CN102027117B

CN102027117B - 新的氧化酶基因及使用该基因生产3-吲哚-丙酮酸的方法

Info

Publication number: CN102027117B
Application number: CN200880104143XA
Authority: CN
Inventors: 高仓康彰; 原诚一; 田场登志希; 铃木俊一; 杉山雅一; 渡部乙比古; 横关健三
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 2007-08-24
Filing date: 2008-08-15
Publication date: 2012-11-07
Anticipated expiration: 2028-08-15
Also published as: US20100221795A1; WO2009028338A1; US8518665B2; CN102027117A; US20130084610A1; US8394940B2

Abstract

本发明提供了实现3-吲哚-丙酮酸的节约且便利生产的手段。使用具有限定碱基序列的多核苷酸构建了转化体，该限定碱基序列编码具有氧化酶活性的蛋白质。然后，在培养基中培养此转化体，如此通过在培养基和/或转化体中积累氧化酶而生成氧化酶。另外，在存在上文所述转化体和/或其培养物的条件下将色氨酸转变成3-吲哚-丙酮酸，由此生成3-吲哚丙酮酸。

Description

新的氧化酶基因及使用该基因生产3-吲哚-丙酮酸的方法

技术领域

本发明涉及新的氧化酶基因及利用该基因生产3-吲哚-丙酮酸的新方法。

背景技术

在Giovanna De Luca等的用于生产3-吲哚-丙酮酸的化学方法中，通过在存在用于使质子受体脱水的碱的条件下使作为起始材料的色氨酸与吡啶醛反应，以50-62％产率获得了3-吲哚-丙酮酸(参见JP Sho-62-501912[专利文件1]，国际公开87/00169小册子[专利文件2])。在此方法中，所需要的碱和吡啶醛价格昂贵，而且产率低。结果，其生产成本似乎很高。通过使用吲哚和3-溴-2-肟基丙酸乙酯(ethyl-3-bromopyruvate ester oxime)作为原料进行的缩合反应及随后进行的酸水解，Politi Vincenzo等以64％产率获得了3-吲哚-丙酮酸(参见欧洲专利申请公开No.421946[专利文件3])。在此方法中，需要使用硅胶进行的纯化步骤，产率低，原料昂贵，而且工业生产的成本很高。

另一方面，作为生产3-吲哚-丙酮酸的酶促方法，使用氨基转移酶进行的方法是已知的(参加下文反应式1)。

(反应式1)

已经报告了如下的一种方法，其中通过容许源自麦芽糖假丝酵母(Candida maltosa)的L-色氨酸(L-Trp)氨基转移酶作用于L-Trp而自40mM L-色氨酸和80mM 2-酮戊二酸生成3-吲哚-丙酮酸，并通过离子交换树脂纯化以实现72％的产率(参见Bobe Ruediger等，东德专利DD 297190[专利文件4])，还已经报告了如下的一种方法，其中容许天冬氨酸氨基转移酶作用于L-Trp和2-酮戊二酸以生成3-吲哚-丙酮酸，然后通过用石油醚萃取反应液和通过柱层析进行的分级进行纯化，并收集级分(参见Mario Materazzi等，JPSho-59-95894-A[专利文件5])。国际公开No.2003/091396小册子[专利文件6]和美国专利申请公开No.2005/0282260[专利文件7]记载了由源自大肠杆菌(Escherichia coli)的aspC基因和tyrB基因编码的氨基转移酶。在使用氨基转移酶进行的这些方法中，产率是低的，需要作为氨基受体的酮酸(如2-酮戊二酸)作为L-Trp之外的原料，而且以与待产生的3-吲哚-丙酮酸等摩尔的量生成与所存在的氨基受体对应的一种氨基酸作为副产物。此外，为了提高产率，向反应体系添加相对于L-Trp过量的酮酸。如此，在反应后剩余未反应的酮酸。由于这些原因，为了自反应液收集目标3-吲哚-丙酮酸，需要使用离子交换树脂进行的纯化步骤。如此，操作是复杂的，而且成本是高的。

作为自L-Trp生产3-吲哚-丙酮酸的方法，使用L-氨基酸氧化酶的方法也是已知的。然而，在这点上，3-吲哚-丙酮酸被L-氨基酸氧化酶氧化色氨酸(参见下文反应式2)时作为副产物生成的过氧化氢分解成吲哚乙酸(参见下文反应式3)。如此，产生了通过向反应体系添加过氧化氢酶来分解过氧化氢(参见下文反应式4)的方法(参见美国专利No.5,002,963，授予De Luca等，1991[专利文件8])。

(反应式2)

(反应式3)

(反应式4)

在上述方法中，使用固定化酶柱(其中将源自蛇毒的L-氨基酸氧化酶和源自牛肝的过氧化氢酶固定化至载体)，使含有L-Trp的溶液流经该柱以反应，并使生成的3-吲哚-丙酮酸吸收至离子交换柱，用甲醇洗脱，随后干燥并收集。然而，在此方法中，从起始的0.5g L-Trp只得到了0.2g 3-吲哚-丙酮酸，而且产率较低，为40％。而且，在此方法中，诸如固定化酶和通过离子交换树脂进行纯化等步骤是复杂的，而且还必须收集或再循环未反应的L-Trp，因此成本较高。

关于源自微生物的L-氨基酸氧化酶，John A.Duerre等粗略地纯化了源自雷氏变形菌(Proteus rettgeri)的L-氨基酸氧化酶(脱氨酶)，并通过检测氧消耗量的活性测量方法检测到对L-Trp的氧化活性(参见Journal of Bacteriology，1975，第121卷，第2期，第656-663页[非专利文件1])。通过检测氧消耗量的活性测量方法，Furuyama等证实了源自假单胞菌属菌种(Pseudomonas sp.)P-501的L-苯丙氨酸氧化酶也作用于L-Trp(参见Noda Institute for ScientificResearch，JP Sho-57-146573-A[专利文件9])。

然而，在任何这些方法中，通过测量色氨酸消耗量、氧消耗量或过氧化物生成量来检测氧化酶活性，而且没有直接对吲哚-丙酮酸定量。这似乎是因为3-吲哚-丙酮酸被以氨基酸氧化酶进行的反应生成的过氧化氢分解成吲哚乙酸。另一方面，没有使用微生物细胞或经处理的微生物细胞来生产3-吲哚-丙酮酸的例子，而且微生物如何代谢色氨酸和微生物生成什么代谢物是未知的。

国际公开No.03/056026小册子(专利文件10)公开了具有氧化酶活性且属于无色杆菌属(Achromobacter)、变形菌属(Proteus)、摩根氏菌属(Morganella)、假单胞菌属(Pseudomonas)和脉孢菌属(Neurospora)的微生物。然而，在大规模工业生产3-吲哚-丙酮酸时，仅仅通过微生物细胞反应来生产3-吲哚-丙酮酸受到限制。

而且，在使用氨基转移酶的方法和使用源自蛇毒的L-氨基酸氧化酶的方法等上述公众已知的技术中，反应产率较低，副产物酮酸或未反应的L-色氨酸剩余并混杂在反应液中。这样，就需要层析分离步骤来收集3-吲哚-丙酮酸，因此操作复杂，而且成本高昂。

在上述情形下，需要开发便宜而方便地生产3-吲哚-丙酮酸的方法。

专利文件1：JPSho-62-501912-A

专利文件2：国际公开87/00169小册子

专利文件3：欧洲专利申请公开No.421946

专利文件4：东德专利DD 297190

专利文件5：JP Sho-59-95894-A

专利文件6：国际公开No.WO2003/091396小册子

专利文件7：美国专利申请公开No.2005/0282260

专利文件8：美国专利No.5,002,963

专利文件9：JP Sho-57-146573-A

专利文件10：国际公开No.03/056026小册子

非专利文件1：Journal of Bacteriology，1975，第121卷，第2期，656-663页。

发明内容

本发明要解决的技术问题

3-吲哚-丙酮酸作为多种药物和饮料和食物(特别是甜味剂)的合成中间体是极其有用的。本发明的一个目的是提供用于实现生成3-吲哚-丙酮酸的便宜而简单的方法。

解决技术问题的手段

作为依据上述情形进行广泛研究的结果，本发明人发现，通过从具有氧化酶活性的微生物克隆新氧化酶基因来构建转化体，并在该转化体的存在下使色氨酸发生反应，可生成且能够收集3-吲哚-丙酮酸，而且优选的是，通过将转化体构建成高度表达该基因的微生物菌株，进一步增强该活性(reactivity)。本发明人进一步发现，通过在存在培养物(该培养物是通过将该转化体进行高密度培养而获得的)或经处理的培养物的条件下使色氨酸发生反应，可以较高产率获得3-吲哚-丙酮酸，从而完成了本发明。

因而，本发明提供了下述各发明。

[1].一种选自由如下(a)至(e)组成的组的多核苷酸：

(a)编码具有氨基酸序列SEQ ID NO：2的蛋白质的多核苷酸；

(b)编码具有在氨基酸序列SEQ ID NO：2中取代、缺失和/或插入一个或数个氨基酸而得到的氨基酸序列且具有氧化酶活性的蛋白质的多核苷酸；

(c)编码具有与氨基酸序列SEQ ID NO：2有90％或更高的同源性且具有氧化酶活性的蛋白质的多核苷酸；

(d)具有核苷酸序列SEQ ID NO：1中核苷酸编号第61-1476位的核苷酸序列的多核苷酸；

(e)与核苷酸序列SEQ ID NO：1中核苷酸编号第61-1476位的核苷酸序列的互补核苷酸序列或与能够从所述序列制备的探针在严格条件下杂交，且编码具有氧化酶活性的蛋白质的多核苷酸。

[2].根据上述[1]的多核苷酸，其中所述严格条件是以对应于1×SSC和0.1％SDS的盐浓度于60℃进行清洗的条件。

[3].一种重组多核苷酸，其具有根据上述[1]或[2]的多核苷酸。

[4].一种转化体，其中导入了根据上述[3]的重组多核苷酸。

[5].一种生产氧化酶的方法，其特征在于在培养基中培养根据上述[4]的转化体，从而在所述培养基和/或所述转化体中积累所述氧化酶。

[6].一种生产3-吲哚-丙酮酸的方法，包括在根据上述[4]的转化体和/或其培养物的存在下将色氨酸转变成3-吲哚-丙酮酸的步骤。

[7].根据上述[6]的生产3-吲哚-丙酮酸的方法，其中向将色氨酸转变成3-吲哚-丙酮酸的反应体系中添加超氧化物歧化酶。

[8].根据上述[6]的生产3-吲哚-丙酮酸的方法，其中向将色氨酸转变成3-吲哚-丙酮酸的反应体系中添加表达超氧化物歧化酶的转化体和/或其培养物。

[9].根据上述[8]的生产3-吲哚-丙酮酸的方法，其中所述培养物是通过破裂表达所述超氧化物歧化酶的所述转化体的细胞膜获得的。

除非本文中另有说明，序列号指序列表中记载的序列号。

发明效果

依照本发明，提供了编码具有氧化酶活性的蛋白质的多核苷酸。在利用这样的多核苷酸时，能通过利用色氨酸以高产率方便地生成3-吲哚-丙酮酸(其是作为甜味剂有用的monatin等的原料)，而且这在工业上是有用的，特别是在食品领域。

实施本发明的最佳方式

1.依照本发明的多核苷酸

第一，本发明提供了编码具有氧化酶活性的蛋白质的多核苷酸。

在本发明中，氧化酶指催化底物(如氨基酸)的氧化脱氨的酶，而具有氧化酶活性指具有此类氧化酶的酶活性。作为此类反应的代表例，可以显示将色氨酸转变成3-吲哚-丙酮酸的反应(例如可以包括下文反应式5所示反应)。氨基酸(如色氨酸)包括L型、D型、及D和L型中任一种，但是通常指L型。

(反应式5)

在本发明中，优选的是，所述氧化酶催化上述反应且具有过氧化氢酶活性。过氧化氢酶活性指催化过氧化氢分解反应，例如催化下文反应式6所示反应的活性。

(反应式6)

本发明的多核苷酸编码具有此类氧化酶活性的蛋白质，而且它的代表例可包括(a)编码具有氨基酸序列SEQ ID NO：2的蛋白质的多核苷酸。

最近本发明人自雷氏普罗威登斯菌(Providencia rettgeri)AJ2770菌株分离出具有氨基酸序列SEQ ID NO：2的蛋白质，并鉴定为具有氧化酶活性的蛋白质的氨基酸序列。将AJ2770菌株于1985年11月28日国际保藏于通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(Ministry of International Trade andIndustry，Agency of Industrial Science and Technology，National Institute ofBioscience and Human-Technology)(现在并入独立行政法人产业技术综合研究所(Administrative Agency，National Institute of Advanced Industrial Scienceand Technology))，并给予保藏号FERM BP-941。AJ2770菌株最初被鉴定为雷氏变形菌，但是作为重新鉴定的结果，它被分类入雷氏普罗威登斯菌(雷氏普罗威登斯菌菌种(Providencia rettgeri sp))。

还可以自雷氏变形菌IFO13501菌株分离出具有上文反应式5所示氧化酶活性的蛋白质。IFO13501菌株保藏于大阪发酵研究所(Institute forFermentation Osaka)(17-85Jusohonmachi 2-chome，Yodogawa-ku，大阪，日本)，但是自2002年6月30日起它的业务已经转移至生物技术部(DOB)国立技术和评价研究所(NITE)中的NITE生物资源中心(NBRC)，而且提及上述IFO编号可以自NBRC得到该微生物。

本发明的多核苷酸包括编码与具有氨基酸序列SEQ ID NO：2的蛋白质基本上相同的蛋白质的多核苷酸。具体而言，可以包括下述多核苷酸(b)和(c)：

(b)编码具有如下氨基酸序列且具有氧化酶活性的蛋白质的多核苷酸，该氨基酸序列在氨基酸序列SEQ ID NO：2中取代、缺失和/或插入一个或数个氨基酸而得到的；和

(c)编码具有如下氨基酸序列且具有氧化酶活性的蛋白质的多核苷酸，该氨基酸序列与氨基酸序列SEQ ID NO：2具有90％或更高同源性。

多核苷酸(b)中的“数个氨基酸”随蛋白质三维结构中氨基酸残基的位置和类型而变化，在具有该氨基酸残基的蛋白质的三维结构和活性未被显著削弱的范围中，且具体是优选2-140个、更优选2-95个、更优选2-50个、更优选2-30个、和仍更优选2-10个氨基酸残基。具有一个或数个氨基酸的突变的序列可以与没有突变的序列具有70％或更高、优选80％或更高、更优选90％或更高、仍更优选95％或更高、和仍更优选98％或更高同源性。本文所用同源性是代表两种或更多种序列间序列匹配水平的概念。作为一种评估同源性的简单方法，两种序列中较长氨基酸序列全长中的氨基酸残基数目构成分母，要比较的两种序列中互相对应的匹配氨基酸残基的数目构成分子，计算此分数并乘以100，得出以数值表述的水平。可以依照生物信息学的逻辑极为详细地计算同源性，而且已经开发了多种软件来比较多种序列中的相似性。用于计算同源性的软件的例子可以包括BLAST。

在多核苷酸(c)中，与氨基酸序列SEQ ID NO：2的同源性是优选70％或更高、更优选80％或更高、更优选90％或更高、更优选95％或更高、和仍更优选98％或更高。

多核苷酸(b)或多核苷酸(c)必须具有氧化酶活性。希望由所述多核苷酸编码的酶保留以没有突变的状态具有氨基酸序列SEQ ID NO：2的蛋白质的约一半或更多、更优选80％或更多、和仍更优选90％或更多的酶活性，特别是在30℃pH8的条件下。例如，希望在30℃pH8的条件下保留具有氨基酸序列SEQ ID NO：2的蛋白质的约一半或更多、更优选80％或更多、和仍更优选90％或更多的酶活性。

多核苷酸(b)中所示氨基酸突变是如下获得的，例如先设计通过位点特异性诱变修饰的氨基酸序列，使得氨基酸序列SEQ ID NO：2中一定位置处的氨基酸残基被取代、缺失和/或插入，并表达与此氨基酸序列对应的核苷酸序列。

多核苷酸(c)中所示氨基酸突变是如下获得的，例如先设计通过位点特异性诱变修饰的氨基酸序列，使得氨基酸序列SEQ ID NO：2的一定区域中的氨基酸序列与氨基酸序列SEQ ID NO：2具有90％或更高同源性，并表达与此氨基酸序列对应的核苷酸序列。

如上所述核苷酸取代、缺失和/或插入包括天然存在的突变，如依赖微生物物种和菌株的差异。通过在适宜细胞中表达编码具有如上所述突变的氨基酸的多核苷酸并检验表达产物的酶活性，来获得与具有氨基酸序列SEQ IDNO：2的蛋白质基本上相同的蛋白质。

由于上述多核苷酸(a)至(c)中密码子的简并性，可以存在限定每一种氨基酸序列的多种核苷酸序列。多核苷酸(a)至(c)的具体例子的代表可以包括下述多核苷酸(d)：

(d)具有核苷酸序列SEQ ID NO：1中核苷酸编号第61-1476位的核苷酸序列的多核苷酸。

已经自雷氏普罗威登斯菌AJ2770菌株分离出由核苷酸序列SEQ ID NO：1组成的多核苷酸。由SEQ ID NO：1中核苷酸编号第61-1476位的核苷酸序列组成的多核苷酸是编码序列(CDS)的区域，而且由此CDS区域编码的氨基酸序列显示于SEQ ID NO：2。

可以依照Molecular Cloning，第2版，Cold Spring Harbor Press(1989)或其它参考文献中的记载实施下文所述多种基因重组技术。

可以自具有氧化酶活性的微生物，优选具有作用于色氨酸的氨基酸氧化酶活性和过氧化氢酶活性的微生物获得本发明的多核苷酸(d)。例如，可以通过PCR(聚合酶链式反应，参见White，T.J.等；Trends Genet.，5，185，1989)或杂交自雷氏普罗威登斯菌染色体DNA或DNA文库获得它。可以基于内部氨基酸序列(其是基于自雷氏普罗威登斯菌纯化的氧化酶测定出的)来设计用于PCR的引物。可以基于核苷酸序列SEQ ID NO：1来设计用于杂交的探针和引物，而且可以使用探针来分离它。当使用具有与5’-非翻译区和3’-非翻译区对应的序列的引物作为PCR引物时，能扩增出该酶的全长编码区。具体而言，5’侧引物可包括具有SEQ ID NO：1中第61位核苷酸上游区域的核苷酸序列的引物。3’侧引物可包括具有与SEQ ID NO：1中第1476位核苷酸下游区域的核苷酸序列互补的序列的引物。

可以合成所述引物，例如使用由Applied Biosystems提供的380B型DNA合成仪并使用亚磷酰胺(phosphoamidite)法(参见Tetrahedron Letters，1981，22，1859)根据标准方法进行。可以进行PCR，例如，依照由各制造商的供应商指定的方法使用Gene Amp PCR系统9600(由Perkin Elmer提供)和TaKaRa LAPCR体外克隆试剂盒(由TaKaRa Shuzo Co.，Ltd.提供)进行。

本发明的多核苷酸包括与多核苷酸(d)基本上相同的多核苷酸。像这样的基本上相同的多核苷酸可以包括下述多核苷酸(e)：

(e)在严格条件下与核苷酸序列SEQ ID NO：1中核苷酸编号第61-1476位的核苷酸序列的互补核苷酸序列或与能自所述序列制备的探针杂交且编码具有氧化酶活性的蛋白质的多核苷酸。

本发明中的“严格条件”指如下的条件，其中形成所谓的特异性杂合物，而不形成非特异性杂合物。虽然难以清楚地将此条件量化，其例子可以包括如下的条件，其中一对具有高同源性的多核苷酸，例如具有50％或更高、更优选80％或更高、仍更优选90％或更高、格外优选95％或更高、和仍更优选97％或更高同源性的多核苷酸彼此杂交，而一对具有比上述低的同源性的多核苷酸彼此不杂交，或者普通Southern杂交的清洗条件，即，在相当于1×SSC和0.1％SDS的盐浓度在60℃杂交和优选0.1×SSC和0.1％SDS在60℃杂交。在这样的条件下发生杂交的基因包括在内部序列中存在终止密码子或由于活性中心的突变而丢失活性的那些基因。然而，通过将该基因连接至商业上可得到的载体，在适宜宿主中表达该载体，并通过下文所述方法测量表达产物的酶活性，可容易地去除那些基因。

多核苷酸(e)中的探针由能够自与核苷酸序列SEQ ID NO：1互补的序列制备的序列组成。此类探针可以包含核苷酸序列SEQ ID NO：1的DNA片段作为模板，使用基于核苷酸序列SEQ ID NO：1制备的寡核苷酸作为引物通过PCR来制备。当使用长度为约300bp的DNA片段作为探针时，杂交中的清洗条件可包括用2×SSC和0.1％SDS于50℃清洗。

上述多核苷酸(e)必须具有氧化酶活性。例如，希望的是，在30℃在pH8的条件下，由多核苷酸(e)编码的酶保留由上述多核苷酸(d)编码的氨基酸序列限定的蛋白质的约一半或更多、更优选80％或更多、和仍更优选90％或更多的酶活性。具体而言，希望的是在30℃在pH8的条件下保留由核苷酸序列SEQ ID NO：1核苷酸编号第61-1476位的核苷酸序列编码的蛋白质的约一半或更多、更优选80％或更多、和仍更优选90％或更多的酶活性。

用于获得多核苷酸(e)的方式不受特别限制，例如，可以如下获得多核苷酸(e)：自编码具有突变的酶的多核苷酸或具有所述多核苷酸的细胞分离在严格条件下与由核苷酸序列(所述核苷酸序列与SEQ ID NO：1的CDS互补)组成的多核苷酸或与自该核苷酸序列制备的探针杂交且编码具有氧化酶活性的蛋白质的多核苷酸。

可以依照标准方法基于核苷酸序列SEQ ID NO：1来制备所述探针。可以依照标准方法来实施通过挑取与所用探针杂交的多核苷酸来分离目标多核苷酸的方法。例如，可以如下制备DNA探针：扩增被克隆入质粒或噬菌体载体中的核苷酸序列，用限制酶切出要用作探针的核苷酸序列，并提取它。可以根据目标多核苷酸来控制要切割的位点。

可以通过常规已知的诱变来获得像这样修饰的多核苷酸。诱变的例子包括在体外用羟胺等处理编码所述酶的多核苷酸(例如上述多核苷酸(d))的方法和用常规用于人工诱变的紫外光或诱变剂(如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)或亚硝酸)处理具有编码所述酶的多核苷酸且属于埃希氏菌属的细菌的方法。

2.依照本发明的重组多核苷酸和转化体，及用于生产氧化酶的方法

第二，本发明提供了具有上述本发明多核苷酸的重组多核苷酸，导入有所述重组多核苷酸的转化体，和用于生产氧化酶的方法，其特征在于在培养基中培养所述转化体以在所述培养基和/或所述转化体中积累所述氧化酶。

作为用于表达由所述多核苷酸详明的蛋白质的宿主，可以使用各种原核细胞(包括埃希氏菌属如大肠杆菌和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis))和各种真核细胞(包括啤酒糖酵母/酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、树干毕赤酵母(Pichia stipitis)和米曲霉(Aspergillus oryzae))。

用于将所述多核苷酸导入宿主中的重组多核苷酸可以通过如下来制备：将要导入的所述多核苷酸以由该多核苷酸编码的蛋白质能表达的形式插入与所述宿主的类型对应的载体中。作为用于表达本发明多核苷酸的启动子，若雷氏普罗威登斯菌中该氧化酶基因中固有的启动子在所述宿主细胞中能起作用，则可使用该启动子。如果必要，可以将其它启动子连接至本发明的多核苷酸以在此启动子控制下表达该多核苷酸。

用于将所述重组多核苷酸导入宿主细胞中的转化方法可以包括D.M.Morrison的方法(Methods in Enzymology 68，326，1979)或通过用氯化钙处理接受的微生物细胞来增强多核苷酸通透性的方法(Mandel，M.和Higa，A.，J.Mol.Biol.，53，159，1970)。

在使用重组多核苷酸技术大规模生产蛋白质的场合，一个优选的实施方案可以包括形成该蛋白质的包涵体，其经处理以结合在生成蛋白质的转化体中的蛋白质。此表达生产方法的优点可包括保护目标蛋白质免于被微生物细胞中存在的蛋白酶消化，和易于纯化目标蛋白质，这可以通过破坏微生物细胞和随后的离心来实现。

用蛋白质变性剂使以此方式获得的蛋白质包涵体溶解，然后主要通过清除变性剂来进行活化再生，以转变成正确折叠且有生理学活性的蛋白质。此类方法有许多例子，如人白介素2的活性再生(JP 61-257931A)。

为了自蛋白质包涵体获得活性蛋白质，需要一系列操作，如溶解和活性再生，如此，操作比直接生产活性蛋白质的情况更加复杂。然而，当在微生物细胞中大规模生产影响微生物细胞生长的蛋白质时，通过在微生物细胞中以无活性包涵体的形式积累蛋白质能避免所述影响。

以包涵体形式大规模生产目标蛋白质的方法可以包括在强启动子的控制下单独表达蛋白质的方法和以与已知大量表达的蛋白质的融合蛋白的形式表达目标蛋白质的方法。

下文会更具体地描述用于制备经转化的大肠杆菌及用此生产氧化酶的方法。当在微生物(如大肠杆菌)中生产氧化酶时，可以掺入编码包含前导序列的前体蛋白质的多核苷酸，或者可以掺入编码不含前导序列的成熟蛋白质的多核苷酸作为蛋白质的编码序列。这可以根据要生产的酶的生产条件、形式和使用条件来适当选择。

作为用于表达编码氧化酶的多核苷酸的启动子，可以使用常用于在大肠杆菌中生成异种蛋白质的启动子，它的例子可以包括强启动子，如T7启动子、lac启动子、trp启动子、trc启动子、tac启动子、和λ噬菌体的PR启动子和PL启动子。作为载体，可以使用pUC19、pUC18、pBR322、pHSG299、pHSG298、pHSG399、pHSG398、RSF1010、pMW119、pMW118、pMW219和pMW218。另外，也可以利用用于噬菌体多核苷酸的载体。此外，也可以使用包含启动子且能表达所插入的多核苷酸序列的表达载体。

为了以融合蛋白包涵体的形式生成氧化酶，可以通过将编码其它蛋白质(优选亲水性肽)的基因连接至氧化酶基因的上游或下游来获得融合蛋白包涵体。所述编码其它蛋白质的基因可以是增加融合蛋白积累量和增强变性和复性步骤后融合蛋白溶解度的基因，候选者的例子可以包括T7基因10、β-半乳糖苷酶基因、二氢叶酸还原酶基因、干扰素γ基因、白介素-2基因和凝乳酶原基因。

进行这些基因与编码氧化酶的基因的连接，使得密码子的读码框匹配。这样的连接可以通过在适宜限制酶位点处的连接或通过利用具有适宜序列的合成多核苷酸来进行。

为了提升产量，有时优选将终止子(即，转录终止序列)连接至融合蛋白基因的下游。此终止子可以包括rrnB终止子、T7终止子、fd噬菌体终止子、T4终止子、四环素抗性基因的终止子、大肠杆菌trpA基因的终止子等。

作为将编码氧化酶或氧化酶与其它蛋白质的融合蛋白的基因导入大肠杆菌中的载体，优选所谓的多拷贝类型，并包括具有源自ColE1的复制起点的质粒，如pUC型质粒、pBR322型质粒或其衍生物。如本文中所使用的，“衍生物”指通过核苷酸的取代、缺失和/或插入而修饰的质粒。如本文中所使用的，修饰包括用诱变剂和UV照射进行的诱变，和诸如天然诱变等的修饰。

优选的是，载体具有用于选择转化体的标志物，如氨苄青霉素抗性基因。作为这样的质粒，商业上可得到携带强启动子的表达载体[pUC型(由TaKaRaShuzo Co.，Ltd.提供)、pPROK型(由Clontech提供)、pKK233-2(由Clontech提供)等等]。

重组多核苷酸通过如下获得：将通过连接启动子、编码氧化酶或氧化酶与其它蛋白质的融合蛋白的基因和终止子(在有些情况中是这样的次序)获得的多核苷酸片段连接至载体多核苷酸。

在使用重组多核苷酸转化大肠杆菌细胞并培养大肠杆菌细胞时，表达并生成氧化酶或氧化酶与其它蛋白质的融合蛋白。作为要转化的宿主，可以使用通常用于表达异种基因的菌株，优选大肠杆菌JM109菌株。转化和选择转化体的方法记载于Molecular Cloning，第2版，Cold Spring Harbor Press(1989)或其它参考文献。

在表达融合蛋白时，可以构造融合蛋白，从而能够使用识别氧化酶中不存在的序列(如凝血因子Xa或激肽释放酶(kallikrein)的序列)的限制性蛋白酶自融合蛋白切割氧化酶。

作为生产培养基，可以使用通常用于培养大肠杆菌的培养基，如M9-酪蛋白氨基酸培养基和LB培养基。可以根据载体标志物、启动子、宿主细菌等的类型来适当选择培养条件和生成诱导条件。

可以通过如下方法来回收氧化酶或氧化酶与其它蛋白质的融合蛋白：当氧化酶或氧化酶的融合蛋白在微生物细胞中溶解时，可以收集微生物细胞，然后破坏或裂解微生物细胞以获得粗制酶溶液。如果必要，可以依照普通方法(如沉淀、过滤和柱层析)进一步对氧化酶或其融合蛋白进行纯化。在此情况中，也可使用利用针对氧化酶或融合蛋白的抗体的方法。

在形成蛋白质包涵体的场合，可以用变性剂溶解它。可以将包涵体和微生物细胞一起溶解。然而，考虑到下列纯化工艺，优选在溶解之前取出包涵体，然后溶解包涵体。自微生物细胞回收包涵体可以依照常规的且公知的方法来进行。例如，破坏微生物细胞，并通过离心等回收包涵体。溶解蛋白质包涵体的变性剂可以包括盐酸胍(例如6M，pH5-8)、尿素(例如8M)、等等。

作为通过透析等去除变性剂的结果，蛋白质再生为具有活性。用于透析的透析液可以包括Tris-盐酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、等等。浓度可以是20mM至0.5M，而pH可以是5至8。

优选的是，在再生步骤采用的蛋白质浓度保持在约500μg/ml或更低。为了抑制再生氧化酶的自-交联，优选的是，透析温度保持在5℃或更低。除了此透析法之外，用于去除变性剂的方法可以包括稀释法和超滤法。通过使用任何这些方法，可以预期活性的再生。

3.依照本发明生产3-吲哚-丙酮酸的方法

依照本发明生产3-吲哚-丙酮酸的方法的特征在于具有在存在本发明转化体和/或其培养物的条件下将色氨酸转变成3-吲哚-丙酮酸的步骤。依照本发明的生产方法，能大量地方便地生产氧化酶。如此，还能大量地快速地生产3-吲哚-丙酮酸。

本发明中使用的色氨酸可以是L型、D型、及D和L型中任一种，但是，考虑到易得性和价格，希望采用L型。

上文已经描述了本发明的转化体。转化体的培养物指通过培养转化体得到的培养物。培养可以是液体培养或固体培养，而且培养基的类型不受特别限制。转化体培养物的例子可以包括用于培养的培养基、由培养的转化体生成的物质及其混合物。为了收回酶，可以处理这些培养物，例如用超声、玻璃珠、弗氏细胞破碎器、冻干、裂解酶、有机溶剂或表面活性剂处理。可以通过标准方法来纯化这些经过处理的培养物，如液相层析和硫酸铵分级，而且另外可以包括在角叉菜聚糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶中或固定化在聚醚砜或再生纤维素的膜上。

转化体或其培养物的量可以是引发目标效果的量(有效量)，而且本领域技术人员通过简单的预备实验能容易地确定此有效量。另外，在经过清洗的湿微生物细胞的场合，有效量可以是1-40mg每100ml反应液。

在本发明的生产方法中，当容许上述本发明的转化体培养物作用于色氨酸时，可以使转化体培养物接触色氨酸。例如，生产方法可以包括如下方法，其中在培养基中培养本发明的转化体以在转化体和/或培养基中积累氧化酶，并将色氨酸添加至此培养基，和如下方法，其中将色氨酸添加至事先经过培养以获得氧化酶的转化体培养物。色氨酸的添加是在目标反应不受抑制的范围(例如0.1-10％)内全体、间歇或连续进行的。在添加时，可以以水溶液或浆体的状态添加底物。为了提高溶解度和促进分散，可以将底物与对反应没有影响的有机溶剂或表面活性剂混合。

在本发明的生产方法中，可以适当地确定反应条件。反应pH通常是3-10，优选是5-9。反应温度通常是10-60℃，优选20-40℃。反应时间通常是0.5-120小时，优选0.5-24小时。如果必要，可以进行搅动，而且所述培养可以是静止培养。

通过标准方法来回收所生成的3-吲哚-丙酮酸，而且在必要时可以纯化3-吲哚-丙酮酸。当有必要防止所生成的3-吲哚-丙酮酸在培养后分解时，还可以进行去气处理或去氧处理。

如下文反应式7所示，通过本发明生产方法[反应式7中的步骤(1)]生成的3-吲哚-丙酮酸可用作4-(吲哚-3-基甲基)-4-羟基-谷氨酸{3-(1-氨基-1，3-二羧基-3-羟基-丁烷-4-基)吲哚}[monatin]的起始材料，monatin可用作甜味剂。也就是说，通过3-吲哚-丙酮酸与丙酮酸的醛醇缩合来合成前体酮酸(IHOG)[反应式7中的步骤(2)]，并且在存在酶的条件下IHOG可以在2-位被胺化以合成monatin[反应式7中的步骤(3)]。

(反应式7)

依照本发明生产3-吲哚-丙酮酸的方法的一个优选实施方案可以包括如下实施方案，其中将超氧化物歧化酶(以下有时缩写成SOD)添加至反应体系。根据条件，所生成的3-吲哚-丙酮酸可以被自发氧化以生成超氧化物。所生成的超氧化物分解3-吲哚-丙酮酸，而且在有些情况中自由基反应加速3-吲哚-丙酮酸的分解。如此，通过在反应体系中添加SOD，消除反应体系中的超氧化物，而超氧化物对3-吲哚-丙酮酸的分解能受到抑制。在SOD之外，添加自由基清除剂(如巯基乙醇)也能防止3-吲哚-丙酮酸的分解。

推测在使用SOD时，生成过氧化氢，而过氧化氢能分解3-吲哚-丙酮酸。然而，出乎意料的是，通过添加SOD，反应体系中存在的3-吲哚-丙酮酸的量得到保持，如下文实施例中所证明的。虽然尚不完全清楚它的机制，但是推测超氧化物具有比过氧化氢更强的对于3-吲哚-丙酮酸的分解作用，如此即使在过氧化氢的量略微增加时，通过在反应体系中添加SOD来消除超氧化物，3-吲哚-丙酮酸能稳定地保持在反应体系中。

SOD作为商业上可得到的酶是可得的。可以作为纯化的酶向反应体系添加SOD。可以制备表达SOD的转化体，并且可以向反应体系添加该转化体或其培养物。已经在公开数据库上发表了编码SOD的基因(sod基因)(例如sodA基因、sodB基因和sodC基因)的核苷酸序列。通过参考这些数据库，能扩增编码SOD的核酸片段，而且能使用该核酸片段制备转化体。

在制备转化体时，经转化以表达氨基酸氧化酶的转化体可以被进一步转化以表达SOD，或者，可以分开制备各转化体并使它们在反应体系中共存。当在一个转化体中共表达氨基酸氧化酶和SOD时，可以独立地将编码各蛋白质的核酸片段并入各个质粒，或者可以将两个核酸片段串联并入同一质粒。

在有些情况中，SOD作为在微生物细胞中积累的微生物胞内酶存在。如此，一个优选的实施方案可以包括如下实施方案，其中使SOD自转化体的内部释放。可以通过破裂转化体的膜来释放SOD。例如，可以培养表达SOD的转化体以在转化体中积累足够量的SOD，并且可以破裂转化体的膜以自转化体内部释放在转化体中积累的SOD。通过破裂提供SOD的转化体的膜，能进一步提高SOD与超氧化物接触的概率。结果，可以抑制3-吲哚-丙酮酸分解以提高3-吲哚-丙酮酸的产率。膜的破裂可为破坏转化体的细胞膜。膜的破裂可以包括超声处理和使用溶剂(如甲苯)的细菌裂解等。在使用甲苯破裂膜时，在有些情况中甲苯使氨基酸氧化酶失活。如此，SOD的生成与氨基酸氧化酶的生成及使用它的反应体系是分开的，而且可以分离SOD并将其添加至反应体系。

实施例

实施例1：生成3-吲哚-丙酮酸(IPA)的微生物

配制在1升(pH7.0)中含有3g硫酸铵、1g磷酸二氢钾、3g磷酸氢二钾、10mg硫酸铁、10mg硫酸锰、10g酵母提取物和10g蛋白胨的培养基，将50mL培养基分配到500mL Sakaguchi烧瓶中，然后于120℃灭菌20分钟以用于培养微生物(培养基1)。配制在1升中含有18g常用培养液(usual broth)的斜面琼脂培养基(琼脂20g/L)。接种一满环(loopful)在此斜面琼脂培养基上于30℃培养24小时的微生物并于30℃以120往复/分钟摇动培养16小时。培养后，将微生物细胞离心并制备成湿微生物细胞。

将微生物添加至含有10g/L L-Trp的20mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)中，使得总量50mL中湿微生物细胞的重量为1％(w/v)，然后于30℃实施反应1小时。在添加雷氏普罗威登斯菌的湿微生物细胞后，证实了5.25g/L 3-吲哚-丙酮酸(IPA)的生产。

实施例2：源自雷氏普罗威登斯菌的氨基酸氧化酶(脱氨酶)基因的分离

下文会描述氨基酸氧化酶(脱氨酶)基因的分离。使用雷氏普罗威登斯菌AJ2770菌株作为微生物。使用大肠杆菌JM109菌株作为用于基因分离的宿主，而使用pUC118作为载体。

将雷氏普罗威登斯菌AJ2770菌株在含有18g/L常用培养液的琼脂培养基上于30℃培养24小时。在装有50mL培养基1的500mL Sakaguchi烧瓶中接种一满环微生物细胞，并于30℃摇动培养。

将培养后的培养基(50mL)离心(8,000rpm，4℃，10分钟)，并收集微生物。使用Qiagen Genomic-tip系统(Qiagen)基于其说明书中的方法自此微生物细胞获得染色体DNA。

将自雷氏普罗威登斯菌AJ2770菌株制备的染色体DNA(5μg)用BamHI完全消化。在0.8％琼脂糖凝胶电泳上分离DNA(2kb至10kb)，使用GeneClean II试剂盒(由Funakoshi Corporation提供)纯化，并溶解在10μL TE(Tris-EDTA)中。将10μL TE中的5μL、pUC118 BamHI和BAP(由TaKaRaShuzo Co.，Ltd.提供)混合并使用DNA连接试剂盒第2版(由TaKaRa Shuzo Co.，Ltd.提供)连接。将0.5μL此连接反应液与100μL大肠杆菌JM109感受态细胞(由Toyobo Co.，Ltd.提供)混合以转化大肠杆菌。将所得转化体施加在适于培养大肠杆菌的固体培养基上以制备染色体DNA文库。

在96孔板中在TB培养基(1升中24g酵母提取物、12g蛋白胨、4mL甘油、1g磷酸二氢钾和3g磷酸氢二钾，pH7.0)中接种在固体培养基上形成的菌落并于30℃培养过夜。将100μL此微生物培养基添加至100μL含有10g/L L-Trp的20mM Tris-HC1缓冲液(pH8.0)，并于30℃以120往复/分钟摇动反应。收集产生红色的菌株作为具有L-Trp脱氨酶活性的细菌菌株。

关于本发明中所使用的酶的活性单位(氨基酸氧化酶活性)，当含有10g/LL-Trp的20mM Tris-HC1缓冲液(pH8.0)于30℃以120往复/分钟摇动反应时，每分钟转换1微摩尔L-Trp的酶量定义为1个单位(U)。

将已经通过比色法证实了氨基酸氧化酶(脱氨酶)活性的菌株在装有3mL含50mg/L氨苄青霉素的TB培养基的试管中于37℃培养16小时。该菌株每1mL培养基具有2.84U氨基酸氧化酶(脱氨酶)活性。因此，证实了所克隆的基因在大肠杆菌中表达。将此菌株命名为pTB2菌株。在作为对照单独导入有pUC118的转化体中没有检测到活性。

使用QIAprep旋转微量制备试剂盒(250)(由QIAGEN提供)自证实具有氨基酸氧化酶(脱氨酶)活性的上述细菌菌株制备大肠杆菌JM109拥有的质粒，并测定所插入的DNA片段的核苷酸序列。测序反应使用BigDye终止物3.1版循环测序试剂盒(由Applied Biosystems提供)基于其说明书来进行。使用3100遗传分析仪(由Applied Biosystems提供)进行电泳。

结果，由于存在编码与氨基酸氧化酶(脱氨酶)具有同源性的蛋白质的开读框，证实了所克隆的基因是编码氨基酸氧化酶(脱氨酶)的基因。全长氨基酸氧化酶(脱氨酶)基因的核苷酸序列及其相应氨基酸序列显示于SEQ ID NO：1。使用BLASTP程序分析了所获得的开读框的同源性。结果，计算出与源自奇异变形菌(Proteus mirabilis)的氨基酸脱氨酶(gb|AAA86752.1|)的71％同源性和与源自普通变形菌(Proteus vulgaris)的氨基酸脱氨酶(EC 3.5.4.-)的57％同源性。

实施例3：Ps_aad表达菌株的制备

使用SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示寡核苷酸作为引物通过PCR扩增大肠杆菌W3110的染色体DNA上的trp操纵子的启动子区。将所得DNA片段连接至pGEM-Teasy载体(由Promega提供)。用此连接液转化大肠杆菌JM109，并自氨苄青霉素抗性菌株选择具有目标质粒的菌株，在该目标质粒中以与lac启动子的方向相反的方向插入有trp启动子。然后，将通过用EcoO109I/EcoRI处理此质粒获得的、包含trp启动子的DNA片段连接至用EcoO109I/EcoRI处理的pUC19(由TaKaRa提供)。用此连接液转化大肠杆菌JM109，并自氨苄青霉素抗性菌株选择具有目标质粒的菌株。随后，将通过用HindIII/PvuII处理此质粒获得的DNA片段连接至通过用HindIII/HincII处理pKK223-3(由Amersham Pharmacia提供)获得的、包含rrnB终止子的DNA片段。用此连接液转化大肠杆菌JM109，并自氨苄青霉素抗性菌株选择具有目标质粒的菌株。将所得质粒命名为pTrp4。

使用由证实具有氨基酸氧化酶(脱氨酶)活性的上述菌株所具有的质粒作为模板和使用SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示寡核苷酸作为引物通过PCR扩增目标基因。用NdeI/HindIII处理此DNA片段，并将所得DNA片段连接至用NdeI/HindIII处理的pTrp4。用此连接液转化大肠杆菌JM109，并自氨苄青霉素抗性菌株选择具有目标质粒的菌株。将此质粒命名为pTrP4-Ps_aad。

将具有pTrP4-Ps_aad的大肠杆菌JM109在含有50mg/L氨苄青霉素的LB琼脂培养基上于37℃培养16小时。将一满环所获得的微生物细胞接种入装有50mL TB培养基(含有50mg/L氨苄青霉素)的500mL Sakaguchi烧瓶中，并将主培养于37℃实施16小时。由于1mL培养基显示出0.74U氨基酸氧化酶(脱氨酶)活性，因此证实所克隆的基因在大肠杆菌中表达。在作为对照单独导入pTrp4的转化体中没有检测到活性。

实施例4：亲本菌株和转化体中L-Trp氧化活性的评估

将雷氏普罗威登斯菌AJ2770菌株在含有18g/L常用培养液的琼脂培养基上于30℃培养24小时。将一满环此微生物细胞接种入装有50mL培养基1的500mL Sakaguchi烧瓶中，并于30℃摇动培养16小时。所得经过培养的培养基每1mL培养基具有0.69U的L-Trp氧化活性。

将一满环pTB2菌株接种入装有50mL含100mg/L氨苄青霉素的TB培养基的500mL Sakaguchi烧瓶中，并于37℃摇动培养16小时。所得经过培养的培养基每1mL培养基具有3.5U的L-Trp氧化活性。证实了pTB2菌株具有的L-Trp氧化活性为雷氏普罗威登斯菌AJ2770菌株的约5倍高。

实施例5：Trp转变成IPA的反应

将一满环pTB2菌株接种入装有50mL含100mg/L氨苄青霉素的TB培养基的500mL Sakaguchi烧瓶中，并于37℃摇动培养16小时。将25mL所得经过培养的培养基接种入装有500mL含100mg/L氨苄青霉素的TB培养基的5000mL Sakaguchi烧瓶中，并于37℃摇动培养16小时。制备每份含有100mmol/LL-Trp、20mM Tris-HCl和0.0025％消泡剂GD-113-K(由NOF Corporation提供)、pH7.0的反应液(300mL)，使得其中包括120mL所得经过培养的培养基。

使用1升发酵釜(jar fermenter)于30℃以100、200、300或400rpm搅动进行反应。对反应液中含有的IPA定量。证实了IPA达到最高浓度时的浓度和反应时间，100rpm的浓度为74mM(28个小时后)，200rpm的浓度为85mM(11个小时后)，300rpm的浓度为80mM(4个小时后)，而400rpm的浓度为70mM(2个小时后)。

实施例6：IPA的回收

将一满环pTB2菌株接种入装有50mL含100mg/L氨苄青霉素的TB培养基的500mL Sakaguchi烧瓶中，并于37℃摇动培养16小时。将25mL所得经过培养的培养基接种入装有500mL含100mg/L氨苄青霉素的TB培养基的5000mL Sakaguchi烧瓶中，并于37℃摇动培养16小时。制备每份含有100mmol/LL-Trp和0.0025％消泡剂GD-113-K、pH7.0的反应液(300mL)，使得其中包括120mL所得经过培养的培养基。

使用500mL四颈烧瓶于30℃以400rpm搅动进行反应。以300mL/min的流速通入空气。反应5.5小时后，停止通气，并通入氩气。随后，使用1M硫酸将反应液调整至pH4.0，并离心以去除微生物细胞。向所得上清液添加1M硫酸以调整pH至2.0。将上清液于20℃搅动过夜以进行中和结晶。过滤出晶体，用水清洗并在减压下干燥，以产生3.81g IPA晶体，纯度90％。如上所述，可通过便利的方法来回收IPA，而不利用使用离子交换树脂等进行的复杂纯化步骤。

实施例7：超氧化物歧化酶(SOD)或巯基乙醇作为IPA的稳定因子的相加作用的评估

在试管中装入每份含有10mM IPA、10mM Tris-HCl和1％乙腈的溶液(1mL)，并于25℃以150往复/分钟摇动10小时。然后，对溶液中所含有的IPA定量，其降低至2.6mM。

将SOD(1、10和100U/mL)、过氧化氢酶(100U/mL)、抗坏血酸(10mL)、生育酚(10mM)、DTT(1和10mM)、硫酸氢钠(10mM)、巯基乙醇(1和10％)、乙醇(10％)、甲醇(10％)、甘油(10％)、SDS(10mM)、Tween 20(10％)、Triton X-100(10％)、硼酸钠缓冲液(10mM)、Triton(10mM)或硫代硫酸钠(10mM)单独添加至上述IPA溶液，并同样摇动。对每种情况中的IPA定量。结果显示于表1。

表1

实施例8：在添加SOD的条件下Trp转变成IPA的反应

将一满环pTB2菌株接种入装有50mL含100mg/L氨苄青霉素的TB培养基的500mL Sakaguchi烧瓶中，并于37℃摇动培养16小时。制备150mmol/LL-Trp和20mM Tris-HCl、pH7.0的反应液(1mL)，使得其中包括0.4mL所得经过培养的培养基。以100U/mL的终浓度向反应液添加SOD(大肠杆菌-MnSOD，Sigma)。

在试管中装入每份反应液(1mL)，并于25℃以150往复/分钟摇动6小时。在SOD缺失的条件下反应液中生成的IPA的量为61mM，而在SOD存在的条件下反应液中生成的IPA的量为120mM。

实施例9：构建表达SOD的菌株

将大肠杆菌JM109菌株在LB琼脂培养基上于37℃培养16小时。使用此微生物细胞作为模板通过PCR扩增包含sodA基因的DNA片段。sodA基因编码SOD A(Mn型)，而且它的序列已经在公开数据库如ecogene(URL：http://ecogene.org/index.php)上注册为登录号EG10953。使用SD-Nde-sodA-f(SEQ ID NO：7)和sodA-Hind-r(SEQ ID NO：8)作为引物。将所得DNA片段用NdeI和HindIII消化，并连接至类似地用NdeI和HindIII消化的、国际公开文本No.2006/075486小册子中记载的载体pSFN(实施例中的pSFN Sm_Aet，特别参见实施例1、6和12)。用此连接液转化大肠杆菌JM109菌株，并自氨苄青霉素抗性菌株选择具有目标质粒的菌株。将所得质粒命名为pSFN-sodA。

类似地，构建了pSFN-sodB[使用SD-Nde-sodB-f(SEQ ID NO：9)和sodB-Hind-r(SEQ ID NO：10)作为引物]和pSFN-sodC[使用SD-Nde-sodC-f(SEQ ID NO：11)和sodC-Hind-r(SEQ ID NO：12)作为引物]。pSFN-sodB是其中并入了包含sodB基因的DNA片段的质粒。pSFN-sodC是其中并入了包含sodC基因的DNA片段的质粒。sodA基因的表达产物SOD A(Mn型)、sodB基因的表达产物SOD B(Fe型)和SOD C(Cu-Zn型)是同工酶。sodB基因和sodC基因的序列已经在公开数据库如ecogene上分别注册为登录号EG10954和EG13419。

将经NdeI和HindIII消化的pSFN载体连接至通过用NdeI和HindIII消化pTrp4获得的、具有多克隆位点的DNA片段。用此连接液转化大肠杆菌JM109菌株，并自氨苄青霉素抗性菌株选择具有目标质粒的菌株。将所得质粒命名为pSFN-mcs。

实施例10：表达SOD的菌株的SOD活性的测量

将所构建的SOD表达质粒pSFN-sodA导入大肠杆菌JM109菌株中，并将一满环转化体接种入50mL含有100mg/L氨苄青霉素的TB培养基中，并于37℃摇动培养16小时以获得经过培养的培养基。

类似地，获得了携带pSFN-sodB的转化体的经过培养的培养基、携带pSFN-sodC的转化体的经过培养的培养基和携带pSFN-mcs的转化体的经过培养的培养基。

自这些经过培养的培养基收集微生物细胞，并重悬在BugBuster Master混合物(Novagen)中以制备微生物细胞提取液。使用SOD测定法试剂盒-WST(Dojindo)测量所得微生物细胞提取液中的SOD活性，并计算每1mL经过培养的培养基的SOD活性。使用SOD(大肠杆菌-MnSOD，Sigma)作为标准品。将0.01mM CuCl₂添加至表达SOD C的菌株的微生物细胞提取液，并测量SOD活性。

结果，证明了任何表达SOD的菌株都具有比pSFN-mcs菌株高的SOD活性。结果显示于表2。

表2

实施例11：使用表达SOD的菌株将Trp转变成IPA的反应

制备200mmol/L L-Trp和20mM Tris-HCl、pH7.0的反应液(1mL)，使得其中包括0.1mL表达SOD的菌株的经过培养的培养基和0.4mL pTB2菌株的经过培养的培养基。向表达SOD A的菌株的经过培养的培养基添加甲苯(1％)，混合并搅动，然后添加至反应液。类似地，将甲苯(1％)与表达SOD B的菌株的经过培养的培养基混合并搅动，然后添加至反应液。以0.01mM的终浓度向表达SOD C的菌株的经过培养的培养基添加CuCl₂，将它们搅动，然后添加至反应液。还制备不含表达SOD的菌株的经过培养的培养基的反应液和以100U/mL的终浓度添加SOD(大肠杆菌-MnSOD，Sigma)的反应液。

使用试管将每份反应液(1mL)于25℃以140往复/分钟摇动6小时。对所得反应液中所含有的IPA定量，并且证实了在添加用甲苯处理的表达SOD B的菌株的经过培养的培养基时IPA的最高浓度为129mM。结果显示于表3。

表3

序列表

<110>味之素株式会社(AJINOMOTO CO.，INC.)

<120>新的氧化酶基因及使用该基因生产3-吲哚-丙酮酸的方法

<130>PAMA-20475

<150>2007-218955

<151>2007-08-24

<160>12

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>1600

<212>DNA

<213>普罗威登斯菌属菌种(Providencia sp.)

<220>

<223>发明人：高仓康彰(Yasuaki TAKAKURA)

发明人：原诚一(Seiichi HARA)

发明人：田场登志希(Toshiki TABA)

发明人：铃木俊一(Shunichi SUZUKI)

发明人：杉山雅一(Masakazu SUGIYAMA)

发明人：渡部乙比古(Kunihiko WATANABE)

发明人：横关健三(Kenzo YOKOZEKI)

<220>

<221>CDS

<222>(61)..(1476)

<400>1

cataatctca atttgaaatt atttactata taaaaaacaa gattgttatt gaggttatag 60

atg aaa atc tcg aga aga aag cta tta tta ggg gtt ggt gct gct ggt 108

Met Lys Ile Ser Arg Arg Lys Leu Leu Leu Gly Val Gly Ala Ala Gly

1 5 10 15

gtt tta gca ggg ggt gct gcg gtt gtt cct atg atc aat cgt gaa ggt 156

Val Leu Ala Gly Gly Ala Ala Val Val Pro Met Ile Asn Arg Glu Gly

20 25 30

cgt ttt gaa tcg act aaa tca cgt gta cca gct gtt gct ggc aca gaa 204

Arg Phe Glu Ser Thr Lys Ser Arg Val Pro Ala Val Ala Gly Thr Glu

35 40 45

ggc aaa tta cca gag tct gca gat gca gtc atc atc ggt gcc ggc ctt 252

Gly Lys Leu Pro Glu Ser Ala Asp Ala Val Ile Ile Gly Ala Gly Leu

50 55 60

caa ggg atc atg act gca att aac ctt gct gaa aaa ggt ctt aat gtt 300

Gln Gly Ile Met Thr Ala Ile Asn Leu Ala Glu Lys Gly Leu Asn Val

65 70 75 80

gtt atc tgt gaa aaa ggt gtt gtc ggt ggt gag caa tca ggc cgt gca 348

Val Ile Cys Glu Lys Gly Val Val Gly Gly Glu Gln Ser Gly Arg Ala

85 90 95

tat agc caa att atc agt tat aag act tcc cca gct att ttc cct tta 396

Tyr Ser Gln Ile Ile Ser Tyr Lys Thr Ser Pro Ala Ile Phe Pro Leu

100 105 110

cac cat tac gga aaa att caa tgg ctt ggc atg aac gaa aaa atc ggt 444

His His Tyr Gly Lys Ile Gln Trp Leu Gly Met Asn Glu Lys Ile Gly

115 120 125

gct gat acc agc tac cgt gtt caa ggc cgt gtt gaa gta cct tca agc 492

Ala Asp Thr Ser Tyr Arg Val Gln Gly Arg Val Glu Val Pro Ser Ser

130 135 140

gaa gaa gat tta gaa att tca aga gcc tgg att aaa tct gca tct gaa 540

Glu Glu Asp Leu Glu Ile Ser Arg Ala Trp Ile Lys Ser Ala Ser Glu

145 150 155 160

aac cca ggt ttc gat aca cct tta cgt acc cgt atg att gaa gga act 588

Asn Pro Gly Phe Asp Thr Pro Leu Arg Thr Arg Met Ile Glu Gly Thr

165 170 175

gaa ctg gcg aat cgt ctg gtt gat gca caa act cca tgg aaa atc ggt 636

Glu Leu Ala Asn Arg Leu Val Asp Ala Gln Thr Pro Trp Lys Ile Gly

180 185 190

gga ttt gaa gaa gac tca ggt agc ctt gac cct gaa gtt gtc aca cca 684

Gly Phe Glu Glu Asp Ser Gly Ser Leu Asp Pro Glu Val Val Thr Pro

195 200 205

acc atg gca aac tac gca aaa tca atc ggt att cgc atc tac acc aat 732

Thr Met Ala Asn Tyr Ala Lys Ser Ile Gly Ile Arg Ile Tyr Thr Asn

210 215 220

tgc gca gta cgt ggt att gaa acg gcg ggc ggc aaa att tct gat gtt 780

Cys Ala Val Arg Gly Ile Glu Thr Ala Gly Gly Lys Ile Ser Asp Val

225 230 235 240

gtc aca gaa aaa ggt gca atc aaa act tct cgt gtt gtt ctg acg ggc 828

Val Thr Glu Lys Gly Ala Ile Lys Thr Ser Arg Val Val Leu Thr Gly

245 250 255

ggt att tgg tcg cgt ctg ttc atg ggt aac tta ggc att gat gtt cca 876

Gly Ile Trp Ser Arg Leu Phe Met Gly Asn Leu Gly Ile Asp Val Pro

260 265 270

aca ctg aac gtt tac cta tca caa cag cgt att act ggc gta cca ggc 924

Thr Leu Asn Val Tyr Leu Ser Gln Gln Arg Ile Thr Gly Val Pro Gly

275 280 285

gca cca aaa ggt aac gtc cac tta cct aac ggt att cac ttc cgt gaa 972

Ala Pro Lys Gly Asn Val His Leu Pro Asn Gly Ile His Phe Arg Glu

290 295 300

caa gct gat ggt acc tac gcc gtt gcg cca cgt atc ttt act agc tct 1020

Gln Ala Asp Gly Thr Tyr Ala Val Ala Pro Arg Ile Phe Thr Ser Ser

305 310 315 320

atc gta aaa gac agc ttc ctg tta gga cca aga ttc cta cac gta tta 1068

Ile Val Lys Asp Ser Phe Leu Leu Gly Pro Arg Phe Leu His Val Leu

325 330 335

ggc ggc ggg gaa tta cca tta gag ttc tct ctt ggt aaa gat tta ttc 1116

Gly Gly Gly Glu Leu Pro Leu Glu Phe Ser Leu Gly Lys Asp Leu Phe

340 345 350

aac tcc ttc atg atg gca acg tct tgg aac tta gac gag aaa aca cct 1164

Asn Ser Phe Met Met Ala Thr Ser Trp Asn Leu Asp Glu Lys Thr Pro

355 360 365

ttt gaa gag ttc cgt acc gca act aat aca cca aac aac gaa cac tta 1212

Phe Glu Glu Phe Arg Thr Ala Thr Asn Thr Pro Asn Asn Glu His Leu

370 375 380

gat ggc gtt ctg gaa aga ctg aga aaa gaa ttc cca gta ttt aaa gag 1260

Asp Gly Val Leu Glu Arg Leu Arg Lys Glu Phe Pro Val Phe Lys Glu

385 390 395 400

tct aaa gtg gtt gaa cgt tgg ggt ggt acc gtt gca cca acg gat gat 1308

Ser Lys Val Val Glu Arg Trp Gly Gly Thr Val Ala Pro Thr Asp Asp

405 410 415

gaa att cca att att tca aca atc gag cag tat cca gga cta gtc atc 1356

Glu Ile Pro Ile Ile Ser Thr Ile Glu Gln Tyr Pro Gly Leu Val Ile

420 425 430

aac acc gcc aca ggc tgg ggt atg acg gaa agc cct gca tct ggt cga 1404

Asn Thr Ala Thr Gly Trp Gly Met Thr Glu Ser Pro Ala Ser Gly Arg

435 440 445

tta acg gca gaa ttg tta atg ggc gaa aca cca ttt att gat cct acg 1452

Leu Thr Ala Glu Leu Leu Met Gly Glu Thr Pro Phe Ile Asp Pro Thr

450 455 460

ccg tat aaa ctt tcc cgt ttt agc taaaaaacag gaaaaaaagc gatttttact 1506

Pro Tyr Lys Leu Ser Arg Phe Ser

465 470

gtggatctat tagcgaatag tttaaagtta catgaaagtt taatttttga taaaactaat 1566

agatcctatt tactttgata atgttaagga gttt 1600

<210>2

<211>472

<212>PRT

<213>普罗威登斯菌属菌种(Providencia sp.)

<400>2

Met Lys Ile Ser Arg Arg Lys Leu Leu Leu Gly Val Gly Ala Ala Gly

1 5 10 15

Val Leu Ala Gly Gly Ala Ala Val Val Pro Met Ile Asn Arg Glu Gly

20 25 30

Arg Phe Glu Ser Thr Lys Ser Arg Val Pro Ala Val Ala Gly Thr Glu

35 40 45

Gly Lys Leu Pro Glu Ser Ala Asp Ala Val Ile Ile Gly Ala Gly Leu

50 55 60

Gln Gly Ile Met Thr Ala Ile Asn Leu Ala Glu Lys Gly Leu Asn Val

65 70 75 80

Val Ile Cys Glu Lys Gly Val Val Gly Gly Glu Gln Ser Gly Arg Ala

85 90 95

Tyr Ser Gln Ile Ile Ser Tyr Lys Thr Ser Pro Ala Ile Phe Pro Leu

100 105 110

His His Tyr Gly Lys Ile Gln Trp Leu Gly Met Asn Glu Lys Ile Gly

115 120 125

Ala Asp Thr Ser Tyr Arg Val Gln Gly Arg Val Glu Val Pro Ser Ser

130 135 140

Glu Glu Asp Leu Glu Ile Ser Arg Ala Trp Ile Lys Ser Ala Ser Glu

145 150 155 160

Asn Pro Gly Phe Asp Thr Pro Leu Arg Thr Arg Met Ile Glu Gly Thr

165 170 175

Glu Leu Ala Asn Arg Leu Val Asp Ala Gln Thr Pro Trp Lys Ile Gly

180 185 190

Gly Phe Glu Glu Asp Ser Gly Ser Leu Asp Pro Glu Val Val Thr Pro

195 200 205

Thr Met Ala Asn Tyr Ala Lys Ser Ile Gly Ile Arg Ile Tyr Thr Asn

210 215 220

Cys Ala Val Arg Gly Ile Glu Thr Ala Gly Gly Lys Ile Ser Asp Val

225 230 235 240

Val Thr Glu Lys Gly Ala Ile Lys Thr Ser Arg Val Val Leu Thr Gly

245 250 255

Gly Ile Trp Ser Arg Leu Phe Met Gly Asn Leu Gly Ile Asp Val Pro

260 265 270

Thr Leu Asn Val Tyr Leu Ser Gln Gln Arg Ile Thr Gly Val Pro Gly

275 280 285

Ala Pro Lys Gly Asn Val His Leu Pro Asn Gly Ile His Phe Arg Glu

290 295 300

Gln Ala Asp Gly Thr Tyr Ala Val Ala Pro Arg Ile Phe Thr Ser Ser

305 3l0 315 320

Ile Val Lys Asp Ser Phe Leu Leu Gly Pro Arg Phe Leu His Val Leu

325 330 335

Gly Gly Gly Glu Leu Pro Leu Glu Phe Ser Leu Gly Lys Asp Leu Phe

340 345 350

Asn Ser Phe Met Met Ala Thr Ser Trp Asn Leu Asp Glu Lys Thr Pro

355 360 365

Phe Glu Glu Phe Arg Thr Ala Thr Asn Thr Pro Asn Asn Glu His Leu

370 375 380

Asp Gly Val Leu Glu Arg Leu Arg Lys Glu Phe Pro Val Phe Lys Glu

385 390 395 400

Ser Lys Val Val Glu Arg Trp Gly Gly Thr Val Ala Pro Thr Asp Asp

405 410 415

Glu Ile Pro Ile Ile Ser Thr Ile Glu Gln Tyr Pro Gly Leu Val Ile

420 425 430

Asn Thr Ala Thr Gly Trp Gly Met Thr Glu Ser Pro Ala Ser Gly Arg

435 440 445

Leu Thr Ala Glu Leu Leu Met Gly Glu Thr Pro Phe Ile Asp Pro Thr

450 455 460

Pro Tyr Lys Leu Ser Arg Phe Ser

465 470

<210>3

<211>40

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>3

gtatcacgag gccctagctg tggtgtcatg gtcggtgatc 40

<210>4

<211>40

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>4

ttcggggatt ccatatgata ccctttttac gtgaacttgc 40

<210>5

<211>32

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>5

gggaattcca tatgctaccc atacttaata at 32

<210>6

<211>33

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>6

cccaagcttt tagctaaaac gggaaagttt ata 33

<210>7

<211>50

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物

<400>7

tataacaccg taaggaggaa tgcatatgag ctataccctg ccatccctgc 50

<210>8

<211>34

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物

<400>8

agcccaagct tattttttcg ccgcaaaacg tgcc 34

<210>9

<211>54

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物

<400>9

aacaccgtaa ggaggaatgc atatgtcatt cgaattacct gcactaccgt atgc 54

<210>10

<211>34

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物

<400>10

agcccaagct tatgcagcga gatttttcgc tacg 34

<210>11

<211>50

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物

<400>11

tataacaccg taaggaggaa tgcatatgaa acgttttagt ctggctattc 50

<210>12

<211>34

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物

<400>12

agcccaagct tacttaatta caccacaggc atag 34

Claims

1.选自如下(a)～(b)的多核苷酸：

(a)编码由SEQ ID NO：2所示氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸；

(b)由SEQ ID NO：1所示核苷酸序列中核苷酸编号第61-1476位的核苷酸序列组成的多核苷酸。

2.一种重组多核苷酸，其具有如权利要求1所述的多核苷酸。

3.一种转化体，其中导入了如权利要求2所述的重组多核苷酸。

4.一种生产氧化酶的方法，其包括在培养基中培养如权利要求3所述的转化体，从而在该培养基和/或转化体中积累氧化酶。

5.一种生产3-吲哚-丙酮酸的方法，其包括在包含如权利要求3所述的转化体和/或其培养物的反应体系中将色氨酸转变成3-吲哚-丙酮酸。

6.如权利要求5所述的生产3-吲哚-丙酮酸的方法，其中所述反应体系还包含超氧化物歧化酶。

7.如权利要求5所述的生产3-吲哚-丙酮酸的方法，其中所述反应体系还包含表达超氧化物歧化酶的转化体和/或其培养物。

8.如权利要求7所述的生产3-吲哚-丙酮酸的方法，其中所述表达超氧化物歧化酶的转化体的培养物是通过破裂表达所述超氧化物歧化酶的所述转化体的细胞膜而获得的。