CN1832690A - 莫纳甜桌面甜味剂组合物及其制造方法 - Google Patents

莫纳甜桌面甜味剂组合物及其制造方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及含有莫纳甜的新型甜味剂组合物以及制造这种组合物的方法。本发明还涉及含有莫纳甜的特定立体异构体、莫纳甜立体异构体的特定混合物和/或通过生物合成途径在体内(例如细胞内)或体外生产的莫纳甜的甜味剂组合物。

Description

莫纳甜桌面甜味剂组合物及其制造方法
相关申请的交叉参考
本申请要求2003年8月1日提交的美国临时专利申请60/492,014的优先权，该申请被全文纳入作为参考。
发明领域
本发明涉及含有莫纳甜(monatin)的新型甜味剂组合物以及制造这种组合物的方法。本发明还涉及含有莫纳甜的特定立体异构体、莫纳甜立体异构体的特定混合物和/或通过生物合成途径在体内(例如细胞内)或体外生产莫纳甜的甜味剂组合物。
发明背景
出于儿童肥胖、II型糖尿病和相关疾病增多的健康考虑，非热量高强度甜味剂的使用正在增加。因此，需要有甜度明显高于砂糖(蔗糖)等常规甜味剂的甜味剂。许多高强度甜味剂有令人不愉快的异位和/或非预料到的及低于期望值的甜度表现。为克服这些问题，工业上在继续研究苦味抑制剂、异位掩盖技术和甜味剂混合物，以期获得类似于蔗糖的甜度表现。
莫纳甜(2-羟基-2-(吲哚-3-基甲基)-4-氨基戊二酸)是一种天然产生的高强度甜味剂，它分离自在南非德兰士瓦地区发现的一种植物Sclerochiton ilicifolius。在等甜度时，与蔗糖或其它营养甜味剂不同，莫纳甜不含碳水化合物或蔗糖且几乎不含卡路里。
概述
本发明涉及一种甜味剂组合物，该组合物含有莫纳甜(2-羟基-2-(吲哚-3-基甲基)-4-氨基戊二酸—也称为4-氨基-2-羟基-2-(1H-吲哚-3-基甲基)-戊二酸，或者采用另一种编号系统，叫做4-羟基-4-(3-吲哚基甲基)谷氨酸)，该化合物具有下式：
Figure A20048002224900081
莫纳甜是一种天然产生的高强度甜味剂。莫纳甜有四种立体异构形式：2R，4R(“R，R立体异构体”或“R，R莫纳甜”)；2S，4S(“S，S立体异构体”或“S，S莫纳甜”)；2R，4S(“R，S立体异构体”或“R，S莫纳甜”)以及2S，4R(“S，R立体异构体”或“S，R莫纳甜”)。本文中，除非另有说明，“莫纳甜”是指莫纳甜的所有四种立体异构体，以及莫纳甜立体异构体的任何混合物(例如莫纳甜的R，R和S，S立体异构体的混合物)。
莫纳甜具有极好的甜度特性。莫纳甜的甜度曲线与已知高强度甜味剂一样清楚或更加清楚。莫纳甜的用量反应曲线更加呈线性，因此相比糖精等其它高强度甜味剂更类似于蔗糖。莫纳甜出色的甜度曲线使莫纳甜可理想地用于桌面甜味剂(tabletop)、食品、饮料和其它产品。
莫纳甜的不同立体异构体，其中包括R，R和S，S立体异构体，有可能用于甜味剂工业，无论是作为单独的成分或在混合物中。
相比其它高强度甜味剂，莫纳甜以及莫纳甜的立体异构体与其它甜味剂的混合物被认为具有优良的味道特性和/或物理性质。例如，莫纳甜比Equal或NutraSweet(阿斯巴特，也称为“APM”)稳定，相比Sweet N′Low(糖精)有更加清楚的味道，并且比Splenda(三氯蔗糖)更甜。同时，莫纳甜甜味剂不会有糖精那样苦的后味，或者像其它高强度甜味剂那样有金属味道、酸味、涩味或使用之后感觉喉咙发干。此外，莫纳甜甜味剂不具有某些天然甜味剂(如蛇菊苷和甘草皂苷)那种甘草后味。此外，不同于阿斯巴特甜味剂，莫纳甜甜味剂不需要告诫苯并酮尿症患者注意苯丙氨酸。由于其强烈甜味，R，R立体异构体相比其它高强度甜味剂更具有商业竞争力。
一方面，本发明提供了含有R，R莫纳甜和/或S，S莫纳甜的甜味剂组合物。例如，这种组合物的甜度甜度相当于砂糖(蔗糖)的甜度，因此可“匙对匙”或“杯对杯”地代替蔗糖使用。“甜度相当于”是指有经验的感觉鉴定员平均认为第一种组合物的甜度为第二组组合物甜度的80％-120％。表述“甜度相当于”涉及5名或更多有经验的感觉鉴定员在下述甜度比较实验中确定的结果，该实验用含有2-10％蔗糖等价物的组合物(例如溶液)进行。因此，例如，如果莫纳甜组合物的甜度相当于80-120mg/mL蔗糖的甜度，则100mg/mL含有莫纳甜的组合物提供的“甜度相当于”100mg/mL蔗糖。
我们采用一组熟悉甜度评价过程的经过训练的感觉鉴定员来评价甜味剂相对蔗糖的甜度。所有样品(在相同的缓冲液中)在22℃±1℃下一式两份。测试溶液用3个随机数字编号，并分别随机给予鉴定员。提供以0.5％(w/v)蔗糖递增的蔗糖参考标准(4.0-10.0％(w/v)蔗糖)。要求鉴定员通过比较测试溶液和蔗糖标准的甜度来评价甜度。评定时吸啜3口测试溶液，然后吸啜1口水，再吸啜3口蔗糖标准，然后在吸啜1口水，依此类推。鉴定员用1位小数评价甜度，例如6.8、8.5。在评价测试溶液之间休息5分钟。要求鉴定员彻底漱口并食用一些饼干以降低任何可能的附带结果。采用获自鉴定员的信息，在用量反应曲线的特定点用蔗糖等价值(SEV)(例如，％蔗糖)除以％莫纳甜就得到了甜味强度或效能。
一些实施方案中，该组合物含有基本上由S，S或R，R莫纳甜组成的莫纳甜。其它实施方案中，该组合物主要含有S，S或R，R莫纳甜。“主要”是指组合物中存在的莫纳甜的立体异构体，该莫纳甜所含的一种特定立体异构体的比例超过90％。一些实施方案中，该组合物基本上不含S，S或R，R莫纳甜。“基本上不含”是指组合物中存在的莫纳甜的立体异构体，该组合物所含的一种特定立体异构体的比例低于2％。此外，或是或者，当用来描述用生物合成途径制造的莫纳甜时，“基本上不含”包含在生物合成途径中作为副产物制造的一定量的立体异构体(例如，S，S莫纳甜)，所述生物合成途径涉及采用手性特异性酶(例如D-氨基酸脱氢酶或D-氨基酸转氨酶)和/或手性特异性底物(例如具有一个R立体构型的碳原子)以制造不同的特定立体异构体(例如，R，R莫纳甜)。
在本发明的另一方面，提供了一种甜味剂组合物，该组合物是富含用生物合成途径制造的莫纳甜某种立体异构体的混合物。“富含莫纳甜某种立体异构体的混合物”是指该混合物含有一种以上莫纳甜立体异构体，且混合物中至少60％的莫纳甜立体异构体为一种特定的立体异构体，如R，R、S，S、S，R或R，S。其它实施方案中，该混合物中一种特定的莫纳甜立体异构体的含量超过65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％。另一实施方案中，甜味剂组合物是富含R，R或S，S莫纳甜的混合物。“富含R，R莫纳甜的混合物”是指含有至少60％R，R莫纳甜的莫纳甜混合物。“富含S，S莫纳甜的混合物”是指含有至少60％S，S莫纳甜的莫纳甜混合物。其它实施方案中，“富含某种莫纳甜立体异构体的混合物”含有超过65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的R，R或S，S莫纳甜。
在另一方面，本发明还提供了甜味剂制品，例如，小包装制品或即用型制品，其中含有R，R立体异构体和/或S，S立体异构体形式的莫纳甜。例如，一种独立包装制品(通常约1克)提供的甜度相当于2茶匙砂糖(蔗糖)。本领域已知1“茶匙”蔗糖通常含有约4克蔗糖。或者，一定体积即用型制品提供的甜度相当于相同体积的砂糖。或者，一种莫纳甜组合物的独立包装(例如1克)提供的甜度相当于约0.9-9.0克砂糖(蔗糖)。术语“约”包括任何测量中发生的实验误差范围。除非另有说明，所有测量值具有“约”的含义即便未食用“约”这个词。
在另一方面，本发明提供了一种含有莫纳甜的均匀的桌面甜味剂组合物。“均匀的”组合物是指一种均一的组合物。例如，“均匀的”桌面甜味剂组合物(例如液体)在整个组合物中都将含有相同浓度的莫纳甜—获自这种组合物的任何样品将具有该浓度。
在本发明的另一方面，提供了一种制造甜味剂组合物的方法。该方法包括在体内或体外通过生物合成制造莫纳甜。“生物合成途径”包括至少一个生物转化步骤。一些实施方案中，所述生物合成途径是一种多步骤过程，且至少一个步骤是生物转化步骤。其它实施方案中，所述生物合成途径是一种涉及生物和化学转化步骤的多步骤过程。一些实施方案中，所制得的莫纳甜是一种富含莫纳甜某种立体异构体的混合物。
在本发明的另一方面，存在一些从选自以下的底物制造莫纳甜的生物合成途径：葡萄糖、色氨酸、吲哚-3-乳酸、以及吲哚-3-丙酮酸盐或酯和2-羟基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸(也称为“莫纳甜前体”、“MP”或莫纳甜的α-酮式)。用来制造或产生莫纳甜或其中间体的生物合成途径的例子示于图1-3和11-13，这些图以框显示潜在的中间产物和终产物。例如，从一种产物到另一种产物的转化能用这些方法进行，如葡萄糖到色氨酸、色氨酸到吲哚-3-丙酮酸盐或酯(indole-3-pyruvate)、吲哚-3-丙酮酸盐或酯到MP、MP到莫纳甜或吲哚-3-乳酸(吲哚-乳酸)到吲哚-3-丙酮酸盐或酯。
这些转化可用化学方法或生物学方法促进。术语“转化”指在将第一种中间体转化成第2种中间体的反应中使用化学方法或多肽。术语“化学转化”指不由多肽活性促进的反应。术语“生物转化”指由多肽活性促进的反应。转化可体内或体外发生。当使用生物转化时，多肽和/或细胞能固定于支持物如化学附着于聚合物支持物。转化可用本领域普通技术人员已知的任何反应器完成，例如在分批或连续反应器中。
用来进行生物转化的多肽及其编码序列的实例示于图1-3和11-13。具有一个或多个修饰多肽的底物特异性和/或活性的点突变的多肽可用来制造莫纳甜。表达这种多肽的分离的重组细胞可用来制造莫纳甜。这些细胞可以是任何细胞，如植物、动物、细菌、酵母、藻类、古菌或真菌细胞。
例如，制造莫纳甜的细胞可具有一种或多种(如两种或多种、或者三种或多种)以下活性：色氨酸转氨酶(EC 2.6.1.27)、酪氨酸(芳族)转氨酶(EC 2.6.1.5)、色氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.19)、谷氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.2、1.4.1.3、1.4.1.4)、苯丙氨酸脱氢酶(EC1.4.1.20)、色氨酸-苯丙酮酸转氨酶(EC 2.6.1.28)、多底物转氨酶(EC 2.6.1.-)、天冬氨酸转氨酶(EC 2.6.1.1)、L-氨基酸氧化酶(EC 1.4.3.2)、色氨酸氧化酶(无EC号，Hadar等，J.Bacteriol 125：1096-1104，1976和Furuya等，Biosci Biotechnol Biochem64：1486-93，2000)、D-色氨酸转氨酶(Kohiba和Mito，《第8届国际维生素B6和羰基催化讨论会会议录》(Proceedings of 8th International Symposium on Vitamin B6 andCarbonyl Catalysis)，日本大阪，1990)、D-氨基酸脱氢酶(EC 1.4.99.1)、D-氨基酸氧化酶(EC 1.4.3.3)、D-丙氨酸转氨酶(EC 2.6.1.21)、合酶/裂解酶(EC 4.1.3.-)，如4-羟基-2-氧戊二酸醛缩酶(EC 4.1.3.16)或4-羟基-4-甲基-2-氧戊二酸醛缩酶(EC 4.1.3.17)，和/或合酶/裂解酶(4.1.2.-)。
在另一个例子中，细胞包括一种或多种(例如2种或多种或者3种或多种)下列活性：吲哚乳酸脱氢酶(EC 1.1.1.110)，R-4-羟苯基乳酸脱氢酶(EC 1.1.1.222)，3-(4)-羟基苯丙酮酸还原酶(EC 1.1.1.237)，乳酸脱氢酶(EC 1.1.1.27，1.1.1.28，1.1.2.3)，(3-咪唑-5-基)乳酸脱氢酶(EC 1.1.1.111)，乳酸氧化酶(EC 1.1.3.-)，合酶/裂解酶(4.1.3.-)如4-羟基-2-氧戊二酸醛缩酶(EC 4.1.3.16)或4-羟基-4-甲基-2-氧戊二酸醛缩酶(EC4.1.3.17)，合酶/裂解酶(4.1.2.-)，色氨酸转氨酶(EC 2.6.1.27)，酪氨酸(芳族)转氨酶(EC2.6.1.5)，色氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.19)，谷氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.2，1.4.1.3，1.4.1.4)，苯丙氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.20)，色氨酸-苯丙酮酸转氨酶(EC 2.6.1.28)，多底物转氨酶(EC 2.6.1.-)，天冬氨酸转氨酶(EC 2.6.1.1)，D-色氨酸转氨酶，D-氨基酸脱氢酶(EC1.4.99.1)，和/或D-丙氨酸转氨酶(EC 2.6.1.21)。
此外，细胞可包括一种或多种(例如2种或多种或者3种或多种)下列活性：色氨酸转氨酶(EC 2.6.1.27)，酪氨酸(芳族)转氨酶(EC 2.6.1.5)，色氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.19)，谷氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.2，1.4.1.3，1.4.1.4)，苯丙氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.20)，色氨酸-苯丙酮酸转氨酶(EC 2.6.1.28)，多底物转氨酶(EC 2.6.1.-)，天冬氨酸转氨酶(EC2.6.1.1)，L-氨基酸氧化酶(EC 1.4.3.2)，色氨酸氧化酶，D-色氨酸转氨酶，D-氨基酸脱氢酶(EC 1.4.99.1)，D-氨基酸氧化酶(EC 1.4.3.3)，D-丙氨酸转氨酶(EC 2.6.1.21)，吲哚乳酸脱氢酶(EC 1.1.1.110)，R-4-羟苯基乳酸脱氢酶(EC 1.1.1.222)，3-(4)-羟基苯丙酮酸还原酶(EC 1.1.1.237)，乳酸脱氢酶(EC 1.1.1.27，1.1.1.28，1.1.2.3)，(3-咪唑-5-基)乳酸脱氢酶(EC 1.1.1.111)，乳酸氧化酶(EC 1.1.3.-)，合酶/裂解酶(EC 4.1.3.-)，如4-羟基-2-氧戊二酸醛缩酶(EC 4.1.3.16)或4-羟基-4-甲基-2-氧戊二酸醛缩酶(EC4.1.3.17)，和/或合酶/裂解酶(4.1.2.-)。
进一步的例子是，细胞可包含一种或多种以下醛缩酶活性：KHG醛缩酶、ProA醛缩酶、KDPG醛缩酶和/或相关多肽(KDPH)、转羧基苯丙酮酸水合酶-醛缩酶、4-(2-羧苯基)-2-氧丁-3-烯醇盐醛缩酶、反式-O-羟基苯亚甲基丙酮酸水合酶-醛缩酶、3-羟基天冬氨酸醛缩酶、苯偶姻醛缩酶、二氢新蝶呤醛缩酶、L-苏-3-苯基丝氨酸苯甲醛-裂解酶(苯基丝氨酸醛缩酶)、4-羟基-2-氧戊酸醛缩酶、1、2-二羟基苄基丙酮酸醛缩酶、和/或2-羟基苯丙酮酸醛缩酶。
能生成莫纳甜的方法包括使色氨酸和/或吲哚-3-乳酸接触第一种多肽，其中第一种多肽将色氨酸和/或吲哚-3-乳酸转化成吲哚-3-丙酮酸(D或L型色氨酸或吲哚-3-乳酸可用作转化成吲哚-3-丙酮酸的底物；本领域技术人员理解选择用于此步骤的多肽理想地表现出适当特异性)，所得吲哚-3-丙酮酸接触第2种多肽，其中第2种多肽将吲哚-3-丙酮酸转化成2-羟基-2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸(MP)，MP接触第3种多肽，其中第3种多肽将MP转化成莫纳甜。能用于这些转化的示范多肽示于图2和3。
通过一步或多步生物转化利用生物合成途径制造莫纳甜有一些优点。例如，通过在该生物合成途径中使用特定的多肽和/或某些底物能够制得富含某种立体异构体的混合物，和/或制得基本上不含一种或多种立体异构体的莫纳甜混合物。
用莫纳甜合成法产生的莫纳甜组合物中可能含有一些杂质。仅用合成方法(即不包括至少一步生物转化)制得的莫纳甜组合物中所含的杂质不同于通过生物合成途径制得的莫纳甜组合物。例如，基于所用原料，仅用合成法制得的莫纳甜组合物可含有石油化学的、有毒的和/或对人类消费者不利的其它危险污染物。这种污染物的例子有危险化学品，如LDA、氢-Pd/C、重氮甲烷、KCN、格氏试剂和Na/Hg。另一方面，希望通过生物合成途径制造的莫纳甜组合物可含有可食用或可饮用的杂质，但不含石油化学的、有毒的和/或其它有害物质。
希望在通过一个或多个生物转化的生物合成途径中制造莫纳甜的方法相比单纯的合成方法能够产生较少的有毒或有害污染物，和/或可提供较高百分比的特定立体异构体。例如，希望当用D-氨基酸脱氢酶，D-丙氨酸(天冬氨酸)转氨酶、D-芳基转氨酶或D-甲硫氨酸转氨酶制造莫纳甜时，我们可以获得至少60％的R，R莫纳甜和少于40％的S，S、S，R和/或R，S莫纳甜。例如，当用上述D-酶类以及至少一种具有R-立体构型的碳原子的底物(例如莫纳甜前体)制造莫纳甜时还希望获得至少95％的R，R莫纳甜和少于5％的S，S、S，R和/或R，S莫纳甜。相反，当仅通过合成法制造莫纳甜时，我们只获得约25％-50％所需立体异构体。
一实施方案中，通过生物合成途径制造莫纳甜的方法，例如包括一步或多步生物转化，未产生石油化学、有毒或危险污染物。“石油化学、有毒或危险污染物”是指任何石油化学的、有毒的、有害的和/或对人类消费者不利的物质，包括原料带来的污染物或在仅用合成法制造莫纳甜时产生的污染物。另一实施方案中，通过生物合成途径制造莫纳甜的方法，例如包括一步或多步生物转化，指出了仅可食用或可饮用的物质。“可食用或可饮用的物质”是指适合人类食用或饮用或对人类消费者安全的一种或多种化合物或物质。可食用或可饮用的物质的例子包括莫纳甜、色氨酸、丙酮酸、谷氨酸、其它氨基酸以及人体内天然存在的其它化合物或物质。
某些实施方案中，莫纳甜甜味剂组合物包括甜味剂的桌面小包装和立方体，以及即用型桌面“匙对匙”甜味剂，从体积上来看，它们具有与蔗糖(糖)几乎相同的甜度，因此可用作桌面砂糖的替代品。这种桌面甜味剂可用来使咖啡和茶(热的和冰的)、谷物、果汁和家庭烘焙食品(曲奇、松饼、蛋糕等)以及餐后甜点变甜。
一实施方案中，桌面甜味剂组合物含有莫纳甜或其盐，其中所述组合物提供的甜度相当于约0.9-9.0克砂糖。另一实施方案中，1克莫纳甜桌面甜味剂组合物提供的甜度相当于2茶匙砂糖。另一实施方案中，1克莫纳甜桌面甜味剂组合物提供的甜度相当于约0.9-9.0克砂糖，且它所含的卡路里和碳水化合物少于1克砂糖。
其它实施方案中，包含莫纳甜或其盐的桌面甜味剂组合物含有约0-200毫克S，S莫纳甜或其盐和约0-5毫克R，R莫纳甜或其盐。例如，1克该桌面甜味剂组合物可含有约3-200毫克S，S莫纳甜或其盐和约0-5毫克R，R莫纳甜或其盐。或者，例如，1克该桌面甜味剂组合物可含有约0-200毫克S，S莫纳甜或其盐和约3-5毫克R，R莫纳甜或其盐。
其它实施方案中，1克该莫纳甜桌面甜味剂组合物含有约200mg或更少的S，S莫纳甜或其盐，且基本上不含R，R、S，R或R，S莫纳甜或其盐。另一实施方案中，1克该莫纳甜桌面甜味剂组合物含有约5mg或更少的R，R莫纳甜或其盐，且基本上不含S，S、S，R或R，S莫纳甜或其盐。
其它实施方案中，含有莫纳甜或其盐的组合物还含有至少一种选自下组的成分：填充剂、载体、纤维、糖醇、寡糖、糖、非莫纳甜高强度甜味剂、营养甜味剂、调味品、味道增强剂(flavor enhancer)、味道稳定剂(flavor stablizer)、酸化剂、抗结剂和助流动剂。例如，所述莫纳甜桌面甜味剂组合物还可含有用麦芽糊精成团的葡萄糖。
一实施方案中，甜味剂组合物含有莫纳甜和赤藓醇(erthritol)。其它实施方案中，莫纳甜组合物含有赤藓醇。一实施方案中，莫纳甜组合物含有多达99.7％赤藓醇。另一实施方案中，莫纳甜组合物含有海藻糖。另一实施方案中，莫纳甜组合物含有环磺酸盐(即环己烷氨基磺酸盐，cyclamate)。
其它实施方案中，桌面甜味剂组合物含有莫纳甜或其盐，其中所述莫纳甜或其盐基本上由R，R莫纳甜或其盐组成。或者，所述桌面甜味剂组合物含有莫纳甜或其盐，其中所述莫纳甜或其盐基本上由S，S莫纳甜或其盐组成。其它实施方案中，桌面甜味剂组合物含有莫纳甜或其盐，其中所述莫纳甜或其盐是富含R，R或S，S莫纳甜或其盐的混合物。例如，所述莫纳甜桌面甜味剂组合物可含有至少95％R，R莫纳甜或其盐。
其它实施方案中，桌面甜味剂组合物含有莫纳甜或其盐，其中所述甜度是有通过生物合成途径制造的莫纳甜或其盐提供的。
其它实施方案中，一种即用型甜味剂组合物含有莫纳甜或其盐，其中一定体积该组合物提供的甜度相当于相同体积的砂糖。另一实施方案中，1茶匙所述莫纳甜即用型甜味剂组合物含有的卡路里和碳水化合物少于约1茶匙砂糖。
其它实施方案中，一种即用型甜味剂组合物含有莫纳甜或其盐，其中，1克该组合物含有约3-25毫克S，S莫纳甜或其盐和约0-0.625毫克R，R莫纳甜或其盐。或者，例如，所述莫纳甜即用型甜味剂基本上由S，S莫纳甜或其盐或R，R莫纳甜或其盐组成。其它实施方案中，1克即用型莫纳甜甜味剂组合物含有约5-25毫克S，S莫纳甜或其盐。或者，例如，1克即用型莫纳甜甜味剂组合物含有约0.4-0.625 R，R莫纳甜或其盐，且基本上不含S，S、S，R或R，S莫纳甜或其盐。或者，例如，1克即用型莫纳甜甜味剂组合物含有约0.5-1毫克R，R莫纳甜或其盐，且基本上不含S，S、S，R或R，S莫纳甜或其盐。
其它实施方案中，一种甜味剂组合物含有富含莫纳甜某种立体异构体的混合物，其中所述莫纳甜混合物是通过生物合成途径制造的。一实施方案中，所述生物合成途径是一种多步骤途径，且该多步骤途径的至少步骤是化学转化。另一实施方案中，所述富含莫纳甜某种立体异构体的混合物主要是R，R莫纳甜或其盐。
其它实施方案中，一种均匀的桌面甜味剂组合物含有莫纳甜或其盐，其中该组合物样品中含有多于2毫克到200毫克莫纳甜或其盐，且所述样品中的莫纳甜或其盐提供的甜度相当于约0.9-9.0克砂糖。例如，所述均匀的桌面甜味剂组合物样品提供的甜度可相当于2茶匙砂糖。另一实施方案中，所述均匀的桌面甜味剂组合物样品的重量约为1克或体积约为0.35mL。另一实施方案中，所述均匀的桌面甜味剂组合物样品含有多于2毫克到5毫克莫纳甜或其盐。另一实施方案中，所述均匀的桌面甜味剂组合物基本上不含S，S莫纳甜或其盐，或基本上不含R，R莫纳甜或其盐。
其它实施方案中，一种桌面甜味剂组合物含有莫纳甜或其盐，其中，所述均匀的桌面甜味剂组合物样品含有多于2毫克到105毫克莫纳甜或其盐，且所述样品中的莫纳甜或其盐提供的甜度相当于1茶匙砂糖。另一实施方案中，所述含有莫纳甜或其盐的桌面甜味剂组合物样品的体积约为0.35ml，或是粒化材料的立方体。
其它实施方案中，桌面甜味剂组合物含有在生物合成途径中制造的莫纳甜组合物，其中所述莫纳甜组合物不含石油化学、有毒或危险污染物。例如，所述含有莫纳甜或其盐的莫纳甜桌面甜味剂组合物可在生物合成途径中制造并从重组细胞分离，其中所述重组细胞不含石油化学、有毒或危险污染物。
其它实施方案中，提供了一种含有莫纳甜或其盐的甜味剂组合物的方法，其中，所述方法包括从至少一种选自葡萄糖、色氨酸、吲哚-3-乳酸、吲哚-3-丙酮酸和莫纳甜前体的物质制造莫纳甜或其盐。其它实施方案中，所述方法还包括将莫纳甜或其盐与赤藓醇混合。其它实施方案中，所述方法还包括将莫纳甜或其盐与海藻糖混合。其它实施方案中，所述方法还包括将莫纳甜或其盐与环磺酸盐混合。其它实施方案中，所述方法还包括将莫纳甜或其盐与至少一种不是莫纳甜或其盐的其它成分混合。这种成分可包括填充剂、载体、纤维，糖醇、寡糖，蔗糖、非莫纳甜高强度甜味剂、营养甜味剂、调味品、味道增强剂、味道稳定剂、酸化剂、抗结剂、助流动剂及其任何组合。一实施方案中，至少一种其它成分选自麦芽糊精、葡萄糖、赤藓醇和纤维。
其它实施方案中，在制造该甜味剂组合物的方法中，重约1克的该甜味剂组合物含有约0-200毫克S，S莫纳甜或其盐和约0-5毫克R，R莫纳甜或其盐，且该部分提供的甜度相当于2茶匙砂糖。
其它实施方案中，在制造该甜味剂组合物的方法中，重约1克的该甜味剂组合物含有约0-25毫克S，S莫纳甜或其盐和约0-0.625毫克R，R莫纳甜或其盐，其中一定体积该组合物的甜度相当于相同体积的砂糖。或者，在制造该甜味剂组合物的方法中，1克组合物含有约0-25毫克S，S莫纳甜或其盐和约0-0.625毫克R，R莫纳甜或其盐，其中1克组合物的甜度相当于约0.9-9.0克砂糖。或者，在制造该甜味剂组合物的方法中，每1克组合物含有约5-200毫克S，S莫纳甜或其盐。
其它实施方案中，制造该甜味剂组合物的方法还包括将S，S莫纳甜或其盐与至少一种选自以下的其它成分混合：填充剂、载体、纤维、糖醇、寡糖、糖、非莫纳甜高强度甜味剂、营养甜味剂、调味品、味道增强剂、味道稳定剂、酸化剂、抗结剂、助流动剂及其任何组合，其中每1克组合物含有约3-200毫克莫纳甜或其盐。其它实施方案中，制造该甜味剂组合物的方法还包括将R，R莫纳甜或其盐与至少一种选自以下的其它成分混合：填充剂、载体、纤维、糖醇、寡糖、糖、非莫纳甜高强度甜味剂、营养甜味剂、调味品、味道增强剂、味道稳定剂、酸化剂、抗结剂、助流动剂及其任何组合，其中每1克组合物含有约3-5毫克R，R莫纳甜或其盐每1克组合物。其它实施方案中，制造该甜味剂组合物的方法包括使每1克组合物含有约0.4-5毫克R，R莫纳甜或其盐。
其它实施方案中，制造该甜味剂组合物的方法包括将莫纳甜或其盐与至少一种选自葡萄糖和麦芽糊精的填充剂混合物，其中每1克组合物含有约5毫克R，R莫纳甜或其盐。其它实施方案中，制造该甜味剂组合物的方法包括将莫纳甜或其盐与麦芽糊精混合，其中每1克组合物含有约0.5-1毫克R，R莫纳甜或其盐。
其它实施方案中，在制造含有莫纳甜组合物的甜味剂组合物的方法中，所述方法包括在生物合成途径中制造莫纳甜组合物，且其中所述莫纳甜组合物不含石油化学、有毒或危险污染物。或者，该方法包括在一多步骤途径中从底物制造莫纳甜组合物，其中所述多步骤途径中的一个或多个步骤是生物转化，且其中所述莫纳甜组合物不含石油化学、有毒或危险污染物。
其它实施方案中，在制造含有莫纳甜组合物的甜味剂组合物的方法中，所述方法包括在生物合成途径中制造莫纳甜组合物，且其中所述莫纳甜组合物由莫纳甜或其盐以及其它可食用或可饮用的物质构成。或者，该方法包括在一多步骤途径中从底物制造莫纳甜组合物，其中所述多步骤途径中的一个或多个步骤是生物转化，且其中所述莫纳甜组合物由莫纳甜或其盐以及其它可食用或可饮用的物质构成。
其它实施方案中，在制造含有莫纳甜组合物的甜味剂组合物的方法中，所述方法包括：(a)在重组细胞的生物合成途径中制造莫纳甜或其盐；(b)从所述重组细胞分离莫纳甜组合物，其中，所述莫纳甜组合物由莫纳甜或其盐以及其它可食用或可饮用的物质组成。
精通本领域的技术人员通过这里的描述将显见，本发明的具体实施方案涉及上述一个方面或上述一个方面与其它方面的组合。
附图简述
图1显示用于生成莫纳甜和/或吲哚-3-丙酮酸的生物合成途径。一种途径通过色氨酸生成吲哚-3-丙酮酸，而另一种通过吲哚-3-乳酸生成吲哚-3-丙酮酸。随后通过MP中间体生成莫纳甜。
框中所示化合物是生物合成途径中生成的底物和产物。与箭头相邻的组合物是辅因子或可在底物转化成产物期间使用的反应物。所用辅因子或反应物取决于生物合成途径的特定步骤使用的多肽。辅因子PLP(吡哆醛5’-磷酸)能催化不取决于多肽的反应，因此仅提供PLP可从底物进行到产物。
图2是使用MP中间体的生物合成途径的更详细图。途径中各步骤的底物以框显示。允许底物间转化的多肽列于底物间的箭头附近。各多肽通过其普通名称和酶分类(EC)号描述。
图3显示将吲哚-3-乳酸转化成吲哚-3-丙酮酸的生物合成途径的更详细图。底物以框显示，允许底物间转化的多肽列于底物间的箭头附近。各多肽通过其普通名称和EC号描述。
图4显示一种经化学方法产生MP的可能反应。
图5A和5B是色谱图，显示LC/MS鉴定的酶法生成的莫纳甜。
图6是酶法合成莫纳甜的电喷射质谱。
图7A和7B是LC/MS/MS子离子分析酶混合物中生成的莫纳甜的色谱图。
图8是色谱图，显示酶法生成莫纳甜的高分辨质谱测量。
图9A-9C是色谱图，显示(A)R-色氨酸、(B)S-色氨酸和(C)酶法生成莫纳甜的手性分离。
图10是柱状图，显示IPTG诱导后细菌细胞中生成的相对量的莫纳甜。(-)表示缺乏底物加入(不加入色氨酸或丙酮酸)。
图11-12是示意图，显示用于增加莫纳甜产量的途径，莫纳甜产生自色氨酸或吲哚-3-丙酮酸。
图13是示意图，显示能用于增加莫纳甜产量的途径，莫纳甜产生自色氨酸或吲哚-3-丙酮酸。
图14表示用莫纳甜的R，R立体异构体获得的用量反应曲线。
图15表示用莫纳甜的R，R/S，S立体异构体获得的用量反应曲线。
图16比较了莫纳甜的R，R/S，S立体异构体混合物与糖精的用量反应曲线。
图17显示了用合成法制造的莫纳甜标准品的反相色谱。
图18显示了莫纳甜标准品的手性色谱。
发明详述
莫纳甜生物合成途径的概述
提供下列术语和方法的解释以更好地描述本说明书并指导本领域普通技术人员实践本发明。如本文所用，“含有”指“包括”。此外，单数形式包括复数参考物，除非上下文另有明确规定。
如图1-3和11-13所示，许多生物合成途径能用于生成莫纳甜或其中间体如吲哚-3-丙酮酸或MP。为将各底物(葡萄糖、色氨酸、吲哚-3-乳酸、吲哚-3-丙酮酸和MP)转化成各产物(色氨酸、吲哚-3-丙酮酸、MP和莫纳甜)，可使用一些不同多肽。此外，这些反应可体内、体外完成，或通过体内反应和体外反应的组合，如包括非酶化学反应的体外反应。因此，图1-3和11-13是示范，显示能用于获得所需产物的多种不同途径。
葡萄糖到色氨酸
许多生物体能从葡萄糖合成色氨酸。含从葡萄糖和/或色氨酸生成莫纳甜、MP和/或吲哚-3-丙酮酸所需基因的构建物可克隆入这种生物体中。本文显示色氨酸可转化成莫纳甜。
在其它例子中，生物体用已知多肽改造以生成色氨酸或超量产生色氨酸。例如，美国专利号4,371,614描述用质粒转化大肠杆菌菌株，质粒含野生型色氨酸操纵子。
美国专利号4,371,614所述色氨酸的最大效价约为230ppm。类似地，WO 8701130描述遗传改造大肠杆菌菌株以生成色氨酸并讨论增加发酵生产L-色氨酸。本领域技术人员认识到能从葡萄糖生成色氨酸的生物体也能利用其它可转化成葡萄糖或果糖-6-磷酸的碳源和能源，结果类似。示范性碳源和能源包括但不限于蔗糖、果糖、淀粉、纤维素或甘油。
色氨酸到吲哚-3-丙酮酸
一些多肽可用于将色氨酸转化成吲哚-3-丙酮酸。示范性多肽包括但不限于酶种类(EC)2.6.1.27、1.4.1.19、1.4.99.1、2.6.1.28、1.4.3.2、1.4.3.3、2.6.1.5、2.6.1.-、2.6.1.1和2.6.1.21。这些种类包括但不限于称为色氨酸转氨酶的多肽(也称为L-苯丙氨酸-2-氧戊二酸转氨酶、色氨酸转氨酶、5-羟基色氨酸-酮戊二酸转氨酶、羟基色氨酸转氨酶、L-色氨酸氨基转移酶、L-色氨酸转氨酶、L-色氨酸：2-氧戊二酸转氨酶)，它将L-色氨酸和2-氧戊二酸转化成吲哚-3-丙酮酸和L-谷氨酸；D-色氨酸转氨酶，它将D-色氨酸和2-含氧酸转化成吲哚-3-丙酮酸和氨基酸；色氨酸脱氢酶(也称为NAD(P)-L-色氨酸脱氢酶、L-色氨酸脱氢酶、L-Trp-脱氢酶、TDH和L-色氨酸：NAD(P)氧化还原酶(脱氨))，它将L-色氨酸和NAD(P)转化成吲哚-3-丙酮酸和NH3和NAD(P)H；D-氨基酸脱氢酶，它使D-氨基酸和FAD转化成吲哚-3-丙酮酸和NH3和FADH2；色氨酸-苯基丙酮酸转氨酶(也称为L-色氨酸-α-酮异己酸转氨酶和L-色氨酸：苯基丙酮酸转氨酶)，它将L-色氨酸和苯基丙酮酸转化成吲哚-3-丙酮酸和L-苯丙氨酸；L-氨基酸氧化酶(也称为蛇氨基酸氧化酶和L-氨基酸：氧氧化还原酶(脱氨))，它使L-氨基酸和H2O和O2转化成2-含氧酸和NH3和H2O2；D-氨基酸氧化酶(也称为蛇氨基酸氧化酶和D-氨基酸：氧氧化还原酶(脱氨))，它将D-氨基酸和H2O和O2转化成2-含氧酸和NH3和H2O2；色氨酸氧化酶，它使L-色氨酸和H2O和O2转化成吲哚-3-丙酮酸和NH3和H2O2。这些种类也含有酪氨酸(芳族)转氨酶、天冬氨酸转氨酶、D-氨基酸(或D-丙氨酸)转氨酶和有多种转氨酶活性的广(多底物)转氨酶，其中一些能使色氨酸和2-含氧酸转化成吲哚-3-丙酮酸和氨基酸。
转氨酶种类中有这种活性的11个成员描述于下面的实施例1，包括SEQ IDNOS：11和12所示的新转氨酶。因此，本发明提供分离的核酸和氨基酸序列，与SEQID NOS：11和12有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或甚至至少99％的序列同一性。本发明也涵盖SEQ ID NOS：11和12的片段和融合，它们保持转氨酶活性或编码有转氨酶活性的多肽。示范性片段包括但不限于至少10、12、15、20、25、50、100、200、500或1000个SEQ ID NO：11的毗连核苷酸或至少6、10、15、20、25、50、75、100、200、300或350个SEQ ID NO：12的毗连核苷酸。所示序列(和其变体、片段和融合)可以是载体的一部分。载体能用于转化宿主细胞，从而生成重组细胞，重组细胞可从色氨酸产生吲哚-3-丙酮酸，在一些例子中能进一步生成MP和/或莫纳甜。
已知L-氨基酸氧化酶(1.4.3.2)，序列可分离自一些不同来源，如地中海蝰(Viperalebetine)(sp P81375)、眼睛王蛇(Ophiophagus hannah)(sp P81383)、红口蝮(Agkistrodonrhodostonma)(sp P81382)、西部菱斑响尾蛇(Crotalus atrox)(sp P56742)、洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepaica)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、新月柄杆菌(Caulobactercresentus)、莱因哈德衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)、小鼠(Mus musculus)、丁香假单胞菌(P.Syringae)、和红球菌(Rhodococcus)菌株。此外，色氨酸氧化酶描述于文献且能分离自例如鬼伞属(Coprinus)SF-1、有根肿病的大白菜、拟南芥和哺乳动物的肝。能将色氨酸转化成吲哚-3-丙酮酸的1个L-氨基酸氧化酶类成员讨论于下面的实施例3以及分子克隆的另外来源。许多D-氨基酸氧化酶基因在分子克隆的数据库中是有用的。
已知色氨酸脱氢酶，且可分离自例如菠菜、豌豆(Pisum sativum)、柔黄花牧豆树(Prosopis juliflora)、豌豆、牧豆树、小麦、玉米、番茄、烟草、紫色色杆菌(Chromobacterium violaceum)和乳杆菌(Lactobacilli)。已知许多D-氨基酸脱氢酶基因序列。
如图11-13所示，如果氨基酸氧化酶如色氨酸氧化酶用于使色氨酸转化成吲哚-3-丙酮酸，能加入过氧化氢酶以减少或甚至去除过氧化氢的存在。
吲哚-3-乳酸到吲哚-3-丙酮酸
将吲哚-3-乳酸转化成吲哚-3-丙酮酸的反应可通过多种多肽催化，如1.1.1.110、1.1.1.27、1.1.1.28、1.1.2.3、1.1.1.222、1.1.1.237、1.1.3.-或1.1.1.111多肽类的成员。1.1.1.110多肽类包括吲哚乳酸脱氢酶(也称为吲哚乳酸：NAD+氧化还原酶)。1.1.1.27、1.1.1.28和1.1.2.3类包括乳酸脱氢酶(也称为乳酸脱氢酶、乳酸：NAD+氧化还原酶)。1.1.1.222类包含(R)-4-羟苯基乳酸脱氢酶(也称为D-芳族乳酸脱氢酶、R-芳族乳酸脱氢酶和R-3-(4-羟苯基)乳酸：NAD(P)+2-氧化还原酶)且1.1.1.237类包含3-(4-羟苯基丙酮酸)还原酶(也称为羟苯基丙酮酸还原酶和4-羟苯基乳酸：NAD+氧化还原酶)。1.1.3.-类包含乳酸氧化酶，1.1.1.111类包含(3-咪唑-5-基)乳酸脱氢酶(也称为(S)-3-(咪唑-5-基)乳酸：NAD(P)+氧化还原酶)。可能这些种类中的一些多肽能从吲哚-3-乳酸生成吲哚-3-丙酮酸。此转化的例子提供于实施例2。
化学反应也能用于将吲哚-3-乳酸转化成吲哚-3-丙酮酸。这种化学反应包括能用一些方法完成的氧化步骤，例如：空气氧化，使用B2催化剂(China Chemical Reporter，13卷，28期，18页(1)，2002)、金属催化剂存在时稀释高锰酸盐和高氯酸盐或过氧化氢。
吲哚-3-丙酮酸到2-羟基-2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸(MP)
一些已知多肽能用于使吲哚-3-丙酮酸转化成MP。示范多肽种类包括4.1.3.-、4.1.3.16、4.1.3.17和4.1.2.-。这些种类包括碳-碳合酶/裂合酶，如催化2种羧酸底物缩合的醛缩酶。肽类EC 4.1.3.-是形成碳-碳键的合酶/裂合酶，使用含氧酸底物(如吲哚-3-丙酮酸)作为亲电体，而EC 4.1.2.-是形成碳-碳键的合酶/裂合酶，使用醛底物(如苯甲醛)作为亲电体。
例如，EP 1045-029中所述多肽(EC 4.1.3.16、4-羟基-2-氧戊二酸乙醛酸-裂合酶，也称为4-羟基-2-氧戊二酸醛缩酶、2-氧-4-羟基戊二酸醛缩酶或KHG醛缩酶)将乙醛酸和丙酮酸转化成4-羟基-2-酮戊二酸，多肽4-羟基-4-甲基-2-氧戊二酸醛缩酶(EC4.1.3.17，也称为4-羟基-4-甲基-2-氧戊二酸丙酮酸-裂合酶或ProA醛缩酶)缩合2种酮酸如2个丙酮酸到4-羟基-4-甲基-2-氧戊二酸。本文描述利用这些裂合酶的反应。
图1-2和11-13显示这些反应的示意图，其中3-碳(C3)分子结合吲哚-3-丙酮酸。EC 4.1.2.-和4.1.3.-的许多成员特别是利用PLP的多肽能使用C3分子，C3分子是氨基酸如丝氨酸、半胱氨酸和丙氨酸或其衍生物。由EC 4.1.2.-和4.1.3.-代表催化的醛醇缩合需要此途径的3个碳分子是丙酮酸或丙酮酸衍生物。然而，其它化合物能作为C3碳源且可转化成丙酮酸。丙氨酸可通过许多利用PLP的转氨酶来转氨以产生丙酮酸，包括许多上述的转氨酶。可通过β消除反应(如由色氨酸酶或β酪氨酸酶催化)获得丙酮酸和氨，反应用于L-丝氨酸、L-半胱氨酸、有足够离去基团的丝氨酸和半胱氨酸的衍生物，如O-甲基-L-丝氨酸、O-苄基-L-丝氨酸、S-甲基半胱氨酸、S-苄基半胱氨酸、S-烷基-L-半胱氨酸、O-酰基-L-丝氨酸和3-氯-L-丙氨酸。天冬氨酸可在PLP-介导的β-裂合酶反应中用作丙酮酸的来源，如色氨酸酶(EC 4.1.99.1)和/或β-酪氨酸酶(EC 4.1.99.2，也称为酪氨酸-酚裂合酶)催化的反应。通过在(4.1.99.1-2)多肽上进行定点突变可增加β-裂合酶反应速度，如Mouratou等(J.Biol.Chem 274：1320-5，1999)和实施例8所述。这些修饰使多肽接受二羧基氨基酸底物。乳酸盐也能用作丙酮酸的来源，且通过加入乳酸脱氢酶和氧化辅因子或乳酸氧化酶和氧来氧化成丙酮酸。这些反应的例子描述于下。例如，如图2和图11-13所示，当丙酮酸用作C3分子时，ProA醛缩酶能接触吲哚-3-丙酮酸。
MP可用化学反应产生，如实施例5提供的醛醇缩合。
MP到莫纳甜
MP到莫纳甜的转化可由下列1个或多个催化：色氨酸转氨酶(EC 2.6.1.27)、色氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.19)、D-氨基酸脱氢酶(EC 1.4.99.1)、谷氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.2-4)、苯丙氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.20)、色氨酸-苯丙酮酸转氨酶(EC 2.6.1.28)或更多转氨酶家族(2.6.1.-)的一般成员如天冬氨酸转氨酶(EC 2.6.1.1)、酪氨酸(芳族)转氨酶(2.6.1.5)、D-色氨酸转氨酶或D-丙氨酸(2.6.1.21)转氨酶(图2)。转氨酶类的11个成员描述于下(实施例1)，包括SEQ ID NOS：11和12所示新的种类成员，实施例7提供证明转氨酶和脱氢酶活性的反应。
此反应也能用化学反应进行。酮酸(MP)胺化通过还原性胺化用氨和氰硼氢化钠进行。
图11-13显示另外的多肽，它们能用于使MP转化成莫纳甜以及增加来自吲哚-3-丙酮酸或色氨酸的莫纳甜产量。例如，如果天冬氨酸用作氨基供体，天冬氨酸转氨酶能用于使天冬氨酸转化成草酰乙酸(图11)。草酰乙酸通过脱羧酶转化成丙酮酸和二氧化碳，如草酰乙酸脱羧酶(图11)。此外，如果赖氨酸用作氨基供体，赖氨酸ε转氨酶可用于使赖氨酸转化成ε-醛基赖氨酸(图12)。ε-醛基赖氨酸自发转化成1-哌啶6-羧酸盐(图12)。如果能催化还原性胺化反应的多肽(如谷氨酸脱氢酶)用于将MP转化成莫纳甜，可使用能再循环NAD(P)H和/或生成挥发性产物的多肽，如甲酸脱氢酶。
设计生物合成途径中的另外考虑
取决于哪种多肽用于产生吲哚-3-丙酮酸、MP和/或莫纳甜，能提供辅因子、底物和/或另外多肽给生产细胞以提高产物形成。此外，可设计遗传修饰来提高吲哚-3-丙酮酸、MP和/或莫纳甜等产物的产量。类似的，使用宿主细胞可使莫纳甜生产最优化。
去除过氧化氢
过氧化氢(H2O2)是产物，如果产生，可对生产细胞、多肽或产生的产物(如中间体)有损害。上述L-氨基酸氧化酶产生H2O2作为产物。因此，如果使用L-氨基酸氧化酶，能去除所得H2O2或其水平减少以降低对细胞或产物的潜在损伤。
过氧化氢酶能用于降低细胞中的H2O2水平(图11-13)。生产细胞可表达编码过氧化氢酶(EC 1.11.1.6)的基因或cDNA序列，此酶催化过氧化氢降解成水和氧气。例如，过氧化氢酶可从转染入生产细胞的载体中表达。能使用的过氧化氢酶例子包括但不限于：tr|Q9EV50(木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus))、tr|Q9KBE8(耐盐杆菌)、tr|Q9URJ7(白色念珠菌)、tr|P77948(天兰色链霉菌)、tr|Q9RBJ5(野油菜黄单胞菌)(SwissProt登录号)。使用L-氨基酸氧化酶、D-氨基酸氧化酶或色氨酸氧化酶的生物催化反应也能包含过氧化氢酶多肽。
吡哆醛5’-磷酸(PLP)有效性的调节
如图1所示，PLP可用于本文所述1个或多个生物合成步骤。能补充PLP浓度，从而PLP不成为对反应总效率的限制。
充分研究大肠杆菌中维生素B6(PLP的前体)的生物合成途径且已结晶一些蛋白(Laber等，FEBS Letters，449：45-8，1999)。其它代谢途径中需要2个基因(epd或gapB和serC)，而3个基因(pdxA、pdxB和pdxJ)是吡哆醛磷酸生物合成独有的。大肠杆菌途径中的起始物质之一是1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸(DXP)。从共同的2和3碳中心代谢物合成此前体是由多肽1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶(DSX)催化的。其它前体是苏氨酸衍生物，它形成自4-碳糖，D-赤藓糖4-磷酸。转化到磷酸-4-羟基-L苏氨酸(HTP)所需的基因是epd、pdxB和serC。形成PLP的最后一个反应是DXP与HTP间的复杂分子内缩合和闭环反应，由pdxA和pdxJ的基因产物催化。
如果PLP成为发酵生产莫纳甜期间的限制营养物，1个或多个途经基因在生产宿主细胞中的表达增加可用于提高莫纳甜产量。宿主生物体可包含多个其天然途径基因的拷贝或非天然途径基因的拷贝可掺入生物体基因组中。另外，补救途径基因的多个拷贝能克隆入宿主生物体中。
1个在所有生物体中保守的补救途径使多种维生素B6的衍生物再循环成活性PLP形式。参与此途径的多肽是pdxK激酶、pdxH氧化酶和pdxY激酶。过量表达1个或多个这些基因可增加PLP有效性。
提高维生素B6水平可通过去除或阻抑宿主生物体中天然生物合成途径基因的代谢调节。PLP阻抑多肽，此多肽参与黄杆菌属(Flavobacterium)菌株238-7中前体苏氨酸衍生物的生物合成。此细菌菌株无代谢控制，过度生成吡哆醛衍生物且能分泌多至20mg/L的PLP。以类似方式遗传操作产生莫纳甜的宿主生物体可增加PLP生成而不过度表达生物合成途径基因。
铵利用
能驱动色氨酸酶反应趋向合成方向(从吲哚生成色氨酸)，这是通过制备更能利用的氨或去除水。还原性胺化反应如由谷氨酸氢化酶催化的反应，也能通过铵过量来驱动。
氨可作为碳酸或磷酸缓冲系统中的碳酸铵或磷酸铵盐而得到。氨也能作为丙酮酸铵或甲酸铵提供。另外，如果反应偶联产生氨的反应如谷氨酸脱氢酶或色氨酸脱氢酶，可提供氨。加入EC 4.1.99.-的天然底物(酪氨酸或色氨酸)能产生氨，底物会水解成酚或吲哚、丙酮酸和NH3。通过酶水解其优选底物也能使增加的合成产物的产量超过正常平衡量。
除去产物和副产物
色氨酸经色氨酸转氨酶转化成吲哚-3-丙酮酸可不利地影响吲哚-3-丙酮酸的产率，因为反应生成谷氨酸并需要共底物2-氧戊二酸(α-酮戊二酸)。谷氨酸可引起转氨酶的抑制，反应会消耗大量共底物。此外，高谷氨酸浓度对下游分离过程有害。
多肽谷氨酸脱氢酶(GLDH)将谷氨酸转化成2-氧戊二酸，从而在反应中再循环共底物，反应由色氨酸转氨酶催化。GLDH也产生还原等价物(NADH或NADPH)，能用于在需氧条件下产生细胞所用能量(ATP)。通过GLDH利用谷氨酸也减少副产物形成。另外，反应产生氨，它能用作细胞的氮源或作为图1所示最后步骤中还原性胺化的底物。因此，过度表达GLDH多肽的生产细胞能用于增加产量和降低培养基和/或分离方法的成本。
在色氨酸到莫纳甜的途径中，如果使用来自适当酶类的转氨酶，步骤3的氨基供体(如谷氨酸或天冬氨酸)可反转化成步骤1所需的氨基受体(如2-氧戊二酸或草酰乙酸)。使用此途径的2个独立的转氨酶能提高此途径的效率，其中1个转氨酶的底物不竞争性地抑制其它转氨酶的活性。
所述途径中的许多反应是可逆的且因此会到达底物和产物间的平衡。可通过从多肽中连续取出产物来增加此途径的产量。例如，莫纳甜用通透酶或其它转运蛋白分泌入发酵液或者从生物催化反应器流中选择性结晶莫纳甜并伴随底物再循环会提高反应产量。
通过另外的酶反应或氨基供体基团的取代来去除副产物是另一种增加反应产量的方法。一些例子讨论于实施例13且示于图11-13。生成的副产物不能在反方向中反应，这是通过相变(蒸发)或自发转化成惰性的终产物如二氧化碳。
底物库的调节
调节吲哚库可通过增加色氨酸前体生成和/或改变包括吲哚-3-丙酮酸和/或色氨酸的分解代谢途径。例如，减少或去除从吲哚-3-丙酮酸生成吲哚-3-乙酸可通过功能性缺失宿主细胞中编码EC 4.1.1.74的基因。减少或去除从色氨酸生成吲哚可通过功能性缺失宿主细胞中编码EC 4.1.99.1的基因。另外，过量吲哚能用作体外或体内过程中的底物，结合增加量的编码EC 4.1.99.1的基因(Kawasaki等，J.Ferm.and Bioeng.，82：604-6，1996)。此外，可进行遗传修饰以增加中间体的水平，如D-赤藓糖4-磷酸和分支酸。
在大部分生物体中调节色氨酸生成。一种机制是通过反馈抑制途径中的某些酶；随着色氨酸水平增加，色氨酸的产率减少。因此，当使用经色氨酸中间体生成莫纳甜的工程宿主细胞时，可使用对色氨酸浓度不敏感的生物体。例如，玫瑰长春花(Catharanthus roseus)品系抗多种色氨酸类似物的生长抑制，它通过反复暴露于高浓度5-甲基色氨酸来选择(Schallenberg和Berlin，Z Naturforsch 34：541-5，1979)。可能由于基因突变，所得品系的色氨酸合酶活性受到产物抑制的影响小。类似地，用于莫纳甜生成的宿主细胞可最优化。
最优化色氨酸生成可使用定向进化，以形成对产物抑制不太敏感的多肽。例如，筛选能在培养基中不含色氨酸的平板上进行，但具有高水平的非代谢色氨酸类似物。美国专利号5,756,345；4,742,007和4,371,614描述用于增加发酵生物体中色氨酸产率的方法。色氨酸生物合成的最后步骤是加入丝氨酸到吲哚；因此能提高丝氨酸的有效性以增加色氨酸生成。
可通过增加宿主生物体产生的丙酮酸量来提高发酵生物体产生的莫纳甜量。一些酵母如丝孢酵母菌(Trichosporon cutaneum)(Wang等，Lett.Appl.Microbiol.35：338-42，2002)和光滑球拟酵母菌(Torulopsis glabrata)(Li等，Appl Microbiol.Biotechnol.57：451-9，2001)超量产生丙酮酸且能用于实践本文所述方法。此外，可对生物体进行遗传修饰以促进丙酮酸生成，如在大肠杆菌菌株W1485lip2(Kawasaki等，J.Ferm.and Bioeng.82：604-6，1996)中。
控制手性
通过控制立体化学(手性)能改变莫纳甜的味觉分布。例如，不同食物系统的浓度不同的混合物中需要不同的莫纳甜异构体。手性可通过pH和多肽的组合控制。
Figure A20048002224900251
通过去质子化和再质子化α碳可在莫纳甜的C-4位置(见上面编号的分子)外消旋，这能通过pH变化或与辅因子PLP反应来发生。在微生物中，pH不太可能变化到足以引起外消旋，但PLP是丰富的。控制多肽手性的方法取决于用于生成莫纳甜的生物合成途径。
当莫纳甜用图2所示途径形成时，可考虑下列各项。在生物催化反应中，碳-2的手性由酶确定，酶将吲哚-3-丙酮酸转化成MP。多种酶(如来自EC 4.1.2.-、4.1.3.-)能使吲哚-3-丙酮酸转化成MP，因此可选择形成所需异构体的酶。另外，将吲哚-3-丙酮酸转化成MP的酶的对映特异性可用定向进化修饰或能改造催化抗体以催化所需反应。一旦生成MP(通过酶法或化学缩合)，可用转氨酶立体特异性加入氨基，如本文所述的转氨酶。能产生碳-4的R或S构象，这取决于使用D-还是L-芳族酸转氨酶。大部分转氨酶对L-异构体特异，然而，D-色氨酸转氨酶存在于一些植物(Kohiba和Mito，《第8届国际维生素B6和羰基催化讨论会会议录》，日本大阪，1990)。此外，鉴定了D-丙氨酸转氨酶(2.6.1.21)、D-甲硫氨酸-丙酮酸转氨酶(2.6.1.41)、(R)-3-氨基-2-甲基丙酸转氨酶(2.6.1.61)和(S)-3-氨基-2-甲基丙酸转氨酶(2.6.1.22)。一些转氨酶仅接受在C2碳有特定构象的此反应的底物。因此，即使转化成MP不是立体定向的，可通过适当选择转氨酶控制终产物的立体化学。由于反应是可逆的，未反应MP(不需要的异构体)可再循环回到其组分且可再形成MP的外消旋混合物。
底物的激活
磷酸化底物如磷酸烯醇丙酮酸盐(PEP)可用于本文所示反应。磷酸化底物可在能量上更有利，因此可用于增加反应速度和/或产量。在醛醇缩合中，加入磷酸基团稳定亲核底物的烯醇相互转化异构体，使它更具反应性。在其它反应中，磷酸化底物通常提供更好的离去基团。类似地，可通过转化成CoA衍生物或焦磷酸盐衍生物激活底物。
莫纳甜在甜味剂组合物中的用途
按重量计，莫纳甜的S，S立体异构体比蔗糖甜约50-200倍。按重量计，莫纳甜的R，R立体异构体比蔗糖甜约2000-2400倍。如上所述，莫纳甜的甜度是由有经验的感觉鉴定员在甜度比较过程中计算的，该过程将测试甜味剂溶液与一系列参考溶液之一的甜度进行比较。例如，溶液可用含有0.16％(v/w)柠檬酸和0.02％(v/w)柠檬酸钠的缓冲液(pH3.0)制备。计算用量反应曲线的斜率作为甜度，即将％蔗糖除以％莫纳甜。例如可见图15(R，R/S，S莫纳甜用量反应曲线)；图14(R，R莫纳甜用量反应曲线)。通过测量8％蔗糖等价值(“SEV”)时的斜率获得了相比蔗糖甜度的上述莫纳甜的甜度。
莫纳甜可以消费者喜欢的浓度溶于含水溶液。在某些基料中或与其它甜味剂混合时莫纳甜立体异构体混合物的质量可能较好。将莫纳甜与其它甜味剂混合可使甜味强度和/或曲线最大且成本最低。莫纳甜可与其它甜味剂和/或其它成分组合以产生类似于蔗糖的时间曲线，或获得其它益处。
例如，莫纳甜可与其它营养和非营养甜味剂混合以获得特定的味道或卡路里目标。因此，甜味剂组合物可包括莫纳甜与一种或多种以下甜味剂类型的组合：(1)糖醇(如赤藓醇、山梨糖醇、麦芽糖醇、甘露醇、乳糖醇、木糖醇、异麦芽糖、低糖糖浆等)；(2)其它高强度甜味剂(如阿斯巴特、三氯蔗糖、糖精、乙酰舒泛钾、蛇菊苷、环磺酸盐、纽甜(neotame)、甜蛋白(thaumatin)、阿力甜(alitame)、二氢查耳酮、莫尼糖蛋白、甘草皂素(glycyrrihizin)、罗汉果苷、叶甜素、马槟榔甜素、brazzein、多肽菌素、Pentadin等)，以及(3)营养甜味剂(如蔗糖、塔格糖、转化糖、果糖、玉米糖浆、高果糖玉米糖浆(HFCS)、葡萄糖/葡萄糖、海藻糖、异麦芽酮糖等)。莫纳甜可作为味道修饰剂用于这种混合物以抑制后味、强化其它味道，如柠檬味，或改善暂时味道特征。数据还显示，莫纳甜与环磺酸盐(在欧洲使用)有协同作用，但与阿斯巴特、糖精、乙酰舒泛钾、三氯蔗糖或碳水化合物甜味剂的协同作用不明显。由于，莫纳甜不是碳水化合物，莫纳甜可部分或完全代替含有碳水化合物的甜味剂。
莫纳甜在干燥形式下稳定，并在单独或与碳水化合物混合物时具有所需味道表现。它未显示出不可逆转的分解，但在低pH时倾向于形成内酯和/或内酰胺(在含水缓冲液中)并达到平衡。在溶液中，它可在4位缓慢外消旋，但这通常在高pH下发生。通常，莫纳甜的稳定性相当于或好于阿斯巴特(Equal)，莫纳甜的味道表现相当于或好于其它品质的甜味剂，如阿斯巴特(Equal)、阿力甜和三氯蔗糖(Splenda)。相比糖精和蛇菊苷等其它高强度甜味剂，莫纳甜没有不好的后味。
莫纳甜甜味剂制品可用作桌面蔗糖替代物。通常，当制造桌面蔗糖替代物时，我们可以使用填充剂和/或载体来稀释莫纳甜以便于测量。
一实施方案中，我们可制造方便的独立包装，这种独立包装提供的甜度相当于2茶匙(约8克)砂糖的甜度。由于S，S比蔗糖甜50-200倍，因此40-160毫克S，S莫纳甜提供的甜度相当于8克砂糖。因此，一实施方案中，为实现+/-25％的甜度优化，1克莫纳甜独立包装制品可含有约40-200毫克S，S莫纳甜。
同样，由于R，R比蔗糖甜2000-2400倍，3.3-4.0毫克R，R莫纳甜提供的甜度相当于8克蔗糖。因此，另一实施方案中，为实现+/-25％的甜度优化，1克莫纳甜独立包装制品可含有约3.3-5.0毫克R，R莫纳甜。另一实施方案中，每克这种包装制品可含有40-200毫克S，S莫纳甜、3.3-5.0毫克R，R莫纳甜或其相同量或较少量的组合，以提供可与2茶匙砂糖相比的甜度。
桌面甜味剂包装通常总共含有1克高强度甜味剂和一种或多种填充剂或载体的混合物。可使用多种填充剂或填充剂的组合来制造这种制品。例如，一些实施方案中，莫纳甜可与麦芽糊精和/或葡萄糖一起喷雾干燥。例如，葡萄糖提供较大密度，仍可用于甜味剂包装(约1克)以使每份的热量降至约0卡路里。
一实施方案中，含有莫纳甜的包装制品(总重1克)含有：
葡萄糖(营养性)    0-99.7wt％
麦芽糊精    0-99.7wt％
3.3-5.0毫克R，R莫纳甜，40-200毫克S，S莫纳甜或其相同量或较少量的组合。
其它实施方案中，即用型桌面甜味剂制品被设计成其甜度和体积相当于砂糖(蔗糖)的甜度和体积。这种制品可以“匙对匙”的方式代替砂糖，这在烘焙配方中尤其有用。与包装制品(约1克)相比，这种即用型“匙对匙”制品通常含有更多的稀释物，如填充剂和/或载体，这使其在家庭中便能定量，如用茶匙、汤匙或杯子。相比包装形式，这种制品通常有较低的密度和较少颗粒。因此，这种即用型“匙对匙”制品可含有不同的成分以降低密度并使这种制品可等量代替蔗糖使用。
例如，由于葡萄糖的密度较大，我们在制造这种即用型“匙对匙”制品便可单独使用麦芽糊精。麦芽糊精的低密度使得甜味剂制品可等体积代替蔗糖使用而不会积累相同(高)水平的卡路里。当以一满匙或一满杯使用莫纳甜甜味剂时这将更加有效，如用于烘焙。
由于S，S比蔗糖甜50-200倍，5-20毫克S，S莫纳甜提供的甜度相当于1克砂糖。因此，一实施方案中，为实现+/-25％的甜度优化，每克即用型“匙对匙”制品可含有约5-25毫克S，S莫纳甜。
同样，由于R，R比蔗糖甜2000-2400倍，0.4-0.5毫克R，R莫纳甜提供的甜度相当于1克蔗糖。因此，另一实施方案中，为实现+/-25％的甜度优化，即用型“匙对匙”制品可含有约0.4-0.625毫克R，R莫纳甜。另一实施方案中，这种即用型制品可含有5-25毫克S，S莫纳甜、0.4-0.625毫克R，R莫纳甜或其相同量或较少量的组合，以提供可与蔗糖相比的甜度。
另一实施方案中，每份0.5克即用型甜味剂制品含有约0.2-13毫克莫纳甜，它被喷雾干燥到大约500毫克麦芽糊精上。
其它实施方案中，我们可制造立方体形状的莫纳甜组合物以用于，例如，餐厅。这种立方体的重量约为8克，且与标准方糖的大小相等，即2.2cm×2.2cm×1cm。这些立方体制品含有的莫纳甜的量类似于上述即用型制品，因此这种立方体的甜度相当于标准方糖。或者，我们可以制造大小的立方体(4克，1.1cm×2.2cm×1cm)。这些制品提供的甜度相当于标准方糖(因此以重量计，其甜度约为蔗糖的2倍)。
莫纳甜桌面制品，如小包装或即用型组合物，也可含有其它填充剂或载体。例如，所述制品可含有一种或多种纤维，如菊粉、阿拉伯半乳聚糖、水解瓜尔胶、聚葡萄糖、微晶纤维素、solka floc、淀粉、变性淀粉、抗性淀粉、抗性麦芽糊精等。许多纤维高度溶于水、具有第粘度和温和的味道。纤维是特别有用的填充剂，因为它们相比其它填充剂含有较少热量。
例如，每克菊粉仅提供1.3卡路里，而相同量的葡萄糖提供4卡路里。每克脱糖菊粉(含有＜2％单糖和二糖)仅提供1.1卡路里，因此是特别好的选择。相比麦芽糊精，某些纤维(如菊粉)有助于形成更加像砂糖样的外观，它们通常被用于杯对杯的蔗糖替代品。纤维还可提供其它优点，如营养强化、促进内脏健康、增加钙质吸收等等。使用不可消化的碳水化合物，如纤维或抗性淀粉衍生物，还能降低蔗糖含量(例如对于糖尿病患者)。例如，我们可使用抗性淀粉、抗性麦芽糊精和菊粉以获得低热量、低糖和低胰岛素源性载体和稀释剂。
同样，莫纳甜制品可含有一种或多种糖醇，如赤藓醇、山梨糖醇、木糖醇、麦芽糖醇、甘露醇和乳糖醇。一实施方案中，我们可用赤藓醇代替其它载体或填充剂。赤藓醇提供优于葡萄糖或麦芽糊精的一些优点。例如，相比葡萄糖和麦芽糊精，赤藓醇提供的热量很少或几乎没有一每克赤藓醇提供0-0.2卡路里，而每克葡萄糖提供4卡路里，每克麦芽糊精提供2.8-3.2卡路里。见Lyn O′Brien Nabors编的《甜味剂替代物》(ALTERNATIVE SWEETENERS)，第三版，M.E.Embuscado和S.K.Patil编写的第13章“赤藓醇”(Marcel Dekker，Inc，New York 2001)。同时，当喷雾干燥麦芽糊精时，它看上去更像是粉末而不少砂糖。另一方面，赤藓醇是单晶的，因此看上去像是蔗糖。因此，我们可将莫纳甜直接加到赤藓醇上。
此外，所述制品还可含有寡糖，如果寡糖、麦芽寡糖、异麦芽寡糖、半乳寡糖、大豆寡糖和乳寡糖。该制品还可含有糖，如蔗糖、转化糖、海藻糖、异构糖、葡萄糖、果糖、乳糖、麦芽糖、D-木糖和异构乳糖等。如果制成片状，可加入乳糖以增加片的体积和形状。
可用各种方法制造莫纳甜和填充剂的组合物，其中包括干法混合、共喷雾干燥、共冷冻干燥、成团、混合、共干燥、挤出或其它方法。
我们也可加入香料和酸化剂，如酒石，以改进制品混合物的味道、稳定性和/或烘焙特性。我们还可加入味道增强剂或稳定剂，如SucramaskTM。
所述制品还可含有抗结剂或助流动剂，如二氧化硅(硅石)、硅酸钙、硅酸镁、碳酸钙、铝硅酸钠、铝硅酸钙、铝硅酸钾、磷酸一钙、磷酸二钙、磷酸三钙、滑石、甘露醇等。
一些实施方案中，莫纳甜被用于烘焙。某些实施方案中，在烘焙配方中加入了蜂蜜或糖蜜以使其具有焦糖色外观和良好质地。例如，一些配方可能会要求加入1汤匙糖蜜以模拟蔗糖的天然焦糖色。
另一实施方案中，莫纳甜可用来代替许多普遍用于糖果和其它无糖食品的多元醇。这些多元醇有轻泻作用，而赤藓醇还有降温作用。赤藓醇的轻泻作用弱于其它多元醇。其它多元醇有和赤藓醇一样的降温作用。与传统多元醇(如麦芽糖醇)相比，赤藓醇含有较少卡路里和较低糖分指数。莫纳甜能进一步降低卡路里和糖分指数，且不会显著增加生龋性。然而，当用高强度甜味剂代替多元醇或其它传统甜味剂(如蔗糖)时，需要填充剂以维持产品的体积可口感。最常见的填充剂包括菊粉、麦芽糊精、聚葡萄糖和山梨糖醇。菊粉还能促进身体摄入膳食钙质。抗性淀粉和慢消化淀粉也可用作高强度甜味剂的填充剂或稀释剂。莫纳甜可与许多甜味剂、碳水化合物和填充剂混合使用。
相比其它甜味剂，莫纳甜桌面混合物将有较长的保存期、较高的热稳定性和酸稳定性以及较好的味道和市场销售优势。
                            实施例
                           实施例1
色氨酸转氨酶的克隆和表达
该实施例描述用于克隆色氨酸转氨酶的方法，它可用于使色氨酸转化成吲哚-3-丙酮酸。
实验概述
11个编码转氨酶的基因克隆入大肠杆菌中。这些基因是枯草芽孢杆菌D-丙氨酸转氨酶(dat，Genbank登录号Y14082.1bp 28622-29470和Genbank登录号NP 388848.1分别为核酸序列和氨基酸序列)、苜蓿根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)酪氨酸转氨酶(tatA，SEQ ID NOS：1和2分别为核酸序列和氨基酸序列)、类球红细菌菌株2.4.1酪氨酸转氨酶(tatA通过同源性确定，SEQ ID NOS：3和4分别为核酸序列和氨基酸序列)、类球细红菌35053酪氨酸转氨酶(通过同源性确定，SEQ ID NOS：5和6，分别为核酸序列和氨基酸序列)硕大利什曼原虫广底物转氨酶(bsat，通过与来自墨西哥利什曼原虫(L.mexicana)的肽片段的同源性确定，SEQ ID NO：7和8分别为核酸序列和氨基酸序列)、枯草芽孢杆菌芳族转氨酶(araT，通过同源性确定，SEQ ID NOS：9和10分别为核酸序列和氨基酸序列)、食淀粉乳杆菌芳族转氨酶(araT，通过同源性确定，SEQ ID NOS：11和12，分别为核酸序列和氨基酸序列)、类球红细菌35053多底物转氨酶(通过同源性确定，SEQ ID NOS：13和14分别为核酸序列和氨基酸序列)、类球红细菌菌株2.4.1多底物转氨酶(msa，通过同源性确定，Genbank登录号AAAE01000093.1，bp 14743-16155和Genbank登录号ZP00005082.1分别为核酸序列和氨基酸序列)、大肠杆菌天冬氨酸转氨酶(aspC，Genbank登录号AE000195.1 bp2755-1565和Genbank登录号AAC74014.1分别为核酸序列和氨基酸序列)和大肠杆菌酪氨酸转氨酶(tyrB，SEQ ID NOS：31和32分别为核酸序列和氨基酸序列)。克隆、表达了基因并测试它在色氨酸转化成吲哚-3-丙酮酸中的活性，与可商业购买的酶一起。所有11个克隆有活性。
鉴定可包含具有所需活性的多肽的细菌菌株
NCBI(全国生物技术信息中心)数据库中没有基因命名为色氨酸转氨酶。然而，鉴定了有此酶活性的生物体。在细胞提取物或从纯化蛋白中测量到L-色氨酸转氨酶(TAT)活性，来源如下：羊茅(Festuca octoflora)的根瘤菌分离物、豌豆线粒体和细胞溶质、向日葵冠瘿细胞、豌豆根瘤菌三叶草生物变种(R.leguminosarum biovar trifoli)、草生欧文氏菌石头花致病变种(E.herbicola pv.gypsophilae)、丁香假单胞菌萨氏致病变种(P.syringae pv.savastanio)、根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)、生脂固氮螺菌(Azospirillum lipferum)、巴西固氮螺菌(A.brasilense)、阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)、团聚肠杆菌(Enterobacter agglomerans)、埃氏慢生根瘤菌(Bradyrhizobiumelkanii)、麦芽念珠菌(C.maltosa)、棕色固氮菌(A.vinelandii)、大鼠脑、大鼠肝、苜蓿根瘤菌、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)CHA0、乳酸乳球菌(L.Lactis)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、瑞士乳杆菌(L.Helveticus)、小麦苗、大麦、金色菜豆(Phaseolus aureus)(绿豆)、葡萄状酵母(卡尔斯伯根糖酵母)、利什曼原虫属、玉米、番茄茎、豌豆植物、烟草、猪、生孢梭菌(C.Sporogenes)和灰色链霉菌(Streptomycesgriseus)。
                              实施例2
吲哚-3-乳酸转化成吲哚-3-丙酮酸
如图1和3所示，吲哚-3-乳酸能用于生成吲哚-3-丙酮酸。乳酸和丙酮酸间的转化是可逆反应，正如吲哚-3-丙酮酸和吲哚-3-乳酸间的转化也是这样。由于在340nm来自吲哚-3-丙酮酸的高背景量，通常可跟踪吲哚-乳酸的氧化。
0.1mL标准测定混合物含有100mM磷酸钾，pH8.0、0.3mM NAD+、7单位乳酸脱氢酶(LDH)(Sigma-L2395，St.Louis，MO)和2mM底物。测定在UV-透明微量滴定板中进行2次，使用Molecular Devices SpectraMax Plus板阅读器。混合多肽和缓冲液并移吸到含吲哚-3-乳酸和NAD+的孔中，短暂混合后，各孔在340nm的吸光度以9秒间隔阅读。反应在25℃保持5分钟。从NAD+生成NADH后，在340nm的吸光度增加。进行单独的负对照，没有NAD+且没有底物。来自肠膜明串珠菌(L.Mesenteroides)的D-LDH(Sigma目录号L2395)似乎显示与吲哚衍生物底物的活性大于来自嗜热脂肪芽孢杆菌(Baccilus stearothermophilus)的L-LDH(Sigma目录号L5275)。
类似方法使用D-乳酸和NAD+或NADH和丙酮酸、D-LDH多肽的天然底物。丙酮酸还原的Vmax比乳酸氧化的Vmax高100-1000倍。吲哚-3-乳酸与D-LDH氧化反应的Vmax约为乳酸的五分之一。也通过跟踪在327的吸光度变化(烯醇-硼酸盐衍生物)测量吲哚-3-丙酮酸的存在，使用含0.5mM EDTA和0.5mM砷酸钠的50mM硼酸钠缓冲液。与用于L和D-LDH多肽的负对照相比，观察到小但可重复的吸光度变化。
此外，可克隆广特异性乳酸脱氢酶(酶活性与EC 1.1.1.27、EC 1.1.1.28和/或EC1.1.2.3相关)并用于从吲哚-3-乳酸产生吲哚-3-丙酮酸。广特异性脱氢酶的来源包括大肠杆菌、淋病奈瑟氏球菌和植物乳杆菌(L.plantarum)。
另外，生成吲哚-3-丙酮酸可通过吲哚-3-乳酸接触来自生孢梭菌(C.sporogenes)的细胞提取物，提取物包含吲哚乳酸脱氢酶(EC 1.1.1.110)；或接触克氏表鞭毛型锥虫(Trypanosoma cruzi epimastigotes)细胞提取物，提取物含有已知对吲哚-3-丙酮酸有活性的p-羟苯基乳酸脱氢酶(EC 1.1.1.222)；或食酸假单胞菌(P.Acidovorans)或大肠杆菌细胞提取物，提取物含有咪唑-5-基乳酸脱氢酶(EC 1.1.1.111)；或锦紫苏(Coleusblumei)，它含有羟苯基丙酮酸还原酶(EC 1.1.1.237)；或麦芽念珠菌，它含有D-芳族乳酸脱氢酶(EC 1.1.1.222)。描述这种活性的参考文献包括Nowicki等(FEBS MicrobiolLetters，71：119-24，1992)、Jean和DeMoss(Canadian J.Microbiol.14 1968、Coote和Hassall(Biochem.J.111：237-9，1969)、Cortese等(C.R.Seances Soc.Biol.Fil.162 390-5，1968)、Petersen和Alfermann(Z.Naturforsch.C：Biosci.43 501-4，1988)和Bhatnagar等(J.Gen Microbiol 135：353-60，1989)。此外，乳酸氧化酶如来自假单胞菌属(Pseudomonas)的酶(Gu等J.Mol.Catalysis B：Enzymatic：18：299-305，2002)可用于将吲哚-3-乳酸氧化成吲哚-3-丙酮酸。
                             实施例3
用L-氨基酸氧化酶将L-色氨酸转化成吲哚-3-丙酮酸
该实施例描述的方法用于经氧化酶(EC 1.4.3.2)将L-色氨酸转化成吲哚-3-丙酮酸，作为实施例1所述使用色氨酸转氨酶的另一种选择。L-氨基酸氧化酶纯化自南美响尾蛇(Crotalus durissus)(Sigma，St.Louis，MO，目录号A-2805)。用于分子克隆的L-氨基酸氧化酶的登录号包括：CAD21325.1、AAL14831、NP 490275、BAB78253、A38314、CAB71136、JE0266、T08202、S48644、CAC00499、P56742、P81383、O93364、P81382、P81375、S62692、P23623、AAD45200、AAC32267、CAA88452、AP003600和Z48565。
反应在微离心管中进行，总体积1mL，37℃振荡孵育10分钟。反应混合物含有5mM L-色氨酸、100mM磷酸钠缓冲液pH6.6、0.5mM砷酸钠、0.5mM EDTA、25mM四硼酸钠、0.016mg过氧化氢酶(83U，Sigma C-3515)、0.008mg FAD(Sigma)和0.005-0.125单位的L-氨基酸氧化酶。负对照含有色氨酸之外的所有成分，空白含有氧化酶之外的所有成分。过氧化氢酶用于去除在氧化脱氨期间形成的过氧化氢。四硼酸钠和砷酸钠用于稳定吲哚-3-丙酮酸的烯醇-硼酸盐形式，它在327nm显示最大吸光度。在反应混合物中制备0.1-1mM浓度的吲哚-3-丙酮酸标准。
购得的L-氨基酸氧化酶具有每分钟每毫克蛋白形成的比活540μg吲哚-3-丙酮酸。这与色氨酸转氨酶的比活是相同的数量级。
                               实施例4
用醛缩酶将吲哚-3-丙酮酸转化成2-羟基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸
该实施例描述的方法可用于将吲哚-3-丙酮酸转化成MP，使用醛缩酶(裂合酶)(图2)。醛醇缩合是形成碳-碳键的反应，键在一种醛的β-碳或酮与另一种醛或酮的羰基碳间。在一个底物的羰基相邻碳上形成碳负离子，并用作亲核体攻击第2个底物的羰基碳(亲电碳)。最通常地，亲电底物是醛，因此大部分醛缩酶属于EC 4.1.2.-类别。亲核底物通常是丙酮酸。醛缩酶不常催化2个酮酸或2个醛间的缩合。
然而，鉴定了催化2个羧酸缩合的醛缩酶。例如，EP 1045-029描述从乙醛酸和丙酮酸生成L-4-羟基-2-酮戊二酸，使用假单胞菌培养物(EC 4.1.3.16)。此外，4-羟基-4-甲基-2-氧戊二酸醛缩酶(4-羟基-4-甲基-2-氧戊二酸丙酮酸裂合酶，EC 4.1.3.17)能催化2个酮酸的缩合。因此，类似的醛缩酶多肽用于催化吲哚-3-丙酮酸与丙酮酸的缩合。
克隆
4-羟基-4-甲基-2-氧戊二酸丙酮酸裂合酶(ProA醛缩酶，EC 4.1.3.17)和4-羟基-2-氧戊二酸乙醛酸裂合酶(KHG醛缩酶，EC 4.1.3.16)催化反应很类似图2的醛缩酶反应。设计引物的突出端与pET30Xa/LIC载体(Novagen，Madison，WI)相容。
proA基因产物的活性结果
当用IPTG诱导时，睾丸酮丛毛单胞菌proA和苜蓿根瘤菌SMc00502基因构建物有高水平表达。重组蛋白是高度可溶的，如通过SDS-PAGE分析总蛋白和细胞提取物样品所确定。睾丸酮丛毛单胞菌茎因产物纯化至＞95％纯度。由于用His-结合柱体亲和纯化后苜蓿根瘤菌基因产物的产量很低，细胞提取物用于酶测定。
两种重组醛缩酶都催化从吲哚-3-丙酮酸和丙酮酸形成MP。酶活性需要二价镁和磷酸钾的存在。当缺乏吲哚-3-丙酮酸、丙酮酸或磷酸钾时，没有明显产物。缺乏酶时也形成少量产物(当酶存在时通常不到1个量数量级)。
从反相C18柱洗脱的产物峰稍迟于吲哚-3-丙酮酸标准，此峰的质谱显示292.1的碰撞诱导母离子([M+H]+)，母离子预期产物MP。质谱中存在的主要子片段包括具有m/z＝158(1H-吲哚-3-碳醛正碳离子)、168(3-丁-1，3-二烯基-1H-吲哚-正碳离子)、274(292-H2O)、256(292-2H2O)、238(292-3H2O)、228(292-CH4O3)和204(失去丙酮酸)的子片段。产物也表现出其它含吲哚的化合物的UV光谱特征，如色氨酸，λmax为279-280且有约290nm的小肩。
随着反应温度从室温增加到37℃、底物量和镁量的增加，睾丸酮丛毛单胞菌醛缩酶法生成的MP量提高。酶的合成活性随着pH增加而减少，在pH7观察到最多产物。在色氨酸标准基础上，用20μg纯化的蛋白在标准测定下生成的MP量约为10-40μg/mL反应。
由于苜蓿根瘤菌和睾丸酮丛毛单胞菌ProA醛缩酶编码序列与上述其它基因的高度同源性，预期所有重组基因产物能催化此反应。此外，预期有类似活性的醛缩酶在59位和87位有苏氨酸(T)，在119位有精氨酸(R)，在120位有天冬氨酸(D)，在31位和71位有组氨酸(H)的醛缩酶(以睾丸酮丛毛单胞菌的编号系统为基础)。
khg基因产物的活性结果
当用IPTG诱导时，枯草芽孢杆菌和大肠杆菌khg基因构建物有高水平表达，而苜蓿根瘤菌khg的表达水平较低。重组蛋白高度可溶的，如通过SDS-PAGE分析总蛋白和细胞提取物样品判断。枯草芽孢杆菌和大肠杆菌khg基因产物纯化到＞95％纯度；用His-结合柱体亲和纯化后，苜蓿根瘤菌基因产物的产量不高。
没有迹象证明此酶活性需要镁和磷酸盐。然而，文献报导在磷酸钠缓冲液中进行测定，报导的酶是双功能并对磷酸化底物如2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡糖酸(KDPG)有活性。酶测定如上所述进行，在一些情况中省略磷酸盐。结果表明重组KHG醛缩酶法产生MP，但活性不如ProA醛缩酶。在一些情况中，KHG产生的MP水平几乎与镁和磷酸盐单独产生的量相同。磷酸盐似乎不增加KHG活性。杆菌酶活性最高，比单独镁和磷酸盐的活性约高20-25％，如SRM所确定(见实施例10)。根瘤菌酶活性量最低，这可能与表达中注意到的折叠和溶解度问题相关。所有3种酶有活性位点谷氨酸(枯草芽孢杆菌编号系统中的43位)以及与丙酮酸形成Shiff碱基所需的赖氨酸(130位)；然而，枯草芽孢杆菌酶在47位含有活性位点残基苏氨酸，而不是精氨酸。枯草芽孢杆菌KHG较小且似乎在簇中不同于苜蓿根瘤菌和大肠杆菌酶，其它酶有活性位点苏氨酸。活性位点的差异可能是枯草芽孢杆菌酶活性增加的原因。
改进醛缩酶活性
催化抗体可与天然醛缩酶一样有效，接受广范围的底物，并能用于催化图2所示反应。
也能通过定向进化改进醛缩酶，例如上述用于KDPG醛缩酶的例子(与上述KHG高度同源)，KDPG醛缩酶通过DNA改组和易错PCR逐步形成以去除对磷酸盐的需求和反转对映选择性。KDPG醛缩酶多肽用于生化反应，因为它们高度特异于供体底物(本文是丙酮酸)，但对于受体底物(即吲哚-3-丙酮酸)相对灵活(Koeller和Wong，Nature 409：232-9，2001)。KHG醛缩酶有缩合丙酮酸与一些羧酸的活性。认为KHG醛缩酶的哺乳动物形式的特异性比细菌形式更广，包括对4-羟基-4-甲基-2-氧戊二酸活性较高和接受4-羟基-2-酮戊二酸的2种立体异构体。细菌来源似乎对R异构体有10倍的优先性。基因组数据库中存在将近100个KHG同系物，在假单胞菌、副球菌、普罗威登斯菌、根瘤菌、摩根氏菌、大肠杆菌和哺乳动物组织中证明活性。这些酶能用作修改对映特异性的起始点，莫纳甜生成需要对映特异性。
利用丙酮酸和另一底物的醛缩酶能“进化”以修改多肽特异性、速度和选择性，另一底物是酮酸和/或有大的疏水基团像吲哚。除了本文证明的KHG和ProA醛缩酶之外，这些酶的例子包括但不限于：KDPG醛缩酶和相关多肽(KDPH)；来自类诺卡氏菌属(Nocardioides sp)的转羧基亚苄基丙酮酸水合酶-醛缩酶；4-(2-羧苯基)-2-氧丁-3-烯醇盐醛缩酶(2’-羧基亚苄基丙酮酸醛缩酶)，它缩合丙酮酸与2-羧基苯甲醛(一种含芳环的底物)；来自恶臭假单胞菌(P.Putida)和食芳香物鞘氨醇单胞菌(Sphingomonasaromaticivorans)的反式-O-羟基苯亚甲基丙酮酸水合酶-醛缩酶，它也利用丙酮酸和含芳族的醛作为底物；3-羟基天冬氨酸醛缩酶(赤-3-羟基-L-天冬氨酸乙醛酸裂合酶)，它使用2-含氧酸作为底物且认为在生物体脱氮微球菌(Micrococcus denitrificans)中；苯偶姻醛缩酶(苯甲醛裂合酶)，它利用含苄基的底物；二氢新蝶呤醛缩酶；L-苏-3-苯基丝氨酸苯甲醛-裂合酶(苯基丝氨酸醛缩酶)，它缩合甘氨酸与苯甲醛；4-羟基-2-氧戊酸醛缩酶；1，2-二羟基苄基丙酮酸醛缩酶和2-羟基亚苄基丙酮酸醛缩酶。
通过筛选感兴趣的克隆可选择有所需活性的多肽，使用下列方法。色氨酸营养缺陷型用表达盒上携带感兴趣克隆的载体转化且生长于含少量莫纳甜或MP的培养基。由于转氨酶和醛缩酶反应是可逆的，细胞能从莫纳甜的外消旋混合物生成色氨酸。类似地，通过利用MP或莫纳甜作为碳源和能源的能力可筛选生物体(重组和野生型)。靶醛缩酶的一个来源是多种假单胞菌和根瘤菌菌株的表达文库。假单胞菌有许多不寻常的分解代谢途径用于降解芳族分子，它们也含有许多醛缩酶；而根瘤菌含有醛缩酶，已知在植物根际中生长，有许多描述用于构建莫纳甜生物合成途径的基因。
                             实施例5
化学合成莫纳甜前体
实施例4描述的方法使用醛缩酶将吲哚-3-丙酮酸转化成MP。该实施例描述另一种化学合成MP的方法。MP用典型的醛醇类型缩合形成(图4)。简言之，典型的醛醇类型反应包括用强碱基产生丙酮酸酯的碳负离子，如LDA(二异丙基酰胺锂)、六甲基二硅氮烷锂或丁基锂。产生的碳负离子与吲哚-丙酮酸反应以形成偶联产物。
可用于保护吲哚氮的保护基团包括但不限于：t-丁氧基羰基(Boc)和苄氧基羰基(Cbz)。羧酸的阻断基团包括但不限于烷基酯(例如甲基、乙基、苄基酯)。当使用这些保护基团时，不可能控制所形成产物的立体化学。然而，如果R2和/或R3是手性保护基团(图4)如(S)-2-丁醇、薄荷醇或手性胺，可使一种MP对映异构体的形成优于另一种。
                               实施例6
色氨酸或吲哚-3-丙酮酸转化成莫纳甜
体外方法使用转氨酶和醛缩酶2种酶，从色氨酸和丙酮酸生成莫纳甜。在第1个步骤中，α-酮戊二酸是转氨反应中来自色氨酸氨基的受体，反应产生吲哚-3-丙酮酸和谷氨酸。醛缩酶催化第2个反应，其中丙酮酸在Mg2+和磷酸盐存在时与吲哚-3-丙酮酸反应，产生莫纳甜(MP)2-羟基-2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸的α-酮衍生物。转移第1个反应中形成的谷氨酸的氨基生成所需产物莫纳甜。纯化和表征产物确定形成的异构体是S，S-莫纳甜。描述另外的底物、酶和条件以及对此方法进行的改进。
酶
克隆、表达和纯化来自睾丸酮丛毛单胞菌的醛缩酶、4-羟基-4-甲基-2-氧戊二酸丙酮酸裂合酶(ProA醛缩酶，proA基因)(EC 4.1.3.17)，如实施例4所述。克隆、表达和纯化来自枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和苜蓿根瘤菌的4-羟基-2-氧戊二酸乙醛酸裂合酶(KHG醛缩酶)(EC 4.1.3.16)，如实施例4所述。
用于结合醛缩酶以生成莫纳甜的转氨酶是大肠杆菌aspC基因编码的L-天冬氨酸转氨酶、大肠杆菌tyrB基因编码的酪氨酸转氨酶、苜蓿根瘤菌TatA酶、硕大利什曼原虫bsat基因编码的广底物转氨酶或来自猪心的谷氨酸-草酰乙酸转氨酶(IIa型)。实施例1描述非哺乳动物蛋白的克隆、表达和纯化。来自猪心的谷氨酸-草酰乙酸转氨酶(IIa型)获得自Sigma(#G7005)。
使用ProA醛缩酶和L-天冬氨酸转氨酶的方法
1升反应混合物中含有50mM醋酸铵，pH8.0、0.4mM MgCl2、3mM磷酸钾、0.05mM吡哆醛磷酸、100mM丙酮酸铵、50mM色氨酸、10mM α-酮戊二酸、160mg重组睾丸酮丛毛单胞菌ProA醛缩酶(未纯化细胞提取物，～30％醛缩酶)、233mg重组大肠杆菌L-天冬氨酸转氨酶(未纯化细胞提取物，～40％醛缩酶)。除了酶，所有成分混合一起并在30℃孵育直到色氨酸溶解。随后加入酶，反应溶液30℃孵育并温和振荡(100rpm)3.5小时。酶加入后0.5和1小时，固体色氨酸等分样品(各50微摩尔)加入反应。所有加入的色氨酸不溶解，但浓度维持于50mM或更高。3.5小时后，滤去固体色氨酸。使用确定的色氨酸量作为标准通过LC/MS分析反应混合物显示溶液中的色氨酸浓度为60.5mM且莫纳甜浓度为5.81mM(1.05g)。
下列方法用于纯化终产物。90％的清溶液应用于BioRad AG50W-X8树脂柱(225mL；结合力为1.7meq/mL)。柱用水洗，收集300mL部分，直到280nm的吸光度＜5％首先流过部分的。然后柱用1M醋酸铵，pH8.4洗脱，收集4个300-mL部分。所有4个部分含有莫纳甜并用旋转蒸发器蒸发到105mL，蒸发器装有温水浴。随着体积减小形成沉淀且在蒸发过程中滤去。
通过LC/MS分析柱部分显示99％色氨酸和莫纳甜结合柱。蒸发过程中形成的沉淀含有＞97％色氨酸和＜2％莫纳甜。上清中色氨酸与产物的比例约为2∶1。
上清(7ml)应用于100mL快流DEAE琼脂糖(Amersham Biosciences)柱，柱以前通过0.5L 1M NaOH、0.2L水、1.0L 1.0M醋酸铵，pH8.4和0.5L水洗转化成醋酸盐形式。上清以＜2mL/分钟上样，柱用3-4mL/分钟的水洗直到280nm的吸光度～0。莫纳甜用100mM醋酸铵，pH8.4洗脱，收集4个100-mL部分。
部分的分析显示流过部分的色氨酸与莫纳甜比例为85∶15且洗脱部分的比例为7∶93。假定莫纳甜在280nm的消光系数与色氨酸相同，洗脱部分含有0.146微摩尔产物。对于68％的回收，推断总共1L的反应会生成约2.4微摩尔(约710mg)莫纳甜。
来自DEAE琼脂糖柱的洗脱部分蒸发到＜20mL。通过应用到C8制备性反相柱进一步纯化等分产物，所用色谱条件与实施例10所述用于分析-规模莫纳甜特征的条件相同。Waters FractionlynxTM软件用于在检测m/z＝293离子基础上触发自动分部收集莫纳甜。收集来自莫纳甜的相应质子化分子离子的C8柱的部分，蒸发到干燥，随后溶于小体积水。此部分用于产物的表征。
所得产物用下列方法确定特征。
UV/可见光谱学.UV/可见光谱测量酶法生成的莫纳甜用Cary 100 Bio UV/可见光分光光度计完成。溶于水的纯化产物显示280nm的最大吸收，肩部在288nm，是含吲哚的化合物的典型特征。
LC/MS分析.用于莫纳甜的混合物分析如实施例10所述完成，莫纳甜获得自体外生化反应。图5描述体外酶合成混合物中莫纳甜的典型LC/MS分析。图5的下面一组阐明莫纳甜的质子化分子离子在m/z＝293的所选离子色谱。混合物中的此莫纳甜鉴定通过图6所述质谱确证。LC/MS分析纯化产物显示293的分子离子单峰和280nm的吸光度。质谱与图6所示相同。
MS/MS分析.如实施例10所述，也对莫纳甜进行LC/MS/MS子离子实验。图7阐述莫纳甜的子离子质谱。试验性结构分配图7中标记的所有片段离子。这些包括m/z＝275(293-H2O)、257(293-(2xH2O))、230(275-COOH)、212(257-COOH)、168(3-丁-1，3-二烯基-1H-吲哚-正碳离子)、158(1H-吲哚-3-碳醛正碳离子)、144(3-乙基-1H-吲哚-正碳离子)、130(3-亚甲基-1H-吲哚-正碳离子)和118(吲哚正碳离子)的片段离子。预料的那样，如果获得自分子的吲哚部分，许多这些情况与MP获得的(实施例4)相同。由于存在氨基而不是酮，一些比MP所见高1个质量单位。
莫纳甜的精确质量测量.图8阐明获得的纯化莫纳甜的质谱，使用AppliedBiosystems-Perkin Elmer Q-Star杂合四极/飞行时间质谱仪。使用色氨酸作为内部质量校准标准，质子化莫纳甜的测量质量是293.1144。在C14H17N2O5元素组成的基础上，质子化莫纳甜的计算质量是293.1137。此质量测量误差小于每百万分二(2ppm)，提供酶法生成莫纳甜的元素组成的确证。
NMR光谱学.NMR实验在Varian Inova 500MHz仪器上进行。莫纳甜样品(～3mg)溶于0.5ml D2O。溶剂(D2O)起初用作4.78ppm的内部参考。由于水的峰大，运行1H-NMR抑制水峰。随后，由于水峰的广度，莫纳甜的C-2质子用作参考峰，设在7.192ppm的发表值。
对于13C-NMR，几百次扫描的初始运行表明样品太稀释不能在规定时间获得适当13C谱。因此，进行异核多级量子相干(HMQC)实验，它能使其附着的氢和碳相关，也提供碳化学位移的信息。
表2和3显示1H和HMQC数据的概括。通过与发表值比较，NMR数据表明酶法生成的莫纳甜是(S，S)、(R，R)或两者的混合物。
手性LC/MS分析.为确定体外生成的莫纳甜是一种异构体而不是(R，R)和(S，S)对映异构体的混合物，手性LC/MS分析用实施例10所述仪器完成。
手性LC分离用Chirobiotic T(高级分离技术)手性色谱柱在室温进行。在供应商发表的方案基础上，最优化色氨酸的R-(D)和S-(L)异构体的分离和检测。LC流动相包括A)含0.05％(v/v)三氟醋酸的水；B)含0.05％(v/v)三氟醋酸的甲醇。洗脱在70％A和30％b为等度。流速为1.0mL/分钟，从200nm到400nm监控PDA吸光度。用于手性LC/MS分析色氨酸和莫纳甜的仪器参数与实施例10所述用于LC/MS分析的相同。收集使用m/z150-400区的质谱。质子化分子离子的所选离子色谱(用于R-和S-色氨酸的[M+H]+＝205且用于莫纳甜的[M+H]+＝293)，可直接鉴定混合物中的这些分析物。
图9显示R-和S-色氨酸和莫纳甜的色谱，它们由手性色谱分离并通过MS监控。莫纳甜色谱中的单峰表明该化合物是一种异构体，保留时间几乎与S-色氨酸相同。
                                      表2
                                   1H-NMR数据
Figure A20048002224900391
  Cargill   Veleggaar等1   Takeshi等2
  原子   δH   J(HH)Hz   δH   J(HH)Hz   δH   J(HH)Hz
  2   7.192(1H，s)   7.192(s)   7.18(s)
  4   7.671(d)   7.99   7.686(d)   7.9   7.67(d)   8.0
  5   7.104(dd)   7.99   7.102(dd)   8.0，8.0   7.11(dd)   7.5，7.5
  6   7.178(dd)   *   7.176(dd)   8.0，8.0   7.17(dd)   7.5，7.5
  7   7.439(d)   7.99   7.439(d)   8.1   7.43(d)   8.0
  10a   3.242(d)   14.5   3.243(d)   14.3   3.24(d)   14.5
  10b   3.033(d)   14.5   3.051(d)   14.3   3.05(d)   14.5
  12   2.626(dd)2.015(dd)   15.5，1.515.0，12.0   2.651(dd)2.006(dd)   15.3，1.715.3，11.7   2.62(dd)2.01(dd)   15.5，1.815.5，12.0
  13   3.571(dd)   10.75*，1.5   3.168(dd)   11.6，1.8   3.57(dd)   12.0，1.8
1Veleggaar等(J.C.S.Perkin Trans.1：3095-8，1992).
2Takeshi和Shusuke(JP2002060382，2002-02-26).
              表3
     13C-NMR数据(来自HMQC谱)
  Cargill   Veleggaar等1
  原子   δC   δC
  2   126.1   126.03
  3   *   110.31
  4   120.4   120.46
  5   120.2   120.25
  6   122.8   122.74
  7   112.8   112.79
  8   *   137.06
  9   *   129.23
  10a   36.4   36.53
  12   39.5   39.31
  13   54.9   54.89
  14   *   175.30
  15   *   181.18
1Veleggaar等(J.C.S.Perkin Trans.1：3095-8，1992).
旋光测定.在Rudolph Autopol III旋光仪上测量旋光性。莫纳甜制备为14.6mg/mL的水溶液。对于1g/mL水溶液，S，S莫纳甜(盐形式)的预期比旋光([α]D 20)是-49.6(Veleggaar等)。观察到纯化、酶法生成莫纳甜的[α]D 20为-28.1，表明它是S，S异构体。
改进
最优化包括试剂和酶浓度的反应条件，5-10mg/mL的产量用下列试剂混合物产生：50mM醋酸铵，pH8.3、2mM MgCl2、200mM丙酮酸(钠或铵盐)、5mM α-酮戊二酸(钠盐)、0.05mM吡哆醛磷酸、在酶加入后达到1mL终体积的脱气水、3mM磷酸钾、50μg/mL重组ProA醛缩酶(细胞提取物；总蛋白浓度为167μg/mL)、1000μg/mL大肠杆菌aspC基因编码的L-天冬氨酸转氨酶(细胞提取物；总蛋白浓度为2500μg/mL)和使浓度＞60mM的固体色氨酸(饱和；一些在整个反应中未溶解)。混合物在30℃孵育4小时并温和搅拌或混合。
取代
α-酮戊二酸的浓度可减少到1mM并补充9mM天冬氨酸，莫纳甜的产量相等。另外的氨基酸受体可用于第1个步骤，如草酰乙酸。
当重组硕大利什曼原虫广底物转氨酶用于取代大肠杆菌L-天冬氨酸转氨酶时，获得类似的莫纳甜产量。然而，分子量为292的第2种未鉴定产物(主要产物的3-10％)也通过LC-MS分析检测。当大肠杆菌tyrB编码的酶、苜蓿根瘤菌tatA编码的酶或来自猪心的谷氨酸-草酰乙酸转氨酶(IIa型)作为转氨酶加入时，产生0.1-0.5mg/mL的莫纳甜浓度。当反应从吲哚-3-丙酮酸开始时，还原性胺化可用于最后步骤，此步有谷氨酸脱氢酶和NADH(如实施例7)。
来自枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和苜蓿根瘤菌的KHG醛缩酶也与大肠杆菌L-天冬氨酸转氨酶一起使用以酶法生成莫纳甜。使用下列反应条件：50mM NH4-OAc pH8.3、2mM MgCl2、200mM丙酮酸、5mM谷氨酸、0.05mM吡哆醛磷酸、在酶加入后达到0.5mL终体积的脱气水、3mM磷酸钾、20μg/mL重组枯草芽孢杆菌KHG醛缩酶(纯化的)、大约400μg/mL来自细胞提取物的未纯化大肠杆菌L-天冬氨酸转氨酶(AspC)和12mM吲哚-3-丙酮酸。反应在30℃振荡孵育30分钟。用枯草芽孢杆菌酶法生成的莫纳甜量为80ng/mL，随着醛缩酶量增加而提高。如果用饱和量的色氨酸和5mMα-酮戊二酸取代吲哚-3-丙酮酸和谷氨酸，莫纳甜产量增加到360ng/mL。重复反应用50mM Tris pH8.3中的3种30μg/mL KHG酶和饱和量的色氨酸，进行1小时以增加检测。如实施例4，杆菌酶活性最高，产生约4000ng/mL莫纳甜。大肠杆菌KHG产生3000ng/mL莫纳甜，苜蓿根瘤菌酶产生2300ng/mL。
                          实施例7
MP和莫纳甜间的相互转化
MP的胺化以形成莫纳甜可通过转氨酶催化如实施例1和6鉴定的酶，或通过需要还原辅因子如NADH或NADPH的脱氢酶。这些反应是可逆的且能以任何一个方向测量。当使用脱氢酶时，方向性主要通过铵盐的浓度控制。
脱氢酶活性.随着NAD(P)+转化成更发色的NAD(P)H，通过跟踪340nm吸光度增加来监控莫纳甜的氧化脱氨。如实施例6所述酶法生成和纯化莫纳甜。
典型的0.2mL测定混合物中含有含50mM Tris-HCl，pH8.0到8.9、0.33mM NAD+或NADP+、2到22单位的谷氨酸脱氢酶(Sigma)和10-15mM底物。测定在UV-透明微量滴定板中进行2次，用Molecular Devices SpectraMax Plus板阅读器。酶、缓冲液和NAD(P)+的混合物移吸入含底物的孔，短暂混合后，以10秒间隔监控340nm的吸光度增加。反应在25℃孵育10分钟。负对照不加入底物完成，谷氨酸用作正对照。来自牛肝的III型谷氨酸脱氢酶(Sigma#G-7882)催化莫纳甜转化为莫纳甜前体，转化率约为谷氨酸转化为α-酮戊二酸的百分之一。
转氨活性.用来自大肠杆菌的L-天冬氨酸转氨酶(AspC)、来自大肠杆菌的酪氨酸转氨酶(TyrB)、来自硕大利什曼原虫的广底物转氨酶(BSAT)和2个实施例1所述可商业购买的猪谷氨酸-草酰乙酸转氨酶进行莫纳甜转氨酶测定。草酰乙酸和α-酮戊二酸作为氨基受体测试。测定混合物含有(0.5mL中)50mM Tris-HCl，pH8.0、0.05mM PLP、5mM氨基受体、5mM莫纳甜和25μg转氨酶。测定在30℃孵育30分钟，通过加入0.5mL异丙醇终止反应。莫纳甜损失通过LC/MS监控(实施例10)。注意到以草酰乙酸作为氨基受体的硕大利什曼原虫BSAT活性量最高，接着是以α-酮戊二酸作为氨基受体的相同酶。草酰乙酸的相对活性是：BSAT＞AspC＞猪IIa型＞猪I型＝TyrB。α-酮戊二酸的相对活性是：BSAT＞AspC＞猪I型＞猪IIa型＞TyrB。
                           实施例8
从色氨酸和除了丙酮酸的C3来源生成莫纳甜
如上面实施例6所述，吲哚-3-丙酮酸或色氨酸能转化成莫纳甜，使用丙酮酸作为C3分子。然而，在一些情况中，丙酮酸可能不是理想的原料。例如，丙酮酸可能比其它C3碳源昂贵，或如果加入培养基对发酵有不利影响。丙氨酸可通过许多PLP-酶转氨以产生丙酮酸。
色氨酸酶样酶进行β-消除反应的速度快于其它PLP酶如转氨酶。来自此类别(4.1.99.-)的酶能从氨基酸产生氨和丙酮酸，氨基酸如L-丝氨酸、L-半胱氨酸、有良好离去基团的丝氨酸和半胱氨酸的衍生物例如O-甲基-L-丝氨酸、O-苄基-L-丝氨酸、S-甲基半胱氨酸、S-苄基半胱氨酸、S-烷基-L-半胱氨酸、O-酰基-L-丝氨酸和3-氯-L-丙氨酸。
用EC 4.1.99.-多肽生成莫纳甜的方法可通过突变β-酪氨酸酶(TPL)或色氨酸酶改进，根据Mouratou等(J.Biol.Chem 274：1320-5，1999)的方法。Mouratou等描述将β-酪氨酸酶转化成二羧氨基酸β-裂合酶的能力，此裂合酶没有报导在自然界中产生。通过使缬氨酸(V)283转化成精氨酸(R)和精氨酸(R)100变成苏氨酸(T)来完成特异性变化。这些氨基酸变化使裂合酶接受二羧氨基酸用于水解脱氨反应(如天冬氨酸)。因此，天冬氨酸也能用作丙氨酸的来源用于随后的醛醇缩合反应。
另外，能提供乳酸和将乳酸转化成丙酮酸的酶的细胞或酶反应器。能催化此反应的酶的例子包括乳酸脱氢酶和乳酸氧化酶。
反应混合物包括50mM Tris-Cl pH8.3、2mM MgCl2、200mM C3碳源、5mM α-酮戊二酸、钠盐、0.05mM吡哆醛磷酸、在酶加入后达到0.5mL终体积的脱气水、3mM磷酸钾pH7.5、25μg如实施例4制备的粗重组睾丸酮丛毛单胞菌ProA醛缩酶、500μg如实施例1制备的粗L-天冬氨酸转氨酶(AspC)、使浓度＞60mM的固体色氨酸(饱和；一些在整个反应中未溶解)。反应混合物在30℃混合孵育30分钟。提供丝氨酸、丙氨酸和天冬氨酸作为3-碳源。用或不用二级PLP酶(纯化的)进行测定，PLP酶能进行β-消除反应和β-裂合酶反应(色氨酸酶(TNA)，双突变体色氨酸酶，β-酪氨酸酶(TPL))。结果示于表4：
                    表4
           用另外的C3-碳源产生莫纳甜
  C3-碳源   另外的PLP酶   相对活性
  无   无   0％
  丙酮酸   无   100％
  丝氨酸   无   3％
  丝氨酸   11μg野生型TNA(1U)   5.1％
  丝氨酸   80μg双突变体TNA   4.6％
  丙氨酸   无   32％
  丙氨酸   11μg野生型TNA   41.7％
  丙氨酸   80μg突变体TNA   43.9％
  天冬氨酸   110μg野生型TNA(1U)   7.7％
  天冬氨酸   5U野生型TPL(粗)   5.1％
  天冬氨酸   80μg突变体TNA   3.3％
从作为3-碳源的丙氨酸和丝氨酸产生的莫纳甜通过LC/MS/MS子扫描分析确认，与实施例6中产生的莫纳甜特征相同。丙氨酸是测试的最佳选择之一，通过AspC酶转氨。产生的莫纳甜量通过加入色氨酸酶而增加，色氨酸酶能作为二级活性转氨。通过加入色氨酸酶，用丝氨酸作为碳源产生的莫纳甜量几乎加倍，即使与转氨酶相比仅加入五分之一的色氨酸酶量。AspC可有一些单独的β-消除活性的量。天冬氨酸的结果表明色氨酸酶对天冬氨酸的活性不随着定点诱变增加，定点诱变与前面β-酪氨酸酶提示的相同。预期突变体β-酪氨酸酶具有产生莫纳甜的较高活性。
                            实施例9
化学合成莫纳甜
丙氨酸加入吲哚-3-丙酮酸生成莫纳甜，此反应能用Grignard或有机锂试剂合成进行。
例如，镁在无水条件下加入3-氯-3-溴-丙氨酸，3-氯-3-溴-丙氨酸在羧基和氨基被适当阻断。随后加入吲哚-3-丙酮酸(适当阻断)以形成偶联产物，接着去除保护基团以形成莫纳甜。特别有用的保护基团包括THP(四氢吡喃基醚)，它易附着和去除。
                             实施例10
检测色氨酸莫纳甜和MP
该实施例描述的方法用于检测莫纳甜或其前体2-羟基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸的存在。
LC/MS分析
用于体外或体内生化反应获得的莫纳甜、MP和/或色氨酸的混合物分析用Waters/Micromass液相色谱-串联质谱(LCMS/MS)仪器进行，包括Waters 2690液相色谱，装有Waters 996光电二极管阵列(PDA)吸光度监控器，串联置于色谱与Micromass Quattro Ultima三重四极质谱仪间。LC分离用Supelco Discovery C18反相色谱柱，2.1mm×150mm或Xterra MS C8反相色谱柱，2.1mm×250mm室温进行。LC流动相包括A)含0.05％(v/v)三氟醋酸的水和B)含0.05％(v/v)三氟醋酸的甲醇。
梯度洗脱是从5％B到35％B线性，0-9分钟，从35％B到90％B线性，9-16分钟，在90％B等度，16-120分钟，从90％B到5％B线性，20-22分钟，运行间有10分钟再平衡阶段。流速是0.25mL/分钟，从200nm到4000nm监控PDA吸光度。最优化所有ESI-MS参数且在产生感兴趣分析物的质子化分子离子([M+H]+)、生成特征性片段离子基础上选择。
下列仪器参数用于LC/MS分析莫纳甜：毛细管：3.5kV；圆锥：40V；Hex 1:20V；孔径：0V；Hex 2:0V；来源温度：100℃；去溶剂化温度：350℃；去溶剂化气体：500L/h；圆锥气体：50L/h；低质量分辨(Q1)：15.0；高质量分辨(Q1)：15.0；离子能量：0.2；进入：50V；碰撞能量：2；出口：50V；低质量分辨(Q2)：15；高质量分辨(Q2)：15；离子能量(Q2)：3.5；倍增器：650。报导的质量/电荷比(m/z)和分子量的不确定性为±0.01％。混合物中莫纳甜α-酮酸形式(MP)和莫纳甜的初始检测用LC/MS监控完成，收集m/z150-400区的质谱。质子化分子离子的所选离子色谱(用于MP的[M+H]+＝292，用于莫纳甜的[M+H]+＝293)可直接鉴定混合物中的这些分析物。
MS/MS分析
如下对莫纳甜进行LC/MS/MS子离子实验。子离子分析包括将感兴趣的母离子(如对于莫纳甜，m/z＝293)从第1个质量分析器(Q1)传送到质谱的碰撞细胞，其中导入氩并使母离子化学解离成片段(子)离子。随后用第2个质量分析器(Q2)检测这些片段离子，它们可用于确证母离子结构分配。
下列仪器参数用于LC/MS/MS分析莫纳甜：毛细管：3.5kV；圆锥：40V；Hex 1:20V；孔径：0V；Hex 2:0V；来源温度：100℃；去溶剂化温度：350℃；去溶剂化气体：500L/h；圆锥气体：50L/h；低质量分辨(Q1)：15.0；高质量分辨(Q1)：15.0；离子能量：0.2；进入：-5V；碰撞能量：14；出口：1V；低质量分辨(Q2)：15；高质量分辨(Q2)：15；离子能量(Q2)：3.5；倍增器：650。
高通量测定莫纳甜和色氨酸
高通量分析(＜5分钟/样品)莫纳甜和色氨酸的混合物用上述仪器完成，莫纳甜和色氨酸来源于体外和体内反应，参数与LC/MS/MS所述相同。LC分离用4.6mm×50mm Advanced Separation Technologies Chirobiotic T柱在室温进行。LC流动相为A)含0.25％乙酸的水；B)含0.25％乙酸的甲醇。用50％B等度洗脱0-5分钟。流速为0.6mL/min。ESI-MS/MS系统的所有参数被最优化，并基于色氨酸和内标2H5-色氨酸的质子化分子离子的最佳来源产生以及多反应监测(MRM)实验中碰撞诱导的氨基酸特异性片段离子的产生进行选择(表1)。下列仪器参数用于LC/MS/MS分析莫纳甜和色氨酸：毛细管：3.5kV；圆锥：20V；Hex 1:15V；孔径：1V；Hex 2:0V；来源温度：100℃；去溶剂化温度：350℃；去溶剂化气体：500L/h；圆锥气体：40L/h；低质量分辨(Q1)：12.0；高质量分辨(Q1)：12.0；离子能量：0.2；进入：-5V；碰撞能量：14；出口：1V；低质量分辨(Q2)：15；高质量分辨(Q2)：15；离子能量(Q2)：0.5；倍增器：650。MRM参数：信道间延迟：0.03s；中间扫描延迟：0.03s；停留：0.05s。
莫纳甜的精确质量测量
使用Applied Biosystems-Perkin Elmer Q-Star杂合四极/飞行时间质谱仪进行高分辨MS分子。使用色氨酸作为内部质量校准标准，测量质子化莫纳甜的质量。在C14H17N2O5元素组成的基础上，质子化莫纳甜的计算质量是293.1137。用实施例A描述的生物催化法制得的莫纳甜的测量质量为293.1144。此质量测量误差小于每百万分二(2ppm)，提供酶法生成莫纳甜的元素组成的确证。
                               实施例11
在细菌中产生莫纳甜
该实施例描述的方法用于在大肠杆菌细胞中产生莫纳甜。本领域技术人员理解类似方法可用于在其它细菌细胞中产生莫纳甜。此外，可使用含莫纳甜合成途径中其它基因(图2)的载体。
极限培养基Trp-1+葡萄糖培养基用于增加大肠杆菌细胞中的色氨酸产量(Zeman等，Folia Microbiol.35：200-4，1990)，此培养基如下制备。700mL纳米纯水中加入下列试剂：2g(NH4)2SO4、13.6g KH2PO4、0.2g MgSO4*7H2O、0.01g CaCl2*2H2O和0.5mgFeSO4*7H2O。pH调至7.0，体积增加到850mL，培养基高压灭菌。单独制备50％葡萄糖溶液并无菌过滤。40mL加入基础培养基(850mL)，终体积1L。
10g/L L-色氨酸溶液在0.1M磷酸钠pH7中制备并无菌过滤。通常加入十分之一体积到下面特定的培养物。也制备10％丙酮酸钠溶液并无菌过滤。每升培养物通常使用10mL等分样品。制备氨苄青霉素(100mg/mL)、卡那霉素(25mg/mL)和IPTG(840mM)贮存液，无菌过滤，使用前-20℃贮存。吐温20(聚氧乙烯20-单月桂酸山梨聚糖)以0.2％(体积/体积)终浓度使用。氨苄青霉素以非致死浓度使用，通常为1-10μg/mL终浓度。
大肠杆菌BL21(DE3)：睾丸酮丛毛单胞菌proA/pET30 Xa/LIC的新鲜平板(实施例4中描述)在含50μg/mL卡那霉素的LB培养基上制备。从单菌落中接种过夜培养物(5mL)且30℃生长于有卡那霉素的LB培养基。通常，1到50接种物用于trp-1+葡萄糖培养基中的诱导。加入新鲜抗生素到50mg/L的终浓度。诱导前，摇瓶在37℃生长。
每小时细胞取样，直到获得0.35-0.8的OD600。随后用0.1mM IPTG诱导细胞，温度降到34℃。诱导前(零时间点)收集样品(1ml)并5000xg离心。上清在-20℃冷冻用于LC/MS分析。诱导后4小时，收集另外的1mL样品，离心以从细胞沉淀中分离培养液。如上所述加入色氨酸、丙酮酸钠、氨苄青霉素和吐温。
诱导后细胞生长48小时，另取1mL样品且如上制备。在48小时时，加入另一等分的色氨酸和丙酮酸。生长约70小时后(诱导后)，3500rpm 4℃离心整个培养物体积20分钟。轻轻倒出上清，培养液和细胞都在-80℃冷冻。过滤培养液部分并通过LC/MS分析。如实施例10所述监控[M+H]+＝293峰的高度和面积。减去培养基的背景水平。数据也对于细胞生长标准化，这是通过绘出[M+H]+＝293峰的高度图，峰高除以培养物在600nm的光密度。
当丙酮酸、氨苄青霉素和吐温在诱导后4小时而不是诱导时加入时，产生较高水平的莫纳甜。其它添加物如PLP、另外的磷酸盐或MgCl2不增加莫纳甜产量。当使用色氨酸而不是吲哚-3-丙酮酸时且当色氨酸在诱导后而不是接种或诱导时加入时，获得较高效价的莫纳甜。诱导前和诱导后4小时(底物加入时)，发酵液或细胞提取物中通常没有可检测水平的莫纳甜。负对照仅用有pET30a载体的细胞以及培养物进行，培养物中不加入色氨酸和丙酮酸。亲代MS扫描证明(m+1)/z＝293的化合物不来源于较大分子，子扫描(如实施例10进行)类似于体外产生的莫纳甜。
用0、0.2％(体积/体积)和0.6％终浓度吐温-20研究吐温的效果。摇瓶产生的最高莫纳甜量是0.2％吐温。氨苄青霉素浓度在0和10μg/mL间变化。细胞培养液中的莫纳甜量在0和1μg/mL间迅速增加(2.5倍)，当氨苄青霉素浓度从1增加到10μg/mL时，莫纳甜量增加1.3倍。
显示典型结果的时程实验示于图10。甚至当值对于细胞生长标准化时，分泌到细胞培养液的莫纳甜量增加。通过使用色氨酸的摩尔消光系数，培养液中的莫纳甜量估计小于10μg/mL。重复相同实验用含没有proA插入的载体的细胞。许多数字为负，表明这些培养物中m/z＝293的峰高度小于单独培养基中的峰高度(图10)。当色氨酸和丙酮酸缺乏时，数字一致地较低，证明莫纳甜生成是醛缩酶催化酶反应的结果。
细菌细胞中的莫纳甜体内生成在800mL摇瓶实验和发酵罐中重复。通过阴离子交换层析和制备性反相液相色谱纯化250mL莫纳甜样品(在无细胞的培养液中)。蒸发此样品，用于高分辨质量分析(如实施例6所述)。高分辨MS表明生成的代谢物是莫纳甜。
体外测定说明转氨酶需要以高于醛缩酶的水平存在(参见实施例6)，因此来自大肠杆菌的天冬氨酸转氨酶超量表达，结合醛缩酶基因以增加产生的莫纳甜量。设计引物以将睾丸酮丛毛单胞菌proA导入有aspC/pET30Xa/LIC的操纵子，引物如下：5’引物：ACTCGGATCCGAAGGAGATATACATATGTACGAACTGGGACT(SEQ ID NO：67)和3’引物：CGGCTGTCGACCGTTAGTCAATATATTTCAGGC(SEQ ID NO：68)。5’引物包含BamHI位点，3’引物包含SalI位点用于克隆。PCR如实施例4所述进行并凝胶纯化。aspC/pET30 Xa/LIC构建物用BamHI和SalI消化，PCR产物也如此。消化物用Qiagen自旋柱纯化。根据厂商说明用Roche迅速DNA连接试剂盒(Indianapolis，IN)将proA PCR产物连接到载体。用Novablues Singles(Novagen)进行化学转化，如实施例1所述。菌落在含50mg/L卡那霉素的LB培养基中生长且质粒DNA用Qiagen spin miniprep试剂盒纯化。通过限制酶消化分析筛选克隆并由Seqwright(Houston，TX)确定序列。构建物亚克隆入BLR(DE3)、BLR(DE3)pLysS、BL21(DE3)和BL21(DE3)pLysS(Novagen)。ProA/pET30Xa/LIC构建物也转化入BL21(DE3)pLysS。
在上述标准条件下初始比较BLR(DE3)摇瓶样品证明加入第2个基因(aspC)使产生的莫纳甜量提高7倍。为加速生长，使用BL21(DE3)-衍生宿主菌株。proA克隆和2个基因操纵子克隆在上面的Trp-1培养基中诱导，pLysS宿主也有加入培养基的氯霉素(34mg/L)。进行摇瓶实验，有和没有加入0.2％吐温-20和1mg/L氨苄青霉素。用体外生成的纯化莫纳甜作为标准计算培养液中的莫纳甜量。SRM分析如实施例10所述进行。在零、4小时、24小时、48小时、72小时和96小时生长时细胞取样。
结果示于表5，显示培养液中生成的最大量。在大多数情况下，2个基因构建物产生的值高于单独proA构建物。细胞膜更易渗漏的pLysS菌株分泌的莫纳甜水平较高，尽管这些菌株通常以较慢的速度生长。加入吐温和氨苄青霉素是有益的。
                             表5：
                      大肠杆菌产生的莫纳甜量
  构建物   宿主   吐温+Amp   μg/mL莫纳甜   时间
  proA   BL21(DE3)   -   0.41   72小时
  proA   BL21(DE3)   +   1.58   48小时
  proA   BL21(DE3)pLysS   -   1.04   48小时
  proA   BL21(DE3)pLysS   +   1.60   48小时
  aspC：proA   BL21(DE3)   -   0.09   48小时
  aspC：proA   BL21(DE3)   +   0.58   48小时
  aspC：proA   BL21(DE3)pLysS   -   1.39   48小时
  aspC：proA   BL21(DE3)pLysS   +   6.68   48小时
                            实施例12
酵母中莫纳甜的产生
该实施例描述用于在真核细胞中生成莫纳甜的方法。本领域技术人员理解类似方法可用于在任何感兴趣细胞中生成莫纳甜。此外，除了该实施例所述或两者择一的办法，可使用其它基因(例如图2所列)。
pESC酵母抗原表位标记载体系统(Stratagene，La Jolla，CA)用于克隆和表达大肠杆菌aspC和睾丸酮丛毛单胞菌proA基因入酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中。pESC载体含有相反链上的GAL1和GAL10启动子，有2个不同多克隆位点，可同时表达2个基因。pESC-His载体也含有His3基因用于互补宿主(YPH500)中的组氨酸营养缺陷型。GAL1和GAL10启动子受葡萄糖抑制且由半乳糖诱导；Kozak序列用于在酵母中最佳表达。pESC载体是穿梭载体，能在大肠杆菌中产生初始构建物(bla基因用于选择)；然而，多克隆位点中没有细菌核糖体结合部位。
设计下列引物用于克隆入pESC-His(限制性位点加下划线，Kozak序列粗体显示)：aspC(BamHI/SalI)，GAL1：5’CGC GGATCCATAATGGTTGAGAACATTACCG-3’(SEQ ID NO：69)和5’-ACGC GTCGACTTACAGCACTGCCACAATCG-3’(SEQ IDNO：70)。proA(EcoRI/NotI)，GAL10：5’-CCG GAATTCATAATGGTCGAACTGGGAGTTGT-3’(SEQ ID NO：71)和5’-GAA TGCGGCCGCTTAGTCAATATATTTCAGGCC-3’(SEQ ID NO：72)。
由于导入Kozak序列，两种成熟蛋白的第2个密码子从芳族氨基酸变成缬氨酸。用来自实施例1和实施例4所述克隆的pET30Xa/LIC miniprep DNA作为模板扩增感兴趣的基因。使用Eppendorf Master循环梯度热循环仪进行PCR，和下列用于50μL反应的方案：1.0μL模板、1.0μM各引物、0.4mM各dNTP、3.5U扩增高保真聚合酶(Roche，Indianapolis，IN)和有Mg的1X ExpandTM缓冲液。所用热循环仪程序包括94℃5分钟的热启动，接着是29个下列步骤的重复：94℃30秒，50℃1分钟45秒，72℃2分钟15秒。29个重复后，样品在72℃维持10分钟，随后于4℃贮存。纯化PCR产物是通过在1％TAE-琼脂糖凝胶上分离，接着用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)回收。
pESC-His载体DNA(2.7μg)如上用BamHI/SalI消化并凝胶纯化。aspC PCR产物用BamHI/SalI消化并用QIAquick PCR纯化柱纯化。用Roche迅速DNA连接试剂盒根据厂商的方案进行连接。根据厂商的说明，在0.2cm Biorad一次性小杯中将脱盐的连接物电穿孔入40μl Electromasx DH10B感受态细胞(Invitrogen)，使用附加脉冲控制器的Biorad基因脉冲器II。在1mL SOC培养基中恢复1小时后，转化子平板培养于含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基。用于克隆的质粒DNA制品用QIAprep SpinMiniprep试剂盒完成。质粒DNA通过限制酶切消化筛选，用设计用于载体的引物测序(Seqwright)以确认。
aspC/pESC-His克隆用EcoRI和NotI消化，proA PCR产物也如此。DNA如上纯化和连接。2个基因构建物转化入DH10B细胞中并通过限制酶切消化和DNA测序筛选。
构建物转入酿酒酵母菌株YPH500，使用S.c.EasyCompTM转化试剂盒(Invitrogen)。转化反应在含2％葡萄糖的SC-His极限培养基(Invitrogen pYES2手册)上平板培养。通过菌落PCR用上面的PCR引物筛选单独酵母菌落中proA和aspC基因的存在。沉淀细胞(2μl)悬浮于20μL含1μl消解酶的Y-裂解缓冲液(Zymo Research)并于37℃加热10分钟。随后4μL此悬浮液用于50μL PCR反应，使用上述PCR反应混合物和程序。
5mL培养物在SC-His+葡萄糖中30℃和225rpm生长过夜。逐步调整细胞在棉子糖上生长以便将半乳糖诱导前的延滞期减至最小。生长约12小时后，测量600nm的吸光度，旋下适当体积的细胞且重悬浮于新鲜SC-His培养基中产生0.4的OD。连续使用下列碳源：1％棉子糖+1％葡萄糖，0.5％葡萄糖+1.5％棉子糖，2％棉子糖和最后的1％棉子糖+2％半乳糖用于诱导。
诱导培养基中生长约16小时后，50mL培养物分成双份25mL培养物，下列仅加入双份之一：(终浓度)1g/L L-色氨酸、5mM磷酸钠pH7.1、1g/L丙酮酸钠、1mMMgCl2。来自非诱导培养基和来自加入莫纳甜途径的底物之前16小时培养液和细胞沉淀的样品保存作为负对照。此外，仅含功能性aspC基因(和截短的proA基因)的构建物用作另一种负对照。细胞可在诱导后总共生长69小时。酵母细胞偶尔在较低OD诱导，仅在加入色氨酸和丙酮酸前生长4小时。然而，这些莫纳甜底物似乎抑制生长且在较高OD加入更有效。
来自培养物的细胞沉淀用5mL YeastBusterTM+50μl THP(Novagen)每克(湿重)细胞遵循厂商的方案裂解，加入前面例子所述的蛋白酶抑制剂和benzonase核酸酶。过滤培养液和细胞提取物并通过SRM分析，如实施例10所述。使用此方法，培养液样品中没有检测到莫纳甜，表明细胞不能在这些条件下分泌莫纳甜。这些条件下的质子动力可能不足或一般的氨基酸转运子可用色氨酸饱和。蛋白表达水平不能用SDS-PAGE检测变化。
当色氨酸和丙酮酸加入培养基时，具有2个功能基因的培养物的细胞提取物中可短暂检测到莫纳甜(约60μg/mL)。任何负对照细胞提取物中不能检测到莫纳甜。用4.4mg/mL总蛋白(约为通常用于大肠杆菌细胞提取物的两倍)进行2次莫纳甜的体外测定，使用实施例6所述最优化测定。进行其它测定，加入32μg/mL睾丸酮丛毛单胞菌ProA醛缩酶或400μg/mL AspC转氨酶，以确定哪个酶在细胞提取物中限制。负对照不加入酶或仅加入AspC转氨酶(没有酶时在某种程度上可发生醛醇缩合)。正对照用部分纯化的酶(30-40％)进行，使用16μg/mL醛缩酶和400μg/mL转氨酶。
体外结果通过SRM分析。细胞提取物分析显示当色氨酸在诱导后加入培养基时，它被有效转运入细胞中，使色氨酸水平比没有另外加入色氨酸的高2个数量级。体外莫纳甜的分析结果示于表6(数字表示ng/mL)。
                  表6：用酵母细胞提取物产生莫纳甜
  aspC构建物 +醛缩酶 +AspC   二基因构建物   +醛缩酶 +AspC
  抑制(葡萄糖培养基)   0   888.3   173.5   0   465.2   829
  24小时诱导   0   2832.8   642.4   0   1375.6   9146.6
  69小时诱导   0   4937.3   340.3   71.9   1652.8   23693.5
  69小时+底物   0   556.9   659.1   21.9   755.6   16688.2
  +对照(纯化酶)   21853   21853
  -对照(无酶)   0   254.3   0   254.3
用有和没有底物加入生长培养基的全二基因构建物细胞提取物获得阳性结果。这些结果与正对照相比，表明酶表达水平接近酵母中1％的总蛋白。当aspC构建物(截短的proA)的细胞提取物用醛缩酶测定时，产生的莫纳甜量显著大于单独细胞提取物测定，表明重组AspC转氨酶包含约1-2％酵母总蛋白。由于细胞中存在天然转氨酶，用醛缩酶测定时未诱导培养物的细胞提取物有小量活性。当用AspC转氨酶测定时，来自未诱导细胞的提取物活性增加到用AspC(大约200ng/ml)的负对照生成的莫纳甜量。相反，补充转氨酶时二基因构建物细胞提取物测定中观察到的活性增加大于加入醛缩酶时观察到的活性。由于2个基因都应以相同水平表达，表明当转氨酶水平高于醛缩酶水平时，产生的莫纳甜量最大，与实施例6所示结果一致。
加入丙酮酸和色氨酸不仅抑制细胞生长，而且也明显抑制蛋白表达。加入pESC-Trp质粒可用于纠正YPH500宿主细胞的色氨酸营养缺陷型，是一种提供色氨酸而对生长、表达和分泌效果更少的方法。
                            实施例13
采用偶联反应改进酶方法
理论上，如果没有副反应或底物降解或产生中间体，从图1所述酶反应中形成的最大产物量直接与各反应的平衡常数、色氨酸和丙酮酸的浓度成比例。色氨酸不是高度可溶的底物，大于200mM的丙酮酸浓度似乎对产量有负作用(参见实施例6)。
理想地，莫纳甜浓度相对于底物最大化以降低分离成本。可进行物理分离，这样莫纳甜从反应混合物中取出，防止逆反应发生。原料和催化剂可随后再生。由于莫纳甜的大小、电荷和疏水性与一些试剂和中间体类似，物理分离困难，除非对莫纳甜的亲和性高(如亲和层析技术)。然而，莫纳甜反应可偶联其它反应，这样系统的平衡移向莫纳甜生成。以下是改进莫纳甜产量的方法的例子，莫纳甜获得自色氨酸或吲哚-3-丙酮酸。
采用草酰乙酸脱羧酶(EC 4.1.1.3)的偶联反应
图11是反应的说明。色氨酸氧化酶和过氧化氢酶用于在吲哚-3-丙酮酸生成的方向驱动反应。过氧化氢酶过量使用，因而过氧化氢不能在逆方向中起作用或者损害酶或中间体。氧在过氧化氢酶反应期间再生。另外，吲哚-3-丙酮酸可用作底物。
天冬氨酸用作MP胺化的氨基供体，使用天冬氨酸转氨酶。理想地，与MP对莫纳甜反应相比，使用对色氨酸/吲哚-3-丙酮酸反应特异性低的转氨酶，这样天冬氨酸不用于再胺化吲哚-3-丙酮酸。可加入草酰乙酸脱羧酶(来自假单胞菌属)以将草酰乙酸转化成丙酮酸和二氧化碳。由于CO2是挥发性的，它不能用于与酶反应，减少或甚至防止逆反应。此步骤中产生的丙酮酸也能用于醛醇缩合反应。可使用其它脱羧酶，已知同系物存在于伴放线放线杆菌(A.actinomycetemcomitans)、风产液菌(Aquifexaeolicus)、闪烁古生球菌(Archaeoglobus fulgidus)、棕色固氮菌、脆弱拟杆菌(Bacteroidesfragilis)、一些博德特氏菌属(Bordetella)、空肠弯曲杆菌(C.jejuni)、微温绿菌(Chlorobium tepidum)、橙色绿屈挠菌(Chloroflexus aurantiacus)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、具核梭杆菌(F.nucleatum)、肺炎克氏杆菌(Klebsiellapneumoniae)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)、磁球菌(Magnetocuccus)MC-1、溶血曼海米亚菌(Mannheimia haemolytica)、鞭毛甲基杆菌KT(Methylobacillusflagellatus KT)、多杀巴斯德氏菌(P.Multocida)Pm70、微热石袍菌(Petrotogamiotherma)、牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)、一些假单胞菌属、一些火球菌属(Pyrococcus)、红球菌属(Rhodococcus)、一些沙门氏菌属(Salmonella)、一些链球菌属(Streptococcus)、微温热着色菌(Thermochromatium tepidum)、海栖热袍菌(Thermotoga maritima)、梅毒密螺旋体(Treponema pallidum)和一些弧菌属(Vibrio)种。
用来自大肠杆菌的天冬氨酸转氨酶(AspC)、来自大肠杆菌的酪氨酸转氨酶(TyrB)、来自硕大利什曼原虫的广底物转氨酶(BSAT)和2个实施例1所述可商业购买的猪谷氨酸-草酰乙酸转氨酶进行色氨酸转氨酶测定。草酰乙酸和α-酮戊二酸作为氨基受体测试。比较用莫纳甜的活性(实施例7)相对用色氨酸的活性的比例，用于确定哪一个酶对莫纳甜转氨酶反应的特异性最高。这些结果表明相对色氨酸反应对莫纳甜反应特异性最高的酶是猪II-A型谷氨酸-草酰乙酸转氨酶GOAT(Sigma G7005)。此特异性不取决于使用哪一个氨基受体。因此，此酶用于具有草酰乙酸脱羧酶的偶联反应。
从吲哚-3-丙酮酸起始的典型反应包括(终浓度)50mM Tris-Cl pH7.3、6mM吲哚-3-丙酮酸、6mM丙酮酸钠、6mM天冬氨酸、0.05mM PLP、3mM磷酸钾、3mM MgCl2、25μg/mL转氨酶、50μg/mL睾丸酮丛毛单胞菌ProA醛缩酶和3单位/mL脱羧酶(SigmaO4878)。反应可在26℃进行1小时。在一些情况中，省略脱羧酶或用α-酮戊二酸取代天冬氨酸(作为负对照)。也测试上述取代GOAT的转氨酶以证实早期特异性实验。过滤样品并通过LC/MS分析，如实施例10所述。结果证明GOAT酶法生成最高量的莫纳甜每mg蛋白，而产生最少量的色氨酸作为副产物。此外，加入脱羧酶可增加2-3倍。与其它转氨酶相比，大肠杆菌AspC酶也生成大量莫纳甜。
提高莫纳甜产量是通过：1)定期加入2mM吲哚-3-丙酮酸、丙酮酸和天冬氨酸(每半小时到1小时)，2)在厌氧环境中进行反应或有脱气缓冲液，3)允许反应过夜进行和4)使用没有多次冻融的新鲜制备的脱羧酶。丙酮酸浓度＞12mM会抑制脱羧酶。吲哚-3-丙酮酸浓度高于4mM时，与吲哚-3-丙酮酸的副反应加速。如果也增加醛缩酶量，用于反应的吲哚-3-丙酮酸量可增加。发现高水平的磷酸盐(50mM)和天冬氨酸(50mM)抑制脱羧酶。在1小时反应中，加入的脱羧酶量能减少到0.5U/mL，而莫纳甜产量没有降低。当温度从26℃提高到30℃和从30℃提高到37℃时，产生的莫纳甜量增加；然而，37℃时吲哚-3-丙酮酸的副反应也加速。生成的莫纳甜量随着pH从7增加到7.3而增大，且从pH7.3-7.8相对稳定。
从色氨酸起始的典型反应包括(终浓度)50mM Tris-Cl pH7.3、20mM色氨酸、6mM天冬氨酸、6mM丙酮酸钠、0.05mM PLP、3mM磷酸钾、3mM MgCl2、25μg/mL转氨酶、50μg/mL睾丸酮丛毛单胞菌ProA醛缩酶和4单位/mL脱羧酶、5-200mU/mL L-氨基酸氧化酶(SigmaA-2805)、168U/mL过氧化氢酶(Sigma C-3515)和0.008mg FAD。反应可在30℃进行30分钟。加入脱羧酶观察到改进。当使用50mU/mL氧化酶时，产生最大量的莫纳甜。改进类似于当吲哚-3-丙酮酸用作底物时观察到的。此外，当1)色氨酸水平低(即低于转氨酶的Km且因此不能与MP竞争活性位点)和2)氧化酶与醛缩酶和转氨酶的比例维持的水平不能积聚吲哚-3-丙酮酸时，产生的莫纳甜量增加。
无论从吲哚-3-丙酮酸还是色氨酸起始，当使用2-4倍的所有酶量且同时维持相同酶比例时，孵育时间为1-2小时的测定中产生的莫纳甜量增加。使用任一底物，达到约1mg/mL莫纳甜浓度。如果从吲哚-3-丙酮酸起始，产生的色氨酸量通常低于20％的产物量，显示出使用偶联反应的益处。随着中间体浓度和副反应的进一步最优化和控制，产率和产量能大幅提高。
采用赖氨酸ε转氨酶(EC 2.6.1.36)的偶联反应
在一些生物体中发现赖氨酸ε转氨酶(L-赖氨酸6-转氨酶)，包括红球菌、分枝杆菌(Mycobacterium)、链霉菌(Streptomyces)、诺卡氏菌(Nocardia)、黄杆菌、产朊假丝酵母(C.utilis)和链霉菌。生物体利用此酶作为生成一些β-内酰胺抗生素中的和一步骤(Rius和Demain，J.Microbiol.Biotech.，7：95-100，1997)。此酶将赖氨酸转化成L-2-氨基己二酸6-半醛(ε-醛赖氨酸)，这是通过PLP-介导的赖氨酸的C-6转氨，α-酮戊二酸用作氨基受体。ε-醛赖氨酸不稳定且自发经历分子内脱水以形成环状分子1-哌啶6-羧酸盐。这有效抑制任何逆反应发生。图12描述反应流程。也能使用另外的酶赖氨酸-丙酮酸6-转氨酶(EC 2.6.1.71)。
1mL典型反应包含：50mM Tris-Cl pH7.3、20mM吲哚-3-丙酮酸、0.05mM PLP、6mM磷酸钾pH8、2-50mM丙酮酸钠、1.5mM MgCl2、50mM赖氨酸、100μg转氨酶(赖氨酸ε转氨酶LAT-101，BioCatalytics Pasadena，CA)和200μg睾丸酮丛毛单胞菌ProA醛缩酶。产生的莫纳甜量随着丙酮酸浓度增加而增加。用这些反应条件(50mM丙酮酸)的最大量比用草酰乙酸脱羧酶(约0.1mg/mL)的偶联反应观察到的低10倍。
[M+H]+＝293的峰在莫纳甜预期时间洗脱且质谱包含一些用其它酶方法观察到的相同片段。第2个有正确质量与电荷比(293)洗脱的峰稍早于实施例6中生成的S，S莫纳甜通常观察到的，可能表明存在另一种莫纳甜的异构体。此酶法生成的色氨酸很少。然而，可能对丙酮酸有一些活性(产生丙氨酸作为副产物)。同样，已知酶不稳定。可通过定向进化实验进行改进以增加稳定性，减少与丙酮酸的活性并提高与MP的活性。这些反应也能偶联上述L-氨基酸氧化酶/过氧化氢酶。
其它偶联反应
图13显示另一种能提高来自色氨酸或吲哚-3-丙酮酸的莫纳甜产量的偶联反应。甲酸脱氢酶(EC 1.2.1.2或1.2.1.43)是普通酶。一些甲酸脱氢酶需要NADH而另一些能利用NADPH。谷氨酸脱氢酶在前面的例子中催化莫纳甜前体和莫纳甜间的相互转化，使用以铵为基础的缓冲液。甲酸铵和甲酸脱氢酶的存在是辅因子再生的有效系统，二氧化碳生成是降低逆反应速度的有效方法(Bommarius等，Biocatalysis 10：37，1994和Galkin等，Appl.Environ.Microbiol.63：4651-6，1997)。此外，大量甲酸铵能溶于反应缓冲液。加入甲酸脱氢酶和甲酸铵可改进谷氨酸脱氢酶反应(或类似的还原性胺化)生成的莫纳甜产量。
其它方法能用于驱动平衡趋向莫纳甜生成。例如，如果氨丙烷在MP转化成莫纳甜中用作氨基酸供体，转化用Ω-氨基酸转氨酶(EC 2.6.1.18)如美国专利5,360,724和5,300,437所述，所得产物之一或许是丙酮，它是比底物氨丙烷更易挥发的产物。可周期性提高短期的温度以急骤蒸发挥丙酮，从而缓解平衡。丙酮的沸点为47℃，如果使用短时间段，此温度不可能降解中间体。大部分对α-酮戊二酸有活性的转氨酶也对莫纳甜前体有活性。类似地，如果乙醛酸/芳族酸转氨酶(EC 2.6.1.60)与作为氨基供体的甘氨酸一起使用，生成的乙醛酸相对不稳定且沸点比甘氨酸低很多。
实施例14：含有莫纳甜的包装制品
制造了含有莫纳甜的包装制品，其提供的甜度相当于约2茶匙蔗糖(约8克)。
A.含有S，S莫纳甜的包装制品(每克)：
787毫克葡萄糖
200毫克S，S莫纳甜
10毫克酒石
3毫克硅酸钙
B.含有R，R和S，S莫纳甜的包装制品(每克)
700毫克葡萄糖
292毫克麦芽糊精
4毫克R，R莫纳甜
4毫克S，S莫纳甜
C.含有R，R和S，S莫纳甜的包装制品(每克)
992mg用麦芽糊精*成团的葡萄糖
4mgR，R莫纳甜
4mgS，S莫纳甜
*例如CPC International，Inc.的UnidexAgglomerated Dextose 02540(2034)。
D.含有R，R莫纳甜的包装制品(每克)：
500毫克葡萄糖
495毫克麦芽糊精
5毫克R，R莫纳甜
E.含有R，R莫纳甜的一半大小的立方体(每克)：
999毫克麦芽糊精
1毫克R，R莫纳甜
实施例15：含有莫纳甜的包装制品的配方
以下是如何将莫纳甜包装制品(如上述那些)用作烘焙和其它配方的蔗糖替代品的例子。相比用蔗糖制造的相同的产品，用以下配方制造的含有莫纳甜的产品是可接受的并具有良好质量。
柠檬水：
将2汤匙柠檬汁和3包(3克)莫纳甜包装制品与3/4杯水在长玻璃容器中混合至溶解。加冰。用莫纳甜变甜的柠檬水与用6茶匙(24克)蔗糖变甜的柠檬水的甜味几乎相同且甚至更好，并具有明显较低的卡路里(约0卡路里，而蔗糖为96卡路里)。
搅打奶油(Topping)
1/3杯冰水
1茶匙柠檬汁
茶匙香草
1/3杯脱脂奶粉
3包莫纳甜蔗糖替代品(每份实施例C)
将水、柠檬汁和香草混合。拌入脱脂奶粉。搅打10分钟或直到硬性发泡。加入莫纳甜蔗糖替代品包装并搅打2分钟。
无糖海绵蛋糕配方
配料                       ％w/w
蛋糕粉                     20.42
水                         18.62
全蛋                       18.2
聚葡萄糖                   17.23
高比例起酥油               13.44
山梨糖醇粉末               8.62
脱脂奶粉                   1.66
发酵粉                     1.24
盐                         0.31
R，R莫纳甜(按个人口味)     0.010-0.040
每100克蛋糕使用10-40毫克R，R莫纳甜(例如由3-10包桌面莫纳甜甜味剂提供)。
实施例16：含有莫纳甜的现成制品
制造即用型“匙对匙”制品以代替砂糖使用。由于莫纳甜制品的体积与蔗糖相同，我们可将这些制品直接加入饮料或食品，或直接用于烘焙，其用量与砂糖相等。
A.含有S，S莫纳甜的现成制品(每克)：
188毫克水解淀粉
800毫克麦芽糊精
10毫克S，S莫纳甜
2毫克葡糖酸钠
B.含有R，R莫纳甜的现成制品(每克)：
999.5毫克麦芽糊精
0.5毫克R，R莫纳甜
C.含有S，S/R，R混合物的现成制品(每克)：
972.5毫克麦芽糊精
20毫克酒石
4毫克硅酸钙
3.1毫克S，S莫纳甜
0.4毫克R，R莫纳甜
实施例17：含有莫纳甜的现成制品的配方
以下是如何将莫纳甜的“匙对匙”现成制品(如上述那些)用作烘焙和其它配方的蔗糖替代品的例子。相比用蔗糖制造的相同的产品，用以下配方制造的含有莫纳甜的产品是可接受的并具有良好质量。
法式派
派皮：
1杯碾碎的全麦饼干
1杯碎核桃
1条奶油，熔化
将派皮配料混合并拍入9寸派盘。300°烘30分钟。
馅料
2块未加糖的巧克力
2条奶油
1杯莫纳甜现成制品(每份实施例16B)
2茶匙香草
4个巴氏灭菌蛋
将未加糖的巧克力熔化并冷却至室温。将奶油和莫纳甜蔗糖替代品打发，在其中加入香草和熔化的巧克力。边搅打边加入鸡蛋，每加入一个蛋后搅打4分钟再加入第二个。倒入冷却的派皮中并冷藏过夜。
蓝莓松饼：
注意：出于质地、颜色以及甜味考虑，蔗糖是重要的烘焙原料。在该配方中，使用了少量蜂蜜以补偿配方中缺乏蔗糖造成的缺陷，并且有助于产生焦糖色和良好质地。
2杯万能面粉
2茶匙发酵粉
3/4茶匙盐
杯人造黄油，软化
1杯莫纳甜现成制品
杯蜂蜜
2个全蛋(大)
1茶匙香草
杯脱脂乳
1杯蓝莓，新鲜的或冷冻的
烘箱预热至350°F。用纸折成10个松饼杯。将面粉、发酵粉、盐一起过筛；备用。将人造黄油、莫纳甜甜味剂和蜂蜜一起用电动搅拌机搅打直到松软。加入鸡蛋，每加入一个蛋后搅打均匀再加入第二个。拌入香草。交替拌入面粉混合物和牛奶，以面粉混合物开始和结束。拌入蓝莓。舀入用纸折成的松饼杯，并烘至金黄褐色，同时插入中央的牙签取出是干净的，约25-30分钟。在网架上的烤盘中冷却10分钟。从烤盘中取出松饼。在网架上完全冷却。共制成10个松饼。
草莓香蕉饮：
1杯橙汁
1杯脱脂原味酸奶
1根冰冻香蕉
1杯冰冻草莓
6包莫纳甜制品或杯莫纳甜现成制品
将所有配料置于搅拌机中并搅拌至柔滑。分成2份。相比用杯蔗糖以相同配方制造的饮品相比，这种饮品所含的卡路里降低了约33％。
菠萝橙子冰糕
1罐15盎司的菠萝碎片
1罐6盎司的冰冻浓缩橙汁，解冻
3杯脱脂乳
3/4杯蒸发脱脂乳
1/3杯莫纳甜现成制品(每份实施例B)
茶匙香草
将脱脂乳、未除去水分的菠萝、蒸发脱脂乳、浓缩橙汁、莫纳甜蔗糖替代品和香草一起在大碗中搅拌直到莫纳甜蔗糖替代品溶解。在4或5夸脱的冰淇淋机中按照制造商的说明冷冻。制成15(杯)份。
柠檬幕司
1罐12盎司的蒸发乳
2汤匙柠檬皮屑
2个柠檬榨出的汁
1杯莫纳甜现成制品(每份实施例A)
12片全麦饼干，碾碎
将牛奶倒入果冻圆盘并放置在冰箱中直到形成冰丝，约2小时。将牛奶转移到冰冻过的碗中并搅打。边混合边慢慢加入柠檬皮屑和果汁。加入莫纳甜蔗糖替代品并继续搅打直到有软峰形成。将其转移到分食容器中并洒上全麦饼干屑。可冷却或冷冻食用。
实施例18：含有莫纳甜的甜点和糖果产品
即用型莫纳甜组合物可用于商业制造提供给消费者的包装食品。
速溶巧克力布丁配料表
配料                              ％w/w
冷溶胀淀粉(Ultratex 4)            5.00
脱脂奶粉                          14.00
可可粉                            2.5
麦芽糊精                          3.5
巧克力香精                        0.4
黄蓍胶                            0.20
盐                                0.15
卵磷脂粉                    0.25
磷酸二钠                    0.17
R，R莫纳甜(按个人口味)      0.005-0.010
用水补足至                  100
每100克布丁中含有5-10毫克R，R莫纳甜(例如由2-3包桌面莫纳甜甜味剂提供)。
无糖巧克力涂层
配料
4.0-10％乳固体
15.0-20％巧克力香精或巧克力浆
0-10％可可脂
0-2％可可粉
5-10％甘露醇
0.3-0.5％卵磷脂
12-25％聚葡萄糖(如聚葡萄糖K)
0.10-0.5％S，S莫纳甜或0.007-0.015％R，R莫纳甜或它们的混合物
20-60％植物油
每100毫克涂层使用约2-4包桌面甜味剂。
无糖巧克力
配料
2-3汤匙可可粉
2汤匙奶油(非替代品)
2汤匙液态重搅打奶油
1/4茶匙纯香草精
1汤匙花生酱(颗粒或柔滑)
6包桌面莫纳甜
实施例19：评价莫纳甜在桌面甜味剂中的使用
在咖啡和冰茶中比较其它已知甜味剂甜味剂(阿斯巴特和三氯蔗糖)来评价含有R，R莫纳甜或R，R莫纳甜/赤藓醇混合物的莫纳甜桌面制品。评价的关键感官参数包括甜味质量、后味、苦味及其后味。进行定性评价。
产品配方
(i)咖啡
使用标准咖啡来评价甜味剂性能(表7)。
表7.咖啡配方
  配方   供应商   浓度(％w/w)   g/700ml
  经典烘焙咖啡   Folger   5.41   37.87
  水   94.59   662.13
按照以下浓度在咖啡中加入甜味剂：
阿斯巴特           0.025％(w/v)
三氯蔗糖           0.0082％(w/v)
R，R莫纳甜*       0.0020、0.0025、0.0030％(w/v)加1克麦芽糊精
R，R莫纳甜/赤藓醇  0.0020、0.0025、0.0030％(w/v)加1克赤藓醇
(ii)冰茶
用冰茶制品来评价甜味剂性能(表8)。
表8.冰茶配方
成分   供应商   浓度(w/v)
柠檬酸   0.200
柠檬酸钠   0.020
茶叶提取物′Assam′285002   Plantextrakt   0.150
天然红茶香料提取物31108304010000   Rudolph Wild   0.050
硼酸钠(20％w/w)   0.075
甜味剂   按需
水   加至所需体积
按照以下浓度在咖啡中加入甜味剂：
阿斯巴特               0.0450％(w/v)
三氯蔗糖               0.0170％(w/v)
R，R莫纳甜*           0.0030、0.0035、0.0040％(w/v)加1克麦芽糊精
R，R莫纳甜/赤藓醇      0.0030、0.0035、0.0040％(w/v)加1克赤藓醇
感官评价
采用一小组(n＝6)有经验的感觉鉴定员来评价这些咖啡和茶饮品，这些鉴定员将先品尝咖啡产品然后再品尝茶产品。这些评定的结果总结在表9中。
表9.咖啡和茶的感官评价(每份200ml)
  产品   甜味剂/浓度   评论
  咖啡   阿斯巴特/250ppm   平衡的甜味表现。苦味水平非常低，大概是由于APM的抑制作用。平稳均匀地输送咖啡的味道。舌头背部有典型的APM后味。
  三氯蔗糖/82ppm   缓慢产生甜味使得咖啡味显著。后味中咖啡的苦味非常明显，但不管怎样三氯蔗糖延迟的甜味表现平衡了这种味道。
  莫纳甜(25ppm)+麦芽糊精(1克)(0.5％)   平衡的甜度表现。后味中有清晰的咖啡味道。比任何一种其它甜味剂都有更加强烈的咖啡味道，尽管这可能(至少部分)由于莫纳甜有限的苦味抑制能力。
  莫纳甜(25ppm)+赤藓醇(1克)(0.5％)   在莫纳甜样品中咖啡味更加明显。相比莫纳甜/麦芽糊精，莫纳甜/赤藓醇混合物延迟甜味产生的时间较短。赤藓醇使咖啡风味平稳并能稍快产生甜味。
  冰茶   阿斯巴特/450ppm   良好的暂时特性，尽管阿斯巴特的典型味道非常明显。平衡的，但茶味淡。无证据显示味道增强。
  三氯蔗糖/170ppm   甜味出现延迟，第一感觉是酸味。但产品的味道和总体感觉不平衡的，这是因为甜味表现与酸度或香味表现不匹配。
  莫纳甜(40ppm)+麦芽糊精(1克)(0.5％)   甜味和香味表现非常平衡。相比其它甜味剂柠檬香味显著增强。
  莫纳甜(40ppm)+赤藓醇(1克)(0.5％)   甜味和香味表现平衡。柠檬香味比单独使用莫纳甜/麦芽糊精更强。后味的收敛大大降低/消除。
讨论
莫纳甜能给桌面甜味剂制品带来意想不到的好处，其中包括明显的感官益处。当用于加入咖啡的桌面制品时，感觉到咖啡的香味水平明显提高。加入低浓度赤藓醇进一步增强了这种益处，赤藓醇能够平衡平衡并缓和香味同时缩短甜味出现的时间。在冰茶尤其是酸化的茶(即加入柠檬)中，莫纳甜增强了柠檬的香味。同时，将赤藓醇与莫纳甜混合能带来其它的香味益处。
莫纳甜具有改进的感官特性(例如较少的后味、较少的怪味)和/或改进的溶解性和稳定性。
使咖啡变甜的莫纳甜几乎不含热量，而用2茶匙(约8克)蔗糖使咖啡变甜却含有32卡路里。
实施例20：莫纳甜和糖精的甜度用量反应曲线
用20名感觉鉴定员来评估莫纳甜和糖精的甜味，判断一式两份进行。用pH3.2的柠檬酸/柠檬酸盐缓冲液制备测试和参考溶液。见图16。相比糖精，R，R/S，S莫纳甜的结果更呈线形，这与其味道特征更像蔗糖一致。高出10％SEV的部分说明不存在(或水平较低)“混合物抑制”怪味和后味。莫纳甜的用量反应曲线的形状类似于阿斯巴特、三氯蔗糖和阿力甜，因此它们都是“高质量”甜味剂。
在以R，R/S，S莫纳甜作为主要甜味剂的模型系统(pH3.2)中将观察到以下特征：(1)甜味出现的轻微延迟；(2)甜味迅速消失；(3)轻微“阿斯巴特样”后味，轻微甜后味，后味中无苦味；和(4)在未调味的系统中残留清凉感觉。
实施例21：pH3时随温度增加莫纳甜的稳定性
将合成的莫纳甜样品置于pH3，25℃、50℃和100℃的环境下。室温pH3时，观察到48小时内损失14％莫纳甜。这种损失是由于形成内酯。50℃pH3时，48小时内损失23％莫纳甜。这种损失是由于形成内酯并在约15.5分钟后有未知化合物聚集。100℃pH3时，24小时内几乎所有莫纳甜都损失了。主要的可检测成分是15.5分钟时出现的未知物质。
实施例22：40℃pH2.5、3.0、4.0时莫纳甜和阿斯巴特的感官稳定性
监测在pH2.5、3.0和4.0制备并储藏于40℃的莫纳甜溶液100天内的感官稳定性。将这些溶液损失的甜味与在相同条件下制造并储存的阿拉伯糖溶液损失的甜味进行比较。
在40℃储存之后测量莫纳甜(8％SEV，约55ppm，含有约96％2R，4R/2S，4S对映体对和4％2R，4S/2S，4R对映体对的合成混合物)在pH值为2.5、3.0和4.0的磷酸盐/柠檬酸盐缓冲液中的稳定性。比较莫纳甜和相同缓冲液中阿斯巴特(400ppm)的稳定性。用与莫纳甜和阿斯巴特相同的磷酸盐/柠檬酸盐缓冲液制备三种蔗糖参考溶液。所有制备的溶液避光储存。
缓冲液组成：pH2.5  磷酸(75％溶液)0.127％(w/v)
                   一水合柠檬酸三钠0.005％(w/v)
pH3.0  磷酸(75％溶液)0.092％(w/v)
       一水合柠檬酸三钠0.031％(w/v)
pH4.0  磷酸(75％溶液)0.071％(w/v)
       一水合柠檬酸三钠0.047％(w/v)
通过一小组(n＝8)经过训练的熟悉甜味评定过程的感觉鉴定员来评估每种甜味剂相对蔗糖的甜度，该过程一式两份进行。所有样品(用同样的缓冲液配制)在22℃±1℃下一式两份。测试溶液用3个随机数字编号，并分别随机给予鉴定员。提供以0.5％(w/v)蔗糖递增的蔗糖参考标准(4.0-10.0％(w/v)蔗糖)。要求鉴定员通过比较测试溶液和蔗糖标准的甜度来评价甜度。评定时吸啜3口测试溶液，然后吸啜1口水，再吸啜3口蔗糖标准，然后在吸啜1口水，依此类推。鉴定员用1位小数评价甜度，例如6.8、8.5。在评价测试溶液之间休息5分钟。要求鉴定员彻底漱口并食用一些饼干以降低任何可能的附带结果。
表10和11显示了在磷酸盐柠檬酸盐缓冲液中进行的稳定性研究的结果。在每个pH于40℃避光储存100天后，莫纳甜甜度的残留百分比大于阿斯巴特的残留百分比。在pH4.0时，莫纳甜溶液甜味的损失几乎稳定，因为在第17-100天测得的甜度变化很小，而阿斯巴特溶液的甜味却继续损失。
                                表10
               莫纳甜的感官稳定性：40℃储存100天后的甜度
A.
  pH   时间(天)  莫纳甜SEV(％蔗糖)   莫纳甜甜味的保留(％)  阿斯巴特SEV(％蔗糖)   阿斯巴特甜味的保留(％)
  2.5   0  7.35  7.34
  1  6.86   93.3  6.90   94.0
  2  6.70   91.2  6.80   92.6
  3  6.50   88.4  6.60   89.9
  4  6.26   85.2  6.29   85.7
  7  6.08   82.7  6.01   81.9
  8  5.98   81.4  5.98   81.5
  9  5.89   80.1  5.97   81.3
  11  5.78   78.6  5.86   79.8
  50  4.61   62.7  4.19   57.1
  100  2.10   28.6  0.80   10.9
B.
  pH   时间(天)  莫纳甜SEV(％蔗糖)   莫纳甜甜味的保留(％)  阿斯巴特SEV(％蔗糖)   阿斯巴特甜味的保留(％)
  3.0   0  7.08  7.15
  1  7.05   99.6  6.90   96.5
  2  6.60   93.2  6.87   96.1
  3  6.47   91.4  6.60   92.3
  4  6.49   91.6  6.43   89.9
  7  6.04   85.3  6.17   86.3
  8  5.93   83.8  5.93   82.9
  9  5.88   83.1  5.94   83.1
  11  5.88   83.1  5.83   81.5
  50  5.12   72.3  4.71   65.9
  100  4.10   57.9  2.20   30.8
C.
  pH   时间(天)  莫纳甜SEV(％蔗糖)   莫纳甜甜味的保留(％)  阿斯巴特SEV(％蔗糖)   阿斯巴特甜味的保留(％)
  4.0   0  7.40  7.10
  3  7.08   95.7  6.75   95.1
  8  6.42   86.8  6.23   87.8
  11  6.36   85.9  6.02   84.8
  17  6.10   82.4  5.75   81.0
  24  6.25   84.5  5.85   82.4
  50  6.14   82.9  5.29   74.5
  100  5.80   78.4  4.10   57.7
                 表11
稳定性：在规定pH于40℃储存100天后剩余甜度的量
  pH   甜味剂   剩余甜度(％)
  2.5   阿斯巴特   11
  2.5   莫纳甜   29
  3.0   阿斯巴特   31
  3.0   莫纳甜   58
  4.0   阿斯巴特   58
  4.0   莫纳甜   78
如表12所见，各种缓冲液可有效维持pH。
            表12
  甜味剂   标定pH   实际pH(50天后)
  莫纳甜   2.5   2.39
  3.0   3.13
  4.0   4.28
  阿斯巴特   2.5   2.49
  3.0   3.13
  4.0   4.19
如果假设有伪第一顺序中断反应，在可将logn保留百分比对时间作图(logn％RTNv.t)以估算任何给定条件下甜度损失的半衰期(t)和速度常数(k)。如此便可得出如下表13总结的莫纳甜和阿斯巴特甜度损失动力学。
                    表13
  甜味剂   PH  半衰期(t；天)   速度常数(k；天-1)
  莫纳甜   2.5  65天   0.011天-1
  3.0  115天   0.006天-1
  4.0  230天   0.003天-1
  阿斯巴特   2.5  55天   0.013天-1
  3.0  75天   0.009天-1
  4.0  140天   0.005天-1
每个pH于40℃储存100天后，莫纳甜甜度的保留百分比大于阿斯巴特的保留百分比。在pH4.0时，莫纳甜溶液甜味的损失几乎稳定，因为在第17-100天测得的甜度变化很小，而阿斯巴特溶液的甜味却继续损失。
估计莫纳甜和阿斯巴特的半衰期说明，莫纳甜的甜度损失速度低于阿斯巴特。在pH2.5、3.0和4.0时估算的莫纳甜甜度的半衰期分别为65天、115天和230天。相同条件下估算的阿斯巴特的半衰期为55天、75天和140天。
因此，在酸性条件并于40℃出，莫纳甜可比阿斯巴特更加稳定地输送甜味。
实施例23：制造赤藓醇/莫纳甜颗粒
在40℃下在小的容器内制备2000克赤藓醇、16克R，R莫纳甜和5升水的溶液。在流化床的篮子中加入58千克赤藓醇。流化床的空气温度设为65℃。以25kg/hr的速度在流化床中喷洒莫纳甜/赤藓醇溶液17分钟。需要再加热20分钟以使粉末干燥。产品通过1250mm的筛子。也可参见EP 0 325 790B1(Mitsubishi，Nikken 1993)。计算出的莫纳甜/赤藓醇产品的相对甜度(与蔗糖相比)约为1.10。用两份莫纳甜/赤藓醇样品和一份莫纳甜/麦芽糊精样品进行三角试验。三角试验是本领域已知的。预计用莫纳甜/赤藓醇制成的即用型立方体的颜色和结晶质量与蔗糖接近。
实施例24：莫纳甜立体异构体的层析
样品制备—在微离心管中放入约50-75μg冻干物质。在其中加入1.0mL HPLC级甲醇。将溶液涡漩搅拌30分钟，离心并取出等分量上清进行分析。
反相HPLC—用2.1×250mm XterraTM MS C8 5μm(Waters Corporation)HPLC柱进行层析获得两个分离的非对映体峰(R，R/S，S和R，S/S，R)。用Micromass的UltimaTM三重四极质谱仪进行检测。流动相进行以下梯度：
时间(分钟)              0       9       16       20       21
0.05％TFA        A％    95      65      10       10       95
甲醇，0.05％TFA  B％    5       35      90       90       5
流速mL/min              0.25    0.25    0.25     0.25     0.25
手性HPLC—用250×4.6mm Chirobiotic T(Advanced Separations Technologies，Inc.)HPLC柱进行层析获得两个清楚的莫纳甜立体异构体(R，R和S，S)。用Micromass的UltimaTM三重四极质谱仪进行检测。流动相由甲醇和0.2％乙酸以及0.05％氨水构成。
质谱(MS/MS)—通过选择反应监控(SRM，Selected Reaction Monitoring)实验检测莫纳甜的存在。质子化的莫纳甜分子离子([M+H]+)的m/z＝293.3。断裂该分子离子产生m/z＝257.3的显著离子，这是将分子离子多次脱水得到的。这种转变是莫纳甜特有的并选择作为转变(293.3至257.3)在SRM实验过程中加以监测。这种检测方法可用于莫纳甜的反相和手性分离。
结果—用反相HPLC评价R，S/S，R和S，S/R，R标准样品。通过衍生和酶法拆分制备样品。标准溶液的色谱图示于图17。反相分析之后进行手性层析以评估样品内存在的特定异构体。标准S，S和R，R莫纳甜溶液的手性层析示于图18。
实施例25：莫纳甜在高温(80℃)和中性pH下的稳定性
使用pH7下的100毫升75ppm的莫纳甜溶液作为原料溶液。所述合成的莫纳甜样品包含约96％的2R、4R/2S、4S对映体对和4％的2R、4S/2S、4R对映体对。在整个试验过程中，将所述样品保温在80℃和pH7的条件下，在0、1、2、3、4小时和1、2、4、7、14、21和35天时抽取样品。所有试验条件均一式两份进行。
使用LC-MS并使用反相色谱法进行分离和定量—建立合成莫纳甜的两个测定的非对映体峰的响应曲线。5-150ppm的范围与溶解在去离子水中的合成莫纳甜标准物并列。使用3.9×150mm的Novapak C18(Waters Corporation)HPLC柱来完成两个非对映体峰的分离。串联使用紫外-可见(UV)和质谱仪(MS)来进行检测和定量。莫纳甜及其内酯的峰各自在279nm处具有Uvmax，这有助于精确检测。通过正离子电喷模式获得293.3m/z和275.3m/z的选择性离子监控(SIM)扫描来进行定量。
结果—在中性pH(对烘焙和餐后甜点来说是常见的)下，即使在7-35天之后，莫纳甜的降解程度也不明显。莫纳甜随时间变化而消失的程度取决于pH，这是因为所述主要副产物是环化以及可能出现的很少量的外消旋作用。在80℃和pH7的实验过程中，在使用LC-MS进行定量检测所达到的精确度范围内没有检测到外消旋RR/SS莫纳甜或其内酯的浓度出现变化。基于这一数据，可知在高温和中性pH条件下，莫纳甜的稳定性对于烘焙来说是可以接受的。
考虑到应用本文所述原理的许多可能实施方式，应意识到所述实施方式仅是本公开的具体实施例，决不是限制本公开的范围。例如，从本公开所述内容来看，莫纳甜甜味剂组合物可以制成液体浓缩形式而不仅仅是固体形式，这一点对本领域技术人员来说是显而易见的；其中，所选体积的液体浓缩液(例如1mL或0.35mL)将具有和所选量(例如2茶匙)的颗粒糖相当的甜度。
                                   序列表
<110>嘉吉有限公司(Cargill，Incorporated)
<120>多肽和生物合成途径
<130>6682-64349
<150>60/374,831
<151>2002-04-23
<160>74
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>1170
<212>DNA
<213>苜蓿根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)
<400>1
atgttcgacg ccctcgcccg ccaagccgac gatcccttgc ttttcctgat cggcctgttc      60
aggaaggatg agcgccccgg aaaggtcgat ctcggcgtag gagtctatcg cgacgagacc     120
ggacgcacgc cgatcttccg ggccgtcaag gcggcggaaa agcggcttct cgaaacacag     180
gacagcaagg cctatatcgg ccccgaaggg gacctcgtct ttctcgatcg gctctgggaa     240
ctcgtcggcg gcgacacgat cgagcggagc catgttgcgg gcgtccagac gcccggcggc     300
tccggcgcgc tccgtttggc ggcggacctc atcgcccgca tgggcggccg aggcatctgg     360
ctcgggctgc cgagctggcc gaaccacgcg ccgatcttca aggcggccgg gctcgatatc     420
gccacctacg acttcttcga cattccgtcg cagtcggtca tcttcgataa tctggtgagc     480
gcgctggaag gcgccgcatc cggcgatgcg gtgctgctgc atgcaagctg ccacaacccg     540
accggcggcg tcctgagcga agcacaatgg atggagatcg ccgcgctggt ggccgagcgc     600
ggcctgctgc cgctcgtcga tctcgcctat caggggttcg gccgcggcct cgaccaggat     660
gtcgcgggcc tccggcatct tctcggcgtg gtcccggaag cgctcgtcgc ggtttcctgc     720
tcgaagtcct tcgggcttta tcgcgagcgc gcgggcgcga tcttcgcgcg gaccagctcg     780
actgcctcgg cggacagggt gcgctcaaac ctcgcgggcc tcgcacgcac cagctattcc     840
atgccgccgg atcacggcgc agccgtcgtg cggacgatcc ttgacgaccc ggaactcagg     900
cgcgactgga cggaggagct cgagacgatg cggctcagga tgacgggcct ccggcggtcg     960
cttgccgagg gactccgcac ccgctggcag agcctcggcg cagtcgccga tcaggagggc    1020
atgttctcca tgctgccgct ttccgaagcg gaggttatgc ggctcaggac cgagcacggc    1080
atctatatgc cggcatccgg ccgcatcaac atcgccgggc tgaagacggc ggaagccgcc    1140
gagattgccg gcaagttcac cagtctctga                                     1170
<210>2
<211>389
<212>PRT
<213>苜蓿根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)
<400>2
Met Phe Asp Ala Leu Ala Arg Gln Ala Asp Asp Pro Leu Leu Phe Leu
1               5                   10                  15
Ile Gly Leu Phe Arg Lys Asp Glu Arg Pro Gly Lys Val Asp Leu Gly
            20                  25                  30
Val Gly Val Tyr Arg Asp Glu Thr Gly Arg Thr Pro Ile Phe Arg Ala
        35                  40                  45
Val Lys Ala Ala Glu Lys Arg Leu Leu Glu Thr Gln Asp Ser Lys Ala
    50                  55                  60
Tyr Ile Gly Pro Glu Gly Asp Leu Val Phe Leu Asp Arg Leu Trp Glu
65                  70                  75                  80
Leu Val Gly Gly Asp Thr Ile Glu Arg Ser His Val Ala Gly Val Gln
                85                      90                  95
Thr Pro Gly Gly Ser Gly Ala Leu Arg Leu Ala Ala Asp Leu Ile Ala
            100                     105                 110
Arg Met Gly Gly Arg Gly Ile Trp Leu Gly Leu Pro Ser Trp Pro Asn
        115                 120                 125
His Ala Pro Ile Phe Lys Ala Ala Gly Leu Asp Ile Ala Thr Tyr Asp
    130                 135                 140
Phe Phe Asp Ile Pro Ser Gln Ser Val Ile Phe Asp Asn Leu Val Ser
145                 150                 155                 160
Ala Leu Glu Gly Ala Ala Ser Gly Asp Ala Val Leu Leu His Ala Ser
                165                 170                 175
Cys His Asn Pro Thr Gly Gly Val Leu Ser Glu Ala Gln Trp Met Glu
            180                 185                 190
Ile Ala Ala Leu Val Ala Glu Arg Gly Leu Leu Pro Leu Val Asp Leu
        195                 200                 205
Ala Tyr Gln Gly Phe Gly Arg Gly Leu Asp Gln Asp Val Ala Gly Leu
    210                 215                 220
Arg His Leu Leu Gly Val Val Pro Glu Ala Leu Val Ala Val Ser Cys
225                 230                 235                 240
Ser Lys Ser Phe Gly Leu Tyr Arg Glu Arg Ala Gly Ala Ile Phe Ala
                245                 250                 255
Arg Thr Ser Ser Thr Ala Ser Ala Asp Arg Val Arg Ser Asn Leu Ala
            260                 265                 270
Gly Leu Ala Arg Thr Ser Tyr Ser Met Pro Pro Asp His Gly Ala Ala
        275                 280                 285
Val Val Arg Thr Ile Leu Asp Asp Pro Glu Leu Arg Arg Asp Trp Thr
    290                 295                 300
Glu Glu Leu Glu Thr Met Arg Leu Arg Met Thr Gly Leu Arg Arg Ser
305                 310                 315                 320
Leu Ala Glu Gly Leu Arg Thr Arg Trp Gln Ser Leu Gly Ala Val Ala
                325                 330                 335
Asp Gln Glu Gly Met Phe Ser Met Leu Pro Leu Ser Glu Ala Glu Val
            340                 345                 350
Met Arg Leu Arg Thr Glu His Gly Ile Tyr Met Pro Ala Ser Gly Arg
        355                 360                 365
Ile Asn Ile Ala Gly Leu Lys Thr Ala Glu Ala Ala Glu Ile Ala Gly
    370                 375                 380
Lys Phe Thr Ser Leu
385
<210>3
<211>1260
<212>DNA
<213>类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)
<400>3
atgcgctcta cgacggctcc tggtccgagt ggggcatgta tgacgatctc aaggtcgcga      60
aaggatgacg aaggaatgct gaccgccctg aagccgcagc ccgcggacaa gatcctgcaa     120
ctgatccaga tgttccgcga ggatgcgcgc gcggacaaga tcgatctggg cgtgggcgtc     180
tacaaggacc cgaccgggct caccccggtc atgcgggccg tgaaggcggc cgagaagcgg     240
ctctgggagg tcgagaccac caagacctac accggccttg ccgacgagcc ggcctacaat     300
gccgcgatgg cgaagctgat cctcgcgggc gcggtcccgg ccgaccgggt ggcctcggtc     360
gccacccccg gcggcacggg cgcggtgcgt caggcgctcg agctgatccg catggcctcg     420
cccgaggcca ccgtctggat ctcgaacccg acctggccga accatctgtc gatcgtgaaa     480
tatctcggca tcccgatgcg ggaataccgc tatttcgacg ccgagaccgg cgccgtcgat     540
gccgagggca tgatggagga tctggcccag gtgaaggcgg gcgacgtggt gctgctgcac     600
ggctgctgcc acaacccgac cggcgccaac ccgaacccgg tgcagtggct ggccatctgc     660
gagagcctgg cccggacagg cgcggtgccg ctgatcgacc tcgcctatca gggcttcggc     720
gacgggctcg agatggatgc ggcggcgacg cggcttctgg ccaccagact gcccgaggtg     780
ctgatcgcgg cctcctgctc gaagaacttc ggcatctacc gcgagcgcac gggcatcctg     840
atcgccatcg gcgaggcggc gggccggggc acggtgcagg ccaacctcaa cttcctgaac     900
cggcagaact actccttccc gccggaccat ggcgcgcggc tcgtgaccat gatcctcgag     960
gacgagacgc tgagcgccga ctggaaggcg gaactcgagg aggtgcggct caacatgctg    1020
acactgcgcc gccagcttgc cgatgcgctg caggccgaga ccggctcgaa ccgcttcggc    1080
ttcgtggccg agcatcgcgg catgttctcg cgcctcggga tcacgcccgc cgaggtggag    1140
cggctgcgga ccgagcacgg ggtctacatg gtgggcgatt cgcggctgaa catcgcgggg    1200
ctgaaccgga cgaccgtgcc ggtgctggcg cgcgcggtgg ccaaggtgct gcgcggctga    1260
<210>4
<211>419
<212>PRT
<212>类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)
<400>4
Met Arg Ser Thr Thr Ala Pro Gly Pro Ser Gly Ala Cys Met Thr Ile
1               5                   10                  15
Ser Arg Ser Arg Lys Asp Asp Glu Gly Met Leu Thr Ala Leu Lys Pro
            20                  25                  30
Gln Pro Ala Asp Lys Ile Leu Gln Leu Ile Gln Met Phe Arg Glu Asp
        35                  40                  45
Ala Arg Ala Asp Lys Ile Asp Leu Gly Val Gly Val Tyr Lys Asp Pro
    50                  55                  60
Thr Gly Leu Thr Pro Val Met Arg Ala Val Lys Ala Ala Glu Lys Arg
65                  70                  75                  80
Leu Trp Glu Val Glu Thr Thr Lys Thr Tyr Thr Gly Leu Ala Asp Glu
                85                  90                  95
Pro Ala Tyr Asn Ala Ala Met Ala Lys Leu Ile Leu Ala Gly Ala Val
            100                 105                 110
Pro Ala Asp Arg Val Ala Ser Val Ala Thr Pro Gly Gly Thr Gly Ala
        115                 120                 125
Val Arg Gln Ala Leu Glu Leu Ile Arg Met Ala Ser Pro Glu Ala Thr
    130                 135                 140
Val Trp Ile Ser Asn Pro Thr Trp Pro Asn His Leu Ser Ile Val Lys
145                 150                 155                 160
Tyr Leu Gly Ile Pro Met Arg Glu Tyr Arg Tyr Phe Asp Ala Glu Thr
                165                 170                 175
Gly Ala Val Asp Ala Glu Gly Met Met Glu Asp Leu Ala Gln Val Lys
            180                 185                 190
Ala Gly Asp Val Val Leu Leu His Gly Cys Cys His Asn Pro Thr Gly
        195                 200                 205
Ala Asn Pro Asn Pro Val Gln Trp Leu Ala Ile Cys Glu Ser Leu Ala
    210                 215                 220
Arg Thr Gly Ala Val Pro Leu Ile Asp Leu Ala Tyr Gln Gly Phe Gly
225                 230                 235                 240
Asp Gly Leu Glu Met Asp Ala Ala Ala Thr Arg Leu Leu Ala Thr Arg
                245                 250                 255
Leu Pro Glu Val Leu Ile Ala Ala Ser Cys Ser Lys Asn Phe Gly Ile
            260                 265                 270
Tyr Arg Glu Arg Thr Gly Ile Leu Ile Ala Ile Gly Glu Ala Ala Gly
        275                 280                 285
Arg Gly Thr Val Gln Ala Asn Leu Asn Phe Leu Asn Arg Gln Asn Tyr
    290                 295                 300
Ser Phe Pro Pro Asp His Gly Ala Arg Leu Val Thr Met Ile Leu Glu
305                 310                 315                 320
Asp Glu Thr Leu Ser Ala Asp Trp Lys Ala Glu Leu Glu Glu Val Arg
                325                 330                 335
Leu Asn Met Leu Thr Leu Arg Arg Gln Leu Ala Asp Ala Leu Gln Ala
            340                 345                 350
Glu Thr Gly Ser Asn Arg Phe Gly Phe Val Ala Glu His Arg Gly Met
        355                 360                 365
Phe Ser Arg Leu Gly Ile Thr Pro Ala Glu Val Glu Arg Leu Arg Thr
    370                 375                 380
Glu His Gly Val Tyr Met Val Gly Asp Ser Arg Leu Asn Ile Ala Gly
385                 390                 395                 400
Leu Asn Arg Thr Thr Val Pro Val Leu Ala Arg Ala Val Ala Lys Val
                405                 410                 415
Leu Arg Gly
<210>5
<211>1260
<212>DNA
<213>类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)
<400>5
atgcgctcta cgacggctcc tggtccgagt ggggcatgta tgacgatctc aaggtcgcga     60
aaggatgacg aaggaatgct gaccgccctg aagccgcagc ccgcggacaa gatcctgcaa    120
ctgatccaga tgttccgcga ggatgcgcgc gcggacaaga tcgatctggg cgtgggcgtc    180
tacaaggacc cgaccgggct caccccggtc atgcgggccg tgaaggccgc cgagaagcgg    240
ctctgggagg tcgagaccac caagacctac accggccttg ccggcgagcc cgcctacaat    300
gccgcgatgg cgaagctgat cctcgcaggc gcggtcccgg ccgaccgggt ggcctcggtc    360
gccacccccg gcggcacggg cgcggtgcgt caggcgctcg agctgatccg catggcctcg    420
cccgaggcca ctgtctggat ctcgaacccg acctggccga accatctgtc gatcgtgaaa    480
tatctcggca tcccgatgcg ggaataccgc tatttcgacg ccgagaccgg cgccgtcgat    540
gccgagggct tgatggagga tctggcccag gtgaaggcgg gcgacgtggt gctgctgcac    600
ggctgctgcc acaacccgac cggcgccaac ccgaacccgg tgcagtggct ggccgtctgc    660
gagagcctgg cccggacagg cgcggtgccg ctgatcgacc tcgcctatca gggcttcggc    720
gacgggctcg agatggatgc ggcggcgacg cggcttctgg ccaccagact gcccgaggtg     780
ctgatcgcgg cctcctgctc gaagaacttc ggcatctacc gcgagcgaac gggcatcctg     840
atcgccatcg gcgaggcggc gggccggggc acggtgcagg ccaacctcaa cttcctgaac     900
cggcagaact actccttccc gccggaccat ggcgcgcggc tcgtgaccat gatcctcgag     960
gacgagacgc tgagcgccga ctggaaggcg gaactcgagg aggtgcggct caacatgctg    1020
acgctgcgcc gccagcttgc cgatgcgctg caggccgaga ccggctcgaa ccgcttcggc    1080
ttcgtggccg agcatcgcgg catgttctcg cgcctcggga tcacgcccgc cgaggtggag    1140
cggctgcgga ccgagcacgg ggtctacatg gtgggcgatt cgcggctgaa catcgcgggg    1200
ctgaaccgga cgaccgtgcc ggtgctggcg cgcgcggtgg ccaaggtgct gcgcggctga    1260
<210>6
<211>419
<212>PRT
<213>类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)
<400>6
Met Arg Ser Thr Thr Ala Pro Gly Pro Ser Gly Ala Cys Met Thr Ile
1               5                   10                  15
Ser Arg Ser Arg Lys Asp Asp Glu Gly Met Leu Thr Ala Leu Lys Pro
            20                  25                  30
Gln Pro Ala Asp Lys Ile Leu Gln Leu Ile Gln Met Phe Arg Glu Asp
        35                  40                  45
Ala Arg Ala Asp Lys Ile Asp Leu Gly Val Gly Val Tyr Lys Asp Pro
    50                  55                  60
Thr Gly Leu Thr Pro Val Met Arg Ala Val Lys Ala Ala Glu Lys Arg
65                  70                  75                  80
Leu Trp Glu Val Glu Thr Thr Lys Thr Tyr Thr Gly Leu Ala Gly Glu
                85                  90                  95
Pro Ala Tyr Asn Ala Ala Met Ala Lys Leu Ile Leu Ala Gly Ala Val
            100                 105                 110
Pro Ala Asp Arg Val Ala Ser Val Ala Thr Pro Gly Gly Thr Gly Ala
        115                 120                 125
Val Arg Gln Ala Leu Glu Leu Ile Arg Met Ala Ser Pro Glu Ala Thr
    130                 135                 140
Val Trp Ile Ser Asn Pro Thr Trp Pro Asn His Leu Ser Ile Val Lys
145                 150                 155                 160
Tyr Leu Gly Ile Pro Met Arg Glu Tyr Arg Tyr Phe Asp Ala Glu Thr
                165                 170                 175
Gly Ala Val Asp Ala Glu Gly Leu Met Glu Asp Leu Ala Gln Val Lys
            180                 185                 190
Ala Gly Asp Val Val Leu Leu His Gly Cys Cys His Asn Pro Thr Gly
        195                 200                 205
Ala Asn Pro Asn Pro Val Gln Trp Leu Ala Val Cys Glu Ser Leu Ala
    210                 215                 220
Arg Thr Gly Ala Val Pro Leu Ile Asp Leu Ala Tyr Gln Gly Phe Gly
225                 230                 235                 240
Asp Gly Leu Glu Met Asp Ala Ala Ala Thr Arg Leu Leu Ala Thr Arg
                245                 250                 255
Leu Pro Glu Val Leu Ile Ala Ala Ser Cys Ser Lys Asn Phe Gly Ile
            260                 265                 270
Tyr Arg Glu Arg Thr Gly Ile Leu Ile Ala Ile Gly Glu Ala Ala Gly
        275                 280                 285
Arg Gly Thr Val Gln Ala Asn Leu Asn Phe Leu Asn Arg Gln Asn Tyr
    290                 295                 300
Ser Phe Pro Pro Asp His Gly Ala Arg Leu Val Thr Met Ile Leu Glu
305                 310                 315                 320
Asp Glu Thr Leu Ser Ala Asp Trp Lys Ala Glu Leu Glu Glu Val Arg
                325                 330                 335
Leu Asn Met Leu Thr Leu Arg Arg Gln Leu Ala Asp Ala Leu Gln Ala
            340                 345                 350
Glu Thr Gly Ser Asn Arg Phe Gly Phe Val Ala Glu His Arg Gly Met
        355                 360                 365
Phe Ser Arg Leu Gly Ile Thr Pro Ala Glu Val Glu Arg Leu Arg Thr
    370                 375                 380
Glu His Gly Val Tyr Met Val Gly Asp Ser Arg Leu Asn Ile Ala Gly
385                 390                 395                 400
Leu Asn Arg Thr Thr Val Pro Val Leu Ala Arg Ala Val Ala Lys Val
                405                 410                 415
Leu Arg Gly
<210>7
<211>1239
<212>DNA
<213>硕大利什曼原虫(Leishmania major)
<400>7
atgtccatgc aggcggccat gaccacggcg gagcgctggc agaagattca ggcacaagct      60
cccgatgtca tcttcgatct cgcaaaacgc gccgccgctg ccaagggccc caaggccaac     120
ctcgtcattg gtgcctaccg cgacgagcag ggccgtccct atccgctacg cgtggtccgc     180
aaggctgagc agcttctctt ggacatgaat ctcgactacg agtacctacc catctcgggc     240
taccagccct tcatcgatga ggcggtaaag attatctacg gcaataccgt cgagctggag     300
aacctggttg cggtgcagac gctgagcggg accggtgctg tctctctcgg ggcgaagctg     360
ctgactcgcg tcttcgacgc tgagacgacg cccatctacc tttccgaccc cacgtggccc     420
aaccactacg gcgtcgtgaa ggctgctggc tggaagaaca tctgcacgta cgcctactac     480
gaccccaaga cggtcagcct gaatttcgag ggcatgaaga aagacattct ggcggcgccg     540
gacggctccg tgttcattct gcaccagtgc gcgcacaacc ccaccggcgt ggacccgtcg     600
caggagcagt ggaacgagat cgcgtcactg atgctggcca agcaccatca ggtgttcttc     660
gactccgcct accaaggcta tgcgagcggc agcctcgaca cggacgcgta tgctgcccgc     720
ctgtttgccc gccgcggcat cgaggtactg ctggcgcagt cgttctccaa gaacatgggc     780
ttgtacagcg agcgtgcagg cacgctgtcg ctgctcctca aggacaagac gaagcgcgcg     840
gatgtaaaga gcgtgatgga ttcgctgatc cgtgaggagt acacgtgccc cccagcccac     900
ggtgcccgct tagcccacct aatcctgagc aacaacgaac tgcgaaagga gtgggaggca     960
gagctatcag ccatggcaga gcgcatccgt acgatgcgcc gcaccgtgta cgacgagctg    1020
ctgcgcctgc agacgcccgg gagctgggaa catgtcatta accagattgg catgttttcc    1080
ttcctcgggc tgtcaaaggc gcagtgcgaa tactgccaaa accacaacat cttcatcaca    1140
gtgtcgggcc gcgctaacat ggcaggtctg acgcatgaga cggcgctgat gctagcacag    1200
acgatcaacg atgctgtgcg caatgtgaat cgtgagtga                           1239
<210>8
<211>412
<212>PRT
<213>硕大利什曼原虫(Leishmania major)
<400>8
Met Ser Met Gln Ala Ala Met Thr Thr Ala Glu Arg Trp Gln Lys Ile
1               5                   10                  15
Gln Ala Gln Ala Pro Asp Val Ile Phe Asp Leu Ala Lys Arg Ala Ala
            20                  25                  30
Ala Ala Lys Gly Pro Lys Ala Asn Leu Val Ile Gly Ala Tyr Arg Asp
        35                  40                  45
Glu Gln Gly Arg Pro Tyr Pro Leu Arg Val Val Arg Lys Ala Glu Gln
    50                  55                  60
Leu Leu Leu Asp Met Asn Leu Asp Tyr Glu Tyr Leu Pro Ile Ser Gly
 65                 70                  75                  80
Tyr Gln Pro Phe Ile Asp Glu Ala Val Lys Ile Ile Tyr Gly Asn Thr
                85                  90                  95
Val Glu Leu Glu Asn Leu Val Ala Val Gln Thr Leu Ser Gly Thr Gly
            100                 105                 110
Ala Val Ser Leu Gly Ala Lys Leu Leu Thr Arg Val Phe Asp Ala Glu
        115                 120                 125
Thr Thr Pro Ile Tyr Leu Ser Asp Pro Thr Trp Pro Asn His Tyr Gly
    130                 135                 140
Val Val Lys Ala Ala Gly Trp Lys Asn Ile Cys Thr Tyr Ala Tyr Tyr
145                 150                 155                 160
Asp Pro Lys Thr Val Ser Leu Asn Phe Glu Gly Met Lys Lys Asp Ile
                165                 170                 175
Leu Ala Ala Pro Asp Gly Ser Val Phe Ile Leu His Gln Cys Ala His
            180                 185                 190
Asn Pro Thr Gly Val Asp Pro Ser Gln Glu Gln Trp Asn Glu Ile Ala
        195                 200                 205
Ser Leu Met Leu Ala Lys His His Gln Val Phe Phe Asp Ser Ala Tyr
    210                 215                 220
Gln Gly Tyr Ala Ser Gly Ser Leu Asp Thr Asp Ala Tyr Ala Ala Arg
225                 230                 235                 240
Leu Phe Ala Arg Arg Gly Ile Glu Val Leu Leu Ala Gln Ser Phe Ser
                245                 250                 255
Lys Asn Met Gly Leu Tyr Ser Glu Arg Ala Gly Thr Leu Ser Leu Leu
            260                 265                 270
Leu Lys Asp Lys Thr Lys Arg Ala Asp Val Lys Ser Val Met Asp Ser
        275                 280                 285
Leu Ile Arg Glu Glu Tyr Thr Cys Pro Pro Ala His Gly Ala Arg Leu
    290                 295                 300
Ala His Leu Ile Leu Ser Asn Asn Glu Leu Arg Lys Glu Trp Glu Ala
305                 310                 315                 320
Glu Leu Ser Ala Met Ala Glu Arg Ile Arg Thr Met Arg Arg Thr Val
                325                 330                 335
Tyr Asp Glu Leu Leu Arg Leu Gln Thr Pro Gly Ser Trp Glu His Val
            340                 345                 350
Ile Asn Gln Ile Gly Met Phe Ser Phe Leu Gly Leu Ser Lys Ala Gln
        355                 360                 365
Cys Glu Tyr Cys Gln Asn His Asn Ile Phe Ile Thr Val Ser Gly Arg
    370                 375                 380
Ala Asn Met Ala Gly Leu Thr His Glu Thr Ala Leu Met Leu Ala Gln
385                 390                 395                 400
Thr Ile Asn Asp Ala Val Arg Asn Val Asn Arg Glu
                405                 410
<210>9
<211>1182
<212>DNA
<213>枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
<400>9
atggaacatt tgctgaatcc gaaagcaaga gagatcgaaa tttcaggaat acgcaaattc      60
tcgaatcttg tagcccaaca cgaagacgtc atttcactta caatcggcca gcctgatttt     120
ttcacaccgc atcatgtgaa agctgccgca aaaaaagcca ttgatgaaaa cgtgacgtca     180
tatactccga atgccggcta cctggagctg agacaagctg tgcagcttta tatgaagaaa     240
aaagcggatt tcaactatga tgctgaatct gaaattatca tcacaacagg cgcaagccaa     300
gccattgatg ctgcattccg gacgatttta tctcccggtg atgaagtcat tatgccaggg     360
cctatttatc cgggctatga acctattatc aatttgtgcg gggccaagcc tgtcattgtt     420
gatactacgt cacacggctt taagcttacc gcccggctga ttgaagatgc tctgacaccc     480
aacaccaagt gtgtcgtgct tccttatccg tcaaacccta ccggcgtgac tttatctgaa     540
gaagaactga aaagcatcgc agctctctta aaaggcagaa atgtcttcgt attgtctgat     600
gaaatataca gtgaattaac atatgacaga ccgcattact ccatcgcaac ctatttgcgg     660
gatcaaacga ttgtcattaa cgggttgtca aaatcacaca gcatgaccgg ttggagaatt     720
ggatttttat ttgcaccgaa agacattgca aagcacattt taaaggttca tcaatacaat     780
gtgtcgtgcg cctcatccat ttctcaaaaa gccgcgcttg aagctgtcac aaacggcttt     840
gacgatgcat tgattatgag agaacaatac aaaaaacgtc tggactatgt ttatgaccgt     900
cttgtttcca tgggacttga cgtagttaaa ccgtccggtg cgttttatat cttcccttct     960
attaaatcat ttggaatgac ttcatttgat tttagtatgg ctcttttgga agacgctggc    1020
gtggcactcg tgccgggcag ctcgttctca acatatggtg aaggatatgt aaggctgtct    1080
tttgcatgct caatggacac gctgagagaa ggcctagacc gtttagaatt atttgtatta    1140
aaaaaacgtg aagcaatgca gacgataaac aacggcgttt aa                       1182
<210>10
<211>393
<212>PRT
<213>枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
<400>10
Met Glu His Leu Leu Asn Pro Lys Ala Arg Glu Ile Glu Ile Ser Gly
1               5                   10                  15
Ile Arg Lys Phe Ser Asn Leu Val Ala Gln His Glu Asp Val Ile Ser
            20                 25                 30
Leu Thr Ile Gly Gln Pro Asp Phe Phe Thr Pro His His Val Lys Ala
        35                  40                  45
Ala Ala Lys Lys Ala Ile Asp Glu Asn Val Thr Ser Tyr Thr Pro Asn
    50                  55                  60
Ala Gly Tyr Leu Glu Leu Arg Gln Ala Val Gln Leu Tyr Met Lys Lys
65                  70                  75                  80
Lys Ala Asp Phe Asn Tyr Asp Ala Glu Ser Glu Ile Ile Ile Thr Thr
                85                  90                  95
Gly Ala Ser Gln Ala Ile Asp Ala Ala Phe Arg Thr Ile Leu Ser Pro
            100                 105                 110
Gly Asp Glu Val Ile Met Pro Gly Pro Ile Tyr Pro Gly Tyr Glu Pro
        115                 120                 125
Ile Ile Asn Leu Cys Gly Ala Lys Pro Val Ile Val Asp Thr Thr Ser
    130                 135                 140
His Gly Phe Lys Leu Thr Ala Arg Leu Ile Glu Asp Ala Leu Thr Pro
145                 150                 155                 160
Asn Thr Lys Cys Val Val Leu Pro Tyr Pro Ser Asn Pro Thr Gly Val
                165                 170                 175
Thr Leu Ser Glu Glu Glu Leu Lys Ser Ile Ala Ala Leu Leu Lys Gly
            180                 185                 190
Arg Asn Val Phe Val Leu Ser Asp Glu Ile Tyr Ser Glu Leu Thr Tyr
        195                 200                 205
Asp Arg Pro His Tyr Ser Ile Ala Thr Tyr Leu Arg Asp Gln Thr Ile
    210                 215                 220
Val Ile Asn Gly Leu Ser Lys Ser His Ser Met Thr Gly Trp Arg Ile
225                 230                 235                 240
Gly Phe Leu Phe Ala Pro Lys Asp Ile Ala Lys His Ile Leu Lys Val
                245                 250                 255
His Gln Tyr Asn Val Ser Cys Ala Ser Ser Ile Ser Gln Lys Ala Ala
            260                 265                 270
Leu Glu Ala Val Thr Asn Gly Phe Asp Asp Ala Leu Ile Met Arg Glu
        275                 280                 285
Gln Tyr Lys Lys Arg Leu Asp Tyr Val Tyr Asp Arg Leu Val Ser Met
    290                 295                 300
Gly Leu Asp Val Val Lys Pro Ser Gly Ala Phe Tyr Ile Phe Pro Ser
305                 310                 315                 320
Ile Lys Ser Phe Gly Met Thr Ser Phe Asp Phe Ser Met Ala Leu Leu
                325                 330                 335
Glu Asp Ala Gly Val Ala Leu Val Pro Gly Ser Ser Phe Ser Thr Tyr
            340                 345                 350
Gly Glu Gly Tyr Val Arg Leu Ser Phe Ala Cys Ser Met Asp Thr Leu
        355                 360                 365
Arg Glu Gly Leu Asp Arg Leu Glu Leu Phe Val Leu Lys Lys Arg Glu
    370                 375                 380
Ala Met Gln Thr Ile Asn Asn Gly Val
385                 390
<210>11
<211>1176
<212>DNA
<213>嗜淀粉乳杆菌(Lactobacillus amylovorus)
<400>11
atgccagaat tagctaatga tttaggatta agcaaaaaga tcactgatgt aaaagcttca      60
ggaattagaa tctttgataa caaagtttca gctattcctg gcattatcaa attgactttg     120
ggtgaaccag atatgaatac tcctgagcat gttaagcaag cggctattaa gaatattgca     180
gataatgatt cacactatgc tccacaaaag ggaaagcttg aattaagaaa agctatcagt     240
aaatatttga aaaagattac tggaattgaa tatgatccag aaacagaaat cgtagtaaca     300
gttggtgcaa ctgaagcaat taacgctacc ttgtttgcta ttactaatcc gggtgacaag     360
gttgcaattc ctacgccagt cttttctcta tattggcccg tggctacact tgctgatgcc     420
gattatgttt tgatgaatac tgcagaagat ggttttaagt taacacctaa gaagttagaa     480
gaaactatca aagaaaatcc aacaattaaa gcagtaattt tgaattatcc aactaaccca     540
actggtgttg aatatagcga agatgaaatt aaagctttgg ctaaggtaat taaagataat     600
catctgtacg taattaccga tgaaatttac agtactttga cttacggtgt aaaacacttt     660
tcaattgcca gcttaattcc agaaagagca atttatatct ctggtttatc taaatcacat     720
gcgatgactg gttatcgttt aggctatgtt gccggacctg caaaaattat ggcagaaatt     780
ggtaaagttc atggccttat ggtgacgact acgacggatt catcacaagc tgccgcaatt     840
gaagcacttg aacacggact tgatgaccct gagaaatata gggaagttta tgaaaagcgt     900
cgtgactatg ttttaaagga attagccgag atagagatgc aagcagttaa gccagaaggt     960
gcattttata tctttgctaa aattccagct aagtatggca aagacgatat gaaatttgcc    1020
ttggatttag cttttaaaga aaaagtgggt atcactccag gtagtgcatt tggtcctggt    1080
ggtgaaggtc atattagatt atcttatgca tcaagtgatg aaaacttgca tgaggcaatg    1140
aagcgaatga agaaagtttt acaagaggac gaataa                              1176
<210>12
<211>391
<212>PRT
<213>嗜淀粉乳杆菌(Lactobacillus amylovorus)
<400>12
Met Pro Glu Leu Ala Asn Asp Leu Gly Leu Ser Lys Lys Ile Thr Asp
1               5                   10                  15
Val Lys Ala Ser Gly Ile Arg Ile Phe Asp Asn Lys Val Ser Ala Ile
            20                  25                  30
Pro Gly Ile Ile Lys Leu Thr Leu Gly Glu Pro Asp Met Asn Thr Pro
        35                  40                  45
Glu His Val Lys Gln Ala Ala Ile Lys Asn Ile Ala Asp Asn Asp Ser
    50                  55                  60
His Tyr Ala Pro Gln Lys Gly Lys Leu Glu Leu Arg Lys Ala Ile Ser
65                  70                  75                  80
Lys Tyr Leu Lys Lys Ile Thr Gly Ile Glu Tyr Asp Pro Glu Thr Glu
                85                  90                  95
Ile Val Val Thr Val Gly Ala Thr Glu Ala Ile Asn Ala Thr Leu Phe
            100                 105                 110
Ala Ile Thr Asn Pro Gly Asp Lys Val Ala Ile Pro Thr Pro Val Phe
        115                 120                 125
Ser Leu Tyr Trp Pro Val Ala Thr Leu Ala Asp Ala Asp Tyr Val Leu
    130                 135                 140
Met Asn Thr Ala Glu Asp Gly Phe Lys Leu Thr Pro Lys Lys Leu Glu
145                 150                 155                 160
Glu Thr Ile Lys Glu Asn Pro Thr Ile Lys Ala Val Ile Leu Asn Tyr
                165                 170                 175
Pro Thr Asn Pro Thr Gly Val Glu Tyr Ser Glu Asp Glu Ile Lys Ala
            180                 185                 190
Leu Ala Lys Val Ile Lys Asp Asn His Leu Tyr Val Ile Thr Asp Glu
        195                 200                 205
Ile Tyr Ser Thr Leu Thr Tyr Gly Val Lys His Phe Ser Ile Ala Ser
    210                 215                 220
Leu Ile Pro Glu Arg Ala Ile Tyr Ile Ser Gly Leu Ser Lys Ser His
225                 230                 235                 240
Ala Met Thr Gly Tyr Arg Leu Gly Tyr Val Ala Gly Pro Ala Lys Ile
                245                 250                 255
Met Ala Glu Ile Gly Lys Val His Gly Leu Met Val Thr Thr Thr Thr
            260                 265                 270
Asp Ser Ser Gln Ala Ala Ala Ile Glu Ala Leu Glu His Gly Leu Asp
        275                 280                 285
Asp Pro Glu Lys Tyr Arg Glu Val Tyr Glu Lys Arg Arg Asp Tyr Val
    290                 295                 300
Leu Lys Glu Leu Ala Glu Ile Glu Met Gln Ala Val Lys Pro Glu Gly
305                 310                 315                 320
Ala Phe Tyr Ile Phe Ala Lys Ile Pro Ala Lys Tyr Gly Lys Asp Asp
                325                 330                 335
Met Lys Phe Ala Leu Asp Leu Ala Phe Lys Glu Lys Val Gly Ile Thr
            340                 345                 350
Pro Gly Ser Ala Phe Gly Pro Gly Gly Glu Gly His Ile Arg Leu Ser
        355                 360                 365
Tyr Ala Ser Ser Asp Glu Asn Leu His Glu Ala Met Lys Arg Met Lys
    370                 375                 380
Lys Val Leu Gln Glu Asp Glu
385                 390
<210>13
<211>1413
<212>DNA
<213>类球红细菌(R.sphaeroides)
<400>13
atgcgcgagc ctcttgccct cgagatcgac ccgggccacg gcggcccgct gttcctcgcc      60
atcgccgagg cgatcaccct cgacatcacc cgcgggcggc tgaggcccgg agcgagactg     120
cccggcacac gcgcgctggc gcgggcgctc ggcgtgcatc gcaacacggt ggatgccgcc     180
tatcaggagt tgctgaccca gggctggctg caggccgagc ccgcgcgggg caccttcgtg     240
gcgcaggatc tgccgcaggg gatgctggtg cacaggcccg cgcccgcgcc ggtcgagccg     300
gtcgcgatgc gcgcggggct cgccttctcc gatggcgcgc cggaccccga gctggtgccc     360
gacaaggcgc tggcgcgggc ctttcgccgg gcgctcctgt cgcccgcctt ccgcgccgga     420
gcggattacg gcgatgcccg cggcacctcc tcgctgcggg aggcgctggc agcctatctc     480
gcctcggacc ggggcgtggt cgcggatcct gcgcggctgc tgatcgcgcg gggcagccag     540
atggcgctgt tcctggtagc ccgggcggcg ctggcgccgg gagaggcgat cgcggtcgag     600
gagccgggct atccgctggc ctgggaggcg ttccgcgcag cgggagcgga ggtgcgcggc     660
gtgccggtgg atggcggcgg cctcaggatc gacgcgctcg aggccgcgct ggcccgggat     720
ccgcgaatcc gggcggtcta tgtcacgccc catcaccagt atccgacgac cgtcaccatg     780
ggcgcggcgc ggcggttgca gcttctggaa ctggcagagc gccaccggct cgcgctgatc     840
gaggacgact acgaccacga ataccgcttc gagggccgtc cggtgctgcc gctggctgcc     900
cgcgcgccgg aaggtctgcc gctgatctat gtgggctcgc tgtcgaaact gctctcgccc     960
ggtatccggc tgggatacgc gctggcgccc gagcggctgc tgacccgcat ggccgcggcg    1020
cgcgccgcca tcgaccggca gggcgacgcg ccgctcgagg cggcgctggc cgagctgatc    1080
cgcgacggcg atctgggccg tcatgcccgc aaggcgcgca gggtctaccg ggcgcggcgg    1140
gatctgctgg cggagcgtct cacggcgcag ctggccgggc gcgccgcctt cgatctgccg    1200
gccgggggcc tcgcgctgtg gctgcgctgc gcgggcgtct cggccgagac ctgggccgaa    1260
gccgcagggc aggcggggct cgccctgctg ccgggcacgc gcttcgcgct ggagagcccg    1320
gcgccgcagg ccttccggct gggctatgcg gcgctggacg aggggcagat cgcccgggcg    1380
gtggagatcc tcgcccggag cttccccggc tga                                 1413
<210>14
<211>470
<212>PRT
<213>类球红细菌(R.sphaeroides)
<400>14
Met Arg Glu Pro Leu Ala Leu Glu Ile Asp Pro Gly His Gly Gly Pro
1               5                   10                  15
Leu Phe Leu Ala Ile Ala Glu Ala Ile Thr Leu Asp Ile Thr Arg Gly
            20                  25                  30
Arg Leu Arg Pro Gly Ala Arg Leu Pro Gly Thr Arg Ala Leu Ala Arg
        35                  40                  45
Ala Leu Gly Val His Arg Asn Thr Val Asp Ala Ala Tyr Gln Glu Leu
    50                  55                  60
Leu Thr Gln Gly Trp Leu Gln Ala Glu Pro Ala Arg Gly Thr Phe Val
65                  70                  75                  80
Ala Gln Asp Leu Pro Gln Gly Met Leu Val His Arg Pro Ala Pro Ala
                85                  90                  95
Pro Val Glu Pro Val Ala Met Arg Ala Gly Leu Ala Phe Ser Asp Gly
            100                 105                 110
Ala Pro Asp Pro Glu Leu Val Pro Asp Lys Ala Leu Ala Arg Ala Phe
        115                 120                 125
Arg Arg Ala Leu Leu Ser Pro Ala Phe Arg Ala Gly Ala Asp Tyr Gly
    130                 135                 140
Asp Ala Arg Gly Thr Ser Ser Leu Arg Glu Ala Leu Ala Ala Tyr Leu
145                 150                 155                 160
Ala Ser Asp Arg Gly Val Val Ala Asp Pro Ala Arg Leu Leu Ile Ala
                165                 170                 175
Arg Gly Ser Gln Met Ala Leu Phe Leu Val Ala Arg Ala Ala Leu Ala
            180                 185                 190
Pro Gly Glu Ala Ile Ala Val Glu Glu Pro Gly Tyr Pro Leu Ala Trp
        195                 200                 205
Glu Ala Phe Arg Ala Ala Gly Ala Glu Val Arg Gly Val Pro Val Asp
    210                 215                 220
Gly Gly Gly Leu Arg Ile Asp Ala Leu Glu Ala Ala Leu Ala Arg Asp
225                 230                 235                 240
Pro Arg Ile Arg Ala Val Tyr Val Thr Pro His His Gln Tyr Pro Thr
                245                 250                 255
Thr Val Thr Met Gly Ala Ala Arg Arg Leu Gln Leu Leu Glu Leu Ala
            260                 265                 270
Glu Arg His Arg Leu Ala Leu Ile Glu Asp Asp Tyr Asp His Glu Tyr
        275                 280                 285
Arg Phe Glu Gly Arg Pro Val Leu Pro Leu Ala Ala Arg Ala Pro Glu
    290                 295                 300
Gly Leu Pro Leu Ile Tyr Val Gly Ser Leu Ser Lys Leu Leu Ser Pro
305                 310                 315                 320
Gly Ile Arg Leu Gly Tyr Ala Leu Ala Pro Glu Arg Leu Leu Thr Arg
                325                 330                 335
Met Ala Ala Ala Arg Ala Ala Ile Asp Arg Gln Gly Asp Ala Pro Leu
            340                 345                 350
Glu Ala Ala Leu Ala Glu Leu Ile Arg Asp Gly Asp Leu Gly Arg His
        355                 360                 365
Ala Arg Lys Ala Arg Arg Val Tyr Arg Ala Arg Arg Asp Leu Leu Ala
    370                 375                 380
Glu Arg Leu Thr Ala Gln Leu Ala Gly Arg Ala Ala Phe Asp Leu Pro
385                 390                 395                 400
Ala Gly Gly Leu Ala Leu Trp Leu Arg Cys Ala Gly Val Ser Ala Glu
                405                 410                 415
Thr Trp Ala Glu Ala Ala Gly Gln Ala Gly Leu Ala Leu Leu Pro Gly
            420                 425                 430
Thr Arg Phe Ala Leu Glu Ser Pro Ala Pro Gln Ala Phe Arg Leu Gly
        435                 440                 445
Tyr Ala Ala Leu Asp Glu Gly Gln Ile Ala Arg Ala Val Glu Ile Leu
    450                 455                 460
Ala Arg Ser Phe Pro Gly
465                 470
<210>15
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>15
ggtattgagg gtcgcatgaa ggttttagtc aatgg                                    35
<210>16
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>16
agaggagagt tagagcctta tgaaatgcta gcagcct                                  37
<210>17
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>17
ggtattgagg gtcgcatgtt cgacgccctc gcccg                                    35
<210>18
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>18
agaggagagt tagagcctca gagactggtg aacttgc                                  37
<210>19
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>19
ggtattgagg gtcgcatgga acatttgctg aatcc                                    35
<210>20
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>20
agaggagagt tagagcctta aacgccgttg tttatcg                                 37
<210>21
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>21
ggtattgagg gtcgcatgcg cgagcctctt gccct                                   35
<210>22
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>22
agaggagagt tagagcctca gccggggaag ctccggg                                 37
<210>23
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>23
ggtattgagg gtcgcatgtc cacgcaggcg gccat                                   35
<210>24
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>24
agaggagagt tagagcctca ctcacgattc acattgc                                 37
<210>25
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>25
ggtattgagg gtcgcatgcc agaattagct aatga                                   35
<210>26
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>26
agaggagagt tagagcctta ttcgtcctct tgtaaaa                                 37
<210>27
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>27
ggtattgagg gtcgcatgcg ctctacgacg gctcc                                   35
<210>28
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>28
agaggagagt tagagcctca gccgcgcagc accttgg                                 37
<210>29
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>29
ggtattgagg gtcgcatgtt tgagaacatt accgc                                   35
<210>30
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>30
agaggagagt tagagcctta cagcactgcc acaatcg                                 37
<210>31
<211>1194
<212>DNA
<213>大肠杆菌(E.coli)
<400>31
gtgtttcaaa aagttgacgc ctacgctggc gacccgattc ttacgcttat ggagcgtttt      60
aaagaagacc ctcgcagcga caaagtgaat ttaagtatcg gtctgtacta caacgaagac     120
ggaattattc cacaactgca agccgtggcg gaggcggaag cgcgcctgaa tgcgcagcct     180
catggcgctt cgctttattt accgatggaa gggcttaact gctatcgcca tgccattgcg     240
ccgctgctgt ttggtgcgga ccatccggta ctgaaacaac agcgcgtagc aaccattcaa     300
acccttggcg gctccggggc attgaaagtg ggcgcggatt tcctgaaacg ctacttcccg     360
gaatcaggcg tctgggtcag cgatcctacc tgggaaaacc gcgtagcaat attcgccggg     420
gctggattcg aagtgagtac ttacccctgg tatgacgaag cgactaacgg cgtgcgcttt     480
aatgacctgt tggcgacgct gaaaacatta cctgcccgca gtattgtgtt gctgcatcca     540
tgttgccaca acccaacggg tgccgatctc actaatgatc agtgggatgc ggtgattgaa     600
attctcaaag cccgcgagct tattccattc ctcgatattg cctatcaagg atttggtgcc     660
ggtatggaag aggatgccta cgctattcgc gccattgcca gcgctggatt acccgctctg     720
gtgagcaatt cgttctcgaa aattttctcc ctttacggcg agcgcgtcgg cggactttct     780
gttatgtgtg aagatgccga agccgctggc cgcgtactgg ggcaattgaa agcaacagtt     840
cgccgcaact actccagccc gccgaatttt ggtgcgcagg tggtggctgc agtgctgaat     900
gacgaggcat tgaaagccag ctggctggcg gaagtagaag agatgcgtac tcgcattctg     960
gcaatgcgtc aggaattggt gaaggtatta agcacagaga tgccagaacg caatttcgat    1020
tatctgctta atcagcgcgg catgttcagt tataccggtt taagtgccgc tcaggttgac    1080
cgactacgtg aagaatttgg tgtctatctc atcgccagcg gtcgcatgtg tgtcgccggg    1140
ttaaatacgg caaatgtaca acgtgtggca aaggcgtttg ctgcggtgat gtaa          1194
<210>32
<211>397
<212>PRT
<213>大肠杆菌(E.coli)
<400>32
Val Phe Gln Lys Val Asp Ala Tyr Ala Gly Asp Pro Ile Leu Thr Leu
1               5                   10                  15
Met Glu Arg Phe Lys Glu Asp Pro Arg Ser Asp Lys Val Asn Leu Ser
            20                  25                  30
Ile Gly Leu Tyr Tyr Asn Glu Asp Gly Ile Ile Pro Gln Leu Gln Ala
        35                  40                  45
Val Ala Glu Ala Glu Ala Arg Leu Asn Ala Gln Pro His Gly Ala Ser
    50                  55                  60
Leu Tyr Leu Pro Met Glu Gly Leu Asn Cys Tyr Arg His Ala Ile Ala
65                  70                  75                  80
Pro Leu Leu Phe Gly Ala Asp His Pro Val Leu Lys Gln Gln Arg Val
                85                  90                  95
Ala Thr Ile Gln Thr Leu Gly Gly Ser Gly Ala Leu Lys Val Gly Ala
            100                 105                 110
Asp Phe Leu Lys Arg Tyr Phe Pro Glu Ser Gly Val Trp Val Ser Asp
        115                 120                 125
Pro Thr Trp Glu Asn Arg Val Ala Ile Phe Ala Gly Ala Gly Phe Glu
    130                 135                 140
Val Ser Thr Tyr Pro Trp Tyr Asp Glu Ala Thr Asn Gly Val Arg Phe
145                 150                 155                 160
Asn Asp Leu Leu Ala Thr Leu Lys Thr Leu Pro Ala Arg Ser Ile Val
                165                 170                 175
Leu Leu His Pro Cys Cys His Asn Pro Thr Gly Ala Asp Leu Thr Asn
            180                 185                 190
Asp Gln Trp Asp Ala Val Ile Glu Ile Leu Lys Ala Arg Glu Leu Ile
        195                 200                 205
Pro Phe Leu Asp Ile Ala Tyr Gln Gly Phe Gly Ala Gly Met Glu Glu
    210                 215                 220
Asp Ala Tyr Ala Ile Arg Ala Ile Ala Ser Ala Gly Leu Pro Ala Leu
225                 230                 235                 240
Val Ser Asn Ser Phe Ser Lys Ile Phe Ser Leu Tyr Gly Glu Arg Val
                245                 250                 255
Gly Gly Leu Ser Val Met Cys Glu Asp Ala Glu Ala Ala Gly Arg Val
            260                 265                 270
Leu Gly Gln Leu Lys Ala Thr Val Arg Arg Asn Tyr Ser Ser Pro Pro
        275                 280                 285
Asn Phe Gly Ala Gln Val Val Ala Ala Val Leu Asn Asp Glu Ala Leu
    290                 295                 300
Lys Ala Ser Trp Leu Ala Glu Val Glu Glu Met Arg Thr Arg Ile Leu
305                 310                 315                 320
Ala Met Arg Gln Glu Leu Val Lys Val Leu Ser Thr Glu Met Pro Glu
                325                 330                 335
Arg Asn Phe Asp Tyr Leu Leu Asn Gln Arg Gly Met Phe Ser Tyr Thr
            340                 345                 350
Gly Leu Ser Ala Ala Gln Val Asp Arg Leu Arg Glu Glu Phe Gly Val
        355                 360                 365
Tyr Leu Ile Ala Ser Gly Arg Met Cys Val Ala Gly Leu Asn Thr Ala
    370                 375                 380
Asn Val Gln Arg Val Ala Lys Ala Phe Ala Ala Val Met
385                 390                 395
<210>33
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>33
ggtattgagg gtcgcgtgtt tcaaaaagtt gacgc                                   35
<210>34
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>34
agaggagagt tagagcctta catcaccgca gcaaacg                                 37
<210>35
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>35
ggtattgagg gtcgcatgga gtccaaagtc gttga                                   35
<210>36
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>36
agaggagagt tagagcctta cacttggaaa acagcct                                37
<210>37
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>37
ggtattgagg gtcgcatgaa aaactggaaa acaag                                  35
<210>38
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>38
agaggagagt tagagcctta cagcttagcg ccttcta                                37
<210>39
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>39
ggtattgagg gtcgcatgcg aggggcatta ttcaa                                  35
<210>40
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>40
agaggagagt tagagcctca gcccttgagc gcgaag                                  36
<210>41
<211>1416
<212>DNA
<213>大肠杆菌(E.coli)
<400>41
atggaaaact ttaaacatct ccctgaaccg ttccgcattc gtgttattga gccagtaaaa      60
cgtaccaccc gcgcttatcg tgaagaggca attattaaat ccggtatgaa cccgttcctg     120
ctggatagcg aagatgtttt tatcgattta ctgaccgaca gcggcaccgg ggcggtgacg     180
cagagcatgc aggctgcgat gatgcgcggc gacgaagcct acagcggcag tcgtagctac     240
tatgcgttag ccgagtcagt gaaaaatatc tttggttatc aatacaccat tccgactcac     300
cagggccgtg gcgcagagca aatctatatt ccggtactga ttaaaaaacg cgagcaggaa     360
aaaggcctgg atcgcagcaa aatggtggcg ttctctaact atttctttga taccacgcag     420
ggccatagcc agatcaacgg ctgtaccgtg cgtaacgtct atatcaaaga agccttcgat     480
acgggcgtgc gttacgactt taaaggcaac tttgaccttg agggattaga acgcggtatt     540
gaagaagttg gtccgaataa cgtgccgtat atcgttgcaa ccatcaccag taactctgca     600
ggtggtcagc cggtttcact ggcaaactta aaagcgatgt acagcatcgc gaagaaatac     660
gatattccgg tggtaatgga ctccgcgcgc tttgctgaaa acgcctattt catcaagcag     720
cgtgaagcag aatacaaaga ctggaccatc gagcagatca cccgcgaaac ctacaaatat     780
gccgatatgc tggcgatgtc cgccaagaaa gatgcgatgg tgccgatggg cggcctgctg     840
tgcatgaaag acgacagctt ctttgatgtg tacaccgagt gcagaaccct ttgcgtggtg     900
caggaaggct tcccgacata tggcggcctg gaaggcggcg cgatggagcg tctggcggta     960
ggtctgtatg acggcatgaa tctcgactgg ctggcttatc gtatcgcgca ggtacagtat    1020
ctggtcgatg gtctggaaga gattggcgtt gtctgccagc aggcgggcgg tcacgcggca    1080
ttcgttgatg ccggtaaact gttgccgcat atcccggcag accagttccc ggcacaggcg    1140
ctggcctgcg agctgtataa agtcgccggt atccgtgcgg tagaaattgg ctctttcctg    1200
ttaggccgcg atccgaaaac cggtaaacaa ctgccatgcc cggctgaact gctgcgttta    1260
accattccgc gcgcaacata tactcaaaca catatggact tcattattga agcctttaaa    1320
catgtgaaag agaacgcggc gaatattaaa ggattaacct ttacgtacga accgaaagta    1380
ttgcgtcact tcaccgcaaa acttaaagaa gtttaa                              1416
<210>42
<211>1371
<212>DNA
<213>弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)
<400>42
atgaattatc cggcagaacc cttccgtatt aaaagcgttg aaactgtatc tatgatcccg      60
cgtgatgaac gcctcaagaa aatgcaggaa gcgggttaca atactttcct gttaaattcg     120
aaagatattt atattgacct gctgacagac agtggcacta acgcaatgag cgacaagcag     180
tgggccggaa tgatgatggg tgatgaagcg tacgcgggca gcgaaaactt ctatcatctg     240
gaaagaaccg tgcaggaact gtttggcttt aaacatattg ttccgactca ccaggggcgt     300
ggcgcagaaa acctgttatc gcagctggct attaaacctg ggcaatatgt tgccgggaat     360
atgtatttca ctaccacccg ttatcaccag gaaaaaaatg gtgcggtgtt tgtcgatatc     420
gttcgtgacg aagcgcacga tgccggtctg aatattgcgt ttaaaggtga tatcgatctt     480
aaaaaattac aaaagctgat tgatgaaaaa ggcgcagaga atattgcgta tatctgcctg     540
gcggtgacgg ttaacctcgc gggcggccaa ccggtctcga tggctaacat gcgtgcggtg     600
cgtgaactga cagaagcgca tggcattaaa gtgttctacg acgctacccg ctgcgtagaa     660
aacgcctact ttatcaaaga gcaagagcag ggctttgaga acaagagcat cgccgagatc     720
gtgcatgaga tgttcagcta cgccgacggt tgtaccatga gtggtaaaaa agactgtctg     780
gtgaacatcg gcggcttcct gtgcatgaac gatgacgaaa tgttctcttc tgccaaagag     840
ttagtcgtgg tctacgaagg gatgccatct tacggcggcc tggccggacg tgatatggaa     900
gcgatggcga ttggcctgcg tgaagccatg cagtacgaat atattgagca ccgcgtgaag     960
caggttcgct acctgggcga taagctgaaa gccgctggcg taccgattgt tgaaccggta    1020
ggcggtcacg cggtattcct cgatgcgcgt cgcttctgcg agcatctgac gcaagatgag    1080
ttcccggcac aaagtctggc tgccagcatc tatgtggaaa ccggcgtgcg cagtatggag    1140
cgcggaatta tctctgcggg ccgtaataac gtgaccggtg aacaccacag accgaaactg    1200
gaaaccgtgc gtctgactat tccacgtcgt gtttatacct acgcacatat ggatgttgtg    1260
gctgacggta ttattaaact ttaccagcac aaagaagata ttcgcgggct gaagtttatt    1320
tacgagccga agcagttgcg tttctttact gcacgctttg attacatcta a             1371
<210>43
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>43
ggtattgagg gtcgcatgga aaactttaaa catct                                     35
<210>44
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>44
agaggagagt tagagcctta aacttcttta agttttg                                37
<210>45
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>45
ggtattgagg gtcgcatgaa ttatccggca gaacc                                  35
<210>46
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>46
agaggagagt tagagcctta gatgtaatca aagcgtg                                 37
<210>47
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>47
ccagggcacc ggcgcagagc aaatctatat t                                       31
<210>48
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>48
tgcgccggtg ccctggtgag tcggaatggt                                          30
<210>49
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>49
tcctgcacgc ggcaaagggt tctgcactcg gt                                      32
<210>50
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>50
ctttgccgcg tgcaggaagg cttcccgaca                                           30
<210>51
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>51
aggggaccgg cgcagaaaac ctgttatcg                                            29
<210>52
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>52
tctgcgccgg tcccctggtg agtcggaaca at                                       32
<210>53
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>53
gttagtccgc gtctacgaag ggatgccat                                           29
<210>54
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>54
gtagacgcgg actaactctt tggcagaag                                           29
<210>55
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>55
ggtattgagg gtcgcatgta cgaactggga gttgt                                   35
<210>56
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>56
agaggagagt tagagcctta gtcaatatat ttcaggc                                 37
<210>57
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>57
ggtattgagg gtcgcatgtc cggcatcgtt gtcca                                   35
<210>58
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>58
agaggagagt tagagcctca gacatatttc agtccca                                 37
<210>59
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>59
ggtattgagg gtcgcatgcg actgaacaac ctcgg                                   35
<210>60
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>60
agaggagagt tagagcctca gttctccacg tattcca                                 37
<210>61
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>61
ggtattgagg gtcgcatgag cgtggttcac cggaa                                  35
<210>62
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>62
agaggagagt tagagcctca atcgatatat ttcagtc                                37
<210>63
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>63
ggtattgagg gtcgcatgag cctggttaat atgaa                                   35
<210>64
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>64
agaggagagt tagagcctta tgactttaac gcgttga                                37
<210>65
<211>684
<212>DNA
<213>睾丸酮丛毛单胞菌(C.testosteroni)
<400>65
atgtacgaac tgggagttgt ctaccgcaat atccagcgcg ccgaccgcgc tgctgctgac      60
ggcctggccg ccctgggctc cgccaccgtg cacgaggcca tgggccgcgt cggtctgctc     120
aagccctata tgcgccccat ctatgccggc aagcaggtct cgggcaccgc cgtcacggtg     180
ctgctgcagc ccggcgacaa ctggatgatg catgtggctg ccgagcagat tcagcccggc     240
gacatcgtgg tcgcagccgt caccgcagag tgcaccgacg gctacttcgg cgatctgctg     300
gccaccagct tccaggcgcg cggcgcacgt gcgctgatca tcgatgccgg cgtgcgcgac     360
gtgaagacgc tgcaggagat ggactttccg gtctggagca aggccatctc ttccaagggc     420
acgatcaagg ccaccctggg ctcggtcaac atccccatcg tctgcgccgg catgctggtc     480
acgcccggtg acgtgatcgt ggccgacgac gacggcgtgg tctgcgtgcc cgccgcgcgt     540
gccgtggaag tgctggccgc cgcccagaag cgtgaaagct tcgaaggcga aaagcgcgcc     600
aagctggcct cgggcatcct cggcctggat atgtacaaga tgcgcgagcc cctggaaaag     660
gccggcctga aatatattga ctaa                                            684
<210>66
<211>227
<212>PRT
<213>睾丸酮丛毛单胞菌(C.testosteroni)
<400>66
Met Tyr Glu Leu Gly Val Val Tyr Arg Asn Ile Gln Arg Ala Asp Arg
1               5                   10                  15
Ala Ala Ala Asp Gly Leu Ala Ala Leu Gly Ser Ala Thr Val His Glu
            20                  25                  30
Ala Met Gly Arg Val Gly Leu Leu Lys Pro Tyr Met Arg Pro Ile Tyr
        35                 40                 45
Ala Gly Lys Gln Val Ser Gly Thr Ala Val Thr Val Leu Leu Gln Pro
    50                  55                  60
Gly Asp Asn Trp Met Met His Val Ala Ala Glu Gln Ile Gln Pro Gly
65                  70                  75                  80
Asp Ile Val Val Ala Ala Val Thr Ala Glu Cys Thr Asp Gly Tyr Phe
                85                  90                  95
Gly Asp Leu Leu Ala Thr Ser Phe Gln Ala Arg Gly Ala Arg Ala Leu
            100                 105                 110
Ile Ile Asp Ala Gly Val Arg Asp Val Lys Thr Leu Gln Glu Met Asp
        115                 120                 125
Phe Pro Val Trp Ser Lys Ala Ile Ser Ser Lys Gly Thr Ile Lys Ala
    130                 135                 140
Thr Leu Gly Ser Val Asn Ile Pro Ile Val Cys Ala Gly Met Leu Val
145                 150                 155                 160
Thr Pro Gly Asp Val Ile Val Ala Asp Asp Asp Gly Val Val Cys Val
                165                 170                 175
Pro Ala Ala Arg Ala Val Glu Val Leu Ala Ala Ala Gln Lys Arg Glu
            180                 185                 190
Ser Phe Glu Gly Glu Lys Arg Ala Lys Leu Ala Ser Gly Ile Leu Gly
        195                 200                 205
Leu Asp Met Tyr Lys Met Arg Glu Pro Leu Glu Lys Ala Gly Leu Lys
    210                 215                 220
Tyr Ile Asp
225
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Claims (63)

1.一种含有莫纳甜或其盐的桌面甜味剂组合物，其特征在于，所述组合物提供的甜度相当于约0.9-约9.0克砂糖。
2.如权利要求1所述的桌面甜味剂组合物，其特征在于，1克份的所述组合物提供的甜度相当于2茶匙砂糖。
3.如权利要求1所述的桌面甜味剂组合物，其特征在于，1克所述组合物含有的卡路里和碳水化合物少于约1克砂糖。
4.如权利要求1所述的桌面甜味剂组合物，其特征在于，1克所述组合物含有约0-约200毫克S，S莫纳甜或其盐，和约0-约5毫克R，R莫纳甜或其盐。
5.如权利要求1所述的桌面甜味剂组合物，其特征在于，1克所述组合物含有约3-约200毫克S，S莫纳甜或其盐，和约0-约5毫克R，R莫纳甜或其盐。
6.如权利要求1所述的桌面甜味剂组合物，其特征在于，1克所述组合物含有约0-约200毫克S，S莫纳甜或其盐，和约3-约5毫克R，R莫纳甜或其盐。
7.如权利要求1所述的桌面甜味剂组合物，其特征在于，1克所述组合物含有约200毫克或更少的S，S莫纳甜或其盐，且其中所述莫纳甜或其盐基本上不含R，R、S，R或R，S莫纳甜或其盐。
8.如权利要求1所述的桌面甜味剂组合物，其特征在于，1克所述组合物含有约5毫克或更少的R，R莫纳甜或其盐，且其中所述莫纳甜或其盐基本上不含S，S、S，R或R，S莫纳甜或其盐。
9.如权利要求1所述的桌面甜味剂组合物，其还含有至少一种选自下组的成分：填充剂、载体、纤维、糖醇、寡糖、糖、非莫纳甜高强度甜味剂、营养甜味剂、调味品、味道增强剂、味道稳定剂、酸化剂、抗结剂和助流动剂。
10.如权利要求1所述的桌面甜味剂组合物，其还含有赤藓醇。
11.如权利要求10所述的桌面甜味剂组合物，其特征在于，所述组合物含有多达99.7％的赤藓醇。
12.如权利要求1所述的桌面甜味剂组合物，其还含有海藻糖。
13.如权利要求1所述的桌面甜味剂组合物，其还含有环磺酸盐。
14.如权利要求1所述的桌面甜味剂组合物，其还含有与麦芽糊精成团的葡萄糖。
15.如权利要求1所述的桌面甜味剂组合物，其特征在于，所述莫纳甜或其盐基本上由R，R莫纳甜或其盐组成。
16.如权利要求1所述的桌面甜味剂组合物，其特征在于，所述莫纳甜或其盐基本上由S，S莫纳甜或其盐组成。
17.如权利要求1所述的桌面甜味剂组合物，其特征在于，所述莫纳甜或其盐富含立体异构R，R莫纳甜或其盐。
18.如权利要求1所述的桌面甜味剂组合物，其特征在于，所述莫纳甜或其盐富含立体异构S，S莫纳甜或其盐。
19.如权利要求17所述的桌面甜味剂组合物，其特征在于，所述莫纳甜或其盐含有至少95％的R，R莫纳甜或其盐。
20.如权利要求2所述的桌面甜味剂组合物，其特征在于，所述甜度是由在生物合成途径中产生的莫纳甜或其盐提供的。
21.一种含有莫纳甜或其盐的即用型甜味剂组合物，其特征在于，一定体积所述组合物提供的甜度相当于相同体积的砂糖。
22.如权利要求21所述的即用型甜味剂组合物，其特征在于，1茶匙所述组合物含有的卡路里和碳水化合物少于约1茶匙砂糖。
23.如权利要求21所述的即用型甜味剂组合物，其特征在于，1克所述组合物含有约3-约25毫克S，S莫纳甜或其盐，和约0-约0.625毫克R，R莫纳甜或其盐。
24.如权利要求21所述的即用型甜味剂组合物，其特征在于，所述莫纳甜或其盐基本上由S，S莫纳甜或其盐，或者R，R莫纳甜或其盐组成。
25.如权利要求21所述的即用型甜味剂组合物，其特征在于，1克所述组合物含有约5-约25毫克S，S莫纳甜或其盐。
26.如权利要求21所述的即用型甜味剂组合物，其特征在于，1克所述组合物含有约0.4-约0.625R，R莫纳甜或其盐，且其中所述莫纳甜或其盐基本上不含S，S、S，R或R，S莫纳甜或其盐。
27.如权利要求21所述的即用型甜味剂组合物，其特征在于，1克所述组合物含有约0.5-约1毫克R，R莫纳甜或其盐，且其中所述莫纳甜或其盐基本上不含S，S、S，R或R，S莫纳甜或其盐。
28.如权利要求21所述的即用型甜味剂组合物，其还含有赤藓醇。
29.如权利要求28所述的即用型甜味剂组合物，其特征在于，所述组合物含有多达99.7％赤藓醇。
30.如权利要求21所述的即用型甜味剂组合物，其还含有海藻糖。
31.如权利要求21所述的即用型甜味剂组合物，其还含有环磺酸盐。
32.一种含有富含立体异构莫纳甜混合物的甜味剂组合物，其特征在于，所述莫纳甜混合物是通过生物合成途径产生的。
33.如权利要求32所述的甜味剂组合物，其特征在于，所述生物合成途径是多步骤途径，且所述多步骤途径中的至少一步是化学转化。
34.如权利要求32所述的甜味剂组合物，其特征在于，所述混合物主要含有R，R莫纳甜或其盐。
35.一种含有莫纳甜或其盐的均匀的桌面甜味剂组合物，其特征在于，所述组合物样品含有多于2毫克到约200毫克的莫纳甜或其盐，且其中所述样品中的莫纳甜或其盐提供的甜度相当于约0.9-约9.0克砂糖。
36.如权利要求35所述的组合物，其特征在于，所述样品中的莫纳甜或其盐提供的甜度相当于2茶匙砂糖。
37.如权利要求35所述的组合物，其特征在于，所述样品重约1克。
38.如权利要求35所述的组合物，其特征在于，所述样品含有多于2毫克到约5毫克的莫纳甜或其盐。
39.如权利要求38所述的组合物，其特征在于，所述组合物基本上不含S，S莫纳甜或其盐。
40.如权利要求35所述的桌面甜味剂，其特征在于，所述组合物基本上不含R，R莫纳甜或其盐。
41.一种含有莫纳甜或其盐的桌面甜味剂组合物，其特征在于，所述组合物样品含有多于2毫克到约105毫克莫纳甜或其盐，且其中所述样品中的莫纳甜或其盐提供的甜度相当于1茶匙砂糖。
42.如权利要求35或41所述的桌面甜味剂，其特征在于，所述样品的体积约为0.35ml。
43.如权利要求35或41所述的桌面甜味剂，其特征在于，所述样品是粒化材料的立方体。
44.一种含有在生物合成途径中产生的莫纳甜组合物的桌面甜味剂组合物，其中，所述莫纳甜组合物不含石油化学、有毒或危险污染物。
45.一种含有莫纳甜或其盐的桌面甜味剂组合物，其特征在于，所述莫纳甜或其盐是在生物合成途径中产生的，并分离自重组细胞，且其中所述重组细胞不含石油化学、有毒或危险污染物。
46.一种制造含有莫纳甜或其盐的甜味剂组合物的方法，其特征在于，所述方法包括从至少一种选自下组的底物生产莫纳甜或其盐：葡萄糖、色氨酸、吲哚-3-乳酸、吲哚-3-丙酮酸盐或酯和莫纳甜前体。
47.如权利要求46所述的方法，其特征在于，所述方法还包括将莫纳甜或其盐与赤藓醇混合。
48.如权利要求46所述的方法，其特征在于，所述方法还包括将莫纳甜或其盐与海藻糖混合。
49.如权利要求46所述的方法，其特征在于，所述方法还包括将莫纳甜或其盐与环磺酸盐混合。
50.如权利要求46所述的方法，其特征在于，所述方法还包括将莫纳甜或其盐与至少一种不是莫纳甜或其盐的其它成分混合。
51.如权利要求50所述的方法，其特征在于，所述至少一种其它成分选自：填充剂、载体、纤维、糖醇、寡糖、糖、非莫纳甜高强度甜味剂、营养甜味剂、调味品、味道增强剂、味道稳定剂、酸化剂、抗结剂、助流动剂及其任何组合。
52.如权利要求50所述的方法，其特征在于，所述至少一种其它成分选自：麦芽糊精、葡萄糖、赤藓醇和纤维。
53.如权利要求50所述的方法，其特征在于，重约1克的一份所述甜味剂组合物含有约0-约200毫克S，S莫纳甜或其盐，和约0-约5毫克R，R莫纳甜或其盐，且该份提供的甜度相当于2茶匙砂糖。
54.如权利要求50所述的方法，其特征在于，1克所述甜味剂组合物含有约0-约25毫克S，S莫纳甜或其盐，和约0-约0.625毫克R，R莫纳甜或其盐，且一定体积的该组合物的甜度相当于相同体积的砂糖。
55.如权利要求50所述的方法，其特征在于，1克所述组合物含有约0-约25毫克S，S莫纳甜或其盐，和约0-约0.625毫克R，R莫纳甜或其盐，其中1克所述组合物的甜度相当于约0.9-约9.0克砂糖。
56.如权利要求53所述的方法，其特征在于，每1克所述组合物含有约5-约200毫克S，S莫纳甜或其盐。
57.如权利要求56所述的方法，其特征在于，所述方法还包括将S，S莫纳甜或其盐与至少一种其它成分混合，所述其它成分选自：填充剂、载体、纤维、糖醇、寡糖、糖、非莫纳甜高强度甜味剂、营养甜味剂、调味品、味道增强剂、味道稳定剂、酸化剂、抗结剂、助流动剂及其任何组合，其中每1克所述组合物含有约3-约200毫克莫纳甜或其盐。
58.如权利要求53所述的方法，其特征在于，所述方法还包括将R，R莫纳甜或其盐与至少一种其它成分混合物，所述其它成分选自：填充剂、载体、纤维、糖醇、寡糖、糖、非莫纳甜高强度甜味剂、营养甜味剂、调味品、味道增强剂、味道稳定剂、酸化剂、抗结剂、助流动剂及其任何组合，其中每1克所述组合物含有约3-5毫克R，R莫纳甜或其盐。
59.如权利要求50所述的方法，其特征在于，每1克所述组合物含有约0.4-约5毫克R，R莫纳甜或其盐。
60.如权利要求46所述的方法，其特征在于，所述方法还包括将莫纳甜或其盐与至少一种选自葡萄糖和麦芽糊精的填充剂混合，其中每1克所述组合物含有约5毫克R，R莫纳甜或其盐。
61.如权利要求46所述的方法，其特征在于，所述方法还包括将莫纳甜或其盐与麦芽糊精混合，其中每1克所述组合物含有约0.5-约1毫克R，R莫纳甜或其盐。
62.一种制造含有莫纳甜组合物的甜味剂组合物的方法，所述方法包括：(a)在重组细胞的生物合成途径中产生莫纳甜或其盐；(b)从所述重组细胞中分离所述莫纳甜组合物，其中，所述莫纳甜组合物由莫纳甜或其盐以及其它可食用或可饮用的材料组成。
63.一种含有莫纳甜和赤藓醇的莫纳甜组合物。
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