JP2009538145A - 平衡反応の収量を増加させるための方法およびシステム - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2006年5月24日付の米国特許仮出願第60/803,105号の優先権を主張し、この米国特許仮出願の全内容が参照として本明細書に組み込まれる。
本発明は、平衡反応を含む多段階経路の所望の生成物の収量を増加させるための方法およびシステムに向けられている。いくつかの実施形態においては、所望の生成物は高甘味度甘味料であるモナチンである。
モナチンは、化学式
生物学的合成経路によって所望の最終生成物を合成するための方法およびシステムが提供される。一実施形態によれば、少なくとも1つの経路中間体の形で捕捉される炭素であって、通常であれば合成経路の終わりにおいて失われてしまう炭素が、そのような炭素を所望の最終生成物へと変換するように元の経路を変更することによって救出され、所望の最終生成物へと変換される。当業者であれば、用語「炭素」が、本明細書において該当の化合物の略記として使用されていることを理解すべきである。すなわち、「炭素が所望の生成物へと変換される」と述べた場合、炭素含有の化合物が所望の生成物へと変換されるという意味である。
さらなる実施形態においては、生成物Zがモナチンである合成経路が提供される。
さらなる実施形態においては、経路の反応の促進を担当する分子的実体のすべてが、段階3の前に反応混合物から除去される。
さらなる実施形態においては、除去されるべき中間段階の反応(例えば、Yn−1をYnへと変換する反応)を促進した分子的実体のみが、反応混合物から除去され、あるいは他の方法で抑制、分解、または不活化される。
特定の実施形態においては、本明細書に提示される方法を使用することで、多段階平衡プロセスの生成物の総量、または力価を、平衡プロセスのみに比べて改善することができる。例えば、生成物の濃度または力価について、1.7倍の改善が可能であり、特定の場合には、濃度または力価について、2.0倍の改善が可能である。所与の基質からの生成物のモル収量(生成された生成物のモル数を、供給した基質の初期のモル数で割ったもの)について、1.7倍の改善が可能であり、特定の場合には、2.0倍の改善が可能である。全体としての炭素収量(生成物に含まれる炭素の量を、供給した基質に含まれていた炭素の量で割ったもの)も、基質(とくには、段階3において追加される追加の基質)がリサイクルされる場合に、平衡プロセスのみに比べて改善することができる。
この概要は、添付の特許請求の範囲の技術的範囲に対して限定として機能するものでは決してない。
本明細書において使用されるとき、用語「モナチン」は、特に示されていない限りは、モナチンの特定の立体異性体に限られない。
材料
微生物培養基の成分を、Difco、Fisher Scientific、またはVWRからのものとし、他の試薬は、分析グレ−ドまたは市販の最高グレ−ドのものとした。発酵をNew Brunswick Scientific (Edison, NJ) BioFlo 3000(登録商標)発酵槽にて行った。JLA−16.250またはJA−25.50ロ−タを備えるBeckman (Fullerton, CA) Avanti(登録商標)J−25I遠心分離器を使用して、遠心分離を実行した。
細胞を、Microfluidics (Newton,MA) ホモジナイザ−を使用して破壊した。タンパク質の発現を、Bio−Rad (Hercules, CA) Experion(商標)Pro260システム、またはMini PROTEAN(登録商標)3 cell 装置を流れるBio−Rad 4−15% SDS−ポリアクリルアミド勾配ゲルを使用して分析した。タンパク質を、Bio−Rad Bio−Safe(商標) G−250 Coomassie stainを使用してゲルにおいて視覚化し、水で脱染した。HIS6−タグの酵素を、GE Healthcare (Piscataway, NJ) Chelating Sepharose(商標)Fast Flow樹脂にて精製した。GE Healthcare PD10カラムを、タンパク質溶液のバッファの交換に使用した。タンパク質溶液を、Millipore/Amicon (Billerica,MA) Centricon(登録商標) Plus−70 遠心分離フィルタ−装置(MWCO(分子量しきい値)10kDa)によって濃縮した。タンパク質濃度を、ウシ血清アルブミンを標準とし、Pierce (Rockford, IL) BCA(商標)アッセイ・キットを使用して割り出した。遠心分離を、JLA−16.250またはJA−25.50ロ−タを備えるBeckman (Fullerton, CA) Avanti(登録商標)J−25I遠心分離器を使用して実行した。すべての試薬は、分析グレ−ドまたは市販の最高グレ−ドのものとした。
材料
細胞の培養および遺伝子の導入を、Overnight Express(商標)System II (EMD Biosciences/Novagen;Madison, WI)を使用して行った。他のすべての材料は、HIS6−HEXaspCアミノトランスフェラ−ゼの精製に使用したものと同じである。
アミノ末端HIS6−精製タグを有するproAアルドラ−ゼを、振盪フラスコに0.05mg/mLのカナマイシンを含んでいるOvernight Express(商標) System II (溶液1〜6)を使用して生成した。この発現システムは、細胞の培養を監視する必要なく、IPTG−誘導可能な系の発現を誘導する。BL21(DE3)::C. testosteroni proA pET30(Xa/LIC)の液体培養物またはプレ−トからの培地のアリコ−ト(200mL)を(1Lのフラスコに)接種した後で、培養物を225rpmで振盪させつつ一晩にわたって30℃でインキュベ−トした。OD600が6という最小値に達したときに、細胞を上述のとおり遠心分離によって収穫した。
材料
すべての試薬は、分析グレ−ドまたは市販の最高グレ−ドのものとした。S,S−モナチンの形成を触媒するために使用される酵素を、実施例2および3に記載のとおりに精製した。
L−トリプトファンおよびピルビン酸からS,S−モナチンを生体触媒によって生成するために、小規模な手順を開発した。酵素反応を、15mLのねじ口プラスチック管にて実行した。リン酸カリウム中の50mMのL−トリプトファン、200mMのピルビン酸、4mMのMgCl2、0.05mMのPLPの溶液(pH 7.8)を、標準的な手順において使用し、この溶液を収容してなる管を、穏やかに混合しつつ室温でインキュベ−トした。反応を開始させるために、酵素溶液を、精製Comamonas testosteroni proAアルドラ−ゼについて0.05g/LおよびHIS6−HEXaspCアミノトランスフェラ−ゼについて0.5g/Lの濃度まで加えた(10mLの最終的な体積)。最終的なリン酸カリウムの濃度は、酵素溶液からのバッファの寄与を含め、25mMであった。界面活性剤であるTween 80(登録商標)およびTriton(登録商標)X−100(0.01〜1%)の添加によって、酵素の沈殿を最小限にした。反応は、酵素の追加後に速やかに進行し、時間とともに速度が低下した。3〜5時間において、50mMのL−トリプトファンの第2のアリコ−トを追加し、反応を24時間まで続けた。反応の進行を、L−トリプトファン、L−アラニン、モナチン、モナチン前駆体(2−ヒドロキシ−2−(1H−インド−ル−3−イルメチル)−4−オキソ−ペンタン二酸)、およびピルビン酸の濃度を測定することによって見守った。モナチン、トリプトファン、およびアラニンの濃度は、実施例6に記載の蛍光ポスト・カラム誘導体化手順を使用して測定した。モナチン前駆体およびピルビン酸の分析方法は、実施例6に記載されている。10mL規模の実験からの典型的な結果が、表1に示されている。
材料
すべての試薬は、分析グレ−ドまたは市販の最高グレ−ドのものとした。S,S−モナチンの形成を触媒するために使用される酵素を、実施例2および3に記載のとおりに生成した。ベンチ規模の生体触媒反応を、INFORS (Bottmingen, Switzerland)という0.7Lのバイオリアクタ−にて行った。タンパク質を、YM10膜を備えるAmicon (Millipore; Billerica,MA)限外ろ過攪拌セル(Model 8200)を使用し、あるいはMillipore Pellicon(登録商標)50cm2 限外ろ過カ−トリッジ(MWCO 10,000)を使用して反応混合物から除去した。
ベンチ規模の生体触媒反応を、0.7Lのリアクタ−において温度、pH、および攪拌を制御しつつ行った。チッ素雰囲気で反応を行うことによって、酸素触媒による中間体(インド−ル−3−ピルビン酸)の分解を最小限にした。
モナチンおよびトリプトファンのLC/MS/MS多重反応モニタリング(MRM)分析
生化学的反応から由来するモナチンおよびトリプトファンの混合物の分析を、Waters 2795液体クロマトグラフを備え、Waters 996フォトダイオ−ド・アレイ(PDA)吸光モニタをクロマトグラフとMicromass(登録商標)Quattro Ultima(登録商標)三連四重極質量分析計との間に直列に備えているWaters/Micromass(登録商標)液体クロマトグラフィ−タンデム質量分析(LC/MS/MS)計を使用して実行した。LC分離を、40℃でXterraMS C8逆相クロマトグラフィ・カラム(2.1mm x 250mm)を使用して行った。LC移動相は、A)(i)0.05% (v/v)のトリフルオロ酢酸、または(ii)0.3%のギ酸および10mMのギ酸アンモニウムを含む水、ならびにB)(i)0.05% (v/v)のトリフルオロ酢酸、または(ii)0.3%のギ酸および10mMのギ酸アンモニウムを含むメタノ−ルで構成されていた。
生化学的反応におけるモナチンの立体異性体分布の割り出しを、1−フルオロ−2−4−ジニトロフェニル−5−L−アラニンアミド(FDAA)での誘導体化およびその後の逆相LC/MS/MSMRM測定によって行なった。
50μLの試料またはスタンダ−ドに、200μLの1%FDAAアセトン溶液を添加した。40μLの1.0M重炭酸ナトリウムを加え、混合物を、ときおり混合しつつ40℃で1時間にわたってインキュベ−トした。試料を取り出して冷却し、2.0MのHCl(20μL)で中和した(バッファされた生物学的混合物の中和を達成するためには、より多くのHClを要するであろう)。脱気の完了後に、試料はLC/MS/MSによる分析が可能になった。
上述のLC/MS/MS機器を使用して分析を行なった。モナチン(とくには、FDAA−モナチン)の4種類の立体異性体のすべてを分離することができるLC分離をPhenomenexLuna(登録商標)C18逆相クロマトグラフィ・カラム(2.0 x 250mm(3μm))を用いて40℃にて行なった。LC移動相は、A)0.05%(質量/体積)の酢酸アンモニウムを含む水、およびB)アセトニトリルで構成した。溶出は、実行の間に8分間の再平衡化時間を挟み、13% Bでアイソクラチック(0〜2分)、13% B〜30% Bまで線形(2−15分)、30% B〜80% Bまで線形(15−16分)、80% Bにおいてアイソクラチック(16−21分)、および80% B〜13% Bまで線形(21−22分)であった。流速は0.23mL/分であり、PDA吸光度を200nm〜400nmまで監視した。ESI−MSのすべてのパラメ−タを、FDAA−モナチンのプロトン化分子イオン([M − H]−)の生成および特徴的な断片イオンの生成にもとづいて最適化および選択した。
トリプトファン、モナチン、およびアラニンのための手順
生化学的反応においてアミノ酸を測定するために、ポスト−カラム蛍光検出を備える液体クロマトグラフィを、Waters 474走査型蛍光検出器に組み合わせられたWaters 2690LC systemまたは同等物、およびWatersのポスト−カラム反応モジュ−ルにて実行した(LC/OPA法)。LC分離を、相互作用ナトリウム(Interaction−Sodium)が装填されたイオン交換カラムにおいて60℃で行った。移動相Aは、Pickering Na 328バッファ(PickeringLaboratories, Inc.;Mountain View, CA)とした。移動相Bは、Pickering Na 740バッファとした。勾配溶出は、実行の間に20分間の再平衡期間を挟み、0% B〜100% Bまで〜20分であり、100% Bにおいてアイソクラチック(20〜30分)および100% B〜0% Bまで線形(30〜31分)であった。移動相の流量は、0.5mL/分であった。OPAポスト−カラム誘導体化溶液の流量は、0.5mL/分であった。蛍光検出器の設定は、EX 338nmおよびEm 425nmであった。分析のための内部基準として、ノルロイシンを使用した。アミノ酸の同定を、精製済みの基準についてのクロマトグラフィ保持時間デ−タにもとづいて行った。
生化学的反応からの試料を、充てん材料としてのC18および溶離剤としての0.6%酢酸を含んでいる固相抽出(SPE)カ−トリッジによって清浄化した。次いで、SPEからの留分を既知の体積まで集め、HPLCポスト−カラムOフタルアルデヒド(OPA)誘導体化を使用して蛍光検出器によって分析した。クロマトグラフィ分離を、Waters 2695液体クロマトグラフィ・システムおよび直列な2つのPhenomenex AquaC18カラム(5μmの粒子を有する2.1mm x 250mmのカラムおよび3μmの粒子を有する2.1mm x 150mmのカラム)を使用して可能にした。カラムの温度を40℃とし、カラムのアイソクラチックな流速を、0.18mL/分とした。移動相は、0.6%の酢酸である。OPAポスト−カラム誘導体化および検出のシステムは、Waters Reagent Manager(RMA)、反応コイル・チャンバ、反応コイル・チャンバのための温度制御モジュ−ル、およびWaters 2847蛍光検出器で較正されている。OPA流量を0.16mL/分とし、反応コイル・チャンバを80℃とした。蛍光検出器を、348nmの励起波長および450nmの放射波長に設定した。信号の利得および減衰などといった検出器の感度を制御する他のパラメ−タは、実験の必要に合わせた。HMGの定量化を、グルタミン酸のモル応答にもとづいて行った。
液体クロマトグラフィ分離を、Waters 2690液体クロマトグラフィ・システムおよび2.1mm x 150mmのAgilent Eclipse XDB− C18 5.0μm逆相クロマトグラフィ・カラムを使用し、0.22mL/分の流量および以下の勾配条件で行った。
液体クロマトグラフィ分離を、Waters 2690液体クロマトグラフィ・システムおよび2.1mm x 50mmのAgilent Eclipse XDB− C18 1.8μm逆相クロマトグラフィ・カラムを使用し、2.5mL/分の流量および以下の勾配条件で行った。
LC分離を、Waters HPLC液体クロマトグラフィ・システムおよび2.1mm x 50mmのAgilent Eclipse XDB−C18 1.8μm逆相クロマトグラフィ・カラムを使用し、0.25mL/分の流量および以下の勾配条件で行った。
ピルビン酸およびα−ケトグルタル酸などの他の有機酸を、屈折率検出器を備える高性能液体クロマトグラフィ(HPLC)システムを使用して測定した。システムを、Waters 2690およびWaters 2414屈折率検出器で較正した。
この手順は、インド−ル−3−ピルビン酸のエノ−ル型のホウ酸複合体を測定する。
標準液またはインド−ル−3−ピルビン酸を含んでいる反応混合物試料(0.005mL)を、96穴のマイクロ力価プレ−トにおいて、0.5mMのEDTAおよび0.5mMのヒ酸ナトリウムを含んでいる50mMの四ホウ酸ナトリウム(pH 8.5、0.2mL)へと加えた。次いで、マイクロ力価プレ−トを30℃でインキュベ−トし、327nmにおける吸光を測定した。生成される色が安定でないため、すべての測定を、インド−ル−3−ピルビン酸溶液の添加の正確に30分後に行った。100%のエタノ−ルに溶解させた0〜10mMのインド−ル−3−ピルビン酸を、標準曲線のために使用した。これらの溶液を、アッセイの間、−20℃で保存した。
HMO分析を、最初にアリコ−トをあらかじめ希釈した生化学的反応の試料から取り出し、次いで超音波室温水槽において25分にわたってp−ニトロベンジル・ヒドロキシルアミン(NBHA)塩酸塩(ピリジンにおいて作成)を使用することによって誘導体化することによって実行した。誘導体化プロセスの完了後に、反応混合物を既知の体積まで水でさらに希釈し、超性能液体クロマトグラフィ質量分析(UPLC/MS)を加えた。UPLC/MSシステムには、260nm〜499nmの波長領域を監視するように設定されたフォトダイオ−ド・アレイ(PDA)検出器が含まれている。LC分離を、上述のWatersUPLCシステムおよび2.1mm x 100mmのAgilent Eclipse XDB− C18 1.8μm逆相クロマトグラフィ・カラムを使用し、0.24mL/分の流量に設定し、以下の勾配条件を採用して行った。
細胞の培養および遺伝子の導入を、Overnight Express System II(EMD Biosciences/Novagen;Madison, WI)を使用して行った。他のすべての材料は、HIS6−HEXaspCアミノトランスフェラ−ゼの精製に使用したものと同じである。
B. sphaericus D−アラニン・アミノトランスフェラ−ゼをコードしている遺伝子のクロ−ニングは、参照として本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第2006/0252135号の実施例20に記載されている。
材料
細胞の培養および遺伝子の導入を、Overnight Express System II(EMD Biosciences/Novagen;Madison, WI)を使用して行った。他のすべての材料は、HIS6−HEXaspCアミノトランスフェラ−ゼの精製において使用したものと同じである。
材料
すべての試薬は、分析グレ−ドまたは市販の最高グレ−ドのものとした。R,R−モナチンの形成を触媒するために使用されるB. sphaericus HIS6−標識D−アラニン・アミノトランスフェラ−ゼおよびHIS6−標識アルドラ−ゼを、実施例7および8に記載のとおりに精製した。
D−トリプトファンおよびピルビン酸からR,R−モナチンを生体触媒によって生成するための小規模な手順であって、反応混合物から酸素を排除することによって中間体であるインド−ル−3−ピルビン酸の酸素触媒による分解を最小限にする手順を開発した。酵素反応を、ストッパおよびアルミニウム・シ−ルを有する10−mLのガラス血清ボトルにおいて実行した。
一晩のインキュベ−ションの後で、Amicon Ultra−15遠心分離フィルタ−装置(MWCO 10 kDa)を使用した限外ろ過によって、タンパク質を反応混合物から除去した。
Bacillus sphaericus D−アラニン・アミノトランスフェラ−ゼを、実施例7に記載のようにHIS6−標識タンパク質として精製した。
酵素を、Mateoら(2002)の手順に従ってEupergit(登録商標)C250L樹脂ビ−ズに固定した。48mgの精製済み酵素(9.3mg/mLで5.2mL)に、0.5Mの最終濃度および7.8のpHまでリン酸カリウムを加え、0.05mMの最終濃度までピリドキサル・リン酸(PLP)を加えた。得られた溶液を、Sigma−Alrich (St.Louis,MO)から購入した0.4gのEupergit(登録商標)C250L樹脂と混合した。酵素−樹脂の懸濁を、穏やかに混合しつつ一晩のあいだ室温でインキュベ−トした。樹脂ビ−ズを、5分間にわたる4000xgの遠心分離によって酵素溶液から分離した。浮遊物を取り除き、樹脂を0.05mMのPLPを含むpH 7.8の3 x 5mLの100mMリン酸カリウムで洗浄した。洗浄の間に、混合物を5分間にわたって4000xgで遠心分離した。樹脂へと結合したタンパク質の量を、各洗浄においてタンパク質の量を測定し、合計を固定されるべきタンパク質の元の量から引き去ることによって割り出した。タンパク質の濃度を、ウシ血清アルブミンを標準としてPierce(Rockford, IL)BCA(商標)タンパク質アッセイ・キットを使用して測定した。固定されて洗浄された酵素ビ−ズを、0.05mMのPLPを含んでいる3mLの100mMリン酸カリウム(pH 7.8)に最終的に懸濁させた。固定された酵素ビ−ズの未反応のエポキシ基を、穏やかに混合しつつ室温で1.4Mのグリシンでインキュべ−ションすることによってブロックした。24時間後に、ビ−ズを0.05mMのPLPを含んでいる4 x 10mLの50mM EPPS(pH 8.4)で洗浄して余分なグリシンを取り除き、最後に、0.05mMのPLPを含んでいる5mLの50mM EPPS(pH 8.4)に再び懸濁させた。固定された酵素の最終の濃度は、1gの樹脂ビ−ズにつき66mgのタンパク質であった。
配列ID番号:2のアルドラ−ゼをコードしている遺伝子(この遺伝子のDNA配列が、配列ID番号:1として示されている)を、酵素の精製を可能にするためのN−末端His−タグを備えるpET28b発現ベクタ−(EMD Biosciences/Novagen,Madison, WI)へとサブクロ−ンした。また、この遺伝子を、pET30a(タグなし)へもクロ−ンした。
5'−ATAAGACATATGCCTATCGTTGTTACGAAG−3'(NdeI 制限酵素認識部位)(配列ID番号:5)、および
5'−ATAAGAGGATCCTTATTCCTCGGGCAGCCGCTC−3'(BamHI制限酵素認識部位)(配列ID番号:6)。
atgcctatcg ttgttacgaa gatcgaccga cccagcgcgg cggacgtcga aaggatcgcc gcctatggtg
tcgcgacctt gcatgaagcg caaggacgaa ccgggttgat ggcgtccaat atgcgcccaa tctatcgccc
tgcgcacatt gccgggcccg cggtgacctg ccttgtggcg cctggcgaca attggatgat ccatgtcgcc
gtcgaacagt gccagccggg agatgtcctg gtcgtggtac cgaccagccc ctgcgaagac ggctatttcg
gcgatctgct ggcgacctcg ctgcggtcgc gcggggtcaa aggtctgatc atcgaggccg gcgtacgcga
tatcgcgaca ttgaccgaga tgaaattccc ggtctggtcc aaggcggtgt tcgcgcaagg aacggtcaag
gagaccatcg ccagcgtcaa tgtgcccctc gtctgcgcgg gcgcccgcat cgtgccgggc gatctgatcg
ttgccgacga cgacggggtc gtcgtgattc caagacgttc cgttccggcg gtcctttcca gcgccgaggc
ccgcgaagag aaggaagccc gcaaccgcgc ccgcttcgaa gctggcgagc tgggcctcga cgtctacaac
atgcgccagc gcctggccga caagggcttg cgctatgtcg agcggctgcc cgaggaatag (配列ID番号:1)。
Met Pro Ile Val Val Thr Lys Ile Asp Arg Pro Ser Ala Ala Asp Val Glu ArgIle Ala Ala Tyr Gly Val Ala Thr Leu His Glu Ala Gln Gly Arg Thr Gly LeuMet Ala Ser Asn Met Arg Pro Ile Tyr Arg Pro Ala His Ile Ala Gly Pro AlaVal Thr CysLeu Val Ala Pro Gly Asp Asn Trp Met Ile His Val Ala Val Glu Gln Cys Gln Pro Gly Asp Val Leu Val Val Val Pro Thr Ser Pro Cys Glu AspGly Tyr Phe Gly Asp Leu Leu Ala Thr Ser Leu Arg Ser Arg Gly Val Lys GlyLeu Ile Ile Glu Ala Gly Val Arg Asp Ile Ala Thr Leu Thr Glu Met Lys PhePro Val Trp Ser Lys Ala Val Phe Ala Gln Gly Thr Val Lys Glu Thr Ile AlaSer Val Asn Val Pro Leu Val Cys Ala Gly Ala Arg Ile Val Pro Gly Asp LeuIle Val Ala Asp Asp Asp Gly Val Val Val Ile Pro Arg Arg Ser Val Pro AlaVal Leu Ser Ser Ala Glu Ala Arg Glu Glu Lys Glu Ala Arg Asn Arg Ala ArgPhe Glu Ala Gly Glu Leu Gly Leu Asp Val Tyr Asn Met Arg Gln Arg Leu AlaAsp Lys Gly Leu Arg Tyr Val Glu Arg Leu Pro Glu Glu (配列ID番号:2)。
細胞の培養および遺伝子の導入を、Overnight Express System II(EMD Biosciences/Novagen;Madison, WI)を使用して実行した。他のすべての材料は、HIS6−HEXaspCアミノトランスフェラ−ゼの精製において使用したものと同じである。
配列ID番号:2のアルドラ−ゼをコ−ドする遺伝子のクロ−ニングは、実施例11に記載されている。
配列ID番号:2のアルドラ−ゼを、実施例12に記載のようにHIS6−標識タンパク質として精製した。
酵素を、Mateoら(2002)の手順に従ってEupergit(登録商標)C樹脂ビ−ズに固定した。20.4mgの精製済み酵素(1.45mg/mLで14.1mL)に、0.5Mの最終濃度および7.8のpHならびに1mMのMgCl2の最終濃度までリン酸カリウムを加えた。得られた溶液を、Sigma−Alrich (St.Louis,MO)から購入した0.2gのEupergit(登録商標)C250L樹脂と混合した。酵素−樹脂の懸濁を、穏やかに混合しつつ一晩のあいだ室温でインキュベ−トした。樹脂ビ−ズを、5分間にわたる4000xgの遠心分離によって酵素溶液から分離した。浮遊物を取り除き、樹脂を1mMのMgCl2を含む3x5mLの100mMリン酸カリウム(pH 7.8)で洗浄した。洗浄の間に、混合物を5分間にわたって4000xgで遠心分離した。樹脂へと結合したタンパク質の量を、実施例10に記載したBacillus sphaericusからのアミノトランスフェラ−ゼの固定について説明したように測定した。固定されて洗浄された酵素ビ−ズを、1mMのMgCl2を含んでいる3mLの100mMリン酸カリウム(pH 7.8)に最終的に懸濁させた。固定された酵素ビ−ズの未反応のエポキシ基を、穏やかに混合しつつ室温で1.4Mのグリシンでインキュべ−ションすることによってブロックした。24時間後に、ビ−ズを1mMのMgCl2を含んでいる4x10mLの50mM EPPS(pH 8.4)で洗浄して余分なグリシンを取り除き、最後に、1mMのMgCl2を含んでいる5mLの50mM EPPS(pH 8.4)に再び懸濁させた。固定された酵素の最終の濃度は、1gの樹脂ビ−ズにつき90mgのタンパク質であった。
配列ID番号:1の遺伝子を、標準的な分子生物学の手順を使用して、NgoMIV制限酵素認識部位およびベ−タ・ラクタマ−ゼ遺伝子(bla)の容易な除去のために追加された第2のpsiI制限酵素認識部位に挿入されたE. coli MetE遺伝子およびプロモ−タを含んでいるpET23dベクタ−(Novagen,Madison, WI)の誘導体へとサブクロ−ンした。myo−イノシト−ル・オキシゲナ−ゼ遺伝子のためのインサ−トを含んでいるこのベクタ−の構成が、PCT WO 2006/066072の実施例2および20に記載されている。このアルドラ−ゼ・インサ−トを、DNA配列決定(Agencourt Bioscience Corporation; Beverly,MA)によって確認し、正しいインサ−ト配列を有するプラスミドを、E. coli発現ホストBW30384(DE3)ΔompTΔmetEへと変換した。この発現ホストの構成および変換手順も、PCT WO 2006/066072に記載されている(実施例21および22)。アルドラ−ゼ遺伝子を、3Lの培養槽においてラクト−スでの誘導によって発現させた。誘導の手順は、実施例1に記載されている。アルドラ−ゼを含んでいる無細胞抽出物を作成するために、細胞を、1mMのMgCl2を含んでいる3−4体積の100mMリン酸カリウム(pH 7.8)に懸濁させ、次いで実施例2に記載のとおりに破壊した。細胞残屑を、4℃での30分間にわたる20,000〜25,000xgでの遠心分離によって除去した。無細胞抽出物中の可溶性タンパク質を、Bio−RadLaboratories Experion(商標)Automated Electrophoresis Station (Bio−Rad, Hercules, CA)に分離し、Experionソフトウェアを使用し、あるいは4−15%の勾配ゲルを使用するSDSポリアクリルアミド・ゲル電気泳動によって、パ−セント可溶性タンパク質発現について分析した。
材料
すべての試薬は、分析グレ−ドまたは市販の最高グレ−ドのものとした。R,R−モナチンの生体触媒による生成に使用されるD−アラニン・アミノトランスフェラ−ゼを、Biocatalytics, Inc.(Pasadena, CA)(カタログ番号AT−103)から購入する一方で、生成に使用される配列ID番号:2のアルドラ−ゼを、実施例14に記載のとおりに作成した。
2段階の反応を、0.7LのINFORS(Bottmingen, Switzerland)バイオリアクタ−において250mLで実行した。反応を、チッ素の上部空間のもとでpH 8.4および25℃に維持した。
混合物1(第1の反応混合物):25mMのEPPS(pH 8.4)、1mMのMgCl2、5mMのリン酸カリウム、および50μMのピリドキサル・リン酸(PLP)の溶液を、発酵槽内に用意した。この液体を、200mMのピルビン酸ナトリウムおよび100mMのD−トリプトファンの固体としての添加に先立ち、数分間にわたってチッ素でスパ−ジした。基質の追加後かつ酵素の添加の前に、pHを水酸化ナトリウムによって8.4へと調節した。D−アラニン・アミノトランスフェラ−ゼを、2mg/mLの最終濃度まで固体として添加し、アルドラ−ゼを、0.01mg/mLの最終濃度まで無細胞抽出物として添加した(酵素および基質の添加ごの最終的な体積は250mL)。反応混合物を、チッ素の上部空間のもとで250rpmで攪拌しつつ25℃でインキュベ−トした。反応の進行を、D−トリプトファン、D−アラニン、R,R−モナチン、R−モナチン前駆体(2−ヒドロキシ−2−(1H−インド−ル−3−イルメチル)−4−オキソ−ペンタン二酸)、およびピルビン酸を測定することによって見守った。トリプトファンおよびアラニンの濃度を、蛍光ポスト・カラム誘導体化法を使用して測定した。モナチンを、LC/MS/MS法を使用して定量化した。すべての分析方法は、実施例6に記載されている。
材料
R,R−モナチンの形成を触媒するために使用B. sphaericus HIS6−標識D−アラニン・アミノトランスフェラ−ゼおよびHIS6−標識配列ID番号:2のアルドラ−ゼを、実施例10および13に記載のとおり固定した。反応中間体の酸素触媒による分解を最小限にするために、反応を、97−98%のチッ素および2−3%の酸素からなる雰囲気のCoy嫌気チャンバにおいて準備および実行した。
反応1: 50mMのEPPS(pH 8.4)中の100mMのピルビン酸ナトリウム、1mMのMgCl2、および50μMのPLPの溶液を、脱気H2Oを使用してCoy嫌気チャンバに用意した。この溶液に、固体D−トリプトファンを50mMの最終濃度まで加えた。固定した酵素の溶液を、固定された配列ID番号:2のアルドラ−ゼについて0.05 g/Lかつ固定されたアミノトランスフェラ−ゼについて2 g/Lで反応へと加えた(最終的な体積4mL)。反応混合物を、穏やかに混合しつつ室温でインキュベ−トした。反応の進行を、D−トリプトファン、D−アラニン、R,R−モナチン、R−モナチン前駆体(2−ヒドロキシ−2−(1H−インド−ル−3−イルメチル)−4−オキソ−ペンタン二酸)、およびピルビン酸の濃度を測定することによって見守った。すべての分析方法は、実施例6に記載されている。モナチンについては、LC/MS/MS法を利用した。トリプトファンおよびアラニンについては、蛍光ポスト−カラム誘導体化法を利用した。ピルビン酸の分析には、Aminex(登録商標)カラムを分離のために使用した。
反応2:ろ過後の材料に、固体のD−アラニンを1Mの最終濃度まで加え、固定したアミノトランスフェラ−ゼを2 g/Lタンパク質の濃度へと加えた(最終的な体積は5.1mL)。この反応混合物を、穏やかに混合しつつ室温でインキュベ−トした。反応の進行を、HPLCおよび/またはLC−MS分析によって、D−トリプトファン、D−アラニン、R,R−モナチン、R−モナチン前駆体(2−ヒドロキシ−2−(1H−インド−ル−3−イルメチル)−4−オキソ−ペンタン二酸)、およびピルビン酸を測定することによって見守った。
材料
3リットルの量の反応混合物を、Sartorius BBI Systems(Bethlehem, PA)からの5LのBiostat B発酵槽において嫌気状態のもとで作成した。基準反応物は、25mMのリン酸カリウム(pH 7.8)、4mMの塩化マグネシウム、0.05mMのPLP、0.01%のTween 80、200mMのピルビン酸ナトリウム、および100mMのL−トリプトファンを含んでいた。上記溶液に、未精製のHEXaspCアミノトランスフェラ−ゼおよび生成したComamonas testosteroni proAアルドラ−ゼを、それぞれ0.5および0.05 g/Lで加えた。反応を、30℃および250rpmならびにpH 7.8で、チッ素の上部空間のもとで実行した。3−5時間の後に、さらなる100mMのピルビン酸ナトリウムおよび50mMのL−トリプトファンを加えた。反応を18-24時間後に停止させ、限外ろ過に先立って4℃で嫌気的に保持した。限外ろ過を、GE Osmonicsによって製造されたEPA CFII クロスフロ−平坦シ−ト膜ユニットにて行った。試験した膜の種類の一例は、150cm2の表面積を有するNadir C30 30 kDaMWCO 平坦シ−ト(Microdyn−Nadir Gmbh, Wiesbaden, Germany)である。容器を、酸素に敏感な中間体の分解を最小限にすべく、チッ素によるフラッシングおよびブランケティングを促進するように設計した。
モナチン、アラニン、トリプトファン、ピルビン酸、I3P、およびMPの分析を、UF作業の前および後で実行した。モナチンおよびトリプトファンの濃度を、実施例6に記載のLC−UV/Vis法を使用して測定した。MP分析は、同じLC−UV/vis法および基準曲線を使用して、半定量的であった。アラニンを、実施例6に記載の蛍光ベ−スのポスト−カラム誘導体化法を使用して定量化した。インド−ル−3−ピルビン酸の分析は、実施例6のトリプトファンと比べたインド−ル−3−ピルビン酸のピ−ク面積にもとづき、定性的であった。UF作業における流量は、およそ0.6 gpmに設定した。戻りの流れの背圧を、50−150 psiの範囲にとどまるように連続的に調節した。分析対象の濃度を、表6に挙げる。システムをすすいでより正確な分析を可能にするために、濃縮物の流れを水で再希釈した。
材料
43mLの充てん体積のItochu Chemicals America, Inc.からの樹脂ZGA313を、酢酸の形態でモナチンのアニオン交換生成に使用した。トリプトファン、アラニン、およびモナチンを生物学的反応物のカチオン交換処理後に観察される比に類似した比で含んでいる模擬の溶液を、原料として使用した。試薬グレ−ドの醋酸カリウムを、3M溶液にて溶離剤として使用した。
溶液を装填し、2.5mL/分での溶離の前に2.5mL/分の脱イオン水ですすいだ。結果を表7に示す。控えめな単一バッチ装填能力が、充てんクされた樹脂1mLにつき0.1gのモナチンであると計算された。モナチンの優れた純度および回収が観察された。少量のモナチンが結合することなく洗い流され、アラニンの一部が、溶離の開始前にカラムから完全にすすぎ出されなかった。分析対象を、実施例17に記載のとおりに測定した。
材料
3リットルのタンパク質なしの限外ろ過透過物を、原料として使用した。pHを、HClで7.36へと調節した。膜を、GE Osmonicsによって製造されたEPA CFII クロスフロ−平坦シ−ト膜ユニット上で動作させた。試験した膜の種類の一例は、ITT Aquios−PCIMembrane Systems, Inc. (Basingstoke, UK)によって製造されたNPという名前である。これを、150 cm2の表面積を有する平坦なシ−トとして試験した。容器を、酸素に敏感な中間体の分解を最小限にすべく、チッ素によるフラッシングおよびブランケティングを促進するように設計した。
モナチン、アラニン、トリプトファン、ピルビン酸、I3P、およびMPの分析を、実施例17に記載の方法を使用して膜の動作の各段階において実行した。3つのダイアフィルトレ−ションを、初期の濃縮の後に実行した。膜の動作のための流量を、およそ0.4 gpmに設定した。戻りの流れの背圧を、100−400 psiの範囲にとどまるように連続的に調節した。分析対象の濃度を、表8に挙げる。システムをすすいでより正確な分析を可能にするために、濃縮物の流れを水で再希釈した。
材料
供給材料を、表9に示した濃度でのモナチン、トリプトファン、アラニン、およびピルビン酸の模擬の溶液で構成した。この混合物からモナチンを精製するために、Mitsubishiによって製造された合成SDVB吸着剤樹脂HP21を使用した。試薬グレ−ドのエタノ−ルおよび脱イオン水を、溶離剤として使用した。カラムの充てん体積は、直径1.5cm×高さ55.9cmの寸法を有して98.7mLであった。
280nmにおける吸光度を、溶離の追跡および留分の選択に使用した。流量は、2.5mL/分に設定した。樹脂を、水酸化ナトリウムでpH 8.5へと調節した水で平衡させた。4つの留分が分析のために集められ、表9に挙げられている。カラムを、最初の3つの留分を通じて脱イオン水で洗浄した。主としてトリプトファンを含んでいる最後の留分は、10%の水性エタノ−ルによって溶出された。
材料
研究室規模の電気透析ユニットを、この試験のために使用した。すべての化学物質は、試薬グレ−ドであった。陽極液および陰極液は、1Mの重炭酸ナトリウム溶液とした。原液は、0.1%の塩化ナトリウム溶液とした。使用した膜は、AMXおよびCMXである。電極膜は、Nafion膜とした。供給圧力を、1 psi未満に設定した。動作を80分間続け、電圧が急激に上昇し始めたときに停止させた。電流を、動作の間に2回、電位を下げるために減らした。供給のpHが7.4に設定され、7.7へとわずかに上昇した一方で、原液のpHは7.2で終了した。供給に使用された4つの分析対象の濃度を、表11に挙げる(実施例17に記載のとりに測定した)。
物質収支の最終的な分析が、ピルビン酸が有意な度合いで輸送される唯一の分子であることを示した。残りの3つの分析対象は、試験の際に膜へと吸着され、効率試験の段階の際に溶脱した。入手可能な最高の拡散性の膜での試験にもかかわらず、分子の大部分、とくにはモナチンが、膜を横切って運ばれるためには大きすぎると推測される。いくつかの他のpHおよび膜も試験され、同様の結果であった。それにもかかわらず、ピルビン酸のかなりの濃度を選択的に分離する能力が、これを下流の処理方法の設計における興味深い選択肢にしている。アラニンのサイズはピルビン酸にきわめて類似しているため、適切な条件下で膜を横切るアラニンの拡散を可能にする膜を見出すことができると予想される。
強カチオン交換樹脂を使用して単一の工程でモナチンの他の反応成分(他のアミノ酸など)からの精製を可能にする方法を、想像することができる。酸の形態の強酸カチオン交換樹脂が、好ましい樹脂である。タンパク質を除いた反応混合物が装填され、有機酸化合物が洗い流され、アミノ酸のみがカラムへと結合して残される。等電点の相違にもとづいてアミノ酸を別々に溶出させるために、ステップ勾配が使用される。ステップ勾配を、pH 2.5、3、3.1、および4にステップを有するクエン酸バッファまたはリン酸バッファで構成できる。モナチンのpIが約3.9である一方で、トリプトファンおよびアラニンは、6により近いpIを有するため、モナチンが最初に溶出する。例えば、MCI GEL(登録商標)Technical Information 2004−2005,Mitsubishi Chemical Corporationの7頁を参照されたい。
材料:直径7.5 cmのカラムに、プロトン型のAG50Wx8カチオン交換樹脂の950mLの充てん体積を詰め込んだ。AG50Wx8は、Rohm and Haas (Philadelphia, PA)によって製造されており、Bio−Rad (Hercules, CA)から調達された。限外ろ過された1リットルの生物学的反応混合物を、140mL/分の流量でカラムへと供給した。脱イオン水を洗浄剤として使用した。カラムを、1Mの水酸化カリウムを使用して溶出させた。
モナチンが、反応混合物(例えば、S,S−モナチンについて実施例17で説明した反応混合物)から、強アニオン交換樹脂を使用して単一の工程で精製される。重炭酸塩型のZGA313 (Itochu Chemicals America, Inc)などの強アニオン交換樹脂が、好ましい樹脂である。タンパク質を除いた反応混合物が、pH 7−8で適切なサイズのカラムへと装填される。アラニンおよびトリプトファンなどといった非荷電のアミノ酸は結合せず、水で洗い流される。pH 7−8において負の電荷を有する分子は、カラムに保持される。それらとして、モナチン、4−ヒドロキシ−4−メチルグルタミン酸、4−ヒドロキシ−4−メチル−オキソグルタル酸、ピルビン酸、インド−ル−3−ピルビン酸、およびモナチン前駆体が挙げられる。pH 7−8において、線形塩勾配(0〜2Mの重炭酸アンモニウムなど)を使用して、モナチンが有機酸(例えば、ピルビン酸、4−ヒドロキシ−4−メチル−オキソグルタル酸、モナチン前駆体、インド−ル−3−ピルビン酸)よりも前に溶出すると予想される。モナチンのインド−ル部分と樹脂の骨格との間の疎水性相互作用が、モナチンの溶出を遅らせ、モナチンの4−ヒドロキシ−4−メチルグルタミン酸からの選択的分離を可能にする。クロマトグラフィ留分を、実施例6に記載の方法を使用して分析することができる。
Claims (40)
- a)1またはそれを超える反応剤および1またはそれを超える第1の促進剤を含む第1の組成物を反応させて多段階の平衡経路で一定量のモナチンおよび一定量の1またはそれを超える中間体を形成させ、ここに該経路はモナチン生成反応、およびモナチン生成反応に利用し得る1またはそれを超える中間体の少なくとも1の量を制限する制限反応を含み;
b)第2の組成物を形成する望ましい時間の後に該1またはそれを超える促進剤を除去、阻害、不活性化または分解し;ついで、
c)第2の促進剤を第2の組成物に加えることによってさらなる量のモナチンを生成し、ここに第2の組成物促進剤は該第1の促進剤のうちの少なくとも1と同じものとすることができ;または、モナチン生成反応に関与する1またはそれを超える第1の促進剤を阻害しないかまたは再活性化し;または、それらの組み合わせをし;ついで、モナチン生成反応を前に向けて駆動するための第2の組成物に成分を添加する
ことを含む方法。 - 望ましい時間が、a)において平衡に達するのに必要な時間である請求項1記載の方法。
- 該成分を、a)からの1またはそれを超える反応物の少なくとも1と同じものとすることができ、あるいは、工程a)において生成した化合物と同じものとすることができる請求項1記載の方法。
- さらに、
該第2の組成物から該モナチンを精製し、ついで反応精製混合物を形成することを含む請求項1記載の方法。 - 該除去、阻害、不活性化または分解が、1またはそれを超える促進剤の全てを除去することを含む請求項1記載の方法。
- 該除去が、濾過、クロマトグラフィおよび抽出の1またはそれを超えるものから選択される請求項1記載の方法。
- 該濾過が限外濾過である請求項6記載の方法。
- 該クロマトグラフィが、サイズ排除クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィおよび親和性クロマトグラフィから選択される請求項6記載の方法。
- 1またはそれを超える反応物のうちの少なくとも1がアミノ酸であって、1またはそれを超える反応物のうちの少なくとも1がアミノ基受容体であり、該1またはそれを超える第1の促進剤が2またはそれを超える促進剤を含む請求項1記載の方法。
- 該アミノ酸がL−トリプトファン、D−トリプトファンまたはそれらの混合物である請求項9記載の方法。
- 2またはそれを超える促進剤のうちの1が第2の促進剤である請求項9記載の方法。
- 該アミノ基受容体がピルビン酸、オキサロ酢酸、アルファ−ケトグルタル酸、またはそれらの混合物である請求項9記載の方法。
- 該アミノ基受容体が反応して、アラニン、アスパラギン酸およびグルタミン酸から選択されるアミノ基提供体を生成する請求項9記載の方法。
- 該1またはそれを超える第1の促進剤が、酵素、無機触媒およびRNAから選択される請求項1記載の方法。
- 該酵素が、アミノトランスフェラーゼ、ラセマーゼおよびアルドラーゼから選択される請求項14記載の方法。
- 該アミノ基受容体がピルビン酸であり、該アミノ基受容体が反応してアラニンを生成し、c)における成分もアラニンであり、さらに、反応精製混合物からのアラニンを第2の組成物に、および所望により第1の組成物にリサイクルすることを含む請求項4記載の方法。
- 該成分がアラニンである請求項3記載の方法。
- さらに、所望の時間の後に第2の組成物からアラニンの少なくとも一部分を分離し、ついで該分離したアラニンを第1の組成物にリサイクルすることを含む請求項4記載の方法。
- 工程c)の該促進剤がアミノトランスフェラーゼである請求項1記載の方法。
- 該モナチンがR,Rモナチン、S,Sモナチン、R,Sモナチン、S,Rモナチン、またはそれらの混合物である請求項1記載の方法。
- 該モナチンがR,Rモナチンである請求項20記載の方法。
- 多段階平衡経路でモナチンを製造する方法であって、
a)酵素によって促進される少なくとも2の反応工程を含む経路を介して反応混合物中のモナチンを生成し、ここに該少なくとも2の工程のうちの少なくとも1がモナチン生成工程であって、該少なくとも2の工程のうちの少なくとも1が望ましくない平衡を有し;
b)少なくとも望ましくない平衡を有する反応を妥協して(compromising)、妥協した組成物を形成し;
c)該妥協した組成物に少なくとも1の成分を加えてモナチン生成工程をモナチンの生成に向けて駆動する
ことを含む該方法。 - 該経路が少なくとも3の反応工程を含む請求項22記載の方法。
- さらに、反応混合物から促進剤、促進剤の補助因子またはそれらの組み合わせを分離することによって少なくとも3の工程の全てを妥協することを含み、ここに少なくとも1の成分が少なくとも第1の成分および第2の成分であり、該第1の成分がモナチン−生成工程を促進する酵素であって該第2の成分がモナチン生成工程に関与する反応物であり、ここにモナチン生成工程を促進する酵素が経路におけるより安定性の低い成分から経路におけるより安定性の高い成分への変換も促進する請求項23記載の方法。
- 該より安定性の低い成分がインドール−3−ピルビン酸であって、該より安定性の高い成分がトリプトファンである請求項24記載の方法。
- さらに、分離した酵素およびトリプトファンを反応混合物にリサイクルすることを含む請求項25記載の方法。
- さらに、副生成物、同時生成物(coproduct)またはそれらの組み合わせを第1の組成物、妥協した組成物またはそれらの組み合わせにリサイクルすることを含む請求項24記載の方法。
- さらに、2−ヒドロキシ 2−(インドール−3−イルメチル)−4−ケトグルタル酸(「MP」)を生成する一連の初期成分を反応混合物に提供することを含み、ここに約90%のMPがモナチンに変換する請求項22記載の方法。
- 約95%のMPがモナチンに変換する請求項28記載の方法。
- 約100%のMPがモナチンに変換する請求項28記載の方法。
- 生成したモナチンの濃度が、妨害されていない(undisturbed)平衡経路で生成するよりも約1.5倍高い請求項28記載の方法。
- 生成したモナチンの濃度が、妨害されていない平衡経路で生成するよりも約1.7倍高い請求項28記載の方法。
- 生成したモナチンの濃度が、妨害されていない平衡経路で生成するよりも約2.0倍高い請求項28記載の方法。
- モナチンをアニオン交換クロマトグラフィ、SDVBカラムクロマトグラフィ、またはカチオン交換クロマトグラフィを用いて精製する請求項4記載の方法。
- 多段階平衡経路で生成物を製造する方法であって、
a)該経路で一連の反応剤および一連の促進剤を含む第1の組成物を反応させて、該生成物および1またはそれを超える中間体を含む第2の組成物を形成させ;
b)促進剤を除去、阻害、不活性化または分解して多段階経路を不活性化させるかまたはその速度を低下させ;
c)生成物を生成する工程に競合的な反応を不活性または鈍化した状態に維持しながら、少なくとも生成物を生成する反応の速度を再活性化または増大させ、ついで、所望により生成物を生成する工程を生成物の生成に向けて駆動するのに十分な量で、生成物を生成する工程に関与する少なくとも1の成分を加え;ついで
d)第2の組成物から生成物を精製する
ことを含む該方法。 - 多段階平衡経路で生成物を製造するシステムであって、
a)1またはそれを超える反応物および1またはそれを超える促進剤を含む第1の混合物の成分を受けるおよび保持するための第1の容器、ここに該成分は反応して望ましい生成物および中間体を生成することができ;
b)促進剤から反応物、生成物および中間体を分離するための容器と繋がった第1の装置;
c)促進剤を該容器に戻してリサイクルするための手段;
d)第1の装置からの反応物、望ましい生成物および中間体を受ける該第1の装置と繋がった第2の容器、ここに該第2の容器は反応物および中間体の少なくとも1を含む望ましい生成物を生成する反応を活性化するのに有用な促進剤を受けるようにも適合され、かつ、生成物を生成する反応を駆動して望ましい生成物を形成するのに有用な成分を受けるように適合され;
e)第2の容器と繋がった望ましい生成物を精製するための手段;
f)精製するための手段からの反応物および所望により中間体を第1の容器にリサイクルするための手段;および、所望により、
g)精製するための手段からの成分を第2の容器にリサイクルするための手段
を含む該システム。 - 新たな混合物を残しつつ元の反応混合物からモナチンを精製し、元の反応混合物からの少なくとも1の成分を新たな反応混合物に選択的にリサイクルし、ついで平衡プロセス単独によって生成するモナチンの量よりも多い元の量の反応物から一定量のモナチンを生成することを含み、ここに精製することが、少なくとも1の限外濾過工程および少なくとも1のクロマトグラフィ工程を含む方法。
- 少なくとも1のクロマトグラフィ工程が、カチオン交換クロマトグラフィ工程および非極性吸着剤樹脂上のクロマトグラフィを含む請求項37記載の方法。
- さらに脱塩工程を含み、少なくとも1のクロマトグラフィ工程がカチオン交換クロマトグラフィ工程、アニオン交換クロマトグラフィ工程および非極性吸着樹脂上のクロマトグラフィを含む請求項37記載の方法。
- 少なくとも1のクロマトグラフィ工程が、非極性合成吸着樹脂を用いるクロマトグラフィを含む請求項37記載の方法。
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