CN107557348B - 头孢菌素羟化酶突变体、编码该突变体的dna、使用该突变体的方法及其应用 - Google Patents

头孢菌素羟化酶突变体、编码该突变体的dna、使用该突变体的方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了头孢菌素羟化酶突变体、编码该突变体的DNA、使用该突变体的方法及其应用。所述头孢菌素羟化酶突变体的氨基酸序列以序列表中的SEQ ID NO.:2为参考序列，具有位于第29位甘氨酸、第40位丙氨酸、第41位甘氨酸、第182位精氨酸和第272位苏氨酸中的至少一者的突变，并且与野生型头孢菌素羟化酶相比，所述头孢菌素羟化酶突变体的酶活性高至少10％，耐热性高至少150％。本发明的头孢菌素羟化酶突变体具有提高的催化活性和耐热性，更适于商业和工业应用。

Description

头孢菌素羟化酶突变体、编码该突变体的DNA、使用该突变体 的方法及其应用
技术领域
本发明属于基因工程和蛋白质工程领域，具体而言，涉及头孢菌素羟化酶突变体、编码该突变体的DNA、使用该突变体的方法及其应用。
背景技术
脱乙酰-7-氨基头孢烷酸(D-7-ACA)(式1)是头孢类抗生素的前体之一。目前其由7-氨基头孢烷酸(7-ACA)(式2)制备。脱乙酰-7-氨基头孢烷酸也可经苯乙酰脱乙酰-7-氨基头孢烷酸(G-D-7-ACA)(式3)从7-苯乙酰基脱乙酰氧基头孢菌素(G-7-ADCA)(式4)用酶法合成；所涉的酶分别是青霉素酰化酶和头孢菌素羟化酶。
Figure BDA0001038788190000011
Figure BDA0001038788190000021
目前，上述头孢菌素羟化酶对商业上比较容易取得的底物苯乙酰-7-ADCA的活力低(参见WO 2008/107782；445/CHE/2009,Coque,J.J.R.,等；Appl.Microbiol.Biotechnol.44,605-609,1996；EP465189；US6,180,361)。因此，科学家们正在努力改善其活力(WO2013/105030)。
目前仍需提高头孢菌素羟化酶的耐热性和其对G-7-ADCA的催化活性。
发明内容
为解决上述现有技术中所存在的问题，本发明提供了头孢菌素羟化酶突变体、编码该突变体的DNA、使用该突变体的方法及其应用。
具体而言，本发明提供了：
(1)一种头孢菌素羟化酶突变体，其特征在于其氨基酸序列以序列表中的SEQ IDNO.:2为参考序列，具有位于第29位甘氨酸、第40位丙氨酸、第41位甘氨酸、第182位精氨酸和第272位苏氨酸中的至少一者的突变，并且与野生型头孢菌素羟化酶相比，所述头孢菌素羟化酶突变体的酶活性高至少10％，耐热性高至少150％。
(2)根据(1)所述的头孢菌素羟化酶突变体，其特征在于所述第29位甘氨酸突变为组氨酸。
(3)根据(1)所述的头孢菌素羟化酶突变体，其特征在于所述第40位丙氨酸突变为亮氨酸。
(4)根据(1)所述的头孢菌素羟化酶突变体，其特征在于所述第41位甘氨酸突变为苏氨酸。
(5)根据(1)所述的头孢菌素羟化酶突变体，其特征在于所述第182位精氨酸突变为天冬氨酸。
(6)根据(1)所述的头孢菌素羟化酶突变体，其特征在于所述第272位苏氨酸突变为精氨酸。
(7)根据(1)所述的头孢菌素羟化酶突变体，其特征在于其具有位于第29位甘氨酸和第41位甘氨酸的突变。
(8)根据(7)所述的头孢菌素羟化酶突变体，其特征在于所述第29位甘氨酸突变为组氨酸，并且所述第41位甘氨酸突变为苏氨酸。
(9)根据(1)所述的头孢菌素羟化酶突变体，其特征在于其具有位于第29位甘氨酸、第41位甘氨酸和第272位苏氨酸的突变。
(10)根据(9)所述的头孢菌素羟化酶突变体，其特征在于所述第29位甘氨酸突变为组氨酸，所述第41位甘氨酸突变为苏氨酸，并且所述第272位苏氨酸突变为精氨酸。
(11)根据(1)所述的头孢菌素羟化酶突变体，其特征在于其具有位于第29位甘氨酸、第40位丙氨酸、第41位甘氨酸和第272位苏氨酸的突变。
(12)根据(11)所述的头孢菌素羟化酶突变体，其特征在于所述第29位甘氨酸突变为组氨酸、所述第40位丙氨酸突变为亮氨酸、所述第41位甘氨酸突变为苏氨酸，并且所述第272位苏氨酸突变为精氨酸。
(13)根据(1)所述的头孢菌素羟化酶突变体，其特征在于其具有位于第29位甘氨酸、第40位丙氨酸、第41位甘氨酸、第182位精氨酸和第272位苏氨酸的突变。
(14)根据(13)所述的头孢菌素羟化酶突变体，其特征在于所述第29位甘氨酸突变为组氨酸、所述第40位丙氨酸突变为亮氨酸、所述第41位甘氨酸突变为苏氨酸、所述第182位精氨酸突变为天冬氨酸，并且所述第272位苏氨酸突变为精氨酸。
(15)一种DNA，其含有编码(1)-(14)中任一项所述的头孢菌素羟化酶突变体的核苷酸序列。
(16)(1)-(14)中任一项所述的头孢菌素羟化酶突变体在制备苯乙酰脱乙酰-7-氨基头孢烷酸(G-D-7-ACA)中的应用，其中所述头孢菌素羟化酶突变体以7-苯乙酰基脱乙酰氧基头孢菌(G-7-ADCA)素为底物。
(17)(1)-(14)中任一项所述的头孢菌素羟化酶突变体在制备脱乙酰-7-氨基头孢烷酸(D-7-ACA)中的应用，其中所述头孢菌素羟化酶突变体以7-苯乙酰基脱乙酰氧基头孢菌素(G-7-ADCA)为底物。
(18)(1)-(14)中任一项所述的头孢菌素羟化酶突变体在制备7-氨基头孢烷酸(7-ACA)中的应用，其中所述头孢菌素羟化酶突变体以7-苯乙酰基脱乙酰氧基头孢菌素(G-7-ADCA)为底物。
(19)一种用于制备苯乙酰脱乙酰-7-氨基头孢烷酸(G-D-7-ACA)的方法，包括使(1)-(14)中任一项所述的头孢菌素羟化酶突变体与7-苯乙酰基脱乙酰氧基头孢菌素一起反应。
(20)一种用于制备脱乙酰-7-氨基头孢烷酸(D-7-ACA)的方法，包括使(1)-(14)中任一项所述的头孢菌素羟化酶突变体与7-苯乙酰基脱乙酰氧基头孢菌素一起反应。
(21)一种用于制备7-氨基头孢烷酸(7-ACA)的方法，包括使(1)-(14)中任一项所述的头孢菌素羟化酶突变体与7-苯乙酰基脱乙酰氧基头孢菌素一起反应。
本发明与现有技术相比具有以下优点和积极效果：
本发明通过对棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus)的头孢菌素羟化酶进行基因工程改造，提高了该酶对G-7-ADCA的催化活性和耐热性。与野生型头孢菌素羟化酶相比，本发明的头孢菌素羟化酶突变体的酶活性可提高至少10％，耐热性可提高至少150％。本发明的头孢菌素羟化酶突变体更适于商业和工业应用。
具体实施方式
以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
为了解决上述现有技术中存在的问题，本发明的发明人进行了大量深入的理论研究和实验摸索，利用遗传工程和蛋白质工程技术，对棒状链霉菌的头孢菌素羟化酶进行了突变改造，最终获得了一系列具有高酶活和高耐热性的头孢菌素羟化酶突变体，可更有利地用于生产G-D-7-ACA。
具体而言，本发明提供了一种头孢菌素羟化酶突变体，其特征在于其氨基酸序列以序列表中的SEQ ID NO.:2为参考序列，具有位于第29位甘氨酸、第40位丙氨酸、第41位甘氨酸、第182位精氨酸和第272位苏氨酸中的至少一者的突变，并且与野生型头孢菌素羟化酶相比，所述头孢菌素羟化酶突变体的酶活性高至少10％，耐热性高至少150％。
优选地，所述第29位甘氨酸突变为组氨酸。
优选地，所述第40位丙氨酸突变为亮氨酸。
优选地，所述第41位甘氨酸突变为苏氨酸。
优选地，所述第182位精氨酸突变为天冬氨酸。
优选地，所述第272位苏氨酸突变为精氨酸。
优选地，所述头孢菌素羟化酶突变体同时具有位于第29位甘氨酸的突变和位于第41位甘氨酸的突变。还优选地，所述第29位甘氨酸突变为组氨酸，并且所述第41位甘氨酸突变为苏氨酸。
优选地，所述头孢菌素羟化酶突变体同时具有位于第29位甘氨酸的突变、位于第41位甘氨酸的突变、和位于第272位苏氨酸的突变。还优选地，所述第29位甘氨酸突变为组氨酸，所述第41位甘氨酸突变为苏氨酸，并且所述第272位苏氨酸突变为精氨酸。
优选地，所述头孢菌素羟化酶突变体同时具有位于第29位甘氨酸的突变、位于第40位丙氨酸的突变、位于第41位甘氨酸的突变、和位于第272位苏氨酸的突变。还优选地，所述第29位甘氨酸突变为组氨酸，所述第40位丙氨酸突变为亮氨酸，所述第41位甘氨酸突变为苏氨酸，并且所述第272位苏氨酸突变为精氨酸。
优选地，所述头孢菌素羟化酶突变体同时具有位于第29位甘氨酸的突变、位于第40位丙氨酸的突变、位于第41位甘氨酸的突变、位于第182位精氨酸的突变、和位于第272位苏氨酸的突变。还优选地，所述第29位甘氨酸突变为组氨酸，所述第40位丙氨酸突变为亮氨酸，所述第41位甘氨酸突变为苏氨酸，所述第182位精氨酸突变为天冬氨酸，并且所述第272位苏氨酸突变为精氨酸。
在本发明一个优选的实施方案中，本发明的头孢菌素羟化酶突变体具有序列表中的SEQ ID NO.:3所示的氨基酸序列。在本发明又一个优选的实施方案中，本发明的头孢菌素羟化酶突变体具有序列表中的SEQ ID NO.:4所示的氨基酸序列。在本发明又一个优选的实施方案中，本发明的头孢菌素羟化酶突变体具有序列表中的SEQ ID NO.:5所示的氨基酸序列。在本发明又一个优选的实施方案中，本发明的头孢菌素羟化酶突变体具有序列表中的SEQ ID NO.:6所示的氨基酸序列。在本发明又一个优选的实施方案中，本发明的头孢菌素羟化酶突变体具有序列表中的SEQ ID NO.:7所示的氨基酸序列。在本发明又一个优选的实施方案中，本发明的头孢菌素羟化酶突变体具有序列表中的SEQ ID NO.:8所示的氨基酸序列。在本发明又一个优选的实施方案中，本发明的头孢菌素羟化酶突变体具有序列表中的SEQ ID NO.:9所示的氨基酸序列。在本发明又一个优选的实施方案中，本发明的头孢菌素羟化酶突变体具有序列表中的SEQ ID NO.:10所示的氨基酸序列。在本发明又一个优选的实施方案中，本发明的头孢菌素羟化酶突变体具有序列表中的SEQ ID NO.:11所示的氨基酸序列。
本发明的头孢菌素羟化酶突变体可以利用本领域已知的技术对来自棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus)的野生型头孢菌素羟化酶进行定点突变而获得。所述棒状链霉菌的野生型头孢菌素羟化酶的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.:1所示，氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.:2所示。
所用技术方法和制备流程例如为，利用本领域已知的技术，构建含有野生型头孢菌素羟化酶基因的载体质粒，然后选择定点突变的位点以及突变后的氨基酸种类，合成相应的引物，以所述的含头孢菌素羟化酶基因的载体质粒为模板，PCR扩增突变DNA片段，然后以PCR将所得片段扩增为全长突变基因。通过将该全长突变基因克隆到适当的载体上并转化适当的宿主细胞，经培养筛选出具有高酶活头孢菌素羟化酶的阳性克隆。最后从阳性克隆中提取质粒DNA,进行DNA序列测定分析，以确定引入的突变。
在本发明制备头孢菌素羟化酶突变体的方法中，可采用任何合适的载体。例如，适用的载体包括但不限于原核表达载体pRSET和pET21；包括但不限于真核表达载体pYD1和pYES2/GS；包括但不限于克隆载体pGEMT-Easy、pUC18/19和pBluscript-SK。
在本发明制备头孢菌素羟化酶突变体的方法中，所获得的头孢菌素羟化酶突变基因可以在原核细胞或真核细胞内表达，也可采用本领域已知的任何适当方法实现在原核细胞或真核细胞外表达。
在本发明制备头孢菌素羟化酶突变体的方法中，所述载体的微生物宿主细胞可以为原核生物细胞或真核生物细胞。所述原核微生物包括但不限于大肠杆菌、凝结芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、解糖好热厌氧小杆菌(Thermoanaerobacteriumsaccharolyticum)和链霉菌。所述真核微生物包括但不限于酿酒酵母和毕赤巴斯德酵母。
本文所用的术语“参考序列”，当其为核苷酸序列时，是指序列表SEQ ID NO.:1的序列，当其为氨基酸序列时，是指序列表SEQ ID NO.:2的序列。
本发明的头孢菌素羟化酶突变体可以以未经纯化的粗酶形式使用，也可以是经部分纯化的或纯化的形式，也可以作为固相酶/固相细胞使用。
本发明的头孢菌素羟化酶突变体可以是以序列表SEQ ID NO.:2所示的氨基酸序列为参考序列，与其相比至少存在一个氨基酸的差异，并且酶的活性比该野生型头孢菌素羟化酶至少高10％，优选至少高10％-100％，更优选至少高250％，和/或耐热性比该野生型头孢菌素羟化酶至少高150％，优选至少高900％，更优选高2400％。优选的是，以SEQ IDNO.:2所示氨基酸序列为参考序列，具有以下至少一个突变：第29位的甘氨酸(Gly)突变为组氨酸(His)、第40位的丙氨酸(Ala)突变为亮氨酸(Leu)、第41位的甘氨酸(Gly)突变为苏氨酸(Thr)、第182位的精氨酸(Arg)突变为天冬氨酸(Asp)、和第272位的苏氨酸(Thr)突变为精氨酸(Arg)。
本发明还提供了一种DNA，其含有本发明所述的头孢菌素羟化酶突变体的核苷酸序列。
本发明还提供了本发明所述的头孢菌素羟化酶突变体在制备苯乙酰脱乙酰-7-氨基头孢烷酸(G-D-7-ACA)中的应用，其中所述头孢菌素羟化酶突变体以7-苯乙酰基脱乙酰氧基头孢菌素(G-7-ADCA)为底物。
本发明还提供了本发明所述的头孢菌素羟化酶突变体在制备脱乙酰-7-氨基头孢烷酸(D-7-ACA)中的应用，其中所述头孢菌素羟化酶突变体以7-苯乙酰基脱乙酰氧基头孢菌素(G-7-ADCA)为底物。
本发明还提供了本发明所述的头孢菌素羟化酶突变体在制备7-氨基头孢烷酸(7-ACA)中的应用，其中所述头孢菌素羟化酶突变体以7-苯乙酰基脱乙酰氧基头孢菌素(G-7-ADCA)为底物。
制备G-D-7-ACA、D-7-ACA和7-ACA可以利用本领域已知的常规方法进行，只要在各自的方法中，使用本发明所述的头孢菌素羟化酶突变体作为相应步骤所需的酶即可。
本发明还提供了一种用于制备苯乙酰脱乙酰-7-氨基头孢烷酸(G-D-7-ACA)的方法，包括使本发明所述的头孢菌素羟化酶突变体与G-7-ADCA一起反应。本领域技术人员能够理解，本发明所述的方法还可以包括使用制备G-D-7-ACA所需的其他试剂和材料。
本发明还提供了一种用于制备脱乙酰-7-氨基头孢烷酸(D-7-ACA)的方法，包括使本发明所述的头孢菌素羟化酶突变体与G-7-ADCA一起反应。本领域技术人员能够理解，本发明所述的方法还可以包括使用制备D-7-ACA所需的其他试剂和材料。
本发明还提供了一种用于制备7-氨基头孢烷酸(7-ACA)的方法，包括使本发明所述的头孢菌素羟化酶突变体与G-7-ADCA一起反应。本领域技术人员能够理解，本发明所述的方法还可以包括使用制备7-ACA所需的其他试剂和材料。
以下通过实施例的方式进一步解释或说明本发明内容，但这些实施例不应被理解为对本发明保护范围的限制。
实施例
以下实施例中未注明具体条件的，均按常规条件或制造商建议的条件进行。除非特别说明，否则所述百分比为体积百分比。
实施例1：PK载体的构建
为从载体pRSET-A(Invitrogen)去除氨苄青霉素抗性基因,根据载体pRSET-A的序列设计引物VF和VR(表1)。
为从载体pET-28b(Novogen)扩增出卡那霉素抗性基因,根据载体pET-28b(Novogen)卡那霉素抗性基因的序列设计引物KF和KR(表1)。
具体而言，以质粒pRSET-A为模板，用引物VF和VR扩增模板片段PR；以质粒pET-28b为模板，用引物KF和KR扩增模板片段KAN。
扩增模板片段PR的PCR条件为：1μg质粒pRSET-A，0.1μg引物(VF+VR)，5μl 10x缓冲液(200mM Tris-HCl(pH 8.0),100mM KCl,100mM(NH4)2SO4,20mM MgSO4,1％Triton X-100)，4％DMSO，4μl 2.5mM dNTP,1U LA Taq聚合酶(TaKaRa公司)，用无菌水调反应体积至50μl。
扩增模板片段PR的PCR反应扩增程序为：96℃5分钟，30个循环：94℃45秒、53℃45秒和72℃3分钟，最后72℃10分钟。
通过1％(w/v)琼脂糖电泳，利用E.Z.N.A.Gel Extraction试剂盒(Omega Bio-tekInc.)提纯PCR产物，分离纯化大小为2036bp的片段PR。
扩增模板片段KAN的PCR条件为：1μg质粒pET-28b，0.1μg引物(KF+KR)，5μl 10x缓冲液(200mM Tris-HCl(pH 8.0),100mM KCl,100mM(NH4)2SO4,20mM MgSO4,1％Triton X-100)，4％DMSO，4μl 2.5mM dNTP,1U LA Taq聚合酶(TaKaRa公司)，用无菌水调反应体积至50μl。
扩增模板片段KAN的PCR反应扩增程序为：96℃5分钟，30个循环：94℃45秒、53℃45秒和72℃3分钟，最后72℃10分钟。
通过1％(w/v)琼脂糖电泳，利用E.Z.N.A.Gel Extraction试剂盒(Omega Bio-tekInc.)提纯PCR产物，分离纯化大小为816bp的片段KAN。
以T4DNA连接酶(NEB公司)连接片段PR和片段KAN，获得质粒PK。将该质粒转化入感受态大肠杆菌BL21(Novagen公司)，在含50mg/L卡那霉素的LB平板上37℃培养，挑取单菌落，用DNA-spin plasmid DNA purification试剂盒(Intron Biotechnology)提取质粒PK，经DNA测序确定序列(序列表SEQ ID NO.:12)。
实施例2：头孢菌素羟化酶基因的克隆和质粒pGEMT-hd的构建
根据DNA序列数据库(GenBank:M63809)的头孢菌素羟化酶DNA序列，运用软件GeneDesigner 2.0，根据宿主细胞的密码子偏好性将该DNA序列优化。根据该基因序列设计引物HF和HR(表1)。
合成上述DNA序列，获得质粒Hd-pUC(由金斯瑞生物科技公司合成并连接到载体pUC57上)。以质粒Hd-pUC为模板，用引物对HF和HR进行PCR，扩增得到957bp产物。
PCR反应条件为：1μg质粒Hd-pUC，0.1μg引物(HF+HR)，5μl 10x缓冲液(200mMTris-HCl(pH 8.0),100mM KCl,100mM(NH4)2SO4,20mM MgSO4,1％Triton X-100)，4％DMSO，4μl 2.5mM dNTP,1U LA Taq聚合酶(TaKaRa公司)，用无菌水调反应体积至50μl。
PCR反应扩增程序为：96℃5分钟，30个循环：94℃45秒、53℃45秒和72℃3分钟，最后72℃10分钟。
扩增反应得到野生型头孢菌素羟化酶基因，通过1％(w/v)琼脂糖电泳，利用E.Z.N.A.Gel Extraction试剂盒(Omega Bio-tek Inc.)提纯PCR产物，分离纯化大小为957bp的片段hd，经TA克隆以T4DNA连接酶(NEB公司)连接至pGEMT-Easy(Promega公司)载体，获得质粒pGEMT-hd。将该质粒转化入感受态大肠杆菌BL21(Novagen公司)，在含50mg/L氨苄青霉素的LB平板上37℃培养，挑取单菌落，用DNA-spin plasmid DNA purification试剂盒(Intron Biotechnology)提取质粒pGEMT-hd，经DNA测序确定序列。
实施例3：头孢菌素羟化酶氨基酸位点41的定点突变
定点突变技术参考“PCR Protocols(John M.S.Bartlett和DavidStirling.Totowa,N.J.:Humana Press,2003)”一书之描述。
以质粒pGEMT-hd(实施例2)为模板，设计引物对41TF和41TR(表1)，将原始氨基酸序列中第41位的甘氨酸(Gly)突变为苏氨酸(Thr)，获得突变体HD-G41T。
具体而言，以质粒pGEMT-hd为模板，用引物HF和41TR扩增模板片段41T1；用引物41TF和HR扩增模板片段41T2。PCR反应条件为：1μg质粒pGEMT-hd，0.1μg引物(HF+41TR)(扩增模板片段41T1)，或0.1μg引物(41TF+HR)(扩增模板片段41T2)，5μl 10x缓冲液(200mMTris-HCl(pH 8.0)，100mM KCl,100mM(NH4)2SO4,20mM MgSO4,1％Triton X-100),4％DMSO，4μl 2.5mM dNTP,1U LA Taq聚合酶(TaKaRa公司)，用无菌水调反应体积至50μl。
PCR反应扩增程序为：96℃5分钟，30个循环：94℃45秒、53℃45秒和72℃60秒，最后72℃10分钟。
扩增得到模板片段41T1和模板片段41T2，通过1％(w/v)琼脂糖电泳，用E.Z.N.A.Gel Extraction试剂盒(Omega Bio-tek Inc.)分离纯化，之后用引物HF和HR扩增全长基因。PCR反应条件为：50ng模板片段41T1和50ng模板片段41T2，0.1μg引物(HF+HR)，5μl 10x缓冲液(200mM Tris-HCl(pH 8.0)，100mM KCl,100mM(NH4)2SO4,20mM MgSO4,1％Triton X-100),4％DMSO，4μl 2.5mM dNTP,1U LA Taq聚合酶(TaKaRa公司)，用无菌水调反应体积至50μl。
PCR反应扩增程序为：96℃5分钟，30个循环：94℃45秒、53℃45秒和72℃2分钟，最后72℃10分钟。
扩增反应得全长突变基因，通过1％(w/v)琼脂糖电泳，用E.Z.N.A.GelExtraction试剂盒(Omega Bio-tek Inc.)提纯PCR产物，分离纯化大小为957pb的全长突变基因HD-G41T。
按照与上述类似的方法构建突变体HD-G29H、HD-A40L、HD-R182D、HD-T272R，所用引物见表1。
实施例4：质粒PK-HD-G41T的构建
用E.Z.N.A.Gel Extraction试剂盒(Omega Bio-tek Inc.)提纯酶切产物，以进行分离纯化，以T4 DNA连接酶(NEB公司)连接，转化感受态大肠杆菌HB101(Bio-Rad)，在含50mg/L卡那霉素的LB平板上37℃培养，挑取单菌落，用DNA-spin plasmid DNApurification试剂盒(Intron Biotechnology)提取质粒PK-HD-G41T，经DNA测序确定序列。
按照上述类似的方法构建质粒PK-HD-G29H、PK-HD-A40L、PK-HD-R182D、PK-HD-T272R。
实施例5：头孢菌素羟化酶双突变组合PK-HD-29H41T的构建
定点突变技术参考“PCR Protocols(John M.S.Bartlett和DavidStirling.Totowa,N.J.:Humana Press,2003)”一书之描述。
以质粒PK-HD-G41T(实施例4)为模板，将氨基酸序列中第29位的甘氨酸(Gly)突变为组氨酸(His)，获得突变体HD-29H41T。
具体而言，以质粒PK-HD-G41T为模板，用引物HF和29HR扩增模板片段29H41T1；用引物29HF和HR扩增模板片段29H41T2，PCR反应条件为：1μg PK-HD-G41T，0.1μg引物(HF+29HR)(扩增模板片段29H41T1)，或0.1μg引物(29HF+HR)(扩增模板片段29H41T2)，5μl 10x缓冲液(200mM Tris-HCl(pH 8.0)，100mM KCl,100mM(NH4)2SO4,20mM MgSO4,1％Triton X-100),4％DMSO，4μl 2.5mM dNTP,1U LA Taq聚合酶(TaKaRa)，用无菌水调反应体积至50μl。
PCR反应扩增程序为：96℃5分钟，30个循环：94℃45秒、53℃45秒和72℃60秒，最后72℃10分钟。
扩增得模板片段29H41T1和模板片段29H41T2，通过1％(w/v)琼脂糖电泳，用E.Z.N.A.Gel Extraction试剂盒(Omega Bio-tek Inc.)分离纯化后，用引物HF和HR扩增全长基因。PCR反应条件为：50ng模板片段29H41T1和50ng模板片段29H41T2，0.1μg引物(HF+HR)，5μl 10x缓冲液(200mM Tris-HCl(pH 8.0)，100mM KCl,100mM(NH4)2SO4,20mM MgSO4,1％Triton X-100)，4％DMSO，4μl 2.5mM Dntp，1U LA Taq聚合酶(TaKaRa)，用无菌水调反应体积至50μl。
PCR反应扩增程序为：96℃5分钟，30个循环：94℃45秒、53℃45秒和72℃2分钟，最后72℃10分钟。
扩增反应得全长突变基因，通过1％(w/v)琼脂糖电泳，用E.Z.N.A.GelExtraction试剂盒(Omega Bio-tek Inc.)提纯PCR产物，分离纯化大小为957bp的全长突变基因HD-29H41T。
用NdeI+BglII(NEB)对突变基因HD-29H41T和载体PK进行酶切，通过1％(w/v)琼脂糖电泳，用E.Z.N.A.Gel Extraction试剂盒(Omega Bio-tek Inc.)提纯酶切产物，以进行分离纯化，以T4DNA连接酶(NEB)连接，转化感受态大肠杆菌HB101(Bio-Rad)，在含50mg/L卡那霉素的LB平板上37℃培养，挑取单菌落，用DNA-spin plasmid DNA purification试剂盒(Intron Biotechnology)提取质粒PK-HD-29H41T，经DNA测序确定序列。
实施例6：头孢菌素羟化酶三突变组合PK-HD-sp3的构建
定点突变技术参考“PCR Protocols(John M.S.Bartlett和DavidStirling.Totowa,N.J.:Humana Press,2003)”一书之描述。
以质粒PK-HD-29H41T(实施例5)为模板，将氨基酸序列中第272位的苏氨酸(Thr)突变为精氨酸(Arg)，获得突变体HD-sp3。
具体而言，以质粒PK-HD-29H41T为模板，用引物HF和272RR扩增模板片段sp3-1；用引物272RF和HR扩增模板片段sp3-2，PCR反应条件为：1μg PK-HD-29H41T，0.1μg引物(HF+272RR)(扩增模板片段sp3-1)，或0.1μg引物(272RF+HR)(扩增模板片段sp3-2)，5μl10x缓冲液(200mM Tris-HCl(pH 8.0)，100mM KCl,100mM(NH4)2SO4,20mM MgSO4,1％Triton X-100),4％DMSO，4μl 2.5mM dNTP,1U LA Taq聚合酶(TaKaRa)，用无菌水调反应体积至50μl。
PCR反应扩增程序为：96℃5分钟，30个循环：94℃45秒、53℃45秒和72℃60秒，最后72℃10分钟。
扩增得模板片段sp3-1和模板片段sp3-2，通过1％(w/v)琼脂糖电泳，用E.Z.N.A.Gel Extraction试剂盒(Omega Bio-tek Inc.)分离纯化后，用引物HF和HR扩增全长基因。PCR反应条件为：50ng模板片段sp3-1和50ng模板片段sp3-2，0.1μg引物(HF+HR)，5μl 10x缓冲液(200mM Tris-HCl(pH 8.0)，100mM KCl,100mM(NH4)2SO4,20mM MgSO4,1％Triton X-100),4％DMSO，4μl 2.5mM dNTP,1U LA Taq聚合酶(TaKaRa)，用无菌水调反应体积至50μl。
PCR反应扩增程序为：96℃5分钟，30个循环：94℃45秒、53℃45秒和72℃2分钟，最后72℃10分钟。
扩增反应得全长突变基因，通过1％(w/v)琼脂糖电泳，用E.Z.N.A.GelExtraction试剂盒(Omega Bio-tek Inc.)提纯PCR产物，分离纯化大小为957bp的全长突变基因HD-sp3。
用NdeI+BglII(NEB)对突变基因HD-sp3和载体PK进行酶切，通过1％(w/v)琼脂糖电泳，用E.Z.N.A.Gel Extraction试剂盒(Omega Bio-tek Inc.)提纯酶切产物，以进行分离纯化，以T4DNA连接酶(NEB)连接，转化感受态大肠杆菌HB101(Bio-Rad)，在含50mg/L卡那霉素的LB平板上37℃培养，挑取单菌落，用DNA-spin plasmid DNA purification试剂盒(Intron Biotechnology)提取质粒PK-HD-sp3，经DNA测序确定序列。
实施例7：头孢菌素羟化酶四突变组合PK-HD-sp4的构建
定点突变技术参考“PCR Protocols(John M.S.Bartlett和DavidStirling.Totowa,N.J.:Humana Press,2003)”一书之描述。
以质粒PK-HD-sp3(实施例6)为模板，将氨基酸序列中第40位的丙氨酸(Ala)突变为亮氨酸(Leu)，获得突变体HD-sp4。
具体而言，以质粒PK-HD-sp3为模板，用引物HF和40LR扩增模板片段sp4-1；用引物40LF和HR扩增模板片段sp4-2，PCR反应条件为：1μg PK-HD-sp3，0.1μg引物(HF+40LR)(扩增模板片段sp4-1)，或0.1μg引物(40LF+HR)(扩增模板片段sp4-2)，5μl 10x缓冲液(200mMTris-HCl(pH 8.0)，100mM KCl,100mM(NH4)2SO4,20mM MgSO4,1％Triton X-100),4％DMSO，4μl 2.5mM dNTP,1U LA Taq聚合酶(TaKaRa)，用无菌水调反应体积至50μl。
PCR反应扩增程序为：96℃5分钟，30个循环：94℃45秒、53℃45秒和72℃60秒，最后72℃10分钟。
扩增得模板片段sp4-1和模板片段sp4-2，通过1％(w/v)琼脂糖电泳，用E.Z.N.A.Gel Extraction试剂盒(Omega Bio-tek Inc.)分离纯化后，用引物HF和HR扩增全长基因。PCR反应条件为：50ng模板片段sp4-1和50ng模板片段sp4-2，0.1μg引物(HF+HR)，5μl 10x缓冲液(200mM Tris-HCl(pH 8.0)，100mM KCl,100mM(NH4)2SO4,20mM MgSO4,1％Triton X-100),4％DMSO，4μl 2.5mM dNTP,1U LA Taq聚合酶(TaKaRa)，用无菌水调反应体积至50μl。
PCR反应扩增程序为：96℃5分钟，30个循环：94℃45秒、53℃45秒和72℃2分钟，最后72℃10分钟。
扩增反应得全长突变基因，通过1％(w/v)琼脂糖电泳，用E.Z.N.A.GelExtraction试剂盒(Omega Bio-tek Inc.)提纯PCR产物，分离纯化大小为957bp的全长突变基因HD-sp4。
用NdeI+BglII(NEB)对突变基因HD-sp4和载体PK进行酶切，通过1％(w/v)琼脂糖电泳，用E.Z.N.A.Gel Extraction试剂盒(Omega Bio-tek Inc.)提纯酶切产物，以进行分离纯化，以T4DNA连接酶(NEB)连接，转化感受态大肠杆菌HB101(Bio-Rad)，在含50mg/L卡那霉素的LB平板上37℃培养，挑取单菌落，用DNA-spin plasmid DNA purification试剂盒(Intron Biotechnology)提取质粒PK-HD-sp4，经DNA测序确定序列。
实施例8：头孢菌素羟化酶五突变组合PK-HD-sp5的构建
定点突变技术参考“PCR Protocols(John M.S.Bartlett和DavidStirling.Totowa,N.J.:Humana Press,2003)”一书之描述。
以质粒PK-HD-sp4(实施例7)为模板，将氨基酸序列中第182位精氨酸(Arg)突变为天冬氨酸(Asp)，获得突变体HD-sp5。
具体而言，以质粒PK-HD-sp4为模板，用引物HF和182DR扩增模板片段sp5-1；用引物182DF和HR扩增模板片段sp5-2，PCR反应条件为：1μg PK-HD-sp4，0.1μg引物(HF+182DR)(扩增模板片段sp5-1)，或0.1μg引物(182DF+HR)(扩增模板片段sp5-2)，5μl 10x缓冲液(200mM Tris-HCl(pH 8.0)，100mM KCl,100mM(NH4)2SO4,20mM MgSO4,1％Triton X-100),4％DMSO，4μl 2.5mM dNTP,1U LA Taq聚合酶(TaKaRa)，用无菌水调反应体积至50μl。
PCR反应扩增程序为：96℃5分钟，30个循环：94℃45秒、53℃45秒和72℃60秒，最后72℃10分钟。
扩增得模板片段sp5-1和模板片段sp5-2，通过1％(w/v)琼脂糖电泳，用E.Z.N.A.Gel Extraction试剂盒(Omega Bio-tek Inc.)分离纯化后，用引物HF和HR扩增全长基因。PCR反应条件为：50ng模板片段sp5-1和50ng模板片段sp5-2，0.1μg引物(HF+HR)，5μl 10x缓冲液(200mM Tris-HCl(pH 8.0)，100mM KCl,100mM(NH4)2SO4,20mM MgSO4,1％Triton X-100),4％DMSO，4μl 2.5mM dNTP,1U LA Taq聚合酶(TaKaRa)，用无菌水调反应体积至50μl。
PCR反应扩增程序为：96℃5分钟，30个循环：94℃45秒、53℃45秒和72℃2分钟，最后72℃10分钟。
扩增反应得全长突变基因，通过1％(w/v)琼脂糖电泳，用E.Z.N.A.GelExtraction试剂盒(Omega Bio-tek Inc.)提纯PCR产物，分离纯化大小为957bp的全长突变基因HD-sp5。
用NdeI+BglII(NEB)对突变基因HD-sp5和载体PK进行酶切，通过1％(w/v)琼脂糖电泳，用E.Z.N.A.Gel Extraction试剂盒(Omega Bio-tek Inc.)提纯酶切产物，以进行分离纯化，以T4DNA连接酶(NEB)连接，转化感受态大肠杆菌HB101(Bio-Rad)，在含50mg/L卡那霉素的LB平板上37℃培养，挑取单菌落，用DNA-spin plasmid DNA purification试剂盒(Intron Biotechnology)提取质粒PK-HD-sp5，经DNA测序确定序列。
实施例9：头孢菌素羟化酶的酶活力测定
分别用上述实施例制备的野生型头孢菌素羟化酶质粒和各头孢菌素羟化酶突变体质粒转化大肠杆菌BL21细胞(Novagen公司)，在含50mg/L卡那霉素的LB平板上37℃培养，挑取单菌落，在3ml含50mg/L卡那霉素的LB培养液中在37℃、250rpm下培养8小时，然后取1ml接种至50ml含50mg/L卡那霉素的LB培养液中，在37℃、250rpm下培养18小时。离心收集细胞，悬浮于10mM pH 7.4的磷酸钠缓冲液中，用超声波(50W)裂解细胞，超声时间为5秒30次，离心去除细胞碎片，取上清液为酶液。检测酶液中头孢菌素羟化酶的活力，并以SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定酶蛋白的表达量。具体如下：
于1.5ml离心管中加入900μl底物(10mM G-7-ADCA,20mMα-酮戊二酸钠,4mM L-抗坏血酸钠和1.8mM七水硫酸亚铁,6mM磷酸钠缓冲液(pH 7.5))，然后加入如上述所制备的酶液100μl，混匀，置于200rpm 30℃恒温摇床中反应30分钟。抽取10μl上清液，加入990μl水，混匀，以UPLC测定G-D-7ACA的含量并计算酶活力。下列表2示出了野生型头孢菌素羟化酶与各头孢菌素羟化酶突变体的酶活之比较。
UPLC测定的条件如下：Acquity UPLC管柱：Acquity UPLC BEH C18管柱(WatersCorporation，1.7μm，预柱:2.1mmx5mm,柱:2.1mmx50mm)；流动相：(A)50mM磷酸二氢钾/磷酸氢二钾(pH7)，6％乙腈，(B)60％乙腈；柱温度：40℃；流速：0.3ml/分钟；检测波长：260nm。
实施例10：头孢菌素羟化酶的耐热性测定
按实施例9制备野生型头孢菌素羟化酶酶液和各头孢菌素羟化酶突变体酶液，于1.5ml离心管中分别加入200μl酶液。将离心管置于42℃水浴中进行10分钟热处理，离心后，取上清液，按实施例9所述，测定头孢菌素羟化酶的酶活。用未经热处理的头孢菌素羟化酶的酶活除经热处理的酶活，得到野生型头孢菌素羟化酶与各头孢菌素羟化酶突变体的残余酶活，用百分比表示。用以下公式计算酶耐热性增加的百分比。下列表3示出野生型头孢菌素羟化酶和各头孢菌素羟化酶突变体在热处理后的残余酶活。
Figure BDA0001038788190000181
实施例11：以G-7-ADCA为底物制备G-D-7-ACA
将终浓度分别为10mM的G-7-ADCA,20mM α-酮戊二酸钠，4mM的L-抗坏血酸钠和1.8mM的七水硫酸亚铁溶解于90ml 6mM pH 7.4的磷酸钠缓冲液中。用1M氢氧化钠溶液调至pH 6，加入10ml酶液。置于磁力搅拌器上高速搅拌,于30℃,pH 6.4反应150分钟。于30、60、90、120和150分钟的时间点分别抽取1ml反应液。以13000rpm离心1分钟，抽取10μl上清液并混匀990μl水，以UPLC测定G-D-7-ACA的浓度。
UPLC测定的条件如下：Acquity UPLC管柱：Acquity UPLC BEH C18管柱(WatersCorporation，1.7μm，预柱:2.1mmx5mm,柱:2.1mmx50mm)；流动相：(A)50mM磷酸二氢钾/磷酸氢二钾(pH7)，6％乙腈，(B)60％乙腈；柱温度：40℃；流速：0.3ml/分钟；检测波长：260nm。
本发明不受上述具体文字描述的限制，本发明可在权利要求书所概括的范围内做各种修改或改变。这些改变均在本发明要求保护的范围之内。
表1
Figure BDA0001038788190000191
表2野生型头孢菌素羟化酶与突变体的酶活比较
序列表序列编号 酶的名称 酶活(％)
SEQ ID NO.:2 野生型 100
SEQ ID NO.:3 HD-G29H 110
SEQ ID NO.:4 HD-A40L 120
SEQ ID NO.:5 HD-G41T 160
SEQ ID NO.:6 HD-R182D 140
SEQ ID NO.:7 HD-T272R 150
SEQ ID NO.:8 HD-29H41T 180
SEQ ID NO.:9 Sp3 200
SEQ ID NO.:10 Sp4 220
SEQ ID NO.:11 Sp5 250
表3突变体的耐热性
Figure BDA0001038788190000201
Figure IDA0001038788220000011
Figure IDA0001038788220000021
Figure IDA0001038788220000031
Figure IDA0001038788220000041
Figure IDA0001038788220000051
Figure IDA0001038788220000061
Figure IDA0001038788220000071
Figure IDA0001038788220000081
Figure IDA0001038788220000091
Figure IDA0001038788220000101
Figure IDA0001038788220000111
Figure IDA0001038788220000121
Figure IDA0001038788220000131
Figure IDA0001038788220000141

Claims (12)

1.一种头孢菌素羟化酶突变体，其特征在于其氨基酸序列以序列表中的SEQ ID NO.:2为参考序列，并且位于第29位的甘氨酸突变为组氨酸、和/或第40位的丙氨酸突变为亮氨酸、和/或第41位的甘氨酸突变为苏氨酸、和/或第182位的精氨酸突变为天冬氨酸、和/或第272位的苏氨酸突变为精氨酸，并且与野生型头孢菌素羟化酶相比，所述头孢菌素羟化酶突变体的酶活性高至少10％，耐热性高至少150％。
2.根据权利要求1所述的头孢菌素羟化酶突变体，其特征在于所述第29位甘氨酸突变为组氨酸，并且所述第41位甘氨酸突变为苏氨酸。
3.根据权利要求1所述的头孢菌素羟化酶突变体，其特征在于所述第29位甘氨酸突变为组氨酸，所述第41位甘氨酸突变为苏氨酸，并且所述第272位苏氨酸突变为精氨酸。
4.根据权利要求1所述的头孢菌素羟化酶突变体，其特征在于所述第29位甘氨酸突变为组氨酸、所述第40位丙氨酸突变为亮氨酸、所述第41位甘氨酸突变为苏氨酸，并且所述第272位苏氨酸突变为精氨酸。
5.根据权利要求1所述的头孢菌素羟化酶突变体，其特征在于所述第29位甘氨酸突变为组氨酸、所述第40位丙氨酸突变为亮氨酸、所述第41位甘氨酸突变为苏氨酸、所述第182位精氨酸突变为天冬氨酸，并且所述第272位苏氨酸突变为精氨酸。
6.一种DNA，其含有编码权利要求1-5中任一项所述的头孢菌素羟化酶突变体的核苷酸序列。
7.权利要求1-5中任一项所述的头孢菌素羟化酶突变体在制备苯乙酰脱乙酰-7-氨基头孢烷酸(G-D-7-ACA)中的应用，其中所述头孢菌素羟化酶突变体以7-苯乙酰基脱乙酰氧基头孢菌素(G-7-ADCA)为底物。
8.权利要求1-5中任一项所述的头孢菌素羟化酶突变体在制备脱乙酰-7-氨基头孢烷酸(D-7-ACA)中的应用，其中所述头孢菌素羟化酶突变体以7-苯乙酰基脱乙酰氧基头孢菌素(G-7-ADCA)为底物。
9.权利要求1-5中任一项所述的头孢菌素羟化酶突变体在制备7-氨基头孢烷酸(7-ACA)中的应用，其中所述头孢菌素羟化酶突变体以7-苯乙酰基脱乙酰氧基头孢菌素(G-7-ADCA)为底物。
10.一种用于制备苯乙酰脱乙酰-7-氨基头孢烷酸(G-D-7-ACA)的方法，包括使权利要求1-5中任一项所述的头孢菌素羟化酶突变体与7-苯乙酰基脱乙酰氧基头孢菌素一起反应。
11.一种用于制备脱乙酰-7-氨基头孢烷酸(D-7-ACA)的方法，包括使权利要求1-5中任一项所述的头孢菌素羟化酶突变体与7-苯乙酰基脱乙酰氧基头孢菌素一起反应。
12.一种用于制备7-氨基头孢烷酸(7-ACA)的方法，包括使权利要求1-5中任一项所述的头孢菌素羟化酶突变体与7-苯乙酰基脱乙酰氧基头孢菌素一起反应。
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