высокой специфичностью, чем аналогичный праймер длиной только 15 нуклеотидов. Поэтому чтобы получить более высокую специфичность, можно выбрать зонды и праймеры, которые содержат, например, 10, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600, 1650, 1700, 1750, 1800, 1850, 1900, 2000, 2050, 2100, 2150, 2200, 2250,

2300, 2350, 2400, 2450, 2500, 2550, 2600, 2650, 2700, 2750, 2800, 2850, 2900, 3000, 3050, 3100, 3150, 3200,

3250, 3300, 3350, 3400, 3450, 3500, 3550, 3600, 3650, 3700, 3750, 3800, 3850, 3900, 4000, 4050, 4100, 4150,

4200, 4250, 4300, 4350, 4400, 4450, 4500,4550, 4600, 4650, 4700,4750, 4800, 4850, 4900, 5000, 5050, 5100,

5150, 5200, 5250, 5300, 5350, 5400, 5450 или более последовательно расположенных нуклеотидов.

Промотор: ряд управляющих нуклеотидных последовательностей, которые направляют транскрипцию нуклеиновой кислоты. Промотор содержит обязательные нуклеотидные последовательности, расположенные вблизи сайта инициации (начала) транскрипции, таких как, в случае промотора полимеразы II типа, ТАТА-элемент. В состав промотора может входить дистальный энхансер или репрессорные элементы, которые могут располагаться на расстоянии в несколько тысяч пар нуклеотидов от сайта инициации транскрипции.

Очищенный: термин очищенный, применяемый в настоящем документе, не подразумевает абсолютной чистоты, это скорее относительное понятие. Так, например, очищенный полипептид или очищенный препарат нуклеиновой кислоты может быть таким препаратом, в котором данный полипептид или нуклеиновая кислота, соответственно, находится в более высокой концентрации, чем полипептид или нуклеиновая кислота в естественном окружении в организме. Например, препарат полипептида может считаться очищенным, если содержание полипептида в препарате составляет не менее 50, 60, 70, 80, 85, 90, 92, 95, 98 или 99% от общего содержания белка в этом препарате.

Рекомбинатный: рекомбинантная нуклеиновая кислота - нуклеиновая кислота, которая (1) состоит из последовательности, которой нет в организме в естественных условиях, или (2) получена искусственной комбинацией двух не соединявшихся ранее более коротких последовательностей. Эта искусственная комбинация часто осуществляется путем химического синтеза или, чаще, с помощью искусственных манипуляций с изолированными фрагментами нуклеиновых кислот, например, способами генной инженерии. Термин рекомбинатный используется также для описания молекул нуклеиновых кислот, с которыми проводились искусственные манипуляции, но они содержат те же регуляторные последовательности и кодирующие участки, которые встречаются и в том организме, из которого выделена данная нуклеиновая кислота.

Идентичность последовательностей: сходство между аминокислотными последовательностями выражается в терминах сходства между последовательностями, иначе называемым идентичностью после

- 8 009284 довательностей. Идентичность последовательностей часто измеряется в процентной идентичности (или сходстве или гомологии); чем выше процент, тем более похожи этим последовательности. Гомологи или варианты пептида, такого как 8ЕО Ш №:12, обладают относительно высокой степенью идентичности при выравнивании стандартными способами.

Способы выравнивания последовательностей для сравнения хорошо известны квалифицированным специалистам. Различные программы для сравнения хорошо известны специалистам. Различные программы и алгоритмы выравнивания описаны в следующих источниках: διηίΐΐι и \Уа1сгтап. Λάν. Αρρί. Ма!й. 2:482,1981; Ыее61етап и ^ипкей. I. Μοί. Βίοί. 48:443-53,1970; Реагкоп и Ыртап, Ргос. №111. Асаб. δει. И.8.А. 85:2444-8,1988; Ηί§§ίηκ и 8йагр, Сепе 73:237-44, 1988; Ш§дп8 и 8йатр, САВ1О8 5:151-3,1989; Согре! с соавт., Ыис1е1с Αείάκ Векеатсй 16:10881-10890,1988; и А11ксйи1 с соавт., №11иге Сепе!. 6:119-29, 1994.

Разработанная в Национальном Центре биотехнологической информации США (№Шопа1 СеШег ίοτ Вю1ес11по1оду 1п£оттайоп, ЫСВ1) программа ВЬА8Т™(Вакю Ьоса1 Айдптеп! 8еатсй Τοοί) (А1!ксйи1 с соавт., I. Мо1. Βίο1. 215:403-10,1990) может быть получена из разных источников, включая ЫСВ1 (Ве!йек6а, ΜΌ) и Интернет, для применения в связи с программами анализа последовательностей Ыак!р, Ыак!п, Ыак!*, !Ыак!п и !Ыак!х.

Варианты пептида обычно характеризуются наличием по крайней мере 50%-ного сходства последовательностей в расчете на полноразмерное выравнивание аминокислотной последовательности с помощью программы ЫСВ1 В1ак! 2.0, используя параметры по умолчанию для сравнения с разрывами. Для сравнения аминокислотных последовательностей длиной более 30 аминокислот применяется функция В1ак! 2 с использованием набора матриц ВЬО8ИМ62 по умолчанию с параметрами по умолчанию (стоимость разрыва 11, стоимость одного остатка в разрыве 1). При выравнивании коротких пептидов (менее 30 аминокислот) выравнивание проводится с функцией последовательностей В1ак! 2 с использованием набора матриц РАМ30 по умолчанию с параметрами по умолчанию (открытый разрыв 9, дополнительный штраф за разрыв 1). Белки даже с большим сходством с последовательностями сравнения будут показывать возрастание процентной идентичности при оценке этим способом, например, не менее 80%, не менее 90%, не менее 95%, не менее 98% или даже не менее 99% идентичности. Если сравнивается неполная последовательность на предмет идентичности последовательности, гомологи и варианты будут показывать не менее 80% идентичности последовательности на коротких окнах из 10-20 аминокислот, и могут демонстрировать идентичность на уровне не менее 85%, не менее 90%, не менее 95% или 98% в зависимости от их сходства с основной последовательностью. Способы определения идентичности последовательностей при таких коротких окнах описаны на тееЬ-сайте, поддерживаемом в Национальном Центре биотехнологической информации (г. Бетезда, штат Мэриленд). Квалифицированный специалист согласится, что такие диапазоны идентичности последовательности представлены только для примера и что можно получить значительно совпадающие гомологи, которые окажутся вне представленных диапазонов.

Аналогичные способы можно применить для определения процента идентичности нуклеотидной последовательности. В одном из примеров гомологичная последовательность выравнивается против нативной последовательности, и количество совпадений определяется путем подсчета числа позиций, в которых идентичный нуклеотид или аминокислотный остаток представлен в обеих последовательностях. Процент идентичности последовательностей определяется делением числа совпадений на длину последовательности, определенной в идентифицированной последовательности (например, 8ЕО Ш №11), или по заявленной длине (например, 100 последовательных нуклеотидов или аминокислотных остатков из последовательности, определенной по идентифицированной последовательности) с последующим умножением результата на 100. Например, нуклеотидная последовательность, которая имеет 1166 совпадений при выравнивании против последовательности в 8ЕО Ш № 11, на 75,0% идентична последовательности в 8ЕО Ш№11 (т.е. 1166-1554-100=75,0). Следует отметить, что процент идентичности последовательно сти округляется до ближайшей десятой. Например, 75,11, 75,12, 75,13 и 75,14 округляются до 75,1, а 75,15, 75,16, 75,17, 75,18 и 75,19 округляются до 75,2. Кроме того, следует отметить, что длина всегда является целым числом. В другом примере целевая последовательность, содержащая фрагмент длиной 20 нуклеотидов, который выравнивается с 20 последовательными нуклеотидами идентифицированной последовательности, содержит участок, который показывает 75% идентичности с этой идентифицированной последовательностью (т.е. 15-20-100=75).

20

Целевая последовательность: А00ТС6Т6ТАСТ6ТСАСТСА

I

Идентифицированная последовательность: АСОТССТСААСТСССАОТОА

Специфически связывающийся агент: агент, который способен специфически связываться с одним из полипептидов, описанных в настоящем документе. Среди примеров можно назвать, без ограничений, поликлональные антитела, моноклональные антитела (включая гуманизированные моноклональные ан

- 9 009284 титела) и фрагменты моноклональных антител, такие как РаЬ, Р(аЬ') и Ρν-фрагменты, а также любые другие агенты, которые могут специфически связываться с эпитопом таких полипептидов.

Антитела к представленным в настоящем документе полипептидам (или фрагментам, вариантам или фузионным продуктам) можно использовать для очистки и идентификации таких полипептидов. Аминокислотные и нуклеотидные последовательности, представленные в настоящем документе, позволяют получить связывающие агенты на основе специфических антител, которые распознают полипептиды, представленные в настоящем документе.

Можно получить моноклональные или поликлональные антитела к полипептидам, частям полипептидов или их вариантам. Считается оптимальным, если антитела против одного или нескольких эпитопов на полипептидном антигене специфически выявляют такой полипептид. То есть антитела, полученные против того или иного полипептида, будут распознавать и связываться с этим полипептидом, но практически не будут реагировать и связываться с другими полипептидами. Определение того, что антитела специфически связываются с данным полипептидом, проводится одним из многочисленных стандартных способов иммуноопределения; например вестерн-блоттинг (см., например, 8атЬгоок и др. (ред.), Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬогаФгу Мапиа1, 2-е изд., тт. 1-3, Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬога1огу Ргекк, Со1б 8рппд НагЬог, Ν.Υ., 1989). Чтобы определить, что препарат данного антитела (такой как препарат, полученный у мышей против полипептида с аминокислотной последовательностью, представленной в 8ЕО Ш № 12) специфически определяет соответствующий полипептид (например, полипептид с аминокислотной последовательностью, представленной в 8ЕО Ш №12) способом вестерн-блот-анализа, можно экстрагировать общий клеточный белок из клеток и разделить его способом электрофореза в полиакриламидном геле с 8Ό8.

Затем разделенный клеточный белок можно перенести на мембрану (например, нитроцеллюлозу) и проинкубировать ее с препаратом антител. После промывания мембраны для удаления неспецифически связавшихся антител наличие специфически связанных антител можно определить с помощью соответствующих вторичных антител (например, антимышиных антител), конъюгированных с таким полипептидом, как щелочная фосфатаза, поскольку применение 5-бром-4-хлор-3-индолилфосфат/нитросинего тетразолиевого приведет к образованию темно-синего вещества благодаря иммуно-связанной щелочной фосфатазе.

Практически чистые полипептиды, пригодные для применения в качестве иммуногенов, можно получить из трансфицированных клеток, трансформированных клеток или интактных клеток. Концентрация полипептида в конечном препарате может быть отрегулирована, например, путем концентрирования на фильтре Аписом, до уровня в несколько микрограммов на миллилитр. Кроме того, полипептиды размером от полноразмерных полипептидов до полипептидов всего в несколько аминокислотных остатков можно использовать в качестве иммуногенов. Такие полипептиды можно получать в клеточной культуре, можно синтезировать химическими способами или получать путем расщепления крупных полипептидов на полипептиды меньшего размера, которые можно затем очистить. Полипептиды длиной всего девять аминокислотных остатков могут быть иммуногенными, если они представлены иммунной системе в контексте молекул главного комплекса гистосовместимости (МНС), таких как молекула МНС класса I или МНС класса II. Соответственно, полипептиды длиной не менее 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 76, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 900, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350 или более последовательных аминокислотных остатков любой аминокислотной последовательности, представленной в настоящем документе, могут быть использованы в качестве иммуногенов для получения антител.

Моноклональные антитела к любому из полипептидов, представленных в настоящем документе, можно получить из гибридомы мыши классическим способом КоЫег & МПк1еш (№1мге 256:495-497, 1975) или другим подобным способом.

Поликлональная антисыворотка, содержащая антитела к гетерогенным эпитопам любого полипептида из представленных в настоящем документе, может быть приготовлена путем иммунизации соответствующих животных полипептидом (или его фрагментом), который может быть немодифицированным или модифицированным для улучшения иммуногенности. Протокол эффективной иммунизации кроликов можно найти в работе УайикаШк с соавт. (1. Сйп. Епбосппо1. Ме1аЬ. 33:988-91,1971).

Вместо целых антител можно использовать фрагменты антител, которые проще экспрессировать в прокариотических клетках. Способы получения и применения иммунологически активных фрагментов моноклональных антител, называемых также фрагменты антител, хорошо известны и описаны, в частности, в работах: Вейег & Ного\\йх (МеШобк Епхуто1. 178:476-96,1989), С1осккйиЬег с соавт. (Вюсйеткйу 29:1362-7,1990), патент США №. 5648237 (Экспрессия функциональных фрагментов антител), патент США №. 4946778 (Молекулы, связывающие единичную полипептидную цепь), патент США №. 5455030 (Иммунотерапия с использованием молекул, связывающих единичную полипептидную цепь ), и в процитированной в этих работах литературе.

Трансформированный: трансформированная клетка - это клетка, в которую введена молекула нуклеиновой кислоты с помощью, например, молекулярно-биологических способов. Трансформация происходит при всех способах, при которых нуклеиновая кислота может быть введена в такую клетку,

- 10 009284 включая, но не ограничиваясь, трансфекцию вирусным вектором, конъюгацию, трансформацию плазмидным вектором и введение чистой ДНК с помощью электропорации, липофекции и пушки для ускоренного введения частиц.

Варианты, фрагменты и фузионные белки: представленные в документе белки включают варианты, фрагменты и фузионные белки. Последовательности ДНК (например, 8ЕО ΙΌ №11), которые кодируют белок (например, 8ЕО ΙΌ № 12), фузионный белок или фрагмент или вариант белка, могут быть сконструированы таким образом, чтобы позволить экспрессию белка в эукариотических клетках, бактериях, насекомых и/или растениях. Чтобы получить экспрессию, последовательность ДНК можно изменить и опреративно сцепить с другими регуляторными последовательностями. Конечный продукт, который содержит регуляторные последовательности и белок, называется вектором. Этот вектор можно ввести в клетки эукариот, бактерий, насекомых и/или растений. Как только вектор оказывается внутри клетки, начинается продукция выбранного белка.

Фузионный белок включает белок, например триптофан-аминотрансферазу (или вариант, полиморфизм, мутантный вариант или фрагмент), например 8ЕО ΙΌ № 12, сцепленный с другими аминокислотными последовательностями, которые не подавляют полезную активность данного белка, например способность превращать триптофан в индол-3-пируват. В одном из примеров, прочие аминокислотные последовательности имеют длину не более 10, 12, 15, 20, 25, 30 или 50 аминокислот.

Любой специалист согласится, что последовательность ДНК можно изменить разнообразными способами, не изменяя при этом биологическую активность кодируемого белка. Например, для получения вариаций последовательности ДНК, которая кодирует белок, можно применить ПЦР. Такие варианты могут быть вариантами, оптимизирующими предпочтительность кодонов в клетке хозяина, использованной для экспрессии белка, или другие изменения последовательности, которые облегчают экспрессию.

Вектор: молекула нуклеиновой кислоты, введенная в клетку, в результате чего получается трансформированная клетка. Вектор может содержать последовательности нуклеотидов, которые позволяют ему реплицироваться в клетке, такие как точка начала репликации. Вектор может также содержать один или несколько селекционируемых маркерных генов и другие генетические элементы, известные специалистам.

Обзор биосинтетических путей

Как показано на фиг. 1-3 и 11-13, для получения монатина или промежуточных продуктов его биосинтеза, таких как индол-3-пируват или ПМ, можно использовать разные пути биосинтеза. Для превращения каждого из субстратов (глюкоза, триптофан, индол-3-лактат, индол-3-пируват и ПМ) в каждый продукт (триптофан, индол-3-пируват, ПМ и монатин) можно использовать несколько разных полипептидов. Кроме того, эти реакции можно проводить ίη νίνο, ίη νίίτο, или комбинируя реакции ίη νίνο с реакциями ίη νίίτο, например, реакциями ίη νίίτο, которые включают неферментативные химические реакции. Таким образом, фиг. 1-3 и 11-13 являются примерными и показывают разнообразные множественные пути, которые можно использовать для получения желаемых продуктов.

Превращение глюкозы в триптофан

Многие организмы способны синтезировать триптофан из глюкозы. Конструкт(ы), содержащий ген(ы), необходимые для получения монатина, ПМ и/или индол-3-пирувата из глюкозы и/или триптофана, можно клонировать в таких организмах. В настоящем документе показано, что триптофан можно превратить в монатин.

В других примерах организм конструируется с помощью известных полипептидов для продукции триптофана или гиперпродукции триптофана. Например, патент США Νο. 4371614 (в настоящем документе цитируется по ссылке) описывает штамм Е. сοI^, трансформированный плазмидой, содержащий оперон триптофана дикого типа.

Максимальные титры триптофана, указанные в патенте США Νο 4371614 составляют примерно 230 ррт. Аналогичным образом и заявка XVО 87011130 (здесь цитируется по ссылке) описывает штамм Ε^οΐί. который генетически сконструирован для получения триптофана, и обсуждает увеличение ферментативной продукции Ь-триптофана. Специалисты узнают, что организмы, способные продуцировать триптофан из глюкозы также способны утилизовать другие углеродные и энергетические ресурсы, которые могут превращать глюкозу или фруктозо-6-фосфат с такими же результатами. Примерами углеродных и энергетических ресурсов могут служить сахароза, фруктоза, крахмал, целлюлоза, глицерин и др.

Превращение триптофана в индол-3-пируват

Некоторые полипептиды можно использовать для превращения триптофан в индол-3-пируват. Примерами таких полипептидов могут служить ферменты, относящиеся по Международной классификации (ЕС) к классам 2.6.1.27, 1.4.1.19, 1.4.99.1, 2.6.1.28, 1.4.3.2, 1.4.3.3, 2.6.1.5, 2.6.1.-, 2.6.1.1, и 2.6.1.21. Эти классы включают полипептиды, называемые триптофан-аминотрансфераза (называемая также Ьфенилаланин-2-оксоглутарат-аминотрансфераза, триптофантрансаминаза, 5-гидрокситриптофанкетоглутарат-трансаминаза, гидрокситриптофан-аминотрансфераза, Ь-триптофан-аминотрансфераза, Ьтриптофан-трансаминаза и Е-триптофан-2-оксоглутарат-аминотрансфераза), которые превращают Ьтриптофан и 2-оксоглутарат в индол-3-пируват и Ь-глутамат; Ό-триптофан-аминотрансфераза, которая превращает Ό-триптофан и 2-оксо-кислоту в индол-3-пируват и аминокислоту; триптофан-дегидрогеназа

- 11 009284 (также называемая МЛП(Р)-Ь-триитофан-дегидрогеназа, Ь-триптофан-дегидрогеназа, Ь-Тгрдегидрогеназа, ΤΌΗ и Ь-триитофан:МЛП(Р)-оксидоредуктаза (деаминирующая)), которая превращает Ьтриптофан и ΝΑΌ/Р) в индол-3-пируват и ΝΗ₃ и ΝΑΌ(Ρ)Η; дегидрогеназа Ό-аминокислот, которая превращает Ό-аминокислоты и ΡΑΌ в индол-3-пируват и ΝΗ₃ и ΡΑΌΗ₂; триптофан-фенилпируваттрансаминаза (также называемая триптофан-а-кетоизокапроат-аминотрансфераза и Ьтриптофан:фенилпируват-аминотрансфераза), которая превращает Ь-триптофан и фенилпируват в индол3-пируват и Ь-фенилаланин; оксидаза Ь-аминокислот (также называемая оксидаза офио-аминокислот и Ь-аминокислота:кислород оксидоредуктаза (деаминирующая)), которая превращает Ь-аминокислоту, Н₂О и О₂ в 2-оксокислоту и ΝΗ₃ и Н₂О₂; оксидаза Ό-аминокислот (также называемая оксидаза офиоаминокислот и Ό-аминокислота: кислород оксидоредуктаза (деаминирующая)), которая превращает Όаминокислоту, Н₂О и О₂ в 2-оксокислоту и ΝΗ₃ и Н₂О₂; и триптофан-оксидаза, которая превращает Ьтриптофан, Н₂О и О₂ в индол-3-пируват, ΝΗ₃ и Н₂О₂. Эти классы включают также тирозин (ароматическую) аминотрансферазу, аспартат-аминотрансферазу, Ό-аминокислот (или Ό-аланин) аминотрансферазу, и аминотрансферазу широкого спектра (множественных субстратов), которая проявляет множественную аминотрансферазную активность, и, в частности, может превращать триптофан и 2-оксокислоту в индол-3-пируват и аминокислоту.

Одиннадцать ферментов класса аминотрансфераз, которые имеют такую же активность, описаны ниже в примере 1, в том числе новая аминотрансфераза, представленная в 8ЕЭ ΙΌ №: 11 и 12. Поэтому данное изобретение представляет изолированные нуклеотидные и белковые последовательности, которые имеют не менее 80%, не менее 85%, не менее 90%, не менее 95%, не менее 98%, или даже не менее 99% идентичность с последовательностями 8ЕЭ ΙΌ №: 11 и 12. Кроме того, входящие в состав этого изобретения фрагменты и продукты слияния 8ЕЭ ΙΌ №: 11 и 12, которые сохраняют активность аминотрансферазы или кодируют белок с аминотрансферазной активностью. Примерами фрагментов могут служить, в частности, непрерывные нуклеотидные фрагменты длиной не менее 10, 12, 15, 20, 25, 50, 100, 200, 500 или 1000 нуклеотидов из 8ЕЭ ΙΌ №: 11 или непрерывные цепочки длиной не менее 6, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 200, 300 или 350 аминокислот из 8ЕЭ ΙΌ № 12. Раскрываемые последовательности (и соответствующие варианты, фрагменты и фузионные белки) могут быть частью вектора. Вектор можно использовать для трансформации клеток хозяина, продуцируя тем самым рекомбинантные клетки, которые могут синтезировать индол-3-пируват из триптофана, а в некоторых примерах продолжать синтез дальше до ПМ и/или монатина.

Известны оксидазы Ь-аминокислот (1.4.3.2), и их последовательности можно получить из разных источников, таких как У1рега 1еЬе1ше (кр Р81375), ОрЫорйадик йапиай (кр Р81383), Адк1к1гобоп гйобок1ота (кр Р81382), Сго1а1ик а!гох (кр Р86742), ВигкНоИепа серааа, АгаЫйоркЬ 1йайапа, Саи1оЬае1ег сгекеп1ик, СЫатуботопак гешйагШи, Мик тикси1ик, Ркеиботопак куппдае и РНойососсик 81г. Кроме того, в литературе описаны и могут быть выделены триптофан-оксидазы, например, из Сорппшк кр. 8Р-1, китайской капусты с болезнью клубней, АгаЫборкщ ШаНапа. и печени млекопитающих. Ниже в примере 3 обсуждается один фермент из класса оксидаз Ь-аминокислот, который превращает триптофан в индол-3пируват, а также альтернативные источники для молекулярного клонирования. Многие гены оксидаз Όаминокислот помещены в доступные базы данных для молекулярного клонирования.

Известны триптофан-дегидрогеназы, и их можно выделить, например, из шпината, Р1кит кайуит, Ргокорщ щИПот, гороха, пшеницы, маиса, томата, табака, СНготоЬас1егшт ую1асеит и Ьас1оЬас1Ш. Известны последовательности многих дегидрогеназ Ό-аминокислот.

Как показано на фиг. 11-13, если для превращения триптофана в индол-3-пируват используется оксидаза аминокислот, например триптофан-оксидаза, то для снижения или даже устранения перекиси водорода можно добавить каталазу.

Превращение индол-3-лактата в индол-3-пируват

Реакция, которая превращает индол-3-лактат в индол-3-пируват, может катализироваться различными полипептидами, такими как полипептиды классов 1.1.1.110, 1.1.1.27, 1.1.128, 1.1.2.3, 1.1.1.222, 1.1.1.237, 1.1.3.- или 1.1.1.111. Класс полипептидов 1.1.1.110 включает индоллактат-дегидрогеназы (также называемые индоллактат^АО⁺-оксидоредуктаза). Классы 1.1.1.27, 1.1.1.28 и 1.1.2.3 включают лактатдегидрогеназы (также называемые лактат-дегидрогеназы, лактат^АО⁺-оксидоредуктаза). Класс 1.1.1.222 содержит (В)-гидроксифениллактат-дегидрогеназу (также называемую Ό-ароматическая лактат дегидрогеназа, В-ароматическая лактат-дегидрогеназа и В-3-(4-гидроксифенил)-лактат^АО(Р)⁺-2оксидоредуктаза), а класс 1.1.1.237 содержит 3-(4-гидроксифенилпируват)-редуктазу (также называемую гидроксифенилпируват-редуктаза и 4-гидроксифениллактат^АО⁺-оксидоредуктаза). Класс 1.1.3.- содержит лактат-оксидазы, а класс 1.1.1.111 содержит (3-имидазол-5-ил)-лактат-дегидрогеназы (также называемые (8)-3-имидазол-5-ил)-лактат^АО(Р)⁺-оксидоредуктаза). Вероятно, некоторые полипептиды в этих классах способны осуществлять синтез индол-3-пирувата из индол-3-лактата. Примеры такого превращения представлены в примере 2.

Для превращения индол-3-лактата в индол-3-пируват сложно применять и химические реакции. Такие химические реакции включают этап окисления, который можно проводить несколькими способами, например, окисление воздухом с применением катализатора В2 (СЫпа СНеписа! Веройег, ν.13, п28, р.18

- 12 009284 (1), 2002), разбавленного перманганата и перхлората или перекиси водорода в присутствии металлических катализаторов.

Превращение индол-3-пирувата в 2-гидрокси-2-(индол-3-илметил)-4-кетоглутаровую кислоту (ПМ)

Для превращения индол-3-пирувата в ПМ можно использовать несколько известных полипептидов. Такие полипептиды могут принадлежать классам 4.1.3.-, 4.1.3.16, 4.1.3.17 и 4.1.2.-. В эти классы входят углерод-углерод синтазы/лиазы, такие как альдолазы, которые катализируют реакцию конденсации двух субстратов - карбоксиловых кислот. Класс пептидов ЕС 4.1.3.- - это синтазы/лиазы, которые образуют углерод-углеродные связи с использованием в качестве электрофильного агента оксо-кислотных субстратов (таких как индол-3-пируват), тогда как класс ЕС 4.1.2.- - это синтазы/лиазы, которые образуют углерод-углеродные связи с использованием в качестве электрофильного агента альдегидных субстратов (таких как бензальдегид).

Например, полипептид, описанный в ЕР 1045-029 (ЕС 4.1.3.16, 4-гидрокси-2-оксоглутаратглиоксилат-лиаза, также называемая 4-гидрокси-2-оксоглутарат-альдолаза, 2-оксо-4-гидроксиглутаратальдолаза или КГГ-альдолаза), превращает глиоксиловую кислоту и пируват в 4-гидрокси-2кетоглутаровую кислоту и полипептид 4-гирокси-4-метил-2-оксоглутарат-альдолаза (ЕС 4.13.17, также называемая 4-гидрокси-4-метил-2-оксоглутарат пируват-лиаза или РгоА-альдолаза), конденсирует две кето-кислоты, такие как два пирувата в 4-гидрокси-4-метил-2-оксоглутарат. Реакции с использованием таких лиаз описаны в настоящем документе.

На фиг. 1-2 и 11-13 показаны схематические изображения этих реакций, при которых 3-углеродная молекула (С3) соединяется с индол-3-пируватом. Многие представители классов ЕС 4.1.2.- и 4.1.3.-, в частности, ПФ-утилизирующие полипептиды, могут использовать С3-молекулы, которые являются аминокислотами, такими как серин, цистеин и аланин или их производные. Реакции альдольной конденсации, катализируемые представителями ЕС 4.1.2.- и 4.1.3.-, требуют, чтобы трехуглеродной молекулой был пируват или его производное. Однако и другие вещества могут служить источником трехуглеродной цепочки и превращаться в пируват. Аланин может трансаминироваться многими ПФ-утилизирующими трансаминазами, включая многие из тех, что были упомянуты выше, и превращаться в пируват. Пируват и аммоний могут быть получены в результате реакции бета-элиминации (например, катализируемой, триптофаназой или β-тирозиназой) Ь-серина, Ь-цистеина, и производных серина и цистеина с соответсвующими группами, таких как О-метил-Ь-серин, О-бензил-Ь-серин, 8-метилцистеин. 8-бензилцистеин, δ-алкил-Ь-цистеин, О-ацил-Ь-серин, и 3-хлор-Ь-аланин. Аспартат может служить источником пирувата в ПФ-опосредованных бета-лиазных реакциях, таких как катализируемые триптофаназой (ЕС 4.1.99.1) и/или β-тирозиназой (ЕС 4.1.99.2. также называемой тирозин-фенол-лиаза).

Скорость бета-лиазных реакций можно увеличить с помощью сайт-направленного мутагенеза полипептидов классов 4.1.99.1-2 как описано в работе Мсшаки с соавт. (1. Βίο1. СНет. 274:1320-1325, 1999) и в примере 8. Эти модификации позволяют полипептидам воздействовать на дикарбоксильные аминокислоты в качестве субстратов. Лактат также может служить источником пирувата, и он окисляется до пирувата при добавлении лактат-дегидрогеназы и окисляющего кофактора или лактат-оксидазы и кислорода. Примеры подобных реакций приведены ниже. Например, как показано на фиг. 2 и фиг. 11-13, РгоА альдолаза может контактировать с индол-3-пируватом, если в качестве С3-молекулы используется пируват.

ПМ также может образоваться в результате химических реакций, например, альдольной конденсации, представленной в примере 5.

Превращение ПМ в монатин

Превращение ПМ в монатин может катализироваться одним или несколькими из следующих ферментов: триптофан-аминотрансферазы (2.6.1.27), триптофан-дегидрогеназы (1.4.1.19), дегидрогеназы Όаминокислот (1.4.99.1), глутамат-дегидрогеназы (1.4.1.2-4), фенилаланин-дегидрогеназа (ЕС 1.4.1.20), триптофан-фенилпируват-трансаминазы (2.6.1.28), или чаще представителями семейства аминотрансфераз (2.6.1.-), такими как аспартат-аминотрансфераза (ЕС 2.6.1.1), тирозин (ароматическая) аминотрансфераза (2.6.1.5), Ό-триптофан-аминотрансфераза или Ό-аланин (2.6.1.21) аминотрансфераза (фиг. 2). Ниже описаны одиннадцать представителей класса аминотрансфераз (пример 1), включая новый фермент этого класса, описанный в 8ЕО Ш №: 11 и 12, а реакции, демонстрирующие активность ферментов аминотрансферазы и дегидрогеназы, представлены в примере 7.

Эта реакция может быть проведена и химическими способами. Аминирование кетокислоты (ПМ) проводится восстановительным аминированием с помощью аммония и цианоборгидрида натрия.

На фиг. 11-13 показаны другие полипептиды, которые можно использовать для превращения ПМ в монатина также для увеличения выхода монатина при получении его из индол-3-пирувата или триптофана. Например, если в качестве донора аминогруппы используется аспартат, то для превращения аспартата в оксалоацетат можно использовать аспартат-аминотрансферазу (фиг. 11). Оксалоацетат превращается в пируват и двуокись углерода под действием декарбоксилазы, например оксалоацетат-декарбоксилазы (фиг. 11). Кроме того, если в качестве донора аминогруппы используется лизин, то для превращения лизина в аллизин можно использовать лизин-эпсилон-аминотрансферазу (фиг. 12). Аллизин спонтанно пре

- 13 009284 вращается в 1-пиперидин-6-карбоксилат (фиг. 12). Если для превращения ПМ в монатин используется полипептид, способный катализировать реакции восстановительного аминирования (например, глутаматдегидрогеназа), то можно использовать полипептид, который способен осуществлять рециклизацию ΝΑΌ(Ρ)Η и/или продуцировать летучий продукт (фиг. 13), например формиат-дегидрогеназу.

Дополнительные замечания по устройству биосинтетических путей

В зависимости от того, какие полипептиды используются для образования индол-3-пирувата, ПМ и/или монатина, для повышения выхода продукта реакции продуцирующей клетке можно предоставить кофакторы, субстраты и/или дополнительные полипептиды.

Удаление перекиси водорода

Перекись водорода (Н₂О₂) - это продукт, который в случае его образования является токсичным для продуцирующих клеток и может повредить полипептиды или получающиеся промежуточные продукты. Оксидаза Ь-аминокислот, описанная выше, образует Н₂О₂ в качестве одного из продуктов. Поэтому при применении оксидазы Ь-аминокислот образующуюся Н₂О₂ можно удалять или снижать ее концентрацию, чтобы уменьшить уровень повреждения клеток или продуктов.

Для снижения уровней Н₂О₂ в клетке можно использовать каталазы (фиг. 11-13). Продуцирующая клетка может экспрессировать ген или последовательность кДНК, которая кодирует каталазу (ЕС 1.11.1.6), катализирующую разложение перекиси водорода на воду и газооразный кислород. Например, каталазу может экспрессировать вектор, трансфицированный в продуцирующую клетку. В качестве примера каталаз, которые используются для этого, можно назвать, но не ограничиваясь, следующие: 1г|О9ЕУ50 (Б1арйуйсоссик ху1окик), 1г|О9КВЕ8 (ВасШик йа1обигапк), 1г|О9ЬВ17 (СапФба а1Ысапк), 1г|Р77948 (Б1гер1отусек соейсо1ог), 1г|О9РВ15 (Хап1йошопак сашрекйтк) (приведены номера Ассеккюп № по базе данных Б\\зккРго1). Биокаталитические реакторы, исолпьзующие оксидазу Ь-аминокислот, оксидазу Ό-аминокислот или триптофан оксидазу также могут содержать полипептид каталазу.

Модулирование доступности ПФ (пиридоксаль-5'-фосфата)

Как показано на фиг. 1, ПФ может применяться на одном или нескольких этапах биосинтеза, описанных в настоящем документе. Концентрация ПФ может быть увеличена, чтобы ПФ не стал лимитирующим фактором проведения реакции.

Биосинтетический путь для витамина В₆ (предшественника ПФ) хорошо изучен на примере Е. сой и некоторые участвующие в нем белки выделены в кристаллическом виде (ЬаЬог с соавт., ГЕВБ Ьейегк, 449:45-48, 1999). В других метаболических путях участвуют два гена (ерб или дарВ и кегС), в то время как только для биосинтеза пиридоксаль-фосфата требуется три гена (рбхЛ, рбхВ шрбх1). Одним из стартовых материалов для пути Е. сой является 1-дезокси-О-ксилозо-3-фосфат (ΌΧΡ). Синтез этого предшественника из общих 2- и 3-углеродных центральных метаболитов катализируется полипептидом 1дезокси-Э-ксилозо-5-фосфат синтазой (Ό8Χ). Другим предшественником является производное треонина, полученное из 4-углеродного сахара, Ό-эритрозо 4-фосфата. Гены, необходимые для превращения в фосфо-4-гидроксил-Ь-треонин (НТР), - ерб, рахВ и кегС. Последняя реакция для образования ПФ - сложная внутримолекулярная конденсация и реакция замыкания кольца между ΌΧΡ и НТР, катализируемая продуктами генов рбхЛ и рбхГ

Если ПФ становится лимитирующим фактором в процессе ферментации при продукции монатина, повышенная экспрессия одного или нескольких генов, отвечающих за синтез в продуцирующей клетке хозяина, может быть использована для увеличения выхода монатина. Организм хозяина может содержать множественные копии генов его нативных путей, или копии генов ненативных путей можно включить в геном хозяина. Кроме того, множественные копии генов усовершенствованных метаболических путей можно встроить в организм хозяина.

Один из усовершенствованных путей, который сохраняется во всех организмах, повторно использует различные производные витамина В6 и переводит их в активную форму ПФ. Полипептиды, участвующие в этом пути, -рбхК киназа, рбхН оксидаза, рбхУ киназа. Гиперэкспрессия одного или нескольких из этих генов может увеличить доступность ПФ.

Уровни витамина В₆ можно увеличить путем удаления или подавления метаболической регуляции генов, отвечающих за нативные биосинтетические пути в организме хозяина. ПФ подавляет полипептиды, вовлеченные в биосинтез предшественника - производного треонина в бактериях Г1ауоЬас1егшш кр., штамм 238-7. Этот штамм, освобожденный от метаболического контроля, осуществляет гиперпродукцию пиридоксальпроизводных и может выделять до 20 мг/л ПФ. Сходные генетические манипуляции с организмом хозяина, продуцирующего монатин, позволят повысить продукцию ПФ без гиперэкспрессии генов биосинтетических путей.

Утилизация аммония

Реакции с участием триптофаназы можно проводить в направлении синтеза (продукция триптофана из индола), если сделать аммоний более доступным, или путем удаления воды. Реакции восстановительного аминирования, например, катализируемые глутамат-дегидрогеназой, также могут быть направлены в одну сторону избытком аммония.

Доступность аммония можно повысить путем добавления солей карбоната аммония или фосфата аммония в карбонат- или фосфат-буферной системе. Аммоний также можно ввести в виде пирувата ам

- 14 009284 мония или формиата аммония. Другим способом аммоний можно доставить, если реакция проводится в сопряжении с реакцией образования аммония, например, с участием глутамат-дегидрогеназы или триптофан-дегидрогеназы. Аммоний может образоваться при добавлении натуральных субстратов для ЕС 4.1.99.-(тирозин или триптофан), которые будут гидролизованы до фенола или индола, пирувата и ΝΗ₃. Это также даст возможность повысить выход продуктов синтеза по сравнению с нормальным равновесным количеством за счет предоставления возможности ферменту гидролизовать свой предпочтительный субстрат.

Удаление продуктов и побочных продуктов

Превращение триптофана в индол-3-пируват через триптофан-аминотрансферазу может оказать побочный эффект в виде влияния на скорость продукции индол-3-пирувата, так как реакция приводит к образованию глутамата и требует наличия косубстрата 2-оксоглутарата (α-кетоглутарата). Глутамат может вызвать подавление аминотрансферазы, и в результате реакции будет уничтожено большое количество косубстрата. Кроме того, высокие концентрации глутамата мешают дальнейшим процессам разделения.

Полипептид глутамат-дегидрогеназа (СЬОН) превращает глутамат в 2-оксоглутарат, приводя к повторному использованию этого косубстрата в реакции, катализируемой триптофан-аминотрансферазой. Кроме того, СЬОН образует восстановленных эквивалентов (ΝΑΌΗ или ΝΑΌΡΗ), которые могут использоваться в качестве источников энергии в клетке в аэробных условиях. Утилизация глутамата ферментом СЬОН также уменьшает образование побочных продуктов. К тому же в результате реакции образуется аммоний, который служит источником азота для клетки или субстратом для восстановительного аминирования на заключительном этапе, показанном на фиг. 1. Поэтому клетка-продуцент, которая производит гиперэкспрессию СЬОН-полипептида, может использоваться для увеличения выхода и снижения стоимости сред и/или процессов разделения.

На пути превращения триптофана в монатин донор аминогруппы на этапе 3 (например, глутамат или аспартат) может быть вновь превращен в аминоакцептор для этапа 1 (например, 2-оксоглутарат или оксалоацетат), если используется аминотрансфераза из соответствующего класса ферментов. Использование двух разных трансаминаз для этого пути, где субстрат одной трансаминазы неконкурентно подавляет активность другой трансаминазы, может увеличить эффективность этого пути.

Многие из реакций описанных путей обратимы и поэтому достигнуто равновесие между субстратами и продуктами. Выход продукта на этом пути может быть увеличен путем постоянного удаления продуктов от полипептидов. Например, секреция монатина в ферментационный бульон с помощью пермеазы или другого транспортного белка или избирательной кристаллизации монатин из потока биокаталитического реактора с сопутствующим повторным использованием субстратов увеличит выход реакции.

Удаление побочных продуктов с помощью добавочных каталитических реакций или путем замещения донорских аминогрупп - еще один способ увеличения выхода реакции. Несколько примеров на эту тему обсуждаются в примере 13 и показаны на фиг. 11-13. В идеале в ходе реакции образуется побочный продукт, который не доступен для реакции в обратном направлении, либо из-за фазового перехода (испарение) или благодаря спонтанному превращению в нереагирующий конечный продукт, например, двуокись углерода.

Модулирование субстратных пулов

Пул индола можно модулировать путем увеличения продукции предшественников триптофана и/или изменения катаболических путей, использующих индол-3-пируват и/или триптофан. Например, продукция индол-3-уксусной кислоты из индол-3-пирувата может быть снижена или прекращена при функциональном отключении гена, кодирующего фермент класса ЕС 4.1.1.74 в клетке хозяина. Продукция индола из триптофана может быть снижена или прекращена при функциональном отключении гена, кодирующего фермент класса ЕС 4.1.99.1 в клетке хозяина. Альтернативно, избыток индола можно утилизовать в качестве субстрата в процессах ίη νίίΐΌ или ίη νί\Ό в комбинации с повышенным количеством гена, кодирующего фермент класса ЕС 4.1.99.1 (Ка^а§ак1 с соавт., 1. Ретт. и Вюепд. 82:604-6, 1996). Можно провести генетические модификации для увеличения уровня промежуточных продуктов, таких как П-эритрозо-4-фосфата и хоризмата.

Синтез триптофана регулируется у большинства организмов. Один из механизмов осуществляется через подавление обратной связи для некоторых ферментов этого метаболического пути; поскольку уровень триптофана возрастает, скорость его синтеза снижается. Так, при использовании клеток хозяина, сконструированных для продукции монатина через промежуточный продукт триптофан, можно использовать организм, который нечувствителен к концентрациям триптофана. Например, штамм Са111агап11ш5 гокеи, который устойчив к подавлению роста разными аналогами триптофана, был выведен путем повторного воздействия высокими концентрациями 5-метилтриптофана (8сйа11епЬетд, ВеНтХ.ШШгГогесН 34:541-5,1979). На активность полученной триптофан-синтазы их этого штамма мало влияет подавление продуктом, благодаря наличию мутаций в гене. Аналогичным образом можно оптимизировать клетку хозяина, используемую для продукции монатина.

Продукцию триптофана можно оптимизировать с помощью эволюции, направленной на выявление

- 15 009284 полипептидов, которые менее чувствительны к подавлению их продуктами реакций. Например, можно провести скрининг на плашках, среда в которых не содержит триптофана, но обогащена неметаболизируемыми аналогами триптофана в высоких концентрациях. Патенты США № 5756345, 4742007 и 4371614 описывают способы повышения продуктивности ферментационных организмов по триптофану. Последним этапом биосинтеза триптофана является присоединение серина к индолу; потому для увеличения продукции триптофана можно увеличить доступность серина.

Количество монатина, продуцируемого ферментационным организмом, может быть увеличено путем повышения количества пирувата, синтезируемого в организме хозяина. Некоторые дрожжи, такие как ТпсНохрогоп сЫапеит (\Уапд с соавт., Ье11. Арр1 МюгоЬю1 35:338-42,2002) и Тоги1ор818 §1аЬга1а (Ы с соавт., Арр1 МюгоЬю1. Вю1ес11по1. 57:451-9,2001) осуществляют гиперпродукцию пирувата и могут быть использованы для реализации способов, изложенных в настоящем документе. Кроме того, можно провести генетические модификации организмов, способствующие продукции пировиноградной кислоты, такие как в случае с штаммом Е.со11 \У1485кр2 (Катакай с соавт. 1. Бегт. и Вюепд. 82:604-6,1996).

Контроль хиральности

Вкусовой профиль монатина можно изменить, управляя стереохимическими параметрами (хиральностью) этой молекулы. Например, разные изомеры монатина могут требоваться в разных концентрациях для разных пищевых систем. Хиральность можно контролировать с помощью комбинации рН и полипептидов.

Рацемизация в положении С-4 монатина (см. выше на рисунке) может возникнуть в результате депротонизации и репротонизации альфа-углерода, что может произойти при сдвиге рН или в результате реакции с кофактором ПФ. Маловероятно, что у микроорганизма произойдет смещение рН, достаточное для осуществления рацемизации, но ПФ находится в избытке. Способы контроля хиральности полипептидами зависят от биосинтетического пути, использующего продукцию монатина.

Если монатин образуется в результате реализации пути, представленного на фиг. 2, можно рассмотреть следующий вариант. При биокаталитической реакции хиральность углерода-2 определяется ферментом, который превращает индол-3-пируват в ПМ. Многие ферменты (например, из классов ЕС 4.1.2.-, 4.1.3.-) могут превращать индол-3-пируват в ПМ. Поэтому можно выбрать фермент, который образует нужный изомер. Альтернативно, энантиоспецифичность фермента, который превращает индол-3-пируват в ПМ можно модифицировать путем направленной эволюции или с помощью каталитических антител катализирующих нужную реакцию. Как только получен ПМ (ферментативным путем или в результате химической конденсации), можно стереоспецифически добавить аминогруппу с помощью одной из трансаминаз, описанных в настоящем документе. К-или 8-конфигурация углерода-4 может быть создана в зависимости от того, используется для проведения реакции аминотрансфераза Ό- или Ь-ароматических аминокислот. Большинство аминотрансфераз специфически действуют на Ь-изомер. однако в некоторых растениях имеются Ό-триптофан аминотрансферазы (КоЫЬа, Мйо, Ргосеебшдк о£ 1Не 8(Н 1п1егпа1юпа1 8утро§шт оп Уйатш В₆ и СагЬопу1 Са1а1у8Щ, г. Осака, Япония, 1990). Кроме того, идентифицированы Ό-аланин аминотрансфераза (2.6.1.21), Ό-метионин-пируват-аминотрансфераза (2.6.1.41), а также (К)-3амино-2-метилпропаноат-аминотрансфераза (2.6.1.61) и (8)-3-амино-2-метилпропаноат-аминотрансфераза (2.6.1.22). Некоторые аминотрансферазы могут воспринимать субстрат для этой реакции только в конкретной конфигурации С2-углерода. Поэтому, даже если превращение в ПМ не является стереоспцифическим, стереохимия конечного продукта может контролироваться благодаря правильному выбору трансаминазы. Поскольку эти реакции обратимы, то непрореагировавший ПМ (нежелательный изомер) может разлагаться на исходные составные части и рацемическую смесь ПМ можно приготовить заново.

Активация субстратов

Фосфорилированные субстраты, такие как фосфоенолпируват (РЕР), можно использовать в реакциях, описанных в настоящем документе. Фосфорилированные субстраты могут оказаться энергетически более предпочтительными, и поэтому могут использоваться для увеличения скорости и/или выхода реакции. В реакциях альдольной конденсации добавление фосфатной группы стабилизирует нуклеофильный субстрат, делая его более реакционноспособным. В других реакциях, фосфорилированный субстрат часто обеспечивает более удобное удаление группы. Аналогичным образом субстраты можно активировать путем превращения их в производные СоА или пирофосфатов.

- 16 009284

Пример 1. Клонирование и экспрессия триптофан-аминотрансферазы.

В этом примере описаны способы, которые используются для клонирования триптофанаминотрансфераз, которые можно применять для превращения триптофана в индол-3-пируват.

Обзор экспериментальных данных

Одиннадцать генов, кодирующих аминотрансферазы, клонированы в Ε.εοίί. Этими генами были Όаланин-аминотрансфераза (ба!, беиЬаик Ассе88юи Νο. Υ14082.1 п.н. 28622-29470 и беиЬаик Ассе88юи Νο. ΝΡ 388848.1, нуклеотидная и аминокислотная последовательности, соответственно) из ВасШиз зиЬ41118, тирозин-аминотрансфераза (1а1Л. 8ΕΟ ГО №: 1 и 2, нуклеотидная и аминокислотная последовательности, соответственно) из 8ίηο6ιίζοΝιιιη теШоб (также называемого ВЫзоЬбаи теШоб), тирозинаминотрансфераза (1а1Л заявлена по гомологии, 8ΕΟ ГО №: 3 и 4, нуклеотидная и аминокислотная последовательности, соответственно), из Κ1ιο6οΕ3^γ 8рйаего1бе8 штамм 2.4.1, тирозин аминотрансфераза (заявлена по гомологии, 8ΕΟ ГО №: 5 и 6, нуклеотидная и аминокислотная последовательности соответственно) из В. 8рйаего1бе8 35053, аминотрансфераза широкого спектра действия (Ьза!, заявлена по гомологии с фрагментами пептида из Ь.техюаиа, 8ΕΟ ГО №: 7 и 8, нуклеотидная и аминокислотная последовательности, соответственно) из Ьехзйташа та.щг, ароматическая аминотрансфераза (агаТ, заявлена по гомологии, 8ΕΟ ГО №: 9 и 10, нуклеотидная и аминокислотная последовательности, соответственно) из ВасШиз 8иЬШ18; ароматическая аминотрансфераза (агаТ заявлена по гомологии, 8ΕΟ ГО №: 11 и 12, нуклеотидная и аминокислотная последовательности, соответственно) из ЬасФЪасШиБ ату1ονο^и8, аминотрансфераза множественных субстратов (заявлена по гомологии, 8ΕΟ ГО №: 13 и 14, нуклеотидная и аминокислотная последовательности, соответственно) из В. 8рйаего1бе8 35053, аминотрансфераза множественных субстратов (т8а заявлена по гомологии, беиЬаик Ассе88юи Νο. ΑΑΑΕ01000093.1, п.н. 1474316155 и беиЬаик Ассе88юи Νο. ΖΡ00005082.1, нуклеотидная и аминокислотная последовательности, соответственно) из Κ1ιο6ο^·κΝγ 8рйаего1бе8 штамм 2.4.1, аспартат-аминотрансфераза (а8рС, беиЬаик Ассе88юи Νο. ΑΕ000195.1 п.н. 2755-1565 и беиЬаик Ассе88юи Νο. ААС74014.1, нуклеотидная и аминокислотная последовательности (соответственно) из Ε8θκΓχ1ιίη отН и тирозин аминотрансфераза (1угВ, 8ΕΟ ГО №: 31 и 32, нуклеотидная и аминокислотная последовательности, соответственно) из Е. той.

Гены клонировали, экспрессировали и тестировали на способность превращать триптофан в индол3-пируват параллельно с коммерчески доступными ферментами. Все одиннадцать клонов показали ферментную активность.

Идентификация бактериальных штаммов, которые могут содержать полипептиды с нужной активностью

В базе данных Ν6ΒΙ (Национального Центра биотехнологической информации США) нет ни одного гена, продукт которого носит название триптофан-аминотрансферазы. Однако идентифицированы организмы, обладающие этой ферментативной активностью. Активность Ь-триптофан-аминотрансферазы (ТАТ) измеряли в клеточных экстрактах или в препаратах очищенного белка из следующих источников: ризобактериальный изолят из Ее81иса οсΐοί1ο^а, митохондрии и цитоплазма гороха, клетки подсолнечника, ΒΙιίζοΕίιιιη 1едит^ηο8а^ит сорт ΐπίοίί, Επνίπίη ΙκώΒοίη ру дур8οрЫ1ае, Ρ8еибοтοпа8 8угшдае, АдгоЬасЮпит Ште£ас1еи8, Αζο8р^^^11ит йр£егит & Ь^аζ^1еп8е, ВШегоЬаЛег с^асае, тегоЬабег аддШтегащ, Βπ^ίΓΐιίζοΕίιιιη е1каий, Саиб1ба та1ΐο8а, ΑζοΐοЬасΐе^ уте1аиби, головной мозг крыс, печень крыс, 8^пο^ЫζοЬ^ит те1^1οй, Ρ8еибοтοпа8 Πиο^е8сеп8 СНАО, ^асΐοсοсси8 1асЙ8, ЕасЮЬасШи8 са8е1, Й-асЮЬасШи8 Йе1уебси8, проросшие зерна пшеницы, ячмень, Ρйа8еο1и8 аигеи8 (бобы), 8ассйаготусе8 иуагит (саг18Ьегдеи818), Ее18Йташа 8р., ростки томата, побеги горошка, табак, свинья, С^йНшт 8рο^οдеηе8 и 81герЮтусе8 дп8еи8.

Выделение геномной ДНК для клонирования

8. ιικ1ί1οΙί (АТСС номер 9930) выращивали на среде ΤΥ при 25°С, рН 7,2. Клетки растили до оптической плотности при 600 нм(ОЭ₆₀₀) 1,85 и 2% инокулят использовали для приготовления геномной ДНК. Для выделения геномной ДНК использовали набор О1адеи дегю1шс йр 20/б (Валенсия, Калифорния).

ВасШи8 8иЬ!1118 6051 (АТСС) выращивали при 30°С на питательном бульоне ВегеЮ (Όίίεο; Детройт, Мичиган). Протокол О1адеи дештю йр 20/б использовали для приготовления геномной ДНК со следующими изменениями: концентрации протеиназы К и лизоцима удваивали, а время инкубации увеличивали в 2-3 раза.

Геномную ДНК из Ее18Йташа тащг АТСС 50122 получали от ΙΌΙ, 1ис. (Квебек, Канада) в буфере ТЕ рН 8,0, концентрация 17 нг/мкл.

ВйοбοЬасΐе^ 8р11аегснбе8 2.4.1 (предоставленный профессором Сэмом Капланом, Университет Техаса, г. Хьюстон), В. 8р11аегснбе8 35053 (АТСС) и Ь. ату1ονο^и8-геномную ДНК готовили стандартным способом экстракции фенолом. Клетки собирали на поздней Шд-фазе, ресуспендировали в ТЕ^буфере (10 мМ трис-НС1, рН 7,5, 1 мМ ЭДТА, 100 мМ №1С1) и лизировали добавлением 0,024 мл раствора лаурилсаркозина натрия на мл клеточной суспензии. После экстракции не менее трех раз равным объемом фенола, насыщенного буфером ТЕ (10 мМ трис-НС1, рН 7,5, 1 мМ ЭДТА), раствор ДНК экстрагировали однократно смесью хлороформ-фенол (9:1) и три раза хлороформом. ДНК осаждали добавлением 0,1 объема 3М ацетата натрия, рН 6,8 и 2 объемами этанола. Осадок собирали центрифугированием и про

- 17 009284 мывали 1 раз 70% этанолом. В заключение ДНК растворяли в 0,10 мл дистиллированной воды.

Геномную ДНК из ЕзсйепсЫа сой выделяли из штамма ΌΗ10Β (1пуйгодеп) и готовили с помощью набора 01адеп бепошк-Др™ (500/6). Из 30 мл этого штамма, выросшего в ЬВ до ОЭ₆₅₀ 1,87, получили 0,3 мг очищенной ДНК. Очищенную ДНК растворяли в элюционном буфере 01адеп в концентрации 0,37 мкг/мкл.

Протокол полимеразной цепной реакции

Конструировали праймеры с соответствующим выступом для вектора рЕТ 30 Ха/ЫС вектор (Ыоуадеи, Мэдисон, Висконсин). Вектор рЕТ имеет 12-нуклеотидный одноцепочечный выступ на 5'-стороне от сайта Ха/Ь1С и 15-нуклеотидный одноцепочечный выступ на 3'-стороне от сайта Ха/Ь1С. Конструировали плазмиду для клонирования независимо от сшивки, с Ν-терминальным Н1з и δ-тэгами и дополнительным С-терминальным Н1з-тэгом. Сайт узнавания протеазы Ха (ΙΕ6Β) находится непосредственнно перед стартовым кодоном интересующего гена, так что тэги фузионных белков можно удалить.

Добавляли следующие последовательности к 5'-концам организм-специфических последовательностей при конструировании праймеров:

прямой праймер, 5' 66ТАТТ6А666ТС6С (8ЕО ΙΌ №73);

обратный праймер 5' А6А66А6А6ТТА6А6СС(8Е0 ΙΌ №:74).

ВасШиз 8иЬШ18 ба! праймеры: Ν-конец^' 66ТАТТ6А666ТС6САТ6АА66ТТТТА6ТСААТ66-3' и С-конец: 5'-А6А66А6А6ТТА6А6ССТТАТ6АААТ6СТА6СА6ССТ-3¹ (8ЕО ΙΌ №: 15 и 16).

8тог1и/оЬшт теШой 1а1А праймеры: Ν-конец: 5'-66ТАТТ6А666ТС6САТ6ТТС6АС6СССТ С6ССС6 и С-конец: 5'-А6А66А6А6ТТА6А6ССТСА6А6АСТ66Т6ААСТТ6С (8ЕО ΙΌ №: 17 и 18).

ВасШиз зиЬййз агаТ праймеры: Ν-конец: 5'-66ТАТТ6А666ТС6ССАТ66ААСАТТТ6СТ6ААТСС и С-конец: 5'-А6А66А6А6ТТА6А6ССТТАААС6СС6ТТ6ТТТАТС6 (8ЕО ΙΌ №: 19 и 20).

В1обоЬас!ег зрйаегснбез тза (и 2.4.1, и 35053): Ν-конец: 5'-66ТАТТ6А666ТС6САТ6С6С6А6 ССТСТТ6СССТ и С-конец: 5'-А6А66А6А6ТТА6А6ССТСА6СС6666АА6СТСС666 (8ЕО ΙΌ №: 21 и 22).

й^зИташа та.)ог Ьза! Ν-конец: 5-66ТАТТ6А666ТС6САТ6ТССАС6СА66С66ССАТ и Сконец: 5'-А6А66А6А6ТТА6А6ССТСАС^АС6АТТСАСАТТ6С (8ЕО ΙΌ №: 23 и 24).

Ьас!оЬасй1из ату1оуогиз агаТ: Ν-конец: 5' 66ТАТТ6А666ТС6САТ6ССА6ААТТА6СТААТ6А и С-конец: 5'-А6А66А6А6ТТА6А6ССТТАТТС6ТССТСТТ6ТАААА (8ЕО ΙΌ №: 25 и 26).

В1обоЬас!ег зрНаегснбез !а!А (и 2.4.1 и 35053 з1гатз): Ν-конец: 5'-66ТАТТ6А666ТС6САТ6 С6СТСТАС6АС66СТСС и С-конец: 5'-А6А66А6А6ТТА6А6ССТСА6СС6С6СА6САССТТ66 (8ЕО ΙΌ №: 27 и 28).

ЕзсйейсЫа со11 азрС: Ν-конец: 5'-66ТАТТ6А666ТС6САТ6ТТТ6А6ААСАТТАСС6С-3' и Сконец: 5'-А6А66А6А6ТТА6А6ССТТАСА6САСТ6ССАСААТС6-3' (8ЕО ΙΌ №: 29 и 30).

ЕзсйепсЫа сой !угВ: Ν-конец: 5'-66ТАТ6А666ТС6С6Т6ТТТСААААА6ТТ6АС6С и С-конец: 5'-А6А66А6А6ТТА6А6ССТТАСАТСАСС6СА6САААС6-3¹ (8ЕО ΙΌ №: 33 и 34).

Ген из 8. тей1о!1 (1а1А) амплифицировали с помощью следующего протокола ПЦР: использовали в 50 мкл реакц. 0,1-0,5 мкг матрицы, 1,5 мкМ каждого праймера, 0,4 мМ каждого б№ТР, 3,5 и высокоточной полимеразы Ехрапб (Восйе, [пб1апаро11з, ΙΝ), и 1Х Ехрапб™ буфер с Мд. Использованная программа термоциклера включала горячий старт при 96°С в течение 5 мин с последующими 29 повторами следующих этапов: 94°С в течение 30 с, 55°С в течение 2 мин и 72°С в течение 2,5 мин. После 29 повторов образец выдерживали при 72°С в течение 10 мин и затем хранили при 4°С. Этот ПЦР-протокол давал продукт размером 1199 п.н.

Последовательности генов из В.зрйаего1без (тза и 1а1А), Ь. ату1оуогиз агаТ, и ВасШиз агаТ амплицифировали с помощью следующего протокола ПЦР. Добавляли в 50 мкл реакц. 0,1-0,5 мкг матрицы, 1,5 мкМ каждого праймера, 0,4 мМ каждого бЭТР, 3,5 ед. полимеразы Ехрапб Н1дй Е1бей!у™ и 1Х Ехрапб™ буфер с Мд. Термоциклер включали на горячий старт при 96°С в течение 5 мин с последующими 29 повторами следующих этапов: 94°С в течение 30 с, 40-60°С в течение 1 мин 45 с (градиентный термоциклер) и 72°С в течение 2 мин 15с. После 29 повторов образец выдерживали при 72°С в течение 10 мин и затем хранили при 4°С.

Для каждого гена В. зрйаего1без тза при температурах отжига 42 и 48°С получали множественные продукты, но четкую полосу примерно в районе 1464 п.н. Для Ь. ату1оуогиз агаТ, температуры отжига 42, 48 и 56°С давали единичные продукты с интенсивными полосами в районе 1173 п.н. Для В. зиЬййз агаТ, температуры отжига 40, 45, 50, 55°С давали единичные продукты с интенсивными полосами в 1173 п.н., от обеих геномных ДНК и колоний. Для Ь.та_)ог Ьза! температура отжига 55°С дала чистейший продукт (1239 п.н.). Для генов В1обоЬас!ег зрйаего1без 1а1А температуры отжига 50-55°С давали чистый продукт с правильным размером (1260 п.н.). Для обоих генов Е. сой и гена В.зиЬййз ба! использовали температуры отжига 55-60°С, а время отжига сокращали до 45 с. Получены чистые продукты верного размера (около 1,3 кб для генов Е. сой, и 850 п.н. для гена ба!).

Клонирование

Продукты ПЦР очищали в агарозном геле с 0,8-1% ТАЕ с помощью набора 01адеп де1 ех!гасйоп

- 18 009284 (Валенсия, Калифорния). Продукты ПЦР определяли количественно путем сравнения со стандартами на агарозном геле, а затем обрабатывали Т4 ДНК-полимеразой и рекомендованными протоколами производителя для независимого клонирования ЫдаЕои 1и6ереи6еи1 С1ошид (№уадеи, Мэдисон, Висконсин).

Около 0,2 пмоль очищенного продукта ПЦР обрабатывали 1 ед. Т4 ДНК-полимеразы в присутствии 6СТР в течение 30 мин при 22°С. Полимераза удаляет основания последовательно с З'-концов ПЦРпродукта. Если полимераза встречает гуаниновый остаток, 5'-3'-полимеразная активность фермента нейтрализует экзонуклеазую активность и эффективно препятствует дальнейшему расщеплению. В результате получается одноцепочечные липкие концы, которые совмещаются с вектором рЕТ Ха/Ь1С. Полимераза инактивировали путем инкубации при 75°С в течение 20 мин.

Вектор и обработанную вставку отжигали в соответствии с рекомендациями №уадеп. Около 0,02 пмоль обработанной вставки и 0,01 пмоль вектора инкубировали в течение 5 мин при 22°С, добавляли 625 мМ ЭДТА (конечная концентрация) и повторяли инкубацию при 22°С. Реакцию отжига (1 мкл) добавляли к №уаВ1ие™ единичным компетентным клеткам (№уадеи, Мэдисон, Висконсин) и инкубировали на льду в течение 5 мин. После перемешивания клетки трансформировали тепловым шоком в течение 30 с при 42°С. Клетки помещали на лед на 2 мин и давали восстановиться в 250 мкл при комнатной температуре 8ОС в течение 30 мин при 37°С с встряхиванием при 225 об./мин. Клетки помещали на плашки ЬВ с канамицином (25-50 мкг/мл).

Плазмидную ДНК очищали с помощью набора 01адеи крщ т1шргер и скринировали на наличие правильных вставок, обрабатывая рестриктазами ХНо1 и ХЬа1. Последовательности плазмид с правильными вставками проверяли секвенированием терминирующей ДНК.

8ЕЦ ГО №: 1-14 и 31-32 представляют нуклеотидную и соответствующую аминокислотную последовательность рекомбинантных аминотрансфераз, любые отличия от последовательностей СеиЬаик были либо молчащими, либо проявлялись консервативными заменами в белковой последовательности. 8ЕЦ ГО №: 11 и 12 - это новые последовательности.

Экспрессия генов и способы определения

Плазмидную ДНК, верифицированную с помощью анализа последовательности, субклонировали в экспрессирующие клетки Е. со11 ВЬК(ОЕ3) или ВЬ21(ОЕ3) (№уадеи, Мэдисон, Висконсин). Выращивали культуры и выделяли плазмиды с помощью набора 01адеп т1шргер, а затем проводили рестрикционный анализ для подтверждения идентичности.

Индукцию проводили сначала с Ь. ату1оуогик агаТ, В. киЫШк агаТ, и К.теШоД 1а1Л в клетках ВЬК(ОЕ3) и ВЬ21(ОЕ3). Временное исследование проводили на культурах, растущих на ЬВ с канамицином (30 мг/л) до ΟΌ₆₀₀ от 0,5-0,8, индуцированных 1 мМ 1РТС (изопропилфлуогалактозид) и отобраны через 0, 1, 2 и 4 ч после индукции. Клетки от 2,0 мл ресуспендировали в 0,10 мл 120 мМ трис-НС1, рН 6,8, содержащем 10% додецилсульфат натрия, 10% бета-меркаптоэтанол и 20% глицерин, грели при 95°С в течение 10 мин, охлаждали и разводили 0,10 мл Н2О.

Аликвоты этих образцов с общим клеточным белком анализировали способом электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (δΌδ-РАбЕ) в 4-15% градиентном геле. Не обнаружено существенных различий по количеству белка, экспрессирующегося через 2 и через 4 ч после индукции, а также между клетками ВЬК(ОЕ3) и ВЬ21(ОЕ3).

Кроме того, готовили клеточные экстракты из четырехчасовых образцов путем суспендирования клеточных осадков из 2 мл культуры в 0,25 мл реагента Жуадеп ВидВи81е™, содержащего 0,25 мкл бензоназы нуклеазы, инкубации при комнатной температуре в течение 20 мин с осторожным встряхиванием и центрифугированием при 16,000 х д для удаления клеточных остатков. Супернатанты (клеточные экстракты) вводили на 4-15% градиентные гели для анализа клеточных растворимых белков.

Три клона (Ь. ату1оуогик агаТ (8Еф ГО №: 11 и 12), В. киЫШк агаТ (8Еф ГО №: 9 и 10) и К.теШоЕ 1а(Л (8Еф ГО №: 1 и 2) показали наличие растворимого белка, который соответствует заданному размеру (около 45 кДа). Продукт гена В. киЫШк агаТ был гиперэкспрессирован на самом высоком уровне и/или был более растворим, чем два других белка.

Способами последовательной экспрессии, плазмидную ДНК из положительных клонов субклонировали в клетки ВЬ21(ОЕ3) в связи с повышенными ростовыми характеристиками этих клеток. Повторили индукцию, используя 1 мМ ЕРТС с культурами, растущими на ЬВ с канамицином 50 мг/л, в тот момент, когда ΟΌ₆₀₀ достигла около 0,8. Клетки собирали через 4 роста при 37°С, центрифугировали при 3000 об/мин, в течение 10 мин при 4°С, промывали буфером с ТЕССР (50 мМ трис-НС1 (рН 7,0), 0,5 мМ ЭДТА, 100 мг/л глутатион, 5% глицерин, с полным коктейлем ИосНе с ингибитором протеазы) и замораживали в этаноле при -80°С.

Образцы ресуспендировали в реагенте ВидВи81ег™ (№уадеи) (5 мл/г сырого веса клетки), содержащем 5 мкл/мл коктейля с ингибитором протеазы №3 (Са1ЬюсЬет-ЖуаЬюсЬет Согр., Сан-Диего, Калифорния) и 1 мкг/мл бензоназы нуклеазы. Образцы инкубировали при комнатной температуре в течение 20 мин на вращающемся шейкере. Нерастворимую клеточную взвесь удаляли центрифугированием при 16,000 X д в течение 20 мин при 4°С.

Клеточные экстракты анализировали способом 8Э8-РЛСЕ и определяли активность триптофан

- 19 009284 аминотрансферазы по продукции индол-пирувата по следующему протоколу. Одномиллилитровые реакции проводили с 50 мМ тетрабората натрия (рН 8,5), 0,5 мМ ЭДТА, 0,5 мМ арсената натрия, 50 мкМ пиридоксальфосфата, 5 мМ альфа-кетоглутарата и 5 мМ Ь-триптофана. Реакции инициировали добавлением бесклеточных экстрактов или очищенного фермента и инкубировали 30 мин при 30°С. 20% ТСА (200 мкл) добавляли, чтобы остановить реакцию и осажденный белок удаляли центрифугированием. Измеряли поглощение при 327 нм и сравнивали со стандартной кривой свежеприготовленного раствора индол3-пирувата в буфере определения. Кроме того, проводились контрольные реакции без субстрата триптофана или с использованием бесклеточных экстрактов из клонов, трансформированных одним рЕТ30а.

Из-за наличия фоновой активности нативных аминотрансфераз Е. сой в клеточных экстрактах рекомбинантные белки очищали с помощью картриджей Шз-Вшб в соответствии с протоколами производителя (№уадеп. Мэдисон, Висконсин). Фракции элюента обессоливали на колонках ΡΌ-10 (Атегзйат В1озс1епсез, г.Пискатавей, Нью-Джерси) и элюировали в 50 мМ трис-буфере, рН 7,0. Очищенные белки анализировали способом 8Ό8-ΡΑ6Ε и определяли аминотрансферазную активность.

Результаты индукции при 37°С с 1 мМ 1РТО (4 ч) демонстрируют, что Ь. та)ог Ьза!, 8. теШой !а!А, Е.сой азрС, и оба клона из Я. зрйаегоЫез !а!А показывают значительные уровни активности триптофанаминотрансферазы. Белок агаТ из В. зиЬййз был переэкспрессирован и растворим, но показал низкую ферментативную активность. Продукт гена Ь. ашу1оуогиз агаТ оказался растворимым в клеточном экстракте, но очистка с помощью картриджа Шз-Вшб привела к выходу малого количества белка с нужным молекулярным весом. Продукты гена тза окзались нерастворимыми, и последующие эксперименты с экспрессией проведены при 24°С для минимизации образования инклюзионных телец. Несколько концентраций 1РТС от 10 мкМ до 1 мМ использованы для повышения количества растворимого белка.

В табл. 1 перечислены величины активностей, измеренные в микрограммах образовавшегося индол3-пирувата (ИЗП) на миллиграмм белка в минуту. В некоторых случаях очень небольшое количество рекомбинантного белка показывало высокие уровни активности, которые выходили за пределы эффективного линейного диапазона определения. В этих случаях знак > предшествует величине активности.

Таблица 1. Специфическая активность клонов в клеточных экстрактах (СЕ), очищенного (Р) и коммерческого ферментов

Фермент	Специфическая	Примечание
Ттаюг Л.здГ СЕ	>49..3
ΕπιαίαΐΗχαί Р	>4280
Λ ηιείίΐού ίαΐΑ СЕ	>28.6
5 теШоН ίαίΑ Р	>931
2 4 1 мА СЕ	>41 2
2.4.1 мА Р
35053 МА СЕ	>62.3
35053 МА Р	>486
£. αίκν/ονοη/.ν агаТСЕ	1.26
£. αηιγίονοπιχ агаТ Р	0	мало белка после очистки
В. хиЬИНх ага Т СЕ	0	неоппелепимо
В. хиЬпИхагаТР	1.5-4.5
2.4.1 тха СЕ	2.05	очень мало η-пимого белка
2.4.1 тха Р	0	нет белка пос.пе очистки Н1’я-
35053 тха СЕ	3.97	очень мало о-оимого белка
35053 тха Р	0	нет белка после очистки Ейя-
Е.еоН ахпС (Р!	800
Е.спН ίνκΗ !Р1	1	не очень паствопим
В. χιΜΙίχ П-	2.7	О-тоиптоЛан в качестве
тпансаминаза	22	81вта кат.№ Т 7684
свиная тип 11-А	1.5	81<?тя С7ОО5
свиная, тип I	1	8шта 02751

Выравнивание для сравнения всех клонированных рекомбинатных белков показывает, что между последовательностями генов агаТ, !а!А, Ьза! и тза немного высококонсервативных участков. Выравнивание рекомбинантных белков с более высокой активностью: гомологи продуктов гена Я. зрйаегоЫез !а!А, аминотрансферазы широкого диапазона из Ета)ог и тирозин-аминотрансферазы 8тог1ихоЬшт теШой показало наличие нескольких высококонсервативных участков, однако они всего на 30-43% идентичны по белку. Доступность аминотрансферазы широкого диапазона и Ό-специфической (Ό-аланин) аминотрансферазы может быть полезна при получении других стереоизомеров монатина.

Пример 2. Превращение индол-3-лактат в индол-3-пируват.

Как показано на фиг. 1 и 3, индол-3-лактат можно использовать для получения индол-3-пируват. Превращение лактат в пируват - обратимая реакция, это верно и в отношении превращений между индол-3-пируватом и индол-3-лактатом. Окисление индол-лактата обычно происходит благодаря высокому количеству фона при 340 нм от индол-3-пирувата.

Смесь для стандартного определения содержала 100 мМ фосфат калия, рН 8,0, 0,3 мМ ΝΆΌ', 7 единиц лактат-дегидрогеназы (ЛДГ) (81дта-Ь2395, Сент-Луис, МО) и 2 мМ субстрат в 0,1 мл. Определение проводили дважды на УФ-проницаемой микротитровочной плашке с помощью регистратора Мо1еси1аг

- 20 009284

Оехюез 8рес1гзМзх Р1из. Полипептид и буфер смешивали и с помощью пипетки переносили в ячейки плашки, содержащие индол-3-лактат и ΝΑΌ⁺, после чего поглощение при 340 нм в каждой ячейке считывали через интервалы в 9 с после короткого перемешивания. Реакцию проводили при 25°С в течение 5 мин. Увеличение поглощения при 340 нм сопровождает образование ΝΑΌΗ из ΝΑΌ⁺. Отдельно проводили реакцию для 20 отрицательных контролей без ΝΑΌ⁺ и без субстрата. Оказалось, что Ό-ЛДГ из Ьеи^гюзЮс шезегИегсзбез (81дта, каталожный номер Ь2395) показывает более высокую активность в отношении производных индола в качестве субстратов, чем Ь-ЛДГ из ВасШиз зίеа^οίйе^тοрй^1из (81дта каталожный номер Ь5275).

Аналогичные способы применялись в отношении Ό-лактата и ΝΑΌ⁺ или ΝΑΌΗ и пирувата, естественных субстратов полипептидов Ό-ЛДГ. Величина У_макс для восстановления пирувата оказалась в 1001000 раз выше, чем У_макс для окисления лактата.

Величина У_макс для реакции окисления индол-3-лактата с помощью Ό-ЛДГ была примерно в пять раз меньше, чем для лактата. Наличие индол-3-пирувата также измеряли по изменению поглощения при 327 нм (енол-боратные производные) с использованием 50 мМ натрий-боратного буфера, содержащего 0,5 мМ ЭДТА и 0,5 мМ арсената натрия. Обнаружены небольшие, но воспроизводимые изменения поглощения по сравнению с отрицательным контролем и для Ь, и для Ό-ЛДГ полипептидов.

Кроме того, лактат-дегидрогеназы широкой специфичности (ферменты с активностью, относящейся к классам ЕС 1.1.1.27, ЕС 1.1.1.28, и/или ЕС 1.1.2.3), можно клонировать и использовать для получения индол-3-пирувата из индол-3-лактата. Источниками лактат-дегидрогеназ широкой специфичности являются, в частности, Е. отЬ №1ззепа дοηοπкοеае и ЬзсЮЫзсШиз ркнИагит.

Альтернативно, индол-3-пируват можно получить в результате контакта индол-3-лактата с клеточными экстрактами из С^зРябшт зрο^οдеηез, которые содержат индоллактат-дегидрогеназу (ЕС 1.1.1.110); или клеточными экстрактами из Τ^ураηοзοта сгиз1 ертазб^ез, которые содержат ргидроксифениллактат-дегидрогеназу (ЕС 1.1.1 .222), которая, как известно, обладает активностью в отношении индол-3-пирувата; или клеточными экстрактами из Ρзеи6οтοηаз ас^6ονο^аηз или Е. сοI^, которые содержат имидазол-5-иллактат-дегидрогеназу (ЕС 1.1.1.111); или из Сο1еίа Ы1ите1, которые содержат гидроксифенилпируват-редуктазу (ЕС 1.1.1.237); или СанШба та^за, которые содержат Όароматическую лактат-дегидрогеназу (ЕС 1.1.1.222). Среди источников, описывающих эти виды активности, можно назвать Νο\νκ1<ί с соавт. (ЕЕМ8 МюгоЫю1 Ье11 71:119-24,1992), 1ези и ^еΜοзз (Ск-шабк-ш1. МкгоЫюЬ 14 1968, Сοοίе и Назза11 (Вюсйет. 1. 111: 237-9,1969), СюИезе с соавт. (С.К Зеагоез 8οα ΒίοΙ. Ей. 162 390-5,1968), Ре1егзеи и Α1ίοηη;ιηη (Ζ ^ШНотзсй. С: Вюзск 43: 501-4,1988), ВйаШадаг с соавт. (1. 6еη М1сгоЫю1 135:353-60, 1989). Кроме того, лактат-оксидазу, такую, например, как из Ρзеи6οтοηаз зр. (Ои еί а1. I. Μο1 Сз1з1уз1з В: Еηζутаί^с: 18:299-305, 2002), можно использовать для окисления индол-3лактата в индол-3-пируват.

Пример 3. Превращение Ь-триптофана в индол-3-пируват с использованием оксидазы Ьаминокислот.

В этом примере описываются способы, которые используются для превращения индол-3-пирувата с помощью оксидазы (ЕС 1.4.32), как альтернативы применению триптофан-аминотрансферазы как описано в примере 1. Оксидазу Ь-аминокислот очищали из Сго1а1из бштззиз (81дта, 8ί ^шз, МО, каталожный номер А-2805). Номера последовательностей оксидаз Ь-аминокислот для молекулярного клонирования включают: САО21325.1, ΑΑΌ14831, ΝΡ_490275, ВАВ78253, А38314, САВ71136, 1Е0266, Т08202, 848644, САС00499, Р56742, Р81383, О93364, Р81382, Р81375, 862692, Р23623, ΑΑΌ45200, ААС32267, САА88452, АР003600 иΖ48565.

Реакции проводили в микроцентрифужных пробирках общим объемом 1 мл, инкубировали в течение 10 мин, встряхивая при 37°С. Реакционная смесь содержала 5 мМ Ь-триптофан, 100 мМ натрийфосфатный буфер, рН 6,6, 0,5 мМ арсенат натрия, 0,5 мМ ЭДТА, 25 мМ тетраборат натрия, 0,016 мг каталазы (83 ед., 8щта С-3515), 0,008 мг ΕΑΌ (8щта) и 0,005-0,125 единиц оксидазы Ь-аминокислот. Отрицательные контроли содержали все компоненты, за исключением триптофана, а слепые пробы содержали все компоненты, за исключением оксидазы. Каталазу использовали для удаления перекиси водорода, образующейся в процессе окислительного деаминирования. Тетраборат и арсенат натрия применены для стабилизации енол-боратной форму индол-3-пирувата, которая показывает максимальное поглощение при 327 нм. Стандарты индол-3-пирувата готовили в концентрациях от 0,1 до 1 мМ в реакционной смеси.

Коммерческий препарат оксидазы Ь-аминокислот имеет специфическую активность 540 мкг образовавшегося индол-3-пирувата в минуту на мг белка. Это тот же порядок величин, что обнаруживается и для специфической активности триптофан-аминотрансфераз.

Пример 4. Превращение индол-3-пирувата в 2-гидрокси-2-индол-3-илметил)-4-кетоглутарат с помощью альдолазы.

В этом примере описываются способы, которые можно использовать для превращения индол-3пирувата в 2-гидрокси-2-(индол-3-илметил)-4-кетоглутаровую кислоту - предшественник монатина (ПМ) с помощью альдолазы (лиазы) (фиг. 2). Реакции альдольной конденсации - это реакции, которые образуют углерод-углеродные связи между β-углеродом альдегида или кетона и карбонильным углеродом дру

- 21 009284 гого альдегида или кетона. На углероде. находящемся рядом с карбонильной группой одного субстрата. образуется карбанион. который служит в качестве нуклеофила. атакующего карбонильный углерод другого субстрата (электрофильный углерод). Чаще всего электрофильный субстрат является альдегидом. поэтому большинство альдолаз попадает в категорию ЕС 4.1.2.-. Довольно часто нуклеофильный субстрат - это пируват. Реже альдолазы катализируют реакции конденсации между двумя кето-кислотами или двумя альдегидами.

Однако идентифицированы альдолазы. которые могут катализировать конденсацию двух карбоксильных кислот. Например. ЕР 1045-029 описывает получение Ь-4-гидрокси-2-кетоглутарата из глиоксиловой кислоты и пирувата с помощью культуры Ркеиботопак (ЕС 4.1.3.16). Кроме того. 4-гидрокси-4метил-2-оксоглутарат-альдолаза (4-гидрокси-4-метил-2-оксоглутарат-пируват-лиаза. ЕС 4.1.3.17) может катализировать конденсацию двух кетокислот. Поэтому сходные полипептиды альдолаз используются для катализа конденсации индол-3-пирувата с пируватом.

4-гидрокси-4-метил-2-оксоглутарат-пируват-лиазы (РгоА альдолазы. ЕС 4.1.3.17) и 4-гидрокси-2оксоглутарат-глиоксилат-лиаза (КНС-альдолаза. ЕС 4.1.3.16) катализируют реакции очень похожие на альдолазную реакцию. представленную на фиг. 2. Сконструированы праймеры с концами. совместимыми с вектором рЕТ30 Ха/ЫС (Иоуадеп. Мэдисон. Висконсин). Конструкция этих праймеров описана выше в примере 1.

Для клонирования в рЕТ30 Ха/ЫС сконструированы следующие праймеры:

1. Ркеиботопак кйаттеа ген ргоА (СепЬапк Ассеккюп Ыо.: 12964663 Версия: 12964663) и Сотатопак 1ек1ок1егош ген ргоА (8ЕО ΙΌ N08: 65-66. нуклеотидная и аминокислотная последовательности. соответственно) прямой 5'-ССТАТТСАСССТССССАТСТАССААСТСССАСТТСТ-3' и обратный 5'АСАССАСАСТТАСАССТТАСТСААТАТАТТТСАССС-3' (8ЕО ΙΌ N08: 55 и 56).

2. 8тог1ихоЬшт теШой 1021 ген 8Мс00502 (гомологичен гену ргоА. СепЬапк Ассеккюп Ыок.:15074579 и САС46344. нуклеотидная и аминокислотная последовательности. соответственно) 15'ССТАТТСАСССТССАТСАСССТССТТСАССССАА-3' и обратный 5'-АСАССАСАСТТАСАСССТСА АТССАТАТАТТТСАСТС-3¹ (8ЕО ΙΌ N08: 61 и 62).

3. 8рб^идотоиак кр. ген БВ126 Γ16Ζ (СепЬапк Ассеккюп Ыо.: 7573247 Версия: 7573247. кодирует вероятную ацилтрансферазу) прямой 5'-ССТАТТСАСССТСССАТСТСССССАТССТТСТССА-3' и обратный 5'-АСАССАСАСТТАСАСССТСАСАСАТАТТТСАСТСССА-3' (8ЕО ΙΌ N08: 57 и 58).

4. АйбгоЬас1ег кеукеп ген рстЕ (СепЬапк Ассеккюп №.: АЕ331043 Версия: АЕ331043.1. кодирует оксалоцитрамалат-альдолазу) прямой 5'-ССТАТТСАСССТСССАТСССАСТСААСААССТССС-3' и обратный 5¹-АСАССАСАСТТАСАСССТСАСТТСТССАССТАТТССА-3' (8ЕО ΙΌ N08: 59 и 60).

5. Уегкйиа рекйк штамм СО92 ген УР0А62 (СепЬапк Ассеккюп №.: 15978115 Версия: 15978115. кодирует вероятную трансферазу) прямой 5'-ССТАТТСАСССТСССАТСАСССТССТТААТАТСАА-3' и обратный 5'-АСАССАСАСТТАСАСССТТАТСАСТТТААССССТТСА-3' (8ЕО ΙΌ N08: 63 и 64).

6. ВасШик киЬййк ген кбд (СепЬапк Ассеккюп №к. Ζ99115.1 СЕ2634478.126711-127301 и САВ 14127.1. нуклеотидная и аминокислотная последовательности. соответственно) прямой 5'-ССТАТ ТСАСССТСССАТССАСТССАААСТССТТСА-3' и обратный 5'-АСАССАСАСТТАСАСССТТАСАСТТ ССААААСАСССТ-3' (8ЕО ΙΌ N08: 35 и 36).

7. Е. сой ген кбд (СепЬапк Ассеккюп №к. АЕ000279.1 1331-1972 и ААС74920.1. нуклеотидная и аминокислотная последовательности. соответственно) прямой 5'-ССТАТТСАСССТСССАТСАААА АСгССААААСААС-3' и обратный 5'-АСАССАСАСТТАСАСССТТАСАССТТАСССТТСТА-3' (8ЕО ΙΌ N08: 37 и 38).

8. 8.тей1ой ген кбд (СепЬапк Ассеккюп №к. АБ591792.1 01:15075850.65353-64673 и САС47463.1. нуклеотидная и аминокислотная последовательности. соответственно) прямой 5'-ССТАТТСАСС СТСССАТСССАСССССАТТАТТСАА-3' и обратный 5'-АСАССАСАСТТАСАСССТСАССССТТС АСССССААС-3' (8ЕО ΙΌ N08: 39 и 40).

Геномную ДНК из организмов. описанных выше в пунктах 1-2 и 6-8. очищали с помощью протокола 01адеп депотю-йр. Аналогичными способами можно очистить геномную ДНК из организмов. описанных в 3-5.

Ркеиботопак кйаттеа (АТСС 33636) выращивали на питательном бульоне и среде с гидроксибензоатом при 30°С. Сотатопак 1екЮк1егош (АТСС 49249) выращивали на питательном бульоне и среде с гидроксибензоатом при 26°С. 8рб^идотоиак кр. БВ126 (Е1ет1кб ШкЙШе Гог Тесбпо1одюа1 Векеагсб. У!Т0. В-2400 Мо1. Бельгия) выращивали согласно способу. описанному АаШаи с соавт. (Векеагсб т М1сгоЪю1. 152:861-72. 2001). АгШгоЬас1ег кеукеп (Си1Г Есо1оду Олзкюп. ^Иопа! Неабб апШ Епуйоптеп1а1 ЕГГес(к Векеагсб ЬаЬога1огу. и.8. Епуйоптеп1а1 РгсЛесЕоп Адепсу. Си1Г Вгеехе. ЕЬ 32561. И8А) выращивали согласно протоколу. описанному Еа(оп (1. Вас1епо1 183:3689-3703. 2001). 8тагб17оЬшт теШой 1021 (АТСС 51124) выращивали при 26°С на среде АТСС ТУ и среде с гидроксибензоатом. Уегыша рекйк штамм СО92 (АТСС) выращивали при 26°С в среде АТСС теШит 739 Нопе Ь1ооШ адаг. ВасШик киЬййк 6051 (АТСС выращивали при 30°С в питательном бульоне Веге(о (Э1Гсо; Детройт. Мичиган). Геномную ДНК Е. сой выделяли из штамма ЭН10В (Iиνй^одеи). как описано в примере 1.

Протоколы для ПЦР. клонирования и скринирования. представленные в примере 1. использовали

- 22 009284 для клонирования последовательностей генов ргоА С'ЛеЧоЧегош и !йе 8.теШоб, а также последовательностей кйдЕ. сой, В. виЬййв, и 8. шеШоб. Эти же способы можно использовать для клонирования других последовательностей, описанных выше.

Положительные клоны секвенировали с помощью терминационного секвенирования дидеокси-цепи (8ес.|\упд111. Хьюстон, Техас) с 8-тэгом и Т7-терминаторными праймерами (Коуадеп), и внутренними праймерами, полученными от 1п1едга1еб ΌΝΑ Тесйпо1од1е8,1пс. (Коралвилль, Индиана).

Экспрессия и определение активности

Плазмидную ДНК (проверенную аналитическим секвенированием) субклонировали в экспрессионную клетку хозяина ВЬ21(ИЕ3) (Коуадеп). Культуры выращивали в среде ЬВ с 50 мг/л канамицина. Плазмиды выделяли с помощью набора 01адеп βρίη р1авт1б тшргер и впоследствии подвергали рестрикционому анализу для подтверждения идентичности. Проводили эксперименты с индукцией конструктов ВЬ21(ИЕ3), выращенных в среде ЬВ, содержащей 50 мг/л канамицина, при 37°С. Экспрессию белка индуцировали с помощью 0,1 мМ 1РТС после того, как величина ОЭ₆₀₀ достигала величины около 0,6. Клетки росли в течение 4 ч при 30°С, после чего их отделяли центрифугированием. Клетки затем лизировали реагентом ВидЬи8!ег™ Щоуадеп) и рекомбинатные белки с Ηίβ-тэгами очищали с помощью ΗίβВтб картриджей, как описано выше (пример 1). Очищенные белки обессоливали на колонках ΡΌ-10 и элюировали в 50 мМ трис-НС1 буфере, рН 7,3 с 2 мМ МдС1₂.

Белки анализировали способом 8Э8-РАСЕ на 4-15% градиентных гелях, чтобы определить уровни растворимых белков по предсказанной величине МА рекомбинантного фузионного белка.

Определяли активность белков с помощью индол-3-пирувата и пирувата натрия в качестве субстратов. Смесь для определения содержала 100 мМ трис-НС1 (рН 7-рН8.9), 0-8 мМ МдС1₂, 3 мМ фосфат калия (рН 8) и 6 мМ каждого субстрата в 1 мл. Реакцию запускали добавлением разных количеств полипептида (например, от 10 до 100 мкг) и инкубировали при 25-37°С в течение 30 мин, фильтровали и замораживали при -80°С.

Результаты измерения активности у продуктов гена рго А

Генные конструкты С. (еЧоЧегош ргоА и 8. теШоб 8Мс00502 показывают высокий уровень экспрессии при индукции 1РТ0. Рекомбинантные белки хорошо растворимы, как показывает анализ общего белка и образцов с клеточными экстрактами способом 8И8-РАОЕ. Продукт гена С. (еЧоЧегош был очищен до уровня >95%. Поскольку выход генного продукта 8. теШоб был очень низким после аффинной очистки с помощью картриджа Н18-Вшб, для определения ферментной активности использовали клеточный экстракт.

Обе рекомбинантные альдолазы катализировали образование ПМ из индол-3-пирувата и пирувата. Для проявления ферментативной активности необходимо присутствие двухвалентного магния и фосфата калия. Продукт не выявлялся, если в смеси не присутствовали индол-3-пируват, пируват или фосфат калия. Небольшое количество продукта образовывалось в отсутствие фермента (как правило, на один порядок меньше, при наличии фермента).

Пик продукта элюировали с колонки с обратной фазой С18 несколько позже, чем стандарт индол-3пирувата, масс-спектр этого пика показал коллизионно-индуцированный родительский ион ([М+Н]+) при 292,1, родительский ион, предполагаемый для продукта ПМ. Основные дочерние фрагменты, присутствующие на масс-спектре, показали, в частности, т/ζ =158 (1Н-индол-3-карбальдегид карбонийион), 168 (3-бута-1,3-диенил-1Н-индол карбоний-ион), 274 (292 - Н₂О), 256 (292 - 2Н₂О), 238 (292 3Н₂О), 228 (292 - СН₄О₃) и 204 (затухание пирувата). Продукт также продемонстрировал УФ-спектр, характерный для других индолсодержащих соединений, например триптофана, с Х_макс 279-280 и небольшим плечом примерно при 290 нм.

Количество ПМ, продуцируемое альдолазами С'ДеЧоЧегопг увеличивалось с повышением температуры реакции от комнатной до 37°С, концентрации субстрата и количества магния. Синтетическая активность фермента уменьшалась с повышением рН, при этом максимальное количество продукта получалось при рН 7. При сопоставлении со стандартами триптофана показано, что количество ПМ, полученного в стандартном определении с 20 мкг очищенного белка, составило примерно 10-40 мкг на 1 мл реакции.

Благодаря высокой степени гомологии кодирующих последовательностей РгоА альдолаз из 8. теШой и С. (еЧоЧегопе с другими описанными выше генами, предполагается, что все продукты рекомбинантных генов могут катализировать эту реакцию. Более того, ожидается, что альдолазы, имеющие треонин (Т) в положениях 59 и 87, аргинин (В) в 119, аспартат (И) в 120 и гистидин (Н) в 31 и 71 (на основе нумерации у С. 1С8!о81егош), будут иметь сходную активность.

Результаты измерения активности у продуктов гена кйв

Конструкты на основе генов кйд, полученных у В. виЬййв и Е. сой, покрывают высокий уровень экспрессии при индукции 1РТ0, тогда как ген 8. теШой продемонстрировал низкий уровень экспрессии. Рекомбинантные белки хорошо растворимы, как показывает анализ общего белка и образцов с клеточными экстрактами способом 8И8-РАОЕ. Продукты кйд-генов В. виЫгйв и Е. сой были очищены до уровня >95%; выход генного продукта 8. теШоб был не столь высоким после аффинной очистки с помощью картриджа Нй-Вшб.

- 23 009284

Не удалось найти доказательства того, что магний и фосфат необходимы для активности этого фермента. Однако в литературе есть сообщения о проведении определения в натрий-фосфатном буфере, и этот фермент, по мнению этих авторов, является бифункциональным и обладает активностью в отношении фосфорилированных субстратов, таких как 2-кето-3-дезокси-6-фосфоглюконат (КЭРО). Определение активности ферментов проводили как описано выше, и в некоторых случаях фосфат был исключен. Результаты показывают, что рекомбинантные КНО-альдолазы продуцируют ПМ, но не так активно как РгоА альдолазы. В некоторых случаях уровень ПМ, синтезируемого с помощью КНО, почти идентичен количеству, синтезируемому при наличии одних магния и фосфата. Фосфат, очевидно, не повышает активность КНО. Фермент из ВасШик по данным 8ЕМ (см. пример 10) обладает самой высокой активностью, приблизительно на 20-25% выше активности, наблюдаемой при наличии только магния и фосфата. Фермент из 8тог1ихоЬй1т обладает самой низкой активностью, что может быть связано с особенностями фолдинга и проблемами с растворимостью, отмеченными в экспериментах по экспрессии. Все три фермента имеют в активном сайте глутамат (положение 43 по нумерации В. киЬййк), а также лизин, необходимый для образования шиффова основания с пируватом (позиция 130); однако фермент из В. киЬййк содержит треонин в положении 47 - остаток активного сайта, - а не аргинин. КНО из В. киЬййк меньше и, очевидно, принадлежит подсемейству, отличному от ферментов из 8. теШой и Е. сой, но содержащему другие ферменты с треонином в активном сайте. Расхождения в активном сайте могут быть причиной повышенной активности фермента из В. киЬййк.

Повышение активности альдолаз

Каталитические антитела могут быть такими же активными, как природные альдолазы, воспринимать широкий диапазон субстратов и могут использоваться для катализа реакций, представленных на фиг. 2.

Альдолазы можно также усовершенствовать способами направленной эволюции, например, как описано ранее для КОРО-альдолазы (высокогомологичной КНО, описанной выше), полученной при перестановках в ДНК и неточной ПЦР, чтобы устранить потребность в фосфатах фосфат и обратить энантиоспецифичность. КОРО-альдолазные полипептиды применимы в биохимических реакциях, поскольку они высокоспецифичны в отношении субстрата-донора (в данном случае, пирувата), но относительно неприхотливы по отношению к субстрату-акцептору (т.е. индол-3-пирувату) (Кое11ег & ^опд, №ш.1ге 409:232-9, 2001). КНО-альдолаза катализирует реакцию конденсации пируват с рядом карбокси-кислот. Считается, что КНО альдолазы млекопитающих имеют более широкую субстратную специфичность, чем бактериальные ферменты, в том числе, проявляя более высокую активность в отношении 4-гицрокси 4метил-2-оксоглутарата и способность воздействовать на оба стереоизомера 4-гидрокси-2-кетоглутарата. Оказалось, что бактериальные ферменты отдают почти 10-кратное предпочтение Е-изомеру. В геномных базах данных открыта информация почти о 100 гомологах КНО, и эта активность продемонстрирована у Ркеиботопак, Рагасоссик, Р^оν^άепс^а, 8тогЫ7оЬшт, Могдапе11а, Е.соК и в тканях млекопитающих. Эти ферменты можно использовать в начале работы над энантиоспецифичностью, которая необходима при синтезе монатина.

Альдолазы, которые утилизуют пируват и другой субстрат, который может быть кетокислотой и/или молекулой с большой гидрофобной группой, как у индола, можно «развивать» в направлении специфичности, скорости и избирательности. В добавление к КНО- и РгоА-альдолазам, показанным здесь, можно привести в качестве примеров еще несколько ферментов, но без ограничений: КОРО-альдолазы и родственные полипептиды (КОРН); транскарбоксибензальпируват гидратаза-альдолаза из №сагбюИек Ш; 4-(2-карбоксифенил)-2-оксобут-3 -еноат-альдолаза(2'-карбоксибензальпируват-альдолаза), которая конденсирует пируват и 2-карбоксибензальдегид (субстрат, содержащий ароматическое кольцо); трансО-гидроксибензилиден-пируват-гидратаза-альдолаза из Ркеиботопак рийба и 8рЫпдотопак аготайсШогапк, которая утилизует также пируват и альдегид, содержащий ароматическое кольцо, в качестве субстратов; 3-гидроксиаспартат-альдолаза (эритро-3-гидрокси-Ь-аспартат глиоксилат-лиаза), которая использует в качестве субстратов 2-оксокислоты и, по-видимому, экспрессируется в организме Мюгососсик бешйгДсапк; бензоин-альдолаза (бензальдегид-лиаза), которая утилизует субстраты, содержащие бензиловые группы; дигидронеоптерин-альдолаза; Ь-трео-3-фенилсерин-бензальдегид-лиаза (фенилсеринальдолаза), которая конденсирует глицин с бензальдегидом; 4-гидрокси-2-оксовалерат-альдолаза; 1,2дигидроксибензилпируват альдолаза и 2-гидрокси бензальпируват альдолаза.

Полипептид с нужной активностью можно отобрать при скринировании интересующих клонов с помощью следующих способов. Триптофан-ауксотрофы трансформируют векторами, несущими интересующие клоны, на экспрессионной кассете и выращивают на среде, содержащей небольшие количества монатина или ПМ. Поскольку аминотрансферазные и альдолазные реакции обратимы, клетки способны синтезировать из рацемической смеси монатина. Аналогичным образом организмы (как рекомбинантные, так и интактные) можно скринировать на способность утилизовать ПМ или монатин в качестве источника углерода и энергии. Одним из источников нужной альдолазы может стать экспрессионная библиотека разных штаммов Ркеиботопак и ризобактерий. У псевдомонад есть много необычных катаболических путей для деградации ароматических молекул, и они к тому же содержат много альдолаз; тогда как ризобактерий содержат альдолазы, растут в растительной ризосфере и имеют много генов, хорошо

- 24 009284 описанных для конструирования биосинтетического пути монатина.

Пример 5. Химический синтез предшественника монатина.

В примере 4 описаны способы превращения индол-3-пирувата в 2-гидрокси-2-(индол-3-илметил)-4кето-глутаровую кислоту - предшественник монатина (ПМ) с помощью альдолазы. А в этом примере описывается альтернативный способ химического синтеза ПМ.

ПМ образуется в результате типичной реакции альдольной конденсации (фиг. 4). Типичная реакция альдольной конденсации происходит через образование карбаниона пируват-эфира с помощью сильного основания, например БЭА (диизопропиламид лития), гексаметилдисилазана лития или бутил-лития, образующийся карбанион реагирует с индол-пируватом с образованием конденсированного продукта.

Защитные группы, которые можно использовать для защиты атома азота в индольной группе, включают, но не ограничиваются, следующие: ΐ-бутилоксикарбонил (Вос) и бензилоксикарбонил (С'Ьх). Блокирующие группы для карбоксикислот включают, но не ограничиваются, следующие: алкиловые эфиры (например, метиловые, этиловые, бензиловые эфиры). Если используются такие защитные группы, то становится невозможно контролировать стереохимию образующегося продукта. Однако если К2 и/или К3 - хиральные защитные группы (фиг. 4), такие как (8)-2-бутанол, ментол или хиральный амин, то можно добиться предпочтительного образования одного энантиомера ПМ перед другим.

Пример 6. Превращение триптофана или индол-3-пирувата в монатин.

В результате проведения ш νίΐΐΌ процесса с использованием двух ферментов, аминотрансферазы и альдолазы, образуется монатин из триптофана и пирувата. На первом этапе альфа-кетоглутарат является акцептором аминогруппы триптофана в реакции трансаминирования с образованием индол-3-пирувата и глутамата. Альдолаза, катализирующая вторую реакцию, в которой пируват реагирует с индол-3пируватом в присутствии Мд²⁺ и фосфата с образованием альфа-кето-производного монатина (ПМ), 2гидрокси-2-(индол-3-илметил)-4-кето-кетоглутарата. Перенос аминогруппы от глутамата, образовавшегося на первом этапе реакции, приводит к образованию конечного продукта монатина. В результате очистки и характеристики этого показано, что полученный изомер является 8,8-монатином. Описываются альтернативные субстраты, ферменты и условия, а также усовершенствования, которые можно внести в ход процесса.

Ферменты

Альдолазу, 4-гидрокси-4-метил-2-оксоглутарат-пируват-лиазу (РгоА альдолаза, ген ргоА) (ЕС 4.1.3.17) из Сотатопаз 1ез1оз1егош клонировали, экспрессировали и очищали, как описано в примере 4. 4-Гидрокси-2-окосоглутарат-глиоксилат-лиазы (КНС-альдолазы) (ЕС 4.13.16) из В.зиЫШз, Е.со11, и 8.те111оБ клонировали, экспрессировали и очищали, как описано в примере 4.

Аминотрансферазы, используемые вместе с альдолазами при продукции монатина - это Ь-аспартатаминотрансфераза, кодируемая геном азрС Е.со11, тирозин-аминотрансфераза, кодируемая геном 1угВ из Е.со11, фермент Та!А из 8. теШоБ, аминотрансфераза широкой субстратной специфичности, кодируемая геном Ь. та_)ог Ьза!, или глутамат-оксалоацетат-трансаминаза из сердца свиньи (тип 11а). Белки, полученные не у млекопитающих, клонировали, экспрессировали и очищали, как описано в примере 1. А глутамат-оксалоацетат-трансаминазу из сердца свиньи (тип 11а) получали от 8щта (# С7005).

Способ с использованием альдолазы ргоА и Ь-аспартат-аминотрансфераза

Реакционная смесь содержала 50 мМ ацетата аммония, рН 8,0, 4 мМ МдС1₂, 3 мМ фосфата калия, 0,05 мМ пиридоксаль фосфата, 100 мМ пирувата аммония, 50 мМ триптофана, 10 мМ альфакетоглутарата, 160 мг рекомбинантной РгоА-альдолазы из С.1ез1оз1егош (неочищенный клеточный экстракт, -30% альдолазы), 233 мг рекомбинантной Ь-аспартат-аминотрансферазы из Е. со11 (неочищенный клеточный экстракт, -40% аминотрансферазы) в одном литре. Все компоненты, кроме ферментов, смешивали вместе и инкубировали при 30°С до полного растворения триптофана. Затем добавляли ферменты и раствор реакционной смеси инкубировали при 30°С, осторожно встряхивая (100 об/мин) в течение 3,5 ч. Через 0,5 и 1 ч после добавления ферментов аликвоты твердого триптофана (по 50 ммоль каждая) добавляли в реакционную смесь. Добавленный триптофан не растворяется полностью, но концентрация его поддерживается на уровне 50 мМ или выше. Через 3,5 ч твердый триптофан отфильтровывают. Анализ реакционной смеси способом ЖХ/МС с определенным количеством триптофана в качестве стандарта показал, что концентрация триптофана в растворе составляет 60,5 мМ, а концентрация монатина -5,81 мМ (1,05 г).

Для очистки конечного продукта используют следующие способы. 90% прозрачного раствора наносят на колонку со смолой ВюЕаб АС50\У-Х8 (225 мл; связывающая способность 1,7 мэкв/мл). Колонку промывают водой, собирают фракции по 300 мл до тех пор, пока поглощение при 280 нм не упадет до уровня <5% от первого прохождения фракции. Затем колонку элюировали 1 М ацетатом аммония, рН 8,4, собирая 4 фракции по 300 мл. Все 4 фракции содержали монатин и были упарены 105 мл с помощью вращающегося упаривателя на водяной бане. Осадок, образующийся по мере уменьшения объема, отделяли фильтрованием в процессе упаривания.

Анализ колоночных фракций способами ЛЖ/МС показал, что 99% триптофана и монатина связывается на колонке. Осадок, который формировался в процессе упаривания, содержал >97% триптофана и <2% монатина. Отношение триптофана к продукту в супернатанте составило приблизительно 2:1.

- 25 009284

Супернатант (7 мл) наносили на 100 мл колонку Еак! Ε1ο\ν с ΌΕΑΕ-сефарозой (АтегкЕат Вюксь епсек), предварительно переведенную в ацетатную форму промыванием 0,5 л 1 М №ОН, 0,2 л воды, 1,.0 л 1,0 М ацетата аммония, рН 8,4, и 0,5 л воды. Супернатант загружали со скоростью <2 мл/мин и промывали колонку водой со скоростью 3-4 мл/мин до тех пор, пока поглощение при 280 нм не достигнет значения ~0. Монатин элюировали 100 мМ раствором ацетата аммония, рН 8,4, и собирали 4 фракции по 100 мл.

Анализ фракций показал, что соотношение триптофана к монатину в протоке через фракции было 85:15, а соотношение в элюируемых фракециях составило 7:93. Считая коэффициент экстинкции при 280 нм равным для монатина и триптофана, фракции элюента содержали 0,146 ммоль продукта. При экстраполировании на общий объем реакционной смеси 1 л будет получено -2,4 ммоль (-710 мг) монатина, с выходом 68%.

Фракции элюента, снимаемые с колонки с ΌΕΑΕ-сефарозой, упаривали до объема <20 мл. Затем аликвоту продукта очищали путем нанесения на препаративную колонку С₈ для проведения обращённофазовой хроматографии в условииях, описанных в примере 10 для аналитического определения монатина. Для запуска автоматизированного сбора фракций монатина использовали программное обеспечение \Уа1егк Епс!юп1упх™ на основе определения ионов т/ζ - 293. Фракции с колонки С₈ с соответствующим протежированным молекулярным ионом монатина собирали, упаривали досуха, а затем растворяли в небольшом объеме воды. Эту фракцию использовали для снятия характеристик продукта.

Полученный продукт характеризовали следующими способами.

Спектроскопия в УФ/видимом спектрах. Спектроскопические измерения в УФ/видимом спектрах монатина, полученного ферментативным путем, проводили с помощью спектрофотометра для измерений в УФ/видимом спектрах Сагу 100 Βίο. Очищенный продукт, растворенный в воде, показал максимум поглощения при 280 нм с плечом при 288 нм, характерный для индол-содержащих веществ.

ЖХ/МС-анализ. Анализ смеси монатина, полученного в результате биохимической реакции ш νίίτο, проводили как описано в примере 10. Типичный ЖХ/МС-анализ монатина, полученного в результате биохимической реакции ш νίίτο, показан на фиг. 5. В нижней части фиг. 5 показаны результаты селективной ионной хроматографии для протонированного молекулярного иона монатина при т/ζ = 293. Это определение характеристик монатина в смеси подтверждается масс-спектром, показанным на фиг. 6. ЖХ/МС-анализ очищенного продукта показал единственный пик с молекулярным ионом 293 и поглощением при 280 нм. Масс-спектр идентичен спектру, показанному на фиг. 6.

МС/МС-анализ. ЖХ/МС/МС-анализ дочерних ионов монатина выполнен как описано в примере 10. Масс-спектр дочерних ионов показан на фиг. 7. Проведено экспериментальное структурное распределение для всех фрагментов ионов, отмеченных на фиг. 7. Включены фрагмент-ионы с т/ζ = 275 (293 Н₂О), 257 (293-(2 х Н₂О)), 230 (275-СООН), 212 (257-СООН), 168 (3-бута-1,3-диенил-1Н-индолкарбоний-ион), 158 (1Н-индол-3-карбальдегид-карбоний-ион), 144 (3-этил-1Н-индол-карбоний-ион), 130 (3-метилен-1Н-индол-карбоний-ион) и 118 (индол-карбоний-ион). Многие из этих ионов образуются и при анализе ПМ (пример 4), что можно было предполагать, особенно для индольной части молекулы. Некоторые оказались на 1 единицу массы выше, чем полученные для ПМ, благодаря наличию аминогруппы вместо кетона.

МС/МС-анализ высокого разрешения. На фиг. 8 показан масс-спектр, полученный для очищенного монатина с помощью масс-спектрометра АррЕеб Вюкук1етк-Регкт Е1тег 0-81аг. По результатам измерения масса протонированного монатина с использованием триптофана как внутреннего стандарта для калибровки массы составила 293,1144. Расчетная масса протонированного монатина на основе химического состава С1₄Н1^₂О5 равняется 293,1137. Ошибка в измерении массы составила меньше двух миллионных долей, что подтверждает химический состав монатина, полученного ферментативным путем.

ЯМР-спектроскопия. Эксперименты ЯМР выполнены на аппарате Уапап Iηονа 500 МГц. Образец монатина (~3 мг) растворяли в 0,5 мл Ό₂Ο. Сначала в качестве внутреннего стандарта использовали растворитель (Ό₂Ο) при 4.78 ррт. Поскольку пик для воды был большим, то провели ¹Н-ЯМР с подавлением пика воды. Впоследствии, из-за ширины пика воды, в качестве пика сравнения использовали С-2 часть монатина, установив на опубликованной величине 7,192 ррт.

При ¹³С-ЯМР первоначальный прогон нескольких сотен сканов показал, что образец был слишком разбавленным, чтобы получить адекватный ¹³С-спектр в заданное время. Поэтому были проведены эксперименты с гетероядерной когерентностью с множественным квантованием (НМСС), которые дали возможность провести корреляцию атомов водрода и связанных с ними атомов углерода, а также получить информацию о химических сдвигах атомов углерода.

Сводные данные по 'Н и НМСС представлены в табл. 2 и 3. При сравнении с опубликованными данными данные ЯМР показывают, что монатин, полученный ферментативным путем, является либо (8,8), (ЕЛ), либо смесью этих двух изомеров.

Хиральный ЖХ/МС-анализ. Чтобы установить, что монатин, полученный ш νίίτο, является одним изомером, а не смесью (К,К) и (8,8) энантиомеров, проведен ЖХ/МС-анализ хиральности с использованием инструментария, описанного в примере 10.

ЖХ-разделение по хиральности проведено на колонке для хиральной хроматографии СЫюЬюЕс Т

- 26 009284 (А<Яапсе6 Зерагайопк ТесЬпо1оду) при комнатной температуре. Способы разделения и детекции на основе опубликованных протоколов от поставщиков были оптимизированы для Я- (Ό) и δ- (Ь) изомеров триптофана.

Подвижная фаза для ЖХ состояла из А) воды, содержащей 0,05% (об/об) трифторуксусной кислоты; В) метанола, содержащего 0,05% (об/об) трифторуксусной кислоты. Элюция была изократической при 70% А и 30% В. Скорость составила 1,0 мл/мин, и поглощение РЭА измеряли в диапазоне от 200 нм до 400 нм. Инструментальные параметры, использованные для ЖХ/МС-анализа хиральности триптофана и монатина, идентичны описанным в примере 10 для ЖХ/МС-анализа. Использовали коллекцию массспектров для участка т/ζ 150-400. Результаты селективной ионной хроматографии для протонированных молекулярных ионов ([М + Н]⁺ =205 для Я-и δ-триптофанов и [М + Н]⁺ = 293 для монатина) позволили напрямую идентифицировать эти вещества в смесях.

Хроматограммы Я- и δ-триптофана и монатина, разделенные способом хиральной хроматографии и сопоставленные с МС, показаны на фиг. 9. Единственный пик на хроматограмме монатина показывает, что это вещество представлено одним изомером, а по времени задержки он почти идентичен δтриптофану.

Таблица 2. Данные ¹ ЯМР

НО	о
ЧП—	Ср

* /1
9 лу и²		,ΝΗϊ
1	рз

7 Н НСГ	Η⁵⁵⁵

	Саг£Й1	Ме^ааг с соавт.¹	ТакевЫ с соавт.
Атом	й_н	1(НН) Гц	й_н	3(НН) Гц	Й_н	1(НН) Гц
2	7,192 (1Н, а)		7,192(8)		7,18(5)
4	7,671 (6)	7,99	7,686 (74)	7,9	7,67 (4)	8,0
5	7,104{44>	7,99	7,102(44)	8.0,8.0	7,11(44)	7,5, 7,5
6	7,178(46)		7,176(44)	8.0, 8.0	7,17(44)	7,5, 7,5
7	7,439 (6)	7,99	7,439 (4)	5л	7,43 (4)_	8,0
10а	3,242(4)	14.5	3.243 (4)	14,3	3,24(4)	14,5
10Ь	3,033 (4)	14.5	3.051 (4)	14.3	3,05 (4)	14,5
12	2,626(44) 2,015(44)	15,5,1,5 15,0, 12,0	2,651 (44) 2,006 (44)	15.3.1.7 15.3.11.7	2.62 (44) 2.01 (44)	15,5, 1.8 15,5, 12.0
13	3,571 (44)	10,75*, 1,5	3,168(44)	11,6,1,8	3.57 (44)	12.0,1,8

Гуеддааг с ' соавт.'(1.8.С.Регкт Тгапк. 3095-8,1992). ²ТакезЫ и Зкизике (^2002060382,2002-02-26).

Таблица 3. Данные ¹³С ЯМР (по НМОС-спектру)

	СагетП	Уэееаааг с соавт.¹
Атом		δο
2	126.1	126.03
3 ...	*	14 0.31
4	120.4	120.46
5	120.2	120.25
6	122.8	122.74
7	112.8	112.79
8	♦	137.06
.9	*	129.23
10а	36.4	36 53
17.	39.5	39.31
13	54.9	54.89
14	*	175.30
15	4	181.18

У1еддааг с соавт. (1.8.С. Регкт Тгапк. 3095-8, 1992).

Поляриметрия. Оптическое вращение измеряли на поляриметре Яибо1рГ Аи!оро1 Ер. Препарат монатина готовили в виде 14,6 мг/мл водного раствора. Ожидаемое удельное вращение ([а]_с ²⁰) для δ,δ монатина (солевая форма) составляет -49,6 для 1 г/мл водного раствора (У1еддааг с соавт. Обнаруженная величина [а]_с ²⁰ равняется -28.1 для очищенного монатина, полученного ферментативным путем, показы- 27 009284 вает, что он является 8,8-изомером.

Усовершенствования

Условия реакции, включая концентрации реагента и фермента, были оптимизированы и дали на выходе 10 мг/мл при использовании реакционной смеси следующего состава: 50 мМ ацетата аммония (рН 8) 3,2 мМ МдС1₂, 200 мМ пирувата (в виде солей натрия или аммония), 5 мМ альфа-кетоглутарата (натрия), 0,05 мМ пиридоксаль-фосфата, деаэрированная вода до конечного объема 1 мл после добавления ферментов, 3 мМ фосфат калия, 50 мкг/мл рекомбинантной РгоА альдолазы (клеточный экстракт; общая концентрация белка 167 мкг/мл X 1000 мкг/мл Ь-аспартат-аминотрансферазы, кодируемой геном акрС из Е.сой (клеточный экстракт; общая концентрация белка 2500 мг/мл), и твердый триптофан для поддержания концентрации на уровне клеточный экстракт; общая концентрация белка > 60 мМ (насыщенный; частично нераствореннный в процессе реакции). Смесь инкубировали при 30°С в течение 4 ч с осторожным встряхиванием или перемешиванием.

Замены

Концентрацию альфа-кетоглутарата можно снизить до 1 мМ и дополнить 9 мМ аспартатом с эквивалентным выходом монатина. На первом этапе можно использовать альтернативные акцепторы аминокислот, например оксалоацетат.

Если вместо Ь-аспартат-аминотрансферазы из Е. сой используется рекомбинантная аминотрансфераза широкой субстратной специфичности из Ь. та_)от, достигается аналогичный выход монатина. Однако способом ЖХ/МС-анализа выявляется второй неидентифицированный продукт (3-10% от основного продукта) с молекулярной массой 292. Монатин в концентрации 0,1-0,5 мг/мл получается, если в качестве аминотрансферазы добавляется фермент, кодируемый геном Е. сой 1угВ, или фермент, кодируемый геном 8. теШой 1а1 А, или глутамат-оксалоацетат-трансаминаза из сердца свиньи (1уре 11а). Если реакция начинается с индол-3-пирувата, то на последнем этапе можно провести восстановительное аминирование с применнеием глутамат-дегидрогеназы и ΝΑΌΗ (как в примере 7).

Кроме того, для получения монатина ферментативным путем используются КНС-альдолазы из В. киЬййк, Е. сой, и 8. теШой вместе с Ь-аспартат-аминотрансферазы из Е. сой. Используются следующие условия реакции: 50 мМ ΝΗ.-ι-ОАц (рН 8,3), 2 мМ МдС1₂, 200 мМ пируват, 5 мМ глутамат, 0,05 мМ пиридоксаль-фосфат, деаэрированная вода до конечного объема 0,5 мл после добавления ферментов, 3 мМ фосфат калия, 20 мкг/мл рекомбинантной В. киЬййк КНС-альдолазы (очищенной), против 400 мкг/мл Ьаспартат-аминотрансферазы (АкрС) из неочищенного клеточного экстракта Е. сой, и 12 мМ индол-3пируват. Реакционную смесь инкубировали при 30°С в течение 30 мин со встряхиванием. Количество монатина, полученного с помощью фермента из В. киЬййк, составило 80 нг/мл и повышалось с увеличением количества альдолаз. Если индол-3-пируват и глутамат замещали насыщенным триптофаном и 5 мМ альфа-кетоглутаратом, выход монатина возрастал до 360 нг/мл. Реакции повторяли с 30 мкг/мл каждого из трех мышиных КНС-ферментов в 50 мМ трис (рН 8,3) с насыщенным триптофаном и оставляли для завершения на час, чтобы увеличить определение. Фермент из ВасШик обладает самой высокой активностью, как указывалось в примере 4, и продуцирует приблизительно 4000 нг/мл монатина. КНС из Е. сой продуцирует 3000 нг/мл монатина, а фермент из 8. теШой -2300 нг/мл.

Пример 7. Взаимопревращение между ПМ и монатином.

Аминирование ПМ с образованием монатина может катализироваться аминотрансферазами, например, указанными в примерах 1 и 6, или дегидрогеназами, которые требуют восстанавливающего кофактора: ΝΑΌΜ или ΝΑΌΡΚ Эти реакции обратимы и могут идти в обоих направлениях. Направленность при применении дегидрогеназы можно контролировать концентрациями солей аммония.

Активность дегидрогеназы. Окислительное деаминирование монатина отслеживается с помощью последующего увеличения поглощения при 340 нм, так как ΝΑΌ(Ρ)⁺ превращается в более хромофорный ЫАР(Р)Н. Монатин получают ферментативным путем и очищают как как описано в примере 6.

Типичная смесь для определения содержит 50 мМ трис-НС1, рН от 8.0 до 8,9, 0,33 мМ ЫАО⁴ или ЫАБР⁴. От 2 до 22 единиц глутамат-дегидрогеназы (81дта), и 10-15 мМ субстрата в 0,2 мл. Определение проводится дважды в УФ-проницаемой микротитровочной плашке на детекторе для плашек Мо1еси1аг Ьетюек 8ресйаМах РШк. Смесь фермента, буфера, и ЫАВ(Р)⁺ наливается пипеткой в ячейки плашки, содержащей субстрат, и увеличение поглощения при 340 нм фиксируется с 10-секундными интервалами после краткого перемешивания. Реакицонную смесь инкубируют при 25°С в течение 10 мин. Отрицательные контроли проводят без добавления субстрата, а в качестве положительного контроля используют глутамат. Глутамат-дегидрогеназа (тип III) из печени быка (8щта # С-7882) катализирует превращение монатина в предшественник монатина со скоростью, составляющей приблизительно одну сотую от скорости превращения глутамата в альфа-кетоглутарат.

Активность трансаминирования. Определение аминотрансферазы проводили с аспартатаминотрансферазой (АкрС) из Е. сой, тирозин-аминотрансферазой (ТугВ) из Е. сой, аминотранферазой широкой специфичности (В8АТ) из Ь. та_)от и двумя коммерческими препаратами глутаматоксалоацетат-аминотрансферазы свиньи, описанными в примере 1. И оксалоацетат, и альфа-кетоглутарат тетисровали в качестве амино-акцепторов. Смесь для определения содержала (в 0,5 мл) 50 мМ трис-НС1 (рН 8,0), 0,05 мМ ПФ, 5 мМ амино-акцептора, 5 мМ монатина и 25 мкг аминотрансферазы. Смеси для

- 28 009284 определения инкубировали при 30°С в течение 30 мин и останавливали реакции добавлением 0,5 мл изопропилового спирта. Потери монатина отслеживали способом ЖХ/МС (пример 10). Самая высокая величина активности отмечена у фермента из В8АТ из Ь. та_)ог с оксалоацетатом в качестве аминоакцептора, затем следует тот же фермент с альфа-кетоглутаратом в качестве амино-акцептора. Относительная активность с оксалоацетатом оказалась следующей: В8АТ > АкрС > свиная, тип 11а > свиная, тип I = ТугВ. Относительная активность с альфа-кетоглутаратом оказалась следующей: В8АТ > АкрС > свиная, тип I > свиная, тип 11а > ТугВ.

Пример 8. Получение монатина из триптофана и С3-молекул, не являющихся пируватом.

Как описано выше в примере 6, индол-3-пируват или триптофан можно превратить в монатин, используя пируват в качестве С3-молекулы. Однако в некоторых случаях пируват может быть нежелательным исходным материалом. Например, пируват может оказаться более дорогим, чем другие С3источники углерода, или могут при добавлении в среду оказать побочные эффекты на ферментационные процессы. Многие ПФ-ферменты могут трансаминировать аланин с образованием пирувата.

Триптофаназо-подобные ферменты проводят реакцию бета-элиминации намного быстрее, чем другие ПФ-ферменты, например, аминотрансферазы. Ферменты этого класса (4.1.99.-) могут производить аммоний и пируват из таких аминокислот, как Б-серин, Е-цистеин, и производных серина и цистеина с легко отщепляемыми группами, например, О-метил-Ь-серин, О-бензил-Ь-серин, 8-метилцистеин, 8бензилцистеин, 8-алкил-Ь-цистеин, О-ацил-Ь-серин, 3-хлор-Ь-аланин.

Процессы получения монатина с помощью полипептидов класса ЕС 4.1.99.-можно усовершенствовать с помощью мутационных изменений β-тирозиназы (ТРБ) или триптофаназы по способу Моига1ои с соавт. (1. Вю1 СЫет 274:1320-5,1999). Моига1ои с соавт. описывают возможность превратить βтирозиназы в β-лиазу дикарбоновых аминокислот, которой нет в природе, судя по имеющимся ссообщениям. Изменение специфичности проводится путем превращения валина (V) 283 в аргинин (К) и аргинина (К) 100 в треонин (Т). Эти аминокислотные замены позволяют лиазе соединяться с дикарбоновыми аминокислотами для проведения реакции гидролитического деаминирования (например, аспартата). Аспартат, следовательно, можно также исолпьзовать и в качестве источника пирувата для последующей реакции альдольной конденсации.

Кроме того, в клеточные или ферментативные реакторы можно добавлять лактат и фермент, который превращает лактат в пируват. В качестве примеров таких ферментов можно назвать лактатдегидрогеназу и лактат-оксидазу.

Выделение геномной ДНК

Триптофаназа и ее полипептиды описаны в разных источниках, например, МоигаЮн с соавт. (ДВС 274:1320-5,1999). Чтобы получить гены, которые кодируют полипептиды триптофаназы, использовали геномную ДНК из Е. сой ЭН10В в качестве матрицы для ПЦР, как описано в примере 1.

Ген тирозин-фенол-лиазы выделяли из С.Ггеипби (АТСС, каталожный номер 8090, обозначение АТСС 13316; ЫСТС 9750) и выращивали на агаре МЦпеп! (ЭгГсо 0001) и питательном бульоне ГО1Гсо 0003) при 37°С до ΘΌ = 2,0. Геномную ДНК очищали с помощью набора 61адеп 6епотю-йр™ 100/6.

Амплификация кодирующих последовательностей с помощью ПЦР

Праймеры конструировали с концами, совместимыми с вектором рЕТ 30 Ха/БК.' (Хоуадеп, Мэдисон, XVI) как описано выше в примере 1.

Ген 1па из Е. сой (8Е6 ГО №: 41). Ν-терминальный праймер для клонирования рЕТ30 Ха/ГОС с1опшд: 8'-66Т АТТ 6А6 66Т С6С АТ6 6АА ААС ТТТ ААА САТ СТ-3' (8 ЕС) ГО ΝΟ: 43). Стерминальный праймер для клонирования рЕТ30 Ха/БК.’: 5'-А6А 66А 6А6 ТТА 6А6 ССТ ТАА АСТ ТСТ ТТА А6Т ТТТ 6-3' (8ЕС) ГО N0:44).

Ген 1р1 из С.Ггеипбй (8Е6 ГО N0:42). Ν-терминальный праймер для клонирования рЕТ30 Ха/Б1С: 5'66Т АТТ 6А6 66Т С6С АТ6ААТТАТСС66СА6ААСС-3 ' (8 ЕС) ГО ΝΟ: 45). С-терминальный праймер для клонирования рЕТ 30 Ха/1.1С: 5'-А6А 66А 6А6 ТТА 6А6 ССТТА6АТ6ТААТСААА6С6Т63' (8ЕС) ГО N0: 46).

Для проведения всех ПЦР использовали термоциклер ЕррепбогГ Мак1егсус1ег™ 6габ1еп1 5331. К 50 цЬ мкл добавляли 0,5 мкг матрицы (геномной ДНК), 1,0 мкМ каждого праймера, 0,4 мМ каждого б№ГР, 3,5 ед. полимеразы Ехрапб Н1дЫ Г!бе1йу Ро1утегаке (КосЫе), 1 X Ехрапб буфер с Мд и 5% ДМСО (конечная концентрация). Программу термоциклера для ПЦР устанавливали со следующими параметрами: горячий старт 96°С (5 мин), 94°С - 30 с, 40-60°С -1 мин 45 с, 72°С - 2 мин 15 с; 30 повторов. Конечный этап полимеризации продолжался 7 мин, и образцы хранили при 4°С.

Клонирование

Клонирование и процедуры идентификации положительных клонов, описанные выше в примере 1, использовали для идентификации соответствующих клонов.

Экспрессия генов и способы определения активности.

Плазмидную ДНК (проверенную секвенированием) субклонировали в экспрессирующих клетках ВБ21ГОЕ3) (№уадеп). Культуры выращивали в среде БВ с 30 мг/л канамицином, и выделяли плазмиды с помощью набора О1адеп т1шргер, а затем проводили рестрикционный анализ для подтверждения иден

- 29 009284 тичности.

Индукцию проводили в экспрессирующих клетках ВЬ21(ОЕ3), конструкты выращивали на среде ЬВ с канамицином (50 мг/л) при 37°С. Экспрессию белка индуцировали с помощью 1 мМ 1РТС (изопропилфлуогалактозид) после того, как величина ΟΌ₆₀₀ культуры достигала приблизительно 0,6. Клетки росли в течение 4 ч при 30°С, после чего их отделяли центрифугированием.

Клетки затем лизировали реагентом ВидЬик1ег™ (№уадеп) (5 мл/г сырого веса клетки), содержащем 5 мкл/мл коктейля с ингибитором протеазы #111 (Са1Ьюсйет) и 1 мкл/мл бензоназы-нуклеазы (№уадеп), и рекомбинатные белки с Н1к-тэгами очищали с помощью Н1к-Втб картриджей, как описано выше в примере 1. Очищенные белки обессоливали на колонке ΡΌ-10 (625 Берйабех, Атегкйат Вюкаепсек) и элюировали 100 мМ трис-НС1 буфером, рН 8,0. Белки анализировали способом δΌδ-ΡΛΟΕ на 4-15% градиентных гелях, чтобы определить уровни растворимых белков по предсказанной величине М\\^; рекомбинантного фузионного белка.

Мутагенез

Некоторые ферменты, входящие в класс 4.1.99.- (триптофаназа и бета-тирозиназа), катализируют бета-лиазную реакцию с аспартатом или подобными ааминокислотами без какой-либо модификации. Однако некоторым ферментам этого класса могут потребоваться мутационные изменения, чтобы сделать возможным применение субстратов и/или для получения нужного продукта. Кроме того, в некоторых случаях полипептиды, способные производить это превращение, могут быть в дальнейшем оптимизированы с помощью мутагенеза.

Сайт-направленный мутагенез проводили на основе анализа трехмерной структуры ПФ(Ρ^Ρ)связывающих полипептидов. Ниже приведены два примера изменения субстратной специфичности полипептидов.

Мутагенез триптофаназы - Пример 1.

Представленный ниже протокол проведения мутагенеза описывает введение двух точковых мутаций в аминокислотную последовательность. Первая точковая мутация приводит к замене аргинина (В) в положении 103 на треонин (Т), а вторая точковая мутация - к замене валина (V) в положении 299 на аргинин (В) (система отсчета - по последовательности зрелого белка из Е. сой. Эксперименты по мутагенезу проведены Лабораториями АТ6 (г. Иден-Прери, штат Миннесота). Мутации водили последовательно способом ПЦР на фрагментах гена с последующей сборкой гена, также выполненной способом ПЦР. Праймеры для превращения аргинина (В)103 на треонин (Т): 5'-ССА666САСС66С6СА6А 6САААТСТАТАТТ-3' (БЕС) ГО №: 47) и 5'-Т6С6СС66Т6СССТ66Т6А6ТС66ААТ66Т-3' (БЕС) ГО №: 48).

Праймеры для превращения валина (ν)299 на аргинин (В): 5'-ТССТ6САС6С66СААА 666ТТСТ6САСТС66Т-3' (БЕР ГО №: 49) и 5'-СТТТ6СС6С6Т6СА66АА66СТТССС6АСА-3' (БЕС) ГО №: 50).

Полученные мутантные последовательности скринировали способом рестрикционного анализа с помощью ХЬа Ι/ΗίπάΙΙΙ и БрЫ, а затем проверяли секвенированием.

Мутагенез тирозин-фенол-лиазы (β-тирозиназы) - Пример 2.

Произведены две точковые мутации в аминокислотной последовательности тирозин-фенол-лиазы. Эти мутации превращали аргинин (В) в положении 100 в треонин (Т) и валин (V) в положении 283 в аргинин (В) (по последовательности зрелого белка из С.Ггеипбн).

Праймеры для превращения В100Т: 5'-А6666АСС66С6СА6ААААССТ6ТТАТС6-3¹ (БЕС) ГО ΝΟ: 51) и 5'-А6666АСС66С6СА6ААААССТ6ТТАТС6-3' (БЕС) ГО ΝΟ: 52). Праймеры для превращения V283В: 5'-6ТТА6ТСС6С6ТСТАС6АА666АТ6ССАТ-3' (БЕС) ГО ΝΟ: 53) и 5'6ТА6АС6С66АС ТААСТСТТТ66СА6АА6-3' (БЕС) ГО ΝΟ: 54).

Применялись способы, описанные выше, и полученные клоны скринировали с помощью рестриктаз Крп1/Бас1 и Вк(Х I. Последовательности верифицировали способом терминального секвенирования двойной цепи. Рекомбинатный белок получали как описано выше для ферментов дикого типа.

Реакционная смесь содержала 50 мМ трис-С1 (рН 8,3), 2 мМ МдС1₂, 200 мМ С3-молекулы, 5 мМ альфа-кетоглутарата натрия, 0,05 мМ пиридоксаль-фосфат, деаэрированную воду до конечного объема 0,5 мл после добавления ферментов, 3 мМ фосфат калия (рН 7,5), 25 мкг неочищенное рекомбинантной ΡΐΌΛ-альдолазы из С.1ек1ок1егопг приготовленной как описано в примере 4, 500 мкг неочищенной Ьаспартат-аминотрансферазы (АкрС) как описано в примере 1, и твердый триптофан для поддержания концентрации на уровне > 60 мМ (насыщенный; не полностью растворяется во время реакции).

Реакционную смесь инкубировали при 30°С в течение 30 мин при перемешивании. Серин, аланин, и аспартат служили источниками 3-углеродной цепи. Определение проводили с вторичными ПФферментами (очищенными), способными выполнять бета-элиминацию и бета-лиазные реакции (триптофаназа (ТИА), триптофаназа с двойной мутацией, бета-тирозиназа (ТВЬ)) и без этих ферментов. Результаты представлены в табл. 4.

- 30 009284

Таблица 4. Получение монатина с использованием альтернативных С3-углеродных источников

СЗ-углеродная молекула	Дополнительный ПФ-фермент	Относительная активность
нет	нет	0%
пируват	нет	100%
серин	нет	3%
серин	11 мкг ΤΝΑ дикого типа (1ед.)	5,1%
серин	80 мкг ΤΝΑ с двойной мутацией	4,6%
аланин	нет	32%
аланин	11 мкг ΤΝΑ дикого типа	41,7%
аланин	80 мкг мутантной ΤΝΑ	43,9%
аспартат	НО ηγΤΝΑ дикого типа (10 ед.)	7,7%
аспартат	5 ед. ТРЬ дикого типа (неочищ.)	5,1%
аспартат	80 мкг мутантной ΤΝΑ	3,3%

Монатин, полученный из аланина и серина как 3-углеродных источников, проверяли способами ЖХ/МС/МС-дочернего скан-анализа и показали, что он идентичен стандартному монатину. Аланин оказался лучшим из протестированных альтернативных источников, и его подвергли трансаминированию ферментом ЛкрС. Количество полученного монатина увеличивалось при добавлении триптофаназы, которая в качестве вторичной активности проявляет способность катализировать реакцию трансаминирования. Количество монатина, полученного из серина как источника углерода, практически удваивалось при добавлении ферментов триптофаназы, даже несмотря на то, что количество добавленной триптофаназы составляло всего одну пятую от количества аминотрансферазы. Фермент ЛкрС обладает в некоторой степени самостоятельной бета-элиминационной активностью. Результаты, полученные с применением аспартата, показывают, что активность триптофаназы в отношении аспартата не увеличивает те же самые сайт-направленные мутации, наличие которых предполагалось ранее в отношении бетатирозиназы. Ожидается, что мутантная бета-тирозиназа будет обладать более высокой активностью при синтезе монатина.

Пример 9. Химический синтез монатина.

Добавление аланина к индол-3-пировиноградной кислоте приводит к образованию монатина, и эту реакцию можно проводить как синтетическую с реактивом Гриньяра или органолитиевым реактивом.

Например, к 3-хлор- или 3-бром-аланину, который заблокирован по карбоксильной и аминогруппам, добавляют магний в безводных условиях. Затем добавляют индол-3-пируват (также с заблокированными соответствующим образом группами) и из продукта реакции после удаления защитных групп получают монатин. Среди защитных групп, которые хорошо подходят для применения в данном синтезе, можно назвать ТГП (тетрагидропираниловый эфир), который легко присоединяется и удаляется.

Пример 10. Обнаружение монатина и ПМ.

Данный пример описывает способы, используемые для обнаружения присутствия монатина или его предшественника, 2-гидрокси 2-(индол-3-илметил)-4-кетоглутаровой кислоты.

ЖХ/МС-анализ. Анализ смесей на присутствие монатина в форме альфа-кетокислоты (предшественника монатина, ПМ) монатина, полученного в биохимических реакциях ίη νί\Ό и ίη νίϋΌ, проводили с использованием прибора \Уа1ег8/М1сгота88 для жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии, состоящего из жидкостного хроматографа \Уа1егк 2690 с монитором поглощения, оснащенным фотодиодной матрицей (ФДМ) \Уа1егк 996, который устанавливали последовательно между хроматографом и трехполосным квадрупольным масс-спектрометром М1сготак8 фиайго ИШта. ЖХ-разделение выполняли при комнатной температуре на хроматографической колонке с обращенной фазой 8ире1со ^^8соνе^у С₁₈, 2,1мм х 150мм, или на хроматографической колонке с обращенной фазой Х1егга М§ С₆, 2,1 мм х 250 мм. Подвижная фаза для жидкостной хроматографии состояла из: А) воды, содержащей 0,05% (ν/ν) трифторуксусной кислоты, и В) метанола, содержащего 0,05% (ν/ν) трифторуксусной кислоты.

Использовали линейный градиент элюции от 5% В до 35% В, от 0 до 9 мин; линейный градиент от 35% В до 90% В от 9 до 16 мин, изократическую элюцию при 90 % В от 16 до 20 мин; линейный градиент от 90% В до 5% В с 20 до 22 мин. Период восстановления равновесия между пробами составлял 10 мин. Скорость потока элюента составляла 0,25 мл/мин, ФДМ-поглощение регистриовали от 200 до 400 нм. Все параметры Е81-МС были оптимизированы и подобраны на основании возникновения протонированных молекулярных ионов ([М + Н]⁺) интересующих аналитов и образования характеристичных фрагментарных ионов.

Для ЖХ/МС анализа монатина были использованы следующие инструментальные параметры: капиллярность 3,5 кВ; конус 40 В; шестиугольник 1:20; апертура 0 В; шестиугольник 2: 0 В; температура источника 100 °С; температура десольватации 350°С; газ при десольватации 500 л/ч; газ в конусе 50 л/ч; низкая разрешающая способность масс-спектрометра (01): 15.0; высокая разрешающая способность

- 31 009284 масс-спектрометра (01) 15.0; энергия иона 0,2; напряжение на входе 50 В; энергия столкновения 2; напряжение на выходе 50 В; низкая разрешающая способность масс-спектрометра(02): 15; высокая разрешающая способность масс-спектрометра (01) 15; энергия иона 3,5; умножитель:650. Неопределенность для представленных отношений массы/заряда (т/ζ) и молекулярных масс составляют ± 0,01%. Исходное детектирование монатина в форме альфа-кетокислоты (ПМ) и монатина в смесях осуществляли посредством ЛЖ/МС мониторинга с получением масс-спектров для области т/ζ 150-400. Хроматограммы выбранных ионов для протонированных молекулярных ионов ([М + Н]⁺) = 292 для ПМ, ([М + Н]⁺) = 293 для монатина позволяли прямо идентифицировать эти аналиты в смесях.

МС/МС-анализ. ЛЖ/МС/МС дочерних ионов монатина выполняли следующим образом. Анализ дочерних ионов включает трансмиссию интересующего исходного иона (например, т/ζ = 293 для монатина) из первого масс-спектрометрического анализатора (01) в коллизионную ячейку массспектрометра, куда был введен аргон, и химическую диссоциацию исходного иона на фрагментарные (дочерние) ионы. Затем эти фрагментарные ионы детектируют на втором масс-спектрометрическом анализаторе (02), после чего они могут быть использованы для подтверждения структуры исходного иона.

Для ЖХ/МС/МС анализа монатина были использованы следующие инструментальные параметры: капиллярность 3,5 кВ; конус 40 В; шестиугольник 1:20; апертура 0 В; шестиугольник 2: 0 В; температура источника 100°С; температура десольватации 350°С; газ при десольватации 500 л/ч; газ в конусе 50 л/ч; низкая разрешающая способность масс-спектрометра (01) 13.0; высокая разрешающая способность массспектрометра (01) 13.0; энергия иона 0,2; напряжение на входе 5 В; энергия столкновения 14; напряжение на выходе 1 В; низкая разрешающая способность масс-спектрометра (02) 15; высокая разрешающая способность масс-спектрометра (01) 15; энергия иона 3,5; умножитель 650.

Высокопроизводительное определение монатина

Для высокопроизводительных анализов (< 5 мин/образец) смесей на содержание монатина, полученного в реакциях ш νίίτο и ш νίνο, использовали описанное выше оборудование и параметры, описанные для ЛЖ/МС/МС. ЛЖ-разделение выполняли при комнатной температуре на хроматографической колонке Х1егга М8 С₆, 2,1 мм х 250 мм посредством изократической элюции в 15%-ом водном МеОН, 0,25% уксусной кислоте при скорости потока 0,3 мл/мин. Детектирование монатина в смесях осуществляли способом мониторинга выбранной реакции (МВР)-масс-спектрометрии, который включал мониторинг перехода от специфичного исходного иона, возникшего при столкновении ([М + Н]⁺= 293,1) к дочернему иону (т.е. фрагментарному иону при т/ζ = 168,1, предварительно определенному как иону 3бута-1,3-диенил-1Н-индол-карбония) для достижения максимальной чувствительности, избирательности и производительности при детектировании монатина. Одновременно получали данные ФДМпоглощения для последующего подтверждения подлинности монатина.

Пример 11. Получение монатина в бактериях.

Данный пример описывает способы, используемые для получения монатина в клетках Е. ^1ί. Квалифицированные специалисты поймут, что аналогичные способы могут быть использованы для получения монатина в клетках других бактерий. Для синтеза монатина могут быть также использованы векторы, содержащие другие гены (фиг. 2).

Среду Тгр-1 с глюкозой, минимальную среду, применявшуюся для повышения продукции триптофана в клетках Ε^οϊί, готовили следующим образом: к 700 мл девятикратно очищенной воды добавляли следующие реактивы: 2 г (ΝΉ₄)28Ο₄, 13,6 г КН₂РО₄, 0,2 г Мд8О₄7Н₂О, 0,01 г СаС1₂2Н₂О и 0,5 мг Ее8О₄7Н₂О. рН корректировали до 7,0, объем увеличивали до 850 мл, после чего среду автоклавировали. 50%-ный раствор глюкозы готовили отдельно и стерилизовали фильтрованием. 40 мл раствора глюкозы добавляли к основной среде (850 мл), для конечного объема, равного 1 л.

Раствор Ь-триптофана с концентрацией 10 г/л готовили на 0,1М растворе фосфата натрия рН 7 и стерилизовали фильтрованием. Обычно к культурам добавляли 1/10 объема, как описано ниже. Готовили и стерилизовали фильтрованием 10% раствор пирувата натрия. Как правило, на 1 л культуры добавляли аликвоту 10 мл. Готовили концентрированные растворы ампициллина (100 мг/мл), канамицина (25 мг/мл) и 840 мМ изопропилтиогалактозида (ИПТГ), стерилизовали фильтрованием и хранили при -20°С до использования. Твин-20 (полиоксиэтилен 20-сорбитан-нанолаурат использовали в конечной концентрации 0,2% (ν/ν). Ампициллин использовали в нелетальных концентрациях, обычно конечная концентрация составляла 1-10 мкг/мл.

Готовили свежие чашки с Εχο1ί ВЬ21 (ΌΕ3): СЗекЮЧегош ргаА/рЕТ 30 Ха/ЫС, (описанными в примере 4) на среде ЬВ с добавлением 50 мкг/мл канамицина. Ночные культуры (5 мл) инокулировали одной колонией и выращивали при 30 °С на среде ЬВ с канамицином. Как правило, для индукции на среде 1гр-1 с глюкозой использовали инокулят1:50. Добавляли свежий антибиотик до конечной концентрации 50 мг/л. Встряхиваемые колбы хранили при 37°С на качалке до индукции.

Образцы клеток отбирали через каждый час до тех пор, пока ОЭ₆₀₀ не достигала 0,35-0,8. После этого выполняли индукцию клеток 0,1 мМ раствором ИПТГ и температуру снижали до 34°С. Перед индукцией (нулевой момент времени) отбирали образцы (1 мл) и центрифугировали их при 5000д. Надосадочную жидкость замораживали при -20°С для ЖХ/МС анализа. Через 4 ч после индукции отбирали другой образец 1 мл и центрифугировали его, чтобы отделить бульон от осажденных клеток. Триптофан, пиру

- 32 009284 ват натрия, ампицилллин и Твин добавляли как описано выше.

Клетки выращивали в течение 48 ч после индукции, после чего отбирали еще один образец объемом 1 мл и готовили его как описано выше. Через 48 ч добавляли еще одну аликвоту триптофана и пирувата. Весь объем культуры центрифугировали при 3500 об./мин после выращивания в течение приблизительно 70 ч (после индукции) в течение 20 мин при 4°С. Надосадочную жидкость декантировали, бульон и клетки замораживали при -80°С. Фракции бульона фильтровали и анализировали способом ЖХ/МС. Мониторинг высоты и площади пиков ([М + Н]⁺) = 293 осуществляли как описано в примере 10. Из полученных значений вычитали фоновые значения, измеренные для среды. Данные нормализовали для роста клеток, откладывая на графике высоту пика ([М + Н]⁺) = 293, деленную на оптическую плотность культуры при 600 нм.

При добавлении пирувата, ампциллина и Твина через 4 ч после индукции уровень продукции монатина был выше, чем при добавлении этих соединений одновременно с индукцией. Другие добавки, например, РЬР (пиридоксаль-5'-фосфат), дополнительный фосфат или дополнительный МдС1₂ не повышали продукцию монатина. Более высокие титры монатина получали при использовании триптофана вместо индол-3-пирувата и добавлении триптофана после индукции, а не одновременно с инокуляцией или индукцией. Перед индукцией и через 4 ч после индукции (во время добавления субстрата) в ферментативном бульоне и клеточных экстрактах концентрации монатина были ниже уровня обнаружения. В качестве отрицательного контроля использовали клетки, содержащие только вектор рЕТ30а, а также культуры, в которые не добавляли пируват и триптофан. МС-сканограммы исходного иона продемонстрировали, что из более крупных молекул соединение с (π+1)/ζ=293 не образуется, сканограммы дочерних йонов (выполненные как описано в примере 10) были сходным со сканограммами монатина, выполненными ίη νίΐΐΌ.

Эффект Твина изучали, используя Твин-20 в конечных концентрациях 0, 0,2% (ν/ν) и 0,6%. Наибольшее количество монатина образовывалось во встряхиваемых колбах в присутствии 0,2% Твина. Концентрации ампициллина варьировали от 0 до 10 мг/мл. Количество монатина в клеточном бульоне быстро повышалось (2,5-кратное увеличение) при концентрациях ампициллина от 0 до 1 мкг/мл и повышалось в 1,3 раза когда концентрация ампициллина увеличивалась до 1 до 10 мкг/мл.

На фиг. 10 показаны типичные результаты изменения количества монатина со временем. Количество монатина, секретируемого в клеточный бульон, увеличивается, даже когда значения нормализованы по росту клеток.

Количество монатина в бульоне, которое оценивали при использовании коэффициента молярной экстинкции триптофана, составил менее 10 мкг/мл. Этот же эксперимент повторяли с клетками, содержащими вектор без вставки ргоА. Многие значения были отрицательными, это указывает на то, что высота пика при π/ζ=293 в этих культурах была ниже, чем в одной лишь среде (фиг. 10). При отсутствии триптофана и пирувата значения были последовательно ниже; это наблюдение демонстрирует, что продукция монатина является результатом ферментативной реакции, катализируемой альдолазой.

Получение монатина в бактериальных клетках ίη νί\Ό повторяли в экспериментах со встряхиваемыми колбами и в ферментерах. Образец монатина объемом 250 мл в бесклеточном бульоне очищали способом анионобменной хроматографии и препаративной жидкостной хроматографии с обращенной фазой. Образец выпаривали и направляли на анализ массы, имеющий высокую разрешающую способность (описан в примере 6). Масс-спектрометрия с высокой разрешающей способностью показывает, что образующимся метаболитом является монатин.

Анализы ίη νίίΐΌ указывают на необходимость присутствия аминотрансферазы в более высоких концентрациях, чем альдолазы (см. пример 6); следовательно, имела место сверхэкспрессия аминотрансферазы из Е.соБ в комбинации с геном альдолазы для увеличения количества образующегося монатина. Были созданы следующие праймеры для вставки СЛекФгош ргоА в оперон с акрС/рЕТ30 ХаЫС,: 5'праймер: АСТС66АТССС6АА66А6АТАТАСАТАТ6ТАС6ААСТ666АСТ (последовательность 8ЕО ΙΌ № 67) и 3'-праймер: С66СТ6ТС6АСС6ТТА6ТСААТАТАТТТСА66С (последовательность 8ЕО ΙΌ № 68). 5'-праймер содержит сайт ВатШ, 3'-праймер содержит сайт 8аП для клонирования. ПЦР выполняли как описано в примере 4 с последующей очисткой геля. Конструкция акрС/рЕТ30 ХаЫС и продукт ПЦР были гидролизованы в присутствии ВатШ и 8аП. Продукты гидролиза были очищены на вращающейся колонке 01адеп. Продукт ПЦР ргоА был сшит с вектором с использованием набора для сшивки ДНК ВосНе Вар1б ^NΑ Ыдайоп Κίΐ (Индианаполис, Индиана), в соответствии с инструкциями производителя. Химическую трансформацию осуществляли с использованием NоνаЬ1иек 8тд1ек (Nоνадеη), как описано в примере 1. Колонии выращивали в среде ЬВ, содержащей канамицин в концентрации 50 мг/л, и плазмидную ДНК очищали с использованием спинового мини-набора О|;щеп. Скрининг клонов проводили посредством рестрикционного анализа продуктов гидролиза, последовательность подтверждали с помощью 8ес|\\тщ111 (Хьюстон, Техас). Конструкции субклонировали в ВЬВ(ОЕ3), ВЬВ(ПЕ3)рЬук8, ВЬ21(ОЕ3) и ВЬ21(ПЕ3)рЬук8 (Nоνадеη). Конструкцию ргоА/рЕТ30 ХаЫС также трансформировали в ВЬ21(ПЕ3)рЬук8.

Первоначальное сравнение образцов ВБВ(ПЕ3) из встряхиваемых колб в стандартных условиях, которые были описаны выше, продемонстрировало, что добавление второго гена (акрС) семикратно уве

- 33 009284 личивает количество продуцируемого монатина. Для ускорения роста были использованы хозяйские штаммы, полученные из ВЬ21(ЭЕ3). Клоны ргоА и 2 клона оперона гена были индуцированы в среде Тгр-1, как описано выше, в среду хозяев рЬуз8 был также добавлен хлорамфеникол (34 мг/л). Были проведены эксперименты со встряхиваемыми колбами с добавлением и без добавления 0,2% Твина-20 и ампициллина в концентрации 1 мг/л. Количество монатина в бульоне рассчитывали с использованием в качестве стандарта полученного ш νίΙΐΌ и очищенного монатина. Анализ 8ВМ проводили как описано в примере 10. Образцы клеток отбирали в момент времени 0 и через 4, 24, 48, 72 и 96 ч выращивания.

В табл. 5 показаны результаты для максимальных количеств, полученных в бульонных культурах. В большинстве случаев, конструкция из двух генов обеспечивала более высокий выход, чем конструкция ргоА. Из штаммов рЬуз8 с менее плотной клеточной оболочкой секретировалось большее количество монатина, даже несмотря на то, что для этих штаммов характерна более низкая скорость роста. На уровне продукции благоприятно сказывалось добавление Твина и ампциллина.

Таблица 5. Количество монатина, продуцированного в бактериях Е.соН

Конструкция	Хозяин	Твин + ампциллин	мкг/мл монатина	время
ргоА	ВЬ21(ОЕЗ)	-	0,41	72 ч
ргоА	В1_21(ОЕЗ\|	4-	1,58	48 ч
ргоА	ВТ21ЮЕЗ)р1.у_к8	-	1,04	48 ч
ргоА	ВЬ21(ОЕЗ)рЬу58	+	1,60	48 ч
ахрС-ргоА	ВЬ21(ОЕЗ)	-	0,09	48 ч
азрС-ргоА	ВЬ21(Г)ЕЗ)	+	0,58	48 ч
трС-ргоА	В1_21(1)ЕЗ)рГу.з8	- 1 1,39	48 ч
азрС-ргоА	ВТ21(ОЕЗ)рЬуз8	+ 6,68	48 ч

Пример 12. Получение монатина в дрожжах.

Данный пример описывает способы, используемые для получения монатина в эукариотических клетках. Квалифицированные специалисты поймут, что аналогичные способы могут быть использованы для получения монатина в любых других интересующих их клетках. Кроме того, в дополнение к генам, описанным в данном примере или вместо них, могут быть также использованы другие гены (например, перечисленные на фиг. 2).

Для клонирования и экспрессии генов Е.со11 азрС и С. 1ез1оз1егош ргоА в 8ассйаготусез сеге\тз1ае была использована векторная система с меченым эпитопом дрожжей рЕ8С ^еаз1 Ерйоре Таддшд Уес!ог 8уз!ет (8!га!адепе, Ла-Джолла, Калифорния). Векторы рЕ8С содержат оба промотора САЬ1 и САБ10 на противоположных цепях, с двумя отдельными сайтами множественного клонирования, что позволяет экспрессироваться двум генам одновременно. Вектор рЕ8С-Ыз также содержит ген Н1з3 для комплементации гистидиновой ауксотрофии в хозяйской ДНК (ΥРН500). Репрессию промоторов САЬ1 и САБ10 осуществляет глюкоза, индукцию - галактоза; для оптимальной экспрессии в дрожжах используют последовательность Козака. Плазмиды рЕ8С представляют собой челночные векторы, что позволяет получить первичную конструкцию в Е.соН (с генами Ь1а для выбора); однако в сайтах множественного клонирования сайты связывания бактериальных рибосом отсутствуют.

Для клонирования в рЕ8С-Ыз (подчеркнуты сайты рестрикции, последовательность Козака выделена жирным шрифтом): АзрС(ВатН1/8а11), САЬ1: 5'-СССССАТССАТААТССТТСАСААСАТТАССС-3' (последовательность 8ЕЦ ГО 69); и 5'-АССССТССАСТТАСАССАСТСССАСААТСС-3' (последовательность 8 ЕС) ГО 70). РгоА(ЕсоК!/Ш11), САЕ 10: 5'-ССССААТТСАТААТССТССААСТСССАСТТСТ-3' (последовательность 8ЕС) ГО 71); и 5'-СААТССССССССТТАСТСААТАТАТТТСАСССС-3' (последовательность 8ЕЦ ГО 72).

Вставка последовательности Козака привела к замене второго кодона в обоих зрелых белках с ароматической аминокислоты на валин. Амплификацию интересующих генов осуществляли с использованием в качестве матрицы минипрепарата рЕТ30 Ха/ЫС ДНК из клонов, описанных в примере 1 и примере 4. При проведении ПЦР использовали термосайклер градиентов ЕррепбогГ Маз!ег и следующий протокол для проведения реакции в объеме 50 мкл: 1,0 мл матрицы, 1,0 мкМ каждого праймера, 0,4 мМ каждого дНТФ, 3,5 Ед. высоко надежной полимеразы (Ехрапб Н1дй Е1бе1йу Ро1утегазе - Воске, Индианаполис, Индиана) и буферный раствор IX Ехрапб™ с магнием. Использованная программа термосайклера включала горячий старт при 94°С в течение 5 мин, далее 29 повторяющихся шагов: 94°С в течение 30 с, 50°С в течение 1 мин 45 с и 72°С в течение 2 мин 15 с. После 29 повторов образец поддерживали при 72°С в течение 2 мин и хранили при 4°С. Продукты ПЦР очищали посредством разделения на агарозном геле с 1% ТАЕ с последующим восстановлением набора для экстракции из геля О1Ас.|шск (Ц1адеп, Валенсия, Калифорния).

ДНК-вектор рЕ8С-Ыз (2,7 мкг) гидролизовали с помощью ВатН1/8а11 и очищали в геле, как описано выше. Продукт ПЦР азрС гидролизовали с помощью ВатН1/8а11 и очищали на колонке очистки О1Ас.|шск РСВ. Лигирование выполняли с использованием набора для быстрого лигирования ДНК Воске,

- 34 009284 в соответствии с инструкциями производителя. Обессоленные лигированные фрагменты электропорировали в 40 мкл Е1ес1готах ОН10В-компетентные клетки (^йгодеп) в одноразовой кювете Вюгаб с использованием генератора импульсов Вюгаб Оепе Ри1кег II контроллером импульсов, в соответствии с инструкциями производителя. После восстановления в течение 1 ч в 1 мл среды 8ОС трансформированные клетки высевали в чашки на среду ЬВ, содержащую ампициллин в концентрации 100 мкг/мл. Препараты плазмидной ДНК для клонов готовили с использованием наборов ОМргер 8рш М1шргер. Скрининг плазмидной ДНК проводили посредством рестрикционного анализа продуктов гидролиза, последовательность определяли с помощью 8ед^г1дй1, используя для подтверждения праймеры, созданные для вектора.

Клон акрС/рЕ8С-Н1к и продукт ПЦР ргоА гидролизовали с помощью ЕсоКЕ и №Й. Очистку и лигирование ДНК выполняли как описано выше. Конструкцию, состоящую из 2 генов, трансформировали в клетки ВР10В и осуществляли скринниг посредством рестрикционного гидролиза и определения последовательности ДНК.

Конструкцию трансформировали в клетки 8.сегес1к1ае, штамм ΥРН500, используя набор для трансформации 8.с.ЕакуСтрТМ ипуйгодеп). Реакции трансформации осуществляли на чашках Петри с минимальной средой (руководство [п\з1годеп рΥЕ82), содержащей 2% глюкозы. Скрининг индивидуальных дрожжевых колоний на наличие генов ргоА и акрС выполняли посредством ПЦР колоний с использованием описанных выше праймеров ПЦР. Осажденные клетки (2 мкл) суспендировали в 20 мкл буферного раствора Υ-Εχ^Α (2уто Кекеагсй), содержащего 1 мкл зимолазы и нагревали при 37°С в течение 10 мин. 4 мкл этой суспензии затем использовали при проведении ПЦР в пробе 50 мкл, используя реакционную смесь и программу ПЦР, описанные выше.

Культуры (5 мл) выращивали в течение ночи на среде 8С-Н1к с глюкозой при 30°С и 225 об./мин. Клетки постепенно адаптировали к росту на рафинозе, чтобы минимизировать лаг-период, предшествующий индукции галактозой. После выращивания в течение приблизительно 12 ч измеряли оптическую плотность при 600 нм, надлежащий объем клеток центрифугировали и ресуспендировали, чтобы их ΟΌ в свежей среде 8С-Н1к была равной 0,4. Последовательно использовали следующие источники углерода: 1% рафинозу + 1% глюкозу; 0,5% глюкозу + 1,5% рафинозу, 2% рафинозу и наконец 1% рафинозу +2% галактозу для индукции.

После выращивания в течение приблизительно 16 ч в индукционной среде культуры (50 мл) делили на повторности (25 мл), и в одну из повторностей добавляли следующие соединения (показаны конечные концентрации): 1 г/л Ь-триптофана; 5 мМ фосфата натрия рН 7.1; 1 г/л пирувата натрия; 1 мМ МдС1₂. Для использования в качестве отрицательного контроля сохраняли образцы бульона и осажденных клеток из неиндукционной среды и из 16-часовых культур перед добавлением субстратов, необходимым для метаболизма по монатиновому пути. В качестве другого отрицательного контроля использовали конструкции, содержащие только функциональный ген акрС (и укороченный ген ргоА). После индукции клеткам позволяли расти в течение 69 ч. В некоторых случаях индукцию дрожжевых клеток осуществляли при более низкой ΟΌ и выращивали в течение всего 4 ч до добавления пирувата и триптофана. Однако выяснилось, что эти субстраты монатина подавляют рост и эффективнее добавлять их при более высокой ΟΌ.

Осажденные клетки из культур лизировали в 5 мл ΥеакΐВикΐе^ТМ + 50 мкл ТНР (Nоνадеη) на грамм сырого веса клеток, в соответствии с протоколом производителя, с добавлением ингибиторов протеазы и бензоназы нуклеазы, как описано в предыдущих примерах. Культуральный бульон и клеточные экстракты фильтровали и анализировали посредством 8ЕМ, как описано в примере 10. При использовании этого способа в образцах бульона не было обнаружено монатина, т.е. клетки не секретируют монатин в данных условиях. Возможно, в данных условиях движущая сила протонов оказывается недостаточной, или общие переносчики аминокислот могут быть насыщены триптофаном. Экспрессия белка не достигала уровня, позволявшего обнаружить изменения, используя электрофорез в ПААГ с добавление додецилсульфата натрия.

Монатин удавалось временно обнаружить (приблизительно в концентрации 60 мкг/мл) в клеточных экстрактах культуры с двумя функциональными генами, когда к среде добавляли пируват и триптофан. Монатин не был обнаружен ни в одном клеточном экстракте, служившем отрицательным контролем. Анализы 1п хйго на присутствие монатина проводились в двух повторностях с концентрацией общего белка 4,4 мг/мл (что приблизительно вдвое больше, чем обычно используется для клеточных экстрактов Е.сой), с использованием оптимизированного анализа, описанного в примере 6. Другие анализы проводили с добавлением либо альдолазы С.1ек1ок1егош РгоА в концентрации 32 мкг/мл или аминотрансферазы АкрС, чтобы определить, какой из ферментов является лимитирующим в клеточном экстракте. В образцы-отрицательные контроли ферменты не добавляли или добавляли только аминотрансферазу АкрС (конденсация альдоля в некотором количестве возможна без фермента). Образцы - положительные контроли содержали частично очищенные ферменты (30-40%), 16 мкг/мл альдолазы и 400 мкг/мл аминотрансферазы.

Результаты, полученные ш νίϋΌ, анализировали способом 8ЕМ. Анализ клеточных экстрактов показал, что триптофан эффективно транспортировался внутрь клеток, в случае добавления его в среду по

- 35 009284 сле индукции; в результате концентрации триптофана были на два порядка выше, чем в образцах, в которые дополнительный триптофан не добавляли. Результаты анализа монатина ίη νίίΐΌ показаны в табл. 6 (нг/мл).

Таблица 6. Продукция монатина в экстрактах дрожжевых клеток

	Констр. азрС	+ альдолаз а	+А»рС	Констр. из 2 генов	+ альдолаз а	-Азр С
В условиях репрессии (глюкозная среда)	0	888,3	173,5	0	465,»	829
Через 24 часа после индукции	0	2832,8	624,4	0	1375,6	9146, 6
Через 69 часов после индукции	0	4937,3	340,3	71,9	1652,8	23693 ,5
Через 69 часов после индукции + субстрат	0	556,9	659,1	21,9	755,6	16688 ,2
Положительный контроль (очищенные ферменты	21853			21853
Отрицательный контроль (без ферментов)	0		254,3	0		254,3

Положительные результаты получены с клеточными экстрактами, содержащими полную конструкцию из двух генов, при добавлении или без добавления субстрата к питательной среде. Эти результаты, по сравнению с положительным контролем, показывают, что уровень экспрессии ферментов составлял около 1% от экспрессии общего белка в дрожжах. Количество монатина, продуцированного, когда анализ клеточного экстракта, содержащего конструкцию акрС, проводили с альдолазой, было значительно больше, чем когда клеточные экстракты анализировали отдельно, т.е. рекомбинантная аминотрансфераза АкрС составляет приблизительно 1-2% от общего белка дрожжей. Клеточные экстракты неиндуцироваанных культур обладали меньшей активностью при анализе с альдолазой из-за присутствия в клетках нативной аминотрансферазы. При анализе с аминотрансферазой АкрС активность экстрактов из неиндуцированных клеток увеличивалась до количества монатина, продуцированного в образцах отрицательного контроля с АкрС (приблизительно 200 нг/мл). В противоположность этим наблюдениям активность, наблюдавшаяся при анализе клеточных экстрактов с конструкцией из двух генов, при добавлении аминотрансферазы усиливалась больше, чем при добавлении альдолазы. Поскольку экспрессия обоих генов должна осуществляться на одном и том же уровне, эти данные указывают на то, что количество продуцированного монатина максимально, когда уровень аминотрансферазы выше уровня альдолазы, что согласуется с результатами, показанными в примере 6.

Добавление пирувата и триптофана подавляет не только рост клеток, но, по-видимому и экспрессию белка. Для устранения триптофановой ауксотрофии в хозяйских клетках УРН500 может быть добавлена плазмида рЕ8С-Тгр, как источник поступления триптофана, оказывающий меньшее воздействие на рост, экспрессию и секрецию.

Пример 13. Усовершенствование ферментативных процессов с использованием сопряженных реакций.

Теоретически при отсутствии побочных реакций, а также деградации субстрата или промежуточных продуктов максимальное количество продукта, образующегося в результате ферментативной реакции, показанной на фиг. 1, прямо пропорционально константам равновесия каждой реакции и концентрациям триптофана и пирувата.

Триптофан является не только хорошо растворимым субстратом, и при концентрациях пирувата выше 200 мМ выход продукта снижается (см. пример 6).

В идеале концентрация монатина должна быть максимальной по отношению к субстратам, для того чтобы снизить стоимость разделения. Может быть выполнено физическое разделение, при котором монатин удаляют из реакционной смеси, предотвращая обратные реакции. После этого можно регенерировать катализаторы и сырьевые материалы. Поскольку монатин сходен по размеру, заряду и гидрофобностью с рядом других реактивов и промежуточных веществ, физическое разделение осуществить сложно, за исключением случаев, когда имеет место высокая аффинность к монатину (например, при применении способа аффинной хроматографии). Однако реакции монатина могут быть сопряжены с другими реакциями, таким образом, чтобы равновесие в системе было смещено в сторону образования монатина. Ниже приведены примеры процессов, которые могут быть использованы для повышения выхода монатина из триптофана из индол-3-пирувата.

- 36 009284

Сопряженные реакции с использованием оксалацетат декарбоксилазы (ЕС 4.1.1.3)

Реакция показана на фиг. 11. Для смещения равновесия в сторону образования индол-3-пирувата использованы триптофаноксидаза и каталаза. Каталазу добавляют в избытке, чтобы обеспечить отсутствие перекиси водорода, которая может изменить направление реакции, повредить ферменты и промежуточные продукты. Каталазная реакция обеспечивает регенерацию кислорода. В качестве альтернативного субстрата может быть использован индол-3-пируват.

В качестве донора аминной групы для аминирования ПМ используют аспартат, а в качестве фермента аминирования - аминотрансферазу. В идеале следует использовать аминотрансферазу, обладающую низкой специфичностью в отношении реакции образования триптофан/индол-3-пируват по сравнению с реакцией образования монатина из предшественника монатина, чтобы аспартат не мог быть использован для реаминирования индол-3-пирувата. Для превращения оксалацетата в пируват и углекислый газ может быть использована оксалацетат декарбоксилаза (из Рзеиботопаз зрр.). Поскольку СО₂ является летучим соединением, он не может быть использован в реакции с ферментами, что сокращает или даже позволяет полностью избежать обратной реакции. Образовавшийся на данной стадии пируват может быть утилизирован в реакции альдольной конденсации. Могут быть использованы и другие декарбоксилазы, известно что гомологи существуют у АсйпоЬасШиз асйпотусе!етсотйапз, ДсциГех аеойсиз, АгсНаеод1оЬиз Ги1д1биз, Ахо1оЬас1ег уте1апбй, Вас!его1без ГгадШз, несколько видов Вогбе!е11а, Сатру1оЬас!ег _)е.)иш, СЫогоЬшт !ер1бит, СН1огоГ1ехиз аигапйасиз, Еп!егососсиз ГаесаДз, РизоЬас!егшт пис1еаи!ит, К1еЬз1е11а рпеитошае, Ьедюпе11а паиторНДа, Мадпе!ососсиз МС-Ι, МаппНетиа Наето1уДса, Ме!Ну1оЬасй1из Г1аде11а!из КТ, Раз!еиге11а ти1!ос1ба Рт70, Ре!го!ода тюДегта. РогрНуготопаз дтд1уайз, несколько видов Рзеиботопаз, несколько видов Ругососсиз, ВНобососсиз, несколько видов 8а1топе11а, несколько видов 8!егр!ососсиз, ТНегтосНготаДит !ер1бит, ТНегто!ода тапДте, Тгеропета ра111бит и несколько видов У1Ьгю.

Проведены анализы на триптофанаминотрансферазу с использованием аспартат аминотрансферазы (АзрС) из Е.сой, тирозин аминотрансферазы (ТугВ) из Е.сой, аминотрансферазы, активной в отношении широкого спектра субстратов из Ь.та_)ог и двух коммерческих глутамат-оксалацетат трансфераз свиньи, как описано в примере 1. В качестве акцепторов аминогруппы были проверены оксалацетат и альфакетоглутарат. Проведено сравнение соотношения активности при использовании монатина (пример 7) и активности при использовании триптофана, для того чтобы определить какой из ферментов обладает самой высокой специфичностью в отношении монатин-аминотрансферазной реакции. Эти результаты показали, что ферментом с наиболее высокой специфичностью в отношении реакции, ведущей к образованию монатина, по сравнению с реакцией образования триптофана, является свиная глутаматоксалацетат аминотрансфераза (ГОАТ) типа ΙΙ-А (81дта 67005). Такая специфичность не зависела от используемого акцептора аминогруппы. Поэтому именно этот фермент был использован в сопряженных реакциях с оксалацетат декарбоксилазой.

Типичная реакция, начинающаяся с индол-3-пирувата, включала (указаны конечные концентрации в реакционной смеси) 50 мМ Трис-НС1, рН 7,3; 6 мМ индол-3-пирувата 6 мМ пирувата натрия, 6 мМ аспартата, 0,05 мМ РЬР, 3 мМ фосфата калия, 3 мМ МдС1₂, аминотрансферазу в концентрации 25 мкг/мл, альдолазу С.!ез!оз!егош РгоаА, и декарбоксилазу в концентрации 3 Ед./мл (81дта 04878). Реакции продолжались в течение 1 ч при 26°С. В некоторых случаях декарбоксилазу исключали или аспартат заменяли альфа-кетоглутаратом (в качестве отрицательного контроля). Вместо ГОАТ были проверены также перечисленные выше аминотрансферазы для подтверждения более ранних экспериментов по специфичности. Образцы фильтровали и анализировали способом ЛЖ/МС, как описано в примере 10. Результаты демонстрируют, что максимальное количество монатина на мг белка образуется при использовании ГОАТ, при этом образуется минимальное количество триптофана, являющегося побочным продуктом. Кроме того, добавление декарбоксилазы обеспечивало 2-3-кратное преимущество. По сравнению с другими аминотрансферазами фермент АзрС Е.сой также обеспечивал получение больших количеств монатина.

Образование монатина увеличивалось: 1) при периодическом (через каждые 0,5-1 ч) добавлении 2 мМ индолпирувата, пирувата и аспартата; 2) при проведении реакции в анаэробной среде или при использовании дегазированных буферных растворов; 3) при продолжении реакции в течение ночи; 4) при использовании свежеприготовленной декарбоксилазы, не подвергавшейся многократному замораживанию-оттаиванию. Концентрации пирувата выше 12 мМ ингибировали декарбоксилазу. При концентрациях индол-3-пирувата выше 4 мМ повышались скорости побочных реакций с участием индол-3-пирувата. Количество используемого в реакции индол-3-пирувата можно было увеличить в случае увеличения количества альдолазы. Обнаружено, что высокие концентрации фосфата (50 мМ) и аспартата (50мМ) ингибируют декарбоксилазу. Количество добавляемой декарбоксилазы может быть снижено до 0,5 Ед./мл без уменьшения образующегося монатина в реакции, продолжающейся 1 ч. Количество образованного монатина увеличивалось при повышении температуры от 26 до 30°С и от 30 до 37°С, однако при 37°С также повышалась скорость побочной реакции образования индол-3-пирувата. Количество образовавшегося монатина увеличивалось при повышении рН от 7 до 7,3 и оставалось относительно стабильным при рН 7,3-8,3.

Типичная реакция, начинающаяся с триптофана, включала (указаны конечные концентрации в ре

- 37 009284 акционной смеси) 50 мМ Трис-НС1, рН 7,3; 20 мМ триптофана, 6 мМ пирувата натрия, 6 мМ аспартата, 0,05 мМ РЬР, 3 мМ фосфата калия, 3 мМ МдС1₂, аминотрансферазу в концентрации 25 мкг/мл, альдолазу СЛейойегош РгоаА в концентрации 50 мкг/мл, декарбоксилазу в концентрации 4 Ед./мл, оксидазу Ьаминокислоты (81дта А-2805) в концентрации 5-200 мЕ/мл, каталазу в концентрации 168 Е/мл (81дта С3515) и 0,008 мг ФАД. Реакции продолжали в течение 30 мин при 30°С. Добавление декарбоксилазы благоприятно сказывалось на проведении реакции. Наибольшее количество монатина удавалось получить при использовании оксидазы в концентрации 50 мЕ/мл. Сходных улучшений удавалось достичь при использовании в качестве субстрата индол-3-пирувата. Кроме того, количество образующегося монатина увеличивалось: 1) при низкой концентрации триптофана (т.е. ниже К₂ аминотрансферазы, при которой триптофан не способен конкурировать с ПМ за активные сайты) и 2) отношение оксидазы к альдолазе и аминотрансферазе поддерживалось на уровне, при котором отсутствует накопление индол-3-пирувата.

Независимо от того, каким было исходное вещество, с которого начиналась реакция, индол-3пируватом или триптофаном, количество образующегося триптофана за время инкубации, продолжавшейся 1-2 ч, увеличивалось при увеличении количества всех используемых ферментов в 2-4 раза при сохранении соотношения между ферментами. При использовании любого из этих субстратов концентрации монатина достигали приблизительно 1 мг/мл. Если реакция начиналась с индол-3-пирувата, количество образующегося триптофана составляло обычно менее 20% от количества продукта, что указывает на целесообразность использования сопряженных реакций. Дальнейшая оптимизация и контроль над концентрациями промежуточных продуктов и побочных реакций позволят еще более повысить продуктивность и выход продукта.

Сопряженные реакции с использованием лизин эпсилон аминотрансферазы (ЕС 2.6.1.36)

Лизин эпсилон аминотрансфераза (Ь-лизин 6-трансминаза) обнаружена у нескольких микроорганизмов, включая Кйобососсик, МусоЬас!егшт, 8!гер!отусе5, Косагб1а, Е1ауоЬас!егшт, Сапб1ба и!11к и 81гер1отусе5. Микроорганизмы используют ее на первом этапе образования некоторых бета-лактамных антибиотиков (Клик апб Петаш, 1. М1сгоЫо1. Вю!есй, 7:95-100, 1997). Этот фермент превращает лизин в Ь-2-аминоадипат 5-семиальдегид (аллизин) посредством РЬР-опосредованного трансаминирования С6 в молекуле лизина, с использованием альфа-кетоглутарата в качестве акцептора аминогруппы. Аллизин нестабилен и спонтанно подвергается внутримолекулярной деградации с образованием циклической молекулы 1-пиперидин 6-карбоксилата. За счет этого эффективно подавляются любые возможные обратные реакции. Реакция схематично показана фиг. 12. В качестве альтернативы может быть также использован фермент лизин-пируват-6-трансаминаза (ЕС 2.6.1.71).

При проведении типичной реакции 1 мл реакционной смеси содержал 50 мМ Трис-НС1, рН 7,3; 20 мМ индол-3-пирувата, 0,05 мМ РЬР, 6 мМ фосфата калия, рН 8, 2-50 мМ пирувата натрия, 1,5 мМ МдС1₂, 50 мМ лизина, 100 мкг аминотрансферазы (лизин-эпсилон аминотрансферазу ЬАТ-101, В1оСа!а1убс8, Пасадена, Калифорния) и 200 мкг альдолазы СЛейойегош РгоаА. Количество образующегося монатина увеличивалось с повышением концентрации пирувата. При использовании этих условий реакции (при 50 мМ пирувата) максимальное количество образующегося монатина составляло 1/10 от количества, наблюдавшегося при проведении сопряженных реакций и оксалацетат декарбоксилазой (приблизительно 0,1 мг/мл).

Пик с [М+Н]⁺ = 293, элюировавший во время, ожидаемое для монатина, и масс-спектр содержали несколько одинаковых фрагментов, наблюдавшихся при проведении других ферментативных процессов. Второй пик с правильным отношением массы к заряду (293) элюировал несколько раньше, чем обычно наблюдается элюция 8,8-монатина, образующегося в примере 6, что может указывать на присутствие другого изомера монатина. Этот фермент образует очень небольшое количество триптофана. Однако, вероятно, некоторая активность направлена на пируват (из которого в качестве побочного продукта образуется аланин). Кроме того, что этот фермент нестабилен. Для повышения выхода могут быть проведены эксперименты по направленной эволюции с целью улучшения стабильности, снижения активности по отношению к пирувату и повышению активности по отношению к ПМ. Эти реакции также могут быть сопряжены с оксидазой/каталазой Ь-аминокислоты, как описано выше.

Другие сопряженные реакции

Другая сопряженная реакция, которая может улучшить выход монатина из троптофана из индолпирувата показана на фиг. 13. Формиатдегидрогеназа (ЕС 1.2.1.2 или 1.2.1.43) является распространенным ферментом. Для некоторых формиат-дегидрогеназ необходим НАДФ, другие могут использовать НАДФН. В предыдущих примерах глутаматдегидрогеназа катализировала внутреннее превращение между предшественником монатина и монатином, при использовании буферных растворов на основе аммония. Присутствие аммония формиата и формиатдегидрогеназы является эффективной системой для регенерации кофакторов, а образование диоксида углерода - эффективный способ снижения скорости обратных реакций (Воттагшв е! а1., Вюса!а1у8к 10:37, 1994 и 6а1кт е! а1. Арр1. Епупоп.МкгоЬюк 63:4651-6, 1997). Кроме того, формиат аммония может быть в больших количествах растворен в реакционном буфере. Выход монатина в реакциях, катализируемых глутаматдегидрогеназой (или в результате аналогичного восстановительного аминирования), можно повысить посредством добавления формиатдегидрогеназы и формиата аммония.

- 38 009284

Для того чтобы сместить равновесие в сторону образования монатина могут быть использованы и другие процессы. Например, если при превращении ПМ в монатин, которое катализирует аминотрансфераза омега-аминокислот (ЕС 2.6.1.18), в качестве донора аминокислоты использовать аминопропан, как описано в патентах США 5,260,724 и 5,300,437 одним из полученных продуктов будет ацетон, который является более летучим соединением, чем субстрат аминопропан. Для испарения ацетона можно периодически на короткое время повышать температуру и таким образом облегчать достижение равновесия. Точка кипения ацетона составляет 47°С, при поддержании такой температуры в течение коротких интервалов времени разложение промежуточных продуктов маловероятно. Большинство аминотрансфераз, катализирующих реакции с участием альфа-кетоглутарата, также активны в отношении предшественника монатина. Аналогично, если используется глиоксилатаминотрансфераза/аминотрансфераза ароматических кислот (ЕС 2.6.1.60), а в качестве донора аминогруппы - глицин, образуется относительно нестабильный глиоксилат, точка кипения которого значительно ниже точки кипения глицина.

Пример 14. Экспрессия рекомбинантов.

При наличии общедоступных кДНК ферментов и последовательностей аминокислот, ферментов и последовательностей, раскрытых в данной публикации, например Последовательностей 8ЕО ΙΌ № 11 и 8ЕО ΙΌ № 12, а также вариантов, полиморфов, мутантов, фрагментов и образованных ими гибридов, может быть осуществлена экспрессия и очистка любого белка, в том числе фермента, при использовании стандартных лабораторных способов. Квалифицированным специалистам понятно, что такие ферменты и фрагменты могут быть получены посредством рекомбинации в любой интересующей исследователя клетке или организме и перед применением очищены, например, перед получением последовательности №12 и ее производных.

Способы получения рекомбинантных белков хорошо известны специалистам. Поэтому сфера применения данного сообщения охватывает рекомбинантную экспрессию любого белка, в том числе фермента. Например, см. патент США № 5,342,764 Ιοίιι^οη еί а1.; патент США № 5,846,819 Раизск еί а1.; патент США №5,876,969 Е1еег еί а1. аиб 8;·ιπΛιόο1< еί а1. (Μο^πΕί Οοηίη§: Α ^аЫο^аίο^у Маииа1, Колд Спринг Харбор, Нью-Йорк, 1989, гл. 17).

Вкратце, неполноразмерные, полноразмерные и вариантные последовательности кДНК, кодирующие белок или пептид, могут быть лигированы в экспрессирующий вектор, например, бактериальный или эукариотический экспрессирующий вектор. Белки и/или пептиды могут быть получены посредством помещения вектора выше последовательности кДНК. Примерами промоторов могут служить 1ас, 1гр, 1ас, 1гс, крупные операторные и промоторные области фага лямбда, контрольный участок белка оболочки £6, ранние и поздние промоторы 8У40, промоторы, полученные из вирусов полиомы, аденовирусов, ретровирусов, бакуловирусов, обезьяньего вируса, промотор гена 3-фосфоглицераткиназы, промоторы кислой фосфатазы дрожжей, промотор факторов альфа-спаривания дрожжей и комбинации этих промоторов.

Векторы, которые могут быть использованы для получения интактных нативных белков, включают рКС30 (81зта1аке зи6 ΚοзеηЫе^д, 1981, №1иге 292:128), рКК177-3 (Αтаηи зи6 Вгозшз, 1985; Сене 40:183) и рЕТ-3 (8(и61ег зи6 ΜοΗΙίΙ, 1986, 1. Μο1.Β^ο1.189:133). Последовательно ДНК может быть перенесена на другие клонирующие носители, например другие плазмиды, космиды, вирусы животных и искусственные хромосомы дрожжей (Вигке еί а1., 1987; 8стеисе 236:806-12). Эти векторы могут быть введены в разнообразные хозяйские клетки, в том числе соматические, и простые и сложные организмы, например бактерий, грибов (Т1тЫег1зке зи6 Магзка11, 1989, 8стеисе 244:1313-7), беспозвоночных, растений (Сзззег зи6 Ега1еу, 1989, 8с1еисе 244:1293) и млекопитающих (Ригзе1 еί а1., 1989; 8с1еисе 244:1281-8), которые становятся трансгенными после введения в них гетерологичной ДНК.

Для того чтобы стала возможной экспрессия в клетках млекопитающих, последовательность кДНК должна быть лигирована с гетерологичным промотором, например промотором обезьяньего вируса 8У40, промотором вектора р8У2 (МцШдаи зи6 Вегд, 1981, Ргос. №111. Αсаб. 8с1. υ8Α 78:2072-6), и введена в клетки, например клетки обезьяны СО8-1 (С1ц7таи, 1981, Се11 23: 175-82), для достижения временной или длительной экспрессии. Стабильная интеграция конструкции, представляющей собой химерный ген, может поддерживаться в клетках млекопитающих посредством биохимической селекции, например, с применением неомицина (8οιι11κΓΠ зи6 Вегд, 1982, 1. Μο1. Αрр1. СеиеБ 1:327-41) и микофеноловой кислоты (МцШдаи зи6 Вегд, 1981, Ргос. №111. Αсаб. 8с1. υ8Α 78:2072-6).

Перенос ДНК в эукариотические клетки, например, клетки человека или других млекопитающих, является обычным технологическим приемом. Векторы вводят в реципиентные клетки в форме чистой ДНК (трансфекция), например, при осаждении с фосфатом кальция (Сгакат зи6 Уен6ег ЕЫ, 1973, У1го1οβ\· 52:466), фосфатом стронция (Вгазк еί а1., 1987, Μο1 Се11 Вю1. 7:2013), при электропорировании (Кеитаηи еί а1., 1982, ЕМВОБ 1:841), посредством липофекции (Ее^иег еί а1., 1987, Ргос. №111. Αсаб. 8с1. υ8Α 84:7413), при применении ДЭАЭ-декстрана (МсСиШаи еί а1., 1968, ^.Nаί1.Саисе^ Ιηδί. 41:351), микроинъекции (Мие11ег еί а1., 1978, Се11 15:579), при слиянии протопластов (8ска£Ъег, 1980, Ргос. №11. Αсаб. 8с1. υ8Α 77:2163-7) или обстрела гранулами (К1ет еί а1., 1987, №11иге 327:70). Альтернативный способ введения кДНК заключается в инфекции вирусным вектором, например, ретровирусом (Ветз1ет еί а1., 1985, Сен. Епдгд. 7:235), аденовирусом (Α1ιιηα6 еί а1., 1986, I. У1го1. 57:267) или вирусом герпеса (8раеίе еί а1., 11982, Се11 30:295).

- 39 009284

В свете многочисленных возможных примеров осуществления изобретения, к которым могут быть применимы принципы нашего сообщения, следует признать, что проиллюстрированные примеры являются лишь отдельными примерами, которыми данное сообщение не ограничивается. Правильнее считать, что объем данного сообщения соответствует перечисленным ниже пунктам формулы изобретения. Исходя из этого мы заявляем, что нашим изобретением является все, что соответствует объему и сущности этих пунктов.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ получения монатина, включающий превращение глюкозы в монатин.
2. Способ получения монатина, включающий превращение триптофана и/или индол-3-молочной кислоты в монатин, причем этот способ включает контакт триптофана или индол-3-молочной кислоты с первым полипептидом, где первый полипептид превращает триптофан или индол-3-молочную кислоту в индол-3-пируват;

контакт индол-3-пирувата со вторым полипептидом и источником трехатомного (С3) С3-углерода, где второй полипептид превращает индол-3-пируват и источник С3-углерода в 2-гидрокси-2-(индол-3илметил)-4-кетоглутаровую кислоту, и контакт 2-гидрокси-2-(индол-3-илметил-4-кетоглутаровой кислоты с третим полипептидом, где третий полипептид превращает 2-гидрокси-2-(индол-3-илметил)-4-кетоглутаровую кислоту в монатин.
3. Способ по п.2, отличающийся тем, что первый полипептид выбирают из группы, включающей триптофан аминотрансферазу (ЕС 2.6.1.27), триптофан дегидрогеназу (ЕС 1.4.1.19), тирозин(ароматическую) аминотрансферазу (ЕС 2.6.1.5), триптофан-фенилпируват трансаминазу (ЕС

2.6.1.28), аминотрансферазу множественных субстратов (ЕС 2.6.1.-), аспартат аминотрансферазу (ЕС

2.6.1.1) , триптофан оксидазу, оксидазу Ь-аминокислоты (ЕС 1.4.3.2), дегидрогеназу Ό-аминокислот (ЕС

1.4.99.1) , оксидазу Ό-аминокислот (ЕС 1.4.3.3.), Ό-триптофан аминотрансферазу, Ό-аланин аминотрансферазу (ЕС 2.6.1.21), глутамат дегидрогеназу (ЕС 1.4.1.2-4), фенилаланин дегидрогеназу (ЕС 1.4.1.20) или комбинацию этих полипептидов, и первый полипептид превращает триптофан в индол-3-пируват.
4. Способ по п.2, отличающийся тем, что первый полипептид выбирают из группы, включающей индол-лактат дегидрогеназу (ЕС 1.1.1.110), Я-4-гидроксифенил-лактат дегидрогеназу (ЕС 1.1.1.222), 3(4)-гидроксифенилпируват редуктазу (ЕС 1.1.1.237), лактат дегидрогеназу (ЕС 1.1.1.27, ЕС 1.1.1.28, 1.1.2.3), (3-имидазол-5-ил)лактат дегидрогеназу (ЕС 1.1.1.111) и лактат оксидазу (ЕС 1.1.3-) или комбинацию этих полипептидов, и первый полипептид превращает индол-3-молочную кислоту в индол-3пируват.
5. Способ по п.2 или 3, отличающийся тем, что первый и/или третий полипептид включает аминокислотную последовательность, показанную среди δΕρ ΙΌ № 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 32, № ΝΓ-

388848.1 по Каталогу банка генов, № 2Р00005082.1 по Каталогу банка генов или № ААС74014.1 по Каталогу банка генов;

аминокислотную последовательность, не менее чем на 90% идентичную последовательности, показанной среди δΕρ ΙΌ № 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 32, № ΝΈ-388848.1 по Каталогу банка генов, № 2Р00005082.1 по Каталогу банка генов или № ААС74014.1 по Каталогу банка генов; или аминокислотную последовательность, которая отличается от δΕρ ΙΌ № 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 32, № №-388848.1 по Каталогу банка генов, № 2Р00005082.1 по Каталогу банка генов или № ААС74014.1 по Каталогу банка генов менее чем на 50 консервативных аминокислотных замен, где аминокислотная последовательность превращает триптофан в индол-3-пируват.
6. Способ по в п. 2, отличающийся тем, что второй полипептид представляет собой ЕС 4.1.2.- или ЕС 4.1.3.0.
7. Способ по п.6, отличающийся тем, что фермент ЕС 4.1.3.-представлен 4-гидрокси-2оксоглутаратглиоксилат-лиазой (ЕС 4.1.3.16), 4-гидрокси-4-метил-2-оксоглутарат пируват-лиазой (ЕС 4.1.3.17) или комбинацией этих ферментов.
8. Способ по п.2, отличающийся тем, что третий полипептид выбирают из группы, включающей тирозин(ароматическую) аминотрансферазу (ЕС 2.6.1.5), триптофан-дегидрогеназу (ЕС 1.4.1.19), триптофан-фенилпируват трансаминазу (ЕС 2.6.1.28), триптофан-аминотрансферазу (ЕС 2.6.1.27), аспартат аминотрансферазу (ЕС 2.6.1.1), Ό-аланин аминотрансферазу (ЕС 2.6.1.21), триптофан оксидазу, оксидазу Ь-аминокислоты (ЕС 1.4.3.2), дегидрогеназу Ό-аминокислот (ЕС 1.4.99.1), оксидазу Ό-аминокислот (ЕС 1.4.3.3.), Ό-триптофан аминотрансферазу, глутамат дегидрогеназу (ЕС 1.4.1.2-4), фенилаланин дегидрогеназу (ЕС 1.4.1.20), аминотрансферазу множественных субстратов (ЕС 2.6.1.-), дегидрогеназу Όаминокислот (ЕС 1.4.99.1) или комбинацию этих полипептидов.
9. Способ по п.2, отличающийся тем, что первый полипептид включает оксидазу аминокислоты (ЕС 1.4.3-) и каталазу (ЕС 1.11.1.6) и что первый полипептид превращает триптофан в индол-3-пируват.
10. Способ по п.9, отличающийся тем, что оксидаза аминокислоты представлена триптофаноксидазой.
11. Способ по п.2, отличающийся тем, что источник С3-углерода выбирают из группы, которая

- 40 009284 включает пируват, фосфоенолпируват, аланин, серии, цистеин или комбинацию этих соединений.
12. Способ по п.11, отличающийся тем, что пируват получают из аланина и полипептида, способного осуществлять трансаминирование аланина; серина и полипептида, способного осуществлять бетаэлиминацию серина; аспартата и полипептида, способного вступать в бета-лиазные реакции с дикарбоновой аминокислотой; лактата и лактат оксидазы (ЕС 1.1..3-) или лактат дегидрогеназы (ЕС 1.1.1.27,

1.1.1.28, 1.1.1.2.3) или комбинации этих соединений.
13. Способ по п.2, отличающийся тем, что способ далее включает восстановление пероксида водорода в количестве, образовавшемся при превращении триптофана в индол-3-пируват, при контакте между пероксидом водорода и каталазой.
14. Способ по п.2, отличающийся тем, что второй полипептид включает аминокислотную последовательность, которую выбирают из группы, включающей:

- последовательность 8Ε0 ΙΌ 66, № САС46344 по Каталогу банка генов, № САВ14127.1 по Каталогу банка генов, № ААС74920.1 по Каталогу банка генов или № САС47463.1 по Каталогу банка генов;

аминокислотную последовательность, не менее чем на 90% идентичную последовательности 8ΕΟ ΙΌ 66, № САС46344 по Каталогу банка генов, № САВ14127.1 по Каталогу банка генов, № ААС74920.1 по Каталогу банка генов № САС47463.1 по Каталогу банка генов или аминокислотную последовательность, которая отличается от последовательности 8ΕΟ ΙΌ 66, № САС46344 по Каталогу банка генов, № САВ 14127.1 по Каталогу банка генов, № ААС74920.1 по Каталогу банка генов или № САС47463.1 по Каталогу банка генов, менее чем на 50 консервативных аминокислотных замен, где аминокислотная последовательность превращает индол-3-пирувати пируват в ПМ.
15. Способ по п.8, отличающийся тем, что третий полипептид включает аспартат-аминотрансферазу и 2-гидрокси-2-(индол-3-илметил)-4-кетоглутаровая кислота контактирует с аспартатом с образованием оксалацетата и монатина.
16. Способ по п.15, отличающийся тем, что оксалацетат далее контактирует с декарбоксилазой.
17. Способ по п.2, отличающийся тем, что третий полипептид представлен лизин-эпсилонаминотрансферазой и 2-гидрокси-2-(индол-3-илметил)-4-кетоглутаровая кислота далее контактирует с лизином.
18. Способ по п.2, отличающийся тем, что третий полипептид представлен ферментом, осуществляющим восстановительное аминирование и способным к рециклизации НАД(Ф)Н.
19. Способ по п.18, отличающийся тем, что фермент, осуществляющий восстановительное аминирование выбран из группы, включающей глутамат дегидрогеназу, фенилаланин дегидрогеназу, триптофан дегидрогеназу, или представлен комбинацией этих соединений.
20. Способ по п.18, отличающийся тем, что полипептид, способный к рециклизации НАД(Ф)Н, далее продуцирует летучий продукт.
21. Способ по п.20, отличающийся тем, что полипептид, способный к рециклизации и продуцированию летучего продукта, представлен формиат дегидрогеназой и образующийся летучий продукт представляет собой диоксид углерода.
22. Способ по п.2, отличающийся тем, что способ включает превращение индол-3-молочной кислоты в монатин.
23. Способ по п.2, отличающийся тем, что монатин образуется в количестве не менее 10 г/л.
24. Способ получения монатина, включающий превращение индол-3-пирувата в монатин и взаимодействие индол-3-пирувата с полипептидом.
25. Способ получения монатина, включающий превращение триптофана в монатин.
26. Клетка, продуцирующая монатин, где клетка включает по крайней мере одну экзогенную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей по крайней мере один полипептид, и этот по крайней мере один полипептид осуществляет превращение первого промежуточного продукта по пути получения монатина с образованием второго промежуточного продукта или монатина.
27. Клетка по п.26, отличающаяся тем, что по крайней мере один полипептид выбран из группы, которая включает триптофан аминотрансферазу (ЕС 2.6.1.27), триптофан дегидрогеназу (ЕС 1.4.1.19), тирозин (ароматическую) аминотрансферазу (ЕС 2.61.5), триптофан-фенилпируват трансаминазу (ЕС

2.6.1.28), аминотрансферазу множественных субстратов (ЕС 2.6.1.-), триптофан оксидазу, оксидазу Ьаминокислот (ЕС 1.4.3.2), аспартат аминотрансферазу (ЕС 2.6.1.1), дегидрогеназу Ό-аминокислот (ЕС

1.4.99.1), оксидазу Ό-аминокислот (ЕС 1.4.3.3), Ό-аланин аминотрансферазу (ЕС 2.6.1.21), Ό-триптофан аминотрансферазу, индоллактат дегидрогеназу (ЕС 1.1.1.110), В-4-гидроксифениллактат дегиидрогеназу (ЕС 1.1.1.222), 3-(4)-гидроксифенилпируват редуктазу (ЕС 1.1.1.237), лактат дегидрогеназу (ЕС 1.1.1.27,

1.1.1.28, 1.1.2.3), (3-имидазол-5-ил) лактат дигидрогеназу (ЕС 1.1.1.111), лактат оксидазу (ЕС 1.1.3.-), синтазу/лиазу (4.1.2.-), синтазу/лиазу (4.1.3.-), фенилаланин дегидрогеназу (ЕС 1.4.1.20), глутамат дегидрогеназу (ЕС 1.4.1.2., 1.4.1.3., 1.4.1.4) и комбинацию этих соединений.
28. Клетка по п.27, отличающаяся тем, что по крайней мере один полипептид выбран из группы, которая включает триптофан аминотрансферазу (ЕС 2.6.1.27), триптофан дегидрогеназу (ЕС 1.4.1.19), тирозин (ароматическую) аминотрансферазу (ЕС 2.6.1.5), триптофан-фенилпируват трансаминазу (ЕС

2.6.1.28), аминотрансферазу множественных субстратов (ЕС 2.6.1.-), аспартат аминотрансферазу (ЕС

- 41 009284

2.6.1.1) , триптофан оксидазу, оксидазу Ь-аминокислот (ЕС 1.4.3.2), дегидрогеназу Ό-аминокислот (ЕС

1.4.99.1) , оксидазу Ό-аминокислот (ЕС 1.4.3.3), Ό-аланин аминотрансферазу (ЕС 2.6.1.21), Ό-триптофан аминотрансферазу, синтазу/лиазу (4.1.3.-), синтазу/лиазу (4.1.2.-), фенилаланин дегидрогеназу (ЕС

1.4.1.20), глутамат дегидрогеназу (ЕС 1.4.1.2., 1.4.1.3., 1.4.1.4) и комбинацию этих соединений.
29. Клетка по п. 27, отличающаяся тем, что по крайней мере один полипептид представлен активностью, выбранной из группы, которая включает индоллактат дегидрогеназу (ЕС 1.1.1.110), Я-4гидроксифениллактат дегидрогеназу (ЕС 1.1.1.222), 3-(4)-гидроксифенилпируват редуктазу (ЕС 1.1.1.237), лактат дегидрогеназу (ЕС 1.1.1.27, 1.1.1.28, 1.1.2.3), (3-имидазол-5-ил) лактат дигидрогеназу (ЕС 1.1.1.111), лактат оксидазу (ЕС 1.1.3.-), синтазу/лиазу (4.1.2.-), синтазу/лиазу (4.1.3.-), триптофан дегидрогеназу (ЕС 1.4.1.19), триптофан-фенилпируват трансаминазу (ЕС 2.6.1.28), триптофан аминотрансферазу (ЕС 2.6.1.27), тироизин (ароматическую) аминотрансферазу (ЕС 2.6.1.5), аминотрансферазу множественных субстратов (ЕС 2.6.1.-), аспартат аминотрансферазу (ЕС 2.6.1.1), глутамат дегидрогеназу (ЕС 1.4.1.2., 1.4.1.3., 1.4.1.4), фенилаланин дегидрогеназу (ЕС 1.4.1.20), Ό-триптофан аминотрансферазу, дегидрогеназу Ό-аминокислот (ЕС 1.4.99.1), Ό-аланин аминотрансферазу (ЕС 2.6.1.21), и комбинацию этих соединений.
30. Клетка по п.27, отличающаяся тем, что по крайней мере один полипептид является синтаза/лиазой (ЕС 4.1.3.-), включающей 4-гидрокси-2-оксоглутарат альдолазу (ЕС 4.1.3.16) или 4-гидрокси-4метил-2-оксоглутарат альдолазу (ЕС 4.1.3.17).
31. Клетка по любому из пп.26-30, отличающаяся тем, что клетка представлена бактериальной клеткой.
32. Клетка по любому из пп.26-30, отличающаяся тем, что клетка представлена дрожжевой клеткой.
33. Клетка по п.27, отличающаяся тем, что клетка представлена одним или несколькими полипептидами, кодирующими по крайней мере одну экзогенную последовательность нуклеиновой кислоты и одним или более полипептидом, причем клетка дополнительно включает активности, выбранные из группы, которая включает каталазу, оксалацатат декарбоксилазу, лизин эписилон аминотрансферазу и формиат дегидрогеназу.
34. Полипептид, включающий аминокислотную последовательность, выбранной из группы, которая включает Последовательность № Р00913 по Каталогу банка генов; № ΝΡ_290344 по Каталогу банка генов; № САА34096 по Каталогу банка генов; № ΝΡ_246359 по Каталогу банка генов; № ААВ96579 по Каталогу банка генов; № ΝΡ_232561 по Каталогу банка генов; № 059342 по Каталогу банка генов; № Р28796 по Каталогу банка генов; № 1АХ4_4 по Каталогу банка генов; № ВАА34638 по Каталогу банка генов; № Р31014 по Каталогу банка генов; Р31015 по Каталогу банка генов; № ΝΡ_280989 по Каталогу банка генов; № ААС33284 по Каталогу банка генов; № ΝΡ_147838 по Каталогу банка генов; ААЕ63441 по Каталогу банка генов; № ААА24679 по Каталогу банка генов, где аминокислотные остатки в положениях 103 и 299 по отношению к Последовательности № ΝΡ_418164 были изменены, для того чтобы расширить специфичность полипептида и допустить субстраты, представленные дикарбоновыми аминокислотами.
35. Полипептид по п.34, отличающийся тем, что замена аминокислоты выбрана из группы, которая включает замену аргинина 103 на треонин; замену аргинина 103 на треонин и валина 299 на аргинин и валина 299 на аргинин.
36. Полипептид, включающий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, кото- рая включает Последовательность № 2ТΡ^_Α по Каталогу банка генов; № Р31012 по Каталогу банка генов; №Ρ31013, А49493 по Каталогу банка генов; № Р31011 по Каталогу банка генов; № ААВ24234 по Каталогу банка генов; № по Каталогу банка генов; № ΜΡ^Ρ по Каталогу банка генов;

№ ΝΡ245748 по Каталогу банка генов; № ААВ41499 по Каталогу банка генов; № Т45297 по Каталогу банка генов; № ААА71928, где аминокислотные остатки в положениях 100 и 283 по отношению к Последовательности № Х66978 были изменены для того чтобы расширить специфичность полипептида и допустить субстраты, представленные дикарбоновыми аминокислотами.
37. Полипептид по п.36, отличающийся тем, что замена аминокислоты выбрана из группы, группы, которая включает замену аргинина 100 на треонин; замену аргинина 100 на треонин и валина 283 на аргинин и валина 283 на аргинин.
38. Полипептид по п.34 или 36, отличающийся тем, что субстрат представлен аспартатом.
39. Способ получения монатина, включающий реакцию между по крайней мере одним производным аланина с блокированными карбоксильной и аминной группой и по крайней мере одним производным индол-3-пирувата с блокированной карбоксильной группой.
40. Способ получения монатина по п. 39, отличающийся тем, что производное аланина представлено 3-хлороаланином или 3-бромоаланином и что индол-3-пируват вступает в реакцию Гриньяра или реакцию с литий-органическим катализатором с производным аланина.
41. Способ получения монатина, включающий превращение субстрата, выбранного из группы, которая включает триптофан, индол-3-молочную кислоту, индол-3-пируват и 2-гидрокси-2-(индол-3илметил)-4-кетоглутаровую кислоту, в один или несколько промежуточных продуктов при получении промежуточных продуктов или монатина.

- 42 009284
42. Способ по п.41. отличающийся тем. что по крайней мере один промежуточный продукт подвергается превращению посредством химической реакции.
43. Способ по п. 41. отличающийся тем. что по крайней мере один промежуточный продукт. полученный при получении промежуточного продукта или монатина. превращается в полипептид.
44. Изолированная нуклеиновая кислота. последовательность которой по крайней мере на 90% идентична 8ЕО ΙΌ N0: 11.
45. Изолированная нуклеиновая кислота по п.44. отличающаяся тем. что нуклеиновая кислота включает последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 11.
46. Изолированная нуклеиновая кислота по п.44. отличающаяся тем. что нуклеиновая кислота включает по крайней мере 20 последовательных нуклеотидов последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 11.
47. Вектор. представляющий собой изолированную нуклеиновую кислоту по п.44.
48. Рекомбинантная клетка. включающая вектор по п.47.
49. Изолированный белок. кодируемый изолированной нуклеиновой кислотой по п.44.
50. Изолированный белок по п.49. отличающийся тем. что белок включает последовательность. которая по крайней мере на 90% идентична 8Е0 ΙΌ N0: 12.
51. Изолированный белок по п.50. отличающийся тем. что белок включает последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 12.
52. Способ получения монатина. включающий превращение 2-гидрокси 2-(индол-3-илметил)-4кетоглутаровой кислоты в монатин.
53. Способ по п.52. отличающийся тем. что далее включает определение 2-гидрокси 2-(индол-3илметил)-4-кетоглутаровой кислоты способом масс-спектрометрии.
54. Композиция. включающая изолированную или очищенную. или ненатурально возникающую 2гидрокси 2-(индол-3-илметил)-4-кетоглутаровую кислоту.
55. Способ по п.2. отличающийся тем. что триптофан получают из индола с использованием полипептида из ЕС 4.1.99.1.
56. Способ получения монатина. включающий реакцию триптофана с одним или несколькими полипептидами.
57. Способ по п.56. отличающийся тем. что один или несколько полипепидов выбирают из группы. состоящей из триптофан аминотрансферазы (ЕС 2.6.1.27). триптофан дегидрогеназы (ЕС 1.4.1.19). тироизин (ароматической) аминотрансферазы (ЕС 2.6.1.5). триптофан-фенилпируват трансаминазы (ЕС

2.6.1.28). аминотрансферазы множественных субстратов (ЕС 2.6.1.-). аспартат аминотрансферазы (ЕС

2.6.1.1) . триптофан оксидазы. оксидазы Ь-аминокислот (ЕС 1.4.3.2). дегидрогеназы Ό-аминокислот (ЕС

1.4.99.1) . оксидазы Ό-аминокислот (ЕС 1.4.3.3). Ό-аланин аминотрансферазы (ЕС 2.6.1.21). Ό-триптофан аминотрансферазы. синтазы/лиазы (4.1.3.-). синтазы/лиазы (4.1.2.-). фенилаланин дегидрогеназы (ЕС

1.4.1.20). глутамат дегидрогеназы (ЕС 1.4.1.2. 1.4.1.3. 1.4.1.4) и комбинации этих соединений.
58. Клетка. способная продуцировать монатин. отличающаяся тем. что включает 2-гидрокси 2(индол-3 илметил)-4 кетоглутаровую кислоту (предшественник монатина). где клетка включает по крайней мере одну экзогенную последовательность нуклеиновой кислоты. кодирующей по крайней мере один полипептид. и этот по крайней мере один полипептид осуществляет превращение первого промежуточного продукта по пути получения монатина с образованием второго промежуточного продукта или монатина.
59. Клетка по п.58. отличающаяся тем. что по крайней мере один полипептид выбран из группы. которая включает триптофан аминотрансферазу (ЕС 2.6.1.27). триптофан дегидрогеназу (ЕС 1.4.1.19). тирозин (ароматическую) аминотрансферазу (ЕС 2.61.5). триптофан-фенилпируват трансаминазу (ЕС

2.6.1.28). аминотрансферазу множественных субстратов (ЕС 2.6.1.-). триптофан оксидазу. оксидазу Ьаминокислот (ЕС 1.4.3.2). аспартат аминотрансферазу (ЕС 2.6.1.1). дегидрогеназу Ό-аминокислот (ЕС

1.4.99.1) . оксидазу Ό-аминокислот (ЕС 1.4.3.3). Ό-аланин аминотрансферазу (ЕС 2.6.1.21). Ό-триптофан аминотрансферазу. индоллактат дегидрогеназу (ЕС 1.1.1.110). В-4-гидроксифениллактат дегиидрогеназу (ЕС 1.1.1.222). 3-(4)-гидроксифенилпируват редуктазу (ЕС 1.1.1.237). лактат дегидрогеназу (ЕС 1.1.1.27.

1.1.1.28. 1.1.2.3). (3-имидазол-5-ил) лактат дигидрогеназу (ЕС 1.1.1.111). лактат оксидазу (ЕС 1.1.3.-). синтазу/лиазу (4.1.2.-). синтазу/лиазу (4.1.3.-). фенилаланин дегидрогеназу (ЕС 1.4.1.20). глутамат дегидрогеназу (ЕС 1.4.1.2.. 1.4.1.3.. 1.4.1.4) и комбинацию этих соединений.
60. Клетка по п.59. отличающаяся тем. что по крайней мере один полипептид выбран из группы. которая включает триптофан аминотрансферазу (ЕС 2.6.1.27). триптофан дегидрогеназу (ЕС 1.4.1.19). тирозин (ароматическую) аминотрансферазу (ЕС 2.6.1.5). триптофан-фенилпируват трансаминазу (ЕС

2.6.1.28). аминотрансферазу множественных субстратов (ЕС 2.6.1.-). аспартат аминотрансферазу (ЕС

2.6.1.1) . триптофан оксидазу. оксидазу Ь-аминокислот (ЕС 1.4.3.2). дегидрогеназу Ό-аминокислот (ЕС

1.4.99.1) . оксидазу Ό-аминокислот (ЕС 1.4.3.3). Ό-аланин аминотрансферазу (ЕС 2.6.1.21). Ό-триптофан аминотрансферазу. синтазу/лиазу (4.1.3.-). синтазу/лиазу (4.1.2.-). фенилаланин дегидрогеназу (ЕС

1.4.1.20). глутамат дегидрогеназу (ЕС 1.4.1.2.. 1.4.1.3.. 1.4.1.4) и комбинацию этих соединений.
61. Клетка по п.59. отличающаяся тем. что по крайней мере один полипептид представлен активностью. выбранной из группы. которая включает индоллактат дегидрогеназу (ЕС 1.1.1.110). В-4

- 43 009284 гидроксифениллактат дегиидрогеназу (ЕС 1.1.1.222), 3-(4)-гидроксифенилпируват редуктазу (ЕС 1.1.1.237), лактат дегидрогеназу (ЕС 1.1.1.27, 1.1.1.28, 1.1.2.3), (3-имидазол-5-ил) лактат дигидрогеназу (ЕС 1.1.1.111), лактат оксидазу (ЕС 1.1.3.-), синтазу/лиазу (4.1.2.-, синтазу/лиазу (4.1.3.-), триптофан дегидрогеназу (ЕС 1.4.1.19), триптофан-фенилпируват трансаминазу (ЕС 2.6.1.28), триптофан аминотрансферазу (ЕС 2.6.1.27), тироизин (ароматическую) аминотрансферазу (ЕС 2.6.1.5), аминотрансферазу множественных субстратов (ЕС 2.6.1.-), аспартат аминотрансферазу (ЕС 2.6.1.1), глутамат дегидрогеназу (ЕС 1.4.1.2., 1.4.1.3., 1.4.1.4), фенилаланин дегидрогеназу (ЕС 1.4.1.20), Ό-триптофан аминотрансферазу, дегидрогеназу Ό-аминокислот (ЕС 1.4.99.1), Ό-аланин аминотрансферазу (ЕС 2.6.1.21) и комбинацию этих соединений.
62. Клетка по п.59, отличающаяся тем, что по крайней мере один полипептид является синтаза/лиазой (ЕС 4.1.3.-), включающей 4-гидрокси-2-оксоглутарат альдолазу (ЕС 4.1.3.16) или 4-гидрокси-4метил-2-оксоглутарат альдолазу (ЕС 4.1.3.17).
63. Клетка по п.58, отличающаяся тем, что клетка представлена бактериальной клеткой.
64. Клетка по п.59, отличающаяся тем, что клетка представлена дрожжевой клеткой.
65. Клетка по п.58, отличающаяся тем, что клетка представлена одним или несколькими полипептидами, кодирующими по крайней мере одну экзогенную последовательность нуклеиновой кислоты и одним или более полипептидом, причем клетка дополнительно включает активности, выбранные из группы, которая включает каталазу, оксалацатат декарбоксилазу, лизин эписилон аминотрансферазу и формиат дегидрогеназу.
66. Способ по п.43, отличающийся тем, что один или более субстратов получены химической реакцией.
67. Способ по п.2, отличающийся тем, что производится по крайней мере 1 мг/мл монатина.