JPH069649A

JPH069649A - セファロスポリンの改良製法

Info

Publication number: JPH069649A
Application number: JP5094268A
Authority: JP
Inventors: John P Gardner; ジョン・ポール・ガードナー
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 1992-04-24
Filing date: 1993-04-21
Publication date: 1994-01-18
Also published as: ZA932809B; HU9301188D0; BR9301627A; ATE183778T1; US5801011A; EP0567323A3; FI931815A; GR3031739T3; FI931815A0; NO931483L; CZ69593A3; CA2094686A1; AU664078B2; YU27893A; ES2135446T3; NO931483D0; CN1063491C; HUT64352A; DK0567323T3; IL105494A

Abstract

(57)【要約】【目的】７−アミノセファロスポリン骨格とα−アミ
ノ酸の誘導体とを酵素的に縮合させてセファロスポリン
抗生物質とする工業的製法の改良。【構成】７−アミノセファロスポラン酸、７−アミノ
−３−デアセトキシセファロスポラン酸またはその誘導
体のような化合物とα−アミノ酸の誘導体とを適切な固
定化ペニシリン・アシラーゼの存在下に反応させて対応
するセファロスポリンを製造するに当り、下記各条件を
各独立にまたは組合せて採用する。（１）０℃から＋２
０℃の範囲の温度、（２）反応液のｐＨ変化の放置、お
よび（３）セファロスポラン骨格に対するα−アミノ酸
モル比の増加。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は対応する７−アミノセファロスポ
リン骨格とα−アミノ酸とを酵素的に縮合させるセファ
ロスポリン製法の工業的に有利な改良法に関する。

【従来の技術】

【０００２】アミノ酸誘導体と７−アミノセファロスポ
リン骨格との縮合によるセファロスポリンの酵素的製法
は米国特許第３８１６２５３号に記載がある。この特許
の殆どの実施例では、酵素を生産する微生物自体を酵素
源として反応混合物に加える。無細胞の粗製処理物およ
び２段階クロマトグラフィーした処理物の例示がある。
この特許は反応温度範囲として５℃から５０℃、中でも
２０℃から４０℃が最も有利であると記載している。し
かし実施例の一つを除き、３７℃で反応している。この
唯一の例外である実施例では２５℃で反応し、６３％の
収率に達するとしている。

【発明が解決しようとする課題】

【０００３】前記特許に例示された温度で操作する時に
は所期生成物の収率はアミノ酸誘導体の加水分解物を主
とする混在副産物の形成を起こす競争反応によって低下
することがある。この副産物は反応混合物から容易に分
離できるとは限らない。副産物が存在すると、容易に除
去できると否とに拘らず、生産費は増加する。過去に酵
素製法が用いられたが、どの合成反応でも多量の酵素が
消費される。そのため、酵素の価格がその製法の価格の
大きな部分を占める。

【０００４】酵素法は現在操業費用のため、商業的には
通常の有機化学製法ほどには魅力がない。しかし、酵素
製法の費用が減少すれば、有機化学的製法と比べて酵素
的製法の商業的な重要さが増すような多くの利点を持
つ。例えば、酵素的反応法が一工程を要する時、有機化
学法は数工程を要する。更に、有機化学的製法は長く、
ピリジンのような溶媒を多量に使い、望ましくない副産
物ができる。前記に鑑み、この技術で必要なのは以前に
酵素法で達成されたのと同等か、より良い収率の酵素製
法である。

【課題を解決するための手段】

【０００５】以下に記載する様に、固定化ペニシリン・
アシラーゼの存在下、適当な反応液／溶媒中、＋２０℃
から０℃の範囲の温度で縮合反応を行うことによって、
所期セファロスポリン抗生物質製品の収率を先行技術の
開示よりも高い水準に増加できることが見出された。ほ
かに、本発明の方法は反応液のｐＨ変化を放置しながら
以下に記載のように縮合する方法に関する。さらに、本
発明の方法はセファロスポリン骨格に対し、高モル比の
α−アミノ酸を使って縮合させる方法に関する。

【０００６】本発明の方法は式（Ｉ）

【化７】［式中、Ｒは置換されていてもよい５または６員環炭化
水素環であるか、またはヘテロ原子（Ｎ、ＯまたはＳ）
１ないし４を含む置換されていてもよい５員環ヘテロ環
であり、Ｒ₁は水素、ハロゲン、メチル、メトキシ、有
機基に結合しているメチレン、有機基に架橋酸素、硫黄
または窒素原子を介して結合していてもよいメチレンで
あり、Ｒ₂は水素またはカルボキシ保護基である］で示
されるセファロスポリンの製造に用いられる。

【０００７】本製法は式（ＩＩＩ）

【化８】で示されるα−置換−α−アミノ酸の反応性誘導体（こ
の誘導はカルボキシ基中のヒドロキシ基の置換による）
と式（ＩＩ）

【化９】［式中、Ｒ、Ｒ₁およびＲ₂は前記の基である］で示され
る７−アミノセファロスポリン基質化合物とをペニシリ
ン・アシラーゼ酵素（好ましくは固定化されたもの）の
存在下、独立した反応条件、すなわち、温度範囲０℃か
ら＋２０℃（好ましくは０℃から５℃）、反応液ｐＨ変
化の放置およびセファロスポリン基質に対するα−アミ
ノ酸の高モル比、の中から一つ以上を採用して反応させ
ることからなるものである。

【０００８】先行技術によるセファロスポリン酵素的製
法の特性は不純物の副生および製造中の酵素損失であ
る。本発明の第一の態様では、抗生物質化合物製造に際
して発生する不純物量が式（ＩＩＩ）で示されるα−置
換−α−アミノ酸の反応性誘導体と式（ＩＩ）で示され
る７−アミノセファロスポリン基質とを固定化酵素の存
在下に約０℃から約２０℃に至る範囲の温度における縮
合反応を採用することによって減少する。

【０００９】低温では、酵素活性は一般に抑制される。
この抑制はしばしば顕著である。この問題に対応するた
め本発明では一般に多量の酵素を使う。この対応策によ
って極めて低温、たとえば０℃から５℃、でも生成物が
好収率で得られる。

【００１０】このバイオ触媒縮合工程の実施に当り、生
成物の濃度は酵素量、基質、温度およびその他の当業者
公知の条件によって変化する時間の後に最高に達する。
その後、生成物濃度は最高生成物濃度に達するに要した
時間に大体比例する時間だけ一定値を示す。例えば約２
時間で最高生成物濃度に達する時は横這い濃度が約１時
間続く。その後、普通は生成物濃度が減少する。本発明
の実施に当り、生成物を反応器から除くのに十分な時間
があるように、安定な生成物濃度（または横這い濃度）
が約１時間継続するようなペニシリン・アシラーゼ酵素
量を採用するのが好適である。しかし、横這い濃度時間
約１０分から約１２０分、より好ましくは約３０分から
約８０分、が本発明の実用には有用と思われる。

【００１１】本発明の他の態様では、反応液のｐＨ変化
を放置する。換言すれば緩衝液のような手段でｐＨを一
定に保つことはしない。ｐＨ変化の放置と言う条件は反
応の間に何の介入もせずにｐＨを変動または変化するま
まにしておくものである。通常、ｐＨを約７〜７．５に
設定し、反応の間にｐＨ６〜７に落ちるままにする。理
論に拘束されることは望まないが、反応液のｐＨ変化を
放置すればＰＧＭＥおよび最終生成物の加水分解速度の
減少は最終生成物の生成速度の減少より大きいと信じら
れている。

【００１２】本発明の全態様で、一般に酵素使用量は７
−アミノセファロスポリン基質（ＩＩ）１ｇ当り酵素５
０〜３０００国際単位である。勿論、本発明で使う酵素
量は例えば基質の性質と品質、反応規模、採用する温度
および使用する装置の型などによって変化するのは当業
者の認識し得るところである。

【００１３】前式において、Ｒは５または６員環脂肪族
または芳香族炭化水素環（たとえばフェニル、シクロヘ
キサジエニル、シクロヘキセニルまたはシクロヘキシ
ル）で、これに限定されるものではないがヒドロキシ
ル、ハロゲン、アルキル、アルコキシル、カルボキシ
ル、ニトロ、アミノなどを含む１個以上の基で置換され
ていてもよい。またはＲはＯ、Ｎ、Ｓから選ばれたヘテ
ロ原子１個以上またはその組合せ（好ましくは４個以
下）を含む５員環ヘテロ環（たとえばチエニル、フリル
など）で、これに限定されるものではないがヒドロキシ
ル、ハロゲン、アルキル、アルコキシル、カルボキシ
ル、ニトロ、アミノなどを含む１個以上（好ましくは３
個以下）の基で置換されていてもよい。特に、Ｒが非置
換フェニル、ｐ−ヒドロキシフェニルまたは１，４−シ
クロヘキサジエン−１−イル基である生成物化合物
（Ｉ）および対応する式（ＩＩＩ）で示される化合物は
好適である。Ｒがヘテロ環基である時、４−チアゾリ
ル、フリルおよびチエニル基は有利に用い得ると期待さ
れる。

【００１４】次にＲ₁は水素原子、ハロゲン原子（Ｂ
ｒ、Ｃｌ、Ｉ、Ｆ）、メトキシ、メチル、Ｃ₁〜Ｃ₆アル
コキシ、Ｃ₁〜Ｃ₆アルコキシ−カルボニルまたはＯ、
Ｓ、Ｎから選ばれたヘテロ原子１個ないし４個またはそ
の組合せを含む５−または６−員環ヘテロ環基のような
有機基に結合しているメチレン基であって、このメチレ
ン基はこの有機基にＯ、ＳまたはＮの架橋原子を通して
結合していてもよく、ヘテロ環基は（限定ではなく）ヒ
ドロキシ、ハロゲン、Ｃ₁〜Ｃ₆アルキル、Ｃ₁〜Ｃ₆アル
コキシ、カルボニル、カルボキシ、シアノ、アミノ、ニ
トロなどを含む１個以上の置換基を有していてもよい。
特に好適なＲ₁はメチル、メトキシ、クロロおよびアセ
トキシメチレンである。Ｒ₁用に好適なヘテロ環基は
（ヘテロ環のラクタム環系への接続を仲立するメチレン
とヘテロ原子を除き）１Ｈ−１，２，３−トリアゾール
−４−イル、１Ｈ−テトラゾール−５−イルおよび２−
チアゾリル基である。

【００１５】本発明で使うα−置換−α−アミノ酸の反
応性誘導体はカルボキシル基の誘導体で、ペニシリン・
アシラーゼと接触した時に加水分解されて縮合に用いる
カルボン酸を再生することができる有機基でカルボキシ
ル基中のヒドロキシが置換されているものである。理論
に拘束されることは望まないが、この実験からこの誘導
体を酵素と反応して反応性アシル−酵素中間体を形成、
次にそれが式（ＩＩ）で示される７−アミノセファロス
ポリン骨格と反応してアミジン結合を形成できるもので
あると信じられている。

【００１６】式（ＩＩＩ）で示されるα−アミノ酸の反
応性誘導体の有用な例はアルキルエステル（たとえば、
メチルエステル、エチルエステル）、アラルキルエステ
ル（たとえばベンジルエステル）、アミドおよびジペプ
チド（すなわち、第２のアミノ酸との間のアミド）であ
る。Ｄ−フェニルグリシン、Ｄ−ｐ−ヒドロキシフェニ
ルグリシンおよびＤ−１，４−シクロヘキサジエン−１
−イル−グリシンの各メチルエステルは好適な例であ
る。カルボキシ保護基（Ｒ₂）の他の例は参考文献、米
国特許第４８９２９４２号、Ｅ．ハスラム、「有機化学
における保護基」、Ｊ．Ｇ．Ｗ．マコミー編、プレナム
・プレス、ニューヨーク、ＮＹ、１９７３年、第５章お
よびＴ．Ｗ．グリーン、「有機合成における保護基」、
ジョン・ワイリー・アンド・サンズ、ニューヨーク、Ｎ
Ｙ、１９８１年、第５章を参照。式（ＩＩ）で示される
化合物の中でも以下の酸は殊に重要である。７−アミノ
セファロスポラン酸、７−アミノ−３−デアセトキシセ
ファロスポラン酸および７−アミノ−３−クロロセファ
ロスポラン酸。

【００１７】本発明の方法で使うペニシリン・アシラー
ゼは公知微生物源のどれから誘導してもよい。この中に
は、キサントモナス、シュードモナス、アエロモナス、
エシェリチア、アースロバクター、コリネバクテリウム
およびバチルスの属の微生物がある。大腸菌ＡＴＣＣ９
６３７のペニシリン・アシラーゼ利用は殊に好適であ
る。好ましくは、本発明の製法は固定化酵素の存在下に
行う。吸着、ポリマー・マトリックスへのイオン結合ま
たは共有結合、架橋構造、ゲルまたは繊維への封じ込
め、マイクロカプセル化または膜反応器中の限外濾過膜
への捕捉（すなわち、膜分配）など多数の公知固定化技
術のどれも固定化に採用できる。セルローズ・トリアセ
テート繊維構造に取込んだ酵素またはポリアクリルアミ
ジン樹脂へ共有結合させた酵素の使用が好ましい。固定
化ペニシリン・アシラーゼは、繊維に捕捉したものもポ
リマーに共有結合したものもイタリー、カッシナ・デ・
ペッチのレコルダッチ、Ｓ．ｐ．Ａ．社、ビオケミカル
・ユニット、Ｄｅ．Ｂｉ．から商業的に入手できる。

【００１８】式（ＩＩ）で示される化合物は約０．５か
ら約２％（ｗｔ／ｖ）、好ましくは１．４から１．５％
の濃度で反応させる。本発明の他の態様では、式（ＩＩ
Ｉ）で示される反応性誘導体は式（ＩＩ）で示される化
合物に対して高モル比（約３から約５の間）で反応させ
る。反応は約０℃から約＋２０℃の範囲で行っても良い
が、０℃から２℃の温度が好適である。

【００１９】水のみの溶媒系は好適である。しかし、適
当な有機溶媒にはエチレングリコール、低級アルコール
（たとえば、メタノール、エタノール、イソプロパノー
ル、２−ブタノール）、アセトンなどを含み、水性の系
中で使用してもよい。本発明の反応工程中に、反応の進
行と生成物の品質を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰ
ＬＣ）などの方法で監視してもよい。温度とモル比の二
つの有利な変数を最高収率を得るように制御しつつ、反
応液のｐＨ変化を放置するのが本発明の最も好適な製造
法である。

【実施例】

【００２０】以下の実施例は本発明の性質と適用性をさ
らによく説明するが、これがその範囲を制限するもので
はない。発明を例示するに当り、７−アミノ−３−クロ
ロセファロスポラン酸（「７−ＡＣＣＡ」）をセファロ
スポリン基質として用いた。７−ＡＣＣＡはＲ．Ｒ．シ
ョウベット等がジャーナル・オブ・メデイシナル・ケミ
ストリー、１８巻、４０３頁（１９７５年）に記載した
方法によって製造できる。Ｄ−フェニルグリシンメチル
エステル（「ＰＧＭＥ」）およびＤ−ｐ−ヒドロキシフ
ェニルグリシンメチルエステル（「ＨＰＧＭＥ」）は商
業的に入手可能なアミノ酸（たとえば、ＳＩＧＭＡ社か
ら）から塩酸の存在下メタノールで処理する標準的エス
テル化操作を用いて製造できる。これらのアミノ酸の古
典的誘導方法はＣ．Ａ．ビューラーおよびＤ，Ｅ，ピア
ソン、サーベイ・オブ・オーガニック・シンテシス、ワ
イリー−インターサイエンス、ニューヨーク、１９７０
年、１巻、８０１〜８３０頁および１９７７年、２巻、
７１１〜７２６頁に記載がある。

【００２１】実施例１７−（Ｄ−２−アンモニウム−２−フェニルアセトアミ
ド）−３−クロロ−３−セフェム−４−カルボキシレー
ト、分子内塩

【化１０】（１）７−ＡＣＣＡ（１）（０．９３８８ｇ、４．００
０７ｍｍｏｌ）および水（９６．０ｍｌ）をビーカー中
で混合する。ｐＨは４．１２である。３モルＮＨ
₃（１．７８ｍｌ）をビーカーに加える。ｐＨは７．５
７である。Ｄ−フェニルグリシンメチルエステル塩酸塩
（２）（４．７５９４ｇ、２３．６０２ｍｍｏｌ）をビ
ーカーに加える。ｐＨは５．６８である。混合物を５℃
に冷却、３モルＮＨ₃（１．９０ｍｌ）を加え、ｐＨを
７．００とする。酵素（６．１４４２ｇ、９４０ＩＵ／
ｇ骨格）を加える。ＨＰＬＣ分析で以下の反応速度資料
を得る。

【表１】２００分目に混合物を濾過（固定化酵素を除去する）し
た時、濾液中の標記化合物の収率は９３％である。

【００２２】実施例２７−（Ｄ−２−アンモニウム−２−フェニルアセトアミ
ド）−３−クロロ−３−セフェム−４−カルボキシレー
ト、分子内塩（１）７−ＡＣＣＡ（１．００７２ｇ、４．０００ｍｍ
ｏｌ）および精製水（５５０ｍｌ）をビーカー中で混合
する。ｐＨは３．３９である。３モルＮＨ₃（４．１０
ｍｌ）を混合物に加える。ｐＨは６．７３である。Ｄ−
フェニルグリシンメチルエステル塩酸塩（４．８３９７
ｇ、２４．０００ｍｍｏｌ）を混合物に加える。ｐＨは
６．５である。混合物を水（１３．７７ｍｌ）でうすめ
て７５．０９ｍｌとする。混合物に湿った酵素（３．０
６７２ｇ、〜４７０ＩＵ／ｇ骨格）を加える。（実験
中、３０分毎にｐＨを６．５に調整する）。ＨＰＬＣ分
析で以下の資料を得る。

【表２】３５０分後、混合物を濾過すると濾液中の標記化合物の
収率は８８．２％である。

【００２３】実施例３〜１７７−（Ｄ−２−アンモニウム−２−フェニルアセトアミ
ド）−３−クロロ−３−セフェム−４−カルボキシレー
ト、分子内塩実施例３〜１７では以下の一般的操作を用いた。（１）７−ＡＣＣＡ（１．００７２ｇ、４．００ｍｍｏ
ｌ）を水と混合する。混合物のｐＨを３モルＮＨ₃で調
節して溶液とする。Ｄ−フェニルグリシンメチルエステ
ル塩酸塩（所定量）を次表記載の通りに加える。混合物
を５℃に冷却する。次に３モルＮＨ₃を加えてｐＨを次
表記載の値とする。混合物を水で希釈して次表記載の濃
度とする。次に湿った酵素（３．０７ｇ、５００ＩＵ／
ｇ骨格）を加える。出発ｐＨを６．５とした実験ではｐ
Ｈを６．２〜６．５にしたが、それ以外の実験ではｐＨ
調節はしなかった。反応条件ａ）Ｄ−フェニルグリシンメチルエステル塩酸塩１．０
当量ｂ）Ｄ−フェニルグリシンメチルエステル塩酸塩３．５
当量ｃ）Ｄ−フェニルグリシンメチルエステル塩酸塩６．０
当量ｄ）濃度０．５ｅ）濃度１．２５ｆ）濃度２．０ｇ）出発ｐＨ（酵素添加後）６．５ｈ）出発ｐＨ（酵素添加後）７．２５ｉ）出発ｐＨ（酵素添加後）８．０

【表３】

【００２４】実施例１８７−（Ｄ−２−アンモニウム−２−フェニルアセトアミ
ド）−３−クロロ−３−セフェム−４−カルボキシレー
ト、分子内塩（１）７−ＡＣＣＡ（４．８３３８ｇ、２０ｍｍｏｌ）
を水（１５０ｍｌ）と混合する。ｐＨは３．６７であ
る。３Ｍ−ＮＨ₃（８．４０ｍｌ）を混合物に加える。
ｐＨは８．２０である。Ｄ−フェニルグリシンメチルエ
ステル（２３．０ｇ、１１４ｍｍｏｌ）を混合物に加え
る。ｐＨは５．２９である。混合物をフィルター・エイ
ドで濾過し、水（１００ｍｌ）でうすめる。溶液の容積
は３１０ｍｌである。水（５ｍｌ）を加え、溶液を１℃
に冷す。ｐＨは５．８０である。ｐＨを３Ｍ−ＮＨ
₃（１６．６ｍｌ）で７．２８に調整する。容積は３３
２ｍｌである。水洗した酵素（１５．３４ｇ）を加え
る。ＨＰＬＣ分析で以下の資料を得る。

【表４】

【００２５】実施例１９７−（Ｄ−２−アンモニウム−２−フェニルアセトアミ
ド）−３−クロロ−３−セフェム−４−カルボキシレー
ト、分子内塩（１）７−ＡＣＣＡ（０．４９４ｇ、２．０００ｍｍｏ
ｌ）および０．００３３Ｍ−Ｋ₂ＨＰＯ₄（４２．０ｍ
ｌ、ｐＨ６．５）をビーカーに入れる。ｐＨは５．９１
である。この溶液に４５％Ｋ₃ＰＯ₄（ｅｑ）（０．９２
ｍｌ）を加えて溶かす。ｐＨは７．２４である。Ｄ−フ
ェニルグリシンメチルエステル塩酸塩（２．３７９７
ｇ、１１．８０１ｍｍｏｌ）（２）を加える。ｐＨは
６．４０である。４５％Ｋ₃ＰＯ₄（１．１０ｍｌ）を加
えてｐＨ約７．０とする。酵素（２．６１２０ｇ、８０
０ＩＵ／ｇ骨格）を加える。Ｔ＝４３分に４５％Ｋ₃Ｐ
Ｏ₄（１．３４ｍｌ）でｐＨを７．００に調整する。標
記化合物の最高収率は６６．１％である。

【表５】

【００２６】実施例２０７−（Ｄ−２−アンモニウム−２−フェニルアセトアミ
ド）−３−クロロ−３−セフェム−４−カルボキシレー
ト、分子内塩乾燥酵素２．２７０７ｇ（２６６０ＩＵ／ｇ骨格）を用
いる他は実施例１９の実験を反復する。反応中、ｐＨの
調節はしない。最高収率は６７．５％である。

【表６】

【００２７】実施例２１７−（Ｄ−２−アンモニウム−２−フェニルアセトアミ
ド）−３−クロロ−３−セフェム−４−カルボキシレー
ト、分子内塩以下の点を変更して実施例１９に記載した実験を反復す
る。化合物１：０．４６９８ｇ、２．００２ｍｍｏｌ化合物２：２．３８１ｇ、１１．８０７４ｍｍｏｌ０．０３３Ｍ−Ｋ₂ＨＰＯ₄／ｐＨ６．５緩衝液：４４．
０ｍｌ４５％Ｋ₃ＰＯ₄：０．９５ｍｌ／１．０６ｍｌ湿った酵素：８．１６８６ｇ、２６６０ＩＵ／ｇ骨格Ｔ＝５２分に４５％Ｋ₃ＰＯ₄１．３７ｍｌでｐＨを７．
００に調節する。最高収率は６５．６％である。

【表７】

【００２８】実施例２２７−（Ｄ−２−アンモニウム−２−フェニルアセトアミ
ド）−３−クロロ−３−セフェム−４−カルボキシレー
ト、分子内塩７−ＡＣＣＡ（０．４７０ｇ、２．００５８ｍｍｏｌ）
（１）および０．０３３Ｍ−Ｋ₂ＨＰＯ₄（４８．０ｍ
ｌ、ｐＨ６．５）をビーカーに入れる。ｐＨは５．７３
である。ビーカーを２０℃の浴中に置く。４５％Ｋ₃Ｐ
Ｏ₄（１．０６ｍｌ）を加えて溶かす。ｐＨは７．２１
である。溶液にＤ−フェニルグリシンメチルエステル塩
酸塩（２．３８１１ｇ、１１．８０９９ｍｍｏｌ）
（２）を加える。ｐＨは６．６０である。４５％Ｋ₃Ｐ
Ｏ₄（０．７１ｍｌ）を加えてｐＨを７．００とする。
湿った酵素（３．０７２７ｇ）を加える。生成物のイン
・シチュ最高収率は７４．６％である。

【表８】

【００２９】実施例２３７−（Ｄ−２−アンモニウム−２−フェニルアセトアミ
ド）−３−クロロ−３−セフェム−４−カルボキシレー
ト、分子内塩７−ＡＣＣＡ（０．４７１０ｇ、２．００７１ｍｍｏ
ｌ）（１）および０．０３３Ｍ−Ｋ₂ＨＰＯ₄（４８．０
ｍｌ、ｐＨ６．５）をビーカーに入れる。ｐＨは６．０
２である。４５％Ｋ₃ＰＯ₄（０．９８ｍｌ）を加えて溶
解する。ｐＨは７．３４である。溶液にＤ−フェニルグ
リシンメチルエステル塩酸塩（２．３８０１ｇ、１１．
８０３ｍｍｏｌ）（２）を加える。ｐＨは６．５８であ
る。ビーカーを浴（２０℃）中に置く。４５％Ｋ₃ＰＯ₄
（０．６３ｍｌ）を加えて溶液のｐＨを７．００とす
る。湿った酵素（３．０７３８ｇ）を加える。標記化合
物の最高収率は７０．１％である。［注釈：５分から５０分の間には各５分の間隔に先立つ
１分前に少量の４５％Ｋ₃ＰＯ₄を加えて溶液のｐＨを約
７．００に上昇させる］

【表９】

【００３０】実施例２４７−（Ｄ−２−アンモニウム−２−フェニルアセトアミ
ド）−３−クロロ−３−セフェム−４−カルボキシレー
ト、分子内塩７−ＡＣＣＡ（０．４６９６ｇ、２．００１２ｍｍｏ
ｌ）（１）および水（４８．０ｍｌ）をビーカーに入れ
る。ｐＨは３．５である。溶液を１０℃に冷却する。３
Ｍ−ＮＨ₃（２．４７ｍｌ）を加える。ｐＨは７．１０
である。Ｄ−フェニルグリシンメチルエステル塩酸塩
（２．３８３５ｇ、１１．８１９８ｍｍｏｌ）を加え
る。ｐＨは５．６５である。３Ｍ−ＮＨ₃（４．３０ｍ
ｌ）を加える。ｐＨは７．００である。湿った酵素
（３．０７７８ｇ、１０００ＩＵ／ｇ骨格）を加える。
［Ｔ＝２５６分に３Ｍ−ＮＨ₃２．６０ｍｌでｐＨを
７．００に調整する］。最高収率は７１．１％である。

【表１０】

【００３１】実施例２５７−（Ｄ−２−アンモニウム−２−フェニルアセトアミ
ド）−３−クロロ−３−セフェム−４−カルボキシレー
ト、分子内塩７−ＡＣＣＡ（０．４６９４ｇ、２．０００３ｍｍｏ
ｌ）（１）および水（４８．０ｍｌ）をビーカーに入れ
る。ｐＨは３．２５である。溶液を１０℃に冷却する。
３Ｍ−ＮＨ₃（３．０５ｍｌ）を加える。ｐＨは７．０
８である。Ｄ−フェニルグリシンメチルエステル塩酸塩
（２）（２．３８０９ｇ、１１．８０６９ｍｍｏｌ）を
加える。ｐＨは５．４０である。３Ｍ−ＮＨ₃（７．２
４ｍｌ）を加えてｐＨを７．００とする。湿った酵素
（８．１８４０ｇ、２６７０ＩＵ／ｇ骨格）を加える。
［Ｔ＝３７分に３Ｍ−ＮＨ₃（１．７２ｍｌ）を加えて
ｐＨを６．５２に調整する。Ｔ＝２９８分に３Ｍ−ＮＨ
₃（１．７２ｍｌ）を加えてｐＨを６．５５に調整す
る］。最高収率は７１．２％である。

【表１１】

【００３２】実施例２６７−（Ｄ−２−アンモニウム−２−フェニルアセトアミ
ド）−３−クロロ−３−セフェム−４−カルボキシレー
ト、分子内塩７−ＡＣＣＡ（１）（０．４６９８ｇ、２．００２ｍｍ
ｏｌ）および水（４８．０ｍｌ）をビーカーに入れる。
ｐＨは３．４６である。３Ｍ−ＮＨ₃（３．５０ｍｌ）
を加える。ｐＨは７．２３である。Ｄ−フェニルグリシ
ンメチルエステル塩酸塩（２）（２．３７９８ｇ、１
１．８０１５ｍｍｏｌ）を加える。ｐＨは５．４８であ
る。混合物を５℃に冷却する。３Ｍ−ＮＨ₃（４．３３
ｍｌ）を加えてｐＨを７．００とする。湿った酵素
（３．０７１０ｇ、１０００ＩＵ／ｇ骨格）を加える。
［Ｔ＝２９５分に３Ｍ−ＮＨ₃（２．８７ｍｌ）を加え
てｐＨを７．００に調整する］。最高収率は７９．５％
である。

【表１２】

【発明の効果】引用特許に記載の収率と比べ、本発明条
件を採用する実施例では顕著な収率の上昇を確認でき
た。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】式（Ｉ）【化１】［式中、Ｒは置換されていてもよい５または６員環炭化
水素環であるか、または窒素、酸素または硫黄からなる
群から選ばれたヘテロ原子１個またはそれ以上を含む、
置換基を有することもある５員環ヘテロ環であり、Ｒ₁は水素原子、ハロゲン原子、メトキシ、メチル、ま
たは有機基に直接にまたは酸素、硫黄または窒素原子
を介して結合しているメチレンであり、この有機基はア
ルコキシ、アルコキシカルボニルまたは置換されていて
もよい５または６員環ヘテロ環基であって、そのヘテロ
環基はＯ、ＳおよびＮから選ばれたヘテロ原子１〜４個
を含む基であり、Ｒ₂は水素またはカルボキシ保護基である］で示される
セファロスポリンの製造法であって、式（ＩＩＩ）【化２】［式中、カルボキシ基中のヒドロキシは有機基で置換さ
れているものとする］で示されるα−置換−α−アミノ
酸の反応性誘導体と式（ＩＩ）【化３】で示されるセファロスポリン基質とを有効量の固定化ペ
ニシリン・アシラーゼ酵素の存在下、約０℃から約＋２
０℃の温度範囲で反応させることからなる方法。
【請求項２】反応液のｐＨ変化を放置したまま反応さ
せる請求項１の製法。
【請求項３】式（Ｉ）【化４】［式中、Ｒは置換されていてもよい５または６員環炭化
水素環であるか、または窒素、酸素または硫黄からなる
群から選ばれたヘテロ原子１個またはそれ以上を含む、
置換基を有することもある５員環ヘテロ環であり、Ｒ₁は水素原子、ハロゲン原子、メトキシ、メチル、ま
たは有機基に直接にまたは酸素、硫黄または窒素原子
を介して結合しているメチレンであり、この有機基はア
ルコキシ、アルコキシカルボニルまたは置換されていて
もよい５または６員環ヘテロ環基であって、そのヘテロ
環基はＯ、ＳおよびＮから選ばれたヘテロ原子１〜４個
を含む基であり、Ｒ₂は水素またはカルボキシ保護基である］で示される
セファロスポリンの製造法であって、式（ＩＩＩ）【化５】［式中、カルボキシ基中のヒドロキシは有機基で置換さ
れているものとする］で示されるα−置換−α−アミノ
酸の反応性誘導体と式（ＩＩ）【化６】で示されるセファロスポリン基質とを有効量の固定化ペ
ニシリン・アシラーゼ酵素の存在下、反応液のｐＨ変化
を放置したまま反応させることからなる方法。
【請求項４】反応温度範囲が約０℃から約５℃である
請求項３の製法。