CN116497010A - G-7-adca合成酶及其在制备头孢烷酸类化合物中的应用 - Google Patents

G-7-adca合成酶及其在制备头孢烷酸类化合物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明通过计算机辅助设计获得一系列具有扩环活性的新型G‑7‑ADCA合成酶（突变体），并通过实验验证，获得提高了对PenG催化活性的G‑7‑ADCA合成酶。本发明的G‑7‑ADCA合成酶对于底物PenG具有比野生型扩环酶高出多倍的扩环酶活性，具有较大的应用价值。

Description

G-7-ADCA合成酶及其在制备头孢烷酸类化合物中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及系列新的合成酶在合成G-7-ADCA中的应用。
背景技术
头孢菌素是β-内酰胺类抗生素的重要组成部分，具有耐药性高、对β-内酰胺酶稳定、毒副作用小等优点，对多种细菌、病毒感染具有良好疗效，在临床领域得到广泛应用。7-氨基-3-脱乙酰氧基头孢烷酸(7-ADCA)是重要的头孢菌素类抗生素合成母核，可用于合成头孢羟氨、头孢拉定、头孢克罗等药物，而G-7-ADCA又是合成7-ADCA的主要原料，市场需求量较大。
目前，以G-7-ADCA为中间体合成7-ADCA主要有三种方法：化学酶法、发酵法和全酶法。化学酶法制备7-ADCA以青霉素G(PenG)为原料，通过过氧乙酸将其氧化为青霉素G亚砜，然后扩环重排产生G-7-ADCA，最后在青霉素酰化酶的作用下脱去侧链生成7-ADCA。此工艺在实际生产中存在众多不足：①氧化过程所用的氧化剂为40％的过氧乙酸，成本高、危险性大、产生危害环境的酸性废水；②扩环反应所用的酯化剂BSU严重过量，导致生产成本高；③产品7-ADCA质量不稳定，影响7-ADCA的纯度及溶解度，从而影响产品的纯度。
在CN1075336A中公开，通过发酵法制备7-ADCA，将来源于StreptomycesClavuligerus菌株扩环酶(scDAOCS)基因导入到产黄青霉菌(Penicilliumchrysogenum)中，在发酵培养基中添加己二酸，产黄青霉菌利用己二酸产生己二酰-6-APA，进一步通过产黄青霉菌扩环酶，将己二酰-6-APA环扩为己二酰-7-ADCA，然后利用己二酰酰基转移酶裂解己二酰侧链而获得终产物7-ADCA。Alvarez等(Antimicrobial Agents&Chemotherapy,1987,31(11):1675-82)发现在顶头孢霉菌中，以脱乙酰氧头孢菌素C(DAOC)为底物，在D型氨基酸氧化酶(DAO)催化下转化为酮己二酸-7-ADCA，同时产生过氧化氢，进一步通过过氧化氢的氧化生成戊二酰-7-ADCA(GL-7-ADCA)，最后在戊二酰酰化酶催化下生成7-ADCA。由此可见，发酵法合成G-7-ADCA工艺步骤多并且存在发酵周期长等问题。
全酶法制备7-ADCA，以PenG为底物在扩环酶作用下扩环合成G-7-ADCA，G-7-ADCA在青霉素酰化酶的催化下发生水解反应合成7-ADCA，其合成路线如图1所示。该过程环保且工艺步骤简单，但扩环酶酶活较低，无法应用到工业生产中。因此，为了提高扩环酶的酶活性，进行了理性和非理性的改造。Hsu等(Applied and Environmental Microbiology,2004,70(10):6257-6263)将8个不同菌属来源的基因进行DNA shuffling，获取FF8突变体，针对底物PenG的活性(kcat/KM)增加了117.8倍，但未测定对PenG的转化率。Ji等(Appliedand Environmental Microbiology,2012,78(21):7809-7812)在前人基础上，通过迭代组合突变，获得C155Y/Y184H/V275I/C281Y/I305M/S261M、C155Y/Y184H/V275I/C281Y/I305M/T213V/M73T以及C155Y/Y184H/V275I/C281Y/I305M/T213V/S261M等组合突变体，活性提高了7-8倍，是目前报道活性最高的突变体。CN1446908A中描述了一种扩环酶，在该专利文献中，提到了将155位半胱氨酸替换为酪氨酸、184位酪氨酸替换为组氨酸、275位缬氨酸替换为异亮氨酸、281位半胱氨酸替换为酪氨酸，通过改变以上一个或多个氨基酸而产生突变扩环酶，并且酶活性有所提高，但酶活性提高依然有限，不能满足工业需求。
目前已经报道，还没有获得针对PenG高活性扩环酶，不能应用到工业生产中。因此，有必要在天然扩环酶序列基础上，设计新颖的G-7-ADCA合成酶，实现PenG到G-7-ADCA的高效生物转化。
发明内容
本发明通过计算机辅助设计获得一系列具有扩环活性的新型G-7-ADCA合成酶(突变体)，并通过实验验证，获得提高了对PenG催化活性的G-7-ADCA合成酶。
因而，本发明提供了SEQ ID No.2至SEQ ID No.21所示序列的G-7-ADCA合成酶，还提供了在SEQ ID No.11的基础上发生了C155Y/Y184H、V275I/C281Y/L305M、C155Y/Y184H/V275I/C281Y/L305M、C155Y/Y184H、V275I/C281Y/I305M、或C155Y/Y184H/V275I/C281Y/I305M的突变的G-7-ADCA合成酶；
或者在SEQ ID No.19的基础上发生了C155Y/Y184H、V275I/C281Y/I305M、C155Y/Y184H/V275I/C281Y/I305M的突变的G-7-ADCA合成酶。
进而本发明也提供编码上述G-7-ADCA合成酶的核酸分子。所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA、hnRNA或tRNA等。更优选地，所述核酸分子具体为编码上述G-7-ADCA合成酶的基因。
更进一步，本发明提供含上述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。所述重组载体可为重组表达载体，也可为重组克隆载体。
本发明还提供所述G-7-ADCA合成酶在催化PenG扩环生成G-7-ADCA提高PenG转化率中的应用。
本发明还一种制备G-7-ADCA的方法，具体包括如下步骤：所述G-7-ADCA合成酶催化PenG进行扩环反应，生成G-7-ADCA。任选地，在所述反应还包括制备所述G-7-ADCA合成酶的步骤，优选地通过重组表达的方式制备所述G-7-ADCA合成酶。可以将PenG与本发明的G-7-ADCA合成酶及其突变体相接触来产生G-7-ADCA，其中G-7-ADCA合成酶及其突变体可以培养液的形式或组合物(其中含有纯化的游离酶、酶的固定化、新型G-7-ADCA合成酶全细胞、全细胞的固定化)的形式使用。优选地，G-7-ADCA合成酶与PenG之间的接触反应可以在溶液中进行。所述催化反应还包括Fe2+和α-酮戊二酸。
优选的，反应体系中PenG的浓度为1-500mM，加入G-7-ADCA合成酶的量为0.1-100U/mL，反应混合液在pH 6到8之间，反应时间0.1至24h，反应温度4至40℃，可以通过常规方法将以上制备的G-7-ADCA从反应混合物中分离和纯化出来。
此外，可以在体内将本发明G-7-ADCA合成酶与PenG相接触，以产生G-7-ADCA。具体而言，可以通过以下步骤产生G-7-ADCA，将所述G-7-ADCA合成酶编码基因或者其功能等效的衍生物导入具有所述G-7-ADCA合成酶活性的微生物(如大肠杆菌，枯草芽孢杆菌，酵母)中；在恰当的条件下，合适的培养基中培养转化体，自发地通过G-7-ADCA合成酶在所述转化体中生物合成G-7-ADCA。
本发明也提供一种用于生产G-7-ADCA的固定化细胞，通过下述方式获得：将发酵的含有所述核酸分子的重组细胞进行收集离心，重悬菌体使其OD600为10到150，添加2-8％的硅藻土，添加0.1-2％w/v絮凝剂，添加0.07-2％v/v交联剂，交联2-3h，获得固定化细胞。
本发明提供的G-7-ADCA合成酶对于底物例如PenG具有比野生型扩环酶高出多倍的扩环活性，具体较大的应用价值。
附图说明
图1全酶法制备G-7-ADCA反应流程图。
图2为计算机设计技术用到的序列比对信息。
图3利用计算模拟技术产生序列酶活信息。
图4G-7-ADCA和PenG液相检测图谱。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1：基于数据挖掘技术产生新酶
1.基因获得以及载体构建
以scDAOCS序列为模板，使用BLAST工具通过序列比对，从(National Center forBiotechnology Information,NCBI)数据库中挖掘潜在序列，根据不同的物种来源以及序列相似性(50％-85％)，共选取23条序列(表1)，并将23条序列进行多序列比对，保留序列最保守的氨基酸，基于此产生一条共有序列(E632，SEQ ID No.2)。经过密码子优化后，利用全基因合成的方式获得全长基因，并将其构建到pET-24a表达载体上。
表1.利用BLAST工具挖掘的23条序列
2.共有序列E632基因表达
将含有E632基因序列的pET-24a表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)中，菌液均匀的涂布在含有50μg/mL卡那霉素抗性的LB平板上，37℃恒温条件下培养14h后长出单菌落，即为含有E632基因工程菌株。同时设置阴性对照组(pET-24a的空载体)。挑取上述单菌落，接种到含有50μg/mL卡那霉素的5mL LB培养基中，37℃、220rpm培养8h；按照1％的接种量转接到含有50μg/mL卡那霉素的100mLTB培养基中，在37℃下培养至OD600＝0.6时，加入0.1mMIPTG诱导16h，获得表达E632酶的重组菌体。
3.E632酶催化合成G-7-ADCA
收集上述菌体到50mL离心管，8000rpm离心10min，弃上清，获取菌体，称取湿菌重；添加磷酸盐缓冲液(50mM pH 7.4)至菌浓度为0.1g/mL。取1mL上述菌体重悬液分别添加5mMPenG、6mMα-酮戊二酸、0.4mM抗坏血酸、50μg/mL FeSO4，30℃反应2h。添加1mL甲醇终止反应，1200rpm离心3min，取上清进行液相色谱(HPLC)检测G-7-ADCA的含量。
HPLC检测条件为：
色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18 Stable Bond Analytical 4.6×250mm；流动相：20mM pH 3.0磷酸钠缓冲液：甲醇＝55:45；流速：1mL/min；检测波长215nm。
所用标准品为G-7-ADCA(山东鲁抗药业股份有限公司)，利用G-7-ADCA制备标准曲线。液相检测结束后根据标准曲线计算摩尔转化率，转化率(％)＝100×P/(5×10-3)，P为液相检测出G-7-ADCA的摩尔浓度(mol/L)。
表2共有序列E632的催化效率
由表2可知，E632酶对底物PenG具有催化活性。
实施例2：基于结构片段重组技术产生新酶
1.新酶基因获得以及载体构建
利用结构片段重组技术，获得19条G-7-ADCA合成酶序列(编号为从E719至E737)。经过密码子优化后，利用全基因合成的方式获得全长基因，并将其构建到pET-24a表达载体上。
具体过程如下：利用结构片段重组技术，大量产生自然界酶家族中的二级结构片段，并快速重组成全新的嵌合酶，通过打分函数评估3条扩环酶亲本序列中哪些片段可以进行互换，而不对蛋白的整体结构产生严重破坏作用，3条亲本序列的比对如图2所示，其中包括实施例1中所产生的共有序列E632,SEQ ID No.2。利用重组最短路径问题(Recombination as Shortest Path Problem,RASPP)算法共识别出4个最优计算模拟文库，将3条亲本序列分别截断为6、7、8、9个砌块(blocks)，统一根据平均<E>值，选择出序列截断位置集，最后通过视觉观察scDAOCS的三维晶体结构(PDB：1UOB)，最终选择出的交叉位点为[50,126,150,184,237],[50,73,118,150,188,242],[37,50,70,106,179,268,299],[37,59,93,118,136,166,188,237]，4个计算模拟文库分别包括36(729)，37(2187)，38(6561)，39(19683)条重组序列，共29160条序列。由于不可能对所有的重组序列进行合成及表征，所以统一根据平均扰动<E>值及最大突变数<m>值为原则，目的是增加选取序列的多样性，与野生型序列相比，序列相似性降为70％，每个文库分别选取5条进行合成及表征，总共选取了19条序列。经过密码子优化后，利用全基因合成的方式获得全长基因，并将其构建到pET-24a表达载体上。
2.新酶基因表达
按照实施例1方法对上述19条序列的新酶(编号为从E719至E737)基因进行表达。
3.新酶全细胞催化合成G-7-ADCA
按照实施例1方法对上述19个新酶进行催化合成G-7-ADCA。新酶酶活(图3)以及催化PenG合成G-7-ADCA转化率如表3。
1个酶活力性单位(U)：30℃，1min产生1mM的G-7-ADCA。
比酶活(U/mL)：每毫升酶蛋白所具有的酶活力。
表3利用重组技术产生的新型合成酶催化效率
根据表3和图3，19条序列新酶均对底物PenG具有活性，相对于E632而言，活性都得到提高，而以E727及E735酶活性最高。
实施例3：E727以及E735粗酶液催化合成G-7-ADCA
将实施例2中含有E727和E753基因序列的pET24a质粒(pET24a-E727和pET24a-E735)分别转化到大肠杆菌BL21(DE3)，将转化后的大肠杆菌BL21(DE3)菌液均匀的涂布在含有50μg/mL卡那霉素抗性的LB平板上，37℃培养14h后长出单菌落，即为含有E727和E735基因的工程菌株。挑取上述单菌落，接到含有50μg/mL卡那霉素的5mL LB培养基中，37℃培养6h，按1％的接种量接种在含有50μg/mL卡那霉素的200mLTB培养基中，37℃培养3h，添加1mM IPTG 25℃诱导13h。收集菌体，称取湿菌重，添加磷酸缓冲液使菌终浓度为0.25g/mL(每毫升含有湿菌体的重量)，对菌体进行超声破碎，破碎后裂解液12000rpm离心30min，收集上清液。对上清液进行如下反应：
取1mL上清液(粗酶液)分别添加20mMPenG、30mMα-酮戊二酸、0.4mM抗坏血酸、50μg/mL FeSO4，30℃反应2h。添加1mL甲醇终止反应，按照实施例1方法对反应后的样品进行G-7-ADCA和PenG含量的检测，并计算转化率。检测结果见表4，2h转化率达60％以上。
表4 E727和E735粗酶液转化率
实施例4：E727以及E735全细胞催化合成G-7-ADCA
按照实施例3的方式培养菌体，收集菌体，用磷酸缓冲液溶解菌体，调整菌体的OD600为50，取100mL上述菌体，分别添加30mMPenG、45mMα-酮戊二酸、0.4mM抗坏血酸、0.5μg/mL，FeSO430℃反应2h，取1mL上述反应液，12000rpm离心3min，取上清50μL，添加950μL甲醇。按照实施例1方法对反应后的样品进行G-7-ADCA和PenG含量的检测。检测结果见表5。
表5 E727和E735全细胞转化率
实施例5：固定化E727以及E735的全细胞催化合成G-7-ADCA
按照实施3培养菌体，收集菌体，调整OD600＝100，向悬液中添加1％硅藻土，搅拌均匀，随后添加0.5％w/v分子量为10000的聚乙烯亚胺，水溶液在室温下絮凝，然后添加2％v/v戊二醛水溶液下交联2h，获得固定化的细胞。在100ml的反应体系下，分别加入终浓度OD600＝50菌液、30mMPenG、45mMα-酮戊二酸、0.4mM抗坏血酸、50μg/mL FeSO4，补加pH7.4磷酸盐缓冲液到100mL，30℃反应2h，按照实施例1方法对反应后的样品进行G-7-ADCA和PenG含量的检测，固定化E727以及E735的全细胞转化率分别为79％和80％。
实施例6：对E727以及E735酶进行理性改造
1、E727以及E735理性改造
为了获得针对底物PenG活性更高的扩环酶，对E727及E735进行理性改造。将E727和E735分别与SEQ ID No.1序列进行比对。构建如下突变体：E727M2(C155Y/Y184H)、E727M3(V275I/C281Y/L305M)、E727M5(C155Y/Y184H/V275I/C281Y/L305M)、E735M2(C155Y/Y184H)、E735M3(V275I/C281Y/I305M)、E727M5(C155Y/Y184H/V275I/C281Y/I305M)。
2、构建E727以及E735突变体载体
为了构建E727以及E735突变体载体，设计引物见表6：
表6引物列表
(1)构建E727M2(C155Y/Y184H)突变体载体
以质粒pET24a-E727为模板，分别取727M2-F和727M2-R引物对扩增获得片段P1(155-184片段)、以片段P1作为大引物，用KOD-plus DNA聚合酶做MegaPrimer PCR。
第一轮PCR反应体系(50μL)包括：10ng质粒模板，10pmol的引物对，1xKOD plusbuffer，0.2mMdNTP，1.5mM MgSO4，5个单位的KOD-plus DNA聚合酶。
第一轮PCR反应条件为：95℃2min；98℃10s，57℃30s，68℃1min/kbp；30个循环；68℃10min。胶回收片段P1。
第二轮PCR以片段P1作为大引物，用KOD-plus DNA聚合酶做MegaPrimer PCR。
MegaPrimer PCR反应体系(50μL)包括：10ng质粒模板，250ng片段P1，1xKOD plusbuffer，0.2mMdNTP，1.5mM MgSO4，5个单位的KOD-plus DNA聚合酶。
MegaPrimer PCR反应条件为：94℃5min；98℃10s，60℃30s，68℃2min/kbp，25个循环；68℃10min。DpnI消化质粒模板，电转化大肠杆菌BL21(DE3)，挑取单菌落测序鉴定。经测序获得含有C155Y/Y184H突变位点的pET24a-E727M2(C155Y/Y184H)表达载体。
(2)构建E727M3(V275I/C281Y/L305M)突变体载体
以质粒pET24a-E727为模板，分别取727M3-F和727M3-R引物对扩增获得片段P2(275-305片段)、以片段P2作为大引物，用KOD-plus DNA聚合酶做MegaPrimer PCR，获得含有V275I/C281Y/L305M突变位点的pET24a-E727M3(V275I/C281Y/L305M)表达载体。PCR反应体系和反应条件同上。
(3)构建E727M5(C155Y/Y184H/V275I/C281Y/L305M)突变体载体
以质粒pET24a-E727M2(C155Y/Y184H)为模板，分别取727M3-F和727M3-R引物对扩增获得片段P3(155-305片段)、以片段P3作为大引物，用KOD-plus DNA聚合酶做MegaPrimer PCR，获得含有C155Y/Y184H/V275I/C281Y/L305M突变位点的pET24a-E727M3(C155Y/Y184H/V275I/C281Y/L305M)表达载体。PCR反应体系和反应条件同上。
突变体E735M2(C155Y/Y184H)、E735M3(V275I/C281Y/I305M)、E727M5(C155Y/Y184H/V275I/C281Y/I305M)载体的构建方法同上，经测序鉴定，获得了pET24a-E735M2(C155Y/Y184H)、pET24a-E735M3(V275I/C281Y/I305M)以及pET24a-E727M5(C155Y/Y184H/V275I/C281Y/I305M)表达载体。
3、E727和E735突变体基因表达及催化合成G-7-ADCA
按照实施例1的方式表达E727以及E735突变体的基因。
按照实施例1的方式检测E727以及E735突变体催化合成G-7-ADCA。
表7理性改造E727以及E735突变体转化率
由表7可知，与对照E727和E735比较，突变体转化率有不同程度的提高，其中E727M2催化PenG合成G-7-ADCA的转化率最高。
实施例6：E727M2粗酶液催化合成G-7-ADCA
将含有E727M2基因序列的pET24a质粒(pET24a-E727M2)转化到大肠杆菌BL21(DE3)，按照实施例3方法获得粗酶液。对粗酶液进行酶活性验证，在1mL粗酶液中分别添加20mM PenG、30mMα-酮戊二酸、0.4mM抗坏血酸、50μg/mL FeSO4，30℃反应2h。添加1mL甲醇终止反应，12000rpm离心3min。按照实施例1方法对反应后的样品进行G-7-ADCA和PenG检测，并计算转化率。按照实施例1方法对反应后的样品进行G-7-ADCA和PenG检测，2h转化率达95％。
实施例7：E727M2全细胞催化合成G-7-ADCA
按照实施例3的方式培养菌体，收集菌体，用磷酸缓冲液溶解菌体，调整菌体的OD600为50，取100mL上述菌体，分别添加30mM PenG、45mMα-酮戊二酸、0.4mM抗坏血酸、0.5μg/mLFeSO4，30℃反应2h。取1mL上述反应液，12000rpm离心3min，取上清50μL，添加950μL甲醇。按照实施例1方法对反应后的样品进行G-7-ADCA和PenG检测。2h转化率达90％。
实施例8：固定化E727M2全细胞催化合成G-7-ADCA
按照实施例5培养菌体，收集菌体，调整OD600＝100，向悬液中添加1％硅藻土，搅拌均匀，随后添加0.5％w/v分子量为10000的聚乙烯亚胺，水溶液在室温下絮凝，然后添加2％v/v戊二醛水溶液下交联2h，获得固定化的细胞，在100mL的反应体系下，分别加入终浓度OD＝50，分别添加30mM PenG、45mMα-酮戊二酸、0.4mM抗坏血酸、0.5μg/mLFeSO4，30℃反应2h，补加pH7.4磷酸盐缓冲液到100ml，30℃反应2h，通过HPLC检测转化率可达90％。
<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所
<120> G-7-ADCA合成酶及其在制备头孢烷酸类化合物中的应用
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Claims (10)

1.一种G-7-ADCA合成酶，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID No. 2至SEQ ID No. 21任一所示，或者
在SEQ ID No.11的基础上发生了C155Y/Y184H、V275I/C281Y/L305M、C155Y/Y184H/V275I/C281Y/L305M、C155Y/Y184H、V275I/C281Y/I305M、或C155Y/Y184H/V275I/C281Y/I305M的突变；
或者在SEQ ID No.19的基础上发生了C155Y/Y184H、V275I/C281Y/I305M、C155Y/Y184H/V275I/C281Y/I305M的突变。
2.编码如权利要求1所述的G-7-ADCA合成酶的核酸分子；具体地，所述核酸分子是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；或者是RNA，如mRNA、hnRNA或tRNA；更优选地，所述核酸分子具体为编码上述G-7-ADCA合成酶的基因。
3.含有如权利要求2所述的核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌；所述重组载体为重组表达载体或重组克隆载体；优选将转基因细胞系固定化得到固定化细胞。
4.一种用于生产G-7-ADCA的固定化细胞，通过下述方式获得：将发酵的含有如权利要求2所述核酸分子的重组细胞进行收集离心，重悬菌体使其OD600为10到150，添加2-8%的硅藻土，添加0.1-2% w/v絮凝剂，添加0.07-2% v/v交联剂，交联2-3 h，获得固定化细胞。
5.如权利要求1所述的G-7-ADCA合成酶在催化PenG扩环生成G-7-ADCA中的应用。
6.一种制备G-7-ADCA的方法，具体包括如下步骤：将如权利要求1所述的G-7-ADCA合成酶催化PenG进行扩环反应，生成G-7-ADCA；任选地，所述反应还包括制备所述G-7-ADCA合成酶的步骤，优选地通过重组表达的方式制备所述G-7-ADCA合成酶。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，还包括对制备得到的G-7-ADCA从反应的混合物中进行分离和纯化。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，将PenG与所述的G-7-ADCA合成酶相接触来产生G-7-ADCA。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的G-7-ADCA合成酶以培养液的形式或组合物的形式使用，例如以含有纯化的游离酶、酶的固定化、全细胞、全细胞的固定化的形式使用；优选地，G-7-ADCA合成酶与PenG之间的接触反应可以在溶液中进行；
优选的，在反应体系中PenG的浓度为1-500 mM，加入G-7-ADCA合成酶的量为0.1-100U/mL，反应混合液在pH 6到8之间，反应时间0.1至24 h，反应温度4至40℃；进一步的所述催化反应还包括Fe2+和α-酮戊二酸。
10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，在细胞体内实现G-7-ADCA合成酶与PenG相接触，以催化产生G-7-ADCA；具体地，通过以下步骤产生G-7-ADCA，将导入有所述G-7-ADCA合成酶编码基因的重组微生物（如细菌，具体如大肠杆菌，枯草芽孢杆菌；如真菌，具体如酵母）进行培养，在培养基中添加底物PenG，通过生物合成G-7-ADCA。
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