CN118185912A - 一种副球菌来源的酰胺酶及其突变体 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种源自于副球菌Paracoccussp.KDSPL‑02的酰胺酶及其突变体，属于生物化学与酶催化技术领域，所述野生型酰胺酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述酰胺酶突变体Pm‑F274A的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述酰胺酶突变体Pm‑F274A/W404G的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。本发明还提供了所述的酰胺酶及其突变体的催化性能，该酶能够高效催化青霉素G等常见抗生素水解和半合成抗生素的合成。
Description
技术领域
本发明涉及一种酰胺酶，尤其涉及一种副球菌Paracoccus sp KDSPL-02来源的酰胺酶及其突变体，属于生物化学与酶催化技术领域。
背景技术
酰胺酶的来源十分广泛，在细菌、酵母和真菌中都有发现。以青霉素酰化酶为例，其能水解青霉素G生成苯乙酸和6-氨基青霉烷酸(6-APA)，其中6-APA是工业中生产β-内酰胺类抗生素的重要中间体，因此青霉素G酰化酶在工业生产中显得尤为重要。青霉素酰化酶属于酰胺酶家族中的一员，在N-末端位置具有丝氨酸、半胱氨酸或苏氨酸等的活性位点，在生物催化中起着转移酶的作用。在水溶液中该活性位点残基与酰基的疏水基团(例如苯基)特异性相互作用，导致形成酰基酶中间体。
在β-内酰胺类半合成抗生素的制备过程中，青霉素酰化酶(酰胺酶)扮演了重要的角色，其可水解青霉素G获得重要的中间体6-APA。而在有机溶剂中，其又能催化6-APA与D-苯基甘氨酸甲酯或对羟基-D-苯基甘氨酸甲酯发生反应，实现6-APA氨基上的酰化。
近年来，青霉素酰化酶在欧美的一些发达国家中需求量逐渐上升，我国在微生物产青霉素酰化酶方面的研究与开发取得了巨大的进展。本课题组前期筛选得到一株高效水解青霉素的菌株，即Paracoccus sp.KDSPL-02，提示在该菌中，具有高效水解青霉素的酶。到目前为止，源于副球菌的酰胺酶(青霉素酰化酶)和突变体及其相关催化应用尚无报道。
发明内容
针对上述问题，本发明提供了一种副球菌来源的酰胺酶及其突变体，及其克隆表达制备及应用。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：一种副球菌来源的酰胺酶，所述酰胺酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，副球菌以保藏编号CGMCC No.12494保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。命名为Paracoccus sp.KDSPL-02。
一种副球菌来源的酰胺酶，命名为Pa404W，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明通过定点突变，在野生型副球菌酰胺酶Pa404W的基础上引入突变位点，将其274位苯丙氨酸(Phe)突变为丙氨酸(Ala)，突变体(Pm-F274A)氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。同样利用定点突变，继续将突变体F274A的404位色氨酸(Trp)突变为甘氨酸(Gly)，形成双突变体，命名为Pm-F274A/W404G。
本发明提供了包含所述基因的表达盒、重组载体和重组转化子。
所述重组载体的原始载体具体可以为pGEX-6p-1，将其原始质粒中Amp抗性基因盒置换为Kan抗性基因盒。
所述重组转化子的宿主细胞为大肠杆菌，具体可以为大肠杆菌BL21(DE3)或JM109。
本发明提供的酰胺酶的最适pH为8.0，最适温度为30℃。
本领域普通技术人员根据本发明提供的酰胺酶及其突变体的氨基酸序列，可以方便地进行重组获得基因工程菌，以基因工程菌发酵培养获得的菌体细胞或菌体细胞破碎后的上清液或者纯化后的酶液作为酶源。
本发明的副球菌来源的酰胺酶及其突变体的有益效果为：
本发明利用生物信息学技术从前期研究得到的副球菌Paracoccus sp.KDSPL-02中挖掘得到酰胺酶的编码基因，提供了一种新的来源于副球菌中的酰胺酶Pa404W，本发明SEQ ID NO.1(其氨基酸序列)所示的酶与已完成功能鉴定的酶的最高同源性低于50％，序列具有新颖性，氨基酸组成具有独特性。本发明在此基础上，对其位点进行改造，获得催化效率提高的突变体Pm-F274A、Pm-F274A/W404G。
本发明将上述序列成功克隆至大肠杆菌中，对重组菌株进行优化，得到高表达副球菌酰胺酶的工程菌株，为该酶的工业大规模生产提供一种技术思路。以往对该酶的使用局限于半合成抗生素工业，本发明所述酰胺酶及其突变体可用于抗生素降解等环境保护领域。本发明中的副球菌来源的酰胺酶及其突变体在工业领域均具有潜在的应用价值。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
图1a-图1b是副球菌酰胺酶突变体Pm-F274A/W404G对青霉素G降解分析图，其中图1a为副球菌酰胺酶突变体Pm-F274A/W404G催化青霉素G的HPLC结果图，图1b为酰胺酶突变体Pm-F274A/W404G催化青霉素G的活性分析图；
图2a-图2b是副球菌酰胺酶突变体Pm-F274A/W404G对青霉素V降解分析图，其中，图2a为副球菌酰胺酶突变体Pm-F274A/W404G催化青霉素V的HPLC结果图，图2b为酰胺酶突变体Pm-F274A/W404G催化青霉素G的活性分析图；
图3是利用副球菌酰胺酶突变体Pm-F274A/W404G合成阿莫西林分析图；
图4为实施例2中PCR循环过程。
具体实施方式
下面结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
实施例1副球菌酰胺酶的制备
1、副球菌酰胺酶的挖掘与分析
针对实验室前期对副球菌株(副球菌以保藏编号CGMCC No.12494保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。命名为Paracoccus sp.KDSPL-02.)进行基因组测序的基础上进一步对副球菌中的酰胺酶进行生物信息学挖掘，通过NCBI及Swiss-prot等数据库的分析，在测序得到的基因组中挖掘出了注释为酰胺酶的序列。
通过分析，从Paracoccus sp.KDSPL-02基因组中获得一条被注释为酰胺酶的序列，其氨基酸序列见SEQ ID NO.1。
将上述选定的酰胺酶序列在Blast模块的中的Swiss-prot数据库进行系统的比较，发现其与NCBI数据库中登录号为P06875.2的同源性最高，为41％，相似性较低，具备序列及功能的新颖性。其中P06875.2序列编码Penicillin G acylase(Escherichia coli)蛋白。
经生物信息学预测分析，该副球菌酰胺酶分子量为87.61kDa，等电点pI为4.87。
2、表达副球菌酰胺酶的工程菌株构建
1)酰胺酶基因的合成以及扩增
本实施例利用PGEX-6p-1(购自Biofeng)为基础质粒构建表达载体，该质粒经过实验室改造把质粒上自带的氨苄西林抗性基因改造成卡那霉素的抗性基因质粒PGEX-6p-1-Kan。将目的片段插入至PGEX-6p-1-Kan的Xho I和BanH I酶切位点。具体操作如下：
利用引物对F：5’-CGGGATCCATGCTCAGGTCTTCGCTTGGCCG-3’
R：5’-CCGCTCGAGCTAGCGCGGAACGGCGATGG-3’
以目的基因组DNA为模板进行PCR，可扩增得到所需基因的目的片段，PCR扩增条件如下：
2)目的片段与PGEX-6p-1-Kan质粒的双酶切与连接
将扩增完成的目的基因利用PCR产物纯化试剂盒(EasyPure PCR PurificationKit，购自于北京全式金生物技术有限公司)对其纯化。利用限制性内切酶XhoⅠ和BanHⅠ对上述扩增所得片段及载体分别进行PGEX-6p-1双酶切。酶切体系如下所示，酶切反应为37℃孵育30min：
表1
利用T4 DNALigase连接酶(购自宝生物工程有限公司)对目的片段和载体进行连接，连接体系如下：
表2
16℃连接过夜后，化转至E.coli DH5α感受态细胞中，涂布于卡那霉素抗性平板上，待其生长一段时间后出现单菌落，挑取单菌落进行菌落PCR，选取阳性克隆子进行测序。测序验证成功后，将质粒化转至表达菌株E.coli BL21(DE3)中进行表达，获得重组工程菌株。
3、副球菌酰胺酶的异源表达与纯化
3.1副球菌酰胺酶的异源表达
将重组工程菌接种于5mL试管LB培养基中，添加卡那霉素至终浓度50μg/mL。37℃，200rpm震荡培养过夜，即得种子液。吸取种子液0.5mL，接种于50mL TB培养基中，添加卡那霉素至终浓度为50μg/mL。37℃，200rpm震荡培养3小时，并降低温度至20℃，同时添加诱导剂IPTG，使其终浓度为0.1μM，进行诱导表达，转速调整为120rpm，诱导表达至18h，收集菌体用于蛋白纯化。
准备若干个50mL的离心管，将诱导结束后的菌液放入离心管中，7000rpm,4℃，离心4min，弃上清液，保留离心后的产物。每个离心管中分别加入15mL的Binding Buffer，震荡混匀使沉在底部的菌体充分与非变形裂解液融合后离心，如此重复两次后，然后再次加入Binding Buffer与菌体充分混合，将离心管放在装有碎冰的烧杯中，利用超声破细胞碎机对菌体进行破碎。超声结束后溶液在4℃的离心机中12000rpm离心8min。留取上清液，沉淀用Binding Buffer重悬，取1.5mL的ep管分别留取沉淀和上清液用于蛋白电泳的分析。
3.2副球菌酰胺酶的纯化
利用GST琼脂糖纯化树脂对带有GST标签蛋白进行纯化，其操作流程如下：
1)将超声破碎后的蛋白上清液用直径为0.22μm的水洗超滤膜过滤后备用，准备6倍柱体积的蒸馏水，对柱子经行冲洗。
2)缓慢加入5倍柱体积的蒸馏水对柱子经行清洗。在加入5倍柱体积的平衡缓冲液对柱子进行平衡，维持柱子pH值为8.0。
3)将过滤后的蛋白上清液缓慢的加入含有GST琼脂糖树脂的柱子中，控制上清液在填料中的流速，保证上清液中的蛋白能最大限度的与GST树脂结合，此步骤重复两次。
4)加入8倍柱体积的平衡缓冲液，对柱子经行洗脱，收集此步骤中流出的洗脱液用于蛋白电泳分析。
5)加入2倍柱体积的Elution Buffer洗脱液，收集洗脱下来的液体用于SDS蛋白检测。
6)加入3倍柱体积的平衡洗脱液，对柱子进行清洗。
7)加入5倍柱体积的蒸馏水和5倍柱体积的20％乙醇对柱子进行冲洗，冲洗结束后，加入1倍柱体积的20％乙醇封存柱子，放置在4℃冰箱里。
在Elution Buffer洗脱液加入终浓度为10mM的还原型谷胱甘肽。注意：还原型谷胱甘肽易于被氧化，需要现配先用。由于GST标签的特异性，只会与谷胱甘肽结合从而达到洗脱出蛋白的目的。
利用高回收过滤器对蛋白进行浓缩
使用Millipore的高回收过滤器(MWCO50kDa)对在10mM谷胱甘肽洗脱液洗下来的蛋白液进行超滤浓缩，离心机提前降温至4℃，过滤器先5000xg离心超纯水洗10min，然后加入约12mL的蛋白液超滤，当过滤器中的溶液量大概为1mL时停止过滤，缓慢的加入pH为6.5的磷酸钠缓冲溶液10mL，将溶液中残留的谷胱甘肽置换除去，此操作步骤循环四次后，过滤器中剩余约1mL的浓缩蛋白液，小心吸取蛋白液于1.5mL的离心管中加一定比例的甘油放置于-80℃的冰箱中保存用于后续的实验。
实施例2.副球菌酰胺酶突变体的构建
利用重叠延伸PCR技术将副球菌酰胺酶的第274位苯丙氨酸(F)突变为丙氨酸(A)，获得突变体Pm-F274A；在此基础上，利用重叠延伸PCR技术将Pm-F274A的第404位色氨酸(W)突变为甘氨酸(G)，获得突变体Pm-F274A/W404G。
根据青霉素G酰化酶的基因序列结合所要进行的突变形式进行引物的设计，合成部分由上海生工生物公司完成。
所设计的引物碱基序列分别为：
(1)PGA-a-F：5’-CGGGATCCATGCTCAGGTCTTCGCTTGGCCG-3’
(2)PGA-a-R：5’-CCGCTCGAGCTAGCGCGGAACGGCGATGGTTTC-3’
(3)PGA-b-F：5’-TCCTGATCAACGGCCCGCAAGCCGGCAATTTCAACCCG-3’
(4)PGA-b-R：5’-CGGGTTGAAATTGCCGGCTTGCGGGCCGTTGATCAAGA-3’
(5)PGA-c-F：5’
-CAGGAGATCTCGACGCTCAGGGCCTGGGTGAACTCG-3’
(6)PGA-c-F：
5’-CCTTGGTCGAGTTCACCCCGGCCATGAGCGTCGAGATC-3’
引物PGA-b-F和PGA-b-R分别为包含突变位点的上下引物，突变形式是由苯丙氨酸(TTC)变成丙氨酸(GCC)。引物PGA-c-F和PGA-c-R分别为包含突变位点的上下引物，突变形式是由色氨酸(TGG)变成甘氨酸(GGG)
以实验室构建的能够高效表达副球菌中青霉素G酰化酶的基因工程菌DNA为模板，运用重叠延伸PCR技术进行目的基因的扩增，需进行三次PCR即可得到突变后的目的基因。
PCR反应体系如下：
表3PCR反应体系1
将反应体系中的各个溶液用移液枪吸取，并温和地放置于PCR管中混合均匀，然后放入PCR仪中进行反应。
根据该反应体系扩增出目的基因，用琼脂糖凝胶电泳检测，并将此DNA切胶回收，命名为上片段。
表4PCR反应体系2
根据该反应体系扩增出目的基因，用琼脂糖凝胶电泳检测，并将此DNA切胶回收，命名为下片段。
回收的上下片段作为第三次PCR的模板用于扩增突变的目的基因。
表5PCR反应体系3
根据该反应体系扩增出的目的基因大小应为2373bp左右(应与原青霉素G酰化酶基因长度一致)，用琼脂糖凝胶电泳检测，并将此DNA切胶回收，即为完成突变后的目的基因。PCR循环过程如下图4所示。
获得的编码突变体的目的基因，按照上述实例1中基因工程菌株构建的方法，构建工程菌株，并表达酰胺酶的突变体，纯化制得用于抗生素的水解研究。其他突变体的制备方法同本实施例过程。
实施例3副球菌酰胺酶或其突变体对青霉素G的水解
利用实施例1中经纯化所得的酰胺酶或其突变体(本实施例为突变体Pm-F274A/W404G)对发酵类β-内酰胺类抗生素青霉素G进行水解。首先利用水洗法将发酵菌渣中的青霉素G进行清洗分离，经超声清洗三次后可将菌渣中全部抗生素转移至清洗水体中。
向抗生素清洗水中投入纯化后的副球菌酰胺酶或突变体或经壳聚糖凝胶固定化后的酰胺酶或突变体，酶的终浓度为100mg/L。温度控制为30℃，pH调整为7.0，反应24小时过程中，HPLC检测降解情况。结果显示(见附图1a和图1b)，在降解2小时，副球菌酰胺酶或其双突变体均可将青霉素G进行水解，降解率达到100％。
实施例4副球菌酰胺酶单突变体对青霉素G的水解
利用实施例1中经纯化所得的酰胺酶单突变体Pm-F274A对发酵类β-内酰胺类抗生素青霉素G进行水解。首先利用水洗法将发酵菌渣中的青霉素G进行清洗分离，经超声清洗三次后可将菌渣中全部抗生素转移至清洗水体中。向抗生素清洗水中投入纯化后的副球菌酰胺酶或突变体或经壳聚糖凝胶固定化后的酰胺酶或突变体，酶的终浓度为100mg/L。温度控制为30℃，pH调整为7.0。降解2小时后，副球菌酰胺酶单突变体Pm-F274A可将青霉素G进行水解，降解率达到100％。
实施例5副球菌酰胺酶或其突变体对青霉素V的水解
利用实施例1中经纯化所得的酰胺酶或其突变体(本实施例为突变体Pm-F274A/W404G)对发酵类β-内酰胺类抗生素青霉素V进行水解。首先利用水洗法将青霉素V微生物发酵菌渣中的青霉素V进行清洗分离，经超声清洗三次后可将菌渣中全部抗生素转移至清洗水体中。
向青霉素V清洗水体中投入纯化后的酰胺酶或其突变体，或经壳聚糖凝胶等固定化后的酰胺酶或其突变体，酶的终浓度为100mg/L。水解反应温度控制为30℃，pH调整为7.0，反应24小时过程中，HPLC检测降解情况。如图2a和图2b所示，在降解12小时，副球菌酰胺酶或其双突变体均可将青霉素V进行水解，降解率达到100％。
实施例6副球菌酰胺酶单突变体对青霉素V的水解
利用实施例1中经纯化所得的酰胺酶单突变体Pm-F274A对发酵类β-内酰胺类抗生素青霉素V进行水解。首先利用水洗法将发酵菌渣中的青霉素V进行清洗分离，经超声清洗三次后可将菌渣中全部抗生素转移至清洗水体中。向抗生素清洗水中投入纯化后的副球菌酰胺酶或突变体或经壳聚糖凝胶固定化后的酰胺酶或突变体，酶的终浓度为100mg/L。温度控制为30℃，pH调整为7.0。降解12小时后，副球菌酰胺酶单突变体Pm-F274A可将青霉素V进行水解，降解率达到100％。
实施例7副球菌酰胺酶或其突变体用于半合成抗生素阿莫西林的制备
利用实施例1中经纯化所得的酰胺酶用于半合成抗生素阿莫西林的制备，所用底物包括D-对羟基苯甘氨酸甲酯以及6-APA，具体实施过程如下：
将反应原料D-对羟基苯甘氨酸甲酯以及6-APA分别加入至100mL锥形瓶中，使其终浓度均为0.1mg/L。反应溶液为60mL乙二醇和40mL 25mM的NaH2PO4缓冲溶液，待全部反应原料溶解后加入纯化所得的酰胺酶或其突变体，至终浓度为100mg/L。反应温度为30℃，200rpm震荡反应，反应12h后，HPLC法检测产物。如图3所示，利用突变体Pm-F274A/W404G进行催化，阿莫西林转化率达到近70％。
本发明利用生物信息学挖掘得到副球菌中酰胺酶，并通过定点突变技术，获得其单突变体Pm-F274A及双突变体Pm-F274A/W404G。后结合蛋白克隆表达技术，构建了表达副球菌酰胺酶的工程菌株，对该菌株进行诱导表达确定其在20℃，120rpm，添加IPTG终浓度为0.1mM诱导18h的条件下该酶得到很好的表达。对其进行纯化，将所得到的纯酶液用于降解一系列的β-内酰胺类抗生素，本发明为酶法高效降解青霉素类抗生素提供了生物催化剂的选择，实验中所用到的制备酰胺酶的方法为其在工业中的应用提供了可能性。
显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
Claims (7)
1.一种副球菌来源的酰胺酶，其特征在于，所述酰胺酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述副球菌为副球菌Paracoccus sp.KDSPL-02。
2.一种副球菌来源的酰胺酶的突变体，其特征在于，所述突变体是由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列第274位、404位进行定点突变获得。
3.如权利要求2所述的突变体，其特征在于，所述突变体选自下列之一：
(1)将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列第274位苯丙氨酸突变为丙氨酸，突变体序列如SEQ ID NO.2所示；
(2)将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列第274位苯丙氨酸突变为丙氨酸、第404位的色氨酸突变为甘氨酸，突变体序列如SEQ ID NO.3所示。
4.编码权利要求1-3任一项所述的酰胺酶或其突变体的基因。
5.包含权利要求4所述的酰胺酶或其突变体的编码基因的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体使用的质粒为经改造的pGEX-6P-1质粒，所述改造为由原有的氨苄西林抗性改造为卡那霉素抗性。
6.如权利要求5所述的重组表达载体构建的含有所述的酰胺酶或其突变体的编码基因的重组基因工程菌，其特征在于，所述的重组基因工程菌是将目的基因与权利要求5所述的重组表达载体构建表达并将其转入到大肠杆菌中得到。
7.一种副球菌来源的酰胺酶或其突变体在催化青霉素水解及阿莫西林合成中的应用。
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