CN104364376A - 突变的头孢菌素羟化酶及其在脱乙酰基头孢菌烷酸合成中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于生成苯乙酰基-7-HACA衍生物的突变型羟化酶，所述突变型羟化酶具有增加的活性和对苯乙酰基-7-ADCA衍生物具有更高的底物特异性，所述突变型羟化酶与野生型羟化酶相比具有一个或多个在来自以下残基的残基位置上的氨基酸修饰：位置7的脯氨酸、位置40的丙氨酸、位置51的苏氨酸、位置53的甲硫氨酸、位置82的谷氨酸、位置91的精氨酸、位置96的苏氨酸、位置108的甘氨酸、位置149的异亮氨酸、位置171的缬氨酸、位置177的丙氨酸、位置182的精氨酸、位置184的甲硫氨酸、位置193的异亮氨酸、位置195的苯丙氨酸、位置209的谷氨酰胺、位置210的丙氨酸、位置226的缬氨酸、位置233的甲硫氨酸、位置236的亮氨酸、位置237的丙氨酸、位置241的丙氨酸、位置249的缬氨酸、位置250的精氨酸、位置251的丝氨酸、位置255的甘氨酸、位置258的谷氨酸、位置260的丝氨酸、位置267的苯丙氨酸、位置280的丙氨酸、位置307的缬氨酸和位置313的天冬酰胺。本发明还提供一种使用本发明的酶从对应的脱乙酰氧基头孢菌烷酸制备脱乙酰基头孢菌烷酸的方法。本发明还提供了用于生产和处理这类酶的方法。
Description
技术领域
本发明涉及具有更好的羟化活性和增加的对式(II)化合物的特异性的经修饰/突变的来自棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus)的头孢菌素羟化酶，所述式(II)化合物包括但不限于苯乙酰基-7-氨基脱乙酰氧基头孢菌烷酸(苯乙酰基-7-ADCA)和脱乙酰氧基头孢菌素C(DAOC)。
其中R代表但不限于氢、苯乙酰基、苯氧乙酰基、氨基己二酰基、戊二酰基或任何其他合适的基团。
本发明还描述了通过使用本发明的突变的头孢菌素羟化酶来羟基化对应的式(II)化合物以制备通式I的头孢菌烷酸(cephalosporanicacid)的生物过程，
其中R代表与上文所述相同的基团。所述过程在α-酮戊二酸和抗坏血酸的存在下进行。
本发明还进一步描述了表达和处理用于所述反应的头孢菌素羟化酶的方法。所述修饰的来自棒状链霉菌的头孢菌素羟化酶和用于合成脱乙酰基头孢菌烷酸的生物过程可用于制备7-氨基头孢菌烷酸(7-ACA)、脱乙酰基-7-ACA(7-HACA)、7-苯基乙酰氨基脱乙酰基头孢菌烷酸(苯乙酰基-7-HACA)、7-苯乙酰氨基-3-氯甲基-4-头孢菌烷酸-对-甲氧苄酯(p-methoxybenzyl-7-phenylacetamido-3-chloromethylcepham-4-carboxylate)(GCLE)、7-氨基-3-乙烯基-4-头孢菌烷酸(CAVA)等的方法。
背景技术
β-内酰胺类抗生素例如青霉素和头孢菌素广泛用于多种感染性疾病的治疗。由于头孢菌素提供比青霉素更好的保护作用，特别是在针对耐药菌方面，因此显著地推动了对头孢菌素的衍生化以加宽其广谱性并增强其效能。7-ADCA(7-氨基脱乙酰氧基头孢菌烷酸)、7-HACA和7-ACA充当用于合成大量半合成的头孢菌素(例如头孢拉定、头孢氨苄、头孢羟氨苄(cephadroxyl)、头孢唑林、头孢噻肟、头孢曲松、头孢吡肟、头孢哌酮、头孢呋辛、头孢西丁等)的核心中间体。目前，7-ACA是通过一种两阶段的酶学过程切割7-氨基己二酰基侧链而由头孢菌素C衍生的(US 5424196)，7-ADCA是通过青霉素G酰胺酶水解苯乙酰基-7-ADCA而衍生的，其中苯乙酰基-7-ADCA是通过对青霉素G的扩环反应的常规化学方法制备。由于7-ADCA或头孢菌素G分别比7-ACA或头孢菌素C价格低，因此实际可行地将在7-氨基位上具有或不具有取代基(例如苯乙酰基基团)的7-ADCA转化为相应的脱乙酰基头孢菌烷酸的方法会提供一种HACA的较廉价的替代品。
天然的青霉素和头孢菌素是由多种细菌和真菌生物产生的，对于它们的调控体系的理解已经取得了显著的进步(Aharonowitz,Y.,et al.,Annu.Rev.Microbiol.46:461-495,1992；Axel A.Brakhage,Microbiol.Mol.Biol.Rev.62:547-585,1998)。三种氨基酸——L-缬氨酸、L-α-氨基己二酸酯和L-半胱氨酸缩合形成三肽——δ-(L-α-氨基己二酰基)-L-半胱氨酰-D-缬氨酸，然后δ-(L-α-氨基己二酰基)-L-半胱氨酰-D-缬氨酸环化形成异青霉素N。对于青霉素生产者，异青霉素N被转化为青霉素G、青霉素V等。通过在生物体(例如顶头孢霉(C.acremonium)、棒状链霉菌等)中将异青霉素N差向异构化为青霉素N来进行的头孢菌素的生物合成，产生了头孢类(cephem)化合物例如头孢菌素C和头孢霉素C。头孢菌素的生物合成过程中的限速或更确切的说，关键步骤是青霉素N的五元噻唑烷环扩环为脱乙酰氧基头孢菌素C(DAOC)的六元二氢噻嗪环。在原核生物例如棒状链霉菌中，青霉素N的扩环步骤是由被称为脱乙酰氧基头孢菌素C合酶(DAOCS或cefE或扩环酶)的酶催化，DAOC的羟化作用是通过头孢菌素羟化酶(脱乙酰头孢菌素C合酶或DACS或cefF或羟化酶)实施(Jensen S.E.et al.,Journal ofAntibiotics,38,263-265,1985)。在真核生物例如顶头孢霉中，这两个反应都是由单独一个双功能酶DAOCS-DACS(扩环酶-羟化酶或cefEF)催化(Dotzlaf,J.E.and Yeh,W.K.,Journal of Bacteriology,169,1611-1618,1987)。随后，脱乙酰基头孢菌素C(DAC)在顶头孢霉中被乙酰化为头孢菌素C，而在细菌例如棒状链霉菌中发生进一步修饰产生头孢霉素C。
在顶头孢霉中编码332个氨基酸的cefEF基因编码扩环酶-羟化酶(Samson,S.M et al.,Nature Biotechnology,5,1207-1215,1987)。
已经从棒状链霉菌克隆并测序了脱乙酰头孢菌素C合酶基因(cefF)，其编码318个氨基酸(Kovacevic,S.and Miller,J.R.,Journalof Bacteriology,173,398-400,1991)。所述羟化酶的氨基酸序列与顶头孢霉的扩环酶-羟化酶的氨基酸序列具有54％的序列同一性。所述扩环酶、扩环酶-羟化酶和羟化酶是铁(II)和α-酮戊二酸依赖的加氧酶，并且其是单核亚铁酶(mononuclear ferrous enzymes)亚家族的一部分。
青霉素N是扩环酶和扩环酶-羟化酶的天然底物，DAOC是羟化酶的底物。但是，已经检测到了扩环酶-羟化酶对不同的底物(例如青霉素G、青霉素V、6-α-甲基青霉素N和己二酰基-6-APA)具有不同的底物特异性(Lloyd et al.，Journal of Biological Chemistry,279,15420-15426,2004)。因此，制造头孢菌素中间体的绿色技术的开发缩小至这些酶。但是，这些酶转化易得的底物(例如苯乙酰基-7-ADCA)的能力较弱，因此，需要将其改造以供商业应用。WO 2008/107782(445/CHE/2007)描述了针对羟化酶的这些操作和它在制备式(I)化合物的生物过程中的用途，由于较弱的羟化酶活性，根据该专利获得的一些菌株例如MTCC 5739、MTCC 5741、MTCC 5746-MTCC 5749不可用于工业规模，因此考虑到工业生产的问题仍需要鉴定更好的羟化酶突变体。
同样在一些出版物中，例如Baker,B.J et al.,Journal of BiologicalChemistry 266,5087-5093,1991；Coque,J.J.R et al.,AppliedMicrobiology and Biotechnology 44,605-609,1996，已经描述了7-氨基己二酰基脱乙酰氧基头孢菌烷酸转化为相应的脱乙酰基头孢菌烷酸。当测试时，这些方法不能转化多于5％的非常低浓度的所述底物。因此这些方法不实用并且不能大规模使用。现有技术尚未公开可大规模使用的对脱乙酰氧基头孢菌素进行羟基化的方法。
EP 465189提供了编码棒状链霉菌的羟化酶活性物的DNA化合物。该专利公开了用于在重组宿主细胞中表达棒状链霉菌的羟化酶活性物的方法。所述编码羟化酶活性物的DNA化合物分离自棒状链霉菌基因组DNA，用于构建名为pOW399的重组DNA表达载体。所克隆的羟化酶基因用在头孢菌素化合物的羟基化反应中；但是对于工业制造来讲，该酶的活性并不令人满意。
US 6,180,361涉及编码DAOCS和DACS活性物的DNA化合物、重组DNA克隆和表达载体。编码DACS/DAOCS活性物的DNA化合物分离自顶头孢霉基因组DNA，并用于构建重组DNA表达载体。该发明还公开了用于在重组宿主细胞中表达头孢菌属脱乙酰氧基头孢菌素C合成酶/羟化酶多肽的方法。
因此需要鉴定具有成本效益且可用于工业规模的头孢菌素羟化酶，所述头孢菌素羟化酶具有增强的羟化式(II)化合物的活性。由于天然的头孢菌素羟化酶对式(II)化合物的亲和力较弱，因此工业应用需要开发经修饰的羟化酶以增强其活性。因此，本发明涉及开发经修饰的来自棒状链霉菌的羟化酶，所述羟化酶与野生型羟化酶相比，具有增加的对底物(例如式(II)的化合物)的底物特异性。本发明还提供一种用于羟化脱乙酰氧基头孢菌烷酸的大规模方法，该方法是通过所述经修饰的头孢菌素羟化酶或任何α-酮戊二酸依赖的羟化酶来催化的。
附图说明
图1：SEQ ID No:1给出了来自棒状链霉菌的羟化酶的野生型氨基酸序列。
图2：SEQ ID No:1给出了来自棒状链霉菌的羟化酶的野生型核苷酸和氨基酸序列。
发明目的
本发明一个目的是提供与天然的野生型羟化酶相比，具有改善的羟化能力的经修饰/突变的羟化酶。
本发明的另一个目的是提供具有增强的对式(II)的底物化合物例如苯乙酰基-7-ADCA的羟化活性的经修饰的羟化酶。
本发明的另一个目的是提供一种通过头孢菌素羟化酶催化从各自的脱乙酰氧基头孢菌烷酸产生脱乙酰基头孢菌烷酸的方法。
本发明的另一个目的是提供一种生成并处理用于工业生产式(I)化合物的头孢菌素羟化酶的方法，其中式(I)化合物是用于制备许多头孢菌素化合物的中间体。
发明内容
因此，本发明提供一种突变的来自棒状链霉菌的头孢菌素羟化酶，其在一个或多个对应于野生型头孢菌素羟化酶(棒状链霉菌)的氨基酸残基上包含氨基酸置换，所述氨基酸残基选自：位置7的脯氨酸、位置40的丙氨酸、位置51的苏氨酸、位置53的甲硫氨酸、位置82的谷氨酸、位置91的精氨酸、位置96的苏氨酸、位置108的甘氨酸、位置149的异亮氨酸、位置171的缬氨酸、位置177的丙氨酸、位置182的精氨酸、位置184的甲硫氨酸、位置193的异亮氨酸、位置195的苯丙氨酸、位置209的谷氨酰胺、位置210的丙氨酸、位置226的缬氨酸、位置233的甲硫氨酸、位置236的亮氨酸、位置237的丙氨酸、位置241的丙氨酸、位置249的缬氨酸、位置250的精氨酸、位置251的丝氨酸、位置255的甘氨酸、位置258的谷氨酸、位置260的丝氨酸、位置267的苯丙氨酸、位置280的丙氨酸、位置307的缬氨酸和位置313的天冬酰胺。
具体地，本发明提供包含一个或多个具体氨基酸置换的突变的羟化酶，所述具体氨基酸置换选自：
P7L，A40V，T51M，M53L，E82D，R91G，T96S，G108D，I149T，V171L，V171M，A177V，R182S，R182W，M184I，I193V，F195L，Q209E，A210V，V226I，M233I，L236V，A237V，A241V，V249I，R250L，S251F，G255D，E258K，S260G，F267L，A280S，V307A，N313D，
其中所述氨基酸置换的残基位置对应于野生型羟化酶的残基位置。
在一方面，本发明的突变的羟化酶任选地具有一个或多个选自以下的具体氨基酸置换：
E16G，Y38C，P72L，T90A，T90G，T90D，V150A，P186L，V206I，V221A，V221P，V221H，V221T，M229V，M229I，T273A，T304A，A311M和A311V。
在另一方面，本发明提供一种包含在一个或多个残基位置上的置换的组合的突变型羟化酶，所述残基位置对应于野生型扩环酶的残基位置。
本发明的方法提供一种修饰的cefF基因，所述修饰的cefF基因编码所述突变的脱乙酰基头孢菌素C合酶(DACS)。
本发明的另一个实施方案提供了一种头孢菌素羟化酶蛋白，所述头孢菌素羟化酶蛋白具有对式(II)底物例如苯乙酰基-7-ADCA的经修饰的羟化活性。
在另一方面，本发明提供一种重组载体特别是一种表达载体，其包含所述修饰的羟化酶基因。
本发明还涉及一种宿主菌株，所述宿主菌株包含具有所述修饰的羟化酶(cefF)基因的表达载体。
本发明的另一个实施方案提供了一种在包含具有所述修饰的羟化酶(cefF)基因的表达载体的宿主菌株中表达头孢菌素羟化酶的方法。
本发明的另一个实施方案提供了一种生成和处理所述用于催化对脱乙酰氧基头孢菌烷酸的羟化作用的蛋白的方法。
本发明的另一个实施方案提供了一种用于制备(式I)的头孢菌烷酸化合物的大规模方法，
其中，R代表但不限于氢、苯乙酰基、苯氧乙酰基、氨基己二酰基、戊二酰基等。
所述方法包括在5-25℃范围内的温度下，pH 5-8.5优选6-8下，在氧气、α-酮戊二酸、抗坏血酸和硫酸亚铁的存在下，使水性介质中的式(II)的化合物与本发明的修饰的羟化酶接触。
所述方法在以下方案中示出：
本发明的另一方面提供一种制备脱乙酰基头孢菌烷酸(式I)的方法，所述方法包括以下步骤：
i)溶解脱乙酰氧基头孢菌烷酸；
ii)加入与脱乙酰氧基头孢菌烷酸和硫酸亚铁相比1-3摩尔比的α-酮戊二酸、0.1-1摩尔比的抗坏血酸；
iii)加入本发明的修饰的羟化酶；
iv)在优选6-8范围内的pH和0-25℃的温度下进行反应。
具体实施方式
本发明的一个实施方案是提供一种突变型头孢菌素羟化酶，其与来自细菌棒状链霉菌的野生型羟化酶相比展示出增强的活性和对底物例如苯乙酰基-7-ADCA的更高的特异性。该酶和对应基因(cefF基因)已经被克隆并表征(Kovacevic S.,and Miller J.R.,Journal ofBacteriology,173,398-400,1991)。SEQ ID No:1(图2)中给出了来自棒状链霉菌的羟化酶的野生型核苷酸和氨基酸序列。
本发明的另一个实施方案，一种具有增强的对底物例如苯乙酰基-7-ADCA的羟化活性的突变的羟化酶，所述突变的羟化酶在一个或多个对应于野生型羟化酶的氨基酸残基上包含氨基酸置换，所述氨基酸残基选自：位置7的脯氨酸、位置40的丙氨酸、位置51的苏氨酸、位置53的甲硫氨酸、位置82的谷氨酸、位置91的精氨酸、位置96的苏氨酸、位置108的甘氨酸、位置149的异亮氨酸、位置171的缬氨酸、位置177的丙氨酸、位置182的精氨酸、位置184的甲硫氨酸、位置193的异亮氨酸、位置195的苯丙氨酸、位置209的谷氨酰胺、位置210的丙氨酸、位置226的缬氨酸、位置233的甲硫氨酸、位置236的亮氨酸、位置237的丙氨酸、位置241的丙氨酸、位置249的缬氨酸、位置250的精氨酸、位置251的丝氨酸、位置255的甘氨酸、位置258的谷氨酸、位置260的丝氨酸、位置267的苯丙氨酸、位置280的丙氨酸、位置307的缬氨酸和位置313的天冬酰胺。具体地，本发明提供在一个或多个氨基酸残基上具有以下氨基酸置换及其组合的突变体：
P7L，A40V，T51M，M53L，E82D，R91G，T96S，G108D，I149T，V171L，V171M，A177V，R182S，R182W，M184I，I193V，F195L，Q209E，A210V，V226I，M233I，L236V，A237V，A241V，V249I，R250L，S251F，G255D，E258K，S260G，F267L，A280S，V307A，N313D其中所述氨基酸置换的残基位置对应于来自棒状链霉菌的野生型羟化酶的残基位置。
本发明的另一个实施方案，与野生型羟化酶相比，本发明的突变型羟化酶还在来自以下残基的残基位置上具有一个或多个氨基酸修饰：位置16的谷氨酸、位置38的酪氨酸、位置72的脯氨酸、位置90的苏氨酸、位置150的缬氨酸、位置186的脯氨酸、位置206的缬氨酸、位置221的缬氨酸、位置229的甲硫氨酸、位置273的苏氨酸、位置304的苏氨酸和位置311的丙氨酸。因此，本发明的突变的羟化酶还包含一个或多个具体的氨基酸置换，所述具体的氨基酸置换选自：
E16G，Y38C，P72L，T90A，T90G，T90D，V150A，P186L，V206I，V221A，V221P，V221H，V221T，M229V，M229I，T273A，T304A，A311M和A311V。
在另一方面，本发明提供一种突变型羟化酶，所述突变型羟化酶包含在一个或多个残基位置上的置换的组合，所述置换的残基位置对应于野生型羟化酶的残基位置。
以下是对来自Seq.ID.NO.1序列的氨基酸残基的变化：
-位置7的脯氨酸被亮氨酸置换
-位置40的丙氨酸被缬氨酸置换
-位置51的苏氨酸被甲硫氨酸置换
-位置53的甲硫氨酸被亮氨酸置换
-位置82的谷氨酸被天冬氨酸置换
-位置91的精氨酸被甘氨酸置换
-位置96的苏氨酸被丝氨酸置换
-位置108的甘氨酸被天冬氨酸置换
-位置149的异亮氨酸被苏氨酸置换
-位置171的缬氨酸被亮氨酸置换
-位置171的缬氨酸被甲硫氨酸置换
-位置177的丙氨酸被缬氨酸置换
-位置182的精氨酸被色氨酸置换
-位置182的精氨酸被丝氨酸置换
-位置184的甲硫氨酸被异亮氨酸置换
-位置193的异亮氨酸被缬氨酸置换
-位置195的苯丙氨酸被亮氨酸置换
-位置209的谷氨酰胺被谷氨酸置换
-位置210的丙氨酸被缬氨酸置换
-位置226的缬氨酸被异亮氨酸置换
-位置233的甲硫氨酸被异亮氨酸置换
-位置236的亮氨酸被缬氨酸置换
-位置237的丙氨酸被缬氨酸置换
-位置241的丙氨酸被缬氨酸置换
-位置249的缬氨酸被异亮氨酸置换
-位置250的精氨酸被亮氨酸置换
-位置251的丝氨酸被苯丙氨酸置换
-位置255的甘氨酸被天冬氨酸置换
-位置258的谷氨酸被赖氨酸置换
-位置260的丝氨酸被甘氨酸置换
-位置267的苯丙氨酸被亮氨酸置换
-位置280的丙氨酸被丝氨酸置换
-位置307的缬氨酸被丙氨酸置换
-位置313的天冬酰胺被天冬氨酸置换
本发明的突变的羟化酶还具有以下对来自Seq.ID.NO.1序列的氨基酸残基的变化：
-位置16的谷氨酸被甘氨酸置换
-位置38的酪氨酸被半胱氨酸置换
-位置72的脯氨酸被亮氨酸置换
-位置90的苏氨酸被丙氨酸置换
-位置90的苏氨酸被甘氨酸置换
-位置90的苏氨酸被天冬氨酸置换
-位置150的缬氨酸被丙氨酸置换
-位置186的脯氨酸被亮氨酸置换
-位置206的缬氨酸被异亮氨酸置换
-位置221的缬氨酸被脯氨酸置换
-位置221的缬氨酸被组氨酸置换
-位置221的缬氨酸被丙氨酸置换
-位置221的缬氨酸被苏氨酸置换
-位置229的甲硫氨酸被异亮氨酸置换
-位置229的甲硫氨酸被缬氨酸置换
-位置273的苏氨酸被丙氨酸置换
-位置304的苏氨酸被甘氨酸置换
-位置304的苏氨酸被异亮氨酸置换
-位置304的苏氨酸被亮氨酸置换
-位置304的苏氨酸被缬氨酸置换
-位置311的丙氨酸被甲硫氨酸置换
-位置311的丙氨酸被缬氨酸置换
在本发明的另一个实施方案中，本发明的修饰的羟化酶在对应于野生型羟化酶的氨基酸残基上具有以下具体氨基酸置换：
-位置72的脯氨酸被亮氨酸置换，位置90的苏氨酸被丙氨酸置换，位置206的缬氨酸被异亮氨酸置换，位置210的丙氨酸被缬氨酸置换，位置311的丙氨酸被缬氨酸置换(MTCC 5740)
-位置7的脯氨酸被亮氨酸置换，位置72的脯氨酸被亮氨酸置换，位置90的苏氨酸被丙氨酸置换，位置237的丙氨酸被缬氨酸置换，位置311的丙氨酸被缬氨酸置换(MTCC 5742)
-位置51的苏氨酸被甲硫氨酸置换，位置72的脯氨酸被亮氨酸置换，位置90的苏氨酸被丙氨酸置换，位置311的丙氨酸被缬氨酸置换(MTCC 5743)
-位置40的丙氨酸被缬氨酸置换，位置72的脯氨酸被亮氨酸置换，位置90的苏氨酸被丙氨酸置换，位置311的丙氨酸被缬氨酸置换(MTCC 5744)
-位置72的脯氨酸被亮氨酸置换，位置90的苏氨酸被丙氨酸置换，位置237的丙氨酸被缬氨酸置换，位置311的丙氨酸被缬氨酸置换(MTCC 5745)
-位置72的脯氨酸被亮氨酸置换，位置90的苏氨酸被丙氨酸置换，位置233的甲硫氨酸被异亮氨酸置换，位置311的丙氨酸被缬氨酸置换(MTCC 5750)
-位置72的脯氨酸被亮氨酸置换，位置90的苏氨酸被丙氨酸置换，位置258的谷氨酸被赖氨酸置换，位置311的丙氨酸被缬氨酸置换(MTCC 5751)
-位置72的脯氨酸被亮氨酸置换，位置90的苏氨酸被丙氨酸置换，位置195的苯丙氨酸被亮氨酸置换，位置311的丙氨酸被缬氨酸置换(MTCC 5752)
-位置72的脯氨酸被亮氨酸置换，位置90的苏氨酸被丙氨酸置换，位置250的精氨酸被亮氨酸置换，位置311的丙氨酸被缬氨酸置换(MTCC 5753)
-位置72的脯氨酸被亮氨酸置换，位置90的苏氨酸被丙氨酸置换，位置226的缬氨酸被异亮氨酸置换，位置311的丙氨酸被缬氨酸置换(MTCC 5754)
-位置72的脯氨酸被亮氨酸置换，位置90的苏氨酸被丙氨酸置换，位置206的缬氨酸被异亮氨酸置换，位置210的丙氨酸被缬氨酸置换，位置273的苏氨酸被丙氨酸置换，位置311的丙氨酸被缬氨酸置换
-位置7的脯氨酸被亮氨酸置换，位置72的脯氨酸被亮氨酸置换，位置90的苏氨酸被丙氨酸置换，位置237的丙氨酸被缬氨酸置换，位置273的苏氨酸被丙氨酸置换，位置311的丙氨酸被缬氨酸置换
-位置7的脯氨酸被亮氨酸置换，位置72的脯氨酸被亮氨酸置换，位置90的苏氨酸被丙氨酸置换，位置273的苏氨酸被丙氨酸置换，位置311的丙氨酸被缬氨酸置换
-位置72的脯氨酸被亮氨酸置换，位置90的苏氨酸被丙氨酸置换，位置237的丙氨酸被缬氨酸置换，位置273的苏氨酸被丙氨酸置换，位置311的丙氨酸被缬氨酸置换
-位置51的苏氨酸被甲硫氨酸置换，位置72的脯氨酸被亮氨酸置换，位置90的苏氨酸被丙氨酸置换，位置273的苏氨酸被丙氨酸置换，位置311的丙氨酸被缬氨酸置换
-位置40的丙氨酸被缬氨酸置换，位置72的脯氨酸被亮氨酸置换，位置90的苏氨酸被丙氨酸置换，位置273的苏氨酸被丙氨酸置换，位置311的丙氨酸被缬氨酸置换
-位置72的脯氨酸被亮氨酸置换，位置90的苏氨酸被甘氨酸置换，位置237的丙氨酸被缬氨酸置换，位置273的苏氨酸被丙氨酸置换，位置311的丙氨酸被缬氨酸置换
-位置51的苏氨酸被甲硫氨酸置换，位置72的脯氨酸被亮氨酸置换，位置90的苏氨酸被丙氨酸置换，位置237的丙氨酸被缬氨酸置换，位置273的苏氨酸被丙氨酸置换，位置311的丙氨酸被缬氨酸置换
-位置40的丙氨酸被缬氨酸置换，位置72的脯氨酸被亮氨酸置换，位置90的苏氨酸被丙氨酸置换，位置237的丙氨酸被缬氨酸置换，位置273的苏氨酸被丙氨酸置换，位置311的丙氨酸被缬氨酸置换
-位置51的苏氨酸被甲硫氨酸置换，位置72的脯氨酸被亮氨酸置换，位置90的苏氨酸被丙氨酸置换，位置229的甲硫氨酸被异亮氨酸置换，位置273的苏氨酸被丙氨酸置换，位置311的丙氨酸被缬氨酸置换
-位置40的丙氨酸被缬氨酸置换，位置72的脯氨酸被亮氨酸置换，位置90的苏氨酸被丙氨酸置换，位置229的甲硫氨酸被异亮氨酸置换，位置273的苏氨酸被丙氨酸置换，位置311的丙氨酸被缬氨酸置换(MTCC 5755)
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-位置40的丙氨酸被缬氨酸置换，位置72的脯氨酸被亮氨酸置换，位置90的苏氨酸被丙氨酸置换，位置195的苯丙氨酸被亮氨酸置换，位置229的甲硫氨酸被异亮氨酸置换，位置267的苯丙氨酸被亮氨酸置换，位置273的苏氨酸被丙氨酸置换，位置311的丙氨酸被缬氨酸置换
-位置40的丙氨酸被缬氨酸置换，位置72的脯氨酸被亮氨酸置换，位置90的苏氨酸被丙氨酸置换，位置184的甲硫氨酸被异亮氨酸置换，位置193的异亮氨酸被缬氨酸置换，位置229的甲硫氨酸被异亮氨酸置换，位置273的苏氨酸被丙氨酸置换，位置311的丙氨酸被缬氨酸置换(MTCC 5756)
-位置40的丙氨酸被缬氨酸置换，位置72的脯氨酸被亮氨酸置换，位置90的苏氨酸被丙氨酸置换，位置171的缬氨酸被亮氨酸置换，位置229的甲硫氨酸被异亮氨酸置换，位置273的苏氨酸被丙氨酸置换，位置311的丙氨酸被缬氨酸置换(MTCC 5758)
-位置40的丙氨酸被缬氨酸置换，位置72的脯氨酸被亮氨酸置换，位置90的苏氨酸被丙氨酸置换，位置209的谷氨酰胺被谷氨酸置换，位置229的甲硫氨酸被异亮氨酸置换，位置249的缬氨酸被异亮氨酸置换，位置273的苏氨酸被丙氨酸置换，位置311的丙氨酸被缬氨酸置换
-位置40的丙氨酸被缬氨酸置换，位置72的脯氨酸被亮氨酸置换，位置90的苏氨酸被丙氨酸置换，位置209的谷氨酰胺被谷氨酸置换，位置229的甲硫氨酸被异亮氨酸置换，位置273的苏氨酸被丙氨酸置换，位置311的丙氨酸被缬氨酸置换
-位置40的丙氨酸被缬氨酸置换，位置72的脯氨酸被亮氨酸置换，位置82的谷氨酸被天冬氨酸置换，位置90的苏氨酸被丙氨酸置换，位置209的谷氨酰胺被谷氨酸置换，位置229的甲硫氨酸被异亮氨酸置换，位置236的亮氨酸被缬氨酸置换，位置249的缬氨酸被异亮氨酸置换，位置273的苏氨酸被丙氨酸置换，位置311的丙氨酸被缬氨酸置换(MTCC 5759)
-位置40的丙氨酸被缬氨酸置换，位置72的脯氨酸被亮氨酸置换，位置90的苏氨酸被丙氨酸置换，位置221的缬氨酸被脯氨酸置换，位置229的甲硫氨酸被异亮氨酸置换，位置273的苏氨酸被丙氨酸置换，位置311的丙氨酸被缬氨酸置换
-位置40的丙氨酸被缬氨酸置换，位置72的脯氨酸被亮氨酸置换，位置90的苏氨酸被丙氨酸置换，位置221的缬氨酸被组氨酸置换，位置229的甲硫氨酸被异亮氨酸置换，位置273的苏氨酸被丙氨酸置换，位置311的丙氨酸被缬氨酸置换
-位置40的丙氨酸被缬氨酸置换，位置72的脯氨酸被亮氨酸置换，位置90的苏氨酸被丙氨酸置换，位置182的精氨酸被丝氨酸置换，位置229的甲硫氨酸被异亮氨酸置换，位置273的苏氨酸被丙氨酸置换，位置311的丙氨酸被缬氨酸置换(MTCC 5760)
-位置40的丙氨酸被缬氨酸置换，位置72的脯氨酸被亮氨酸置换，位置90的苏氨酸被丙氨酸置换，位置177的丙氨酸被缬氨酸置换，位置229的甲硫氨酸被异亮氨酸置换，位置273的苏氨酸被丙氨酸置换，位置311的丙氨酸被缬氨酸置换(MTCC 5761)
-位置40的丙氨酸被缬氨酸置换，位置72的脯氨酸被亮氨酸置换，位置90的苏氨酸被丙氨酸置换，位置171的缬氨酸被甲硫氨酸置换，位置229的甲硫氨酸被异亮氨酸置换，位置273的苏氨酸被丙氨酸置换，位置311的丙氨酸被缬氨酸置换(MTCC 5762)
-位置40的丙氨酸被缬氨酸置换，位置72的脯氨酸被亮氨酸置换，位置90的苏氨酸被丙氨酸置换，位置229的甲硫氨酸被异亮氨酸置换，位置260的丝氨酸被甘氨酸置换，位置273的苏氨酸被丙氨酸置换，位置311的丙氨酸被缬氨酸置换(MTCC 5763)
-位置40的丙氨酸被缬氨酸置换，位置72的脯氨酸被亮氨酸置换，位置90的苏氨酸被丙氨酸置换，位置229的甲硫氨酸被异亮氨酸置换，位置251的丝氨酸被苯丙氨酸置换，位置273的苏氨酸被丙氨酸置换，位置311的丙氨酸被缬氨酸置换(MTCC 5764)
-位置40的丙氨酸被缬氨酸置换，位置72的脯氨酸被亮氨酸置换，位置90的苏氨酸被丙氨酸置换，位置195的苯丙氨酸被亮氨酸置换，位置229的甲硫氨酸被异亮氨酸置换，位置273的苏氨酸被丙氨酸置换，位置311的丙氨酸被缬氨酸置换
-位置40的丙氨酸被缬氨酸置换，位置72的脯氨酸被亮氨酸置换，位置90的苏氨酸被丙氨酸置换，位置226的缬氨酸被异亮氨酸置换，位置229的甲硫氨酸被异亮氨酸置换，位置273的苏氨酸被丙氨酸置换，位置311的丙氨酸被缬氨酸置换
-位置40的丙氨酸被缬氨酸置换，位置72的脯氨酸被亮氨酸置换，位置90的苏氨酸被丙氨酸置换，位置229的甲硫氨酸被异亮氨酸置换，位置250的精氨酸被亮氨酸置换，位置273的苏氨酸被丙氨酸置换，位置311的丙氨酸被缬氨酸置换
-位置40的丙氨酸被缬氨酸置换，位置72的脯氨酸被亮氨酸置换，位置90的苏氨酸被丙氨酸置换，位置229的甲硫氨酸被异亮氨酸置换，位置258的谷氨酸被赖氨酸置换，位置273的苏氨酸被丙氨酸置换，位置311的丙氨酸被缬氨酸置换
-位置40的丙氨酸被缬氨酸置换，位置72的脯氨酸被亮氨酸置换，位置90的苏氨酸被丙氨酸置换，位置229的甲硫氨酸被异亮氨酸置换，位置233的甲硫氨酸被异亮氨酸置换，位置273的苏氨酸被丙氨酸置换，位置311的丙氨酸被缬氨酸置换
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-位置40的丙氨酸被缬氨酸置换，位置72的脯氨酸被亮氨酸置换，位置90的苏氨酸被丙氨酸置换，位置184的甲硫氨酸被异亮氨酸置换，位置193的异亮氨酸被缬氨酸置换，位置229的甲硫氨酸被异亮氨酸置换，位置267的苯丙氨酸被亮氨酸置换，位置273的苏氨酸被丙氨酸置换，位置311的丙氨酸被缬氨酸置换
-位置40的丙氨酸被缬氨酸置换，位置72的脯氨酸被亮氨酸置换，位置90的苏氨酸被丙氨酸置换，位置184的甲硫氨酸被异亮氨酸置换，位置193的异亮氨酸被缬氨酸置换，位置233的甲硫氨酸被异亮氨酸置换，位置229的甲硫氨酸被异亮氨酸置换，位置267的苯丙氨酸被亮氨酸置换，位置273的苏氨酸被丙氨酸置换，位置311的丙氨酸被缬氨酸置换
-位置40的丙氨酸被缬氨酸置换，位置72的脯氨酸被亮氨酸置换，位置90的苏氨酸被丙氨酸置换，位置171的缬氨酸被亮氨酸置换，位置229的甲硫氨酸被异亮氨酸置换，位置267的苯丙氨酸被亮氨酸置换，位置273的苏氨酸被丙氨酸置换，位置311的丙氨酸被缬氨酸置换(MTCC 5765)
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-位置40的丙氨酸被缬氨酸置换，位置72的脯氨酸被亮氨酸置换，位置90的苏氨酸被丙氨酸置换，位置171的缬氨酸被亮氨酸置换，位置229的甲硫氨酸被异亮氨酸置换，位置233的甲硫氨酸被异亮氨酸置换，位置267的苯丙氨酸被亮氨酸置换，位置273的苏氨酸被丙氨酸置换，位置311的丙氨酸被缬氨酸置换
-位置40的丙氨酸被缬氨酸置换，位置72的脯氨酸被亮氨酸置换，位置90的苏氨酸被丙氨酸置换，位置171的缬氨酸被亮氨酸置换，位置229的甲硫氨酸被异亮氨酸置换，位置258的谷氨酸被赖氨酸置换，位置267的苯丙氨酸被亮氨酸置换，位置273的苏氨酸被丙氨酸置换，位置311的丙氨酸被缬氨酸置换
-位置40的丙氨酸被缬氨酸置换，位置72的脯氨酸被亮氨酸置换，位置90的苏氨酸被丙氨酸置换，位置171的缬氨酸被亮氨酸置换，位置182的精氨酸被色氨酸置换，位置229的甲硫氨酸被异亮氨酸置换，位置267的苯丙氨酸被亮氨酸置换，位置273的苏氨酸被丙氨酸置换，位置311的丙氨酸被缬氨酸置换(MTCC 5766)
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-位置40的丙氨酸被缬氨酸置换，位置72的脯氨酸被亮氨酸置换，位置90的苏氨酸被丙氨酸置换，位置91的精氨酸被甘氨酸置换，位置171的缬氨酸被亮氨酸置换，位置182的精氨酸被色氨酸置换，位置229的甲硫氨酸被异亮氨酸置换，位置267的苯丙氨酸被亮氨酸置换，位置273的苏氨酸被丙氨酸置换，位置311的丙氨酸被缬氨酸置换(MTCC5768)
-位置40的丙氨酸被缬氨酸置换，位置72的脯氨酸被亮氨酸置换，位置90的苏氨酸被丙氨酸置换，位置171的缬氨酸被亮氨酸置换，位置182的精氨酸被色氨酸置换，位置229的甲硫氨酸被异亮氨酸置换，位置255的甘氨酸被天冬氨酸置换，位置267的苯丙氨酸被亮氨酸置换，位置280的丙氨酸被丝氨酸置换，位置273的苏氨酸被丙氨酸置换，位置311的丙氨酸被缬氨酸置换(MTCC 5769)
-位置40的丙氨酸被缬氨酸置换，位置53的甲硫氨酸被亮氨酸置换，位置72的脯氨酸被亮氨酸置换，位置90的苏氨酸被丙氨酸置换，位置171的缬氨酸被亮氨酸置换，位置182的精氨酸被色氨酸置换，位置229的甲硫氨酸被异亮氨酸置换，位置267的苯丙氨酸被亮氨酸置换，位置273的苏氨酸被丙氨酸置换，位置311的丙氨酸被甲硫氨酸置换(MTCC 5770)
-位置40的丙氨酸被缬氨酸置换，位置72的脯氨酸被亮氨酸置换，位置90的苏氨酸被丙氨酸置换，位置171的缬氨酸被亮氨酸置换，位置182的精氨酸被色氨酸置换，位置226的缬氨酸被异亮氨酸置换，位置229的甲硫氨酸被异亮氨酸置换，位置267的苯丙氨酸被亮氨酸置换，位置273的苏氨酸被丙氨酸置换，位置311的丙氨酸被缬氨酸置换
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-位置40的丙氨酸被缬氨酸置换，位置90的苏氨酸被丙氨酸置换，位置171的缬氨酸被亮氨酸置换，位置182的精氨酸被色氨酸置换，位置229的甲硫氨酸被异亮氨酸置换，位置267的苯丙氨酸被亮氨酸置换，位置273的苏氨酸被丙氨酸置换，位置311的丙氨酸被缬氨酸置换
-位置40的丙氨酸被缬氨酸置换，位置72的脯氨酸被亮氨酸置换，位置90的苏氨酸被丙氨酸置换，位置171的缬氨酸被亮氨酸置换，位置182的精氨酸被色氨酸置换，位置229的甲硫氨酸被异亮氨酸置换，位置267的苯丙氨酸被亮氨酸置换，位置273的苏氨酸被丙氨酸置换，位置311的丙氨酸被甲硫氨酸置换(MTCC 5772)
-位置40的丙氨酸被缬氨酸置换，位置72的脯氨酸被亮氨酸置换，位置90的苏氨酸被丙氨酸置换，位置96的苏氨酸被丝氨酸置换，位置149的异亮氨酸被苏氨酸置换，位置171的缬氨酸被亮氨酸置换，位置182的精氨酸被色氨酸置换，位置229的甲硫氨酸被异亮氨酸置换，位置267的苯丙氨酸被亮氨酸置换，位置273的苏氨酸被丙氨酸置换，位置311的丙氨酸被缬氨酸置换(MTCC 5773)
-位置40的丙氨酸被缬氨酸置换，位置72的脯氨酸被亮氨酸置换，位置90的苏氨酸被丙氨酸置换，位置171的缬氨酸被亮氨酸置换，位置177的丙氨酸被缬氨酸置换，位置182的精氨酸被色氨酸置换，位置229的甲硫氨酸被异亮氨酸置换，位置267的苯丙氨酸被亮氨酸置换，位置273的苏氨酸被丙氨酸置换，位置311的丙氨酸被缬氨酸置换
-位置40的丙氨酸被缬氨酸置换，位置72的脯氨酸被亮氨酸置换，位置90的苏氨酸被丙氨酸置换，位置171的缬氨酸被亮氨酸置换，位置182的精氨酸被色氨酸置换，位置229的甲硫氨酸被异亮氨酸置换，位置251的丝氨酸被苯丙氨酸置换，位置267的苯丙氨酸被亮氨酸置换，位置273的苏氨酸被丙氨酸置换，位置311的丙氨酸被缬氨酸置换
-位置40的丙氨酸被缬氨酸置换，位置72的脯氨酸被亮氨酸置换，位置90的苏氨酸被丙氨酸置换，位置171的缬氨酸被亮氨酸置换，位置182的精氨酸被色氨酸置换，位置229的甲硫氨酸被异亮氨酸置换，位置260的丝氨酸被甘氨酸置换，位置267的苯丙氨酸被亮氨酸置换，位置273的苏氨酸被丙氨酸置换，位置311的丙氨酸被缬氨酸置换
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-位置40的丙氨酸被缬氨酸置换，位置72的脯氨酸被亮氨酸置换，位置90的苏氨酸被丙氨酸置换，位置96的苏氨酸被丝氨酸置换，位置171的缬氨酸被亮氨酸置换，位置182的精氨酸被色氨酸置换，位置229的甲硫氨酸被异亮氨酸置换，位置255的甘氨酸被天冬氨酸置换，位置267的苯丙氨酸被亮氨酸置换，位置273的苏氨酸被丙氨酸置换，位置280的丙氨酸被丝氨酸置换，位置311的丙氨酸被缬氨酸置换
-位置40的丙氨酸被缬氨酸置换，位置72的脯氨酸被亮氨酸置换，位置90的苏氨酸被丙氨酸置换，位置96的苏氨酸被丝氨酸置换，位置171的缬氨酸被亮氨酸置换，位置182的精氨酸被色氨酸置换，位置229的甲硫氨酸被异亮氨酸置换，位置241的丙氨酸被缬氨酸置换，位置267的苯丙氨酸被亮氨酸置换，位置273的苏氨酸被丙氨酸置换，位置307的缬氨酸被丙氨酸置换，位置311的丙氨酸被缬氨酸置换
-位置40的丙氨酸被缬氨酸置换，位置72的脯氨酸被亮氨酸置换，位置90的苏氨酸被丙氨酸置换，位置96的苏氨酸被丝氨酸置换，位置171的缬氨酸被亮氨酸置换，位置182的精氨酸被色氨酸置换，位置229的甲硫氨酸被异亮氨酸置换，位置267的苯丙氨酸被亮氨酸置换，位置273的苏氨酸被丙氨酸置换，位置311的丙氨酸被缬氨酸置换
-位置40的丙氨酸被缬氨酸置换，位置72的脯氨酸被亮氨酸置换，位置90的苏氨酸被丙氨酸置换，位置108的甘氨酸被天冬氨酸置换，位置171的缬氨酸被亮氨酸置换，位置182的精氨酸被色氨酸置换，位置229的甲硫氨酸被异亮氨酸置换，位置267的苯丙氨酸被亮氨酸置换，位置273的苏氨酸被丙氨酸置换，位置311的丙氨酸被缬氨酸置换(MTCC 5775)。
本发明的另一个实施方案是提供一种编码所述突变的羟化酶的分离的核酸分子。依照本发明，该分离的核酸分子是通过突变野生型羟化酶获得的。诱变技术可以是通过化学、易错PCR或定点方法。可选择合适的诱变技术用于引入突变，可将突变的核酸分子进行克隆和表达，并可对多肽的性质进行研究。
在本发明的一个方面，所述突变的核酸可与β-内酰胺酶信号肽序列融合，并且表达的融合蛋白用于增强的可溶蛋白表达。
在本发明的另一方面，所述突变的核酸分子可被整合到重组载体中，所述重组载体当被转入宿主细胞中时能够表达或复制。所述多肽的表达可由调控序列(可能为启动子)控制。
所述重组载体可被导入宿主菌株中以产生所述突变的脱乙酰基头孢菌素C合酶。
当所述突变的羟化酶在宿主菌株中表达时，能够通过羟化作用将通式(II)的底物苯乙酰基-7-ADCA转化为通式(I)的苯乙酰基-7-HACA。通过使用Pen G酰胺酶的酶法水解可由苯乙酰基-7-HACA获得7-HACA，或者在通过乙酰基转移酶进行的乙酰化或合适的化学转化接着使用Pen G酰胺酶的酶法水解后而由苯乙酰基-7-HACA获得7-ACA。
依照本发明，所述修饰的肽具有与SEQ ID NO:1的氨基酸序列不同的氨基酸序列。该多肽是具有羟化活性的多肽，即催化苯乙酰基-7-ADCA的3-甲基侧链羟化为3-羟甲基。所述多肽的羟化活性被修饰或被增加，并且对于除了其天然底物之外的底物的催化活性也被增加。本发明提供一种修饰的羟化酶，所述羟化酶与野生型羟化酶相比，具有增强的催化活性或者对其他底物如苯乙酰基-7-ADCA的增加的特异性。
因此，从所述突变的核苷酸序列生成的多肽可用于产生嵌合体，所述嵌合体来自其他扩环酶-羟化酶、扩环酶和羟化酶多肽的部分。
本发明的多肽可被纯化为具有不同水平的同质性，并可用于其他目的。
本发明可作为酶学技术或基于体内发酵的技术用于制造修饰的头孢菌素。文献报道了详细的程序，例如这类细胞的转化和发酵、纯化和分离。
本发明的另一个实施方案提供一种产生和处理所述用于催化对脱乙酰氧基头孢菌烷酸的羟化作用的蛋白的方法。
可将具有经修饰的羟化酶的大肠杆菌(Escherichia coli)BL21菌株在烧瓶或者发酵罐中表达，诱导前温度为25℃或更低。诱导前在高于25℃下的培养会产生包涵体，可以在诱导后12-25小时出现有活性且可溶形式的最佳表达。可用IPTG诱导细胞，在诱导后12-30小时间的任意时间收集细胞，优选14-20小时，甚至更优选16-20小时。诱导的OD600nm可优选为60以上，更优选80以上，甚至更优选120以上。
可以在加入适当量的重悬缓冲液之后，通过任何方法裂解通过发酵获得的细胞沉淀物，所述方法包括但不限于超声处理、高压匀浆、小珠研磨、冻融或通过添加任何化学药品。
依照本发明，可通过一种方法或多种方法的组合富集通过发酵产生的酶，以获得可用于催化对脱乙酰氧基头孢菌烷酸的羟化作用的酶。所述方法可包括在Tris缓冲液或磷酸盐缓冲液的存在下使所述蛋白与任何含有二乙氨乙基(DEAE)或其他弱阴离子交换官能团的基质结合，并用0.4M氯化钠(NaCl)溶液洗脱。替代的方法可包括向细胞裂解物中加入0.3％(v/w)的聚乙烯亚胺(PEI)，并将所述酶捕捉到所形成的沉淀物中，或者通过加入0.4M NaCl将所述酶从所述沉淀物中释放到溶液中。在另一替代方法中，可加入0.1％(v/v)PEI，搅拌适当时间，优选1小时，再进行离心。向离心物中加入60％硫酸铵(w/w)，接着搅拌一段时间并离心。所获得的含有所述活性蛋白质的沉淀物可用于进一步处理。因此，从以上任意方法获得的活性蛋白质可作为溶液或作为冻干固体或作为固定的固体或作为颗粒使用。
本发明的另一个实施方案提供一种用于制备脱乙酰基头孢菌烷酸(式I)的大规模方法
其中，R可为以下任何基团，包括但不限于：氢、苯乙酰基、氨基己二酰基、戊二酰基等。
可从其中获得羟化酶或扩环酶/羟化酶的微生物为，但不限于，例如棒状链霉菌、耐内酰胺诺卡尔菌(Nocardia lactamdurans)(以前被称为耐内酰胺链霉菌(Streptomyces lactamdurans))、产内酰胺黄单胞杆菌(Xanthomonas lactamgenus)、黄杆菌属(Flavobacterium sp)、Streptomyces organanencis、产内酰胺链霉菌(Streptomyces lactamgens)、弗氏链霉菌(Streptomyces fradiae)、黑色链霉菌(Streptomyces griseus)、Streptomyces ofivaceus和顶头孢霉。
底物托乙酰氧基头孢菌烷酸在反应体系中的起始浓度可为0.5-10％，优选1-10％，甚至更优选2-10％，甚至更优选3-10％，甚至更优选4-10％，甚至更优选5-10％。
本发明的另一方面提供一种制备脱乙酰基头孢菌烷酸(式I)的方法，所述方法包括以下步骤：
1)将通式(II)的脱乙酰氧基头孢菌烷酸溶解在水性介质中；
2)加入与脱乙酰氧基头孢菌烷酸和硫酸亚铁相比1-3摩尔比的α-酮戊二酸、0.1-1摩尔比的抗坏血酸；
3)加入所述酶头孢菌素羟化酶；
4)在pH 5-8.5和5-25℃的温度下进行反应。
5)分离式(II)的化合物
可在反应起始时或在反应过程中的一段时间内全部加入脱乙酰氧基头孢菌烷酸。可以使用任何碱例如氨水、碳酸氢钠、氢氧化钠将所述脱乙酰氧基头孢菌烷酸溶解于水中。
可在反应起始时或在反应过程中向反应体系中全部加入1-3摩尔比的α-酮戊二酸，优选1-2摩尔比，甚至更优选1-1.5摩尔比。可在反应起始时或在反应过程中向反应体系中全部加入0.1-1，优选0.2-0.8摩尔比的抗坏血酸。
酶添加物可作为溶液或固体、以游离形式或捕获在基质上或固定在基质上的形式使用，并且酶添加物可在反应开始时或在反应过程中被全部加入。
反应可以在pH 5-8.5，优选6.0-8，更优选6.5-7.5的任何pH的范围内，并在5-25℃，优选10-25℃，甚至更优选15-25℃的温度下进行。
参照下文的实施例本发明将变得更加清楚。下文描述的实施例仅以举例说明的形式给出，并不意欲对本发明进行任何限制。
含有本发明的修饰的羟化酶基因的大肠杆菌BL21(DE3)菌株按照布达佩斯条约下保藏在印度昌迪加尔微生物菌种保藏中心(MicrobialType Culture Collection)，并被指定了登录号(MTCC 5740、MTCC5742至MTCC 5745、MTCC 5750至MTCC 5775)(在表-1中用±标记指示)。
材料：
所有化学品和试剂均购自美国Sigma-Aldrich Chemicals Pvt.Ltd或USB。寡核苷酸由印度班加罗尔Eurofins Genomics合成并提供。用于克隆的限制性内切酶、pUC19载体和菌株从美国New EnglandBiolabs Inc获得。用于表达的pET24a载体、大肠杆菌BL21(DE3)表达宿主菌株和Bugbuster试剂购自美国Novagen。棒状链霉菌从美国典型菌种保藏中心(ATCC)获得。Bradford试剂购自美国Biorad。C18柱(50x 4.6mm,5μ,Xterra)从美国Waters获得。DNeasy Plant minigDNA分离试剂盒和QIAEX II凝胶提取试剂盒由德国Qiagen提供，生长培养基成分从美国Becton Dickinson获得。
棒状链霉菌生长条件：
将棒状链霉菌菌株(ATCC No.27064)在YMG培养基上生长，所述YMG培养基含有溶于1升蒸馏水的酵母提取物4gm、麦芽提取物10gm和葡萄糖4gm，pH为7。将培养物在25℃和180rpm下进行孵育48小时。OD600nm达到3时，收集菌丝体并在16,000rpm下离心15分钟后收集细胞沉淀物。
聚合酶链式反应：
使用DNeasy Plant mini gDNA分离试剂盒(Qiagen)按照该试剂盒提供的方案，从菌丝体中分离出基因组DNA。使用20p摩尔的引物
5’CCATATGGCGGACACGCCCGTACC3’和5′CCCGGCTTGAATGCAACGACGAGCAT3′，
、200μΜdNTP、10％DMSO、deep vent DNA聚合酶缓冲液、2U deepvent DNA聚合酶、1mM MgSO4和水(100μl的终反应体积)扩增编码羟化酶的基因(cefF)(登录号：M63809)。PCR条件包括95℃初始变性5分钟，接着24个循环的95℃变性40秒、60℃退火1分钟、72℃延伸5分钟，最后72℃延伸15分钟。通过琼脂糖凝胶电泳验证cefF基因片段的长度约为1kb的扩增产物。
在pUC19和pET24a中进行克隆：
通过QIAEX II凝胶提取试剂盒(Qiagen)对扩增后获得的羟化酶基因片段进行纯化，并使用SmaI限制酶切位点通过平末端连接将所述羟化酶基因片段克隆到pUC19载体中以提供pOBTF载体。随后，通过使用NdeI/EcoRI进行消化而释放所述羟化酶基因片段，并将所述羟化酶基因片段连接到以类似方式消化的pET24a(+)中以得到pOCPLF载体，并将所述pOCPLF载体转化到感受态大肠杆菌BL21(DE3)菌株中用于进一步表达。
β-内酰胺酶融合蛋白的产生：
(从Sigma Aldrich)获得包含β-内酰胺酶信号肽基因和cefF的起始密码子的引物，并通过运行30个循环的无引物PCR而将所述引物与cefF基因融合。随后，将该PCR产物作为模板用于另一组PCR(30个循环)，其中正向引物含有β-内酰胺酶信号序列的一部分，反向引物含有所扩增的(3’端的)cefF序列。PCR条件保持与前文描述的用于扩增cefF基因的条件相同。将PCR混合物在琼脂糖凝胶中进行电泳，使用从班加罗尔Sigma Aldrich获得的凝胶提取试剂盒从凝胶中提取基因产物。使用常规分子生物学方法通过使用SmaI限制酶切位点的平末端连接将所分离的融合基因产物克隆到pBSK中。随后，通过使用NcoI&Hind III进行消化而释放β-内酰胺酶信号—cefF(BF)基因片段，并将所述β-内酰胺酶信号—cefF基因片段连接到以类似方式消化的pET24a中以得到pBFP载体，并将所述pBFP载体转化到感受态大肠杆菌BL21(DE3)菌株中用于进一步表达融合构建体。表达和活性的测量结果表明其活性比对应亲本构建体的活性高2倍。
诱变和文库建立：
将pOBTF载体作为起始模板用于随机和定点诱变以产生cefF基因变体。通过在以DNA聚合酶进行的DNA合成过程中采用有利于纳入非互补核苷酸的诱变条件而以聚合酶链式反应(PCR)扩增cefF基因，从而实现随机诱变(易错PCR诱变)。这可以通过选择适当的DNA聚合酶(例如，Taq DNA聚合酶已经被用于一些用于随机诱变的研究中)和/或通过改变PCR反应混合物的组成以增强易错聚合酶活性(例如，通过对dNTP的浓度有所偏向而不是使用等摩尔的所有四种dNTP的混合物)而实现。详细方法可参考文章Cirino PC,et al.,Generating mutantlibraries using error-prone PCR,Methods Mol Biol.2003；231:3-9及其中的参考文献。将由此获得的CefF基因的突变型拷贝克隆到表达载体pET24a中，并将所述表达载体pET24a转化到表达菌株大肠杆菌BL21(DE3)中以建立表达cefF蛋白的突变体/变体的克隆文库。将转化过程中获得的单个菌落培养在96孔培养板中，并以甘油储液形式保存在-80℃下。还可以通过产生突变体的组合而改善所需性质，所述突变体的组合是通过采用例如DNA改组的步骤[Joern JM.DNA shuffling,Methods Mol Biol.2003；231:85-89]进行的随机诱变(随机组合)和/或通过定点诱变(特定组合)而获得的。还可以通过以例如位点-饱和诱变和/或定点诱变的步骤纳入并非通过随机诱变获得的氨基酸的氨基酸，而进一步优化突变体。详细方案可见于文章Georgescu R,et al.,Saturation mutagenesis,Methods Mol Biol.2003；231:75-83和MiyazakiK.Creating random mutagenesis libraries by megaprimer PCR ofwhole plasmid(MEGA WHOP),Methods Mol Biol.2003；231:23-28以及其中的参考文献。一旦一个突变体被鉴定为具有所需性质(在本发明的情况下为改善的活性)，则该突变体就可作为下一轮定向进化的模板，下一轮定向进化包括上文所述的一些或全部步骤。
用于筛选的文库克隆的表达：
含有位于大肠杆菌BL21(DE3)菌株的pET24a(+)载体中的假定的突变型cefF基因的甘油储液接种到包含具有卡那霉素(75μg/ml)的LB培养基的96孔板中，37℃和260rpm下生长过夜。将过夜培养物再次传代培养到含有1ml LB培养基的96孔深孔板中，并在37℃下生长直至OD600nm达到0.4-0.6，然后用0.1mM异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)进行诱导。诱导后，使所述培养物在25℃下生长5小时，通过在微孔板离心机中在4℃下以4,000rpm离心10分钟而收集细胞。将所得沉淀物在-80℃下保存直至进一步使用。
用于活性筛选的测定法：
使用bugbuster试剂释放来自所表达的克隆的酶，用45mMα-酮戊二酸、9mM抗坏血酸、0.1mM硫酸亚铁、355mM Tris.HCl和0.56％苯乙酰基-7-ADCA(反应体积为200μL)，在25℃下以220rpm振荡180分钟而测定羟化反应。用200μL甲醇终止反应，并通过HPLC进行分析。将活性数据制成表1，以野生型酶作为100％基准。
羟化酶活性的高效液相色谱法监测
在Shimadzu 2010C上采集所有HPLC数据。将C18Xterra柱用缓冲液平衡，所述缓冲液含有溶于800ml水和200ml乙腈中的3.12g磷酸钠，pH用正磷酸调至2.4。用缓冲液A以2.5ml/min的流速洗脱所述测定组分。注入20μL的样品，在260nm下检测组分。对于苯乙酰基脱乙酰基-7-ACA和苯乙酰基-7-ADCA，在这些条件下的化合物保留时间分别为0.65分钟和1.3分钟。
大规模的蛋白质表达：
按照Lee SY.and Chang HN.,Biotechnology Letters,15,971-974,1993所描述制备发酵培养基。
将4-5％的在R/2培养基中以摇瓶培养了6-8小时的种子接种物转接到发酵罐中，在25摄食度下振荡培养以保持溶氧量为至少40％。耗尽原有葡萄糖后，开始给料以保持剩余葡萄糖为0.1g/L。OD600nm达到约40-150后，加入0.1mM IPTG以诱导蛋白生成。诱导后进一步培养细胞12-18小时然后收集细胞。
细胞裂解：
获得来自高细胞密度发酵的细胞沉淀物(20g)，并将所述细胞沉淀物重悬于200ml重悬缓冲液(50mM Tris pH 8.0、1mM DTT和10％甘油)中。完全重悬后，加入200μL的100mg/ml溶菌酶并搅拌20分钟。通过超声15分钟裂解细胞，或者可使用匀浆器裂解细胞。
酶处理：
通过以下方法之一或这些方法的组合而对酶进行处理。
a)柱纯化：
将细胞裂解物以13000rpm离心15分钟，保留上清液并弃去沉淀物。如下文所述使用来自GE healthcare的AKTA纯化器对上清液进行柱纯化。
柱：XK26/20
基质：DE52whatmann或者任何含有二乙氨乙基(DEAE)或弱阴离子交换官能团的基质。
流速：5m/min
起始缓冲液：50mM Tris pH 8.0、1mM DTT和10％甘油
洗脱缓冲液：50mM Tris pH 8.0、1mM DTT和10％甘油+0.4MNacl
将柱子用10个柱体积的水冲洗，然后用10个柱体积的起始缓冲液平衡。将样品上样到柱中，用起始缓冲液冲洗直至穿透物(flow through)不具有UV吸光度。用洗脱缓冲液洗脱蛋白。
b)通过PEI进行的蛋白质沉淀
方法1：向裂解物中加入0.3％(v/w)的PEI，并搅拌60分钟。将样品以4000rpm离心10分钟，保留沉淀物并弃去上清液。
方法2：将细胞裂解物以13000rpm离心15分钟，保留上清液并弃去沉淀物。向上清液中加入0.3％(v/w)的PEI，并搅拌60分钟。将样品以4000rpm离心10分钟，保留沉淀物并弃去上清液。
方法3：将细胞裂解物以13000rpm离心15分钟，保留上清液并弃去沉淀物。向上清液中加入0.3％(v/w)的PEI并搅拌60分钟。将样品以4000rpm离心10分钟，保留沉淀物并弃去上清液。将沉淀物重悬于洗脱缓冲液(50mM Tris pH 8.0、1mM DTT和10％甘油+0.4MNaCl)15分钟，然后以4000rpm离心10分钟。保留上清液用于反应。
硫酸铵分级分离：
获得细胞沉淀物(20g)，将细胞沉淀物重悬于200ml重悬缓冲液(50mM Tris pH 8.0、1mM DTT和10％甘油)中。完全重悬后，加入200μL来自100mg/ml储液的溶菌酶，搅拌20分钟。对样品超声(功率级0.5，振幅60％)15分钟。加入0.1％的PEI并搅拌60分钟。将样品以4000rpm离心10分钟，取上清液并弃去沉淀物。向上清液中加入硫酸铵(60％w/w)并搅拌过夜。然后将溶液以13000rpm离心10分钟。将含有活性蛋白质的沉淀物用于进一步反应。所有以上步骤均在4℃下进行。
蛋白质冻干：
将20g沉淀物重悬于100ml的50mM缓冲液——含有100μL的溶菌酶(100mg/ml)的pH7.0磷酸盐缓冲液。通过超声对细胞悬液进行裂解。将溶液以10000rpm离心30-40分钟并提取上清液。向其中加入2.5ml的PEI(来自10％储液)并搅拌2小时。将溶液以10000rpm离心15分钟，并向上清液中加入1％的PEG 6000，搅拌10-30分钟。冷冻所述样品并用于冻干。在20-24小时内获得自由流动的固体形式的冻干蛋白质。
反应监测：
使用360mg苯乙酰基7-ADCA、239mgα-酮戊二酸、95mg抗坏血酸和2.64mg硫酸亚铁并使用120mg的酶，在pH 7.3下，反应体积为20ml，在15℃下连续搅拌300分钟，而进行羟化反应。通过HPLC对反应进行监测，所述HPLC是通过取10μL反应混合物，用20μL甲醇和90μL水终止反应，离心并分析上清液而实现的。反应完成95-97％时指示达到终点。
表1：显示出改善的羟化作用的突变体的详情。
将每种突变体的相对活性与野生型酶(图-1)的活性进行比较，将野生型酶的活性设置为100％。
以上表格清楚地表明，与对应的野生型相比，本发明的突变的羟化酶具有显著更高的对式(II)化合物的羟化活性。由于本发明的突变的羟化酶的活性比天然羟化酶的活性高10倍以上，因此本发明提供了用于以低成本生产规模制备式(I)化合物的生物过程。由于鉴定了所述突变的羟化酶，本发明提供了一种用于制备多种头孢菌素药物/中间体的环保绿色方法。
Claims (17)
1.一种用于产生式(I)的化合物的突变型羟化酶，所述突变型羟化酶具有增加的活性和对式(II)的化合物具有更高的底物特异性，所述突变型羟化酶与野生型羟化酶相比具有一个或多个在来自以下残基的残基位置上的氨基酸修饰：位置7的脯氨酸、位置40的丙氨酸、位置51的苏氨酸、位置53的甲硫氨酸、位置82的谷氨酸、位置91的精氨酸、位置96的苏氨酸、位置108的甘氨酸、位置149的异亮氨酸、位置171的缬氨酸、位置177的丙氨酸、位置182的精氨酸、位置184的甲硫氨酸、位置193的异亮氨酸、位置195的苯丙氨酸、位置209的谷氨酰胺、位置210的丙氨酸、位置226的缬氨酸、位置233的甲硫氨酸、位置236的亮氨酸、位置237的丙氨酸、位置241的丙氨酸、位置249的缬氨酸、位置250的精氨酸、位置251的丝氨酸、位置255的甘氨酸、位置258的谷氨酸、位置260的丝氨酸、位置267的苯丙氨酸、位置280的丙氨酸、位置307的缬氨酸和位置313的天冬酰胺，
其中R代表氢、苯乙酰基、苯氧乙酰基、氨基己二酰基和戊二酰基。
2.权利要求1的突变型羟化酶，其与野生型羟化酶相比还具有一个或多个在来自以下残基的残基位置上的氨基酸修饰：位置16的谷氨酸、位置38的酪氨酸、位置72的脯氨酸、位置90的苏氨酸、位置150的缬氨酸、位置186的脯氨酸、位置206的缬氨酸、位置221的缬氨酸、位置229的甲硫氨酸、位置273的苏氨酸、位置304的苏氨酸和位置311的丙氨酸。
3.权利要求1和2的突变型羟化酶及其对应基因，其中所述野生型羟化酶及其对应基因从棒状链霉茵(Streptomyces clavuligerus)中获得(图-1)。
4.权利要求1的突变型羟化酶，其在一个或多个残基位置上包含选自以下的氨基酸置换：
P7L，A40V，T51M，M53L，E82D，R91G，T96S，G108D，I149T，V171L，V171M，A177V，R182S，R182W，M184I，I193V，F195L，Q209E，A210V，V226I，M233I，L236V，A237V，A241V，V249I，R250L，S251F，G255D，E258K，S260G，F267L，A280S，V307A和N313D。
5.权利要求4的突变型羟化酶，其还具有一个或多个选自以下的具体氨基酸置换：
E16G，Y38C，P72L，T90A，T90G，T90D，V150A，P186L，V206I，V221A，V221P，V221H，V221T，M229V，M229I，T273A，T304A，A311M和A311V。
6.权利要求1的突变型羟化酶，其包含以下氨基酸置换：
i)P72L，T90A，V206I，A210V，A311V
ii)P7L，P72L，T90A，A237V，A311V
iii)T51M，P72L，T90A，A311V
iv)A40V，P72L，T90A，A311V
v)P72L，T90A，A237V，A311V
vi)P72L，T90A，M233I，A311V
vii)P72L，T90A，E258K，A311V
viii)P72L，T90A，F195L，A311V
ix)P72L，T90A，R250L，A311V
x)P72L，T90A，V226I，A311V
xi)P72L，T90A，V206I，A210V，T273A，A311V
xii)P7L，P72L，T90A，A237V，T273A，A311V
xiii)P7L，P72L，T90A，T273A，A311V
xiv)P72L，T90A，A237V，T273A，A311V
xv)T51M，P72L，T90A，T273A，A311V
xvi)A40V，P72L，T90A，T273A，A311V
xvii)P72L，T90G，A237V，T273A，A311V
xviii)T51M，P72L，T90A，A237V，T273A，A311V
xix)A40V，P72L，T90A，A237V，T273A，A311V
xx)T51M，P72L，T90A，M229I，T273A，A311V
xxi)A40V，P72L，T90A，M229I，T273A，A311V
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lxiv)A40V，P72L，T90A，V171L，R182W，M229I，S260G，F267L，T273A，A311V
lxv)A40V，P72L，T90A，R91G，V171L，R182W，M229I，A241V，F267L，T273A，V307A，A311V
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lxx)A40V，P72L，T90A，G108D，V171L，R182W，M229I，F267L，T273A，A311V
7.权利要求1或6的突变型羟化酶，包含以下氨基酸置换：
-P72L，T90A，V206I，A210V，A311V
-P7L，P72L，T90A，A237V，A311V
-T51M，P72L，T90A，A311V
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-P72L，T90A，A237V，A311V
-P72L，T90A，M233I，A311V
-P72L，T90A，E258K，A311V
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-P72L，T90A，R250L，A311V
-P72L，T90A，V226I，A311V
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-A40V，P72L，T90A，M184I，I193V，M229I，T273A，A311V
-A40V，P72L，T90A，V171L，M229I，T273A，A311V
-A40V，P72L，E82D，T90A，E209Q，M229I，L236V，V249I，T273A，A311V
-A40V，P72L，T90A，R182S，M229I，T273A，A311V
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-A40V，P72L，T90A，T96S，I149T，V171L，R182W，M229I，F267L，T273A，A311V
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-A40V，P72L，T90A，G108D，V171L，R182W，M229I，F267L，T273A，A311V
8.含有权利要求1、6和7的羟化酶基因的载体。
9.具有权利要求8的重组载体且能够表达所述基因的微生物。
10.一种在权利要求9描述的生物体中表达所述酶的方法。
11.权利要求10所述的表达的酶用于合成头孢茵素的用途。
12.与权利要求3具有显著序列同一性的酶，其中权利要求1的一个或多个氨基酸位置在所述第二种酶的类似位置上被修饰。
13.一种生成任何α-酮戊二酸依赖的头孢茵素羟化酶的发酵条件，其中诱导前温度保持在25℃或更低，诱导后12-20小时收集细胞以及诱导OD600nm在120-180范围内；优选120-150。
14.一种制备任何如权利要求1或6所述的α-酮戊二酸依赖的头孢茵素羟化酶的方法，其中通过通过使用具有二乙氨乙基官能团的基质或通过通过加入PEI以沉淀所述蛋白或通过使用硫酸铵进行分级分离或通过所述方法的结合从细胞裂解物中部分纯化所述酶。
15.一种制备式(I)的化合物的方法，所述方法包括在水性介质中使式(II)的化合物与权利要求1或权利要求6所要求保护的酶反应。
16.权利要求15的方法，其中所述反应是在以下条件下进行：温度为5-25℃的范围，pH保持在6-8之间，在存在α-酮戊二酸、抗坏血酸和硫酸亚铁的情况下。
17.基本上如本文中参照说明书所描述的突变型羟化酶。
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