PL208481B1 - Sposób wytwarzania monatyny - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Rozwiązanie dotyczy polipeptydów i szlaków biosyntetycznych, które są wykorzystywane do wytwarzania monatyny poprzez indolo-3-pirogronian i kwas 2-hydroksy-2-(indol-3-ilometylo)-4-ketoglularowy.

Pirogronian indolu

Indolo-3-pirogronian jest silnym przeciwutleniaczem, o którym sądzi się, że przeciwdziała stresowi oksydacyjnemu w tkankach, w których występują wysokie stężenia tlenu (Politi i in. Recent advances in Tryptophan Research, pod redakcją G. A. Filippini i in., Plenum Press, New York, 1996, str. 291-8).

Pirogronian indolu jest również półproduktem w szlaku wytwarzania kwasu indolooctowego (IAA), głównego roślinnego hormonu wzrostu auksyny (dyfuzyjny czynnik pobudzający wzrost). IAA jest aktywny w submikrogramowych ilościach w procesach fizjologicznych mieszczących się w zakresie obejmującym dominację wierzchołkową, tropizmy, wydłużanie pędu, indukowanie podziału komórek kambium oraz inicjację rozwoju korzenia. Syntetyczne auksyny stosuje się w ogrodnictwie do indukcji ukorzeniania oraz pobudzania powstawania i rozwoju owocu. W wysokich stężeniach, syntetyczne auksyny są skutecznymi herbicydami przeciw roślinom szerokolistnym. Naturalnie wytwarzane przez fermentację auksyny można uważać za bardziej przyjazne dla środowiska niż herbicydy wytwarzane chemicznie. Sprzedaż regulatorów wzrostu na świecie wyniosła w 1999 roku 0,4 biliona funtów (1,4 biliona dolarów USA).

Niektóre przykłady opisów patentowych dotyczących kwasu indolooctowego i jego pochodnych obejmują: US 5 843 782, Micropropagation of rose plants, auxin used in culture medium i US 5 952 231, Micropropagation of rose plants.

Oprócz zastosowań związanych z roślinami, kwas indolooctowy jest użyteczny w zastosowaniach farmaceutycznych. Na przykład, US 5 173 497 Method of preparing alpha-oxopyrrolo[2,3-B]indole acetic acids and derivatives, proponuje stosowanie tych związków w leczeniu upośledzenia pamięci, stanów związanych z chorobą Alzheimera i otępieniem starczym.

Mechanizm działania, zaproponowany w US 5 173 497, polega na tym, że związki te hamują acetylocholinesterazę polipeptydową i powodują wzrost poziomów acetylocholiny w mózgu.

Indolo-3-karbinol wytwarza się z kwasu indolo-3-octowego przez utlenianie katalizowane peroksydazą i można go z łatwością przekształcić w diindolilometan. O obu związkach donoszono, że eliminują one toksyny i pobudzają wytwarzanie hormonów korzystnych dla zdrowia kobiet.

Pochodne tryptofanu

Stwierdzono, że chlorowany D-tryptofan jest nieodżywczym słodzikiem i istnieje wzrastające zainteresowanie uzyskiwaniem również innych jego pochodnych.

Monatyna jest naturalnym słodzikiem, który jest podobny w składzie do aminokwasu tryptofanu. Ekstrahuje się ją z kory korzenia południowo afrykańskiego krzewu, Sclerochiton ilicifolius, i jest ona obiecująca dla przemysłu spożywczego i napojów jako wysoce intensywny słodzik.

Niektóre przykłady opisów patentowych dotyczących monatyny obejmują:

US 5 994 559, Synthesis of monatin-A high intensity natural sweetener,

US 4 975 298, 3-(1-amino-1,3-dicarboxy-3-hydroxy-but-4-yl)indole compounds,

US 5 128 164, Composition for human consumption containing 3-(1-amino-1,3-dicarboxy-3-hydroxy-but-4-yl)indole compounds oraz US 5 128 482, Process for the production of 3-1(1-amino-1,3-dicarboxy-3-hydroxy-but-4-yl)indole.

Niektóre z opisanych tu prekursorów monatyny mogą być użyteczne również jako syntetyczne słodziki lub jako półprodukty w syntezie pochodnych monatyny.

Sposób wytwarzania monatyny według wynalazku obejmuje: zetknięcie indolo-3-pirogronianu z aldolazą , co uł atwia przekształ cenie indolo-3 pirogronianu lub jego soli i C3 ź ródł a wę gla w kwas 2-hydroksy-2-(indol-3-ilometylo)-4-ketoglutarowy lub jego sól, przy czym aldolaza jest wybrana spośród glioksylano-liazy 4-hydroksy-2-oksoglutaranu (EC 4.1.3.16) lub pirogroniano-liazy 4-hydroksy-4-metylo-2-oksoglutaranu (EC 4.1.3.17) i zetknięcie kwasu 2-hydroksy-2-(indol-3-ilometylo)-4-ketoglutarowego lub jego soli z aminotransferazą, co ułatwia przekształcenie kwasu 2-hydroksy-2-(indol-3-ilometylo)-4-ketoglutarowego lub jego soli w monatynę lub jej sól, przy czym aminotransferaza jest wybrana spośród: aminotransferazy tryptofanowej (EC 2.6.1.27), aminotransferazy tyrozynowej (aromatycznej) (EC 2.6.1.5),

PL 208 481 B1 dehydrogenazy tryptofanowej (EC 1.4.1.19), aminotransferazy asparaginianowej (EC 2.6.1.1), dehydrogenazy glutaminianowej (EC 1.4.1.2-4), dehydrogenazy fenyloalaninowej (EC 1.4.1.20), dehydrogenazy D-aminokwasowej (EC 1.4.99.1), aminotransferazy D-aminokwasowej (D-alaninowej) (EC 2.6.1.21), aminotransferazy D-metionino-pirogronianowej (EC 2.6.1.41), i ich kombinacji do wytworzenia monatyny lub jej soli.

Korzystnie aminotransferaza zawiera:

sekwencję aminokwasową przedstawioną w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 32, numer dostępu w Genbank: NP_388848.1, numer dostępu w Genbank: ZP00005082.1 lub numer dostępu w Genbank: AAC74014.1;

sekwencję aminokwasową wykazującą co najmniej 90% identyczność sekwencji z sekwencją przedstawioną w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 32, numer dostępu w Genbank: NP_388848.1, numer dostę pu w Genbank: ZP00005082.1 lub numer dostę pu w Genbank: AAC74014.1 lub sekwencje aminokwasowe, które różnią się od sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 32, numer dostępu w Genbank: NP_388848.1, numer dostępu w Genbank: ZP00005082.1 lub numer dostępu w Genbank: AAC74014.1 o mniej niż 50 konserwatywnych podstawień aminokwasowych, przy czym sekwencja aminokwasowa przekształca tryptofan w indolo-3-pirogronian.

C3 źródło węgla wybiera się z grupy składającej się z pirogronianu, fosfoenolopirogronianu, alaniny, seryny, cysteiny lub ich kombinacji.

Korzystnie C3 źródło węgla stanowi pirogronian i pirogronian wytwarza się przez:

alaninę i polipeptyd zdolny do transaminacji alaniny;

serynę i polipeptyd zdolny do beta-eliminacji seryny;

cysteinę i polipeptyd zdolny do beta-eliminacji cysteiny;

asparaginian i polipeptyd zdolny do reakcji beta-liazy z aminokwasem dikarboksylowym;

mleczan i oksydazę mleczanową (EC 1.1.3.-) lub dehydrogenazę mleczanową (EC 1.1.1.27, 1.1.1.28, 1.1.2.3) lub ich kombinacje.

Aldolaza zawiera sekwencję aminokwasową wybraną spośród:

sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 66, numer dostępu w Genbank: CAC46344, numer dostępu w Genbank: CAB14127.1, numer dostępu w Genbank: AAC74920.1 lub numer dostępu w Genbank: CAC47463.1;

sekwencji aminokwasowej wykazującej co najmniej 90% identyczność sekwencji z sekwencją o numerze identyfikacyjnym: 66, numer dostę pu w Genbank: CAC46344, numer dostę pu w Genbank: CAB14127.1, numer dostępu w Genbank: AAC74920.1 lub numer dostępu w Genbank: CAC47463.1 lub sekwencji aminokwasowej, która różni się od sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 66, numer dostępu w Genbank: CAC46344, numer dostępu w Genbank: CAB14127.1, numer dostępu w Genbank: AAC74920.1 lub numer dostępu w Genbank: CAC47463.1 o mniej niż 50 konserwatywnych podstawień aminokwasowych, przy czym sekwencja aminokwasowa przekształca indolo-3-pirogronian w MP.

Korzystnie aminotransferazę stanowi aminotransferaza asparaginianowa, przy czym kwas 2-hydroksy-2-(indol-3-ilometylo)-4-ketoglutarowy kontaktuje się z asparaginianem dla wytwarzania szczawiooctanu i monatyny.

Sposób według wynalazku korzystnie obejmuje także zetknięcie szczawiooctanu z dekarboksylazą.

Aminotransferazę korzystnie stanowi enzym wykazujący aktywność redukcyjnej aminacji oraz polipeptyd, który jest zdolny do powodowania obiegu NAD(P)H.

Enzym wykazujący aktywność redukcyjnej aminacji wybiera się z grupy składającej się z dehydrogenazy glutaminianowej, dehydrogenazy fenyloalaninowej, dehydrogenazy tryptofanowej lub ich kombinacji.

Opisano drogi biosyntezy dla wytwarzania monatyny z glukozy, tryptofanu, kwasu indolo-3-mlekowego, i/lub przez prekursory monatyny, takie jak indolo-3-pirogronian i kwas 2-hydroksy-2-(indol-3-ylometylo)-4-ketoglutarowy. Ujawniono polipeptydy i sekwencje kwasów nukleinowych, które można stosować do przygotowywania monatyny, indolo-3-pirogronianu oraz kwasu 2-hydroksy-2-(indol-3-ilometylo)-4-ketoglutarowego.

PL 208 481 B1

Monatynę można wytwarzać przez indolo-3-pirogronian, kwas 2-hydroksy-2-(indol-3-ilometylo)-4-ketoglutarowy (prekursor monatyny, MP, postać alfa-keto monatyny), kwas indolo-3-mlekowy, tryptofan i/lub glukozę (Fig. 1).

Ujawniono sposoby wytwarzania lub przygotowywania monatyny lub jej półproduktów, które obejmują przekształcanie substratu do pierwszego produktu a następnie przekształcanie pierwszego produktu do drugiego produktu, i tak dalej, dokąd nie powstanie pożądany produkt (przedstawione na Fig. 1-3 oraz 11-13).

Figury 1-3 i 11-13 przedstawiają potencjalne półprodukty i produkty końcowe, w ramkach. Stosując te sposoby można przekształcać jeden produkt w drugi, na przykład, glukozę w tryptofan, tryptofan w indolo-3-pirogronian, indolo-3-pirogronian w MP, MP w monatynę lub kwas indolo-3-mlekowy (indolo-mleczan) w indolo-3-pirogronian.

Te przekształcenia można ułatwiać chemicznie lub biologicznie.

Termin przekształcać odnosi się do stosowania albo sposobów chemicznych, albo polipeptydów, w reakcji, która zmienia pierwszy półprodukt w drugi półprodukt.

Termin przekształcanie chemiczne odnosi się do reakcji, które nie są aktywnie ułatwiane przez polipeptydy.

Termin przekształcanie biologiczne odnosi się do reakcji, które są aktywnie ułatwiane przez polipeptydy. Przekształcenia mogą mieć miejsce in vivo lub in vitro. Kiedy wykorzystuje się przekształcenia biologiczne, polipeptydy i/lub komórki można immobilizować na nośnikach, tak jak przez chemiczne wiązanie na nośnikach polimerowych. Przekształcanie można przeprowadzać stosując dowolny reaktor znany specjalistom w tej dziedzinie, na przykład, w reaktorze szarżowym lub ciągłym.

Opisano również sposoby, które obejmują zetknięcie pierwszego polipeptydu z substratem i wytworzenie pierwszego produktu a następnie zetknięcie pierwszego wytworzonego produktu z drugim polipeptydem i wytworzenie drugiego produktu a następnie zetknięcie drugiego wytworzonego produktu z trzecim polipeptydem i wytworzenie trzeciego produktu, na przykład monatyny. Stosowane polipeptydy i wytwarzane produkty przedstawiono na Fig. 1-3 oraz 11-13.

Ujawniono polipeptydy i ich sekwencje kodujące, które można stosować do przekształceń przedstawionych na Fig. 1-3 oraz 11-13. W niektórych przykładach, do przygotowywania monatyny stosuje się polipeptydy posiadające jedną lub więcej mutacji punktowych, które umożliwiają modyfikację specyficzności substratowej i/lub aktywności.

Ujawniono wyizolowane i rekombinowane komórki, które wytwarzają monatynę. Komórki te mogą być dowolnymi komórkami, takimi jak komórki roślinne, zwierzęce, bakteryjne, drożdżowe, glonów, bakterii należących do Archeobacteria lub komórki grzybowe.

W szczególnym przykł adzie, ujawnione komórki posiadają jedną lub wię cej nastę pują cych aktywności, na przykład, dwie lub więcej bądź trzy lub więcej z następujących aktywności:

aminotransferazy tryptofanowej (EC 2.6.1.27), aminotransferazy tyrozynowej (aromatycznej) (EC 2.6.1.5), aminotransferazy wielosubstratowej (EC 2.6.1.-), aminotransferazy asparaginianowej (EC 2.6.1.1), dehydrogenazy tryptofanowej (EC 1.4.1.19), transaminazy tryptofanowofenylopirogronianowej (EC 2.6.1.28), oksydazy L-aminokwasowej (EC 1.4.3.2), oksydazy tryptofanowej (bez numeru EC, Hadar i in., J. Bacteriol 125:1096-1104, 1976 oraz Furuya i in., Biosci Biotechnol Biochem 64:1486-93, 2000), dehydrogenazy D-aminokwasowej (EC 1.4.99.1), oksydazy D-aminokwasowej (EC 1.4.3.3), aminotransferazy D-alaninowej (EC 2.6.1.21), syntazy/liazy (EC 4.1.3.-), takiej jak aldolaza 4-hydroksy-4-metylo-2-oksoglutaranowa (EC 4.1.3.17) lub aldolaza 4-hydroksy-2-oksoglutaranowa (EC 4.1.3.16), syntazy/liazy (4.1.2.-), aminotransferazy D-tryptofanowej (Kohiba i Mito, Proceedings of the 8^th International Symposium on Vitamin B6 and Carbonyl Catalysis, Osaka, Japonia 1990), dehydrogenazy fenyloalaninowej (EC 1.4.1.20) i/lub dehydrogenazy glutaminianowej (EC 1.4.1.2, 1.4.1.3, 1.4.1.4).

W innym przykładzie, komórki posiadają jedną lub więcej, na przykład, dwie lub wię cej bądź trzy lub więcej z następujących aktywności:

dehydrogenazy indolomleczanowej (EC 1.1.1.110), dehydrogenazy R-4-hydroksyfenylomleczanowej (EC 1.1.1.222), reduktazy 3-(4)-hydroksyfenylopirogronianowej (EC 1.1.1.237), dehydrogenazy mleczanowej (EC 1.1.1.27, 1.1.1.28, 1.1.2.3), dehydrogenazy (3-imidazol-5-ilo)mleczanowej (EC 1.1.1.111), oksydazy mleczanowej (EC 1.1.3.-), syntazy/liazy (4.1.3.-), takiej jak aldolaza 4-hydroksy-4-metylo-2-oksoglutaranowa (EC 4.1.3.17) lub aldolaza 4-hydroksy-2-oksoglutaranowa (EC 4.1.3.16), syntazy/liazy (4.1.2.-), dehydrogenazy tryptofanowej (EC 1.4.1.19), transaminazy tryptofanofenylopirogronianowej (EC 2.6.1.28), aminotransferazy tryptofanowej (EC 2.6.1.27), aminotransferazy

PL 208 481 B1 tyrozynowej (aromatycznej) (EC 2.6.1.5), aminotransferazy wielosubstratowej (EC 2.6.1.-), aminotransferazy asparaginianowej (EC 2.6.1.1), dehydrogenazy fenyloalaninowej (EC 1.4.1.20), dehydrogenazy glutaminianowej (EC 1.4.1.2, 1.4.1.3, 1.4.1.4), dehydrogenazy D-aminokwasowej (EC 1.4.99.1), aminotransferazy D-tryptofanowej i/lub aminotransferazy D-alaninowej (EC 2.6.1.21).

Ponadto, ujawnione komórki mogą posiadać jedną lub więcej następujących aktywności, na przykład, dwie lub więcej bądź trzy lub więcej z następujących aktywności: aminotransferazy tryptofanowej (EC 2.6.1.27), aminotransferazy tyrozynowej (aromatycznej) (EC 2.6.1.5), aminotransferazy wielosubstratowej (EC 2.6.1.-), aminotransferazy asparaginianowej (EC 2.6.1.1), dehydrogenazy tryptofanowej (EC 1.4.1.19), transaminazy tryptofanofenylopirogronianowej (EC 2.6.1.28), oksydazy L-aminokwasowej (EC 1.4.3.2), oksydazy tryptofanowej (bez numeru EC), dehydrogenazy D-aminokwasowej (EC 1.4.99.1), oksydazy D-aminokwasowej (EC 1.4.3.3), aminotransferazy D-alaninowej (EC 2.6.1.21), dehydrogenazy indolomleczanowej (EC 1.1.1.110), dehydrogenazy R-4-hydroksyfenylomleczanowej (EC 1.1.1.222), reduktazy 3-(4)-hydroksyfenylopirogronianowej (EC 1.1.1.237), dehydrogenazy mleczanowej (EC 1.1.1.27, 1.1.1.28, 1.1.2.3), dehydrogenazy (3-imidazol-5-ilo)mleczanowej (EC 1.1.1.111), oksydazy mleczanowej (EC 1.1.3.-), syntazy/liazy (4.1.3.-), takiej jak aldolaza 4-hydroksy-4-metylo-2-oksoglutaranowa (EC 4.1.3.17) lub aldolaza 4-hydroksy-2-oksoglutaranowa (EC 4.1.3.16), syntazy/liazy (4.1.2.-), dehydrogenazy glutaminianowej (EC 1.4.1.2, 1.4.1.3, 1.4.1.4), dehydrogenazy fenyloalaninowej (EC 1.4.1.20), i/lub aminotransferazy D-tryptofanowej.

Monatynę można wytwarzać sposobem, który obejmuje zetknięcie tryptofanu i/lub kwasu indolo-3-mlekowego z pierwszym polipeptydem, gdzie pierwszy polipeptyd przekształca tryptofan i/lub kwas indolo-3-mlekowy w indolo-3-pirogronian (jako substrat, który przekształcany jest w indolo-3-pirogronian, można stosować albo postać D bądź L tryptofanu albo kwas indolo-3-mlekowy, specjalista w tej dziedzinie będzie zdawać sobie sprawę, że polipeptydy wybrane do tego etapu idealnie wykazują właściwą specyficzność), zetknięcie otrzymanego indolo-3-pirogronianu z drugim polipeptydem, gdzie drugi polipeptyd przekształca indolo-3-pirogronian w kwas 2-hydroksy-2-(indol-3-ilometylo)-4-ketoglutarowy (MP), i zetknięcie MP z trzecim polipeptydem, gdzie trzeci polipeptyd przekształca MP w monatynę. Przykładowe polipeptydy, które można stosować do tych przekształceń przedstawiono na Fig. 2 i 3.

Inny aspekt wynalazku zapewnia kompozycje takie jak MP, komórki, które zawierają co najmniej dwa polipeptydy lub czasami co najmniej trzy lub co najmniej cztery polipeptydy, które są kodowane przez co najmniej jedną egzogenną sekwencję kwasu nukleinowego.

Wynalazek przedstawiono w przykładach wykonania.

Krótki opis figur

FIG. 1 przedstawia szlaki biosyntetyczne wykorzystywane do wytwarzania monatyny i/lub indolo-3-pirogronianu. W jednym szlaku powstaje indolo-3-pirogronian przez tryptofan, podczas gdy w innym powstaje indolo-3-pirogronian przez kwas indolo-3-mlekowy.

Monatyna wytwarzana jest przez półprodukt, kwas 2-hydroksy-2-(indol-3-ilometylo)-4-ketoglutarowy (MP).

Związki przedstawione w ramkach są substratami i produktami wytwarzanymi w szlakach biosyntetycznych.

Kompozycje sąsiadujące ze strzałkami są kofaktorami lub substratami reakcji, które można wykorzystywać podczas przekształcania substratu w produkt. Stosowany kofaktor lub substrat reakcji będzie zależał od polipeptydu stosowanego w określonym etapie szlaku biosyntetycznego. Kofaktor PLP (5'-fosforan pirydoksalu) może katalizować reakcje niezależnie od polipeptydu, i dlatego też, dostarczając jedynie PLP można umożliwić postęp reakcji od substratu do produktu.

FIG. 2 jest bardziej szczegółowym diagramem szlaku biosyntetycznego, który wykorzystuje półprodukt MP. Substraty dla każdego etapu w szlaku przedstawiono w ramkach. Polipeptydy umożliwiające przekształcanie pomiędzy substratami wymieniono w pobliżu strzałek znajdujących się pomiędzy substratami. Każdy polipeptyd opisano jego nazwą zwyczajową i numerem klasy enzymatycznej (EC).

FIG. 3 przedstawia bardziej szczegółowy diagram szlaku biosyntetycznego przekształcania kwasu indolo-3-mlekowego w indolo-3-pirogronian. Substraty przedstawiono w ramkach a polipeptydy umożliwiające przekształcanie pomiędzy substratami wymieniono w pobliżu strzałek znajdujących się pomiędzy substratami. Każdy polipeptyd opisano jego nazwą zwyczajową i numerem klasy enzymatycznej (EC).

FIG. 4 przedstawia jedną z możliwych reakcji wytwarzania MP sposobami chemicznymi.

PL 208 481 B1

FIG. 5A i 5B są chromatogramami przedstawiającymi identyfikację LC/MS monatyny wytworzonej enzymatycznie.

FIG. 6 jest elektro-rozpyłowym widmem masowym enzymatycznie zsyntetyzowanej monatyny.

FIG. 7A i 7B przedstawiają chromatogramy analiz jonów potomnych LC/MS/MS monatyny wytworzonej w mieszaninie enzymatycznej.

FIG. 8 jest chromatogramem przedstawiającym pomiary masy o wysokiej rozdzielczości monatyny wytworzonej enzymatycznie.

FIG. 9A-9C są chromatogramami przedstawiającymi chiralny rozdział (A) R-tryptofanu, (B)

S-tryptofanu oraz (C) monatyny wytworzonej enzymatycznie.

FIG. 10 jest wykresem słupkowym przedstawiającym względną ilość monatyny wytworzonej w komórkach bakteryjnych po indukcji IPTG. (-) wskazuje brak dodawania substratu (nie dodawano ani tryptofanu ani pirogronianu).

FIG. 11-12 są schematycznymi diagramami przedstawiającymi szlaki stosowane do podwyższania wydajności monatyny wytwarzanej z tryptofanu lub indolo-3-pirogronianu.

FIG. 13 jest schematycznym diagramem przedstawiającym szlak, który można stosować do podwyższania wydajności monatyny wytwarzanej z tryptofanu lub indolo-3-pirogronianu.

Lista sekwencji

Sekwencje nukleinowe i aminokwasowe wymienione w liście sekwencji przedstawiono wykorzystując standardowe skróty literowe dla zasad nukleotydowych oraz trójliterowy kod dla aminokwasów. Przedstawiono tylko jedną nić dla każdej sekwencji kwasu nukleinowego, ale uważa się, że wszelkie odniesienia do przedstawionej nici obejmują nić komplementarną.

Sekwencje o numerach identyfikacyjnych SEQ ID No. 1 i 2 przedstawiają, odpowiednio, sekwencje kwasu nukleinowego i aminokwasową aminotransferazy z Sinorhizobium meliloti, (gen tatA, zwany w literaturze genem aminotransferazy tyrozynowej lub aromatycznej).

Sekwencje o numerach identyfikacyjnych SEQ ID No. 3 i 4 przedstawiają, odpowiednio, sekwencje kwasu nukleinowego i aminokwasową aminotransferazy tyrozynowej z Rhodobacter sphaeroides (2.4.1) (przez homologię z tatA (Sekwencje o numerach identyfikacyjnych SEQ ID No. 1 i 2), na podstawie oprogramowania genomowego przewidywane jako aminotransferaza asparaginianowa).

Sekwencje o numerach identyfikacyjnych SEQ ID No. 5 i 6 przedstawiają, odpowiednio, sekwencje kwasu nukleinowego i aminokwasową aminotransferazy z Rhodobacter sphaeroides (35053), (nowe, sklonowane w oparciu o sekwencję 2.4.1 sekwencji o numerach identyfikacyjnych SEQ ID No. 3 i 4).

Sekwencje o numerach identyfikacyjnych SEQ ID No. 7 i 8 przedstawiają, odpowiednio, sekwencje kwasu nukleinowego i aminokwasową aminotransferazy o szerokim spektrum substratowym (bsat) z Leishmania major.

Sekwencje o numerach identyfikacyjnych SEQ ID No. 9 i 10 przedstawiają, odpowiednio, sekwencje kwasu nukleinowego i aminokwasową aminotransferazy aromatycznej (araT) z Bacillus subtilis.

Sekwencje o numerach identyfikacyjnych SEQ ID No. 11 i 12 przedstawiają, odpowiednio, nowe sekwencje kwasu nukleinowego i aminokwasową aminotransferazy aromatycznej (araT) z Lactobacillus amylovorus (przez homologię identyfikowaną jako aminotransferazę aromatyczną).

Sekwencje o numerach identyfikacyjnych SEQ ID No. 13 i 14 przedstawiają, odpowiednio, sekwencje kwasu nukleinowego i aminokwasową aminotransferazy wielosubstratowej (msa) z R. sphaeroides (35053) (zidentyfikowaną jako aminotransferazę wielosubstratową przez homologię do sekwencji o numerze dostępu AAAE01000093.1, 14743-16155 bp oraz o numerze dostępu ZP00005082.1).

Sekwencje o numerach identyfikacyjnych SEQ ID No. 15 i 16 przedstawiają startery stosowane do klonowania sekwencji aminotransferazy D-alaninowej B. subtilis (dat).

Sekwencje o numerach identyfikacyjnych SEQ ID No. 17 i 18 przedstawiają startery stosowane do klonowania sekwencji tatA S. meliloti.

Sekwencje o numerach identyfikacyjnych SEQ ID No. 19 i 20 przedstawiają startery stosowane do klonowania sekwencji aminotransferazy araT B. subtilis.

Sekwencje o numerach identyfikacyjnych SEQ ID No. 21 i 22 przedstawiają startery stosowane do klonowania sekwencji aminotransferazy wielosubstratowej (2.4.1 i 35053) Rhodobacter sphaeroides.

Sekwencje o numerach identyfikacyjnych SEQ ID No. 23 i 24 przedstawiają startery stosowane do klonowania sekwencji bsat Leishmania major.

Sekwencje o numerach identyfikacyjnych SEQ ID No. 25 i 26 przedstawiają startery stosowane do klonowania sekwencji araT Lactobacillus amylovorus.

PL 208 481 B1

Sekwencje o numerach identyfikacyjnych SEQ ID No. 27 i 28 przedstawiają startery stosowane do klonowania sekwencji tatA R. sphaeroides (obydwu 2.4.1 i 35053).

Sekwencje o numerach identyfikacyjnych SEQ ID No. 29 i 30 przedstawiają startery stosowane do klonowania sekwencji aspC E. coli (sekwencja genowa o numerze dostępu w Genbank: AE000195.1, sekwencja białkowa o numerze dostępu w Genbank: AAC74014.1).

Sekwencje o numerach identyfikacyjnych SEQ ID No. 31 i 32 przedstawiają, odpowiednio, sekwencje kwasu nukleinowego i aminokwasową aminotransferazy aromatycznej (tyrB) z E. coli.

Sekwencje o numerach identyfikacyjnych SEQ ID No. 33 i 34 przedstawiają startery stosowane do klonowania sekwencji tyrB E. coli.

Sekwencje o numerach identyfikacyjnych SEQ ID No. 35-40 przedstawiają startery stosowane do klonowania polipeptydów o aktywności aldolazy 4-hydroksy-2-oksoglutaranowej (KHG) (EC 4.1.3.16).

Sekwencje o numerach identyfikacyjnych SEQ ID No. 41 i 42 przedstawiają sekwencje kwasu nukleinowego tryptofanazy (tna) z E. coli i liazy tyrozyno-fenolowej (tp1) z Citrobacter freundii, kodujące białka, odpowiednio, P00913 (GI:401195) i P31013 (GI:401201).

Sekwencje o numerach identyfikacyjnych SEQ ID No. 43-46 przedstawiają startery stosowane do klonowania polipeptydów tryptofanazy i polipepydów β-tyrozynazy (liazy tyrozyno-fenolowej).

Sekwencje o numerach identyfikacyjnych SEQ ID No. 47-54 przedstawiają startery stosowane do mutowania polipeptydów tryptofanazy i polipepydów β-tyrozynazy.

Sekwencje o numerach identyfikacyjnych SEQ ID No. 55-64 przedstawiają startery stosowane do klonowania polipeptydów o aktywności aldolazy 4-hydroksy-4-metylo-2-oksoglutaranowej (EC 4.1.3.17).

Sekwencje o numerach identyfikacyjnych SEQ ID No. 65 i 66 przedstawiają, odpowiednio, sekwencje kwasu nukleinowego i aminokwasową aldolazy 4-hydroksy-4-metylo-2-oksoglutaranowej (proA) z C. testosteroni.

Sekwencje o numerach identyfikacyjnych SEQ ID No. 67-68 przedstawiają startery stosowane do klonowania aldolazy 4-hydroksy-4-metylo-2-oksoglutaranowej (proA) z C. testosteroni w operonie z aspC E. coli w pET30 Xa/LIC.

Sekwencje o numerach identyfikacyjnych SEQ ID No. 69-72 przedstawiają startery stosowane do klonowania aspC E. coli i proA C. testosteroni w pESC-his.

Sekwencje o numerach identyfikacyjnych SEQ ID No. 73-74 przedstawiają sekwencje dodane do końca 5' starterów stosowanych do klonowania genów ujawnionych w opisie.

Skróty i terminy

Poniższe wyjaśnienia terminów i metod przedstawiono dla lepszego opisania wynalazku oraz dla udzielenia wskazówek specjalistom w tej dziedzinie co do stosowania wynalazku w praktyce.

Termin zawierający oznacza obejmujący, a formy w liczbie pojedynczej odnoszą się również do liczby mnogiej o ile z kontekstu wyraźnie nie wynika inaczej. Na przykład, odniesienie do terminu zawierający białko obejmuje jedno lub wiele takich białek a odniesienie do terminu zawierający komórkę obejmuje odniesienie do jednej lub więcej komórek i ich równoważników znanych specjalistom w tej dziedzinie, itd.

O ile nie wyjaśniono inaczej, wszystkie terminy techniczne i naukowe stosowane w opisie mają takie samo znaczenie jak powszechnie rozumiane przez specjalistę w dziedzinie wynalazku. Chociaż w praktycznym stosowaniu lub testowaniu wynalazku można stosować metody i materiały podobne lub równoważne do opisanych w opisie, to jednak odpowiednie metody i materiały opisano poniżej.

Materiały, metody i przykłady są jedynie ilustracyjne i nie stanowią one ograniczenia. Inne cechy i zalety wynalazku staną się oczywiste na podstawie poniższego szczegółowego opisu i zastrzeżeń.

cDNA (komplementarny DNA): kawałek DNA pozbawionego wewnętrznych, nie kodujących odcinków (intronów) i sekwencji regulatorowych, które determinują transkrypcję. cDNA można syntetyzować w laboratorium przez odwrotną transkrypcję z informacyjnego RNA wyekstrahowanego z komórek.

Podstawienie konserwatywne: jedno lub więcej podstawień aminokwasowych (na przykład 2, 5 lub 10 reszt) dla reszt aminokwasowych mających podobne właściwości biochemiczne. Zazwyczaj, podstawienia konserwatywne mają mały lub żaden wpływ na aktywność otrzymywanego polipeptydu. Na przykład, idealnie, polipeptyd aminotransferazy tryptofanowej obejmujący jedno lub więcej podstawień konserwatywnych zachowuje aktywność aminotransferazy tryptofanowej. Polipeptyd można wytwarzać tak, aby zawierał jedno lub więcej podstawień konserwatywnych, przez manipulację sekwen8

PL 208 481 B1 cją nukleotydową, która koduje ten polipeptyd, stosując na przykład standardowe procedury, takie jak mutageneza ukierunkowana wobec miejsca lub PCR.

Warianty podstawieniowe są wariantami, w których usunięto co najmniej jedną resztę w sekwencji aminokwasowej i w jej miejsce wstawiono inną resztę. Przykłady aminokwasów, które można podstawiać w miejsce oryginalnego aminokwasu w białku i, które uważa się za podstawienia konserwatywne obejmują: ala podstawioną ser lub thr, arg podstawioną gln, his lub lys, asn podstawioną glu, gln, lys, his, asp; asp podstawiony asn, glu lub gln; cys podstawioną ser lub ala; gln podstawioną asn, glu, lys, his, asp, lub arg; glu podstawiony asn, gln lys lub asp; gly podstawioną pro; his podstawioną asn, lys, gln, arg, tyr; ile podstawioną leu, met, val, phe; leu podstawioną ile, met, val, phe; lys podstawioną asn, glu, gln, his, arg; met podstawioną ile, leu, val, phe; phe podstawioną trp, tyr, met, ile lub leu; ser podstawioną thr, ala; thr podstawioną ser lub ala; trp podstawiony phe, tyr; tyr podstawioną his, phe lub trp; oraz val podstawioną met, ile, leu.

Dalsze informacje na temat podstawień konserwatywnych można znaleźć, między innymi, w Ben-Bassat i in., (J. Bacteriol. 169: 751-7, 1987), O'Regan i in., (Gene 77: 237-51, 1989), Sahin-Toth i in., (Protein Sci. 3: 240-7, 1994), Hochuli i in., (Bio/Technology 6:1321-5, 1988), WO 00/67796 (Curd i in.) oraz w standardowych podręcznikach genetyki i biologii molekularnej.

Termin egzogenny, stosuje się w opisie w odniesieniu do kwasu nukleinowego i określonej komórki, odnosi się do każdego kwasu nukleinowego, który nie pochodzi, w warunkach naturalnych, z tej okreś lonej komórki. A zatem, nie wyst ę pują cy naturalnie kwas nukleinowy uważ a się za egzogenny dla komórki po wprowadzeniu go do tej komórki. Kwas nukleinowy, który występuje naturalnie również może być egzogenny dla określonej komórki. Na przykład, cały chromosom wyizolowany z komórki osoby X jest egzogennym kwasem nukleinowym w odniesieniu do komórki osoby Y, je ś li ten chromosom wprowadzi się do komórki Y.

Funkcjonalny równoważnik: Posiadający równoważną funkcję. W kontekście enzymu cząsteczki funkcjonalnie równoważne obejmują różne cząsteczki, które zachowują funkcję enzymu. Na przykład, funkcjonalne równoważniki można zapewniać przez zmiany sekwencji w sekwencji enzymu, przy czym peptyd z jedną lub więcej zmianami sekwencji zachowuje funkcję niezmienionego peptydu tak, że zachowuje on swoją aktywność enzymatyczną. W konkretnym przykładzie, funkcjonalny równoważnik aminotransferazy tryptofanowej zachowuje zdolność do przekształcania tryptofanu w indolo-3-pirogronian.

Przykłady zmian sekwencji obejmują, bez ograniczenia, podstawienia konserwatywne, delecje, mutacje, przesunięcia ramek odczytu oraz insercje. W pewnym przykładzie, dany polipeptyd wiąże się z przeciwciałem, a funkcjonalnym równoważnikiem jest polipeptyd, który wiąże się z tym samym przeciwciałem. A zatem, funkcjonalny równoważnik obejmuje peptydy, które posiadają taką samą specyficzność wiązania jak polipeptyd i, które można stosować jako reagent w miejsce polipeptydu. W pewnym przykładzie, funkcjonalny równoważnik obejmuje polipeptyd, w którym sekwencja wiążąca jest nieciągła, przy czym przeciwciało wiąże się z liniowym epitopem. A zatem, jeśli sekwencja peptydu jest MPELANDLGL (1-10 aminokwasów sekwencji o numerze identyfikacyjnym SEQ ID No. 12), to funkcjonalny równoważnik obejmuje epitopy nieciągłe, które mogą przedstawiać się następująco (** = dowolna liczba aminokwasów rozdzielających):

NH2-**-M**P**E**L**A**N**D**L**G**L-COOH.

W tym przykładzie, polipeptyd jest funkcjonalnym równoważnikiem aminokwasów 1-10 sekwencji o numerze identyfikacyjnym SEQ ID No. 12, jeśli struktura trójwymiarowa polipeptydu jest taka, że może on wiązać się z przeciwciałem monoklonalnym, które wiąże się z aminokwasami 1-10 sekwencji o numerze identyfikacyjnym SEQ ID No. 12.

Hybrydyzacja: Termin hybrydyzacja, odnosi się do metody testowania komplementarności sekwencji nukleotydowych dwóch cząsteczek kwasu nukleinowego, opierając się na zdolności komplementarnych jednoniciowych DNA i/lub RNA do tworzenia cząsteczek dupleksu. Według wynalazku, techniki hybrydyzacji kwasów nukleinowych można stosować do otrzymywania wyizolowanego kwasu nukleinowego. W skrócie, dowolny kwas nukleinowy wykazujący jakąś homologię do sekwencji przedstawionej w sekwencji o numerze identyfikacyjnym SEQ ID No. 11 można stosować jako sondę do identyfikacji podobnego kwasu nukleinowego przez hybrydyzację w warunkach od umiarkowanie do wysoce surowych.

Po identyfikacji, kwas nukleinowy można następnie oczyszczać, sekwencjonować i analizować w celu okreś lenia, czy wchodzi on w zakres wynalazku.

PL 208 481 B1

Hybrydyzację można przeprowadzać przez analizę Southern lub Northern, dla identyfikacji sekwencji, odpowiednio, DNA lub RNA, która hybrydyzuje z sondą. Sondę można znakować biotyną, digoksygeniną, polipeptydem lub izotopem promieniotwórczym, takim jak ³²P. Analizowany DNA lub RNA można elektroforetycznie rozdzielać na żelu agarozowym lub poliakryloamidowym, przenosić na nitrocelulozę, nylon lub inną odpowiednią membranę i hybrydyzować z sondą, stosując standardowe techniki dobrze znane w nauce, takie jak te opisane w części 7.39-7.52 Sambrook i in., (1989) Molecular Cloning, wyd.2, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, NY. Zazwyczaj, sonda ma co najmniej 20 nukleotydów długości. Na przykład, sondę odpowiadającą sekwencji 20 ciągłych nukleotydów przedstawionej w sekwencji o numerze identyfikacyjnym SEQ ID No. 11 można stosować do identyfikacji identycznego lub podobnego kwasu nukleinowego.

Wynalazek zapewnia również sekwencje wyizolowanego kwasu nukleinowego, które mają co najmniej 12 zasad długości (np., co najmniej około 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 100, 250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000 lub 5000 zasad długości) i hybrydyzują, w warunkach hybrydyzacji, z sensowną lub nonsensowną nicią kwasu nukleinowego, posiadającego sekwencję przedstawioną w sekwencji o numerze identyfikacyjnym SEQ ID No. 11. Warunki hybrydyzacji mogą być warunkami o umiarkowanej do wysokiej surowości.

Dla celów tego wynalazku, umiarkowanie surowe warunki hybrydyzacji oznaczają, że hybrydyzację przeprowadza się w temperaturze około 42°C w roztworze hybrydyzacyjnym, zawierającym 25 mM KPO₄ (pH 7,4), 5X SSC, 5X roztwór Denharta, 50 μg/ml zdenaturowanego, sonifikowanego DNA nasienia łososia, 50% formamid, 10% siarczan dekstranu i 1-15 ng/ml sondy (około 5x10⁷ cpm/ig), podczas gdy przemywania przeprowadza się w temperaturze około 50°C, stosując roztwór do przemywania zawierający 2X SSC i 0,1% sodowy siarczan dodecylu.

Warunki hybrydyzacji o wysokiej surowości oznaczają, że hybrydyzację przeprowadza się w temperaturze około 42°C w roztworze hybrydyzacyjnym, zawierającym 25 mM KPO4 (pH 7,4), 5X SSC, 5X roztwór Denharta, 50 μg/ml zdenaturowanego, sonifikowanego DNA nasienia łososia, 50% formamid, 10% siarczan dekstranu oraz 1-15 ng/ml sondy (około 5x10⁷ cpm/ig), podczas gdy przemywania przeprowadza się w temperaturze około 65°C, stosując roztwór do przemywania zawierający 0,2X SSC i 0,1% sodowy siarczan dodecylu.

Termin wyizolowany, stosuje się w odniesieniu do kwasu nukleinowego, dotyczy naturalnie występującego kwasu nukleinowego, który nie jest bezpośrednio ciągły z obiema sekwencjami, z którymi jest bezpośrednio ciągły (jednej po stronie końca 5' i jednej po stronie końca 3') w naturalnie występującym genomie organizmu, z którego pochodzi.

Na przykład, wyizolowany kwas nukleinowy może być, bez ograniczeń, cząsteczką rekombinowanego DNA dowolnej długości, z zastrzeżeniem, że jedną z sekwencji kwasu nukleinowego zazwyczaj stwierdzaną jako bezpośrednio flankującą rekombinowaną cząsteczkę DNA w naturalnie występującym genomie usuwa się lub jest ona nieobecna. A zatem, wyizolowany kwas nukleinowy obejmuje, bez ograniczeń, rekombinowany DNA, która istnieje jako odrębna cząsteczka (np. cDNA lub fragment genomowego DNA wytworzone przez PCR lub działanie endonukleazami restrykcyjnymi), niezależnie od innych sekwencji, jak również jako rekombinowany DNA, który włączono do wektora, plazmidu ulegającego autonomicznej replikacji, wirusa (np. retrowirusa, adenowirusa lub herpeswirusa) lub do genomowego DNA prokariota bądź eukariota. Ponadto, wyizolowany kwas nukleinowy może obejmować cząsteczkę rekombinowanego DNA, która jest częścią hybrydowej lub fuzyjnej cząsteczki kwasu nukleinowego.

Termin wyizolowany stosuje się w odniesieniu do kwasu nukleinowego, dotyczy również dowolnego nie występującego naturalnie kwasu nukleinowego, ponieważ nie występujących naturalnie sekwencji kwasu nukleinowego nie znajduje się w naturze i nie posiadają one bezpośrednich ciągłych sekwencji w naturalnie występującym genomie. Na przykład, nie występujący naturalnie kwas nukleinowy, taki jak kwas nukleinowy otrzymany technikami inżynierii uważa się za wyizolowany kwas nukleinowy. Otrzymany technikami inżynierii kwas nukleinowy można przygotowywać wykorzystując zwykłe techniki klonowania molekularnego lub techniki chemicznej syntezy kwasu nukleinowego. Wyizolowany nie występujący naturalnie kwas nukleinowy może być niezależny od innych sekwencji lub włączony do wektora, plazmidu ulegającego autonomicznej replikacji, wirusa (np. retrowirusa, adenowirusa lub herpeswirusa) lub do genomowego DNA prokariota bądź eukariota. Ponadto, wyizolowany kwas nukleinowy może obejmować cząsteczkę rekombinowanego DNA, która jest częścią hybrydowej lub fuzyjnej cząsteczki kwasu nukleinowego.

PL 208 481 B1

Dla specjalistów w tej dziedzinie będzie oczywiste, że kwasu nukleinowego występującego wśród setek do milionów innych cząsteczek kwasu nukleinowego w obrębie, na przykład, bibliotek cDNA lub genomowych, bądź żeli zawierających produkty trawienia restrykcyjnego genomowego DNA, nie uważa się za wyizolowany kwas nukleinowy.

Termin kwas nukleinowy obejmuje oba kwasy nukleinowe RNA i DNA obejmując, bez ograniczeń, cDNA, genomowy DNA oraz syntetyczny (np. zsyntetyzowany chemicznie) DNA. Kwas nukleinowy może być dwuniciowy lub jednoniciowy. Jeśli jest jednoniciowy, to kwas nukleinowy może być nicią sensowną lub nicią nonsensowną. Ponadto, kwas nukleinowy może być kołowy lub liniowy.

Połączony w sposób umożliwiający działanie: Pierwsza sekwencja kwasu nukleinowego jest połączona w sposób umożliwiający działanie z drugą sekwencją kwasu nukleinowego jeśli pierwsza sekwencja kwasu nukleinowego jest umieszczona w funkcjonalnej relacji w stosunku do drugiej cząsteczki kwasu nukleinowego. Na przykład, promotor jest połączony w sposób umożliwiający działanie z sekwencją kodują c ą , jeś li promotor wpł ywa na transkrypcję sekwencji kodują cej. Ogólnie rzecz biorąc, sekwencje DNA połączone w sposób umożliwiający działanie są ciągłe i, jeśli jest to konieczne dla połączenia dwóch regionów kodujących polipeptyd, w tej samej ramce odczytu.

Modyfikacje peptydów: Wynalazek obejmuje enzymy, jak również ich syntetyczne rozwiązania. Ponadto, w metodach opisanych w opisie można wykorzystywać analogi (niepeptydowe cząsteczki organiczne), pochodne (chemicznie modyfikowane funkcjonalnie cząsteczki peptydowe otrzymane wyjściowo z ujawnianych sekwencji peptydowych) oraz warianty (homologi) wykazujące pożądaną aktywność enzymatyczną. Peptydy obejmują sekwencje aminokwasów, które mogą być zarówno L- i/lub D-aminokwasami, naturalnie występującymi i innymi.

Peptydy można modyfikować, stosując szereg technik chemicznych, dla wytwarzania pochodnych wykazujących zasadniczą taką samą aktywność jak peptydy niemodyfikowane i, ewentualnie, posiadających inne pożądane właściwości. Na przykład, grupy kwasu karboksylowego białka, niezależnie czy końca karboksylowego czy łańcucha bocznego, można dostarczać w postaci soli farmaceutycznie dopuszczalnego kationu lub zestryfikowane, tak aby tworzyły ester C1-C16, lub przekształcone do amidu o wzorze NR1R2, gdzie R1 i R2 są każdy niezależnie atomem H lub grupą C1-C16 alkilową, albo połączone tak, aby tworzyły pierścień heterocykliczny, taki jak 5- lub 6-członowy pierścień. Grupy aminowe peptydu, niezależnie czy końca aminowego czy łańcucha bocznego, mogą być w postaci farmaceutycznie dopuszczalnych soli addycyjnych z kwasami, takimi jak HCl, HBr, kwas octwowy, benzoesowy, toluenosulfonowy, maleinowego, winowego i innych soli organicznych lub można je zmodyfikować do grup C1-C16 alkilo- lub dialkiloaminowych, bądź dalej przekształcać do amidu.

Grupy hydroksylowe łańcuchów bocznych peptydów można przekształcać w grupy C1-C16 alkoksylowe lub C1-C16 estrowe stosując dobrze znane techniki. Pierścienie fenylowe i fenolowe łańcuchów bocznych peptydów można podstawiać jednym lub więcej atomami chlorowca, takimi jak atomy F, Cl, Br lub I, lub grupami C1-C16 alkilową, C1-C16 alkoksylową, kwasami karboksylowymi i ich estrami, bądź amidami takich kwasów karboksylowych. Grupy metylenowe łańcuchów bocznych peptydów można wydłużać do homologicznych grup C2-C4 alkilenowych. Tiole można blokować stosując dowolną spośród dobrze znanych grup blokujących, takich jak grupy acetamidowe. Specjaliści w tej dziedzinie będą również znać metody wprowadzania cyklicznych struktur do peptydów według tego wynalazku w celu selekcjonowania i zapewnienia wymuszonej struktury przestrzennej, która spowoduje wzmocnienie stabilności.

Na przykład, do peptydu można dodać C- lub N-końcową cysteinę tak, że jeśli się przeprowadza utlenianie peptyd będzie zawierać wiązanie disiarczkowe, tworząc peptyd cykliczny. Inne metody cyklizacji peptydów obejmują tworzenie tioeterów oraz karboksylo- i aminokońcowych amidów oraz estrów.

W zakres wynalazku wchodzą również rozwią zania obejmują ce peptydomimetyki i organomimetyki, w których trójwymiarowe uporządkowanie chemicznych składowych takich peptydo- i organomimetyków naśladuje trójwymiarowe uporządkowanie szkieletu peptydowego i skład aminokwasowych łańcuchów bocznych, w wyniku czego dla takich peptydo- i organomimetyków białek według tego wynalazku stwierdza się wykrywalną aktywność enzymatyczną. Dla zastosowań modelowania komputerowego, farmakofora jest idealizowaną, trójwymiarową definicją wymagań strukturalnych dla aktywności biologicznej. Peptydo- i organomimetyki można projektować tak, aby dopasować każdą farmakoforę za pomocą aktualnego oprogramowania modelowania komputerowego (stosując komputerowo wspomagane projektowanie leków czyli CADD). Walters, Computer-Assisted Modeling of Drugs, in Klegerman i Groves (red.), Pharmaceutical Biotechnology, 1993, Interpharm Press: Buffalo Grove, IL, str. 165-74 i Ch. 102 in Munson (red.), Principles of Pharmacology, 1995, Chapman i Hall, dla

PL 208 481 B1 zapoznania się z opisami technik stosowanych w CADD. W zakres wynalazku wchodzą również mimetyki przygotowywane z zastosowaniem takich technik.

W jednym z przykładów, mimetyki naśladują aktywność enzymatyczną enzymu lub jego warianta, fragmentu bądź fuzji.

Sondy i startery: Kwasy nukleinowe sond i starterów można z łatwością przygotowywać w oparciu o sekwencje aminokwasowe i kwasów nukleinowych przedstawione w opisie. Sonda obejmuje wyizolowany kwas nukleinowy zawierający wykrywalny znacznik lub cząsteczkę reporterową. Przykładowe znaczniki obejmują, bez ograniczania, izotopy radioaktywnych, ligandów, czynniki chemiluminescencyjne i polipeptydy. Metody znakowania i kierowania wyborem znaczników odpowiednich dla różnych celów omawia się, na przykład, w Sambrook i in. (red.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual wydanie 2, tom 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989 oraz Ausubel i in. (red.) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York (z aktualizacjami), 1987.

Startery są zazwyczaj cząsteczkami kwasu nukleinowego posiadającymi dziesięć lub więcej nukleotydów (np. cząsteczki kwasu nukleinowego posiadające pomiędzy 10 a 100 nukleotydów). Starter można przyłączać do komplementarnej nici docelowego kwasu nukleinowego przez hybrydyzację z utworzeniem hybrydy pomiędzy starterem a nicią docelowego kwasu nukleinowego a następnie wydłużać wzdłuż nici docelowego kwasu nukleinowego przez, na przykład, polimerazę DNA polipeptydu. Pary starterów można stosować do amplifikacji sekwencji kwasu nukleinowego, na przykład, przez łańcuchową reakcję polimerazy (PCR) lub inne znane w nauce metody amplifikacji kwasów nukleinowych.

Sposoby przygotowywania i stosowania sond i starterów opisano, na przykład, w takich pozycjach literaturowych jak Sambrook i in. (red.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, wyd. 2, tom 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989; Ausubel i in. (red.), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York (z cyklicznymi aktualizacjami), 1987 oraz Innis i in. (red.), PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press: San Diego, 1990.

Pary starterów do PCR mogą pochodzić ze znanej sekwencji, na przykład, dzięki zastosowaniu programów komputerowych przeznaczonych do tego celu, takich jak Primer (wersja 0.5, © 1991, Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, Mass.). Dla specjalistów w tej dziedzinie będzie oczywiste, że specyficzność określonej sondy lub startera wzrasta wraz z długością, ale wielkość sondy lub startera może pozostawać w zakresie od sekwencji o pełnej długości do sekwencji tak krótkich, jak pięć kolejnych nukleotydów.

A zatem, na przykład, starter o długości 20 kolejnych nukleotydów można przyłączać do celu z wyż szą specyficznoś cią niż odpowiadają cy starter o dł ugoś ci jedynie 15 nukleotydów. W celu uzyskania wyższej specyficzności, sondy i startery można wybierać tak, że zawierają, na przykład, 10, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600, 1650, 1700, 1750, 1800, 1850, 1900, 2000, 2050, 2100, 2150, 2200, 2250, 2300, 2350, 2400, 2450, 2500, 2550, 2600, 2650, 2700, 2750, 2800, 2850, 2900, 3000, 3050,3100, 3150, 3200, 3250, 3300, 3350, 3400, 3450, 3500, 3550, 3600, 3650, 3700, 3750, 3800, 3850, 3900, 4000, 4050, 4100, 4150, 4200, 4250, 4300, 4350, 4400, 4450, 4500, 4550, 4600, 4650, 4700, 4750, 4800, 4850, 4900, 5000, 5050, 5100, 5150, 5200, 5250, 5300, 5350, 5400, 5450, lub więcej kolejnych nukleotydów.

Promotor: Szereg sekwencji kontrolnych kwasu nukleinowego, które kierują transkrypcją kwasu nukleinowego. Promotor obejmuje konieczne sekwencje kwasu nukleinowego w pobliżu miejsca startu transkrypcji, takie jak w przypadku promotora polimerazy typu II, element TATA. Promotor może zawierać dystalne elementy wzmacniające lub represorowe, które mogą być położone tak daleko jak kilka tysięcy par zasad od miejsca startu transkrypcji.

Termin oczyszczony/nie wymaga absolutnej czystości jest raczej terminem względnym. Na przykład, oczyszczonym preparatem polipeptydu lub kwasu nukleinowego może być preparat, w którym polipeptyd lub kwas nukleinowy, odpowiednio, jest w wyższym stężeniu niż byłby polipeptyd lub kwas nukleinowy w swoim naturalnym środowisku, w obrębie organizmu. Na przykład, preparat polipeptydu można uważać za oczyszczony jeśli zawartość polipeptydu w preparacie stanowi co najmniej 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 98% lub 99% całkowitej zawartości białka preparatu.

Rekombinowany kwas nukleinowy jest kwasem nukleinowym posiadającym (1) sekwencję, która nie występuje naturalnie w organizmie, w którym ulega ona ekspresji, lub (2) sekwencję wyko12

PL 208 481 B1 naną przez sztuczne połączenie dwóch inaczej rozdzielonych, krótszych sekwencji. To sztuczne połączenie często przeprowadza się przez syntezę chemiczną lub, częściej, przez sztuczną manipulację wyizolowanymi odcinkami kwasów nukleinowych, np. technikami inżynierii genetycznej. Rekombinowany stosuje się również do opisania cząsteczek kwasu nukleinowego, które poddawano sztucznym manipulacjom, ale zawierają te same sekwencje regulatorowe i regiony kodujące, które znajduje się w organizmie, z którego wyizolowano kwas nukleinowy.

Identyczność sekwencji: Podobieństwo pomiędzy sekwencjami aminokwasowymi wyraża się terminem podobieństwo pomiędzy sekwencjami, inaczej określanym jako identyczność sekwencji. Identyczność sekwencji często mierzy się jako procent identyczności (lub podobieństwa lub homologii). Im wyższy jest procent, tym większe podobieństwo dwóch sekwencji. Homologi lub warianty peptydu, takiego jak sekwencja o numerze identyfikacyjnym SEQ ID No. 12, wykazują stosunkowo wysoki stopień identyczności sekwencji kiedy przyporządkowuje się je stosując standardowe metody.

Metody przyporządkowywania sekwencji dla ich porównania są dobrze znane w nauce. Różne programy i algorytmy przyporządkowywania opisano w: Smith i Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482, 1981; Needleman i Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443-53, 1970; Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85: 2444-8, 1988; Higgins i Sharp, Gene 73: 237-44, 1988; Higgins i Sharp, CABIOS 5: 151-3, 1989; Corpet i in., Nucleic Acids Research 16: 10881-90, 1988 oraz Altschul i in., Nature Genet. 6: 119-29, 1994.

The NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST^TM) (Altschul i in., J. Mol. Biol. 215: 40310, 1990) dostępny jest z kilku źródeł, włącznie z National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD) i przez internet, do stosowania w połączeniu z programami do analiz sekwencji blastp, blastn, blastx, tblastn oraz tblastx.

Warianty peptydu zazwyczaj charakteryzują się posiadaniem co najmniej 50% identyczności sekwencji obliczanej na podstawie przyrównania na całej długości sekwencji aminokwasowej z wykorzystaniem NCBI Blast 2.0, gapped blastp z wybranymi parametrami domyślnymi.

Do przyrównywania sekwencji aminokwasowych większych niż około 30 aminokwasów wykorzystuje się funkcję sekwencji Blast 2 z domyślną macierzą BLOSUM62 i wybranymi parametrami domyślnymi (koszt otwarcia luki 11 i koszt powiększenia luki o każdą resztę 1). Do przyrównywania krótkich peptydów (krótszych niż około 30 aminokwasów) wykorzystuje się funkcję sekwencji Blast 2 z użyciem macierzy PAM30 z domyślnym ustawieniem parametrów (kary za otwarcie luki 9, za wydłużenie luki 1). Białka o jeszcze większym podobieństwie do sekwencji referencyjnej, analizowane tą metodą, będą wykazywać wzrastający procent identyczności, tak jak co najmniej 80%, co najmniej 90%, co najmniej 95%, co najmniej 98% lub nawet co najmniej 99% identyczności sekwencji. Gdy porównuje się odcinki mniejsze od pełnej sekwencji w kierunku identyczności sekwencji, homologi i warianty będą zazwyczaj wykazywać co najmniej 80% identyczności sekwencji na obszarze krótkich okien przeszukiwania o długości 10-20 aminokwasów i mogą wykazywać identyczność sekwencji co najmniej 85% co najmniej 90%, co najmniej 95% lub 98% w zależności od ich podobieństwa do sekwencji referencyjnej. Metody ustalenia identyczności sekwencji w takich krótkich oknach są opisane na stronie internetowej utrzymywanej przez NCBI w Bethesda, Maryland. Specjalista w tej dziedzinie zrozumie, że te zakresy identyczności sekwencji są podane jedynie jako wskazówki. Jest całkiem możliwe, że można odnaleźć znaczące homologi niespełniające tych kryteriów.

Do ustalenia procentowej identyczności sekwencji kwasu nukleinowego można użyć podobnych metod. W szczególnych przykładach przyrównuje się sekwencję homologiczną i wyjściową i ustala liczbę dopasowań licząc liczbę pozycji, w których w obu sekwencjach występuje identyczny nukleotyd lub reszta aminokwasowa. Procent identyczności sekwencji ustala się dzieląc liczbę dopasowań albo przez długość danej sekwencji w sekwencji zidentyfikowanej (np. sekwencji o numerze identyfikacyjnym SEQ ID No. 11), albo przez określoną długość (np. 100 kolejnych nukleotydów lub reszt aminokwasowych z danej sekwencji w sekwencji zidentyfikowanej), a następnie mnożąc wynik przez 100. Na przykład sekwencja nukleotydowa, która wykazuje 1166 dopasowań po przyrównaniu do sekwencji przedstawionej jako sekwencja o numerze identyfikacyjnym SEQ ID No. 11 jest w 75,0% identyczna z sekwencją przedstawioną jako sekwencja o numerze identyfikacyjnym SEQ ID No. 11 (tj. 1166:1554*100=75,0). Należy zauważyć, że procentową identyczność sekwencji zaokrągla się do pierwszej pozycji po przecinku. Na przykład 75,11, 75,12, 75,13 i 75,14 zaokrągla się do 75,1, podczas gdy 75,15, 75,16, 75,17, 75,18 i 75,19 zaokrągla sie do 75,2. Należy też zauważyć, że długość to zawsze jest liczba całkowita. W innym przykładzie, sekwencja docelowa zawierająca 20-nukleotydowy region, który daje się nałożyć na 20 kolejnych nukleotydów z sekwencji zidentyfikowanej, tak jak

PL 208 481 B1 podano poniżej, zawiera region o 75-procentowej identyczności z tą zidentyfikowaną sekwencją (tj. 15:20*100=75).

20

Sekwencja docelowa: AGGTCGTGTACTGTCAGTCA

Sekwencja zidentyfikowana: ACGTGGTGAACTGCCAGTGA

Specyficznie wiążący czynnik: Czynnik, który jest zdolny do specyficznego wiązania z dowolnym polipeptydem. Przykłady obejmują, ale nie ograniczają się do przeciwciał poliklonalnych, przeciwciał monoklonalnych (włącznie z humanizowanymi przeciwciałami monoklonalnymi), i fragmentów przeciwciał monoklonalnych, takich jak Fab, F(ab')2 oraz fragmenty Fv, jak również inny czynnik zdolny do specyficznego wiązania z epitopem takich polipeptydów.

Przeciwciała skierowane przeciw polipeptydom (lub fragmentom, wariantom bądź ich fuzjom) można stosować do oczyszczania lub identyfikowania takich polipeptydów. Opisane sekwencje aminokwasowe i kwasów nukleinowych umożliwiają wytwarzanie specyficznych opartych na przeciwciałach czynników wiążących, które rozpoznają opisane polipeptydy.

Można wytwarzać przeciwciała monoklonalne lub poliklonalne skierowane przeciw polipeptydom, częściom polipeptydów lub ich wariantom. Optymalnie, przeciwciała skierowane przeciw jednemu lub więcej epitopów antygenu polipeptydowego będą specyficznie wykrywać taki polipeptyd. Czyli, przeciwciała skierowane przeciw określonemu polipeptydowi będą rozpoznawać i wiązać się z tym określonym polipeptydem, i zasadniczo nie będą rozpoznawać i wiązać się z innymi polipeptydami. Oznaczenia, czy przeciwciało specyficznie wiąże się z określonym polipeptydem wykonuje się jedną z wielu standardowych metod oznaczeń immunologicznych, na przykład, blotting Western (np. Sambrook i in. (red.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, wyd. 2, tom 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989).

W celu określenia czy dany preparat przeciwciała (taki jak preparat wytworzony w myszy skierowany przeciw polipeptydowi posiadającemu sekwencję aminokwasową przedstawioną w sekwencji o numerze identyfikacyjnym SEQ ID No. 12) specyficznie wykrywa właściwy polipeptyd (np. polipeptyd posiadający sekwencję aminokwasową przedstawioną w sekwencji o numerze identyfikacyjnym SEQ ID No. 12) metodą blottingu Western, z komórek ekstrahuje się całkowite białko komórkowe i rozdziela przez elektoforezę w żelu poliakryloamidowym z SDS.

Rozdzielone całkowite białko komórkowe przenosi się następnie na membranę (np. nitrocelulozową) i preparat przeciwciała inkubuje się z membraną. Po przemyciu membrany w celu usunięcia niespecyficznie związanych przeciwciał, można wykrywać obecność specyficznie związanych przeciwciał stosując odpowiednie drugie przeciwciało (np. przeciwciało skierowane przeciw przeciwciałom myszy) skoniugowane z polipeptydem, takim jak fosfataza zasadowa ponieważ zastosowanie fosforanu 5-bromo-4-chloro-3-indolilu /błękitu nitrotetrazoliowego powoduje powstawanie gęstego związku o barwie niebieskiej w miejscach zlokalizowanych przez kompleks przeciwciało-fosfataza zasadowa.

Zasadniczo czyste polipeptydy odpowiednie do stosowania jako immunogeny można otrzymywać z stransfekowanych komórek, stransformowanych komórek lub komórek typu dzikiego. Stężenia polipeptydów w ostatecznym preparacie można doprowadzać, na przykład, przez zatężanie na urządzeniu filtrującym Amicon, do poziomu kilku mikrogramów na mililitr. Ponadto, jako immunogeny można wykorzystywać polipeptydy w zakresie wielkości, od polipeptydów pełnej długości do polipeptydów posiadających tak mało, jak dziewięć reszt aminokwasowych. Takie polipeptydy można wytwarzać w hodowlach komórkowych, można syntetyzować chemicznie stosując standardowe metody lub można otrzymywać przez rozszczepianie dużych polipeptydów do mniejszych polipeptydów, które można oczyszczać. Polipeptydy o długości tak małej jak dziewięć aminokwasów mogą być immunogenne kiedy prezentowane są układowi immunologicznemu w kontekście cząsteczki głównego kompleksu zgodności tkankowej (MHC), takiej jak cząsteczka MHC klasy I lub MHC klasy II. Zgodnie z tym, polipeptydy posiadające co najmniej 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 900, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350 lub więcej kolejnych reszt aminokwasowych dowolnej sekwencji amonokwasowej ujawnianej w opisie można stosować jako immunogeny do wytwarzania przeciwciał.

PL 208 481 B1

Przeciwciała monoklonalne skierowane przeciw dowolnemu polipeptydowi ujawnianemu w opisie można wytwarzać stosując mysie hybrydomy zgodnie z klasyczną metodą Kohlera i Milsteina (Nature 256: 495-7, 1975) lub metodami pochodnymi.

Poliklonalne surowice odpornościowe, zawierające przeciwciała skierowane przeciw heterogennym epitopom dowolnego ujawnianego w opisie polipeptydu, można przygotowywać immunizując odpowiednie zwierzęta polipeptydem (lub jego fragmentem), który może być niezmodyfikowany lub zmodyfikowany dla wzmocnienia immunogenności. Efektywny protokół immunizacji królików można znaleźć w Vaitukaitis i in. (J. Clin. Endocrinol. Metab. 33: 988-91,1971).

Zamiast pełnych przeciwciał można stosować fragmenty przeciwciał i można łatwo przeprowadzać ich ekspresję w prokariotycznych komórkach gospodarza. Metody przygotowywania i stosowania immunologicznie efektywnych części przeciwciał monoklonalnych, określanych również jako „fragmenty przeciwciał są dobrze znane i obejmują metody opisane w Better i Horowitz (Methods Enzymol. 178: 476-96, 1989), Glockshuber i in. (Biochemistry 29: 1362-7, 1990), US 5 648 237 (Expression of Functional Antibody Fragments), US 4 946 778 (Single Polypeptide Chain Binding Molecules), US5 455 030 (Immunotherapy Using Single Chain Polypeptide Binding Molecules) oraz cytowane w nich pozycje literaturowe.

Stransformowana komórka jest komórką, do której wprowadzono cząsteczkę kwasu nukleinowego, na przykład, technikami biologii molekularnej. Transformacja obejmuje wszystkie techniki, którymi można wprowadzać cząsteczkę kwasu nukleinowego do takiej komórki, obejmując, bez ograniczeń, transfekcję wektorem wirusowym, koniugację, transformację wektorem plazmidowym oraz wprowadzanie nagiego DNA przez elektroporację, lipofekcję i wstrzykiwanie cząstek.

Warianty, fragmenty lub białka fuzyjne: Ujawnione białka, obejmują ich warianty, fragmenty i fuzje. Sekwencje DNA (na przykład sekwencja o numerze identyfikacyjnym SEQ ID No. 11), która koduje białko (na przykład sekwencję o numerze identyfikacyjnym SEQ ID No. 12), białko fuzyjne lub fragment bądź wariant białka, można poddawać zabiegom inżynierii genetycznej dla umożliwienia ekspresji białka w komórkach eukariotycznych, bakteryjnych, owadzich i/lub roślinnych.

W celu uzyskania ekspresji, sekwencję DNA można zmieniać i łączyć umożliwiając działanie z innymi sekwencjami regulatorowymi. Ostateczny produkt, który zawiera sekwencje regulatorowe i białka, określa się jako wektor. Wektor ten można wprowadzać do komórek eukariotycznych, bakteryjnych, owadzich i/lub roślinnych. Po wprowadzeniu do komórki wektor umożliwia wytwarzanie białka.

Białko fuzyjne obejmuje białko, takie jak aminotransferaza tryptofanowa (lub jej wariant, postać polimorficzna, mutant lub fragment), na przykład sekwencję o numerze identyfikacyjnym SEQ ID No. 12, połączoną z inną sekwencją aminokwasową, która nie hamuje pożądanej aktywności białka, na przykład zdolności do przekształcania tryptofanu w indolo-3-pirogronian. W pewnym przykładzie, inne sekwencje aminokwasowe mają długość nie większą niż około 10, 12, 15, 20, 25, 30, lub 50 aminokwasów.

Dla specjalisty w tej dziedzinie będzie oczywiste, że sekwencję DNA można zmieniać bez wpływu na aktywność biologiczną kodowanego białka. Na przykład, dla tworzenia wariacji w sekwencji DNA, która koduje białko, można stosować PCR. Takie warianty mogą być wariantami optymalizowanymi pod względem preferencji kodonów w komórce gospodarza wykorzystywanej do ekspresji białka lub z innymi zmianami sekwencji, które ułatwiają ekspresję.

Wektor: Cząsteczka kwasu nukleinowego wprowadzana do komórki, dzięki której powstaje stransformowana komórka. Wektor może obejmować sekwencje kwasu nukleinowego, które umożliwiają jego replikację w komórce, takie jak miejsce początku replikacji. Wektor może również obejmować jeden lub więcej genów markerów selekcyjnych i innych elementów genetycznych znanych w nauce.

Przegląd szlaków biosyntetycznych

Jak pokazano na Fig. 1-3 oraz 11-13, do wytwarzania monatyny lub jej półproduktów, takich jak indolo-3-pirogronian lub MP, można stosować wiele szlaków biosyntetycznych. Do przekształcania każdego z substratów (glukozy, tryptofanu, kwasu indolo-3-mlekowego, indolo-3-pirogronianu i MP) w każdy produkt (tryptofan, indolo-3-pirogronian, MP i monatynę) można stosować kilka różnych polipeptydów. Ponadto, reakcje te można przeprowadzać in vivo, in vitro, lub poprzez kombinację reakcji in vivo oraz reakcji in vitro, tak jak reakcji in vitro, które obejmują nieenzymatyczne reakcje chemiczne. Dlatego też, Fig. 1-3 oraz 11-13 są przykładowe i pokazują wiele różnych szlaków, które można stosować do otrzymywania pożądanych produktów.

Glukoza do tryptofanu

Wiele organizmów może syntetyzować tryptofan z glukozy. Konstrukt(y) zawierający(ce) taki(e) gen(y) konieczny(ne) do wytwarzania monatyny, MP i/lub indolo-3-pirogronianu z glukozy i/lub tryptoPL 208 481 B1 fanu można klonować w takich organizmach. W opisie pokazano, że tryptofam można przekształcać w monatynę .

W innych przykł adach, organizm poddaje się zabiegom inż ynierii z wykorzystaniem znanych polipeptydów w celu wytwarzania tryptofanu lub nadprodukcji tryptofanu. Na przykład, US 4 371 614 (włączony do niniejszego opisu poprzez odnośnik literaturowy) opisuje szczep E. coli stransformowany plazmidem zawierającym operon tryptofanowy typu dzikiego.

Maksymalne miana tryptofanu, ujawnione w US 4 371 614, wynoszą około 230 ppm. Podobnie, WO87/01130 (włączony do niniejszego opisu poprzez odnośnik literaturowy) opisuje szczep E. coli, który poddano zabiegom inżynierii genetycznej w celu wytwarzania tryptofanu i omawia podwyższone fermentacyjne wytwarzanie L-tryptofanu. Specjaliści w tej dziedzinie będą wiedzieć, że organizmy zdolne do wytwarzania tryptofanu z glukozy są również zdolne do wykorzystywania innych źródeł węgla i energii, które mogą być przekształcane w glukozę lub fruktozo-6-fosforan, z podobnymi rezultatami. Przykładowe źródła węgla i energii obejmują, ale nie ograniczają się do sacharozy, fruktozy, skrobii, celulozy lub glicerolu.

Tryptofan do indolo-3-pirogronianu

Kilka polipeptydów można stosować do przekształcania tryptofanu do indolo-3-pirogronainu. Przykładowe polipeptydy obejmują przedstawicieli klas enzymów (EC) 2.6.1.27, 1.4.1.19, 1.4.99.1, 2.6.1.28, 1.4.3.2, 1.4.3.3, 2.6.1.5, 2.6.1.-, 2.6.1.1 i 2.6.1.21. Klasy te obejmują polipeptydy nazywane aminotransferazą tryptofanową (również określane aminotransferazą L-fenyloalanino-2-oksoglutaranową, transaminazą tryptofanową, transaminazą 5-hydroksytryptofanowo-ketoglutarową, aminotransferazą hydroksytryptofanową, aminotransferazą L-tryptofanową, transaminazą L-tryptofanową oraz aminotransferazą L-tryptofan:2-oksoglutaran), która przekształca L-tryptofan i 2-oksoglutaran w indolo-3-pirogronian i L-glutaminian; aminotransferazą D-tryptofanową, która przekształca D-tryptofan i kwas 2-okso w indolo-3-pirogronian i aminokwas; dehydrogenazą tryptofanową (również nazywaną dehydrogenazą NAD(P)-L-tryptofanową, dehydrogenazą L-tryptofanową, L-Trp-dehydrogenazą, TDH oraz oksydoreduktazą L-tryptophan:NAD(P) (deaminującą)), która przekształca L-tryptofan i NAD(P) w indolo-3-pirogronian i NH3 oraz NAD(P)H; dehydrogenazą D-aminokwasową, która przekształca

D-aminokwasy i FAD w indolo-3-pirogronian i NH3 oraz FADH2; transaminazą tryptofanofenylopirogronianową (nazywaną również aminotransferazą L-tryptofano-a-ketoizokapronianową i aminotransferazą L-tryptofan:fenylopirogronian), która przekształca L-tryptofan i fenylopirogronian w indolo-3-pirogronian i L-fenyloalaninę; oksydazą L-aminokwasową (określaną również oksydazą opio-aminokwasową i oksydoreduktazą L-aminokwas:tlen (deaminującą)), która przekształca L-aminokwas i H2O oraz O2 w kwas 2-okso oraz NH3 i H2O2; oksydazą D-aminokwasową (również określaną oksydazą opioaminokwasową i oksydoreduktazą D-aminokwas:tlen (deaminującą)), która przekształca D-aminokwas oraz H2O i O2 w kwas 2-okso oraz NH3 i H2O2; i oksydazą tryptofanową, która przekształca L-tryptofan oraz H2O i O2 w indolo-3-pirogronian oraz NH3 i H2O2. Klasy te zawierają również aminotransferazę tyrozynową (aromatyczną), aminotransferazę asparaginianową, aminotransferazę D-aminokwasową (lub D-alaninową), oraz szeroką (wielosubstratową) aminotransferazę, która posiada aktywności wielu aminotransferaz, z których niektóre mogą przekształacać tryptofan i kwas 2-okso w indolo-3-pirogronian i aminokwas.

W Przykładzie 1 opisano jedenastu przedstawicieli klasy aminotransferaz, którzy wykazują taką aktywność, włącznie z nową aminotransferazą przedstawioną w sekwencjach o numerach identyfikacyjnych: 11 i 12. A zatem, wynalazek zapewnia wyizolowany kwas nukleinowy i sekwencje białkowe wykazujące co najmniej 80%, co najmniej 85%, co najmniej 90%, co najmniej 95%, co najmniej 98%, lub nawet co najmniej 99% identyczności sekwencji z sekwencjami o numerach identyfikacyjnych SEQ ID No. 11 i 12. Wynalazek ten obejmuje również fragmenty i fuzje sekwencji o numerach identyfikacyjnych SEQ ID No. 11 i 12, które zachowują aktywność aminotransferazy lub kodują białko wykazujące aktywność aminotransferazy. Przykładowe fragmenty obejmują, ale nie ograniczają się do co najmniej 10, 12, 15, 20, 25, 50, 100, 200, 500, lub 1000 ciągłych nukleotydów sekwencji o numerze identyfikacyjnym SEQ ID No. 11 lub co najmniej 6, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 200, 300 lub 350 ciągłych aminokwasów sekwencji o numerze identyfikacyjnym SEQ ID No. 12. Ujawnione sekwencje (oraz ich warianty, fragmenty i fuzje) mogą być częścią wektora. Wektor można stosować do transformacji komórek gospodarza, wytwarzając zrekombinowane komórki, które mogą produkować indolo-3-pirogronian z tryptofanu, i w pewnych przykładach mogą również produkować MP i/lub monatynę.

Oksydazy L-aminokwasowe (1.4.3.2) są znane i sekwencje można wyizolować z kilku różnych źródeł, takich jak Vipera lebetine (sp P81375), Ophiophagus hannah (sp P81383), Agkistrodon rhodo16

PL 208 481 B1 stoma (spP81382), Crotalus atrox (sp P56742), Burkholderia cepacia, Arabidopsis thaliana, Caulobacter cresentus, Chlamydomonas reinhardtii, Mus musculus, Pseudomonas syringae oraz Rhodococcus str. Ponadto, w literaturze opisane są oksydazy tryptofanowe i można je izolować, na przykład, z Coprinus sp. SF-1, kapusty chińskiej z kiłą kapuścianą, Arabidopsis thaliana oraz wątroby ssaków. Jednego z przedstawicieli oksydaz L-aminokwasowych, które mogą przekształcać tryptofan w indolo-3-pirogronian, omówiono w Przykładzie 3, jak również alternatywne źródła dla klonowania molekularnego. Wiele genów oksydaz D-aminokwasowych dostępnych jest dla klonowania molekularnego w bazach danych.

Dehydrogenazy tryptofanowe są znane i można je izolować, na przykład, ze szpinaku, Pisum sativum, Prosopis juliflora, grochu, jadłoszynu baziowatego, pszenicy, kukurydzy, pomidora, tytoniu, Chromobacterium violaceum oraz Lactobacilli. Znane są sekwencje genowe wielu dehydrogenaz D-aminokwasowych.

Jak przedstawiono na Fig. 11-13, jeśli oksydazę aminokwasową, taką jak oksydaza tryptofanowa, stosuje się do przekształcania tryptofanu w indolo-3-pirogronian, można dodać katalazę w celu zmniejszenia lub nawet wyeliminowania obecności nadtlenku wodoru.

Indolo-3-mleczan do indolo-3-pirogronianu

Reakcja, która przekształca indolo-3-mleczan w indolo-3-pirogronian może być katalizowana przez szereg polipeptydów, takich jak przedstawicieli klas polipeptydów 1.1.1.110, 1.1.1.27, 1.1.1.28, 1.1.2.3, 1.1.1.222, 1.1.1.237, 1.1.3.- lub 1.1.1.111. Klasa polipeptydów 1.1.1.110 obejmuje dehydrogenazy indolomleczanowe (również nazywane oksydoreduktazami kwas indolomlekowy: NAD⁺). Klasy 1.1.1.27, 1.1.1.28 i 1.1.2.3 obejmują dehydrogenazy mleczanowe (nazywane również dehydrogenazami kwasu mlekowego, oksydoreduktazą mleczan:NAD⁺). Klasa 1.1.1.222 zawiera dehydrogenazę (R)-4-hydroksyfenylomleczanową (nazywaną również D-aromatyczną dehydrogenazą mleczanową, R-aromatyczną dehydrogenazą mleczanową oraz 2-oksydoreduktazą R-3-(4-hydroksyfenylo)mleczan:NAD(P)⁺) i klasa 1.1.1.237 zawiera reduktazę 3-(4-hydroksyfenylopirogronianową) (nazywaną również reduktazą hydroksyfenylopirogronianową i oksydoreduktazą 4-hydroksyfenylomleczan:NAD⁺). Klasa 1.1.3. zawiera oksydazy mleczanowe, a klasa 1.1.1.111 zawiera dehydrogenazy (3-imidazol-5-ilo)mleczanowe (nazywane również oksydoreduktazą (S)-3-(imidazol-5-ilo)mleczan:NAD(P)⁺). Jest prawdopodobne, że kilka polipeptydów z tych klas umożliwia wytwarzanie indolo-3-pirogronianu z kwasu indolo-3-mlekowego. Przykłady takiego przekształcenia są w Przykł adzie 2.

Do przekształcania kwasu indolo-3-mlekowego i indolo-3-pirogronian można również stosować reakcje chemiczne. Takie reakcje chemiczne obejmują etap utleniania, który można przeprowadzać stosując kilka metod, na przykład: utlenianie na powietrzu z katalizatorem B2 (China Chemical Reporter, v 13, n 28, p 18 (1), 2002), rozcieńczonym nadmanganianem i nadchloranem lub nadtlenkiem wodoru w obecności metalu katalizatora.

Indolo-3-pirogronian do kwasu 2-hydroksy-2-(indol-3-ilometylo)-4-ketoglutarowego (MP)

Do przekształcania indolo-3-pirogronianu w MP można stosować kilka znanych polipeptydów. Przykładowe klasy polipeptydów obejmują 4.1.3.-, 4.1.3.16, 4.1.3.17 oraz 4.1.2.-. Te klasy obejmują syntazy/liazy węgiel-węgiel, takie jak aldolazy, które katalizują kondensację dwóch substratów będących kwasami karboksylowymi. Klasa peptydów EC 4.1.3.- to syntazy/liazy, które tworzą wiązania węgiel-węgiel wykorzystując substraty oksokwasowe (takie jak indolo-3-pirogronian) jako elektrofile, podczas gdy EC 4.1.2.- to syntazy/liazy, które tworzą wiązania węgiel-węgiel wykorzystując substraty aldehydowe (takie jak aldehyd benzylowy) jako elektrofile.

Na przykład, polipeptyd opisany w EP 1 045 029 (EC 4.1.3.16, glioksylanoliaza 4-hydroksy-2-oksooglutaranu, nazywana również aldolazą 4-hydroksy-2-oksoglutaranu, aldolazą 2-okso-4-hydroksyglutaranu lub aldolazą KHG) przekształca kwas glioksylowy i pirogronian w kwas 4-hydroksy-2-ketoglutarowy, a polipeptyd aldolaza 4-hydroksy-4-metylo-2-oksoglutaranowa (EC 4.1.3.17, nazywana również pirogroniano-liazą 4-hydroksy-4-metylo-2-oksoglutaranu lub aldolazą ProA), kondensuje dwa ketokwasy, takie jak dwa pirogroniany do 4-hydroksy-4-metylo-2-oksoglutaranu. Reakcje wykorzystujące te liazy opisano w opisie.

Fig. 1-2 i 11-13 przedstawiają schematyczne diagramy tych reakcji, w których węgiel 3 (C3) cząsteczki jest połączony z indolo-3-pirogronianem. Wielu przedstawicieli EC 4.1.2.- i 4.1.3.-, zwłaszcza polipeptydów wykorzystujących PLP, może wykorzystywać cząsteczki C3, które są aminokwasami takimi jak seryna, cysteina i alanina, lub ich pochodnymi. Kondensacje aldolowe katalizowane przez reprezentatntów EC 4.1.2.- i 4.1.3.- wymagają jako trójwęglowej cząsteczki tego szlaku pirogronianu lub pochodnej pirogronianu. Jednakże, inne związki mogą służyć jako źródła węgla C3 i być przekształcane w pirogronian. Alanina może być poddawana transaminacji do pirogronianu przez wiele,

PL 208 481 B1 wykorzystujących PLP transaminaz, obejmujących wiele z tych wymienionych powyżej. Pirogronian i amoniak można otrzymywać przez reakcje beta-eliminacji (takie jak te katalizowane przez tryptofanazę lub β-tyrozynazę) L-seryny, L-cysteiny, oraz pochodnych seryny i cysteiny z odpowiednimi grupami opuszczającymi, takich jak O-metylo-L-seryna, O-benzylo-L-seryna, S-metylocysteina, S-benzylocysteina, S-alklo-L-cysteina, O-acylo-L-seryna i 3-chloro-L-alanina. Asparaginian może służyć jako źródło pirogronianu w reakcjach beta-liazy, w których pośredniczy PLP, takich jak te katalizowane przez tryptofanazę (EC 4.1.99.1) i/lub β-tyrozynazę (EC 4.1.99.2, nazywaną również tyrozyno-fenolową). Szybkość reakcji beta-liazy można podwyższyć przeprowadzając mutagenezę ukierunkowaną wobec miejsca polipeptydów (4.1.99.1-2), jak opisali Mouratou i in. (J. Biol. Chem 274: 1320-5, 1999) oraz jak opisano w Przykładzie 8.

Te modyfikacje umożliwiają polipeptydom akceptację dikarboksylowych substratów aminokwasowych. Mleczan może także służyć jako źródło pirogronianu i jest utleniany do pirogronianu przez dodanie dehydrogenazy mleczanowej i utlenionego kofaktora lub oksydazy mleczanowej lub tlenu. Przykłady takich reakcji opisano poniżej. Na przykład, jak przedstawiono na Fig. 2 i 11-13, jeśli pirogronian stosuje się jako cząsteczkę C3, to aldolazę ProA można zetknąć z indolo-3-pirogronianem.

MP można również wytwarzać stosując reakcje chemiczne, takie jak kondensacje aldolowe przedstawione w Przykładzie 5.

MP do monatyny

Przekształcanie MP do monatyny może katalizować jeden lub więcej z: aminotransferaz tryptofanowych (2.6.1.27), dehydrogenaz tryptofanowych (1.4.1.19), dehydrogenaz D-aminokwasowych (1.4.99.1), dehydrogenaz glutaminianowych (1.4.1.2-4), dehydrogenazy fenyloalaninowej (EC 1.4.1.20), transaminaz tryptofano-fenylopirogronianowych (2.6.1.28), lub bardziej ogólnie przedstawiciele rodziny aminotransferaz (2.6.1.-), tak jak aminotransferaza asparaginianowa (EC 2.6.1.1), aminotransferaza tyrozynowa (aromatyczna) (2.6.1.5), aminotransferaza D-tryptofanowa lub aminotransferaza D-alaninowa (2.6.1.21) (Fig. 2). Poniżej opisano (Przykład 1) jedenastu przedstawicieli klasy aminotransferaz, włącznie z nowym przedstawicielem klasy przedstawionym w sekwencjach o numerach identyfikacyjnych SEQ ID No. 11 i 12, a reakcje wykazujące aktywność enzymów aminotransferaz i dehydrogenaz przedwstawiono w Przykładzie 7.

Reakcję tę można również przeprowadzać wykorzystując reakcje chemiczne. Aminowanie ketokwasu (MP) przeprowadza się przez redukcyjne aminowanie z wykorzystywaniem amoniaku i cyjanoborowodorku sodowego.

Fig. 11-13 przedstawiają dodatkowe polipeptydy, które można stosować do przekształcania MP w monatynę, jak również do zapewniania wyższych wydajności otrzymywania monatyny z indolo-3-pirogronianu lub tryptofanu. Na przykład, jeśli asparaginian stosuje się jako donor grupy aminowej, aminotransferazę asparaginianową można stosować do przekształcania asparaginianu w szczawiooctan (Fig. 11). Szczawiooctan przekształca się w pirogronian w dwutlenek węgla stosując dekarboksylazę, taką jak dekarboksylaza szczawiooctanowa (Fig. 11). Ponadto, jeśli lizynę stosuje się jako donor grupy aminowej, aminotransferazę epsilon lizynową można stosować do przekształcania lizyny w allizynę (Fig. 12). Allizyna ulega spontanicznemu przekształceniu w 6-karboksylan 1-piperydeinowy (Fig. 12). Jeśli do przekształcania MP w monatynę stosuje się polipeptyd zdolny do katalizowania reakcji redukcyjnej aminacji (np. dehydrogenazę glutaminianową), można stosować polipeptyd, który jest zdolny do obiegu NAD(P)H i/lub wytwarzania lotnego produktu (Fig. 13), taki jak dehydrogenaza mrówczanowa.

Dodatkowe uwagi dotyczące projektu szlaków biosyntetycznych

W zależności od tego, jakie polipeptydy stosuje się do wytwarzania indolo-3-pirogronianu, MP i/lub monatyny, wytwarzającym komórkom można dostarczać kofaktory, substraty i/lub dodatkowe polipeptydy dla wzmocnienia tworzenia produktu.

Usuwanie nadtlenku wodoru

Nadtlenek wodoru (H2O2) jest produktem, który jeśli powstaje, może być toksyczny dla komórek produkcyjnych i może uszkadzać wytwarzane polipeptydy lub półprodukty. Opisana oksydaza L-aminokwasowa wytwarza H2O2 jako produkt. Dlatego też, jeśli stosuje się oksydazę L-aminokwasową, powstający H2O2 można usuwać lub obniżać jego poziomy dla zmniejszenia potencjalnych uszkodzeń komórki lub produktu.

Do zmniejszania poziomu H2O2 w komórce stosuje się katalazę (Fig. 11-13). W komórce produkcyjnej może zachodzić ekspresja genu lub sekwencji cDNA, która koduje katalazę (EC 1.11.1.6), katalizującą rozkład nadtlenku wodoru do wody i tlenu w postaci gazu. Na przykład, ekspresja katalazy może zachodzić z wektora, którym stransfekowano komórkę produkcyjną. Przykłady katalaz, które

PL 208 481 B1 można stosować obejmują, ale nie są ograniczone do: tr|Q9EV50 (Staphylococcus xylosus), tr|Q9KBE8 (Bacillus halodurans), tr|Q9URJ7 (Candida albicans), tr|P77948 (Streptomyces coelicolor), tr|Q9RBJ5 (Xanthomonas campestris) (numery dostępu SwissProt). Reaktory biokatalityczne wykorzystujące oksydazę L-aminokwasową, oksydazę D-aminokwasową lub oksydazę tryptofanową mogą również zawierać polipeptyd katalazy.

Modulacja dostępności PLP (pyridoksalo-5'-fosforanu)

Jak przedstawiono na Fig. 1, PLP można wykorzystywać w jednym lub więcej opisywanych w opisie etapów biosyntetycznych. Stężenie PLP można uzupełniać tak, aby PLP nie stanowił ograniczenia dla całkowitej wydajności reakcji.

Szlak biosyntetyczny witaminy B6 (prekursora PLP) zbadano dokładnie w E. coli, a niektóre z białek skrystalizowano (Laber i in., FEBS Letters, 449: 45-8, 1999). Dwa z genów (epd lub gapB i serC) wymagane są w innych szlakach metabolicznych podczas gdy trzy geny (pdxA, pdxB i pdxJ) są unikalne dla biosyntezy fosforanu pirydoksalu. Jednym z materiałów wyjściowych szlaku w E. coli jest 1-deoksy-D-ksylulozo-5-fosforan (DXP). Synteza tego prekursora ze zwykłych 2 i 3 węglowych metabolitów centralnych katalizowana jest przez polipeptyd syntazę 1-deoksy-D-ksylulozo-5-fosforanową (DSX). Innym prekursorem jest pochodna treoniny utworzona z 4-węglowego cukru, 4-fosforanu D-erytrozy. Genami wymaganymi do przekształcania w fosfo-4-hydroksylo-L-treoniny (HTP) są epd, pdxB, i serC. Ostatnią reakcją dla tworzenia PLP jest kompleksowa wewnątrzcząsteczkowa kondensacja i reakcja zamykania pierścienia pomiędzy DXP i HTP, katalizowana przez produkty genów pdxA i pdxJ.

Jeśli PLP staje się ograniczającym czynnikiem odżywczym podczas fermentacji prowadzącej do wytwarzania monatyny, podwyższoną ekspresję jednego lub więcej genów szlaku w produkcyjnych komórkach gospodarza można wykorzystywać do podwyższania wydajności wytwarzania monatyny. Organizm gospodarza może zawierać wielokrotne kopie swoich natywnych genów szlaku lub kopie nienatywnych genów szlaku można wprowdzać do genomu organizmu. Dodatkowo, wielokrotne kopie zebranych genów szlaku można klonować w organizmie gospodarza.

Jeden ze szlaków, który jest konserwatywny we wszystkich organizmach zapewnia obieg różnych pochodnych witaminy B6 do aktywnej postaci PLP. Polipeptydami zaangażowanymi w tym szlaku są kinaza pdxK, oksydaza pdxH i kinaza pdxY. Nadekspresja jednego lub więcej z tych genów może podwyższać dostępność PLP.

Poziomy witaminy B6 można podwyższać przez eliminację lub represję metabolicznej regulacji genów natywnego szlaku biosyntetycznego w organizmie gospodarza. PLP hamuje polipeptydy zaangażowane w biosyntezę pochodnej prekursora treoniny w bakterii Flavobacterium sp. szczep 238-7. Ten szczep bakteryjny, wolny od kontroli metabolicznej, wykazuje nadprodukcję pochodnych pirydoksalu i może wydzielać do 20 mg/litr PLP. Genetyczna manipulacja organizmem gospodarza wytwarzającym monatynę w podobny sposób będzie umożliwiać podwyższone wytwarzanie PLP bez nadekspresji genów szlaku biosyntetycznego.

Zużytkowanie amoniaku

Reakcje tryptofanazy można ukierunkowywać na drogę syntetyczną (wytwarzanie tryptofanu z indolu) przez zwiększanie dostępności amoniaku lub usuwanie wody. Reakcje redukcyjnej aminacji, takie jak te katalizowane przez dehydrogenazę glutaminianową, również można ukierunkowywać przez nadmiar amoniaku.

Amoniak można czynić dostępniejszym w postaci soli, węglanu amonowego lub fosforanu amonowego, w układzie buforowanym węglanami lub fosforanami. Amoniak można również dostarczać jako pirogronian amonowy lub mrówczan amonowy. Alternatywnie, amoniak można dostarczać jeśli reakcja sprzężona jest z reakcją, w której powstaje amoniak, taką jak dehydrogenazy glutaminianowej lub dehydrogenazy tryptofanowej. Amoniak można wytwarzać przez dodanie naturalnych substratów EC 4.1.99.- (tyrozyny lub tryptofanu), które będą hydrolizowane do fenolu lub indolu, pirogronianu i NH3. Pozwala to również na podwyższenie wydajności produktu syntetycznego ponad normalną równowagową ilość przez umożliwienie enzymowi hydrolizy jego preferowanego substratu.

Usuwanie produktów i produktów ubocznych

Przekształcanie tryptofanu do indolo-3-pirogronianu przez aminotransferazę tryptofanową może niekorzystnie wpływać na szybkość wytwarzania indolo-3-pirogronianu, ponieważ w wyniku reakcji powstaje glutaminian i wymaga ona ko-substratu 2-oksoglutaranu (α-ketoglutaranu). Glutaminian może powodować hamowanie aminotransferazy, i reakcja będzie zużywać duże ilości ko-substratu. Ponadto, wysokie stężenia glutaminianu są niekorzystne dla dalszych procesów rozdzielania.

PL 208 481 B1

Polipeptyd dehydrogenaza glutaminianowa (GLDH) przekształca glutaminian w 2-oksoglutaran, w ten sposób zapewniając obieg ko-substratu w reakcji katalizowanej przez aminotransferazę tryptofanową. GLDH wytwarza również równoważniki redukujące (NADH lub NADPH), które można stosować do wytwarzania energii dla komórki (ATP) w warunkach tlenowych. Wykorzystywanie glutaminianu przez GLDH zmniejsza również tworzenie produktu ubocznego. Ponadto, w reakcji powstaje amoniak, który służy jako źródło azotu dla komórki lub jako substrat w redukcyjnej aminacji etapu końcowego przedstawionego na Fig. 1. Dlatego też, komórki produkcyjne, w których zachodzi nadekspresja polipeptydu GLDH można stosować do podwyższania wydajności i zmniejszania kosztów podłoża i/lub procesów rozdzielania.

W szklaku prowadzącym od tryptofanu do monatyny, donor grupy aminowej etapu trzeciego (np. glutaminian lub asparaginian) można przekształcać z powrotem w akceptor grupy aminowej, wymagany dla etapu 1 (np. 2-oksoglutaran lub szczawiooctan), jeśli stosuje się aminotransferazę z odpowiedniej klasy enzymów. Stosowanie dwóch odrębnych transaminaz dla tego szlaku, w którym substrat jednej transaminazy nie hamuje współzawodniczo aktywności drugiej transaminazy, może podwyższać wydajność tego szlaku.

Wiele reakcji w opisanych szlakach jest odwracalnych i dlatego też będzie osiągany stan równowagi między substratami a produktami. Wydajność szlaku można podwyższać przez ciągłe usuwanie produktów od polipeptydów. Na przykład, wydzielanie monatyny do brzeczki fermantacyjnej z wykorzystaniem permeazy lub innego białka transportowego, bądź selektywna krystalizacja monatyny ze strumienia reaktora biokatalicznego z jednoczesnym wprowadzaniem w obieg substratów będzie podwyższać wydajność reakcji.

Usuwanie produktów ubocznych przez dodatkowe reakcje enzymatyczne lub przez podstawienia aminowych grup donorowych jest kolejną drogą podwyższania wydajności reakcji. Kilka przykładów omówiono w Przykładzie 13 i przedstawiono na Fig. 11-13. Idealnie wytwarzany produkt uboczny jest niedostępny do reakcji przebiegającej w przeciwnym kierunku, albo dzięki zmianie fazy (odparowywanie), albo dzięki spontanicznemu przekształcaniu w niereaktywny produkt końcowy, taki jak dwutlenek węgla.

Modulacja puli substratów

Pulę indolu można modulować przez podwyższanie wytwarzania prekursorów tryptofanu i/lub zmianę szlaków katabolicznych, obejmujących indolo-3-pirogronian i/lub tryptofan. Na przykład, wytwarzanie kwasu indolo-3-octowego z indolo-3-pirogronianu można zmniejszać lub eliminować przez funkcjonalną delecję genu kodującego dla EC 4.1.1.74 w komórce gospodarza. Wytwarzanie indolu tryptofanu można zmniejszać lub eliminować przez funkcjonalną delecję genu kodującego dla EC

4.1.99.1 w komórce gospodarza. Alternatywnie, nadmiar indolu można wykorzystywać jako substrat w procesie in vitro lub in vivo w połączeniu z podwyższonymi ilościami genu kodującego dla EC

4.1.99.1 (Kawasaki i in., J. Ferm. and Bioeng., 82: 604-6, 1996).

W celu podwyższania poziomu półproduktów, takich jak D-erytrozo-4-fosforan i chorismat można przeprowadzać genetyczne modyfikacje.

Wytwarzanie tryptofanu jest regulowane w większości organizmów. Jednym z mechanizmów jest hamowanie przez sprzężenie zwrotne pewnych enzymów w szlaku, kiedy poziom tryptofanu wzrasta, szybkość wytwarzania tryptofanu maleje. A zatem, jeśli stosuje się komórkę gospodarza zmodyfikowaną technikami inżynierii tak, aby wytwarzała monatynę przez tryptofan jako półprodukt, można stosować organizm, który nie jest wrażliwy na stężenia tryptofanu. Na przykład, wyselekcjonowano szczep Catharanthus roseus, który jest oporny na hamowanie wzrostu przez różne analogi tryptofanu przez powtarzaną ekspozycję na wysokie stężenia 5-metylotryptofanu (Schallenberg i Berlin, Z Naturforsch 34: 541-5, 1979). Uzyskana aktywność syntazy tryptofanowej szczepu była mniej podatna na hamowanie przez produkt, prawdopodobnie z powodu mutacji w genie. Podobnie, można optymalizować komórkę gospodarza stosowaną do wytwarzania monatyny.

Wytwarzanie tryptofanu można optymalizować przez stosowanie ukierunkowanej ewolucji dla uzyskania polipeptydów, które są mniej wrażliwe na hamowanie przez produkt. Na przykład, przeszukiwanie można przeprowadzać na płytkach nie zawierających tryptofanu w podłożu, ale z wysokimi poziomami niemetabolicznych analogów tryptofanu. US 5 756 345, US 4 742 007 i US 4 371 614 opisują metody stosowane do podwyższania produktywności tryptofanu w organizmach fermentacyjnych. Ostatnim etapem biosyntezy tryptofanu jest dodawanie seryny do indolu, dlatego dla zwiększenia wytwarzania tryptofanu można podwyższać dostępność seryny.

PL 208 481 B1

Ilość monatyny wytwarzanej przez organizm fermentacyjny można podwyższać przez zwiększanie ilości pirogronianu wytwarzanego przez organizm gospodarza. Pewne drożdże, takie jak Trichosporon cutaneum (Wang i in., Lett. Appl. Microbiol. 35: 338-42, 2002) i Torulopsis glabrata (Li i in., Appl Microbiol. Biotechnol. 57: 451-9, 2001) wytwarzają podwyższone ilości pirogronianu i można je stosować w praktycznym wykorzystywaniu metod ujawnianych w opisie. Ponadto, dla pobudzania wytwarzania kwasu pirogronowego można przeprowadzać modyfikacje genetyczne organizmu, takie jak te w szczepie Wl485lip2 E. coli (Kawasaki i in., J. Ferm. and Bioeng. 82: 604-6, 1996).

Kontrolowanie chiralności

Profil smaku monatyny można zmieniać przez kontrolowanie stereochemii (chiralności) cząsteczki. Na przykład, różne izomery monatyny mogą być pożądane w różnych stężeniach mieszanek dla różnych układów żywności. Chiralność można kontrolować przez kombinację kontrolowania pH i polipeptydów.

Racemizację monatyny w pozycji C-4 (patrz ponumerowana cząsteczka powyżej) można przeprowadzać przez deprotonowanie i ponowne protonowanie węgla alfa, które mogą zachodzić w wyniku przesunięcia pH lub reakcji z kofaktorem PLP. W mikroorganizmie, nie jest możliwa zmiana pH, ale PLP występuje obficie. Metody kontrolowania chiralności z zastosowaniem polipeptydów zależą od wykorzystywanej drogi biosyntetycznej do wytwarzania monatyny.

Kiedy monatyna jest wytwarzana z wykorzystaniem szlaku przedstawionego na Fig. 2, rozważać można poniższe okoliczności. W reakcji biokatalitycznej, chiralność węgla-2 determinowana jest przez enzym, który przekształca indolo-3-pirogronian w MP. Wiele enzymów (np. z EC 4.1.2.-, 4.1.3.-) może przekształcać indolo-3-pirogronian w MP, a zatem, można wybrać enzym, który tworzy pożądany izomer. Alternatywnie, enancjospecyficzność enzymu, który przekształca indolo-3-pirogronian w MP można modyfikować przez ukierunkowaną ewolucję lub można tworzyć przeciwciała katalityczne dla katalizowania pożądanej reakcji. Po wytworzeniu MP (albo enzymatycznie, albo przez kondensację chemiczną), można dodać stereospecyficznie grupę aminową stosując transaminazę, taką jak te opisane w opisie. Można utworzyć albo konfigurację R albo S węgla-4, w zależności od tego czy stosuje się aminotransferazę D- czy L-aminokwasu aromatycznego. Większość aminotransferaz jest specyficznych dla izomeru L, jednakże aminotransferazy D-tryptofanowe występują w pewnych roślinach (Kohiba i Mito, Proceedings of the 8th International Symposium on Vitamin B6 and Carbonyl Catalysis, Osaka, Japonia 1990). Ponadto, zidentyfikowano aminotransferazy D-alaninowe (2.6.1.21), aminotransferazy D-metionino-pirogronianowe (2.6.1.41) and obydwie aminotransferazy, aminotransferazę (R)-3-amino-2-metylopropionianową (2.6.1.61) oraz aminotransferazę (S)-3-amino-2-metylopropionianową (2.6.1.22).

Niektóre aminotransferazy mogą akceptować jedynie substrat dla tej reakcji z określoną konfiguracją przy węglu C2. Dlatego też, nawet jeśli przekształcanie do MP nie jest stereospecyficzne, stereochemię końcowego produktu można kontrolować przez właściwy wybór transaminazy. Ponieważ reakcje są odwracalne, nieprzereagowany MP (niepożądany izomer) można z powrotem wprowadzić w obieg do jego składowych i można ponownie tworzyć mieszninę racemiczną MP.

Aktywacja substratów

Fosforylowane substraty, takie jak fosfoenolopirogronian (PEP), można stosować w reakcjach ujawnionych w niniejszym opisie. Fosforylowane substraty mogą być korzystniejsze energetycznie i, dlatego też, można je stosować do podwyższania szybkości i/lub wydajności reakcji. W kondensacji aldolowej, dodatek grupy fosforanowej stabilizuje tautomer enolowy substratu nukleofilowego, czyniąc

PL 208 481 B1 go bardziej reaktywnym. W innych reakcjach, fosforylowany substrat często zapewnia lepszą grupę opuszczającą. Podobnie substraty można aktywować przez przekształcanie do pochodnych CoA lub pochodnych pirofosforanowych.

P r z y k ł a d 1

Klonowanie i ekspresja aminotransferaz tryptofanowych

Przykład ten opisuje metody użyte do klonowania aminotransferaz tryptofanowych, które można wykorzystać do przekształcania tryptofanu do indolo-3-pirogronianu.

Schemat eksperymentu

Sklonowano 11 genów kodujących aminotransferazy w E. coli. Te geny to gen aminotransferazy D-alaninowej Bacillus subtilis (dat, numer dostępu w Genbank Y14082.1 bp 28622-29470 i numer dostępu w Genbank NP_388848.1, odpowiednio sekwencje nukleotydowa i aminokwasowa), aminotransferazy tyrozynowej Sinorhizobium meliloti (zwanego również Rhizobium meliloti) (tatA, sekwencje o numerach identyfikacyjnych SEQ ID No. 1 i 2, odpowiednio sekwencje nukleotydowa i aminokwasowa), aminotransferazy tyrozynowej szczepu 2.4.1 Rhodobacter sphaeroides (tatA ustalony na podstawie homologii, sekwencje o numerach identyfikacyjnych SEQ ID No. 3 i 4, odpowiednio sekwencje nukleotydowa i aminokwasowa), aminotransferazy o szerokim spektrum substratowym Leishmania major (bsat, ustalony na podstawie homologii z fragmentami peptydowymi z L. mexicana, sekwencje o numerach identyfikacyjnych SEQ ID No. 7 i 8, odpowiednio sekwencje nukleotydowa i aminokwasowa), aminotransferazy aromatycznej Bacillus subtilis (araT, ustalony na podstawie homologii, sekwencje o numerach identyfikacyjnych SEQ ID No. 9 i 10, odpowiednio sekwencje nukleotydowa i aminokwasowa), aminotransferazy aromatycznej Lactobacillus amylovorus (araT ustalony na podstawie homologii, sekwencje o numerach identyfikacyjnych SEQ ID No. 11 i 12, odpowiednio sekwencje nukleotydowa i aminokwasowa), aminotransferazy wielosubstratowej R. sphaeroides 35053 (ustalona na podstawie homologii, sekwencje o numerach identyfikacyjnych SEQ ID No. 13 i 14, odpowiednio sekwencje nukleotydowa i aminokwasowa), aminotransferazy wielosubstratowej szczepu

2.4.1 Rhodobacter sphaeroides (msa, ustalony na podstawie homologii, numer dostępu w Genbank AAAE01000093.1, bp 14743-16155 i numer dostępu w Genbank ZP00005082.1, odpowiednio sekwencje nukleotydowa i aminokwasowa), aminotransferazy asparaginianowej Escherichia coli (aspC, numer dostępu w Genbank AE000195.1 bp 2755-1565 i numer dostępu w Genbank AAC74014.1, odpowiednio sekwencje nukleotydowa i aminokwasowa) i aminotransferazy tyrozynowej E. coli (tyrB, sekwencje o numerach identyfikacyjnych SEQ ID No. 31 i 32, odpowiednio sekwencje nukleotydowa i aminokwasowa).

Geny klonowano, przeprowadzano ich ekspresję i badano aktywność w przekształcaniu tryptofanu do indolo-3-pirogronianu, równolegle z enzymami dostępnymi komercyjnie. Wszystkie 11 klonów wykazywało aktywność.

Identyfikacja szczepów bakteryjnych, które mogą zawierać polipeptydy o pożądanej aktywności

W bazie NCBI (National Center for Biotechnology Information) nie ma genów oznaczonych jako aminotransferazy tryptofanowe. Jednakże zidentyfikowano organizmy posiadające tę aktywność enzymatyczną. Aktywność aminotransferazy L-tryptofanowej (TAT) oznaczono w ekstraktach komórkowych lub w oczyszczonym białku z następujących źródeł: izolat Rhizobacterium z Festuca octoflora, mitochondriów i cytozolu groszku, komórek nowotworu typu crown-gall słonecznika, Rhizobium leguminosarum biowar trifoli, Erwinia herbicola pv gypsophilae, Pseudomonas syringae pv. savastanoi, Agrobacterium tumefaciens, Azospirillum lipferum i brasilense, Enterobacter cloacae, Enterobacter agglomerans, Bradyrhizobium elkanii, Candida maltosa, Azotobacter vinelandii, mózgu szczura, wątroby szczura, Sinorhizobium meliloti, Pseudomonas fluorescens CHA0, Lactobacillus lactis, Lactobacillus casei, Lactobacillus helveticus, kiełków pszenicy, jęczmienia, Phaseolus aureus (fasoli mung), Saccharomyces uvarum (carlsbergensis), Leishmania sp., kukurydzy, pędów pomidora, roślin groszku, tytoniu, świni, Clostridium sporogenes i Streptomyces griseus.

Izolacja genomowego DNA do klonowania

S. meliloti (ATCC numer 9930) hodowano w podłożu TY w temperaturze 25°C, pH 7,2. Komórki hodowano do gęstości optycznej, przy długości fali 600 nm (OD600), równej 1,85 i 2% inokulum użyto do izolacji genomowego DNA. Izolację genomowego DNA przeprowadzono z użyciem zestawu Qiagen genomie tip 20/G (Valencia, CA).

Bacillus subtilis 6051 (ATCC) hodowano w temperaturze 30°C w podłożu odżywczym Bereto (Difco, Detroit, MI). Do izolacji genomowego DNA użyto metody Qiagen genomie tip 20/G z następu22

PL 208 481 B1 jącymi modyfikacjami: stężenia proteinazy K i lizozymu zwiększono dwukrotnie, a czasy inkubacji zwiększono 2-3 krotnie.

Genomowe DNA Leishmania major ATCC 50122, 17 ng/μΐ w buforze TE pH 8,0, uzyskano od

IDI, Inc. (Quebec, Kanada).

DNA genomowe z Rhodobacter sphaeroides 2.4.1 (dostarczonego przez profesora Sam Kaplan, Unversity of Texas, Houston), R. sphaeroides 35053 (numer ATCC) i L. amylovorus wyizolowano standardową ekstrakcją fenolem. Komórki zebrano w późnej fazie logarytmicznej, zawieszono w buforze TEN (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA, 100 mM NaCl) i lizowano dodając 0,024 ml laurylo-sarkozyny sodowej na ml zawiesiny komórek. Po co najmniej trzykrotnej ekstrakcji równą objętością fenolu nasyconego buforem TE (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA) roztwór DNA ekstrahowano jeden raz mieszaniną chloroform:oktanol 9:1 i trzy razy chloroformem. DNA wytrącano przez dodanie 0,1 objętości 3 M octanu sodu, pH 6,8 i 2 objętości etanolu. Precypitat zebrano poprzez wirowanie i przemyto jeden raz 70% etanolem. Na koniec DNA rozpuszczono w 0,10 ml wody destylowanej.

Genomowe DNA Escherichia coli izolowano ze szczepu DH10B (Invitrogen) przy użyciu zestawu Qiagen Genomic-tip^TM (500/G). Z 30 ml szczepu hodowanego w LB do OD650 1,83 uzyskano 0,3 mg oczyszczonego DNA. Oczyszczone DNA rozpuszczono w buforze do elucji (EB) Qiagen w stężeniu 0,37 gg/gl.

Protokół reakcji łańcuchowej polimerazy

Startery zaprojektowano, by miały końce kompatybilne z wektorem pET 30 Xa/LIC (Novagen, Madison, WI). Wektor pET ma 12-nukleotydowy jednoniciowy koniec po stronie 5' od miejsca Xa/LIC i 15-nukleotydowy jednoniciowy koniec po stronie 3' od miejsca Xa/LIC. Plazmid jest zaprojektowany do klonowania niezależnego od ligacji z N-końcowymi znacznikami His i S i ewentualnym C-końcowym znacznikiem His. Miejsce rozpoznawane przez proteazę Xa (IEGR) jest położone bezpośrednio przed kodonem start klonowanego genu, dzięki czemu można usunąć znaczniki białka fuzyjnego.

Przy projektowaniu starterów do końców 5' sekwencji specyficznych dla danego organizmu dodano następujące sekwencje: starter w kierunku do przodu, 5'GGTATTGAGGGTCGC (sekwencja o numerze identyfikacyjnym SEQ ID No. 73) i starter odwrotny: 5' AGAGGAGAGTTAGAGCC (sekwencja o numerze identyfikacyjnym SEQ ID No. 74).

Startery dat Bacillus subtilis:

N-końcowy: 5'-GGTATTGAGGGTCGCATGAAGGTTTTAGTCAATGG-3' i C-końcowy: 5'-AGAGGAGAGTTAGAGCCTTATGAAATGCTAGCAGCCT-3' (sekwencje o numerach identyfikacyjnych SEQ ID No. 15 i 16).

Startery tatA Sinorhizobium meliloti:

N-końcowy: 5'-GGTATTGAGGGTCGCATGTTCGACGCCCTCGCCCG i C-końcowy: 5'-AGAGGAGAGTTAGAGCCTCAGAGACTGGTGAACTTGC (sekwencje o numerach identyfikacyjnych SEQ ID No. 17 i 18). Startery araT Bacillus subtilis·.

N-końcowy: 5'-GGTATTGAGGGTCGCATGGAACATTTGCTGAATCC i C-końcowy: 5'-AGAGGAGAGTTAGAGCCTTAAACGCCGTTGTTTATCG (sekwencje o numerach identyfikacyjnych SEQ ID No. 19 i 20).

PL 208 481 B1 msa Rhodobacter sphaeroides (zarówno 2.4.1 jak i 35053):

N-końcowy: 5'-GGTATTGAGGGTCGCATGCGCGAGCCTCTTGCCCT i

C-końcowy: 5'-AGAGGAGAGTTAGAGCCTCAGCCGGGGAAGCTCCGGG (sekwencje o numerach identyfikacyjnych SEQ ID No. 21 i 22). bsat Leishmania major:

N-końcowy: 5'-GGTATTGAGGGTCGCATGTCCACGCAGGCGGCCAT i

C-końcowy: 5'-AGAGGAGAGTTAGAGCCTCACTCACGATTCACATTGC (sekwencje o numerach identyfikacyjnych SEQ ID No. 23 i 24). araT Lactobacillus amylovorus:

N-końcowy: 5'-GGTATTGAGGGTCGCATGCCAGAATTAGCTAATGA i

C-końcowy: 5'-AGAGGAGAGTTAGAGCCTTATTCGTCCTCTTGTAAAA (sekwencje o numerach identyfikacyjnych SEQ ID No. 25 i 26). tatA Rhodobacter sphaeroides (oba szczepy- 2.4.1 i

35053): N-końcowy: 5'-GGTATTGAGGGTCGCATGCGCTCTACGACGGCTCC i

C-końcowy: 5'-AGAGGAGAGTTAGAGCCTCAGCCGCGCAGCACCTTGG (sekwencje o numerach identyfikacyjnych SEQ ID No. 27 i 28). aspC Escherichia coli:

N-końcowy: 5'-GGTATTGAGGGTCGCATGTTTGAGAACATTACCGC-3' i

C-końcowy: 5'-AGAGGAGAGTTAGAGCCTTACAGCACTGCCACAATCG-3' (sekwencje o numerach identyfikacyjnych SEQ ID No. 29 i 30). tyrB Escherichia coli:

N-końcowy: 5'-GGTATTGAGGGTCGCGTGTTTCAAAAAGTTGACGC i

C-końcowy: 5'-AGAGGAGAGTTAGAGCCTTACATCACCGCAGCAAACG-3' (sekwencje o numerach identyfikacyjnych SEQ ID No. 33 i 34).

Gen pochodzący z S. meliloti (tatA) amplifikowano przy użyciu następującego protokołu PCR. W mieszaninie reakcyjnej o objętości 50 z buforem Expand™ 1x i Mg, użyto 0,1-0,5 μg matrycy,

1,5 μM każdego startera, 0,4 μM każdego z dNTP, 3,5 jednostki Expand High Fidelity Polymerase (Roche, Indianapolis, IN). Wykorzystany program termocyklera obejmował „gorący start w temperaturze 96°C przez 5 minut, a po nim 29 powtórzeń następujących etapów: temperatura 94°C przez 30 sekund, temperatura 55°C przez 2 minuty i temperatura 72°C przez 2,5 minuty. Po 29 powtórzeniach próbkę utrzymywano przez 10 minut w temperaturze 72°C, a następnie przechowywano w temperaturze 4°C. W wyniku zastosowania tego protokółu PCR powstał produkt o długości 1199 bp.

Sekwencje genów pochodzących z R. sphaeroides (msa i tatA), L. amylovorus araT i Bacillus araT amplifikowano przy użyciu następującego protokołu PCR. Do mieszaniny reakcyjnej o objętości 50 μl 0,1-0,5 μg matrycy, 1,5 μM każdego startera, 0,4 μM każdego z dNTP, 3,5 jednostki Expand High Fidelity Polymerase (Roche, Indianapolis, IN) oraz bufor Expand^TM 1x z Mg. Wykorzystany pro24

PL 208 481 B1 gram termocyklera obejmował „gorący start w temperaturze 96°C przez 5 minut, a po nim 29 powtórzeń następujących etapów: temperatura 94°C przez 30 sekund, temperatura 40-60°C przez 1 minutę i 45 sekund (gradientowy termocykler) i temperatura 72°C przez 2 minuty i 15 sekund. Po 29 powtórzeniach próbkę utrzymywano przez 10 minut w temperaturze 72°C, a następnie przechowywano w temperaturze 4°C.

Dla genu msa R. sphaeroides temperatury renaturacji 42°C i 48°C pozwoliły wytworzyć wiele produktów i wyraźny prążek o wielkości około 1464 bp. Dla araT L. amylovorus przy temperaturach renaturacji 42°C, 48°C i 56°C powstawały pojedyncze produkty tworzące intesywne prążki o wielkości 1173 bp. Dla araT B. subtilis temperatury renaturacji 40°C, 45°C, 50°C i 55°C powodowały powstawanie pojedynczych intensywnych produktów (1173 bp) zarówno z genomowego DNA jak i kolonii. Dla bsat L. major temperatura renaturacji 55°C dała najczystszy produkt (1239 bp). Dla genów tatA Rhodobacter temperatury renaturacji 50-55°C dały czyste produkty o właściwej wielkości (1260 bp). Dla obu genów E. coli i genu dat B. subtilis użyto temperatury renaturacji 55-60°C, a czas renaturacji skrócono do 45 sekund. Uzyskano czyste produkty o odpowiedniej wielkości (około 1,3 kb dla genów E. coli, 850 bp dla genu dat).

Klonowanie

Produkty PCR oczyszczano z 0,8% i 1% żelu agarozowego w buforze TAE przy użyciu zestawu Qiagen (Valencia, CA) do ekstrakcji z żelu. Ilości produktów PCR oznaczano przez porównywanie do standartów w żelu agarozowym a następnie traktowano polimerazą DNA faga T4 według protokołu zalecanego przez producenta do klonowania niezależnego od ligacji (Novagen, Madison, WI).

W skrócie, około 0,2 pmol oczyszczonego produktu PCR traktowano 1 jednostką polimerazy DNA faga T4 w obecności dGTP przez 30 minut w temperaturze 22°C. Polimeraza usuwa kolejne zasady z końca 3' produktu PCR. Gdy polimeraza natrafi na resztę guaninową aktywność 5'-3' polimerazy przeciwdziała aktywności egzonukleolitycznej i skutecznie uniemożliwia dalsze trawienie. To tworzy jednoniciowe końce kompatybilne z wektorem pET Xa/LIC. Polimerazę inaktywuje się przez inkubację w temperaturze 75°C przez 20 minut.

Wektor i zmodyfikowaną wstawkę łączono przez renaturację według zaleceń Novagen. Około 0,02 pmol zmodyfikowanej wstawki i 0,01 pmol wektora inkubowano przez 5 minut w temperaturze 22°C, dodano 6,25 mM EDTA (stężenie końcowe) i powtórzono inkubację w temperaturze 22°C. Mieszaninę reakcyjną po reakcji łączenia (1 μθ dodawano do komórek kompetentnych NovaBlue^TM singles (Novagen, Madison, WI) i inubowano w lodzie przez 5 minut. Po wymieszaniu komórki transformowano za pomocą szoku cieplnego w temperaturze 42°C przez 30 sekund. Komórki przeniesiono do lodu na 2 minuty, dodawano do nich 250 μl podłoża SOC o temperaturze pokojowej i inkubowano przez 30 minut w temperaturze 37°C z wytrząsaniem przy 225 obrotach na minutę. Komórki wysiewano na szalki z podłożem LB zawierającym kanamycynę (25-50 μg/ml).

DNA plazmidowe izolowano przy użyciu zestawu Qiagen spin miniprep i poszukiwano właściwych wstawek za pomocą trawienia enzymami restrykcyjnymi XhoI i Xbal. Sekwencje plazmidów, które wydawały się mieć odpowiednią wstawkę potwierdzano sekwencjonowaniem DNA metodą terminacji łańcucha dideoksynukleotydami.

Sekwencje o numerach identyfikacyjnych SEQ ID No. 1-14 i 31-32 przedstawiają sekwencje nukleotydowe i odpowiadające im sekwencje aminokwasowe rekombinowanych aminotransferaz. Jakiekolwiek różnice w stosunku do sekwencji z Genbank były albo milczące albo prowadziły do konserwatywnych podstawień w sekwencji białka. Sekwencje o numerach identyfikacyjnych SEQ ID No. 11 i 12 są nowymi sekwencjami.

Ekspresja genu i oznaczenia

DNA plazmidowe zweryfikowane przez sekwencjonowanie subklonowano w gospodarzach ekspresyjnych E. coli BLR(DE3) i BL21(DE3) (Novagen, Madison, WI). Prowadzono hodowle, a następnie przy użyciu zestawu Qiagen miniprep izolowano plazmidy i analizowano przez trawienie restrykcyjne dla potwierdzenia identyczności.

Początkowo prowadzono indukcję araT L. amylovorus, araT B. subtilis i tatA S. meliloti zarówno w komórkach BLR(DE3) jak i BL21(DE3). Poszukiwanie optymalnego czasu indukcji przeprowadzano w hodowlach prowadzonych do uzyskania gęstości optycznej OD600 = 0,5-0,8 w podłożu LB zawierającym kanamycynę (30 mg/l) i indukowano z 1 mM IPTG (tiogalaktozydem izopropylu). Próbki pobierano w czasach 0, 1, 2 i 4 godziny po indukcji. Komórki z 2 ml hodowli zawieszano w 0,10 ml 120 mM Tris-HCl, pH 6,8 zawierającego 10% sól sodową siarczanu dodecylu, 10% 2-merkaptoetanol i 20% glicerol, ogrzewano w temperaturze 95°C przez 10 minut, schładzano i rozcieńczano 0,10 ml H2O.

PL 208 481 B1

Część tych próbek całkowitego białka komórkowego analizowano w 4-15% żelu gradientowym SDS-PAGE. Nie wykryto żadnych znaczących różnic w ilości uzyskanego w wyniku ekspresji białka pomiędzy 2 i 4 godziną od indukcji, ani pomiędzy komórkami BLR(DE3) i BL21(DE3).

Ekstrakty komórkowe przygotowywano również z próbki 2 ml hodowli po 4 godzinach przez zawieszenie osadu komórek w 0,25 ml odczynnika Novagen BugBuster™ zawierającego 0,25 μΐ nukleazy benzonazowej, inkubację przez 20 minut w temperaturze pokojowej z delikatnym wytrząsaniem i wirowanie przy 16 000 x g dla usunięcia resztek komórek. Supernatanty (ekstrakty komórkowe) nakładano na żele gradientowe 4-15% dla analizy rozpuszczalnych białek komórkowych.

Trzy klony: araT L.amylovorus (sekwencje o numerach identyfikacyjnych SEQ ID No. 11 i 12), araT B. subtilis (sekwencje o numerach identyfikacyjnych SEQ ID No. 9 i 10) i tatA S. meliloti (sekwencje o numerach identyfikacyjnych SEQ ID No. 1 i 2) wykazywały rozpuszczalne białko, które odpowiadało właściwej wielkości (około 45 kDa). Produkt genu araT B. subtilis ulegał nadekspresji na najwyższym poziomie i/lub był bardziej rozpuszczalny niż produkty pozostałych dwu genów.

W następnych metodach ekspresji, plazmidowe DNA z pozytywnych klonów subklonowano do szczepu BL21(DE3) ze względu na lepszy wzrost tego gospodarza. Indukcję powtarzano przy użyciu 1 mM IPTG w kulturach hodowanych w podłożu LB zawierającym 50 mg/l kanamycyny, gdy OD600 osiągnęło wartość wynoszącą w przybliżeniu 0,8. Komórki zbierano po 4 godzinach hodowli w temperaturze 37°C, odwirowywano przy 3000 obrotów na minutę przez 10 minut (w temperaturze 4°C), przemywano buforem TEGGP (50 mM tris-HCl (pH 7,0), 0,5 mM EDTA, 100 mg/ml glutationu, 5% glicerol z kompletnym koktailem inhibitorów proteaz Roche) i zamrażano błyskawicznie w etanolu o temperaturze -80°C.

Próbki ponownie zawieszano w 5 ml/g mokrej masy komórkowej w odczynniku BugBuster^TM (Novagen), zawierającym 5 nl/ml koktailu inhibitorów proteazy zestaw #3 (Calbiochem-Novabiochem Corp. San Diego, CA) i 1 Ll/ml nukleazy benzonazowej. Próbki inkubowano przez 20 minut w temperaturze pokojowej na wytrząsarce obrotowej. Nierozpuszczalne resztki komórek usuwano przez wirowanie przy 16 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4°C.

Ekstrakty komórkowe analizowano techniką SDS-PAGE i oznaczano aktywność aminotransferazy tryptofanowej mierząc wytwarzanie kwasu indolo-pirogronowego za pomocą następującego protokołu. Reakcje w objętości jednego mililitra prowadzono w roztworze 50 mM tetraboranu sodowego (pH 8,5), 0,5 mM EDTA, 0,5 mM arsenianu sodowego, 50 lM fosforanu pirydoksalu, 5 mM α-ketoglutaranu i 5 mM L-tryptofanu. Reakcje inicjowano przez dodanie bezkomórkowych ekstraktów lub oczyszczonego enzymu i inkubowano przez 30 minut w temperaturze 30°C. Reakcję zatrzymywano dodając 20% TCA (200 ul) i wytrącone białko usuwano przez wirowanie. Mierzono absorpcję przy długości fali 327 nm i porównywano z krzywą standardową dla świeżo przygotowanego indolo-3-pirogronianu w buforze reakcyjnym. Prowadzono również reakcje kontrolne bez substratu lub przy użyciu bezkomórkowych ekstraktów transformowanych samym plazmidem pET30a.

Z powodu tła wynikającego z obecności natywnych aminotransferaz E. coli w ekstraktach komórkowych, rekombinowane białka oczyszczano przy użyciu kolumienek His-Bind według protokołu producenta (Novagen, Madison, WI). Frakcje eluatu odsalano na kolumnach PD-10 (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) i eluowano w 50 mM Tris, pH 7,0. Oczyszczone białka analizowano przez SDS-PAGE i używano do oznaczeń aktywności aminotransferazy.

Wyniki dotyczące indukcji 1 mM IPTG w temperaturze 37°C (4 godziny) wykazują, że bsat L. major, tatA S. meliloti, aspC E. coli i oba klony tatA R. sphaeroides wykazują znaczące poziomy aktywności aminotransferazy tryptofanowej. Białko araT B. subtilis ulegało nadekspresji, było rozpuszczalne ale miało niewielką aktywność enzymatyczną. Produkt genu araT L. amylovorus wydawał się występować w ekstraktach komórkowych w formie rozpuszczalnej, ale oczyszczanie przy użyciu kolumienki His-Bind dostarczało jedynie niewielkich ilości białka o odpowiedniej masie cząsteczkowej. Produkt genu msa był nierozpuszczalny i dalsze eksperymenty z ekspresją prowadzono w temperaturze 24°C, aby zminimalizować tworzenie ciałek inkluzyjnych. Użyto kilku stężeń IPTG pomiędzy 10 lM i 1 mM, aby zmaksymalizować ilość rozpuszczalnego białka.

Tablica 1 podaje aktywności właściwe wyrażone w mikrogramach indolo-3-pirogronianu (I3P) wytwarzanego na miligram białka na minutę. W niektórych wypadkach bardzo małe ilości rekombinowanego białka wykazywały wysoką aktywność powyżej efektywego liniowego zakresu oznaczenia. W takich przypadkach wartość aktywności właściwej poprzedza znak „>”.

PL 208 481 B1

T a b l i c a 1:

Aktywności właściwe klonów mierzone dla ekstraktów komórkowych (CE) i oczyszczonych białek (P) oraz dla komercyjnych enzymów

Enzym	Aktywność właściwa (pg I3P/mg białka/minutę)	Uwagi
Bsat L. major CE	> 49,3
Bsat L. major P	> 4280
tatA S. meliloti CE	> 28,6
tatA S. meliloti P	> 931
tatA 2.4.1 CE	> 41,2
tatA 2.4.1 P	1086
tatA 35053 CE	> 62,3
tatA 35053 P	> 486
araT L. amylovorus CE	1,26
araT L. amylovorus P	0	Niewiele białka po oczyszczaniu na kolumnince His-Bind
araT B. subtilis CE	0	niewykrywalne
araT B. subtilis P	1,5-4,5
msa 2.4.1 CE	2,05	bardzo mało rozpuszczalnego białka
msa 2.4.1 P	0	brak białka po oczyszczaniu na kolumience His-Bind
msa 35053 CE	3,97	bardzo mało rozpuszczalnego białka
msa 35053 P	0	brak białka po oczyszczaniu na kolumience His-Bind
aspC E. coli (P)	800
tyrB E. coli (P)	1	niezbyt rozpuszczalne
D-aminotransferaza B. subtilis (P)	2,7	przy użyciu D-tryptofanu jako substratu
Transaminaza o szerokim spektrum	22	Sigma nr kat. T 7684
Świńska typu II-A	1,5	Sigma G7005
Świńska typu I	1	Sigma G2751

Przyrównanie wszystkich sklonowanych rekombinowanych białek pokazuje, że nie ma zbyt wielu obszarów wysokokonserwowanych w sekwencjach araT, tatA, bsat i msa. Przyrównanie białek rekombinowanych o najwyższych aktywnościach: homologów produktu genu tatA Rhodobacter, aminotransferazy o szerokim spektrum substratowym L. major i aminotransferazy tyrozynowej Sinorhizobium meliloti wykazuje kilka regionów konserwowanych, chociaż na poziomie białka wykazują one jedynie około 30-43% identyczności. Dostępność aminotransferazy D-specyficznej (D-alaninowej) o szerokim spektrum może byc użyteczna w produkcji innych stereoizomerów monatyny.

P r z y k ł a d 2

Konwersja indolo-3-mleczanu w indolo-3-pirogronian

Jak przedstawiono na Fig. 1 i 3 do wytwarzania indolo-3-pirogronianu można wykorzystywać kwas indolo-3-mlekowy. Konwersja kwas mlekowy - pirogronian jest reakcją odwracalną, podobnie jak konwersja indolo-3-pirogronian - indolo-3-mleczan. Zazwyczaj mierzy się utlenianie indolo-mleczanu ze względu na wysokie tło przy długości fali 340 nm pochodzące od indolo-3-pirogronianu.

Standardowa mieszanina reakcyjna zawierała 100 mM fosforan potasu, pH 8,0, 0,3 mM NAD⁺, 7 jednostek dehydrogenazy mleczanowej (LDH) (Sigma-L2395, St. Louis, MO) i 2 mM substrat w 0,1 ml.

PL 208 481 B1

Oznaczenia przeprowadzano w dwóch powtórzeniach w przejrzystej dla promieniowania UV płytce do mikromiareczkowania przy użyciu czytnika płytek Molecular Devices SpectraMax Plus. Polipeptyd i bufor mieszano i przenoszono do studzienek zawierających kwas indolo-3-mlekowy i NAD⁺ i po krótkim mieszaniu co 9 sekund mierzono absorpcję przy długości fali 340 nm. Reakcję prowadzono przez 5 minut w temperaturze 25°C. Wzrost absorpcji przy długości fali 340 nm odpowiada wytwarzaniu NADH z NAD⁺. Przeprowadzono niezależne pomiary kontrolne bez NAD⁺ i bez substratu. D-LDH z Leuconostoc mesenteroides (Sigma, numer katalogowy L2395) wydawała się wykazywać wyższą aktywność wobec substratów będących pochodnymi indolowymi niż L-LDH z Bacillus stearothermophilus (Sigma, numer katalogowy L5275).

Podobne metody wykorzystano z kwasem D-mlekowym i NAD⁺ lub NADH i pirogronianem, naturalnymi substratami plipeptydów D-LDH. Vmax dla redukcji pirogronianu była 100-1000-krotnie wyższa niż Vmax utleniania mleczanu. Vmax reakcji utleniania indolo-3-pirogronianu przez D-LDH była około 5 razy niższa od tej dla kwasu mlekowego. Obecność indolo-3-pirogronianu oznaczano również mierząc zmiany absorpcji przy długości fali 327 (pochodna enolo-boranowa) używając 50 mM buforu boranu sodowego zawierającego 0,5 mM EDTA i 0,5 mM arsenian sodowy. Zarówno dla polipeptydów L jak i D-LDH obserwowano małe, ale powtarzalne zmiany w absorpcji w porównaniu z kontrolami negatywnymi.

Ponadto dehydrogenazy mleczanowe o szerokim spektrum (enzymy o aktywności związanej z EC 1.1.1.27, EC 1.1.1.28 i/lub EC 1.1.2.3) można klonować i wykorzystywać do wytwarzania indolo-3-pirogronianu z kwasu indolo-3-mlekowego. Źródłami dehydrogenaz o szerokiej specyficzności mogą być E. coli, Neisseria gonorrhoeae i Lactobacillus plantarum.

Alternatywnie, indolo-3-pirogronian można wytwarzać przez poddawanie indolo-3-mleczanu działaniu ekstraktów komórkowych z Clostridium sporogenes, które zawierają dehydrogenazę indolomleczanową (EC 1.1.1.110), ekstraktów komórkowych Trypanosoma cruzi epimastogotes, które zawierają dehydrogenazę p-hydroksyfenylomleczanową (EC 1.1.1.222), o której wiadomo, że wykazuje aktywność wobec indolo-3-pirogronianu lub ekstraktów komórkowych Pseudomonas acidovorans lub E. coli, które zawierają dehydrogenazę imidazol-5-ilomleczanową (EC 1.1.1.111), Coleus blumei, które zawierają reduktazę hydroksyfenylopirogronianową (EC 1.1.237) lub Candida maltosa, które zawierają dehydrogenazę D-aromatyczno mleczanową (EC 1.1.1.222). Pozycje literaturowe opisujące te aktywności obejmują: Nowicki i in. (FEMS Microbiol Lett 71: 119-24, 1992), Jean i DeMoss (Canadian J. Microbiol. 14 1968), Coote i Hassall (Biochem. J. 111: 237-9, 1969), Cortese i in. (CR. Seances Soc. Biol. Fil. 162: 390-5, 1968), Petersen i Alfermann (Z. Naturforsch. C: Biosci. 43: 501-4, 1988) i Bhatnagar i in. (J. Gen. Microbiol 135: 353-60, 1989). Dodatkowo, oksydazę mleczanową, taką jak ta pochodząca z Pseudomonas sp. (Gu i in. J. Mol. Catalysis B: Enzymatic: 18: 299-305, 2002) może można wykorzystywać do utleniania indolo-3-mleczanu do indolo-3-pirogronianu.

P r z y k ł a d 3

Konwersja L-tryptofanu w indolo-3-pirogronian przy użyciu oksydazy L-aminokwasowej

Przykład ten opisuje metody wykorzystywane do przekształcania tryptofanu w indolo-3-pirogronian za pomocą oksydazy (EC 1.4.3.2), jako alternatywę dla wykorzystywania aminotransferaz tryptofanowych opisanego w Przykładzie 1. Oksydazę L-aminokwasową oczyszczono z Crotalus durissus (Sigma, St. Louis, MO, numer katalogowy A-2805). Numery dostępu oksydaz L-aminokwaso- wych do klonowania obejmują: CAD21325.1, AAL14831, NP_490275, BAB78253, A38314, CAB71136,

JE0266, T08202, S48644, CAC00499, P56742, P81383, 093364, P81382, P81375, S62692, P23623, AAD45200, AAC32267, CAA88452, AP003600 i Z48565.

Reakcje prowadzono w probówkach mikrowirówkowych w objętości całkowitej 1 ml, inkubując je z wytrząsaniem przez 10 minut w temperaturze 37°C. Mieszanina reakcyjna zawierała 5 mM L-tryptofan, 100 mM bufor z fosforanu sodowego pH 6,6, 0,5 mM arenian sodowy, 0,5 mM EDTA, 25 mM tetraboran sodowy, 0,016 mg katalazy (83 jednostki, Sigma C-3515), 0,008 mg FAD (Sigma) i 0,0050,125 jednostek oksydazy L-aminokwasowej. Kontrole negatywne zawierały wszystkie składniki z wyjątkiem tryptofanu a ślepa próba zawierała wszystkie składniki z wyjątkiem oksydazy. Katalaza służyła do usuwania nadtlenku wodoru tworzonego podczas oksydacyjnej deaminacji. Tetraboran sodowy i arsenian wykorzystywano do stabilizacji enoloboranowej formy indolo-3-pirogronianu, która wykazuje maksimum absorpcji przy długości 327 nm. Standardy indolo-3-pirogronianu przygotowano w stężeniach 0,1-1 mM w mieszaninie reakcyjnej.

PL 208 481 B1

Zakupiona oksydaza L-aminokwasowa wykazywała aktywność właściwą 540 Lg wytworzonego indolo-3-pirogronianu na minutę na miligram białka. Jest to ten sam rząd wielkości jak dla aktywności właściwych aminotransferaz tryptofanowych.

P r z y k ł a d 4

Konwersja indolo-3-pirogronianu w kwas 2-hydroksy-2-(indol-3-ilometylo)-4-ketoglutarowy za pomocą aldolazy

Przykład ten opisuje metody, które można wykorzystywać do konwersji indolo-3-pirogronianu w kwas 2-hydroksy-2-(indol-3-ilometylo)-4-ketoglutarowy, prekursor monatyny (MP) przy użyciu aldolazy (liazy) (Fig. 2). Kondensacje aldolowe to reakcje tworzące wiązania węgiel-węgiel pomiędzy węglem β aldehydu lub ketonu i węglem karbonylowym innego aldehydu lub ketonu. Na węglu sąsiadującym z grupą karbonylową jednego substratu powstaje karboanion, który służy jako nukleofil atakujący węgiel karbonylowy drugiego substratu (węgiel elektrofiIowy). Najczęściej substratem elektrofilowym jest aldehyd, więc większość aldolaz należy do kategorii EC 4.1.2. Dość często substratem nukleofilowym jest pirogronian. Rzadziej aldolazy katalizują kondensację pomiędzy dwoma ketokwasami lub dwoma aldehydami.

Jednakże zidentyfikowano aldolazy katalizujące kondensację dwóch kwasów karboksylowych. Na przykład, EP 1 045 029 opisuje wytwarzanie kwasu L-4-hydroksy-2-ketoglutarowego z kwasu glioksalowego i pirogronianu przy użyciu hodowli Pseudomonas (EC 4.1.3.16). Ponadto, aldolaza 4-hydroksy-4-metylo-2-oksoglutaranowa (pirogroniano-liaza 4-hydroksy-4-metylo-2-oksoglutaranu, EC 4.1.3.17) może katalizować kondensację dwóch ketokwasów. Dlatego podobne polipeptydy aldolaz zastosowano do katalizowania kondensacji indolo-3-pirogronianu z pirogronianem.

Klonowanie

Pirogroniano-liazy 4-hydroksy-4-metyl-2-oksoglutaranu (aldolaza ProA, EC 4.1.3.17) i glioksylano-liaza 4-hydroksy-2-oksoglutaranu (aldolaza KHG, EC 4.1.3.16) katalizują reakcje bardzo podobne do reakcji aldolazy przedstawionej na Fig. 2. Zaprojektowano startery z końcami kompatybilnymi z wektorem pET30 Xa/LIC (Novagen, Madison, WI). Zostały one opisane powyżej w Przykładzie 1.

Do klonowania w pET30 Xa/LIC zaprojektowano następujące startery:

1. Gen proA Pseudomonas straminea (numer dostępu w Genbank: 12964663 wersja 12964663) i gen proA Comamonas testosteroni (sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 65-66, odpowiednio sekwencje nukleotydowa i aminokwasowa): starter w kierunku do przodu 5'-GGTATTGAGGGTCGCATGTACGAACTGGGAGTTGT-3' i starter odwrotny 5'-AGAGGAGAGTTAGAGCCTTAGTCAATATATTTCAGGC-3' (sekwencje o numerach identyfikacyjnych SEQ ID No. 55 i 56).

2. Gen SMc00502 Slnorhlzobium meliloti 1021 (homologiczny z proA, numery dostępu w Genbank: 15074579 i CAC46344, odpowiednio sekwencje nukleotydowa i aminokwasowa): starter w kierunku do przodu 5'-GGTATTGAGGGTCCATGAGCGTGGTTCACCGGAA-3' i starter odwrotny 5'-AGAGGAGAGTTAGAGCCTCAATCGATATATTTCAGTC-3' (sekwencje o numerach identyfikacyjnych SEQ ID No. 61 i 62).

3. Gen fldZ Sphingomonas sp. LB126 (numer dostępu w Genbank: 7573247 wersja 7573247, kodujący przypuszczalną transferazę acylową): starter w kierunku do przodu 5'-GGTATTGAGGGTCGCATGTCCGGCATCGTTGTCCA-3' i starter odwrotny 5'-AGAGGAGAGTTAGAGCCTCAGACATATTTCAGTCCCA-3' (sekwencje o numerach identyfikacyjnych SEQ ID No. 57 i 58).

4. Gen pcmE Arthrobacter keyseri (numer dostępu w Genbank: AF331043 wersja AF331043.1, kodujący aldolazę szczawiano-cytryniano-jabłczanową): starter w kierunku do przodu 5'-GGTATTGAGGGTCGCATGCGACTGAACAACCTCGG-3' i starter odwrotny 5' -AGAGGAGAGTTAGAGCCTCAGTTCTCCACGTATTCCA-3' (sekwencje o numerach identyfikacyjnych SEQ ID No. 59 i 60).

5. Gen YPO0082 Yersinia pestis szczep C092 (numer dostępu w Genbank: 15978115 wersja 15978115 kodujący przypuszczalną transferazę): starter w kierunku do przodu 5'-GGTATTGAGGGTCGCATGAGCCTGGTTAATATGAA-3' i starter odwrotny 5'-AGAGGAGAGTTAGAGCCTTATGACTTTAACGCGTTGA-3' (sekwencje o numerach identyfikacyjnych SEQ ID No. 63 i 64).

6. Gen khg Bacillus subtilis (numery dostępu w Genbank: Z99115.1 GI:2634478, 126711127301 i CAB14127.1, odpowiednio sekwencje nukleotydowa i aminokwasowa): starter w kierunku do przodu 5'-GGTATTGAGGGTCGCATGGAGTCCAAAGTCGTTGA-3' i starter odwrotny 5'-AGAGGAGAGTTAGAGCCTTACACTTGGAAAACAGCCT-3' (sekwencje o numerach identyfikacyjnych SEQ ID No. 35 i 36).

7. Gen khg E. coli (numery dostępu w Genbank: AE000279.1 1331-1972 i AAC74920.1, odpowiednio sekwencje nukleotydowa i aminokwasowa): starter w kierunku do przodu 5'-GGTATTGAPL 208 481 B1

GGGTCGCATGAAAAACTGGAAAACAAG-3' i starter odwrotny 5'-AGAGGAGAGTTAGAGCCTTACAGCTTAGCGCCTTCTA-3' (sekwencje o numerach identyfikacyjnych SEQ ID No. 37 i 38).

8. Gen khg S. meliloti (numery dostępu w Genbank: AL591792.1 GI:15075850, 65353-64673 i CAC47463.1, odpowiednio sekwencje nukleotydowa i aminokwasowa): starter w kierunku do przodu 5'-GGTATTGAGGGTCGCATGCGAGGGGCATTATTCAA-3' i starter odwrotny 5'-AGAGGAGAGTTAGAGCCTCAGCCCTTGAGCGCGAAG-3' (sekwencje o numerach identyfikacyjnych SEQ ID No. 39 i 40).

DNA genomowe organizmów opisanych powyżej w punktach 1-2 i 6-8 oczyszczono wykorzystując protokół Qiagen genomic-tip. Podobnie można oczyszczać genomowe DNA organizmów opisanych w punktach 3-5.

Pseudomonas straminea (ATCC 33636) hodowano w temperaturze 30°C w bulionie odżywczym z hydroksybenzoesanem. Comamonas testosteroni (ATCC 49249) hodowano w temperaturze 26°C w bulionie odżywczym z hydroksybenzoesanem. Sphingomonas sp. LB126 (Flemish Institute for Technological Research, VITO, B-2400 Mol, Belgia) hodowano według metody opisanej przez Wattiau i in. (Research in Microbiol. 152: 861-72, 2001). Arthrobacter keyseri (Gulf Ecology Division, National Health and Environmental Effects Research Laboratory, U.S. Environmental Protection Agency, Gulf Breeze FL 32561, USA) hoduje się według protokołu opisanego przez Eaton (J. Bacteriol. 183: 36893703, 2001). Sinorhizobium meliloti 1021 (ATCC 51124) hodowano w temperaturze 26°C w podłożu ATCC TY i podłożu hydroksybenzoesanowym. Szczep C092 Yersinia pestis (ATCC) hodowano w temperaturze 26°C w podłożu ATCC 739, agar z końską krwią. Bacillus subtilis 6051 (ATCC) hodowano w temperaturze 30°C w podłożu Bereto (Difco, Detroit, MI). Genomowe DNA E. coli izolowano ze szczepu DH10B (Invitrogen) jak opisano w Przykładzie 1.

Protokoły PCR, klonowania i selekcji opisane w Przykładzie 1 stosowano również do klonowania sekwencji proA C. testosteroni i S.meliloti, jak również sekwencji khg E. coli, B. subtilis i S. meliloti. Te same metody można stosować do klonowania innych sekwencji opisanych powyżej.

Pozytywne klony zsekwencjonowano za pomocą sekwencjonowania metodą terminacji łańcucha dideoksynukleotydami (Seqwright, Houston, TX) przy użyciu starterów S-tag i T7 terminator (Novagen) i starterów wewnętrznych z Integrated DNA technologies, Inc. (Coralville, IA).

Ekspresja i oznaczenia aktywności

Plazmidowe DNA (zweryfikowane przez analizę sekwencyjną) subklonowano do gospodarza ekspresyjnego BL21(DE3) (Novagen). Kultury hodowano w podłożu LB z 50 mg/l kanamycyny, izolowano plazmidy przy użyciu zestawu Qiagen spin plasmid miniprep, a następnie analizowano porzez trawienie enzymami restrykcyjnymi dla potwierdzenia identyczności. Esperymeny z indukcją prowadzono na konstruktach w BL21(DE3) hodowanych w podłożu LB zawierającym 50 mg/l kanamycyny w temperaturze 37°C. Ekspresję białka indukowano używając 0,1 mM IPTG, gdy OD600 osiągało około 0,6. Komórki hodowano przez 4 godziny w temperaturze 30°C i zbierano poprzez wirowanie. Następnie komórki poddawano lizie przy użyciu odczynnika Bugbuster^TM (Novagen) i rekombinowane białka ze znacznikiem His oczyszczano przy użyciu kolumienek His-Bind, jak opisano powyżej (Przykład 1). Oczyszczone białka odsalano na jednorazowych kolumnach PD-10 i eluowano buforem 50 mM Tris-HCl, pH 7,3 z 2 mM MgCl2.

Białka analizowano przez SDS-PAGE w żelach gradientowych 4-15%, aby ustalić poziom rozpuszczalnego białka o masie cząsteczkowej przewidywanej dla rekombinowanego białka fuzyjnego.

Aktywność białek oznaczano używając indolo-3-pirogronianu i pirogronianu sodowego jako substratów. Mieszanina reakcyjna zawierała 100 mM Tris-HCl (pH 7-8,9), 0-8 mM MgCl2, 3 mM fosforan potasowy (pH 8) i 6 mM stężenie każdego z substratów w 1 ml. Reakcję rozpoczynano dodając różne ilości polipeptydu (na przykład od 10 do 100 pg), inkubowano w temperaturze 25-37°C przez 30 minut, filtrowano i zamrażano w -80°C.

Wyniki oznaczeń aktywności produktów genu proA

Zarówno konstrukty z genem proA C. testosteroni jak i SMc00502 S. meliloti wykazywały wysokie poziomy ekspresji po indukcji IPTG. Jak wykazała analiza całkowitego białka oraz ekstraktów komórkowych w SDS-PAGE rekombinowane białka były wysoce rozpuszczalne. Produkt genu C. testosteroni został wyizolowany z czystością >95%. Ponieważ ilość produktu genu S. meliloti po oczyszczaniu na kolumience His-Bind była bardzo niewielka do oznaczeń aktywności enzymatycznej użyto ekstrakt komórkowy.

Obie rekombinowane aldolazy katalizowały tworzenie MP z indolo-3-pirogronianu i pirogronianu. Do aktywności enzymatycznej potrzebne były zarówno diwalentny magnez jak i fosforan potasowy. Gdy brakowało indolo-3-pirogronianu, pirogronianu lub fosforanu potasowego nie wykrywano pro30

PL 208 481 B1 duktu. Przy nieobecności enzymu powstawała również niewielka ilość produktu (zazwyczaj jeden rząd wielkości mniejsza niż w obecności enzymu).

Szczyt produktu eluował z kolumny odwrotnej fazy C18 nieco później niż standard indolo-3-pirogronianu. Spektrum masowe tego szczytu wykazywało indukowany przez kolizję rodzicielski jon ([M+H]⁺) o wartości 292.1, jon rodzicielski spodziewany dla produktu MP. Główne fragmenty pochodne obecne w spektrum masowym obejmują te o m/z=158 (1H-indolo-3-karbaldehydowy jon karboniowy), 168 (3-buta-1,3-dienylo-1H-indolowy jon karboniowy), 274 (292 - H2O), 256 (292 - 2 H2O), 238 (292 3 H2O), 228 (292 - CH4O3) i 204 (utrata pirogronianu). Produkt wykazywał również charakterystykę widma UV taką jak inne związki zawierające indol, takie jak tryptofan, z X_max 279-280 i małym ramieniem przy około 290 nm.

Ilość MP wytwarzanego przez aldolazę C. testosteroni rosła wraz ze wzrostem temperatury reakcji od temperatury pokojowej do 37°C oraz ze wzrostem ilości substratu i ilości magnezu. Aktywność syntetyczna enzymu malała wraz ze wzrostem pH, maksymalą ilość produktu otrzymywano przy pH 7. Według tryptofanu jako standardu, ilość MP tworzonego w standardowym oznaczeniu przy użyciu 20 Lg oczyszczonego białka wynosiła około 10-40 Lg na jeden ml mieszaniny reakcyjnej.

Ze względu na wysoki poziom homologii sekwencji kodujących aldolazę ProA w S. meliloti i C. testosteroni z innymi genami opisanymi powyżej należy się spodziewać, że wszystkie rekombinowane produkty genów mogą katalizować tę reakcję. Ponadto można się spodziewać, że wszystkie aldolazy, które mają treoninę (T) w pozycjach 59 i 87, argininę (R) w pozycji 119, asparaginian (D) w pozycji 120 i histydynę (H) w pozycjach 31 i 71 (według numeracji dla C. testosteroni) będą wykazywać podobną aktywność.

Wyniki oznaczeń aktywności dla poduktów genu khg

Zarówno konstrukt genu khg z B. subtilis jak i z E. coli wykazują wysokie poziomy ekspresji białka po indukcji IPTG, podczas kiedy khg S. meliloti wykazuje niski poziom ekspresji. Sądząc z analizy całkowitego białka oraz ekstraktów komórkowych w SDS-PAGE rekombinowane białka są wysoce rozpuszczalne. Produkty genu khg B. subtilis i E. coli wyizolowano z czystością >95%; wydajność oczyszczania przez powinowactwo produktu genu z S. meliloti na kolumience His-Bind nie była równie wysoka.

Nie ma dowodów, że do aktywności tego enzymu konieczne są magnez i fosforan. Jednakże, dane literaturowe opisują oznaczenia wykonane w buforze fosforanowym i zauważono, że enzym jest bifunkcjonalny i wykazuje aktywność wobec ufosforylowanych substratów, takich jak 2-keto-3-deoksy-6-fosfoglukonian (KDPG). Oznaczenia enzymatyczne prowadzono, tak jak opisano powyżej i w niektórych wypadkach pominięto fosforan. Wyniki wskazują, że rekombinowane aldolazy KHG wytwarzały MP, ale nie były tak aktywne jak aldolazy ProA.

W niektórych wypadkach poziom MP wytwarzanego przez KHG był niemal identyczny, jak ilości wytwarzane w obecności samego magnezu i fosforanu. Fosforan nie wydawał się zwiększać aktywności KHG. Według SRM enzym z Bacillus wykazywał najwyższą aktywność, około 20-25% wyższą niż magnez i fosforan osobno (patrz Przykład 10). Enzym z Sinorhizobium wykazywał najniższą aktywność, co może być związane z problemami z fałdowaniem i rozpuszczalnością zauważonymi podczas ekspresji. Wszystkie trzy enzymy mają kwas glutaminowy w miejscu aktywnym (pozycja 43 według numeracji białka B. subtilis), jak również lizynę konieczną do utworzenia zasady Shiffa z pirogronianem (pozycja 130), jednakże enzym z B. subtilis ma w pozycji 47, miejscu aktywnym, treoninę a nie argininę. KHG B. subtilis jest mniejszy i wydaje się tworzyć zgrupowanie z innymi enzymami posiadającymi treoninę w miejscu aktywnym, a nie z enzymami z S. meliloti i E. coli. Różnice w miejscu aktywnym mogą być przyczyną większej aktywności enzymu z B. subtilis.

Poprawa aktywności aldolazy

Katalityczne przeciwciała mogą być równie wydajne co naturalne aldolazy, akceptują szerokie spektrum substratów i mogą być wykorzystywane do katalizowania reakcji przedstawionej na Fig. 2.

Aldolazy można również ulepszać na drodze ukierunkowanej ewolucji, tak jak to zostało opisane dla aldolazy KDPG (wysoce homologicznej z opisaną powyżej KHG) poddanej ewolucji za pomocą tasowania DNA i PCR podatnego na błędy, w celu wyeliminowania zależności od fosforanu i odwrócenia selektywności wobec enancjomerów. Polipeptydy aldolazy KDPG są użyteczne w reakcjach biochemicznych ponieważ są wysoce specyficzne wobec substratu-donora (w tym przypadku pirogronianu), ale względnie elastyczne jeśli chodzi o substrat-akceptor (tj. indolo-3-pirogronian) (Koeller i Wong, Nature 409: 232-9, 2001). Aldolaza KHG posiada aktywność kondensacji pirogronianu z wieloma kwasami karboksylowymi. Uważa się, że ssacze wersje aldolaz KHG mają szerszą specyficzPL 208 481 B1 ność niż enzymy bakteryjne, w tym wyższą aktywność wobec 4-hydroksy-4 metylo-2-oksoglutaranu i tolerowanie obu stereoizomerów 4-hydroksy-2-ketoglutaranu. Enzymy bakteryjne wydają się wykazywać 10-krotną preferencję dla izomeru R.

W bazach danych genomowych znajduje się niemal 100 homologów KHG, a aktywność wykazano u Pseudomonas, Paracoccus, Providencia, Sinorhizobium, Morganella, E. coli i w tkankach ssaków. Enzymy te można wykorzystać jako punkt wyjściowy do modyfikacji specyficzności wobec enancjomerów pożądanej do wytwarzania monatyny.

Aldolazy wykorzystujące pirogronian i inny substrat, który jest ketokwasem i/lub ma dużą grupę hydrofobową, jak indol, mogą zostać poddane „ewolucji, aby polepszyć specyficzność polipeptydu, prędkość i selektywność. Poza zaprezentowanymi tu aldolazami KHG i ProA, przykłady takich enzymów obejmują, choć nie ograniczają się do: aldolazy KDPG i polipeptydów pokrewnych (KDPH), hydratazy-aldolazy transkarboksybenzalopirogronianowej z Nocardioides st, aldolazy 4-(2-karboksyfenylo)-2-oksobut-3-enianowej (aldolazy 2'-karboksybenzalopirogronianowej), która prowadzi kondensację pirogronianu i 2-karboksybenzaldehydu (substratu zawierającego pierścień aromatyczny), hydratazy-aldolazy trans-O-hydroksybenzylidenopirogronianowej z Pseudomonas putida i Sphingomonas aromaticovorans, która jako substraty wykorzystuje również pirogronian i aldehyd zawierający grupę aromatyczną, aldolazy 3-hydroksyasparaginianowej (glioksylano-liazy erytro-3-hydroksy-L-asparaginianowej), która wykorzystuje jako substraty 2-oksokwasy i występuje przypuszczalnie u Micrococcus denitrificans, aldolazy benzoinowej (liazy benzaldehydowej), która wykorzystuje substraty zawierające grupy benzylowe, aldolazy dihydroneopterynowej, benzaldehydo-liazy L-treo-3-fenyloserynowej (aldolazy fenyloserynowej), która prowadzi kondensację glicyny z benzaldehydem, aldolazy 4-hyroksy-2-oksywalerianowej, aldolazy 1,2-dihydroksybenzylopirogronianowej i aldolazy 2-hydroksybenzylopirogronianowej.

Polipeptyd o pożądanej aktywności można wyselekcjonować przez przeszukiwanie badanych klonów za pomocą poniższych metod. Auksotrofy tryptofanowe transformuje się wektorami niosącymi badane klony w kasetce ekspresyjnej i hoduje się je w podłożu zawierającym małe ilości monatyny lub MP. Ponieważ reakcje katalizowane przez aminotransferazy i aldolazy są odwracalne, komórki są zdolne do wytwarzania tryptofanu z mieszaniny racemicznej monatyny. Podobnie, organizmy (zarówno rekombinowane jak i typu dzikiego) można selekcjonować na podstawie zdolności do wykorzystania MP lub monatyny jako źródła węgla i energii. Jednym ze źródeł aldolaz są biblioteki ekspresyjne różnych szczepów Pseudomonas i Rhizobacterium. Bakterie rodzaju Pseudomonas wykazują wiele niezwykłych szlaków katabolicznych służących degradacji związków aromatycznych, a także zawierają wiele aldolaz, podczas gdy bakterie rodzaju Rhizobium zawierają aldolazy, rozwijają się w ryzosferach roślin i posiadają wiele genów opisanych przy konstruowaniu szlaku biosyntetycznego monatyny.

P r z y k ł a d 5

Chemiczna synteza prekursora monatyny

Przykład 4 opisywał metodę wykorzystania aldolazy do konwersji indolo-3-pirogronianu w kwas 2-hydroksy-2-(indol-3-ilometylo)-4-ketoglutarowy, prekursora monatyny (MP). Ten przykład opisuje alternatywną metodę chemicznej syntezy MP.

MP powstaje przy wykorzystaniu typowej reakcji kondensacji typu aldolowego (Fig. 4). W skrócie, typowa reakcja typu aldolowego obejmuje wytworzenie karbanionu estru pirogronianowego przy użyciu silnej zasady, takiej jak LDA (diizopropyloamidu litowego), heksametylodisilazanu litowego lub butylu litowego. Wytworzony karbanion reaguje z indolo-pirogronianem tworząc sprzęgnięty produkt.

Grupy blokujące, które mogą zostać wykorzystane do ochrony azotu indolu obejmują, choć nie są ograniczone do grupy: t-butyloksykarbonylowej (Boc) i benzyloksykarbonylowej (Cbz). Grupy blokujące kwas karboksylowy obejmują, choć nie są ograniczone do: estrów alkilowych (na przykład estry metylowych, etylowych, benzylowych). Gdy wykorzystuje się takie grupy zabezpieczające, nie można kontrolować stereochemii tworzonego produktu. Jednakże, gdy R2 i/lub R3 są chiralnymi grupami zabezpieczającymi (Fig. 4), takimi jak (S)-2-butanol, mentol lub chiralna amina, może to faworyzować powstawanie jednego z enancjomerów MP w stosunku do drugiego.

P r z y k ł a d 6

Konwersja tryptofanu lub indolo-3-pirogronianu w monatynę

Proces in vitro wykorzystujący dwa enzymy, aminotransferazę i aldolazę, wytwarza monatynę z tryptofanu i pirogronianu. W pierwszym etapie alfa-ketoglutaran służy jako akceptor grupy aminowej z tryptofanu w reakcji transaminacji tworzą cej indolo-3-pirogronian i glutaminian. Aldolaza katalizuje drugą reakcję, w której pirogronian reaguje z indolo-3-pirogronianem w obecności Mg²⁺ i fosforanu,

PL 208 481 B1 tworząc alfa-keto pochodną monatyny (MP), kwas 2-hydroksy-2-(indol-3-ilometylo)-4-ketoglutarowy. Przeniesienie grupy aminowej z glutaminianu powstałego w pierwszej reakcji tworzy pożądany produkt, monatynę. Dzięki oczyszczeniu i charakteryzacji produktu ustalono, że wytworzony izomer to S,S-monatyna. Opisane zostały alternatywne substraty, enzymy i warunki, jak również ulepszenia poczynione w tym procesie.

Enzymy

Aldolazę, pirogroniano-liazę 4-hydroksy-4-metylo-2-oksyglutaranu (aldolaza ProA, gen proA) (EC 4.1.3.17) z Comamonas testosteroni sklonowano, przeprowadzano jej ekspresję i oczyszczono, jak opisano w Przykładzie 4. Glioksylano-liazy 4-hydroksy-2-oksyglutaranu (aldolazy KHG) (EC 4.1.3.16) z B. subtilis, E. coli i S. meliloti sklonowano, przeprowadzono ich ekspresję i oczyszczono, tak jak opisano w Przykładzie 4.

Aminotransferazy użyte wraz z aldolazami do wytwarzania monatyny to aminotransferaza L-asparaginianowa kodowana przez gen aspC E. coli, aminotransferaza tyrozynowa kodowana przez gen tyrB E. coli, enzym TatA S. meliloti, aminotransferaza o szerokim spektrum substratowym kodowana przez gen bsat L. major oraz transaminaza glutaminianowo-szczawiooctowa ze świńskiego serca (Typ Ila). Klonowanie, ekspresję i oczyszczanie nie-ssaczych białek opisano w Przykładzie 1. Transaminazę glutamininowo-szczawiooctową z serca świni (typ Ila) uzyskano z Sigmy (nr kat. G7005).

Metoda stosowania aldolazy ProA i aminotransferazy L-asparaginianowej

Mieszanina reakcyjna zawierała 50 mM octan amonowy, pH 8,0, 4 mM MgCl2, 3 mM fosforan potasowy, 0,05 mM fosforan pirydoksalu, 100 mM pirogronian amonowy, 50 mM tryptofan, 10 mM alfa-ketoglutaran, 160 mg rekombinowanej aldolazy ProA C. testosteroni (nieoczyszczony ekstrakt komórkowy, ~30% aldolazy), 233 mg rekombinowanej aminotransferazy L-asparaginianowej E. coli (nieoczyszczony ekstrakt komórkowy, ~40% aminotransferazy) w jednym litrze. Wszystkie składniki z wyjątkiem enzymów zmieszano razem i inkubowano w temperaturze 30°C aż do rozpuszczenia tryptofanu. Następnie dodano enzymy i roztwór reakcyjny inkubowano w temperaturze 30°C z łagodnym wytrząsaniem (100 obrotów na minutę) przez 3,5 godziny. Po 0,5 h i 1 godzinie po dodaniu enzymów dodawano do reakcji tryptofan w formie stałej (za każdym razem 50 milimoli). Nie cały dodany tryptofan rozpuścił się, ale stężenie utrzymywano na poziomie 50 mM lub wyższym. Po 3,5 godzinach odfiltrowano nierozpuszczony tryptofan. Analiza mieszaniny reakcyjnej przy użyciu LC/MS przy wykorzystaniu zdefiniowanej ilości tryptofanu jako standardu wykazała, że stężenie tryptofanu w roztworze wynosiło 60,5 mM, a stężenie monatyny 5,81 mM (1,05 g).

Do oczyszczenia produktu finalnego wykorzystano następujące metody. Dziewięćdziesiąt procent klarownego roztworu nałożono na kolumnę ze złożem AG50W-X8 BioRad (225 ml; pojemność wiązania 1,7 meq/ml). Kolumnę przemyto wodą, zbierając 300 ml frakcje, aż absorpcja przy długości fali 280 nm wynosiła <5% pierwszej frakcji. Następnie kolumnę eluowano 1 M octanem amonowym, pH 8,4 zbierając 4 frakcje 300 ml. Wszystkie 4 frakcje zawierały monatynę i zostały zagęszczone do 105 ml przez odparowanie, przy użyciu wyparki rotacyjnej w łaźni z ciepłą wodą. Podczas zmniejszania się objętości powstawał precypitat, który został odfiltrowany w trakcie procesu odparowywania.

Analiza frakcji z kolumny przy użyciu LC/MS wykazała, że 99% tryptofanu i monatyny związało się z kolumną. Precypitat wytworzony podczas procesu odparowania zawierał >97% tryptofanu i <2% monatyny. Proporcja tryptofanu do produktu w supernatancie wynosiła około 2:1.

Supernatant (7 ml) nałożono na kolumnę ze 100 ml złoża Fast Flow DEAE Sepharose (Amersham Biosciences) uprzednio przekształconego do formy octanowej przez przemycie 0,5 litra 1 M NaOH, 0,2 litra wody, 1,0 litrem 1,0 M octanu amonu, pH 8,4 i 0,5 litra wody. Supernatant nakładano przy szybkości przepływu <2 ml/min. i kolumnę przemywano wodą przy przepływie 3-4 ml/min. aż absorpcja przy długości fali 280 nm wynosiła ~0. Monatynę eluowano 100 mM octanem amonowym, pH 8,4 zbierając 4 frakcje o objętości 100 ml.

Analiza frakcji wykazała, że stosunek tryptofanu do monatyny we frakcjach przesączu wynosił 85:15, a we frakcjach eluatu 7:93. Zakładając, że współczynnik ekstynkcji monatyny przy długości fali 280 nm jest taki sam jak tryptofanu, frakcje eluatu zawierały 0,146 milimola produktu. Ekstrapolacja do całego 1 litra mieszaniny reakcyjnej daje ~2,4 milimola (~710 mg) monatyny, przy wydajności 68%.

Frakcje eluatu z kolumny DEAE Sepharose odparowano do <20 ml. Próbkę produktu oczyszczano dalej nakładając na preparatywną kolumnę odwrotnej fazy C8 wykorzystując te same warunki chromatografii, jak te opisane w Przykładzie 10 do charakteryzacji monatyny w skali analitycznej. Oprogramowanie Waters Fractionlynx^TM zostało wykorzystane do włączania automatycznego zbierania frakcji zawierających monatynę w oparciu o wykrycie jonu m/z = 293. Frakcję z kolumny C8 zawiePL 208 481 B1 rającą odpowiedni uprotonowany jon cząsteczkowy monatyny zebrano, odparowano całkowicie i rozpuszczono w małej objętości wody. Frakcję tę wykorzystano do charakteryzacji produktu.

Powstały produkt charakteryzowano przy użyciu następujących metod.

Spektroskopia w zakresie UV/widzialnym.

Pomiary spektrofotometryczne monatyny wytworzonej enzymatycznie w zakresie UV/widzialnym prowadzono przy użyciu spektrofotometru Cary 100 Bio UV/visible. Oczyszczony produkt wykazywał maksimum absorpcji przy długości fali 280 nm z ramieniem przy 288 nm, charakterystyczne dla związków zawierających indol.

Analiza LC/MS. Analizę mieszanin zawierających monatynę, a pochodzących z biochemicznych reakcji in vitro prowadzono, jak opisano w Przykładzie 10. Typową analizę LC/MS monatyny w mieszaninie syntezy enzymatycznej in vitro przedstawia Fig. 5. Dolna część Fig. 5 przedstawia chromatogram wybranego jonu odpowiadającego uprotonowanemu jonowi cząsteczkowemu monatyny przy m/z = 293.

Ta identyfikacja monatyny w mieszaninie została potwierdzona przez spektrum masowe przedstawione na Fig. 6. Analiza oczyszczonego produktu przy użyciu LC/MS wykazuje pojedynczy szczyt dla jonu cząsteczkowego 293 i absorpcji przy długości fali 280 nm. Spektrum masowe było identyczne z tym przedstawionym na Fig. 6.

Analiza MS/MS. Jak opisano w Przykładzie 10 na monatynie prowadzono również eksperymenty techniką LC/MS/MS. Spektrum masowe jonów rozpadowych monatyny przedstawiono na Fig. 7. Dokonano wstępnego przypisania struktur wszystkim jonom rozpadowym oznaczonym na Fig. 7. Dotyczy to jonów rozpadowych o m/z = 275 (293 - H2O), 257 (293 - (2 x H2O)), 230 (275 -COOH), 212 (257 - COOH), 168 (jon karboniowy 3-buta-1,3-dienylo-1H-indolu), 158 (jon karboniowy 1H-indolo-3-karbaldehydu), 144 (jon karboniowy 3-etylo-1H-indolu), 130 (jon karboniowy 3-metyleno-1H-indolu) i 118 (jon karboniowy indolu). Wiele z nich jest identycznych z tymi otrzymanymi dla MP (Przykład 4), czego należy się spodziewać po pochodnych z grupy indolowej. Niektóre są o 1 jednostkę masową cięższe niż te uzyskane dla MP, ze względu na obecność grupy aminowej w miejsce ketonowej.

Analiza MS o wysokiej rozdzielczości. Fig. 8 przedstawia spektrum masowe uzyskane dla oczyszczonej monatyny przy użyciu hybrydowego spektrometru masowego kwadrupolowego z analizatorem czasu przelotu Applied Biosystems-Perkin Elmer Q-Star. Zmierzona masa uprotonowanej monatyny przy użyciu tryptofanu jako wewnętrznego standardu kalibracyjnego wynosiła 293,1144. Masa uprotonowanej monatyny obliczona w oparciu o skład pierwiastkowy C14H17N2O5 wynosi 293,1137. Oznacza to błąd w ustaleniu masy mniejszy niż 2 części na milion (ppm), dostarczając ostatecznego dowodu na skład pierwiastkowy monatyny wytworzonej enzymatycznie.

Spektroskopia NMR.

Badania NMR przeprowadzono przy użyciu urządzenia Varian Inova 500 MHz. Próbkę monatyny (~3 mg) rozpuszczono w 0,5 ml D2O. Początkowo rozpuszczalnik (D2O) użyto jako wewnętrzną referencję przy 4,78 ppm. Ponieważ szczyt dla wody był duży, NMR ¹H prowadzono przy supresji szczytu dla wody. Następnie, ze względu na szerokość szczytu dla wody, jako szczytu odniesienia używano protonu C-2 monatyny, dla którego przyjęto opublikowaną wartość 7,192 ppm.

W przypadku NMR ¹³C początkowy eksperyment z kilkuset skanami wskazywał, że próbka była zbyt rozcieńczona, by uzyskać odpowiednie spektrum ¹³C w przydzielonym czasie. Dlatego przeprowadzono eksperyment z heterojądrową wielokrotną spójnością kwantową (HMQC), który umożliwił korelację wodorów i węgli, do których były one dołączone, jak również dostarczył informacji o chemicznych przesunięciach węgli.

Podsumowanie danych dotyczących ¹H i HMQC przedstawiają Tablice 2 i 3. Porównanie danych NMR z wartościami opublikowanymi wskazuje, że monatyna wytworzona enzymatycznie miała formę (S,S), (R,R), lub była mieszaniną obu.

Chiralna analiza LC/MS. Aby ustalić, czy monatyna wytworzona in vitro była jednym izomerem, czy mieszaniną enancjomerów (R,R) i (S,S) przeprowadzono chiralną analizę LC/MS przy użyciu oprzyrządowania opisanego w Przykładzie 10.

Chiralny rozdział w LC wykonano przy użyciu chiralnej kolumny chromatograficznej Chirobiotic T (Advanced Separation Technology) w temperaturze pokojowej. Rozdział i detekcję oparte na opublikowanych protokołach producenta zoptymalizowano dla izomerów R- (D) i S- (L) tryptofanu. Faza ruchoma LC składała się z A) wody zawierającej 0,05% (obj./obj.) kwas trifluorooctowy i B) metanolu zawierającego 0,05% (obj./obj.) kwas trifluorooctowy. Elucja była izokratyczna przy 70% A i 30% B. Szybkość przepływu wynosiła 1,0 ml/minutę, a absorpcję PDA monitorowano od długości fali od 200 nm do 400 nm. Parametry sprzętowe użyte do chiralnej analizy LC/MS tryptofanu i monatyny były iden34

PL 208 481 B1 tyczne z opisanymi w Przykładzie 10 dla analizy LC/MS. Użyto zbioru spektrów masowych dla regionu m/z 150-400. Chromatogramy selekcjonowanych uprotonowanych jonów cząsteczkowych ([M + H]⁺ = 205 dla R- i S-tryptofanu i [M + H]⁺ = 293 dla monatyny) umożliwiły bezpośrednią identyfikację tych analitów w mieszaninach.

Chromatogramy R- i S-tryptofanu i monatyny, rozdzielonych w chiralnej chromatografii i monitorowane przy użyciu MS przedstawiono na Fig. 9. Pojedynczy szczyt w chromatogramie monatyny wskazuje, że składnik ten występuje jako pojedynczy izomer o czasie retencji niemal identycznym jak S-tryptofan.

T a b l i c a 2

Dane NMR dla ¹H

	Cargill	1 Vleggaar i in.	2 Takeshi i in.
Atom	δΝ	J (HH) Hz	δH	J (HH) Hz	δH	J(HH) Hz
2	7,192 (1H,s)		7,192 (s)		7,18 (s)
4	7,671 (d)	7,99	7,686 (d)	7,9	7,67 (d)	8,0
5	7,104	7,99	7,102 (dd)	8,0,	7,11	7,5, 7,5
	(dd)			8,0	(dd)
6	7,178	*	7,176 (dd)	8,0	7,17	7,5, 7,5
	(dd)			8,0	9dd)
7	7,439 (d)	7,99	7,439 (d)	8,1	7,43 (d)	8,0
10a	3,242 (d)	14,5	3,243 (d)	14,3	3,24 (d)	14,5
10b	3,033 (d)	14,5	3,051 (d)	14,3	3,05 (d)	14,5
12	2,626	15,5,	2,561 (dd)	15,3,	2,62	15,5, 1,8
	(dd)	1,5	2,006 (dd)	1,7	(dd)	15,5,
	2,015	15,0		15,3,	2,01	12,0
	(dd)	12,0		11,7	(dd)
13	3,571	10,75*,	3,168	11,6,	3,57	12,0, 1,8
	(dd)	1,5	(dd)	1,8	(dd)

¹ Vleggaar i in. (J.C.S. Perkin Trans. 1: 3095-8, 1992).

² Takeshi i Shusuke (JP2002060382, 2002-02-26).

T a b l i c a 3: Dane NMR dla ¹³C (ze spektrum HMQC)

	Cargill	Vleggaar i in. 1
1	2	3
Atom	δc	δc
2	126,1	126,03
3	*	110,31
4	120,4	120,46
5	120,2	120,25
6	122,8	122,74
7	112,8	112,79

PL 208 481 B1 cd. tablicy 3

1	2	3
8	*	137,06
9	*	129,23
10a	36,4	36,53
12	39,5	39,31
13	54,9	54,89
14	*	175,30
15	*	181,18

¹Vleggaar i in. (J.C.S. Perkin Trans. 1: 3095-8, 1992).

Polarymetria. Skręcalność optyczną mierzono na polarymetrze Rudolph Autopol III. Przygotowywano roztwór monatyny w wodzie o stężeniu 14,6 mg/ml. Dla roztworu 1 g/ml spodziewana skrę20 calność specyficzna ([a]D ) w przypadku S,S monatyny wynosi -49,6 (Vleggaar i in.). Obserwowana

[a]_D dla oczyszczonej wytworzonej enzymatycznie monatyny wynosiła -28,1, co wskazuje, że jest to izomer S,S.

Ulepszenia

Zoptymalizowano warunki reakcji, w tym stężenia reagentów i enzymów, co w opisanych poniżej mieszaninach przynosiło wydajność 10 mg/ml:

mM octan amonu pH 8,3, 2 mM MgCl2, 200 mM pirogronian (sól sodowa lub amonowa), 5 mM alfa-ketoglutaran (sól sodowa), 0,05 mM fosforan pirydoksalu, odpowietrzona woda do objętości 1 ml po uwzględnieniu objętości enzymów, mM fosforan potasowy, 50 pg/ml rekombinowanej aldolazy ProA (ekstrakt komórkowy - całkowite stężenie białka 167 pg/ml), 1000 pg/ml aminotransferazy L-asparaginianowej kodowanej przez gen aspC E. coli (ekstrakt komórkowy - całkowite stężenie białka 2500 pg/ml) i tryptofan w formie stałej do stężenia >60 mM (roztwór nasycony - częściowo nierozpuszczony podczas reakcji). Mieszaninę inkubowano w temperaturze 30°C przez 4 godziny z delikatnym mieszaniem.

Zmiany

Stężenie alfaketoglutaranu można obniżyć do 1 mM i uzupełnić 9 mM asparaginianem uzyskując zbliżoną wydajność monatyny. W pierwszym etapie można wykorzystać alternatywne akceptory aminokwasowe takie jak szczawiooctan.

Podobną wydajność monatyny uzyskano stosując w miejsce aminotransferazy L-asparaginianowej E. coli aminotransferazę o szerokim spektrum substratowym z L. major. Jednakże, w analizie LC-MS wykrywano drugi niezidentyfikowany produkt (3-10% głównego produktu) o masie cząsteczkowej 292. Gdy jako aminotransferazy używano enzymu kodowanego przez tyrB E. coli, kodowanego przez tatA S. meliloti lub transaminazy glutaminianowo-szczawiooctowej z serca świni (typ II), uzyskiwano stężenia monatyny 0,1 - 0,5 mg/ml. Gdy reakcję rozpoczyna się od indolo-3-pirogronianu, jako ostatni etap można za pomocą dehydrogenazy glutaminianowej i NADH przeprowadzić redukcyjną aminację (jak w Przykładzie 7).

Do enzymatycznego wytwarzania monatyny używano również aldolaz KGH z B. subtilis, E. coli i S. meliloti wraz z aminotransferazą L-asparaginianową E. coli. Używano następujących warunków reakcji: 50 mM NH4-OAc pH 8,3, 2 mM MgCl2, 200 mM pirogronian, 5 mM glutaminian, 0,05 mM fosforan pirdoksalu, odpowietrzona woda do ostatecznej objętości 0,5 ml, po uwzględnieniu objętości dodawanych enzymów, 3 mM fosforan potasowy, 20 pg/ml rekombinowanej aldolazy KGH B. subtilis (oczyszczonej), około 400 pg/ml aminotransferazy L-asparaginianowej E. coli (AspC) nieoczyszczonej z ekstraktu komórkowego i 12 mM indolo-3-pirogronian. Reakcje inkubowano przez 30 minut w temperaturze 30°C z wytrząsaniem. Ilość monatyny otrzymywanej przy użyciu enzymu z B. subtilis wynosiła 80 ng/ml i wzrastała wraz z rosnącymi ilościami aldolazy. Kiedy indolo-3-pirogronian zastąpiono nasycającymi ilościami tryptofanu i 5 mM alfa-ketoglutaranem, produkcja monatyny wzrosła do 360 ng/ml. Reakcje powtórzono z 30 pg/ml każdego z trzech enzymów KHG w 50 mM Tris pH 8,3 i nasycającymi ilościami tryptofanu i prowadzono przez godzinę, aby polepszyć detekcję. Podobnie jak w Przykładzie 4, enzym z Bacillus miał najwyższą aktywność wytwarzając około 4000 ng/ml monatyny. KHG E. coli wytwarzał 3000 ng/ml monatyny, a enzym S. meliloti wytwarzał 2300 ng/ml.

PL 208 481 B1

P r z y k ł a d 7

Konwersja MP - monatyna

Aminację MP prowadzącą do monatyny mogą katalizować aminotransferazy takie jak te zidentyfikowane w Przykładach 1 i 6 lub dehydrogenazy wymagające redukującego kofaktora, takiego jak NADH lub NADPH. Reakcje te są odwracalne i można je mierzyć w obu kierunkach. Gdy używa się dehydrogenazy, w dużej mierze można kontrolować kierunkowość za pomocą stężenia soli amonowych.

Aktywność dehydrogenazy. Oksydacyjną deaminację monatyny monitorowano śledząc wzrost absorpcji przy długości fali 340 nm, gdy NAD(P)⁺ był przekształcany do bardziej absorbującego NAD(P)H. Monatynę wytwarzano enzymatycznie i oczyszczano, tak jak opisano w Przykładzie 6.

Typowa mieszanina reakcyjna zawierała 50 mM Tris-HCl, pH 8,0 do 8,9, 0,33 mM NAD⁺ lub NADP⁺, 2 do 22 jednostek dehydrogenazy glutaminianowej (Sigma) i 10-15 mM substratu w 0,2 ml. Oznaczenia prowadzono w dwóch powtórzeniach przy użyciu przezroczystej dla światła UV płytki do mikromiareczkowania w czytniku płytek SpectraMax Plus. Mieszaninę enzymu, buforu i NAD(P)⁺ przenoszono do studzienek zawierających substrat i po krótkim mieszaniu co 10 sekund monitorowano wzrost absorpcji przy długości fali 340 nm. Reakcję inkubowano w temperaturze 25°C przez 10 minut. Negatywne kontrole prowadzono bez dodawania substratu, a jako pozytywną kontrolę używano glutaminian. Dehydrogenaza glutaminianowa typu III z wątroby bydlęcej (Sigma nr kat. G-7882) katalizowała przemianę monatyny do prekursora monatyny z szybkością około sto razy mniejszą od przemiany glutaminianu do alfa-ketoglutaranu.

Aktywność transaminazy. Oznaczenia aminotransferaz monatyny prowadzono dla aminotransferazy asparaginianowej (AspC) z E. coli, aminotransferazy tyrozynowej (TyrB) z E. coli, aminotransferazy o szerekim spektrum substratowym (BSAT) z L. major i dwu świńskich aminotransferaz glutaminianowo-szczawiooctanowych dostępnych komercyjnie, opisanych w Przykładzie 1. Jako akceptor grup aminowych testowano zarówno szczawiooctan jak i alfa-ketoglutaran. Mieszanina do oznaczeń zawierała (w 0,5 ml) 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,05 mM PLP, 5 mM akceptor grup aminowych, 5 mM monatynę i 25 ąg aminotransferazy. Oznaczenia inkubowano przez 30 minut w temperaturze 30°C i reakcje zatrzymywano dodając 0,5 ml alkoholu izopropylowego. Utratę monatyny monitorowano za pomocą LC/MS (Przykład 10). Najwyższą aktywność zaobserwowano z BSAT L. major i szczawiooctanem jako akceptorem grup aminowych, nieco niższą z tym samym enzymem i alfa-ketoglutaranem jako akceptorem grup aminowych. Względna aktywność ze szczawiooctanem wyglądała następująco: BSAT > AspC > świński typ Ila > świński typ I = TyrB. Względna aktywność z alfa-ketoglutaranem wyglądała następująco: BSAT > AspC > świński typ I > świński typ Ila > TyrB.

P r z y k ł a d 8

Wytwarzanie monatyny z tryptofanu i źródeł C3 innych niż pirogronian

Jak pisano powyżej w Przykładzie 6, indolo-3-pirogronian lub tryptofan można przekształcać w monatynę wykorzystując pirogronian jako cząsteczkę C3. Jednakże, w niektórych przypadkach, pirogronian może nie być odpowiednim surowcem. Na przykład, pirogronian może być droższy niż inne źródła węgla C3 lub dodany do podłoża może źle wpływać na fermentację. Wiele enzymów PLP może prowadzić transaminację alaniny do pirogronianu.

Enzymy podobne do tryptofanaz przeprowadzają reakcje beta-eliminacji z większymi prędkościami niż inne enzymy PLP, takie jak aminotransferazy. Enzymy tej klasy (4.1.99.-) mogą wytwarzać amoniak i pirogronian z aminokwasów takich jak L-seryna, L-cysteina i pochodne seryny i cysteiny z odpowiednimi grupami opuszczającymi, takie jak O-metylo-L-seryna, O-benzylo-L-seryna, S-metylocysteina, S-benzylocysteina, S-alkilo-L-cysteina, O-acylo-L-seryna, 3-chloro-L-alanina.

Procesy służące produkcji monatyny przy wykorzystaniu enzymów EC 4.1.99.- można usprawnić przez mutacje β-tyrozynazy (TPL) lub tryptofanazy według metody Mouratou i in. (J. Biol. Chem 274: 1320-5, 1999). Mouratou i in. opisują możliwość przekształcenia β-tyrozynazy w β-liazę aminokwasów dikarboksylowych, której nie opisano w naturze. Zmianę w specyficzności osiągnięto zamieniając walinę (V) w pozycji 283 na argininę (R) i argininę (R) w pozycji 100 na treoninę (T). Te zmiany aminokwasowe powodują, że liaza akceptuje aminokwasy dikarboksylowe (takie jak asparaginian) w reakcji deaminacji hydrolitycznej. Dlatego też, asparaginian można również wykorzystywać jako źródło pirogronianu do następnego etapu, reakcji kondenasacji aldolowej.

Ponadto, komórki lub reaktory enzymatyczne można zaopatrywać w mleczan i enzym przekształcający mleczan do pirogronianu. Przykładami enzymów zdolnych do przeprowadzania takiej reakcji są dehydrogenaza mleczanowa i oksydaza mleczanowa.

PL 208 481 B1

Izolacja genomowego DNA

Polipeptydy tryptofanaz zostały już opisane, na przykład przez Mouratou i in. (JBC 274: 1320-5, 1999). Aby wyizolować geny kodujące tryptofanazę, jako matrycę w PCR wykorzystano genomowy DNA z E. coli DH10B, podobnie jak opisano w Przykładzie 1.

Gen liazy tyrozynowo-fenolowej wyizolowano z C. freundii (numer katalogu ATCC 8090, oznaczenie ATCC 13316; NCTC 9750) hodowanej na agarze odżywczym (Difco 0001) i bulionie odżywczym (Difco 0003) w temperaturze 37°C do OD 2,0. Genomowy DNA oczyszczano przy użyciu zestawu Qiagen Genomictip^TM 100/G.

Amplifikaćja sekwencj i kodujących za pomocą PCR

Startery zaprojektowano z kompatybilnymi końcami dla wektora pET 30 Xa/LIC (Novagen, Madison, WI), jak opisano w Przykładzie 1.

tna E. coli (sekwencja o numerze identyfikacyjnym SEQ ID No. 41). N-końcowy starter do klonowania w pET30 Xa/LIC: 5'-GGT ATT GAG GGT CGC ATG GAA AAC TTT AAA CAT CT-3' (sekwencja o numerze identyfikacyjnym SEQ ID No. 43).

C-końcowy starter do klonowania w pET30 Xa/LIC: 5'-AGA GGA GAG TTA GAG CCT TAA ACT TCT TTA AGT TTT G-3' (sekwencja o numerze identyfikacyjnym SEQ ID No. 44).

tp1 C. freundii (sekwencja o numerze identyfikacyjnym SEQ ID No. 42). N-końcowy starter do klonowania w pET30 Xa/LIC: 5'-GGT ATT GAG GGT CGC ATGAATTATCCGGCAGAACC-3' (sekwencja o numerze identyfikacyjnym SEQ ID No. 45).

C-końcowy starter do klonowania w pET30 Xa/LIC: 5'-AGA GGA GAG TTA GAG CCTTAGATGTAATCAAAGCGTG-3' (sekwencja o numerze identyfikacyjnym SEQ ID No. 46).

Do wszystkich reakcji PCR używano Eppendorf Mastercycler^TM Gradient 5331 Thermal Cycler. Do 50 gl dodawano 0,5 gg matrycy (genomowego DNA), 1,0 U.M każdego startera, 0,4 mM każdego dNTP, 3,5 jednostki polimerazy Expand High Fidelity (Roche), 1x bufor Expand z Mg i 5% DMSO (końcowe stężenie). Używano następującego programu termocyklera PCR: gorący start w temperaturze 96°C (5 minut), temperatura 94°C - 30 sekund, temperatura 40-60°C - 1 minuta 45 sekund, temperatura 72°C - 2 minuty 15 sekund, 30 powtórzeń. Ostatni etap polimeryzacji trwał 7 minut, a następnie próbki utrzymywano w temperaturze 4°C.

Klonowanie

Do identyikacji odpowiednich klonów używano metod klonowania i identyfikacji pozytywnych klonów opisanych dokładnie powyżej w Przykładzie 1.

Ekspresja genów i oznaczenia aktywności

Plazmidowy DNA (zweryfikowany przez analizę sekwencji) subklonowano do gospodarza ekspresyjnego BL21(DE3) (Novagen). Aby potwierdzić identyczność plazmidów kultury hodowano w podłożu LB z 30 mg/l kanamycyny, izolowano plazmidy przy użyciu zestawu Qiagen miniprep i analizowano za pomocą trawienia enzymami restrykcyjnymi.

Eksperymenty z indukcją przeprowadzono w gospodarzu ekspresyjnym BL21(DE3). Konstrukty hodowano w temperaturze 37°C w podłożu LB zawierającym 50 mg/l kanamycyny. Ekspresję białka indukowano przy pomocy 0,1 mM IPTG, gdy OD600 hodowli osiągnęło około 0,6. Komórki hodowano przez 4 godziny w temperaturze 30°C i zbierano przez wirowanie. Następnie komórki lizowano w proporcji 5 ml/g mokrej masy komórkowej odczynnikiem BugBuster^TM (Novagene) zawierającym 5 gl/ml koktailu inhibitorów proteaz, zestaw III (Calbiochem) i 1 gl/ml nukleazy benzonazowej (Novagen). Zawierające znaczniki His rekombinowane białka oczyszczano przy użyciu kolumienek His-Bind, jak opisano powyżej w Przykładzie 1. Oczyszczone białka odsalano na kolumnie PD-10 (Sephadex G25, Amersham Biosciences) i eluowano buforem 100 mM Tris-Cl, pH 8,0. Białka analizowano metodą SDS-PAGE w żelach gradientowych 4-15%, aby ustalić poziom rozpuszczalnego białka o masie cząsteczkowej przewidywanej dla rekombinowanego białka fuzyjnego.

Mutageneza

Niektórzy przestawiciele polipeptydów klasy 4.1.99.- (tryptofanaza i β-tyrozynaza) prowadzą reakcję beta-liazy z asparaginianem lub podobnymi aminokwasami bez żadnej modyfikacji. Jednakże, niektórzy przedstawiciele tej klasy mogą wymagać mutagenezy, aby mogły wykorzystywać substraty i/lub tworzyć produkty. Ponadto, w niektórych przypadkach polipeptydy, które są zdolne do przeprowadzenia konwersji mogą być bardziej zoptymalizowane dzięki mutagenezie.

Mutagenezę ukierunkowaną wobec miejsca przeprowadzano w oparciu o analizę struktury trójwymiarowej polipeptydów wiążących PLP. Poniżej przedstawiono dwa przykłady zmiany specyficzności substratowej polipeptydów.

PL 208 481 B1

P r z y k ł a d 1, mutageneza tryptofanazy

Protokół mutagenezy przedstawiony poniżej wprowadził do sekwencji aminokwasowej dwie mutacje punktowe. Pierwsza mutacja punktowa zamieniła argininę (R) w pozycji 103 na treoninę (T), a druga mutacja punktowa zamieniła walinę (V) w pozycji 299 na argininę (R) (numeracja według dojrzałego białka E. coli). Eksperymenty z mutagenezą przeprowadzono w ATG Laboratories (Eden Praire, MN). Mutacje wprowadzono kolejno za pomocą reakcji PCR fragmentów genu. Złożenie genu przeprowadzono również za pomocą PCR.

Startery do zamiany argininy (R) 103 na treoninę (T):

5'-CCAGGGCACCGGCGCAGAGCAAATCTATATT-3' (sekwencja o numerze identyfikacyjnym

SEQ ID No. 47) i

5'-TGCGCCGGTGCCCTGGTGAGTCGGAAATGGT-3' (sekwencja o numerze identyfikacyjnym

SEQ ID No. 48).

Startery do zamiany waliny (V) 299 na argininę (R):

5'-TCCTGCACGCGGCAAAGGGTTCTGCACTCGGT-3' (sekwencja o numerze identyfikacyjnym

SEQ ID No. 49) i

5'-CTTTGCCGCGTGCAGGAAGGCTTCCCGACA-3' (sekwencja o numerze identyfikacyjnym

SEQ ID No. 50).

Mutanty selekcjonowano za pomocą trawienia eznymami restrykcyjnymi XbaI/HindIII i SphI i potwierdzono przez sekwencjonowanie.

P r z y k ł a d 2, mutageneza liazy tyrozynowo-fenolowej (β-tyrozynazy)

Do sekwencji aminokwasowej liazy tyrozynowo-fenolowej wprowadzono dwie mutacje punktowe. Mutacje te zamieniły argininę (R) w pozycji 100 na treoninę (T) i walinę (V) w pozycji 283 na argininę (R) (w sekwencji dojrzałego białka C. freundii).

Startery do konwersji R100T były następujące:

5'-AGGGGACCGGCGCAGAAAACCTGTTATCG-3' (sekwencja o numerze identyfikacyjnym SEQ

ID No. 51) i

5'-AGGGGACCGGCGCAGAAAACCTGTTATCG-3' (sekwencja o numerze identyfikacyjnym SEQ ID No. 52).

Startery do konwersji V283R były następujące:

5'-GTTAGTCCGCGTCTACGAAGGGATGCCAT-3' (sekwencja o numerze identyfikacyjnym SEQ ID No. 53) i

5'-GTAGACGCGGACTAACTCTTTGGCAGAAG-3' (sekwencja o numerze identyfikacyjnym

SEQ ID No. 54).

Zastosowano metody opisane powyżej, a klony selekcjonowano trawieniem KpnI/SacI i trawieniem Bstl. Sekwencje zweryfikowano za pomocą sekwencjonowania metodą terminacji łańcucha dideoksynukleotydami. Rekombinowane białko wytwarzano, tak jak opisano powyżej dla enzymów typu dzikiego.

Mieszanina reakcyjna składała się z 50 mM Tris-Cl pH 8,3, 2 mM MgCl2, 200 mM źródła węgla C3, 5 mM soli sodowej alfa-ketoglutaranu, 0,05 mM fosforanu pirydoksalu, odpowietrzonej wody, do końcowej objętości 0,5 ml po uwzględnieniu dodawanych enzymów, 3 mM fosforanu potasowego pH 7,5, 25 μg nieoczyszczonej aldolazy ProA C. testosteroni przygotowanej jak w Przykładzie 4, 500 Lig nieoczyszczonej aminotransferazy L-asparaginianowej (AspC) przygotowanej jak w Przykładzie 1 i tryptofanu w formie stałej do stężenia >60 mM (roztwór nasycony, pewna ilość pozostała nierozpuszczona podczas reakcji). Mieszaninę reakcyjną inkubowano przez 30 minut w temperaturze 30°C z mieszaniem. Jako źródeł węgla 3 dodawano seryny, alaniny i asparaginianu. Oznaczenia prowadzono z i bez dodatkowych enzymów PLP (oczyszczonych), zdolnych do przeprowadzania reakcji beta-eliminacji i beta-liazy (tryptofanaza (TNA), podwójny mutant tryptofanazy, β-tyrozynaza (TPL)). Wyniki przedstawia Tablica 4:

T a b l i c a 4:

Wytwarzanie monatyny przy wykorzystaniu alternatywnych źródeł węgla C-3

Źródło węgla C3	Dodatkowy enzym PLP	Aktywność względna
1	2	3
brak	brak	0%
pirogronian	brak	100%

PL 208 481 B1 cd. tablicy 4

1	2	3
seryna	brak	3%
seryna	11pg TNA typu dzikiego (1 jednostka)	5,1%
seryna	80 pg podwójnego mutanta TNA	4,6%
alanina	brak	32%
alanina	11 pg TNA typu dzikiego	41,7%
alanina	80 pg zmutowanego TNA	43,9%
asparaginian	110 pg TNA typu dzikiego (10 jednostek)	7,7%
asparaginian	5 jednostek TPL typu dzikiego (nieoczyszczonego)	5,1%
asparaginian	80 pg zmutowanego TNA	3,3%

Identyfikację monatyny wytwarzanej z alaniny i seryny jako 3-węglowych źródeł węgla potwierdzono analizą skanów z LC/MS/MS, i stwierdzono, że jest identyczna ze scharakteryzowaną monatyną wytworzoną w Przykładzie 6. Najlepszą z tesowanych alternatyw była alanina, transaminowana przez enzym AspC. Ilość wytwarzanej monatyny została zwiększona przez dodanie tryptofanazy, której dodatkową aktywnością jest transaminacja. Ilość monatyny wytwarzanej z seryną jako źródłem węgla wzrosła niemal dwukrotnie po dodaniu enzymów tryptofanazowych, chociaż w porównaniu z aminotransferazą dodano tylko jedną piątą tryptofanazy. AspC sama jest zdolna w pewnym stopniu do aktywności beta-eliminacji. Wyniki uzyskane dla asparaginianu wskazują, że aktywność tryptofanazy w stosunku do asparaginianu nie wzrasta przy tych samych mutacjach co te sugerowane uprzednio dla β-tyrozynazy. Można się spodziewać, że zmutowana β-tyrozynaza będzie miała wyższą aktywność w produkcji monatyny.

P r z y k ł a d 9

Chemiczna synteza monatyny

Dodanie alaniny do kwasu indolo-3-pirogronowego daje monatynę i reakcję tą można przeprowadzać syntetycznie z odczynnikiem Grignarda lub organicznym litem.

Na przykład do 3-chloro lub 3-bromo-alaniny zablokowanej odpowiednio przy grupach aminowej i karboksylowej, dodaje się w warunkach bezwodnych magnez. Następnie dodaje się indolo-3-pirogronian (odpowiednio zablokowany) dając sprzężony produkt, po czym usunięcie grup blokujących daje monatynę. Do grup blokujących, które są szczególnie użyteczne należy THP (eter tetrahydropiranylowy), który można łatwo przyłączyć i usunąć.

P r z y k ł a d 10

Wykrywanie monatyny i MP

Przykład ten opisuje metody wykorzystywane do wykrywania obecności monatyny lub jej prekursora kwasu 2-hydroksy-2-(indol-3-ilometylo)-4-ketoglutarowego.

Analiza LC/MS

Analizę mieszanin alfa-ketokwasowej formy monatny (prekursora monatyny, MP) i monatyny otrzymanej w wyniku reakcji biochemicznych in vitro i in vivo prowadzono przy użyciu wyposażenia Waters/Micromass do chromatografii cieczowej - tandemowej spektrometrii masowej (LC/MS/MS) obejmującego chromatograf Waters 2690 z monitorem absorbancji Waters 996 Photo-Diode Array (PDA) umieszczony pomiędzy chromatografem a potrójnym kwadrupolowym spektrometem masowym Micromass Quatro Ultima. Do rozdziału w LC używano kolumny do chromatografii odwrotnej fazy Supelco Discovery C18, 2,1 mm x 150 mm lub kolumny do chromatogarfii odwrotnej fazy Xterra MS C8, 2,1 mm x 250 mm w temperaturze pokojowej. Faza ruchoma LC składała się z (A) wody zawierającej 0,05% (obj./obj.) kwas trifluorooctowy i B) metanol zawierający 0,05% (obj./obj.) kwas trifluorooctowy.

Prowadzono elucję gradientem liniowym 5% B do 35% B, 0-9 minut, 35% B do 90% B, 9-16 minut, izokratyczną przy 90% B, 16-20 minut, liniowym gradientem 90% B do 5% B, 20-22 minut, z 10 minutowym etapem równoważenia pomiędzy frakcjonowaniami. Szybkość przepływu wynosiła 0,25 ml/minutę, a absorpcję w PDA monitorowano przy długości fali 200 nm do 400 nm. Wszystkie parametry ESI-MS zoptymalizowano i wyselekcjonowano w oparciu o powstawanie uprotonowanych jonów cząsteczkowych ([M + H]⁺) badanych analitów i powstawanie charakterystycznych jonów fragmentacyjnych.

PL 208 481 B1

Przy analizie monatyny w LC/MS używano następujących parametrów instrumentu: kapilara:

3,5 kV, stożek: 40 V; Hex 1: 20 V; apertura: 0 V; Hex 2: 0 V; temperatura źródła: 100°C; temperatura desolwacji: 350°C; gaz do desolwacji 500 l/h; gaz na stożku: 50 l/h; rozdzielczość przy niskich masach (Q1): 15,0; rozdzielczość przy wysokich masach (Q1): 15,0; energia jonu: 0,2; wejście 50V; energia kolizji: 2; wyjście: 50V; rozdzielczość niskich mas (Q2): 15; rozdzielczość wysokich mas (Q2): 15; energia jonu (Q2): 3,5; powielacz: 650. Niepewność podanych proporcji masa/ładunek (m/z) i mas cząsteczkowych +/- 0,01%. Wstępną detekcję alfa-keto kwasowej formy monatyny (MP) i monatyny w mieszaninach uzyskano monitorując za pomocą LC/MS i zbierając spektra masowe w regionie m/z 150-400. Bezpośrednią identyfikację tych analitów w mieszaninach umożliwiły chromatogramy wybranych jonów dla uprotonowanych jonów cząsteczkowych ([M + H]⁺ = 293 dla monatyny).

Analiza MS/MS

Eksperymenty na monatynie z jonem rozpadowym w LC/MS/MS przeprowadzano w następujący sposób. Analiza jonu rozpadowego obejmuje przeprowadzenie badanego jonu rodzicielskiego (np. m/z = 293 dla monatyny) z pierwszego analizatora masowego (Q1) do komory kolizyjnej spektrometru masowego, gdzie wprowadza się argon chemicznie rozbijający jon rodzicielski do jonów rozpadowych. Te jony rozpadowe wykrywa się następnie w drugim analizatorze masowym (Q2) i można je wykorzystać do potwierdzenia identyfikacji strukturalnej jonu rodzicielskiego.

Do analizy monatyny w LC/MS/MS wykorzystano następujące parametry instrumentu: kapilara:

3,5 kV; stożek: 40 V; Hex 1: 20V, apertura: 0 V; Hex 2: 0 V; temperatura źródła: 100°C; temperatura desolwacji: 350°C; gaz desolwacji 500 l/h; gaz stożka: 50 l/h; rozdzielczość niskich mas (Q1): 13,0; rozdzielczość wysokich mas (Q1): 13,0; energia jonu: 0,2; wejście: - 5 V; energia kolizji: 14; wyjście: 1 V; rozdzielczość niskich mas (Q2): 15; rozdzielczość wysokich mas (Q2): 15; energia jonu (Q2): 3,5; powielacz: 650.

Wysokoprzepustowa analiza monatyny

Wysokoprzepustową analizę (<5 min/próbkę) mieszanin monatyny otrzymanych z reakcji in vitro lub in vivo prowadzono używając wyposażenia opisanego powyżej i takich samych parametrów jakie opisano dla LC/MS/MS. Rozdziały w LC prowadzono używając chromatografii na C8 Waters Xterra MS (2,1 mm x 50 mm) w temperaturze pokojowej z elucją izokratyczną w wodnym roztworze 15% MeOH, 0,25% kwasu octowego przy szybkości przepływu 0,3 ml/minutę. Detekcję monatyny w roztworze prowadzono przy użyciu selektywnego monitorowania reakcji (SRM) - tandemowej spektroskopii masowej. Obejmowała ona monitorowanie indukowanego kolizją przejścia specyficznego jonu rodzicielskiego ([M + H]⁺ = 293,1) do jonu rozpadowego (np. jon rozpadowy przy m/z = 168,1, tymczasowo zidentyfikowany jako jon karboniowy 3-buta-1,3-dienylo-1H-indolu), aby zmaksymalizować czułość, wybiórczość i przepustowość wykrywania monatyny. Równolegle zbierano dane dotyczące absorpcji w PDA dla dalszej weryfikacji identyfikacji monatyny.

P r z y k ł a d 11

Wytwarzanie monatyny w bakteriach

Przykład ten opisuje metody wykorzystywane do wytwarzania monatyny w komórkach E. coli. Specjalista w tej dziedzinie będzie rozumiał, że podobne metody można wykorzystywać do wytwarzania monatyny w innych komórkach bakteryjnych. Poza tym, można wykorzystywać wektory zawierające inne geny ze szlaku syntezy monatyny (Fig. 2).

Podłoże Trp-1 z glukozą, podłoże minimalne wykorzystywane do zwiększonej produkcji tryptofanu w komórkach E. coli (Zeman i in. Folia Microbiol. 35: 200-4, 1990), przygotowano następująco. Do 700 ml wody o specjalnej czystości dodano następujące odczynniki: 2 g (NH4)2SO4, 13,6 g KH₂PO₄, 0,2 g MgSO₄7H₂O, 0,01 g CaCl₂7H₂O i 0,5 mg FeSO₄7H₂O. pH doprowadzono do 7,0, objętość powiększono do 850 ml i podłoże sterylizowano w autoklawie. 50% roztwór glukozy przygotowano osobno i wysterylizowano przez filtrację. Aby uzyskać 1 l objętości końcowej do podłoża podstawowego (850 ml) dodawano 40 ml roztworu glukozy.

Roztwór L-tryptofanu 10 g/l przygotowano w 0,1 M fosforanie sodowym pH 7 i sterylizowano przez filtrację. Do hodowli dodawano zwykle jedną dziesiątą objętości, jak opisano dokładnie poniżej. Przygotowano również 10% roztwór pirogronianiu sodowego i wysterylizowano przez filtrację. Zwykle używano 10 ml na litr hodowli. Przygotowano roztwory podstawowe ampicyliny (100 mg/ml), kanamycyny (25 mg/ml) i IPTG (840 mM), wysterylizowano przez filtrację i przechowywano przed użyciem w temperaturze -20°C. Tween 20 (monolaurynian polioksyetyleno 20-sorbitanu) używano w końcowym stężeniu 0,2% (obj./obj.). Ampicylinę używano w stężeniach końcowych nie-letalnych, zazwyczaj 1-10 pg/ml.

PL 208 481 B1

E. coli BL21(DE3)::C. testosteroni proA/pET30 Xa/LIC (opisany w Przykładzie 4) posiewano na szalki z podłożem LB zawierającym 50 pg/ml kanamycyny. Pojedynczą kolonią szczepiono nocne hodowle (5 ml), które prowadzono w temperaturze 30°C w podłożu LB z kanamycyną. Zazwyczaj do indukcji w podłożu tr-1 + glukoza używano inokulum 1 do 50. Dodawano świeżo przygotowany antybiotyk do stężenia końcowego 50 mg/l. Do czasu indukcji prowadzono hodowle wytrząsane w temperaturze 37°C.

Co godzinę pobierano próbkę komórek aż uzyskano OD600 0,35-0,8. Wtedy komórki indukowano 0,1 mM IPTG, a temperaturę obniżono do 34°C. Pobierano próbki (1 ml) przed indukcją (punkt czasowy zero) i odwirowano przy 5000 x g. Supernatant zamrażono w temperaturze -20°C do analizy LC/MS. Cztery godziny po indukcji pobierano kolejną próbkę o objętości 1 ml i odwirowywano, aby oddzielić podłoże od osadu komórek. Tryptofan, pirogronian sodowy, ampicylinę i Tween dodawano, tak jak opisano powyżej.

Komórki hodowano przez 48 godzin po indukcji i pobierano kolejną próbkę o objętości 1 ml przetworzoną, tak jak opisano powyżej. Po 48 godzinach dodano kolejną porcję tryptofanu i pirogronianu. Po około 70 godzinach hodowli (po indukcji) odwirowano całą objętość przez 20 minut w temperaturze 4°C przy 3500 obrotów na minutę. Supernatant dekantowano i zamrażano, w temperaturze -80°C, zarówno podłoże jak i komórki. Próbki podłoża filtrowano i analizowano przez LC/MS. Monitorowano wysokości i powierzchnie szczytów [M + H]⁺ = 293, tak jak opisano w przykładzie 10. Odejmowano poziom tła dla samego podłoża. Dane normalizowano również na wzrost hodowli uwzględniając proporcję wysokości szczytu [M + H]⁺ = 293 do gęstości optycznej hodowli przy długości fali 600 nm.

Wyższe poziomy monatyny były wytwarzane, gdy pirogronian, ampicylinę i Tween dodawano 4 godziny po indukcji, a nie w momencie indukcji. Inne dodatki takie jak PLP, dodatkowy fosforan lub dodatkowy MgCl2 nie zwiększały produkcji monatyny. Wyższą wydajność monatyny uzyskiwano, gdy używano tryptofan zamiast indolo-3-pirogronianu i kiedy tryptofan dodawano po indukcji, a nie przy szczepieniu lub w momencie indukcji. Przed indukcją i 4 godziny po indukcji (w czasie dodawania substratu) zazwyczaj nie było wykrywalnego poziomu monatyny w brzeczce fermentacyjnej, ani w ekstraktach komórkowych. Jako negatywnych kontroli użyto komórek z samym wektorem pET30a lub kultur, do których nie dodano tryptofanu i pirogronianu. Rodzicielski skan MS wskazywał, że składnik o (m+1)/z = 293 nie pochodził z większych cząsteczek, a skany fragmentów (wykonane jak w Przykładzie 10) były bardzo podobne co dla monatyny wytworzonej in vitro.

Wpływ Tween 20 badano używając końcowych stężeń Tween-20 0,2% i 0,6% (obj./obj.). Najwyższą ilość monatyny w wytrząsanych kolbach uzyskano przy 0,2% Tween. Testowano stężenia ampicyliny od 0 do 10 pg/ml. Ilość monatyny w brzeczce komórkowej wzrastała znacznie (2,5 x) przy wzroście stężenia ampicyliny od 0 do 1 pg/ml i wzrastała 1,3 x przy wzroście stężenia ampicyliny od 1 do 10 pg/ml.

Typowe wyniki eksperymentu z krzywą czasową przedstawia Fig. 10. Ilość monatyny wydzielanej do brzeczki hodowlanej wzrastała nawet przy uwzględnieniu wzrastającej gęstości hodowli. Wykorzystując molowy współczynnik ekstynkcji dla tryptofanu, ilość monatyny w brzeczce oszacowano na poniżej 10 pg/ml. Ten sam eksperyment powtórzono z komórkami zawierającymi wektor bez wstawki proA. Uzyskano wiele wartości ujemnych, co wskazuje, że wysokość szczytu przy m/z = 293 była w tych hodowlach niższa niż w samym podłożu (Fig. 10). Wartości były zawsze niższe, gdy brak było tryptofanu i pirogronianu, co wskazuje, że wytwarzanie monatyny było wynikiem reakcji enzymatycznej katalizowanej przez aldolazę.

Produkcję monatyny w komórkach bakteryjnych in vivo powtórzono w wytrząsanych kolbach o pojemności 800 ml i w fermentorze. Przy użyciu chromatografii jonowymiennej i preparatywnej chromatografii odwrotnej fazy oczyszczono 250 ml próbkę monatyny (z podłoża po usunięciu komórek). Próbkę odparowano i poddano analizie masowej o wysokiej rozdzielczości (opisanej w Przykładzie 6). MS wysokiej rozdzielczości wykazał, że wytworzony metabolit to monatyna.

Oznaczenia in vitro wskazują, że poziom aminotransferazy powinien byc wyższy niż aldolazy (Przykład 6), dlatego aby zwiększyć ilość wytwarzanej monatyny prowadzono nadekspresję aminotransferazy asparaginianowej z E. coli wraz z genem aldolazy. Zaprojektowano startery, aby wprowadzić proA C. testosteroni do wspólnego operonu z aspC/pET30 Xa/LIC: starter 5': ACTCGGATCCGAAGGAGATATACATATGTACGAACTGGGACT (sekwencja o numerze identyfikacyjnym SEQ ID No. 67) i starter 3': CGGCTGTCGACCGTTAGTCAATATATTTCAGGC (sekwencja o numerze identyfikacyjnym SEQ ID No. 68). Starter 5' zawiera miejsce BamHI, a starter 3' zawiera miejsce SaII do klonowania. Reakcję PCR prowadzono tak jak opisano w Przykładzie 4 i oczyszczono produkt z żelu.

PL 208 481 B1

Konstrukt aspC/pET30 Xa/LIC, podobnie jak produkt PCR trawiono BamHI i SalI. Produkty trawienia oczyszczono używając Qiagen spin column. Produkt PCR proA ligowano z wektorem używając zestawu Roche rapid DNA Ligation (Indianapolis, IN) zgodnie z zaleceniami producenta. Chemiczną transformację przeprowadzono przy użyciu Novablues Singles (Novagen), tak jak opisano w Przykładzie 1. Kolonie hodowano na podłożu LB zawierającym 50 mg/l kanamycyny i oczyszczono DNA plazmidowe przy użyciu zestawu Qiagen spin miniprep. Klony selekcjonowano przez trawienie enzymami restrykcyjnymi i sekwencję potwierdzono w Seqwright (Houston, TX). Konstrukty subklonowano do BLR(DE3), BLR(DE3)LysS, BL21(DE3) i BL21(DE3)pLys (Novagen). Konstrukt proA/pET30Xa/LIC transformowano również do BL21(DE3)pLysS.

Wstępne porównania próbek z wytrząsanych kolb przy standardowych warunkach opisanych powyżej wykazały, że dodanie drugiego genu (aspC) siedmiokrotnie poprawiło ilość wytwarzanej monatyny. Aby przyspieszyć wzrost użyto szczepów gospodarza pochodzących z BL21(DE3). Klony proA i klony z dwugenowym operonem indukowano w podłożu Trp-1, jak wyżej, w przypadku gospodarzy z pLysS do podłoża dodano również chloramfenikol (34 mg/l). Doświadczenia z wytrząsanymi kolbami wykonywano z i bez dodatku 0,2% Tween-20 i 1 mg/l ampicyliny. Ilość monatyny w podłożu obliczano używając jako standardu oczyszczonej monatyny wytworzonej in vitro. Analizy SRM przeprowadzano, tak jak opisano w Przykładzie 10. Komórki pobierano w czasach 0, 4 godziny, 24 godziny, 48 godzin, 72 godziny i 96 godzin hodowli.

Wyniki w Tablicy 5 pokazują maksymalne ilości wyprodukowane w brzeczce hodowlanej. W większości wypadków konstrukt z dwoma genami dawał wyższe wartości niż konstrukt z samym proA. Szczepy pLysS, których osłony komórkowe są mniej szczelne, dawały większe ilości wydzielanej monatyny, pomimo, że szczepy te zazwyczaj rosną wolniej. Dodatek Tween i ampicyliny był korzystny.

T a b l i c a 5:

Ilość monatyny wytworzonej przez bakterie E. coli

Konstrukt	Gospodarz	Tween + Ampicylina	pg/ml monatyny	Czas
proA	BL21 (DE3)	-	0,41	72 godziny
proA	BL21 (DE3)	+	1,58	48 godzin
proA	BL21 (DE3) pLysS	-	1,04	48 godzin
proA	BL21 (DE3) pLysS	+	1,60	48 godzin
aspC:proA	BL21 (DE3)	-	0,09	48 godzin
aspC:proA	BL21 (DE3)	+	0,58	48 godzin
aspC:proA	BL21 (DE3) pLysS	-	1,39	48 godzin
aspC:proA	BL21 (DE3) pLysS	+	6,68	48 godzin

P r z y k ł a d 12

Wytwarzanie monatyny w drożdżach

Przykład ten opisuje metody stosowane do wytwarzania monatyny w komórkach eukariotycznych. Specjalista w tej dziedzinie będzie rozumiał, że podobne metody można wykorzystywać do wytwarzania monatyny w dowolnych odpowiednich komórkach. Ponadto, oprócz genów opisanych w tym przykładzie lub zamiast nich można wykorzystać inne geny (np. te wymienione na Fig. 2).

Do klonowania i ekspresji genów aspC E. coli i proA C. testosteroni w Saccharomyces cerevisiae stosowano pESC Yeast Epitope Tagging Vector System (Stratagene, La Jolla, CA). Wektory pESC zawierają dwa promotory, GAL1 i GAL10, na przeciwnych niciach, z dwoma odrębnymi miejscami wielokrotnego klonowania, co umożliwia ekspresję dwóch genów w tym samym czasie. Wektor pECS-His zawiera również gen His3 dla komplementacji auksotrofii histydynowej w gospodarzu (YPH500). Promotory GAL1 i GAL10 są hamowane przez glukozę i indukowane przez galaktozę, sekwencję Kozak stosuje się dla optymalnej ekspresji w drożdżach. Plazmidy pESC są wektorami wahadłowymi, umożliwiającymi wytwarzanie początkowego konstruktu w E. coli (z genem bla dla selekcji). Jednakże, w miejscach wielokrotnego klonowania, nie ma żadnych miejsc wiążących rybosomy bakteryjne.

PL 208 481 B1

Do klonowania w pESC-His zaprojektowano następujące startery (miejsca restrykcyjne podkreślono, sekwencję Kozak podano pogrubioną czcionką): aspC (BamHI/SalI), GAL1:

5'-CGCGGATCCATAATGGTTGAGAACATTACCG-3' (sekwencja o numerze identyfikacyjnym SEQ ID No. 69) i

5'-ACGCGTCGACTTACAGCACTGCCACAATCG-3' (sekwencja o numerze identyfikacyjnym SEQ ID No. 70).

proA (EcoRI/Notl), GAL10:

5'-CCGGAATTCATAATGGTCGAACTGGGAGTTGT-3' (sekwencja o numerze identyfikacyjnym SEQ ID No. 71) i

5'-GAATGCGGCCGCTTAGTCAATATATTTCAGGCC-3' (sekwencja o numerze identyfikacyjnym SEQ ID No. 72).

Drugi kodon dla obu dojrzałych białek został zmieniony z aminokwasu aromatycznego na walinę ze względu na wprowadzenie sekwencji Kozak. Wybrane geny zamplifikowano wykorzystując, jako matrycę, miniizolację DNA pET 30 XA/LIC z klonów opisanych w Przykładzie 1 i Przykładzie 4. Reakcję PCR przeprowadzono w termocyklerze gradientowym Eppendorf Master cycler w objętości 50 ąl i z następującym protokołem: 1,0 ąl matrycy, 1,0 ąM każdego startera, 0,4 mM każdego dNTP, 3,5 jednostki polimerazy Expand High Fidelity Polymerase (Roche, Indianapolis, IN) i 1 x bufor Expand^TM z Mg. Wykorzystany program termocyklera składał się z „gorącego startu w temperaturze 94°C przez 5 minut, a po nim 29 powtórzeń następujących etapów: temperatura 94°C przez 30 sekund, temperatura 50°C przez 1 minutę i 45 sekund i temperatura 72°C przez 2 minuty i 15 sekund. Po 29 powtórzeniach próbkę utrzymywano w temperaturze 72°C przez 10 minut, a następnie przechowywano w temperaturze 4°C. Produkty reakcji PCR oczyszczano przez rozdział w 1% żelu TAE-agaroza, a następnie odzyskiwano przy użyciu zestawu QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Valencia, CA).

DNA wektora pESC-His (2,7 ąg) trawiono BamHI/SalI i oczyszczano z żelu, jak opisano wyżej. Produkt PCR genu aspC trawiono BamHI/SaII i oczyszczano przy użyciu QIAquick PCR Purification Column. Ligacje prowadzono przy użyciu zestawu Roche Rapid DNA Ligation Kit według zaleceń producenta. Odsolone produkty ligacji poddawano elektroporacji do 40 ąl kompetentnych komórek Electromax DH10B (Invitrogen) w 0,2 cm jednorazowej kuwecie Biorad przy użyciu Biorad gene Pulser II z kontrolerem impulsu, zgodnie z zaleceniami producenta.

Po godzinnej rewitalizacji komórek w 1 ml podłoża SOC, transformanty wysiewano na podłoże LB zawierające 100 ąg/ml ampicyliny. Izolacje plazmidowego DNA klonów wykonywano przy użyciu zestawów QIAprep Spin Miniprep Kit. DNA plazmidowe przeszukiwano przez trawienia enzymami restrykcyjnymi i sekwencjonowano (Seqwright) dla potwierdzenia, używając starterów zaprojektowanych dla wektora.

Klon aspC/pESC-His trawiono EcoRI i Notl, podobnie jak produkt PCR genu proA. DNA oczyszczano i ligowano, jak opisano wyżej. Dwugenowy konstrukt transformowano do komórek DH10B i selekcjonowano za pomocą trawienia enzymami restrykcyjnymi i sekwencjonowania DNA.

Konstrukt transformowano do szczepu S. cerevisiae YPH500 przy użyciu zestawu S.c. EasyComp^TM Transformation Kit (Invitrogen). Mieszaniny transformacyjne wysiewano na podłoże minimalne SC-His (instrukcja Invitrogen dla pYES2) zawierające 2% glukozę. Pojedyncze kolonie drożdży sprawdzano na obecność genów proA i aspC za pomocą kolonijnego PCR, wykorzystując startery opisane powyżej. Odwirowane komórki (2 ąl) zawieszano w 20 ąl buforu Y-Lysis Buffer (Zymo Research), zawierającego 1 ąl zymolazy i ogrzewano przez 10 minut w temperaturze 37°C. 4 ąl tej zawiesiny wykorzystywano następnie w 50 ąl reakcji PCR przy użyciu, opisanych powyżej, mieszaniny reakcyjnej i programu.

ml hodowle prowadzono przez noc na podłożu SC-His z glukozą w temperaturze 30°C przy 225 obrotach na minutę. Komórki stopniowo przyzwyczajano do wzrostu na rafinozie, aby zminimalizować okres fazy lag przed indukcją za pomocą galaktozy. Po około 12 godzinach hodowli mierzono absorbancję przy długości fali 600 nm i odwirowano odpowiednią ilość komórek by zapewnić OD 0,4 w nowym podłożu SC-His. Kolejno używano następujących źródeł węgla: 1% rafinoza + 1% glukoza, 0,5% glukoza + 1,5% rafinoza, 2% rafinoza i w końcu 1% rafinoza + 2% galaktoza do indukcji.

Po około 16 godzinach hodowli w podłożu indukcyjnym, 50-ml hodowle dzielono na dwie części, po 25 ml każda, i do jednej z nich dodawano następujące składniki (stężenia końcowe): 1 g/l tryptofanu, 5 mM fosforan sodowy pH 7,1, 1 g/l pirogronianu sodowego, 1 mM MgCl2. Jako negatywne kontrole zebrano próbki brzeczki i osadu komórek z podłoża nieindukcyjnego i z 16-godzinnych hodowli przed dodaniem substratów dla szlaku syntezy monatyny. Poza tym jako dodatkową kontrolę nega44

PL 208 481 B1 tywną użyto konstruktów zawierających jedynie funkcjonalny gen aspC (i skrócony gen proA). Komórki hodowano do 69 godzin po indukcji. Czasami komórki drożdży indukowano przy niższym OD i hodowano zaledwie 4 godziny przed dodaniem tryptofanu i pirogronianu. Jednakże, te substraty do syntezy monatyny wydają się hamować wzrost i ich dodanie przy wyższym OD było bardziej efektywne.

Osad komórek z hodowli lizowano 5 ml YeastBuster^TM + 50 gl THP (Novagen) na gram (mokrej masy) komórek według protokołu producenta dodając inhibitorów proteaz i nukleazy benzonazy, tak jak opisano w poprzednich przykładach. Brzeczkę hodowlaną i ekstrakty komórkowe filtrowano i analizowano za pomocą SRM, tak jak opisano w Przykładzie 10. Przy użyciu tej metody nie wykryto monatyny w próbkach brzeczki, co wskazywało, że w tych warunkach komórki nie wydzielają monatyny. Pompa protonowa może w tych warunkach być niewystarczająca lub ogólny system transportu aminokwasów może być nasycony przez tryptofan. Ekspresja białka była poniżej poziomu, przy którym można wykryć zmiany za pomocą SDS-PAGE.

Gdy do podłoża dodano tryptofanu i pirogronianu monatynę wykrywano przejściowo (około 60 gg/ml) w ekstraktach komórkowych hodowli z dwoma funkcjonalnymi genami. Monatyny nie wykrywano w żadnym ekstrakcie komórkowym pochodzącym z kontroli negatywnych. Oznaczenia monatyny in vitro przeprowadzano w dwóch powtórzeniach przy 4,4 mg/ml całkowitego białka (około dwukrotnie więcej niż ilość zwykle używana w przypadku ekstraktów komórkowych z E. coli) wykorzystując zoptymalizowane oznaczenie opisane w Przykładzie 6. Inne oznaczenia przeprowadzano z dodatkiem 32 gg/ml aldolazy ProA C. testosteroni lub 400 gg/ml aminotransferazy AspC, aby ustalić który z enzymów jest ograniczający w ekstraktach komórkowych. Kontrole negatywne prowadzono bez dodawania enzymu lub dodając jedynie aminotransferazę AspC (do pewnego stopnia kondensacja aldolowa może zachodzić bez enzymu). Kontrole pozytywne prowadzono z częściowo oczyszczonymi enzymami (30-40%) używając 16 gg/ml aldolazy i 400 gg/ml aminotransferazy.

Wyniki uzyskane in vitro analizowano w SRM. Analiza ekstraktów komórkowych wykazała, że tryptofan był efektywnie transportowany do komórek, gdy dodano go do podłoża po indukcji, dzięki czemu jego poziom był o dwa rzędy wielkości wyższy niż tam gdzie nie dawano dodatkowo tryptofanu. Wyniki analizy monatyny uzyskanej in vitro przedstawia Tablica 6 (liczby oznaczają ng/ml).

T a b l i c a 6:

Wytwarzanie monatyny w ekstraktach komórkowych drożdży

	konstrukt aspC	+ aldolaza	+ AspC	konstrukt dwugenowy	+ aldolaza	+ AspC
represja (podłoże z glukozą)	0	888,3	173,5	0	465,2	829
indukcja 24 godziny	0	2832,8	642,4	0	1375,6	9146,6
indukcja 69 godzin	0	4937,3	340,3	71,9	1652,8	23693,5
indukcja 69 godzin + substrat	0	556,9	659,1	21,9	755,6	16688,2
kontrola + oczyszczony enzym)	21853			21853
kontrola - (brak enzymu)	0		254,3	0		254,3

Pozytywne wyniki uzyskano dla ekstraktów komórkowych z pełnym dwugenowym konstruktem z substratem dodanym do podłoża i bez. Wyniki te, porównane z kontrolami pozytywnymi, wskazują, że enzymy ulegały ekspresji w drożdżach na poziomie zbliżonym do 1% całkowitego białka. Ilość monatyny wytwarzanej, gdy oznaczano ekstrakt komórkowy z konstruktu aspC (ze skróconym proA) z dodatkiem aldolazy była znacznie wyższa, niż gdy oznaczenia prowadzono dla samego ekstraktu i wskazywała, że rekombinowana aminotransferaza AspC stanowi około 1-2% całkowitego białka drożdży. Ekstrakty komórkowe nieindukowanych hodowli oznaczane z dodatkiem aldolazy wykazywały niską aktywność ze względu na obecność w komórkach natywnych aminotransferaz. Aktywność dla ekstraktów z nieindukowanych hodowli, mierzona w obecności aminotransferazy AspC, wzrastała do poziomu monatyny produkowanej przez negatywną kontrolę z AspC (około 200 ng/ml). Inaczej jest w przypadku ekstraktów komórkowych z konstruktów dwugenowych, gdzie aktywność rośnie bardziej po dodaniu aminotransferazy niż po dodaniu aldolazy. Ponieważ oba geny powinny ulegać ekspresji

PL 208 481 B1 na tym samym poziomie, wskazuje to, że ilość produkowanej monatyny jest wyższa, gdy poziom aminotransferazy jest wyższy niż aldolazy, zgodnie z wynikami przedstawionymi w Przykładzie 6.

Dodanie pirogronianu i tryptofanu nie tylko hamuje wzrost komórek ale najwyraźniej hamuje również ekspresję białka. Dodanie plazmidu pESC-Trp można wykorzystać do usunięcia auksotrofii dla tryptofanu komórek gospodarza YPH500, zapewniając sposób na dostarczanie tryptofanu przy mniejszym wpływie na wzrost, ekspresję i sekrecję.

P r z y k ł a d 13

Poprawa procesów enzymatycznych za pomocą reakcji sprzężonych

W teorii, jeśli nie występują reakcje poboczne ani degradacja substratów lub półproduktów, to maksymalna ilość wytworzonego produktu z reakcji enzymatycznej przedstawionej na Fig. 1 jest wprost proporcjonalna do stałych równowagi każdej reakcji oraz stężeń tryptofanu i pirogronianu. Tryptofan nie jest substratem dobrze rozpuszczalnym, a stężenia pirogronianu przekraczające 200 nM wydają się mieć negatywny wpływ na wydajność (Przykład 6).

Ideałem jest maksymalizacja stężenia monatyny wobec substratów, umożliwiająca obniżenie kosztów rozdziału. Można prowadzić fizyczny rozdział tak, że monatynę usuwa się z mieszaniny reakcyjnej, zapobiegając przed reakcją przebiegającą w kierunku przeciwnym. Następnie, można regenerować surowce i katalizatory. Ze względu na podobieństwo monatyny do kilku odczynników i półproduktów pod wględem wielkości, ładunku i hydrofobowości, fizyczny rozdział byłby trudny, chyba, że znaleziono by wysoko specyficzne oddziaływania z monatyną (np. do techniki chromatografii powinowactwa). Jednakże reakcje syntezy monatyny mogą zostać sprzężone z innymi reakcjami, tak że równowaga układu przesunie się w kierunku wytwarzania monatyny. Poniżej podane są przykłady procesów poprawiających wydajność otrzymywania monatyny z tryptofanu lub indolo-3-pirogronianu.

Reakcje sprzężone z wykorzystaniem dekarboksylazy szczawiooctanowej (EC 4.1.1.3)

Fig. 11 ilustruje tę reakcję. Wykorzystuje się oksydazę tryptofanową i katalazę, aby przesunąć równowagę w stronę wytwarzania indolo-3-pirogronianu. Katalazy używa się w nadmiarze, żeby nie pozostawał nadtlenek wodoru zdolny do reakcji w odwrotnym kierunku lub do uszkodzenia enzymów bądź półproduktów. Podczas reakcji katalazy regenerowany jest tlen. Alternatywnie jako substrat można stosować indolo-3-pirogronian.

Jako donor grupy aminowej do aminacji MP stosuje się asparaginian i wykorzystuje się aminotransferazę asparaginianową. W idealnym układzie, używa się aminotransferaz, które mają niską specyficzność dla reakcji tryptofan/indolo-3-pirogronian w porównaniu do reakcji MP do monatyny, tak że asparaginian nie jest wykorzystywany do ponownej aminacji indolo-3-pirogronianu. W celu przekształcenia szczawiooctanu do pirogronianu i dwutlenku węgla można dodać dekarboksylazy szczawiooctanowej (z Pseudomonas sp.). Ponieważ CO2 jest lotny, nie jest dostępny do reakcji z enzymami, zmniejszając lub nawet eliminując reakcję przeciwną. Pirogronian wyprodukowany w tym etapie można również wykorzystywać w reakcji kondensacji aldolowej. Można stosować inne dekarboksylazy, a wiadomo, że ich homologi występują w Actinobacillus actinomycetemcomitans, Aquifex aeolicus, Archaeoglobus fulgidus, Azotobacter vinelandii, Bacteroides fragilis, kilku gatunkach Bordetella, Campylobacter jejuni, Chlorobium tepidum, Chloroflexus aurantiacus, Enterococcus faecalis, Fusobacterium nucleatum, Klebsiella pneumoniae, Legionella pneumophila, Magnetococcus MC-1, Mannheimia haemolytica, Methylobacillus flagellatus KT, Pasteurella multocida PM70, Petrotoga miotherma, Porphyromonas gingivalis, kilku gatunkach Pseudomonas, kilku gatunkach Streptococcus, Thermochromatium tepidum, Thermotoga maritima, Treponema pallidum i kilku gatunkach Vibrio.

Oznaczenia aminotransferazy tryptofanowej przeprowadzono z aminotransferazą asparaginianową (AspC) z E. coli, aminotransferazą tyrozynową (TyrB) z E. coli, aminotransferazą o szerokim spektrum substratowym (BSAT) z L. major i dwoma świńskimi aminotransferazami glutaminianoszczawiooctowymi dostępnymi komercyjnie, tak jak opisano w Przykładzie 1. Jako akceptor grupy aminowej testowano zarówno szczawiooctan jak i alfa-ketoglutaran. Porównywano stosunki aktywności dla monatyny (Przykład 7) z aktywnością dla tryptofanu, aby ustalić, który z enzymów ma najwyższą specyficzność dla reakcji aminotransferazy monatyny. Wyniki te wskazują, że enzymem o najwyższej specyficzności dla reakcji monatyny w porównaniu z reakcją z tryptofanem jest aminotransferaza glutaminiano-szczawiooctowa typu II-A ze świni, GOAT (Sigma G7005). Specyficzność ta nie zależała od użytego akceptora grupy aminowej. Dlatego też ten enzym został użyty do reakcji sprzężonych z dekarboksylazą szczawiooctanową.

Typowa reakcja rozpoczynająca się od indolo-3-pirogronianu obejmowała (stężenia końcowe) 50 mM Tris-Cl pH 7,3, 6 mM indolo-3-pirogronian, 6 mM pirogronian sodowy, 6 mM asparaginian,

PL 208 481 B1

0,05 mM PLP, 3 mM fosforan potasowy, 3 mM MgCl2, 25 pg/ml aminotransferazy, 50 pg/ml aldolazy ProA C. testosteroni i 3 jednostki/ml dekarboksylazy (Sigma 04878). Reakcje prowadzono w temperaturze 26°C przez 1 godzinę. W niektórych przypadkach, nie dodawano dekarboksylazy lub zamiast asparaginianu dodawano alfa-ketoglutaranu (takie reakcje służyły jako negatywne kontrole). Opisane powyżej aminotransferazy były również testowane w miejsce GOAT, aby potwierdzić wcześniejsze eksperymenty dotyczące specyficzności. Próbki filtrowano i analizowano za pomocą LC/MS, tak jak opisano w Przykładzie 10. Wyniki pokazują, że GOAT wytwarzała największe ilości monatyny na mg białka, przy najniższych ilościach tryptofanu powstającego jako produkt uboczny. Ponadto uzyskiwano 2-3 krotny przyrost po dodaniu dekarboksylazy. Enzym AspC z E. coli również wytwarzał duże ilości monatyny w porównaniu z innymi aminotransferazami.

Produkcję monatyny zwiększano przez: 1) okresowe dodawanie 2 mM dodatków indolo-pirogronianu, pirogronianu i asparaginianu (co pół godziny do godziny), 2) prowadzenie reakcji w środowisku beztlenowym lub z odgazowanymi buforami, 3) wydłużenie reakcji przez noc, oraz 4) używanie świeżo przygotowanej dekarboksylazy, która nie była wielokrotnie rozmrażana-zamrażana. Dekarboksylazę hamowały stężenia pirogronianu wyższe od 12 mM. Przy stężeniach indolo-3-pirogronianu wyższych niż 4 mM przyspieszały się reakcje uboczne z indolo-3-pirogronianem. Ilość indolo-3-pirogronianu wykorzystaną w reakcji można zwiększyć, jeśli zwiększy się również ilość aldolazy. Stwierdzono, że wysoki poziom fosforanu (50 mM) i asparaginianu (50 mM) hamuje dekarboksylazę. Ilość dodanej dekarboksylazy można było zmniejszyć do 0,5 jednostki/ml bez zmniejszenia produkcji monatyny w 1-godzinnej reakcji. Ilość wytwarzanej monatyny wzrosła, gdy temperaturę podniesiono z 26°C do 30°C i z 30°C do 37°C, jednakże w temperaturze 37°C przyspieszone zostały również uboczne reakcje indolo-3-pirogronianu. Ilość powstającej monatyny wzrastała wraz ze wzrostem pH od 7 do 7,3 i była stosunkowo stabilna w pH od 7,3 do 8,3.

Typowa reakcja rozpoczynająca się od tryptofanu zawierała (stężenia końcowe) 50 mM Tris-Cl pH 7,3, 20 mM tryptofan, 6 mM asparaginian, 6 mM pirogronian sodowy, 0,05 mM PLP, 3 mM fosforan potasowy, 3 mM MgCl2, 25 pg/ml aminotransferazy, 50 pg/ml aldolazy ProA C. testosteroni, 4 jednostki/ml dekarboksylazy, 5-200 mili jednostek/ml oksydazy L-aminokwasowej (Sigma A-2805), 168 jednostek/ml katalazy (Sigma C-3515) i 0,008 mg FAD. Reakcje przeprowadzano przez 30 minut w temperaturze 30°C. Przy dodaniu dekarboksylazy obserwowano poprawę. Największa ilość monatyny powstawała, gdy użyto 50 milijednostek/ml oksydazy. Poprawa była podobna do obserwowanej, gdy jako substrat używano indolo-3-pirogronian. Ponadto, ilość powstającej monatyny wzrastała, gdy 1) poziom tryptofanu był niski (tj. poniżej Km enzymu aminotransferazy a przez to poniżej stężenia, przy którym współzawodniczyłby z MP o miejsce aktywne) i 2) stosunek oksydazy do aldolazy i aminotransferazy utrzymywano na niskim poziomie, tak że nie gromadził się indolo-3-pirogronian.

Niezależnie od tego czy reakcję rozpoczynano od indolo-3-pirogronianu czy od tryptofanu, ilość monatyny wytwarzanej w oznaczeniach przy czasie inkubacji 1-2 godzin rosła, gdy używano 2-4 razy więcej wszystkich enzymów, przy utrzymaniu tych samych proporcji. Przy użyciu obu substratów uzyskiwano stężenie monatyny około 1 mg/ml. Ilość powstałego tryptofanu, gdy rozpoczynano od indolo-3-pirogronianu była zazwyczaj poniżej 20% ilości produktu, co pokazuje korzyść wynikającą z zastosowania reakcji sprzężonych. Przy dalszej optymalizacji i kontroli stężeń półproduktów i reakcji ubocznych można znacznie zwiększyć produktywność i wydajność.

Reakcje sprzężone wykorzystujące aminotransferazę epsilon lizynową (EC 2.6.1.36)

Aminotransferazę epsilon lizynową (L-lizyno 6-transaminazę) znaleziono w kilku organizmach, w tym u Rhodococcus, Mycobacterium, Streptococcus, Nocardia, Flavobacterium, Candida utilis i Streptomyces. Organizmy wykorzystują ją w pierwszym etapie syntezy pewnych antybiotyków beta-laktamowych (Rius i Demain, J. Microbiol. Biotech., 7: 95-100, 1997). Enzym ten przekształca lizynę do 6-semialdehydu L-2-aminoadypinianowego (allizyny) przez transaminację C-6 lizyny z udziałem PLP wykorzystując alfa-ketoglutaran jako akceptor grupy aminowej. Allizyna jest nietrwała i spontanicznie ulega dehydratacji wewnątrzcząsteczkowej prowadzącej do 1-piperydyno-6-karboksylanu, cząsteczki cyklicznej. To skutecznie hamuje jakiekolwiek reakcje odwrotne. Schemat reakcji przedstawia Fig. 12. Można również wykorzystywać alternatywny enzym, 6-transaminazę lizyno-pirogronianową (EC 2.6.1.71).

Typowa reakcja obejmowała w 1 ml: 50 mM Tris-HCl pH 7,3, 20 mM indolo-3-pirogronian, 0,05 mM PLP, 6 mM fosforan potasowy pH 8, 2-50 mM pirogronian sodowy, 1,5 mM MgCl2, 50 mM lizynę, 100 pg aminotransferazy (aminotransferazy epsilon lizynowej LAT-101, BioCatalytics Pasadena, CA) i 200 pg aldolazy ProA C. testosteroni. Ilość wytwarzanej monatyny rosła ze wzrostem stężenia pirogronianu. Maksymalna

PL 208 481 B1 ilość w tych warunkach reakcji (przy 50 mM pirogronianie) była 10-krotnie wyższa niż ta obserwowana przy sprzężonych reakcjach wykorzystujących dekarboksylazę szczawiooctanową (około 0,1 mg/ml).

Szczyt o [M + H]⁺ = 293 eluował w czasie przewidywanym dla monatyny i spektrum masowe zawierało kilka z fragmentów obserwowanych w innych procesach enzymatycznych. Nieco wcześniej niż obserwowany czas elucji S,S monatyny wytwarzanej w Przykładzie 6 eluował drugi szczyt o spodziewanym stosunku masy do ładunku (293), co może wskazywać na obecność innego izomeru monatyny. Ten enzym wytwarzał bardzo mało tryptofanu. Jednakże, najprawdopodobniej wykazuje on pewną aktywność wobec pirogronianu (tworząc alaninę jako produkt uboczny). Wiadomo również, że enzym jest nietrwały. Można dokonać ulepszeń wykorzystując doświadczenia z ukierunkowaną ewolucją, aby poprawić stabilność, zmniejszyć aktywność wobec pirogronianu i zwiększyć aktywność wobec MP. Reakcje te można również sprzęgać z oksydazą L-aminokwasową/katalazą, jak opisano powyżej.

Inne reakcje sprzężone

Inną reakcję sprzężoną, która może poprawić wydajność uzyskiwania monatyny z tryptofanu lub indolo-pirogronianu przedstawiono na Fig. 13. Dehydrogenaza mrówczanowa (EC 1.2.1.2 lub 1.2.1.43) jest powszechnie występującym enzymem. Niektóre dehydrogenazy mrówczanowe wymagają NADH, podczas gdy inne mogą wykorzystywać NADPH. Dehydrogenaza glutaminianowa katalizowała przemianę pomiędzy prekursorem monatyny a monatyną w poprzednich przykładach, przy wykorzystaniu buforów opartych na grupach amonowych. Obecność mrówczanu amonowego i dehydrogenazy mrówczanowej stanowi efektywny system regeneracji kofaktorów a wytwarzanie dwutlenku węgla jest efektywnym sposobem zmniejszania prędkości reakcji przeciwnej (Bommarius i in., Biocatalysis 10: 37, 1994 i Galkin i in. Appl. Environ. Microbiol. 63: 4651-6, 1997). W dodatku, w buforze reakcyjnym można rozpuścić duże ilości mrówczanu amonowego. Wydajność wytwarzania monatyny przez reakcje dehydrogenazy glutaminianowej (lub podobne aminacje redukujące) można poprawiać przez dodanie dehydrogenazy mrówczanowej i mrówczanu amonowego.

Inne sposoby można wykorzystać do zmiany równowagi w kierunku wytwarzania monatyny. Na przykład, gdy jako donor aminokwasu w konwersji MP do monatyny aminotransferazą omegaaminokwasową (EC 2.6.1.18) wykorzystuje się aminopropan, tak jak opisano w US 5 360 724 i US 5 300 437, jednym z powstających produktów jest aceton, produkt bardziej lotny niż substrat, aminopropan. Okresowo można podnosić temperaturę na krótki czas aby usunąć aceton i polepszyć równowagę. Temperatura wrzenia acetonu, 47°C, użyta krótko prawdopodobnie nie zniszczy półproduktów. Większość aminotransferaz, które wykazują aktywność wobec alfa-ketoglutaranu, wykazują również aktywność wobec prekursora monatyny. Podobnie, gdy wykorzystuje się aminotransferazy glioksylan/kwas aromatyczny (EC 2.6.1.60) z glicyną, jako donorem grup aminowych, powstaje glioksylan, który jest stosunkowo nietrwały i ma znacznie obniżony punkt wrzenia w stosunku do glicyny.

P r z y k ł a d 14

Ekspresja rekombinacyjna

Dzięki powszechnie dostępnym sekwencjom cDNA i aminokwasowym enzymów oraz enzymom i sekwencjom ujawnionym w opisie, takim jak sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 11 i 12, jak również ich wariantom, mutantom, fragmentom i fuzjom, możliwa staje się ekspresja i oczyszczanie dowolnego białka, takiego jak enzym przy zastosowaniu standardowych technik laboratoryjnych. Specjalista w tej dziedzinie będzie rozumiał, że enzymy i ich fragmenty można wytwarzać w formie rekombinowanej w dowolnym rodzaju komórek czy organizmie i, że można je oczyszczać przed użyciem, np. przed wytwarzaniem sekwencji o numerze identyfikacyjnym SEQ ID No. 12 i jej pochodnych.

Metody wytwarzania białek rekombinowanych są dobrze znane specjalistom w tej dziedzinie. Dlatego też zakres wynalazku obejmuje ekspresję dowolnego białka lub jego fragmentu, takiego jak enzym, w formie rekombinowanej. Na przykład, US 5 342 764 Johnsona i in., US 5 846 819 Pauscha i in., US 5 876 969 Fleer i in. oraz Sambrook i in. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, 1989, rozdział 17).

W skrócie, część, całość lub wariant sekwencji cDNA, które kodują białko lub peptyd można zligować z wektorem ekspresyjnym, takim jak bakteryjny lub eukariotyczny wektor ekspresyjny. Białka i/lub peptydy można wytwarzać umieszczając przed sekwencją cDNA promotor. Przykłady promotorów obejmują, ale nie ograniczają się do promotorów lac, trp, tac, trc, głównych regionów operatorowych i promotorowych faga lambda, regionu kontrolujący białko płaszcza fd, promotorów wczesnego i późnego SV40, promotorów pochodzących z wirusa polyoma, adenowirusa, retrowirusa, bakulowiru48

PL 208 481 B1 sa i wirusa małpiego, promotora kinazy 3-fosfoglicerynowej, promotorów drożdżowej kwaśnej fosfatazy, promotora drożdżowego czynnika rozrodczego alfa i ich kombinacji.

Wektory odpowiednie do wytwarzania nienaruszonych natywnych białek obejmują pKC30 (Shimitake i Rosenberg, 1981, Nature 292: 128), pKKl77-3 (Amann i Brosius, 1985, Gene 40: 183) i pET-3 (Studier i Moffatt, 1986, J. Mol. Biol. 189: 113). Sekwencję DNA można przenieść do innego wektora do klonowania, takiego jak inne plazmidy, bakteriofagi, kosmidy, wirusy zwierzęce i sztuczne chromosomy drożdży (YAC) (Burke i in., 1987, Science 236: 806-12). Wektory te można wprowadzać do różnych gospodarzy, w tym komórek somatycznych i do prostych lub złożonych organizmów, takich jak bakterie, grzyby (Timberlake i Marshall, 1989, Science 244:1313-7), bezkręgowce, rośliny (Gasser i Fraley, 1989, Science 244:1293) i ssaki (Pursel i in., 1989, Science 244: 1281-8), które stają się transgeniczne przez wprowadzenie heterologicznego cDNA.

Aby uzyskać ekspresję w komórkach ssaczych, sekwencję cDNA można zligować z heterologicznymi promotorami, takimi jak promotor małpiego wirusa SV40 w wektorze pSV2 (Mulligan i Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2072-6) i wprowadzać do komórek takich jak małpie komórki COS-1 (Gluzman, 1981, Cell 23: 175-82), aby uzyskać ekspresję przejściową lub stałą. Stabilną integrację konstruktu z genem chimerycznym można utrzymać w komórkach ssaczych poprzez selekcję biochemiczną, np. za pomocą neomycyny (Southern i Berg, 1982, J. Mol. Appl. Genet. 1: 327-41) i kwasu mykofenolowego (Mulligan i Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2072-6).

Przeniesienie DNA do komórek euariotycznych, takich jak ludzkie lub inne ssacze, jest konwecjonalną techniką. Wektory wprowadza się do komórek biorcy jako czyste DNA (transfekcja) na przykład poprzez precypitację fosforanem wapnia (Graham i vander Eb, 1973, Virology 52: 466), fosforanem strontu (Brash i in., 1987, Mol. Cell. Biol. 7: 2013), elektroporację (Neumann i in., 1982, EMBO J. 1: 841), lipofekcję (Felgner i in., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413), traktowanie DEAE dekstranem (McCuthan i in., 1968, J. Natl. Cancer Inst. 41: 351), mikroiniekcję (Mueller i in., 1978, Cell 15: 579), fuzję protoplastów (Schafner, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 11: 2163-7) lub pistolet genowy (Klein i in., 1987, Nature 327: 70). Alternatywnie cDNA można wprowadzać za pomocą infekcji wektorami wirusowymi, na przykład retrowirusami (Bernstein i in., 1985, Gen. Engrg. 7:235), adenowirusami (Ahmad i in., 1986, J. Virol. 57: 267) lub herpeswirusami (Spaete i in., 1982, Cell 30: 295).

Ze względu na wiele możliwych rozwiązań, w których można zastosować nasz wynalazek, należy stwierdzić, że przedstawione rozwiązania stanowią jedynie szczególne przykłady wynalazku i nie należy ich uważać jako ograniczające zakres wynalazku.

Claims (9)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób wytwarzania monatyny, znamienny tym, że obejmuje zetknięcie indolo-3-pirogronianu z aldolazą, co ułatwia przekształcenie indolo-3-pirogronianu lub jego soli i C3 źródła węgla w kwas 2-hydroksy-2-(indol-3-ilometylo)-4-ketoglutarowy lub jego sól, przy czym aldolaza jest wybrana spośród glioksylano-liazy 4-hydroksy-2-oksoglutaranu (EC 4.1.3.16) lub pirogroniano-liazy 4-hydroksy4-metylo-2-oksoglutaranu (EC 4.1.3.17) i zetknięcie kwasu 2-hydroksy-2-(indol-3-ilometylo)-4 -ketoglutarowego lub jego soli z aminotransferazą, co ułatwia przekształcenie kwasu 2-hydroksy-2-(indol-3-ilometylo)-4-ketoglutarowego lub jego soli w monatynę lub jej sól, przy czym aminotransferaza jest wybrana spośród aminotransferazy tryptofanowej (EC 2.6.1.27), aminotransferazy tyrozynowej (aromatycznej) (EC 2.6.1.5), dehydrogenazy tryptofanowej (EC 1.4.1.19), aminotransferazy asparaginianowej (EC 2.6.1.1), dehydrogenazy glutaminianowej (EC 1.4.1.2-4), dehydrogenazy fenyloalaninowej (EC 1.4.1.20), dehydrogenazy D-aminokwasowej (EC 1.4.99.1), aminotransferazy D-aminokwasowej (D-alaninowej) (EC 2.6.1.21), aminotransferazy D-metionino-pirogronianowej (EC 2.6.1.41), i ich kombinacji do wytworzenia monatyny lub jej soli.

   PL 208 481 B1
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że aminotransferaza zawiera:

   sekwencję aminokwasową przedstawioną w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 32, numer dostępu w Genbank: NP_388848.1, numer dostępu w Genbank: ZP00005082.1 lub numer dostępu w Genbank: A7AC74014.1;

   sekwencję aminokwasową wykazującą co najmniej 90% identyczność sekwencji z sekwencją przedstawioną w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 32, numer dostępu w Genbank: NP_388848.1, numer dostępu w Genbank: ZP00005082.1 lub numer dostępu w Genbank: AAC74014.1 lub sekwencje aminokwasowe, które różnią się od sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 32, numer dostępu w Genbank: NP_388848.1, numer dostępu w Genbank: ZP00005082.1 lub numer dostępu w Genbank: AAC74014.1 o mniej niż 50 konserwatywnych podstawień aminokwasowych, przy czym sekwencja aminokwasowa przekształca tryptofan w indolo-3-pirogronian.
3. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że C3 źródło węgla wybiera się z grupy składającej się z pirogronianu, fosfoenolopirogronianu, alaniny, seryny, cysteiny lub ich kombinacji.
4. 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że C3 źródło węgla stanowi pirogronian i pirogronian wytwarza się przez:

   alaninę i polipeptyd zdolny do transaminacji alaniny; serynę i polipeptyd zdolny do beta-eliminacji seryny; cysteinę i polipeptyd zdolny do beta-eliminacji cysteiny;

   asparaginian i polipeptyd zdolny do reakcji beta-liazy z aminokwasem dikarboksylowym;

   mleczan i oksydazę mleczanową (EC 1.1.3.-) lub dehydrogenazę mleczanową (EC 1.1.1.27, 1.1.1.28, 1.1.2.3) lub ich kombinacje.
5. 5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że aldolaza zawiera sekwencję aminokwasową wybraną spośród:

   sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 66, numer dostępu w Genbank: CAC46344, numer dostępu w Genbank: CAB14127.1, numer dostępu w Genbank: AAC74920.1, lub numer dostępu w Genbank: CAC47463.1;

   sekwencji aminokwasowej wykazującej co najmniej 90% identyczność sekwencji z sekwencją o numerze identyfikacyjnym:: 66, numer dostępu w Genbank: CAC46344, numer dostępu w Genbank: CAB14127.1, numer dostępu w Genbank: AAC74920.1 lub numer dostępu w Genbank: CAC47463.1 lub sekwencji aminokwasowej, która różni się od sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 66, numer dostępu w Genbank: CAC46344, numer dostępu w Genbank: CAB14127.1, numer dostępu w Genbank: AAC74920.1 lub numer dostępu w Genbank: CAC47463.1 o mniej niż 50 konserwatywnych podstawień aminokwasowych, przy czym sekwencja aminokwasowa przekształca indolo-3-pirogronian w MP.
6. 6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że aminotransferazę stanowi aminotransferaza asparaginianowa, przy czym kwas 2-hydroksy-2-(indol-3-ilometylo)-4-ketoglutarowy kontaktuje się z asparaginianem dla wytwarzania szczawiooctanu i monatyny.
7. 7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że ponadto obejmuje zetknięcie szczawiooctanu z dekarboksylazą.
8. 8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że aminotransferazę stanowi enzym wykazujący aktywność redukcyjnej aminacji oraz polipeptyd, który jest zdolny do powodowania obiegu NAD(P)H.
9. 9. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że enzym wykazujący aktywność redukcyjnej aminacji wybiera się z grupy składającej się z dehydrogenazy glutaminianowej, dehydrogenazy fenyloalaninowej, dehydrogenazy tryptofanowej lub ich kombinacji.