CN1062903C - 一种新的头孢菌素c酰基转移酶 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种新的头孢菌素C酰基转移酶(CC酰基转移酶)(更确切地说，本发明提供了一种用蛋白质工程生产的新的突变型CC酰基转移酶、编码该酶的DNA、含有所说DNA的表达载体、用所说表达载体转化的微生物以及培养所说转化体生产CC酰基转移酶。

Description

一种新的头孢菌素C酰基转移酶
本发明涉及一种新的头孢菌素C酰基转移酶(下文称作“CC酰基转移酶”)。更确切地说，本发明涉及一种用蛋白质工程生产的新的突变型CC酰基转移酶、编码该酶的DNA、含有所说DNA的表达载体、用所说表达载体转化的微生物以及培养所说转化体生产CC酰基转移酶。
头孢菌素C酰基转移酶是能够水解头孢菌素C生成7-氨基头孢菌酸(7-ACA)的一类酶的总称，迄今，已发现三种酶可归入CC酰基转移酶，它们分别称为头孢菌素C酰基转移酶SE83、N176和V22，其氨基酸顺序也已公开(Journal of Fermentationand Bioengineering Vol.72，232-243，1991)。在上述文献中，CC酰基转移酶的氨基酸顺序号始于该顺序N末端部分的蛋氨酸。但是，在本说明书中，CC酰基转移酶的氨基酸顺序号始于与该顺序N末端部分的蛋氨酸相邻的苏氨酸，因为借助于在原核细胞中表达CC酰基转移酶基因获得的成熟CC酰基转移酶的α-亚单位N末端蛋氨酸通常被一种酶(如氨基肽酶)裂解掉，生成以苏氨酸为其N末端氨基酸的成熟CC酰基转移酶。利用重组DNA技术生产天然形式的CC酰基转移酶也在上述文献中公开过，并且业已发现被表达的CC酰基转移酶是经胞内加工形成由α-亚单位和β-亚单位组成的活性形式的。然而，大肠杆菌中的加工效率通常是较低的。基于广泛研究的结果，本发明人成功地生产出具有更多所需特性的突变CC酰基转移酶，其特征为有较高的酶效、较高的加工效率等等。
本发明的新突变CC酰基转移酶其特征如下：
(1)一种突变CC酰基转移酶，其中位于天然CC酰基转移酶氨基酸顺序305位置上的半胱氨酸被其它氨基酸(如丝氨酸等)取代。
(2)一种突变CC酰基转移酶，其中位于天然CC酰基转移酶氨基酸顺序269位置上的蛋氨酸被其它氨基酸(如酪氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸等)取代。
(3)一种突变CC酰基转移酶，其中位于天然CC酰基转移酶氨基酸顺序271位置上的丙氨酸被其它氨基酸(如酪氨酸等)取代。
(4)一种突变CC酰基转移酶，具有选自上述(1)-(3)中的两种或三种点突变。
另外，突变CC酰基转移酶能够用下式代表，作为其加工成为α-亚单位和β-亚单位之前的前体形式：
A1-268-X1-Tyr-X2-A272-304-X3-A306-773
其中，A1-268等同于天然CC酰基转移酶中Thr1至Gly268的氨基酸顺序，A272-304等同于天然CC酰基转移酶中Gln272至Tyr304的氨基酸顺序，A306-773等同于天然CC酰基转移酶中Val306至Ala773的氨基酸顺序，X1是蛋氨酸或其它氨基酸，X2是丙氨酸或其它氨基酸，X3是半胱氨酸或其它氨基酸，假如X1是蛋氨酸，并且X2是丙氨酸，那么X3是除半胱氨酸以外的一种氨基酸。
在本说明书中，常规性使用用于命名特定突变CC酰基转移酶的命名法。根据该命名法，用丝氨酸取代天然CC酰基转移酶氨基酸顺序305位置上的半胱氨酸残基所制得的突变CC酰基转移酶应被命名为突变CC酰基转移酶C305S，其中，C是欲被取代的半胱氨酸(一种氨基酸)残基的一个字母缩写，305是天然CC酰基转移酶氨基酸顺序的位置序号，S是用于取代半胱氨酸(前一种氨基酸)残基的丝氨酸(另外一种氨基酸)的一个字母缩写。另一方面，例如，突变CC酰基转移酶M269Y或M269T是分别用酪氨酸或苏氨酸取代天然CC酰基转移酶氨基酸顺序269位置上的蛋氨酸残基制得的。突变CC酰基转移酶M269Y/C305S则是用酪氨酸取代天然CC酰基转移酶氨基酸顺序269位置上的蛋氨酸残基和用丝氨酸取代天然CC酰基转移酶氨基酸顺序305位置上的半胱氨酸制取的。
本发明的突变CC酰基转移酶还可以借助重组DNA技术、多肽合成法等方法制备。
也就是说，可以通过在营养培养基中培养用包含编码新的CC酰基转移酶氨基酸顺序的DNA的表达载体转化的宿主细胞，并从培养肉汤中回收新的CC酰基转移酶来制备新的CC酰基转移酶。
有关上述方法的细节将详细说明如下。
宿主细胞可包括微生物[细菌，(如大肠杆菌、枯草杆菌等)，酵母，(如啤酒酵母等)，动物细胞系和培养的植物细胞]。优选的微生物例子包括细菌，特别是大肠杆菌属的菌株(例如E.coli JM109ATCC53323，E.coliHB101 ATCC33694，E.coli HB101-16 FERM BP-1872，E.coli294 ATCC 31446等)，酵母，特别是酵母菌属的菌株(例如啤酒酵母AH22)，动物细胞系[例如小鼠L929细胞，中国地鼠卵巢(CHO)细胞等]等等。
当用细菌，特别是大肠杆菌作宿主细胞时，表达载体通常至少由启动子-操纵基因区、起始密码子、编码新CC酰基转移酶氨基酸顺序的DNA、终止密码子、终止子区和可复制单位组成。当用酵母或动物细胞作宿主细胞时，表达载体最好至少由启动子、起始密码子、编码信号肽和新的CC酰基转移酶氨基酸顺序的DNA及终止密码子组成。增强子顺序、新的CC酰基转移酶的5′和3′非编码区、拼接结合、多聚腺苷酸化作用位点及可复制单位也可能插入表达载体。
启动子-操纵基因区包括启动子、操纵基因和Shine-Dalgarno(SD)顺序(例如AAGG，等)。优选的启动子-操纵基因区可以包括常规性使用的启动子-操纵基因区(例如用于大肠杆菌的PL-启动子和trp-启动子)和CC酰基转移酶N-176染色体基因的启动子。用于在酵母中表达新的CC酰基转移酶的启动子可以包括适合于啤酒酵母的TRPⅠ基因、ADHⅠ或ADHⅡ基因及酸性磷酸酶(PH05)基因，而用于在哺乳动物细胞中表达新的CC酰基转移酶的启动子可包括SV40早期或晚期启动子、HTLV-LTR-启动子、小鼠金属硫因Ⅰ(MMT)启动子和牛痘启动子等。
优选的起始密码子可以包括蛋氨酸密码子(ATG)。
信号肽可以包括常规使用的其它酶的信号肽(天然t-PA的信号肽、天然血纤维蛋白溶酶原的信号肽)等。
编码新的CC酰基转移酶的氨基酸顺序的DNA可以用常规方法制备，例如利用DNA合成仪的部分或全DNA合成法和/或以合适的方式，如常规的突变法[如盒式突变法(参见Tokunaga，T.etal.，Eur.J.Biochem.153，445-449，1985)、PCR突变法(参见Higuchi.R.et al.，Nucleic Acids Res.16，7351-7367，1988)、Kunkel法(参见Kunkel，T.A.et al.，Methods Enzymol.154，367，1987)等]处理插入到从转化体[如E.coli JM 109(pCCN 176-2)FERM BP-3047]可获得的合适载体(如pCCN 176-2)中的天然CC酰基转移酶的完整DNA编码顺序，并且还用一种合适的酶(例如限制性酶、碱性磷酸酶、多核苷酸激酶、DNA连接酶和DNA聚合酶等)进行处理。
终止密码子可以包括常规性应用的终止密码子(例如TAG、TGA等)。
终止子区可以包括天然的或合成的终止子(例如合成的fd噬菌体终止子等)。
可复制单位是能够在宿主细胞中复制其所属的全部DNA顺序的DNA化合物，它可以包括天然质粒、人工修饰的质粒(例如从天然质粒制备的DNA片段)和合成质粒，优选的质粒例子可包括用于大肠杆菌的质粒pBR322或其人工修饰产物(得自用合适的限制性酶处理pBR322的DNA片段)、用于酵母的酵母2μ质粒或酵母染色体DNA和用于哺乳动物细胞的质粒pRSVneo ATCC 37198、质粒pSV 2 dhfr ATCC37145、质粒pdBPV-MMTneo ATCC37224及质粒pSV 2 neo ATCC37149。
增强子顺序可以包括SV40的增强子顺序(72bp)。
多聚腺苷酸化作用位点可以包括SV40的多聚腺苷酸化作用位点。
拼接结合可以包括SV40的拼接结合。
按照常规方法(例如用限制性酶消化，用T4DNA连接酶连接)将启动子、起始密码子、编码新的CC酰基转移酶氨基酸顺序的DNA、终止密码子(一个或多个)和终止子区与一个适当的可复制单位(质粒)按顺序连接成环，形成表达载体，如果需要的话，还可利用足够的DNA片段(一个或多个)(例如接头、其它的限制性位点等)。
用表达载体能转化(转染)宿主细胞。可以用常规方法[例如用于大肠杆菌的Kushner法、用于哺乳动物细胞的磷酸钙法、微注射法等]进行转化(转染)以产生转化体(转染体)。
为了用本发明的方法生产新的CC酰基转移酶，将所获得的含表达载体的转化体在一种水质营养培养基中进行培养。
营养性培养基可含有碳源(一种或多种)(例如葡萄糖、甘油、甘露糖醇、果糖、乳糖等)和无机或有机氮源(一种或多种)(例如硫酸铵、氯化铵、酪蛋白的水解产物、酵母提取物、多胨、细菌胰胨、牛肉提取物等)。如果需要，还可以向培养基中加入其它的营养性来源[例如无机盐(如磷酸氢钠或钾、磷酸氢二钾、氯化镁、硫酸镁和氯化钙)、维生素(如维生素B1)、抗菌素(如氨苄青霉素、卡那霉素)等]。常用补充了胎牛血清和一种抗菌素的Dulbecco改良Eagle基本培养基(DMEM)培养哺乳动物细胞。
转化体(包括转染体)的培养通常在pH5.5-8.5(优选pH7-7.5)和18-40℃(优选20-30℃)进行5-50小时。
因此，当所产生的新CC酰基转移酶存在于培养溶液中时，经滤过或离心被培养的肉汤则获得培养物滤液(上清液)。用常规方法可以从培养物滤液中纯化新的CC酰基转移酶，所说的常规方法即一般用于纯化和分离天然或合成蛋白质的方法(例如透析、凝胶过滤、利用抗CC酰基转移酶单克隆抗体的亲和柱色谱法、以适宜吸附剂为基础的柱色谱、高效液体色谱等)。当所产生的新CC酰基转移酶存在于被培养的转化体的外周胞质和胞浆中时，经过滤和离心收集细胞，借助例如超声波和/或溶菌酶处理以破坏细胞壁和/或细胞膜，形成细胞碎片。将所得碎片溶解于适宜的水溶液(例如8M尿素水溶液、6M鈲盐水溶液)。用上文列举的常规方法可从溶液中纯化新CC酰基转移酶。
本发明进一步提供了制备通式(Ⅰ)化合物或其盐的方法，所说的通式(Ⅰ)为：
Figure 9310348300091
其中，R1是乙酰氧基、羟基和氢，所说的方法包括将通式(Ⅱ)的化合物或其盐与用含有编码本发明新的CC酰基转移酶的DNA的表达载体转化的微生物的培养肉汤或其经加工过的材料接触，所说的通式(Ⅱ)为其中，R1的定义与上文相同，R2是羧酰基。
R2的羧酰基可以包括脂肪族、芳香族或杂环羧酰基，其合适的例子可以是具有一个或两个合适取代基的C1-C8链烷酰基，所说的取代基选自氨基、羧基、C1-C8链烷酰氨基、苯甲酰氨基或噻吩基等。
化合物(Ⅰ)和(Ⅱ)的合适盐可以是碱金属盐(例如钠盐、钾盐、锂盐)。
如果CC酰基转移酶活性一般存在于转化的细胞中，那么可列举下列制剂作为培养肉汤的经加工材料：
(1)粗制细胞，用常规方法(如过滤和离心)从被培养的肉汤中分离。
(2)干细胞，经用常规方法(如冻干和真空干燥)干燥所说的粗制细胞所得。
(3)无细胞提取物，用常规方法(例如利用有机溶剂使细胞自溶、用矾土、海砂等磨研细胞或用超声波处理细胞)破坏所说的粗制细胞或干细胞所得。
(4)酶溶液，用常规方法(例如柱色谱法)纯化或部分纯化所说的无细胞提取物而得。
(5)固定化细胞或酶，用常规方法(例如利用丙烯酰胺、玻璃珠、离子交换树脂等的方法)固定所说细胞或酶而得。
包括化合物(Ⅱ)和酶接触的反应可在水性介质(如水或缓冲液)中进行，这就是说，一般可以通过将被培养的肉汤或其经加工的材料溶解或悬浮于含有化合物(Ⅱ)的水性介质(如水或缓冲液)中进行反应。
优选的反应混合物的pH、化合物(Ⅱ)的浓度、反应时间及反应温度可以随着所使用的培养肉汤或其经加工的材料的性质而变化。一般说来，反应在pH6-pH10(优选pH7-pH9)、5-40℃(优选5-37℃)条件下进行0.5-50小时。
在反应混合物中作为底物的化合物(Ⅱ)的浓度优选1-100mg/ml的范围。
因此，所生成的化合物(Ⅰ)可用常规方法从反应混合物中纯化和分离出来。
附图简要说明如下：
图1说明质粒pYSC305S和pCK305中编码突变CC酰基转移酶C305S的前体的DNA的核苷酸顺序和推测的氨基酸顺序。
图2表明质粒pCK305B中编码突变CC酰基转移酶C305S之前体的DNA的核苷酸顺序和推测的氨基酸顺序。
图3表明质粒pCK269Y中编码突变CC酰基转移酶M269Y之前体的DNA的核苷酸顺序和推测的氨基酸顺序。
图4表明质粒pYSA271Y和质粒pCK271Y中编码突变CC酰基转移酶A271Y前体的DNA的核苷酸顺序和推测的氨基酸顺序。
图5表明质粒p269Y305S中编码突变CC酰基转移酶M269Y/C305S之前体的DNA的核苷酸顺序和推测的氨基酸顺序。
图6表明质粒p269Y305S的限制性图谱。
在下面的实施例中，一些质粒、酶(例如限制性酶、T4连接酶)和其它材料是从商售途径获得，并根据提供者的说明使用。用于DNA克隆、宿主细胞转化、转化体培养和从培养肉汤中回收新CC酰基转移酶等的有关操作方法是现有技术熟知的或可从文献中得知利用的。
下面给出的实施例旨在说明本发明，而不是限制本发明。实施例1——寡脱氧核糖核酸SN-6的合成
用381A DNA合成仪(Applied Biosystems Inc.)合成DNA寡聚体SN-6(5′GGTCGCCTATAGCGTCACGCATGCCTTCATG3′)。用28％的氨水使合成的DNA从CPG聚合物载体(CPG：控制多孔玻璃)上解脱下来，继而于60℃加热9小时以去除所有的保护性基团。反应混合物于真空中蒸发，残留物溶解于200μl TE缓冲液[10mM Tris·HCl(pH 7.4)-1mM EDTA]。将所得的粗制DNA溶液于反相HPLC上样[柱：COSMOSIL C184.6mm×150mm(nacalai tesque)，洗脱液：A：0.1M乙酸三乙铵缓冲液(pH7.2-7.4)，B：乙腈，梯度：起始A(100％)，最终A(60％)+B(40％)，25分钟内呈线性梯度，流速：1.2ml/min]。收集含有目的DNA寡聚体的洗脱液，并在真空中蒸发。用200μl TE缓冲液溶解经纯化的DNA，并在使用前贮存于-20℃。
以类似于上文所述的方式合成并纯化列于下面的表Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ中的所有其它DNA寡聚体。
表Ⅰ：用于CC酰基转移酶N176N末端盒式突变的合成DNA寡聚体
每个末端的限制性位点 合成DNA寡聚体的顺序
上链：5＇-3＇下链：3＇-5＇ 名称/长度
EcoRI/MluI AATTCGGATCCAAGCTTAGCCTAGGTTCGAATGCGC 007a/18007b/18
ClaI/Sau3AI fMetThrMetAlaAlaAsnThrCGATAAAATGACTATGGCGGCCAACACCTATTTTACTGATACCGCCGGTTGTGGCTAG 002a/28002b/30
ClaI/BamHI fMetThrMetAlaAlaAsnThrCGATAAAATGACTATGGCAGCTAATACGTATTTTACTGATACCGTCGATTATGCCTAG 013a/28013b/30
表Ⅱ：用于PCR突变的合成DNA寡聚体
名称/长度 合成DNA寡聚体的顺序
SN-57/39 5＇-CATCGCGTCTTCGAAATCCCTGGCTATTATGCGCAGCAT-3＇
SN-42/27 3＇-GCAGCTCTGAGCGGTACCGGGCCAATA-5＇
表Ⅲ：用于Kunkel突变的合成DNA寡聚体
名称/长度 合成DNA寡聚体顺序(5＇ -3＇)
Z61/28 ATGCTGCGCATAATAGCCAGGGATTTCG
SN-16/24 CCGGGCATGTACTATCATCAT
SN-21/24 GCCGGCGGCGGATCCAACAACTGG
表Ⅳ：用于PCR顺序的合成DNA寡聚体
名称/长度 合成寡聚体的顺序(5＇-3＇)
SN63/21 GATGCGCTGCTGAAGGCGATG
SN64/21 GGGCTCGAAATCGTTGCCGAA
实施例2制备天然CC酰基转移酶N176的在trp启动子控制下的表达载体
(1)构建pCC002A：一种天然CC酰基转移酶N176的氨苄抗性表达载体：
(ⅰ)构建pCC001A：由质粒pCCN176-2[该质粒可用常规方法从转化体E.coli JM109(pCCN178-2)FERM BP-3047中获得]制备质粒pCCN176-3的方法参见Jourral of Fermentation and Bioengineering Vol.72，1991，p235。用EcoRⅠ和HindⅢ消化1.0μg质粒pCCN176-3，并借助琼脂糖凝胶电泳分离携带CC酰基转移酶N176完整编码区的2.9Kb片段。另一方面，也用EcoRⅠ和HindⅢ消化突变t-PA的表达载体pTQipA△trp(1.0μg)[该质粒可用常规方法从转化体E.coli HB101-16(pTQiPA△trp)FERMBP-1870中获得，其制备方法已公开于EP302456]。分离所得的4.3Kb DNA，它带有trp启动子、部分t-PA编码区(Cys 92-Trp 113)和fd噬菌体中心终止子的复制顺序。在T4DNA连接酶(300单位，Takara Shuzo)存在条件下，将2.9Kb和4.3Kb DNA片段于40μl连接缓冲液(50mMTris·HCl，10mM MgCl2，10mM二硫苏糖醇和1mM ATP)中16℃下混合5小时使之连接。该连接混合物用于转化E.coli JM109。从抗氨苄青霉素的转化体之一获取被命名为pCC001A的所需质粒，并借助限制性图谱表示其特征。
(ⅱ)构建pCC002A：质粒pCC001A含有trp启动子与酰基转移酶基因间t-PA(Cys 92-Trp113)基因部份。为了去除所说的区域，用ClaⅠ和MluⅠ消化pCC001A(1.0μg)，并分离所得的6.1KbDNA片段，另一方面，用MluⅠ和Sau3AⅠ消化pCCN176-3(1μg)以分离编码酰基转移酶的Asp7-Arg71的189bp DNA。用于10μl缓冲液(kination缓冲液：50mM Tris·HCl，10mM MgCl2，10mM DTT，1.0mMATP)中的T4多核苷酸激酶(1.5单位，Takara Shuzo)在37℃1小时的条件下，将合成DNA寡聚体002a和002b(参见表Ⅰ，各0.5nmole)进行磷酸化，然后将反应混合物于55℃加热20分钟使酶失活。在存在T4DNA连接酶和15℃、3小时的条件下于20μl连接缓冲液中，将所得的混合物与189bpSau 3AI/MluⅠ DNA结合，使之连接。向所得的连接混合物中加入6.1Kb ClaⅠ/MluⅠ DNA片段，所得混合物在另外加入T4 DNA连接酶(300单位)后于4℃培养16小时。用所得的连接混合物转化E.coliJ M 109。从其中一个转化体中分离所需的CC酰基转移酶N176的表达载体pCC002A质粒，并由限制性图谱表示其特征。
(2)构建pCK002，一种CC酰基转移酶N176的卡那霉素抗性表达载体：
用DraⅠ(TOYOBO)消化质粒pCC002A。用酚处理所得的混合物以除去酶，并用乙醇沉淀。回收的DNA悬浮于20μl连接缓冲液中，再与磷酸化的EcoRⅠ接头(2μg，Pharmacia)混合，继而与T4 DNA连接酶(300单位)于4℃培育16小时。用酚抽提反应混合物，并用乙醇沉淀。用EcoRⅠ消化回收的DNA，借助琼脂糖凝胶电泳分离所得的缺乏氨苄青霉素抗性基因的5.6KbDNA。另一方面，用EcoRⅠ消化质粒pAO97(1μg)[可得自转化体E.coli JM109(pAO97)FERMBP-3772]，分离所得的卡那霉素抗性基因的1.2KbDNA 。用存在于50μl连接缓冲液中的T4 DNA连接酶(300单位)，在16℃、2小时的条件下使1.2KbEcoRⅠ DNA与5.6KbEcoRⅠDNA连接。连接混合物用于转化E.coli JM109，以获得携带卡那霉素抗性基因作为抗菌素标记的所需质粒pCK002。实施例3构建高效表达CC酰基转移酶N176的表达载体
pCK013
(1)构建pCC013A：
(ⅰ)构建pCC007A：用EcoRⅠ和MLuⅠ消化质粒pCC001A，并借助琼脂糖凝胶电泳分离所形成的6.4KbDNA片段。用T4DNA连接酶(300单位)，在16℃，5小时的条件下将回收的DNA与合成的DNA寡聚体007a和007b(见表Ⅰ，分别0.5μg，连接反应前先经过磷酸化处理)连接。所形成的混合物用于转化E.coli JM109，以得到所需的质粒pCC007A 。
(ⅱ)构建pCCNt013：用ClaⅠ和BamHⅠ消化质粒pCC007A(1.0μg)，并借助5％聚丙烯酰胺凝胶电泳分离所产生的6.1Kb DNA。该DNA用T4DNA连接酶(300单位)与合成的寡聚体013a和013b(各0.5μg，均经磷酸化处理，表Ⅰ)连接。用连接混合物转化E.coli JM109，并从氨苄青霉素抗性转化体中分离所需的质粒pCCNt013。
(ⅲ)构建pCC013A：用BamHⅠ和MluⅠ消化质粒pCCNt013，并分离所形成的6.1Kb DNA。另一方面，用MluⅠ和Sau 3AⅠ消化pCC002A(1.0μg)，获得189bpDNA片段。用T4DNA连接酶(300单位)将所得的DNA与6.1Kb BamHⅠ/MluⅠ DNA片段连接，并用连接混合物转化E.coli JM109。从其中一个产生氨苄青霉素抗性的转化体中分离具有丰富AT的NH2末端DNA顺序(编码与天然CC酰基转移酶N176相同的氨基酸顺序)的所需质粒。
(2)构建pCK013，一种天然CC酰基转移酶N176的卡那霉素抗性表达载体：
(ⅰ)构建p△N176：用AatⅡ(TOYOBO)消化质粒pCK002(1.0μg)，并用T4DNA连接酶(150单位)处理上述酶切形成的DNA使之自身连接。用连接混合物转化E.coli JM109，以获得携带唯一AatⅡ限制性核酸内切酶位点的所需质粒。
(ⅱ)构建pCK013：用AatⅡ消化质粒p△N176(1.0μg)，并用溶解于100mM Tris·HCl(pH8.0)缓冲液中的细菌性碱性磷酸酶(1单位，Takara Shuzo)于42℃下处理线性化的DNA 1小时。分离脱磷酸的DNA，并用T4DNA酶连接到得自pCC013A的2.5Kb AatⅡ DNA上。连接混合物用于转化E.coli JM109，以获得携带卡那霉素抗性基因作标记的所需质粒pCK013。
实施例4用Kunkel法对编码CC酰基转移酶的DNA进行点突变
(1)将编码CC酰基转移酶N176的DNA亚克隆到M13噬菌体中：
(ⅰ)制备mp18VVR：用EcoRⅤ消化质粒pCC013A，分离编码CC酰基转移酶N176的Ile92-Asp315的795bpDNA。用T4DNA连接酶将所得的DNA与经HincⅡ消化的M13mp18连接，连接混合物用于转化E.coli JM 109。从其中一个噬菌斑中分离所需的RF DNA mp 18VVR，并用限制性图表示其特征。该RF DNA mp18VVR中，酰基转移酶DNA的一部分以与M13正向复制起点相反的方向插入，用于制备RFDNA mp 18VVR的噬菌体溶液在使用前贮存于4℃。
以类似于上文所述的方法由得自pCC013A的1162bpHpaⅠ/Eco47Ⅲ和经HincⅡ消化的7250bp M13 mp 18制备RF DNA mp 18p183。
(ⅱ)制备单链U-mp 18VVR-SS(参见Kunkel，T.A.et al.，Methods Enzyml.154，367)：将单个E.coliCJ 236(dut-，ung-，F′)(Bio-Rad Lab)菌落在2ml含氯霉素(30μg/ml)的2XTY肉汤中于37℃培养16小时。再将细胞(0.1ml)转移到含氯霉素(30μg/ml)的新鲜2XTY肉汤(50ml)中，于37℃继续培养。当600nm波长处的吸光度达到0.3时，将mp18 VVR的噬菌体溶液(MOI＜0.2)加入到培养物中，继续培养5小时。以17，000×g于4℃离心15分钟后，再次离心上清液。用核糖核酸酶(150μg/ml，Sigma)于室温下处理所得上清液(30ml)30分钟，然后加入7.5ml PEG溶液(3.5M NH4 OAc溶于20％聚乙二醇8000中)。离心(17，000×g，15分钟，4℃)后，将残留物悬浮于200μl缓冲液(300mM NaCl，100mM This·HCl pH8.0，0.1mM EDTA)中。相继用200μl酚和200μl酚/CHCl3(1∶1)抽提所得的溶液，并用CHCl3(200μl)洗涤二次。向溶液中加入7.5M NH4OAc(100μl)和乙醇(600μl)以沉淀出噬菌体DNA。经离心收集DNA，用700μl90％的冰冷乙醇洗涤，并在真空中干燥。将纯化的单链U-DNA(U-mp 18VVR-SS)悬浮于20μl TE缓冲液中，使用前于4℃下贮存。
以类似于上文所述的方法制备用于Kunkel突变法的其它单链U-DNA。
(2)制备编码突变CC酰基转移酶C305S的RF DNA
(ⅰ)寡脱氧核糖核酸的磷酸化：用存在于30μl连接缓冲液[50mM Tris·HCl(pH7.8)，10mM MgCl2，20mM二硫苏糖醇(DTT)，1mM ATP，50μg/ml牛血清白蛋白(BSA)]中的T4多核苷酸激酶(4.5单位，Takara Shuzo)将DNA寡聚体SN-6(1.84μg，约167pmole)磷酸化处理，该反应在37℃进行1小时。
(ⅱ)退火反应：磷酸化的寡聚体(1μl，估计为5.6pmole)与溶于9μl缓冲液[10mM Tris·HCl(pH8.0)、6mM MgCl2、40mM NaCl]中的模板U-mp 18VVR-SS(0.10pmole，估计250ng)混合。将混合物加热至70℃ 5分钟，继而冷却至30℃40分钟，然后置于0℃。
(ⅲ)体外合成双链DNA：将所得的退火溶液(10μl)与1μl合成缓冲液[200mM Tris·HCl(pH8.0)-40mMMgCl2]、1μl 5mM dNTP(dATP、dCTP、dGTP和dTTP)、T4 DNA连接酶(300单位，Takara Shuzo)以及T4 DNA聚合酶(10单位，Pharmacia)混合。混合物相继于冰上孵育5分钟，25℃孵育5分钟，37℃孵育90分钟。加入90μl缓冲液(10mM Tris·HCl(pH8.0)，10mM EDTA)中止反应。
(ⅳ)转化E.coli JM109：将合成的DNA溶液(3μl)加入到用常规方法(例如可参见SAIBO-KOGAKU2，616-626)制备的E.coli JM109感受态细胞(200μl)中，并于冰上孵育细胞30分钟。
单个E.coli JM109菌落在L肉汤(2ml)中培养16小时。再将培养的肉汤(0.1ml)转移到新鲜的L肉汤(2ml)中，所得的肉汤继续培养2小时以获得指示细胞。
向转化的细胞(200μl)中加入指示细胞(200μl)，并将所得的细胞与于55℃预热的3ml H-Top琼脂(1％细菌胰胨、0.8％ NaCl、0.8％琼脂)混合。用细胞-琼脂混合物铺满H平板(1％细菌胰胨、0.5％ NaCl，1.5％琼脂)，并将平板在37℃孵育16小时。
(ⅴ)来自转化体的RFDNA特性鉴定：单个E.coli JM109菌落在2ml 2XTY肉汤中(1.6％细菌胰胨、1％酵母提取物，0.5％NaCl)培养1 6小时，将培养的肉汤(0.1ml)移至新的2XTY肉汤(2ml)中，所得的肉汤继续培养2小时。
用竹牙签(15cm)从步骤(ⅳ)的平板中挑取噬菌斑，并将牙签立即转移到培养的2XTY肉汤中，于37℃继续培养5-6小时。离心(10，000rpm，15秒，室温)收集1ml肉汤中的细胞，上清液(在后续实验中用于大规模制备RF DNA的噬菌体液)在使用前贮存于4℃。将收集的细胞悬浮于100μl GTE缓冲液[50mM葡萄糖、25mM Tris·HCl(pH8.0)，2 5mM EDTA]，借助Voltex TM混合器于200μl碱-SDS溶液(0.2N NaOH，1％SDS)轻轻混合，并与150μl高盐缓冲液(3M KOAc，3M AcOH)剧烈混合。所得的混合物在室温下以10，000rpm离心5分钟。用异丙醇(300μl)处理上清液(400μl)，并以10，000rpm离心5分钟。分离上层(300μl)，与600μl乙醇混合。离心(10，000rpm，5分钟)后，用500μl70％的冰冷乙醇洗涤沉淀物，再于真空中干燥，然后悬浮于含100μg/ml核糖核酸酶(Sigma)的50μl TE缓冲液中，形成RFDNA mp 18VVRC 305S溶液。用SphⅠ对一份RFDNA溶液(10μl)作限制性核酸内切酶图，因为DNA寡聚体SN-6已策略性地导入顺序中的SphⅠ位点以核查突变。
(3)制备编码突变CC酰基转移酶M269Y的RF DNA：
以类似于上文所述的方法由mp18p183的单链U-DNA(作模板)和引物Z 61(ATGCTGCGCATAATAGCCAGGGATTTCG)制备突变RF DNA(称为p183M269Y)。
(4)制备编码突变CC酰基转移酶A271Y的RF DNA：
以类似于上文所述的方法由mp18VVR和合成的DNA寡聚体SN-16制备突变RF DNA(称为mp18VVRA271Y)。
(5)制备称为mp18VVR(SN-21)的RF DNA：
以类似于上文所述的方法由mp18VVR和合成的DNA寡聚体SN-21制备于Gly238/Ser238处发生BamHⅠ不活动突变的突变RF DNA。
实施例5构建表达载体
(1)构建氨苄青霉素抗性型表达载体：
(ⅰ)构建pYSC305S：
用BstBⅠ(5单位，New England Biolabs)和XhoⅠ(5单位，TOYOBO)消化上述实施例4中获得的RF DNA(10μg)。(命名为mp18 VVRC 305S)。借助5％PAGE从消化混合物中分离所产生的162bp DNA片段。另一方面，用XhoⅠ(5单位)和NcoⅠ(5单位，TOYOBO)消化pCC013A(10μg)，并分离所产生的128bp DNA片段。而且，用BstBⅠ(5单位)和NcoⅠ(5单位)消化pCC013A(10μg)，并分离DNA大片段。162bp BstBI/XhoⅠ DNA、128bp XhoⅠ/NcoⅠ DNA和6Kb BstBⅠ/NcoⅠ DNA在20μl连接缓冲液中于4℃下进行16小时连接反应。连接混合物用于转化E.coli JM109。从其中一个氨苄青霉素的转化体中分离命名为pYS C305S的所需质粒，并借助限制性核酸内切酶消化作用表示其特性。
(ⅱ)构建pYSA271Y：
以类似于上文所述的方法由mp18VVRA271Y制备突变CC酰基转移酶A271Y的表达载体pYSA271Y。
(ⅲ)构建pEX21：
以类似于上文所述的方法由mp18VVR(SN-21)制备于Gly238/Ser239发生BamHⅠ不活动突变的表达载体(PEX21)
(2)构建卡那霉素抗性型表达载体
(ⅰ)构建pCK305：
用MluⅠ和NcoⅠ消化质粒pYSC305S，并分离872bpDNA。另一方面，用NcoⅠ和MluⅠ消化pCK013并分离所得的大片段DNA(估计为6.0Kb)。用T4 DNA连接酶将所得的DNA与872bp DNA片段连接，以获得携带卡那霉素抗性基因作标记的所需质粒pCK305。
(ⅱ)构建pCK271Y：
以类似于上文所述的方法也由pCK013和pYSA271Y制备质粒pCK271Y。
(ⅲ)构建pCK305B：
由经BstBⅠ和MluⅠ消化pCK305得的大DNA片段和经BstBⅠ与MluⅠ消化pEX21得的小DNA片段制备质粒pCK305B。
(ⅳ)构建pCK269Y：
用MluⅠ和NcoⅠ消化p183M269Y。分离小DNA片段(872bp)，并在20μl连接缓冲液中[50mMTris·HCl(pH7.8)，10mM MgCl2，20mM二硫苏糖醇，1mM ATP，50μg/ml BSA]与经MluⅠ与NcoⅠ消化的pCK013的大DNA片段(5.9Kb)连接。用连接混合物转化E.coli JM109，从其中一个转化体中分离所需的质粒pCK269Y，并借助限制性核酸内切酶消化作用表达其特性。
实施例6构建产生M269YC305S双突变的酰基转移酶的p269Y305S
(1)突变和扩增pCK305的BstBⅠ/NcoⅠ DNA：
借助Zymoreactor AB-180(ATTO Co.Ltd)用Tag聚合酶(TAKARA)在Tag缓冲液中[50mM KCl，50mMTris·HCl(pH8.3)，1.5mM MgCl2，0.001％(W/V)明胶]进行突变和扩增。引物SN-57(CATCGCGTCTTCGAAATCCCTGGCTATTATGCGCAGCAT)和SN-42(ATAACCGGGCCATGGCGAGTCTCGACG)(各125pmole)与pCK305(0.5fmole)在含有dNTP(各200μmole)和Tag聚合酶(1.25单位)的Tag缓冲液(100μl)中混合。加入数滴矿物油覆盖混合物的液体表面。混合物经过最初的变性(98℃，2分钟)、30次循环扩增(98℃、2分钟，48℃、2分钟，72℃，3分钟)和最终的延伸(72℃、8分钟)。用三氯甲烷洗涤所得混合物的水层，并用酚提取用乙醇沉淀。离心后，用BstBⅠ和NcoⅠ消化回收的DNA。分离所产生的290bp DNA，并与经BstⅠ和NcoⅠ消化的pCK305的大DNA片段连接。用连接混合物转化E.coli JM109，从其中一个转化体中分离所需的质粒p269Y305S，并借助限制性核酸内切酶消化作用表述其特性。
实施例7突变酰基转移酶的DNA顺序
(1)pYSC305S测序：
(ⅰ)亚克隆至M13mp18：用EcoRⅤ和SmaⅠ消化pYSC305S，并分离编码突变CC酰基转移酶C305S的Gly268-Asp315的265bp DNA。另一方面，用SmaⅠ消化M13mp18，并分离线性化的DNA。用T4 DNA连接酶将所得的DNA与265bp SmaⅠ/EcoRⅤ DNA连接。连接混合物用于转化E.coli JM103 。从其中一个噬菌斑中得到所需的单链噬菌体DNAmp18C305S(+)，它携带与M13噬菌体的正向复制起点呈顺时针方向的突变酰基转移酶DNA部分( )。
(ⅱ)亚克隆至M13mp19：由用mp18C305 S(+)转化的细胞制备mpX18C305S的RF DNA，并用EcoRⅠ和HindⅢ消化，获得316bpDNA片段。另一方面用EcoRⅠ和HindⅢ消化M13mp19，分离大DNA片段(估计为7.2Kb)。用T4DNA连接酶将所得DNA与316bp DNA连接，连接混合物用于转化E.coli JM103。从其中一个噬菌斑获得所需的单链噬菌体DNA mp19C305S(-)，它携带与mp18C305S(+)呈反向的突变酰基转移酶DNA部分。
(ⅲ)测序反应：借助370A型DNA测序仪(AppliedBiosystems Inc.)用T7聚合酶(SequenaseTM)进行单链噬菌体DNA mp18C305S(+)和mp19C305S(-)的DNA测序。基于对两条链的核苷酸顺序的测定，证实了pYSC305S中的DNA顺序与预期的一致。
以类似于上文所述的方法确定了pYSA271Y的DNA顺序，并证明与预期的一致。
(3)pCK269Y、p269Y305S和pCK305B的核苷酸测序：
借助Dye DeoxyTM法用373A DNA测序仪(AppliedBiosystems Inc.)直接测定pCK269Y、p269Y305S和pCK305B的核苷酸顺序。用DNA寡聚体SN63(GATGCGCTGCTGAAGGCGATG，编码链：核苷酸序号671-691)和SN64(GGGCTCGAAATCGTTGCCGAA，反义链：核苷酸序号998-1018)作引物。测得的顺序与预期的一致。
(4)pCKM269F、pCKM269L、pCKM269I和pCKM269H的核苷酸测序：
以类似于上述实施例7-(3)的方法测定pCKM269F、pCKM269L、pCKM269I和pCKM269H的核苷酸顺序。
在进行培养之前，将在上述实施例中获得的每个表达载体分别导入E.coli JM109。携带表达载体的E.coli JM109的单个菌落在含50μg/ml氨苄青霉素(或卡那霉素)的L肉汤(5ml)中于37℃培养16小时。所得的肉汤(0.8ml)与80％甘油水溶液(0.2ml)混合，使用前贮存于-80℃。实施例8培养重组E.coli
(1)培养E.coli JM109/pYSC305S：
将用pYSC305S(1ml)转化E.coli JM109制成的转化体E.coli JM109/pYSC305S的甘油贮存物移至含5 0μg/ml氨苄青霉素的100ml L肉汤(1％细菌胰胨、0.5％酵母提取物，0.5％ NaCl、pH7.4)中，该混合物在30℃培养8小时。将培养肉汤(0.2ml)加入到含50μg氨苄青霉素的20ml MS肉汤(1.2％细菌胰胨、2.4％酵母提取物、1.25％甘油、0.11％亮氨酸、0.11％脯氨酸、0.11异亮氨酸、1.25％K2HPO4、0.38％KH2PO4、50μg/ml盐酸硫胺素、2mM MgSO4·7H2O、0.2mM CaCl2·2H2O、0.05mM FeSO4·7H2O)中，混合物于30℃培养16小时。将获得的培养肉汤(3.4ml)再加入到含1％甘油和25μg/ml氨苄青霉素的25ml 2％M9CA肉汤(2％酪蛋白水解物、1.52％Na2HPO4·12H2O、0.3％KH2PO4，0.1％NH4Cl、0.05％NaCl、2mM MgSO4·7H2O、0.2mM CaCl2·2H2O、50μg/ml盐酸硫胺素，pH7.2)中，该混合物以强烈摇动(350-400rpm/分钟)于20℃孵育。在第8小时，向培养肉汤中加入3-吲哚丙烯酸至终浓度为20μg/ml，继续培养40小时。借助离心(7，000rpm、5分钟、4℃)从20ml培养肉汤中收集细胞，然后悬浮于20ml TE缓冲液(pH8.0)中，并用超声处理溶胞。离心(15，000rpm、20分钟、4℃)该溶胞产物以去除所有不溶物。所得上清液贮存于4℃，用于测定CC酰基转移酶与GL-7ACA酰基转移酶的活性和制备纯化的突变CC酰基转移酶C305S。
用类似于上文所述的方法培养携带氨苄青霉素抗性表达载体pCC002A、pCC013A、pYSC305S、pYSA271Y和pEX21的所有其它E.coli。
用类似于上文所述的方法、以含有卡那霉素代替氨苄青霉素的相应肉汤培养携带卡那霉素抗性表达载体pCK013、pCK305B、pCK305、pCK269Y、pCK271Y和p269Y305S的其它E.coli。
实施例9纯化和鉴定酰基转移酶
(1)纯化CC酰基转移酶N176：
向20ml培养肉汤中E.coli JM109/pCC013A的溶菌产物(20ml)中加入硫酸铵(4.18g，终浓度：35％饱和)，所得混合物于室温下搅拌20分钟，离心(20℃、15，000rpm，20分钟)产生的混合物，收集上清液，用硫酸铵(5.56g，终浓度：75％饱和)处理。离心(20℃、15，000rpm，20分钟)收集沉淀，并溶解于5ml 100mMTris·HCl(pH9.0)中。所得的溶液以各4升100mM Tris·HCl缓冲液于4℃透析二次。用Millex-HVTM(0.45μm，微孔)过滤所得透析液，并借助高效液体色谱[柱：Tsk-gelTM DEAE TOYOPEARL-5PW(TOSOH)，洗脱液：A.20mM Tris·HCl(pH8.0)。 B.0.5M NaCl-Tris·HCl(pH8.0)，梯度：起始，A(80％)+B(20％)，最终(第30分钟)：A(50％)+B(50％)，流速：1.0ml/分]纯化。收集用大约0.16M NaCl洗脱的主峰，并对4升Tris·HCl(pH9.0)透析，获得纯的天然型重组CC酰基转移酶N176。
利用反相HPLC[柱：COSMOSIL 4.6mm×50mm(nacalaitesques)，洗脱液：A.0.05％三氟乙酸(TFA)，B.溶于0.05％TFA中的60％乙腈，梯度：起始：A(40％)+B(60％)，最终(在第20分钟)，A(0％)+B(100％)]和十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析纯化的酰基转移酶。HPLC和SDS-PAGE的分析表明，如此获得的酰基转移酶的纯度约为95％。
用类似于上文所述的方法纯化和分析其它的突变酰基转移酶。
(2)测定比活性
(ⅰ)GL-7ACA酰基转移酶活性：向于37℃预孵育10分钟的200μl GL-7ACA溶液[10mg/ml溶于0.15MTris·HCl(pH8.7)，用1N NaOH调pH至pH8.7]中加入20μl酰基转移酶样品，并将混合物在37℃孵育5分钟。加入220μl 5％乙酸中止反应。离心(10，000rpm，5分钟，室温)所得的混合物后，上清液用于检测7ACA的形成。
HPLC条件：柱：TSKgel ODS-80TMCTR4.4mm×100mm(TOSOH)；洗脱液：溶于3％(V/V)乙腈中的5％(V/V)乙酸铵；流速：1.0ml/分；注入体积：10μl，检测器254nm。
1单位被定义为在37℃每分钟能从GL-7ACA合成1.0微摩尔7ACA的活性。
(ⅱ)CC酰基转移酶活性：向已于37℃预孵育10分钟的200μl CC溶液[10mg/ml头孢菌素C的钠盐溶于0.15M Tris·HCl(pH8.7)中，用1N NaOH调pH值至8.7]中加入20μl酰基转移酶样品，混合物在37℃孵育30分钟。加入220μl 5％乙酸中止反应。离心(10，000rpm，5分钟，室温)所得的混合物后，上清液用于测定7ACA的形成。
HPLC条件：柱：TSKgel ODS-80TMCTR4.4mm×100mm(TOSOH)；洗脱液：20mM四丁基溴化铵-10％(W/V)乙腈；流速：1.0ml/分；注入体积：20μl；检测器254nm。
1单位被定义为在37℃每分钟能从头孢菌素C的钠盐合成1.0微摩尔7ACA的活性。
根据上述方法可测定突变酰基转移酶的比活性。
(3)测定天然及突变酰基转移酶的氨基末端顺序：
(ⅰ)分离CC酰基转移酶N176的两条链：对纯化的CC酰基转移酶N176进行反相HPLC[柱：Cosmosil 5C4(4.6mm×35mm，nacalai tesques)，洗脱液：20分钟过程中的线性梯度为溶于0.05％TFA中的乙腈由36％到60％；流速：1.0ml/分]。分别用约48％和51％浓度的乙腈洗脱CC酰基转移酶N176的α链和β链，收集每份洗脱液，并冻干以获得酰基转移酶的α(β)链。
(ⅱ)测定氨基末端顺序：利用气相测序仪470A(AppliedBiosystems Inc.)测定α(β)链的氨基末端顺序，并证实与所预期的一致。
实施例10
(Ⅰ)培养E.coli JM109/p269Y305S
将E.coli JM109/p269Y305S的甘油贮存物加入到含50μg/ml卡那霉素的100ml L肉汤中，于30℃培养8小时，取部分所培养的肉汤(3.75ml)加至25ml N-3肉汤中[成份：5％水解的大豆、1％甘油、0.608％ Na2HPO4、0.7％ KH2PO4、0.7％ K2HPO4、0.12％(NH4)2SO4、0.02％ NH4Cl、0.0011％ FeSO4、0.096％ MgSO4、0.0025％卡那霉素、0.0011％CaCl2、0.00028％MnSO4·nH2O、0.00028％ AlCl3·6H2O、0.00011％CoCl2·6H2O、0.000055％ ZnSO4·7H2O、0.000055％NaMoO4·2H2O、0.000028％CuSO4·7H2O和0.000014％ H3BO4)，培养在20-22℃进行。第16小时向肉汤中加入甘油和IAA至终浓度分别为1％和20μg/ml。第24小时再向肉汤中加入甘油使终浓度再为1％。第30小时，当培养肉汤的A600达15.0时，经离心(4℃、7000rpm、10分钟)收集细胞，并用超声处理进行溶解。离心后，收集上清液，并检测其GL-7ACA酰基转移酶的活性(41.1单位/毫升肉汤)。
(Ⅱ)纯化突变CC酰基转移酶M269Y/C305S
用类似于上文所述的方法在5升发酵罐中培养E.coli JM109/p269Y305S，得自2升肉汤中的细胞悬浮于1.5升20mM Tris·HCl(pH8.0)中，并用Manton-Golin(500Kg/cm，2.3次)溶解。离心(4℃，7，000rpm，30分钟)后，用Polymin P(终浓度0.01％)处理上清液。先后两次离心(7，000rpm，30分钟和15，000rpm，20分钟)混合物，用0.45μm MF膜对上清液进行过滤消毒，产生20.1g(HPLC分析)粗制酰基转移酶。该酶(4.8g)用QAETOYOPEARL 550C柱色谱[条件：柱：5.0×13cm(260ml)；初平衡化：20mMTris·HCl(pH8.0)；洗脱：0.5MNaCl-20mM Tris·HCl(pH8.0)，流速：10ml/分]纯化，产生3.45g纯化的突变CC酰基转移酶M269Y/C305S。根据实施例9-(2)所述方法作为CC酰基转移酶测定的纯化的M269Y/C305S的比活性为2.14单位/mg。
(Ⅲ)天然CC酰基转移酶和突变CC酰基转移酶C305S表达的比较
将根据常规方法用质粒pCK305或pCK013转化E.coliHB101制备的E.coli HB101/pCK305(或HB101/pCK013)的甘油贮存液(1ml)移至含50μg/ml卡那霉素的20ml L肉汤中，该混合物于30℃培养8小时。再将培养的肉汤(0.2ml)加至含50μg卡那霉素的20ml MS肉汤[成份：1.2％细菌胰胨、2.4％酵母提取物、1.25％甘油、0.11％亮氨酸、0.11％脯氨酸、0.11％异亮氨酸、1.259％ K2HPO4、0.38％ KH2PO4、50μg/ml盐酸硫胺素、2mM MgSO4·7H2O、0.2mM CaCl2·2H2O、0.05mMFeSO4·7H2O)中，该混合物于30℃培养16小时。所得的培养肉汤(6ml)再加入到含1％甘油和25μg/ml卡那霉素的40ml2％MgCA肉汤(成份：2％酪蛋白水解物、1.52％Na2HPO4·12H2O、0.3％ KH2PO4、0.1％ NH4Cl、0.05％ NaCl、2mM MgSO4·7H2O、0.2mM CaCl2·2H2O、50μg/ml盐酸硫胺素pH7.2)中，混合物随着强烈摇动(350-400rpm/分)于30℃孵育。第6小时，向培养的肉汤中加入3-吲哚丙烯酸(IAA)、使其终浓度为40μg/ml，再继续培养40小时。离心(14，000rpm、15分钟、4℃)收集细胞，悬浮于40mlTE缓冲液(pH8.0)中，用超声处理进行溶解。离心(14，000rpm、20分钟、4℃)该溶菌产物获得上清液(称为“浓汤”馏分)。而残留物重悬于含100mM Tris·HCl(pH 8.0)、1mMEDTA和8M尿素的缓冲液中，再用超声处理进行溶解。离心去除不溶物后，收集上清液(称为“ppt”馏分)。借助15％ SDS-PAGE分析突变CC酰基转移酶C305S的“浓汤”馏分和“ppt”馏分以及天然CC酰基转移酶N176。通过突变从天然CC酰基转移酶成为突变CC酰基转移酶C305S，细胞不溶性前体蛋白质大大减少。该结果与借助反相HPLC在“浓汤”馏分检测到的成熟酰基转移酶(天然CC酰基转移酶或突变CC酰基转移酶C305S)的量相一致(见下表)：
实施例11利用盒式突变制备突变CC酰基转移酶M269(在269位置上，Met269变成其它的氨基酸)
除突变CC酰基转移酶M269Y和M269T外M269突变体可以用编码对应于被突变的氨基酸顺序的合成DNA寡聚体代替pCKH274Q中BstBⅠ和NheⅠ之间的DNA的方法(盒式突变法)来制备。
(1)制备pCKH274Q
(ⅰ)制备mp18p183(H274Q)
利用实施例4所述的Kunkel法由mp18p183和合成的DNA寡聚体Z84(30聚体，5′-CCGGTCGCAGGCTAGCTGATGCTGCGCATA)制备在编码His274-Ala275的DNA顺序上带有NheⅠ位点的突变RF DNA mp18p183(H274Q)。
(ⅱ)制备pCKH274Q
用相似于实施例5-(2)-(ⅳ)所述方法以得自mp18p183(H274Q)的相应DNA代替pCK013的MluⅠ与NcoⅠ间的小DNA顺序来制备pCKH274Q。
(2)制备M269V
以类似于实施例2-(1)-(ⅱ)所述方法，用T4多核苷酸激酶将合成的寡聚体SO-M269Vc(5′-CGAAATCCCAGGCGTCTATGCGCAGCATCAT)和SO-M269Vr(5′-CTAGATGATGCTGCGCATAGACGCCTGGGATTT)磷酸化。所得的寡聚体与经BstBⅠ和NheⅠ消化的pCKH274Q的大DNA片段连接，产生所需的表达载体pCKM269V。
以类似于上文所述的方法，由pCKH274Q和下表所列合成寡聚体制备用于突变型CC酰基转移酶M269E、M269L、M269W、M269S、M269N、M269A、M269I、M269K、M269H、M269P、M269R、M269C、M269D、M269G、M269Q和M269F的其它表达载体。可以用插入一对寡聚体SO-M269E(编码链)和SO-M269L(反义链)到经BstBⅠ和NheⅠ消化的大DNA片段来制备分别用于M269E和M269L突变体的pCKM269E和pCKM269L。所得载体有存在SmaⅠ限制性酶位点(pCKM269E)或不存在该位点(pCKM269L)之分。
Figure 9310348300351
(3)制备pCKM269T
用类似于实施例4所述的方法用得自mp18p183(M269T)的相应DNA替代pCK013的MluⅠ与NcoⅠ之间的小段DNA以制备pCKM269T，而mp18p183(M269T)借助Kunkel法由合成寡聚体Z63(24聚体，5′GCTGCGCATAGGTACCCGGGATTT)和mp18p183构建。
(4)制备pCKM26.9F
用类似于实施例2-(1)-(ⅱ)所述的方法用T4多核苷酸激酶将合成寡聚体SO-M269Fc(5′-CGAAATCCCTGGTTTCTATGCGCAGCATCAT)和SO-M269Fr(5′-CTAGATGATGCTGCGCATAGAAACCAGGGATTT)进行磷酸化处理。将所得的寡聚体与经BstBⅠ和NheⅠ消化的pCKH274Q的大DNA片段连接，产生所需的表达载体pCKM269F。
(5)制备pCKM269L
以类似于实施例2-(1)-(ⅱ)所述的方法用T4多核苷酸激酶将合成寡聚体SO-M269E(编码链，5′-CGAGATCCCGGGCGAGTATGCGCAGCATCAT)和SO-M269L(反义链，5′-CTAGATGATGCTGCGCATATAAGCCTGGGATCT)进行磷酸化处理。所得的寡聚体与经BstBⅠ和NheⅠ消化的pCKH274Q的大片段连接。连接混和物用于转化E.coli JM109。从所得的转化体中证实了具有一个SmaⅠ位点，而没有BstBⅠ位点也没有NheⅠ位点的质粒是所需的质粒pCKM269L。
(6)培养携带M269突变酰基转移酶表达载体的E.coliJM109
用pCKM269Y(pCKM269F或pCKM269L)转化E.coli JM109。单个菌落在含50μg/ml卡那霉素(5ml)的L肉汤中于37℃培养16小时。取部分所得的培养肉汤(0.8ml)与80％甘油水溶液(0.2ml)混合，得到E.coliJM109/pCKM269Y的甘油贮存液。用类似于实施例8所述方法培养E.coli JM109/pCKM269Y(pCKM269F或pCKM269L)的贮存液(1ml)。
(7)纯化和鉴定M269突变酰基转移酶
以类似于实施例9-(1)所述的方法，从步骤(Ⅴ)所得的相应溶菌产物中纯化M269Y、M269F和M269L。根据实施例9-(2)所述方法，用纯化的M269Y、M269F和M269L测定其比活性。检测结果列于下表：
M269突变体的比活性
酰基转移酶 CC酰基转移酶活性(相当于天然活性的百分数)
天然型M269YM269FM269L 1.55(100)2.11(136)2.62(169)1.67(108)
注：各值代表比活性(单位/毫克蛋白)。

Claims (6)

1．一种突变的头孢菌素C酰基转移酶，其前体的通式为：
A1-268-X1-Tyr-X2-A272-304-X3-A306-773(SEQ ID No:1)
其中，
A1-268是与天然CC酰基转移酶中的Thr1至Gly268之间相同的氨基酸顺序；
A272-304是与天然CC酰基转移酶中的Gln272至Tyr304之间相同的氨基酸顺序；
A306-773是与天然CC酰基转移酶中的Val306至Ala773之间相同的氨基酸顺序；
X1是Met或其它氨基酸；
X2是Ala或Tyr；
X3是Cys或Ser；
条件是当X1是Met，并且X2是Ala时，X3是Ser；
并且与所述天然CC酰基转移酶相比，所述突变的头孢菌素C酰基转移酶具有选自如下的特性：较高的酶效和较高的加工效率。
2．根据权利要求1的突变头孢菌素C酰基转移酶，其中X1是Tyr，X2是Ala，而X3是Ser。
3．编码权利要求1的头孢菌素C酰基转移酶的DNA。
4．含有权利要求3的DNA的表达载体。
5．用权利要求4的表达载体转化的宿主细胞。
6．一种生产权利要求1的突变头孢菌素C酰基转移酶的方法，包括在水质营养培养基中培养权利要求5的宿主细胞，并从所培养的肉汤中回收突变的头孢菌素C酰基转移酶。
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