CN107304418B - 青霉素扩环酶突变体、编码该突变体的dna、含有该突变体的试剂盒及其应用 - Google Patents

青霉素扩环酶突变体、编码该突变体的dna、含有该突变体的试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了青霉素扩环酶突变体、编码该突变体的DNA、含有该突变体的试剂盒及其应用。所述青霉素扩环酶突变体的氨基酸序列以序列表中的SEQ ID NO.:2为参考序列，具有位于第42位苏氨酸和第126位谷氨酰胺中的至少一者的突变，所述第42位苏氨酸突变为除其自身以外其他天然氨基酸中的任一者，所述第126位谷氨酰胺突变为除其自身以外其他天然氨基酸中的任一者。本发明的青霉素扩环酶突变体具有提高的催化活性和耐热性，更适于商业和工业应用。

Description

青霉素扩环酶突变体、编码该突变体的DNA、含有该突变体的 试剂盒及其应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体而言，涉及青霉素扩环酶突变体、编码该突变体的DNA、含有该突变体的试剂盒及其应用。
背景技术
β-内酰胺类抗生素是临床使用最多和应用最广的一类抗生素。β-内酰胺环抗生素中最主要的两类是青霉素和头孢类抗生素。青霉素因其高效和低毒而成为临床上应用最广的重要抗生素。但是随着青霉素的大量使用，它的一些不足也暴露出来，如青霉素抗菌谱相对比较窄、容易导致病菌耐药性、对酸不稳定、不能口服等。
头孢菌素和青霉素都具有β-内酰胺特征，两者的不同之处是青霉素的母核由β-内酰胺环和五元噻唑环构成，而头孢菌素的母核则由β-内酰胺环和六元二氢噻嗪环构成。因此，头孢菌素不易被β-内酰胺酶(如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的β-内酰胺酶)降解。而且头孢菌素具有高效、低毒、抗菌谱广、过敏反应少、可以口服、品种多等优点。头孢菌素作为一类广谱半合成抗生素，可分为以7-氨基-3-去乙酰氧基头孢烷酸(7-ADCA)为母核和以7-氨基头孢烷酸(7-ACA)为母核的两大系列。以7-ADCA为母核的系列是青霉素的下游产品。利用7-ADCA可以进一步合成头孢氨苄、头孢拉定等头孢菌素类抗生素药物。
目前，工业上从青霉素G到7-ADCA的合成使用化学法，反应条件苛刻，步骤繁琐，对环境造成污染。而使用青霉素扩环酶使青霉素G扩环从而得到G-7-ADCA(7-苯乙酰基脱乙酰氧基头孢菌素)是更为有效和环保的方法。因此，青霉素扩环酶成为当今工业酶研究中的一大热点。但青霉素扩环酶的天然底物是不易廉价取得的青霉素N。非天然底物青霉素G则可以方便、廉价地获得。所以科学家们利用各种方法对青霉素扩环酶进行改造，以提高它对非天然性底物青霉素G的催化活性。自1976年Kohsaka首先对低等真核生物顶头孢菌的扩环酶进行研究以来，至今扩环酶的研究得到迅速发展。以棒状链霉菌(Streptomycesclavuligerus)为来源的扩环酶由于具有潜在的工业应用价值而得到研究者的极大关注。然而，仍需要对青霉素G的催化活性和耐热性提高的青霉素扩环酶。
发明内容
为解决上述现有技术中所存在的问题，本发明提供了青霉素扩环酶突变体、编码该突变体的DNA、含有该突变体的试剂盒及其应用。
具体而言，本发明提供了：
(1)一种青霉素扩环酶突变体，其特征在于其氨基酸序列以序列表中的SEQ IDNO.:2为参考序列，具有位于第42位苏氨酸和第126位谷氨酰胺中的至少一者的突变，所述第42位苏氨酸突变为除其自身以外其他天然氨基酸中的任一者，所述第126位谷氨酰胺突变为除其自身以外其他天然氨基酸中的任一者。
(2)根据(1)所述的青霉素扩环酶突变体，其特征在于其具有位于第42位苏氨酸的所述突变和位于第126位谷氨酰胺的所述突变。
(3)根据(1)或(2)所述的青霉素扩环酶突变体，其特征在于所述第42位苏氨酸突变为半胱氨酸、或天冬氨酸、或谷氨酸、或蛋氨酸、或脯氨酸、或谷氨酰胺、或精氨酸。
(4)根据(1)或(2)所述的青霉素扩环酶突变体，其特征在于所述第42位苏氨酸突变为天冬氨酸。
(5)根据(1)或(2)所述的青霉素扩环酶突变体，其特征在于所述第126位谷氨酰胺突变为丙氨酸、或苯丙氨酸、或异亮氨酸、或亮氨酸、或蛋氨酸、或天冬酰胺、或色氨酸、或酪氨酸。
(6)根据(1)或(2)所述的青霉素扩环酶突变体，其特征在于所述第126位谷氨酰胺突变为苯丙氨酸。
(7)根据(1)所述的青霉素扩环酶突变体，其特征在于其具有序列表中的SEQ IDNO.:4所示的氨基酸序列，并且其中第42位的Xaa代表半胱氨酸、或天冬氨酸、或谷氨酸、或蛋氨酸、或脯氨酸、或谷氨酰胺、或精氨酸。
(8)根据(1)所述的青霉素扩环酶突变体，其特征在于其具有序列表中的SEQ IDNO.:4所示的氨基酸序列，并且其中第126位的Xaa代表丙氨酸、或苯丙氨酸、或异亮氨酸、或亮氨酸、或蛋氨酸、或天冬酰胺、或色氨酸、或酪氨酸。
(9)根据(1)所述的青霉素扩环酶突变体，其特征在于其具有序列表中的SEQ IDNO.:4所示的氨基酸序列，其中第42位的Xaa代表天冬氨酸，并且第126位的Xaa代表苯丙氨酸。
(10)一种DNA，其含有编码(1)至(9)中任一项所述的青霉素扩环酶突变体的核苷酸序列。
(11)一种表达载体，其含有与启动子有效连接的(10)所述的DNA。
(12)一种宿主细胞，其含有(11)所述的表达载体。
(13)(1)至(9)中任一项所述的青霉素扩环酶突变体在制备7-苯乙酰基脱乙酰氧基头孢菌素中的应用。
(14)根据(13)所述的应用，其中所述青霉素扩环酶突变体以青霉素G为底物。
(15)一种制备7-苯乙酰基脱乙酰氧基头孢菌素的方法，包括将(1)至(9)中任一项所述的青霉素扩环酶突变体与用于制备7-苯乙酰基脱乙酰氧基头孢菌素的底物一起孵育。
(16)根据(15)所述的方法，其中所述底物为青霉素G。
(17)一种用于制备7-苯乙酰基脱乙酰氧基头孢菌素的试剂盒，包含(1)至(9)中任一项所述的青霉素扩环酶突变体。
(18)根据(17)所述的试剂盒，还包含青霉素G。
本发明与现有技术相比具有以下优点和积极效果：
本发明通过对棒状链霉菌的青霉素扩环酶进行基因工程改造，提高了该酶对青霉素G的催化活性和耐热性。与野生型青霉素扩环酶相比，本发明的青霉素扩环酶突变体的催化活性可提高至少20％，耐热性可提高至少400％。本发明的青霉素扩环酶突变体更适于商业和工业应用。
具体实施方式
以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
为了解决上述现有技术中存在的问题，本发明的发明人进行了大量深入的理论研究和实验摸索，利用遗传工程和蛋白质工程技术，对棒状链霉菌的青霉素扩环酶进行了突变改造，最终获得了一系列具有高酶活和高耐热性的青霉素扩环酶突变体，可更有利地用于生产G-7-ADCA。
具体而言，本发明提供了一种青霉素扩环酶突变体，其特征在于其氨基酸序列以序列表中的SEQ ID NO.:2为参考序列，具有位于第42位苏氨酸和第126位谷氨酰胺中的至少一者的突变，所述第42位苏氨酸突变为除其自身以外其他天然氨基酸中的任一者，所述第126位谷氨酰胺突变为除其自身以外其他天然氨基酸中的任一者。
优选地，所述第42位苏氨酸突变为半胱氨酸、或天冬氨酸、或谷氨酸、或蛋氨酸(Met)、或脯氨酸、或谷氨酰胺、或精氨酸；其中更优选突变为天冬氨酸、谷氨酸、蛋氨酸或谷氨酰胺，最优选突变为天冬氨酸。
优选地，所述第126位谷氨酰胺突变为丙氨酸、或苯丙氨酸、或异亮氨酸、或亮氨酸、或蛋氨酸、或天冬酰胺、或色氨酸、或酪氨酸；其中更优选突变为苯丙氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、或酪氨酸，最优选突变为苯丙氨酸。
优选地，所述青霉素扩环酶突变体同时具有位于第42位苏氨酸的突变和位于第126位谷氨酰胺的突变。
优选地，所述青霉素扩环酶突变体具有序列表中的SEQ ID NO.:4所示的氨基酸序列。编码序列表SEQ ID NO.:4所示的氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.:3所示。还优选地，序列表SEQ ID NO.:4中第42位的Xaa代表半胱氨酸、或天冬氨酸、或谷氨酸、或蛋氨酸、或脯氨酸、或谷氨酰胺、或精氨酸；其中更优选突变为天冬氨酸、谷氨酸、蛋氨酸或谷氨酰胺，最优选突变为天冬氨酸。还优选地，序列表SEQ ID NO.:4中第126位的Xaa代表丙氨酸、或苯丙氨酸、或异亮氨酸、或亮氨酸、或蛋氨酸、或天冬酰胺、或色氨酸、或酪氨酸；其中更优选突变为苯丙氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、或酪氨酸，最优选突变为苯丙氨酸。
在本发明一个优选的实施方案中，本发明的青霉素扩环酶突变体具有序列表中的SEQ ID NO.:4所示的氨基酸序列，并且其中第42位的Xaa代表天冬氨酸，第126位的Xaa代表苯丙氨酸。
本发明的青霉素扩环酶突变体可以利用本领域已知的技术对来自棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus)的野生型青霉素扩环酶进行定点突变而获得。所述棒状链霉菌的野生型青霉素扩环酶的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.:1所示，氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.:2所示。棒状链霉菌的野生型青霉素扩环酶基因的GenBank登录号为m32324。
所用技术方法和制备流程例如为，利用本领域已知的技术，构建含有野生型青霉素扩环酶基因的载体质粒，然后选择定点突变的位点以及突变后的氨基酸种类，合成相应的引物，以所述的含青霉素扩环酶基因的载体质粒为模板，PCR扩增突变DNA片段，分离纯化，然后以PCR将所得片段扩增为全长突变基因。通过将该全长突变基因克隆到适当的载体上并转化适当的宿主细胞，经培养筛选出具有高酶活扩环酶的阳性克隆。最后从阳性克隆中提取质粒DNA,进行DNA序列测定分析，以确定引入的突变。
在本发明制备青霉素扩环酶突变体的方法中，可采用任何合适的载体。例如，适用的载体包括但不限于原核表达载体pGEMT-Easy、pRSET和pET21；包括但不限于真核表达载体pYD1和pYES2/GS；包括但不限于克隆载体pUC18/19和pBluscript-SK。
在本发明制备青霉素扩环酶突变体的方法中，所获得的青霉素扩环酶突变基因可以在原核细胞或真核细胞内表达，也可采用本领域已知的任何适当方法实现在原核细胞或真核细胞外表达。
在本发明制备青霉素扩环酶突变体的方法中，所述载体的微生物宿主细胞可以为原核生物细胞或真核生物细胞。所述原核微生物包括但不限于大肠杆菌、凝结芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、T.saccharolyticum和链霉菌。所述真核微生物包括但不限于酿酒酵母和毕赤巴斯德酵母。
本文所用的术语“参考序列”，当其为核苷酸序列时，是指序列表SEQ ID NO.:1的序列，当其为氨基酸序列时，是指序列表SEQ ID NO.:2的序列。
本发明的青霉素扩环酶突变体可以以未经纯化的粗酶形式使用，也可以是经部分纯化的或纯化的形式。
本发明的青霉素扩环酶突变体可以是以序列表SEQ ID NO.:2所示的氨基酸序列为参考序列，与其相比至少存在一个氨基酸的差异，并且酶的催化活性比该野生型青霉素扩环酶至少高20％，优选至少高20％-100％，更优选至少高200％，和/或耐热性比该野生型青霉素扩环酶至少高400％，优选至少高900％，更优选高1700％。
本发明还提供了一种DNA，其含有本发明所述的青霉素扩环酶突变体的核苷酸序列。
本发明还提供了一种表达载体，其含有与启动子有效连接的本发明所述的DNA。
在本发明中，“表达载体”是指能够指导其有效连接的基因的表达的载体。通过将启动子序列有效连接至根据本发明所述的DNA，该启动子序列可指导根据本发明所述的相应的肽的表达。通常，基因工程技术中所用的表达载体可以为质粒的形式，但本发明也可以包括表达载体的其它已知形式。
当启动子能够启动编码本发明所述肽的DNA表达为RNA时，该启动子和所述DNA即被“有效连接”。所述启动子可以为基因工程领域中常用的启动子。
本发明的表达载体还可包含其它的序列，如还可以包含终止序列，其能够用于提高信息水平并使从构建体到其它序列的通读最小化。另外，表达载体还可以具有选择性标记，例如抗生素抗性基因的形式，从而能够使携带这些载体的细胞被筛选出来。
本发明还提供了一种宿主细胞，其含有根据本发明所述的表达载体。
本文所用的术语“宿主细胞”是指已经引入了根据本发明所述的表达载体的细胞。该细胞例如可以为原核细胞，其可用于例如快速产生大量的本发明的表达载体。
可以用本发明所述的表达载体瞬时或稳定地转化宿主细胞。将表达载体转化入细胞可以通过本领域已知的任意技术实现，所述技术包括但不限于：标准细菌转化、磷酸钙共沉淀或电穿孔。
本发明还提供了本发明所述的青霉素扩环酶突变体在制备7-苯乙酰基脱乙酰氧基头孢菌素中的应用。优选的是，在所述应用中，所述青霉素扩环酶突变体以青霉素G为底物。
本发明还提供了一种制备7-苯乙酰基脱乙酰氧基头孢菌素的方法，包括将本发明所述的青霉素扩环酶突变体与用于制备7-苯乙酰基脱乙酰氧基头孢菌素的底物一起孵育。优选的是，所述底物为青霉素G。
制备7-苯乙酰基脱乙酰氧基头孢菌素可以利用本领域已知的常规方法进行，只要使用本发明所述的青霉素扩环酶突变体作为催化所用的酶即可。
本发明还提供了一种用于制备7-苯乙酰基脱乙酰氧基头孢菌素的试剂盒，包含本发明所述的青霉素扩环酶突变体。还优选包含青霉素G。本领域技术人员能够理解，本发明所述的试剂盒还可以包含制备7-苯乙酰基脱乙酰氧基头孢菌素所需的其他试剂和材料。
以下通过实施例的方式进一步解释或说明本发明内容，但这些实施例不应被理解为对本发明保护范围的限制。
实施例
以下实施例中未注明具体条件的，均按常规条件或制造商建议的条件进行。除非特别说明，否则所述百分比为体积百分比。
实施例1：野生型克隆青霉素扩环酶基因的扩增及质粒pGEMT-SC的构建
根据蛋白质序列数据库(UniProtKB:P18548)的青霉素扩环酶氨基酸序列，运用软件Gene Designer 2.0，根据宿主细胞的密码子偏好性将该氨基酸序列逆转录为DNA序列。根据该DNA序列设计引物SF和SR(引物序列见表1)。
合成上述逆转录的DNA序列，将其连接到载体pMA-T(Life Technologies公司)上，获得质粒SC-pMA-T，以质粒SC-pMA-T为模板，用引物对SF和SR进行PCR，扩增得到936bp产物。
PCR反应条件为：1μg质粒SC-pMA-T，0.1μg引物(SF+SR)，5μl 10x缓冲液(200mMTris-HCl(pH 8.0),100mM KCl,100mM(NH4)2SO4,20mM MgSO4,1％Triton X-100)，4％DMSO，4μl 2.5mM dNTP,1U LA Taq聚合酶(TaKaRa公司)，用无菌水调反应体积至50μl。
PCR反应扩增程序为：96℃5分钟，30个循环：94℃45秒、53℃45秒和72℃3分钟，最后72℃10分钟。
扩增反应得到野生型青霉素扩环酶基因，通过1％(w/v)琼脂糖电泳，利用E.Z.N.A.Gel Extraction试剂盒(Omega Bio-tek Inc.)提纯PCR产物，分离纯化大小为936bp的片段SC，经TA克隆以T4DNA连接酶(NEB公司)连接至pGEMT-Easy(Promega公司)载体，获得质粒pGEMT-SC。将该质粒转化入感受态大肠杆菌BL21(Novagen公司)，在含50mg/L氨苄青霉素的LB平板上37℃培养，挑取单菌落，用DNA-spin plasmid DNA purification试剂盒(Intron Biotechnology)提取质粒pGEMT-SC，经DNA测序确定序列。
实施例2：青霉素扩环酶氨基酸位点42的定点突变
定点突变技术参考“PCR Protocols(John M.S.Bartlett和DavidStirling.Totowa,N.J.:Humana Press,2003)”一书之描述。
以质粒pGEMT-SC(实施例1)为模板，设计引物对42DF和42DR(表1)，将原始氨基酸序列中第42位的苏氨酸(T)突变为天冬氨酸(D)，获得突变体SC-T42D。
具体而言，以质粒pGEMT-SC为模板，用引物SF和42DR扩增模板片段42D1；用引物42DF和SR扩增模板片段42D2。PCR反应条件为：1μg质粒pGEMT-SC，0.1μg引物(SF+42DR)(扩增模板片段42D1)，或0.1μg引物(42DF+SR)(扩增模板片段42D2)，5μl 10x缓冲液(200mMTris-HCl(pH 8.0)，100mM KCl,100mM(NH4)2SO4,20mM MgSO4,1％Triton X-100),4％DMSO，4μl 2.5mM dNTP,1U LA Taq聚合酶(TaKaRa公司)，用无菌水调反应体积至50μl。
PCR反应扩增程序为：96℃5分钟，30个循环：94℃45秒、53℃45秒和72℃60秒，最后72℃10分钟。
扩增得到模板片段42D1和模板片段42D2，通过1％(w/v)琼脂糖电泳，用E.Z.N.A.Gel Extraction试剂盒(Omega Bio-tek Inc.)分离纯化，之后用引物SF和SR扩增全长基因。PCR反应条件为：50ng模板片段42D1和50ng模板片段42D2，0.1μg引物(SF+SR)，5μl 10x缓冲液(200mM Tris-HCl(pH 8.0)，100mM KCl,100mM(NH4)2SO4,20mM MgSO4,1％Triton X-100),4％DMSO，4μl 2.5mM dNTP,1U LA Taq聚合酶(TaKaRa公司)，用无菌水调反应体积至50μl。
PCR反应扩增程序为：96℃5分钟，30个循环：94℃45秒、53℃45秒和72℃2分钟，最后72℃10分钟。
扩增反应得全长突变基因，通过1％(w/v)琼脂糖电泳，用E.Z.N.A.GelExtraction试剂盒(Omega Bio-tek Inc.)提纯PCR产物，分离纯化大小为936pb的全长突变基因SC-T42D。
按照与上述类似的方法构建突变体SC-T42C、SC-T42E、SC-T42M、SC-T42P、SC-T42Q、SC-T42R，所用引物见表1。所得各突变体的名称和序列表编号见表2。
实施例3：质粒PR-SC-T42D的构建
用NdeI+BglII(NEB)对突变基因SC-T42D和载体pRSET-KAN(Invitrogen)进行酶切处理，通过1％(w/v)琼脂糖电泳，用E.Z.N.A.Gel Extraction试剂盒(Omega Bio-tekInc.)提纯酶切产物，以进行分离纯化，以T4DNA连接酶(NEB公司)连接，转化感受态大肠杆菌HB101(Bio-Rad)，在含50mg/L卡那霉素的LB平板上37℃培养，挑取单菌落，用DNA-spinplasmid DNA purification试剂盒(Intron Biotechnology)提取质粒PR-SC-T42D，经DNA测序确定序列。
按照上述类似的方法构建质粒PR-SC-T42C、PR-SC-T42E、PR-SC-T42M、PR-SC-T42P、PR-SC-T42Q和PR-SC-T42R。
实施例4：青霉素扩环酶氨基酸位点126的定点突变
定点突变技术参考“PCR Protocols(John M.S.Bartlett和DavidStirling.Totowa,N.J.:Humana Press,2003)”一书之描述。
以质粒pGEMT-SC(实施例1)为模板，设计引物对126FF和126FR(表1)，将原始氨基酸序列中第126位的谷氨酰胺(Q)突变为苯丙氨酸(F)，获得突变体SC-Q126F。
具体而言，以质粒pGEMT-SC为模板，用引物SF和126FR扩增模板片段126F1；用引物126FF和SR扩增模板片段126F2，PCR反应条件为：1μg质粒pGEMT-SC，0.1μg引物(SF+126FR)(扩增模板片段126F1)或0.1μg引物(126FF+SR)(扩增模板片段126F2)，5μl 10x缓冲液(200mM Tris-HCl(pH 8.0)，100mM KCl,100mM(NH4)2SO4,20mM MgSO4,1％Triton X-100),4％DMSO，4μl 2.5mM dNTP,1U LA Taq聚合酶(TaKaRa)，用无菌水调反应体积至50μl。
PCR反应扩增程序为：96℃5分钟，30个循环：94℃45秒、53℃45秒和72℃60秒，最后72℃10分钟。
扩增得模板片段126F1和模板片段126F2，通过1％(w/v)琼脂糖电泳，用E.Z.N.A.Gel Extraction试剂盒(Omega Bio-tek Inc.)分离纯化后，用引物SF和SR扩增全长基因。PCR反应条件为：50ng模板片段126F1和50ng模板片段126F2，0.1μg引物(SF+SR)，5μl 10x缓冲液(200mM Tris-HCl(pH 8.0)，100mM KCl,100mM(NH4)2SO4,20mM MgSO4,1％Triton X-100),4％DMSO，4μl 2.5mM dNTP,1U LA Taq聚合酶(TaKaRa)，用无菌水调反应体积至50μl。
PCR反应扩增程序为：96℃5分钟，30个循环：94℃45秒、53℃45秒和72℃2分钟，最后72℃10分钟。
扩增反应得全长突变基因，通过1％(w/v)琼脂糖电泳，利用E.Z.N.A.GelExtraction试剂盒(Omega Bio-tek Inc.)提纯PCR产物，分离纯化大小为936bp的全长突变基因SC-Q126F。
按照上述类似的方法构建突变体SC-Q126A、SC-Q126I、SC-Q126L、SC-Q126M、SC-Q126N、SC-Q126W和SC-Q126Y，所用引物见表1。所得各突变体的名称和序列表编号见表2。
实施例5：质粒PR-SC-Q126F的构建
用NdeI+BglII(NEB)对突变基因SC-Q126F和载体pRSET-KAN(Invitrogen)进行酶切，通过1％(w/v)琼脂糖电泳，用E.Z.N.A.Gel Extraction试剂盒(Omega Bio-tek Inc.)提纯酶切产物，以进行分离纯化，以T4DNA连接酶(NEB)连接，转化感受态大肠杆菌HB101(Bio-Rad)，在含50mg/L卡那霉素的LB平板上37℃培养，挑取单菌落，用DNA-spin plasmidDNA purification试剂盒(Intron Biotechnology)提取质粒PR-SC-Q126F，经DNA测序确定序列。
按照上述类似的方法构建质粒PR-SC-Q126A、PR-SC-Q126I、PR-SC-Q126L、PR-SC-Q126M、PR-SC-Q126N、PR-SC-Q126W和PR-SC-Q126Y。
实施例6：青霉素扩环酶双突变组合PR-SC-T42DQ126F的构建
定点突变技术参考“PCR Protocols(John M.S.Bartlett和DavidStirling.Totowa,N.J.:Humana Press,2003)”一书之描述。
以质粒PR-SC-T42D(实施例3)为模板，将氨基酸序列中第126位的谷氨酰胺(Q)突变为苯丙氨酸(F)，获得突变体SC-T42DQ126F。
具体而言，以质粒PR-SC-T42D为模板，用引物SF和126FR扩增模板片段42D126F1；用引物126FF和SR扩增模板片段42D126F2，PCR反应条件为：1μg PR-SC-T42D，0.1μg引物(SF+126FR)(扩增模板片段42D126F1)，或0.1μg引物(126FF+SR)(扩增模板片段42D126F2)，5μl10x缓冲液(200mM Tris-HCl(pH 8.0)，100mM KCl,100mM(NH4)2SO4,20mM MgSO4,1％TritonX-100),4％DMSO，4μl 2.5mM dNTP,1U LA Taq聚合酶(TaKaRa)，用无菌水调反应体积至50μl。
PCR反应扩增程序为：96℃5分钟，30个循环：94℃45秒、53℃45秒和72℃60秒，最后72℃10分钟。
扩增得模板片段42D126F1和模板片段42D126F2，通过1％(w/v)琼脂糖电泳，用E.Z.N.A.Gel Extraction试剂盒(Omega Bio-tek Inc.)分离纯化后，用引物SF和SR扩增全长基因。PCR反应条件为：50ng模板片段42D126F1和50ng模板片段42D126F2，0.1μg引物(SF+SR)，5μl 10x缓冲液(200mM Tris-HCl(pH 8.0)，100mM KCl,100mM(NH4)2SO4,20mM MgSO4,1％Triton X-100),4％DMSO，4μl 2.5mM dNTP,1U LA Taq聚合酶(TaKaRa)，用无菌水调反应体积至50μl。
PCR反应扩增程序为：96℃5分钟，30个循环：94℃45秒、53℃45秒和72℃2分钟，最后72℃10分钟。
扩增反应得全长突变基因，通过1％(w/v)琼脂糖电泳，用E.Z.N.A.GelExtraction试剂盒(Omega Bio-tek Inc.)提纯PCR产物，分离纯化大小为936bp的全长突变基因SC-T42DQ126F。
用NdeI+BglII(NEB)对突变基因SC-T42DQ126F和载体pRSET-KAN(Invitrogen)进行酶切，通过1％(w/v)琼脂糖电泳，用E.Z.N.A.Gel Extraction试剂盒(Omega Bio-tekInc.)提纯酶切产物，以进行分离纯化，以T4DNA连接酶(NEB)连接，转化感受态大肠杆菌HB101(Bio-Rad)，在含50mg/L卡那霉素的LB平板上37℃培养，挑取单菌落，用DNA-spinplasmid DNA purification试剂盒(Intron Biotechnology)提取质粒PR-SC-T42DQ126F，经DNA测序确定序列。
实施例7：青霉素扩环酶的酶活力测定
分别用上述实施例制备的野生型青霉素扩环酶质粒和各青霉素扩环酶突变体质粒转化大肠杆菌BL21细胞(Novagen公司)，在含50mg/L卡那霉素的LB平板上37℃培养，挑取单菌落，在3ml含50mg/L卡那霉素的LB培养液中在37℃、250rpm下培养8小时，然后取1ml接种至50ml含50mg/L卡那霉素的LB培养液中，在37℃、250rpm下培养18小时。离心收集细胞，悬浮于10mM pH 7.4的磷酸钠缓冲液中，用超声波(50W)裂解细胞，超声时间为5秒30次，离心去除细胞碎片，取上清液为酶液。检测各酶液中青霉素扩环酶的活力，并以SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定酶蛋白的表达量。具体如下：
于1.5ml离心管中加入490μl底物(10mM青霉素G,20mMα-酮戊二酸钠,4mM L-抗坏血酸钠和1.8mM七水硫酸亚铁,6mM磷酸钠缓冲液(pH 7.5))，然后加入10μl酶液，混匀，置于200rpm 30℃恒温摇床中反应30分钟。加入500μl甲醇中止反应，抽取200μl上清液，加入800μl水，混匀，以HPLC测定G-7-ADCA的含量并计算酶活力。下列表2示出了野生型青霉素扩环酶与各青霉素扩环酶突变体的酶活之比较。
HPLC测定的条件如下：HPLC色谱柱：依利特高效液相色谱柱(大连依利特分析仪器有限公司，10DS-BP 5μm，4.6mm x 250mm)；流动相：(A)50mM磷酸二氢钾/磷酸氢二钾(pH7)，6％乙腈，(B)60％乙腈；柱温度：30℃；流速：1.0ml/分钟；检测波长：210nm。
实施例8：青霉素扩环酶的耐热性测定
按实施例7制备野生型青霉素扩环酶酶液和各青霉素扩环酶突变体酶液，于1.5ml离心管中分别加入200μl酶液。将离心管置于45℃水浴中进行30分钟热处理，离心后，取上清液，按实施例7所述，测定青霉素扩环酶的酶活。用置于4℃、未经热处理的青霉素扩环酶的酶活除经热处理的酶活，得到野生型青霉素扩环酶与各青霉素扩环酶突变体的残余酶活，用百分比表示。用以下式子计算酶的耐热性增加百分比。下列表3示出野生型青霉素扩环酶和各青霉素扩环酶突变体在热处理后的残余酶活。
Figure BDA0000967797800000141
实施例9：以青霉素G为底物制备G-7-ADCA
将终浓度分别为10mM的青霉素G,20mM哦α-酮戊二酸钠，4mM的L-抗坏血酸钠和1.8mM的七水硫酸亚铁溶解于90ml 6mM pH 7.4的磷酸钠缓冲液中。用1M氢氧化钠溶液调至pH 6，加入10ml酶液。置于磁力搅拌器上高速搅拌,于30℃,pH 6.4反应150分钟。于30、60、90、120和150分钟的时间点分别抽取500μl反应液，与500μl甲醇混匀以中止反应。以13000rpm离心1分钟，抽取200μl上清液并混匀800μl水，以HPLC测定G-7-ADCA的浓度。
HPLC测定的条件如下：HPLC色谱柱：依利特高效液相色谱柱(大连依利特分析仪器有限公司，10DS-BP 5μm，4.6mm x 250mm)；流动相：(A)50mM磷酸二氢钾/磷酸氢二钾(pH7)，6％乙腈，(B)60％乙腈；柱温度：30℃；流速：1.0ml/分钟；检测波长：210nm。
本发明不受上述具体文字描述的限制，本发明可在权利要求书所概括的范围内做各种修改或改变。这些改变均在本发明要求保护的范围之内。
表1
Figure BDA0000967797800000151
Figure BDA0000967797800000161
Figure BDA0000967797800000171
表2野生型青霉素扩环酶与突变体的酶活比较
序列表序列编号 酶的名称 酶活(％)
SEQ ID NO.:2 野生型 100
SEQ ID NO.:5 SC-T42C 120
SEQ ID NO.:6 SC-T42D 160
SEQ ID NO.:7 SC-T42E 150
SEQ ID NO.:8 SC-T42M 130
SEQ ID NO.:9 SC-T42P 120
SEQ ID NO.:10 SC-T42Q 140
SEQ ID NO.:11 SC-T42R 120
SEQ ID NO.:12 SC-Q126A 210
SEQ ID NO.:13 SC-Q126F 260
SEQ ID NO.:14 SC-Q126I 200
SEQ ID NO.:15 SC-Q126L 180
SEQ ID NO.:16 SC-Q126M 220
SEQ ID NO.:17 SC-Q126N 150
SEQ ID NO.:18 SC-Q126W 120
SEQ ID NO.:19 SC-Q126Y 240
SEQ ID NO.:20 SC-T42DQ126F 300
表3热处理后野生型青霉素扩环酶与突变体的残余酶活
Figure BDA0000967797800000191
Figure IDA0000967797840000011
Figure IDA0000967797840000021
Figure IDA0000967797840000031
Figure IDA0000967797840000041
Figure IDA0000967797840000051
Figure IDA0000967797840000061
Figure IDA0000967797840000071
Figure IDA0000967797840000081
Figure IDA0000967797840000091
Figure IDA0000967797840000101
Figure IDA0000967797840000111
Figure IDA0000967797840000121
Figure IDA0000967797840000131
Figure IDA0000967797840000141
Figure IDA0000967797840000151
Figure IDA0000967797840000161
Figure IDA0000967797840000171
Figure IDA0000967797840000181
Figure IDA0000967797840000191
Figure IDA0000967797840000201
Figure IDA0000967797840000211
Figure IDA0000967797840000221
Figure IDA0000967797840000231

Claims (12)

1.一种青霉素扩环酶突变体，其特征在于其氨基酸序列以序列表中的SEQ ID NO.:2为参考序列，其中第126位谷氨酰胺突变为苯丙氨酸，并且任选地，第42位苏氨酸突变为除其自身以外其他天然氨基酸中的任一者。
2.根据权利要求1所述的青霉素扩环酶突变体，其特征在于所述第42位苏氨酸突变为半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、蛋氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺或精氨酸。
3.根据权利要求1所述的青霉素扩环酶突变体，其特征在于所述第42位苏氨酸突变为天冬氨酸。
4.一种DNA，其编码权利要求1-3中任一项所述的青霉素扩环酶突变体。
5.一种表达载体，其含有与启动子有效连接的权利要求4所述的DNA。
6.一种宿主细胞，其含有权利要求5所述的表达载体。
7.权利要求1-3中任一项所述的青霉素扩环酶突变体在制备7-苯乙酰基脱乙酰氧基头孢菌素中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其中所述青霉素扩环酶突变体以青霉素G为底物。
9.一种制备7-苯乙酰基脱乙酰氧基头孢菌素的方法，包括将权利要求1-3中任一项所述的青霉素扩环酶突变体与用于制备7-苯乙酰基脱乙酰氧基头孢菌素的底物一起孵育。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述底物为青霉素G。
11.一种用于制备7-苯乙酰基脱乙酰氧基头孢菌素的试剂盒，包含权利要求1-3中任一项所述的青霉素扩环酶突变体。
12.根据权利要求11所述的试剂盒，还包含青霉素G。
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