CZ200782A3 - Sekvence nukleotidu o velikosti 2646 bp, kódující penicilinacylázu, nové konstrukty rekombinantní nukleové kyseliny a rekombinantní mikroorganismy nesoucí tuto sekvenci - Google Patents
Sekvence nukleotidu o velikosti 2646 bp, kódující penicilinacylázu, nové konstrukty rekombinantní nukleové kyseliny a rekombinantní mikroorganismy nesoucí tuto sekvenci Download PDFInfo
- Publication number
- CZ200782A3 CZ200782A3 CZ20070082A CZ200782A CZ200782A3 CZ 200782 A3 CZ200782 A3 CZ 200782A3 CZ 20070082 A CZ20070082 A CZ 20070082A CZ 200782 A CZ200782 A CZ 200782A CZ 200782 A3 CZ200782 A3 CZ 200782A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- sequence
- nucleotide sequence
- nucleic acid
- recombinant
- nucleotide
- Prior art date
Links
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 title claims abstract description 53
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 title claims abstract description 53
- 108010073038 Penicillin Amidase Proteins 0.000 title claims abstract description 36
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims abstract description 17
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims abstract description 17
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 17
- 244000005700 microbiome Species 0.000 title description 8
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 32
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 21
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 14
- 241000932047 Achromobacter sp. Species 0.000 claims abstract description 7
- 241000672609 Escherichia coli BL21 Species 0.000 claims abstract description 6
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims abstract description 5
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 5
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 claims abstract description 5
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 4
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 claims abstract description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 5
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 abstract description 6
- 241000589518 Comamonas testosteroni Species 0.000 abstract description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 22
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 13
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 11
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 11
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 11
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 9
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 9
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 9
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 7
- 238000000034 method Methods 0.000 description 7
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- OSBLTNPMIGYQGY-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid;boric acid Chemical compound OB(O)O.OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O OSBLTNPMIGYQGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000194107 Bacillus megaterium Species 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020001019 DNA Primers Proteins 0.000 description 2
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 239000008051 TBE buffer Substances 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 2
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 2
- 150000001780 cephalosporins Chemical class 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 2
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 2
- 229940056360 penicillin g Drugs 0.000 description 2
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- 241000590020 Achromobacter Species 0.000 description 1
- 241001673062 Achromobacter xylosoxidans Species 0.000 description 1
- 241000186361 Actinobacteria <class> Species 0.000 description 1
- 241000607534 Aeromonas Species 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 241000588986 Alcaligenes Species 0.000 description 1
- 241000588810 Alcaligenes sp. Species 0.000 description 1
- 241000186063 Arthrobacter Species 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229930186147 Cephalosporin Natural products 0.000 description 1
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 101100109110 Danio rerio aph1b gene Proteins 0.000 description 1
- 241000588698 Erwinia Species 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- 241000589565 Flavobacterium Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 101000573901 Homo sapiens Major prion protein Proteins 0.000 description 1
- 241000588752 Kluyvera Species 0.000 description 1
- 241000588773 Kluyvera cryocrescens Species 0.000 description 1
- 102100025818 Major prion protein Human genes 0.000 description 1
- 241000192041 Micrococcus Species 0.000 description 1
- 241000187654 Nocardia Species 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588769 Proteus <enterobacteria> Species 0.000 description 1
- 241000588768 Providencia Species 0.000 description 1
- 241000588777 Providencia rettgeri Species 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000185992 Rhizobium viscosum Species 0.000 description 1
- 241000192023 Sarcina Species 0.000 description 1
- 241000589634 Xanthomonas Species 0.000 description 1
- 230000010933 acylation Effects 0.000 description 1
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 108010034561 alpha-amino acid esterase Proteins 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 108010016886 ampicillin acylase Proteins 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003782 beta lactam antibiotic agent Substances 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 229940124587 cephalosporin Drugs 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000011790 ferrous sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000003891 ferrous sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 101150043258 gins1 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000003262 industrial enzyme Substances 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000359 iron(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000007003 mineral medium Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 150000002960 penicillins Chemical class 0.000 description 1
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002132 β-lactam antibiotic Substances 0.000 description 1
- 229940124586 β-lactam antibiotics Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
- C12N9/80—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in linear amides (3.5.1)
- C12N9/84—Penicillin amidase (3.5.1.11)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y305/00—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5)
- C12Y305/01—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5) in linear amides (3.5.1)
- C12Y305/01011—Penicillin amidase (3.5.1.11), i.e. penicillin-amidohydrolase
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
Rešení spocívá v sekvenci nukleotidu o velikosti 2646 bp, kde je poradí nukleotidu identické s poradím nukleotidové sekvence kódující penicilinacylázu z Achromobacter sp. CCM 4824 (puvodne Comamonas testosteroni CCM 4824), prípadne v 5´-koncových fragmentech této sekvence o délce nejméne 150 nukleotidu a zacínající kterýmkoli nukleotidem s poradovým císlem 1 až 14 nebo v 3´-koncových fragmentech této sekvence o délce 150 nukleotidu a zacínající kterýmkoli nukleotidem s poradovým císlem 2606 až 2646. Sekvence muže být použita pro tvorbu konstruktu nukleové kyseliny, prípadne konstruktu opatreného nejméne jednou regulacní sekvencí rídící expresi genu a produkci polypeptidu s aktivitou penicilinacylázy. Sekvence muže být soucástí rekombinantního expresního vektoru, který se skládá z výše uvedeného konstruktu, promotoru, translacního start signálu, translacního a transkripcního stop signálu. Dále se rešení týká rekombinantní hostitelské bunky obsahující konstrukt nukleové kyseliny nesený na vektoru nebo integrovaný do genomu bunky a kmene E. coli BL21 obsahujícího recenou sekvenci nukleotidu kódujících penicilinacylázu a nesenou na plazmidu pKX1P1, pKLP3 nebo pKLP6.
Description
Sekvence nukleotidů o velikosti 2646 bp, kódující penícilinacylázu, nové konstrukty rekombinantní nukleové kyseliny a rekombinantní mikroorganismy nesoucí tuto sekvenci.
Oblast techniky
Vynález se týká sekvence nukleotidů o velikosti 2646 bp, kódující polypeptid penícilinacylázu, konstruktů rekombinantní nukleové kyseliny, a rekombinantních mikroorganismů nesoucích tuto sekvenci.
Dosavadní stav techniky
Penicilinacylázy (E.C, 3.5.1.11, penicilinamidohydrolasa) jsou produkovány bakteriemi, aktinomycétami, houbami i kvasinkami. Tyto významné průmyslové enzymy jsou na základě své substrátové specifity děleny do tří skupin: penicilin-G-acylázy (PGA), penicilin-Vacylázy (PVA) a esterhydrolázy ci-aminokyselin (AEH, dříve označované jako ampicilinacylázy). Enzymy skupiny PGA mají širokou substrátovou specifitu a katalyzují hydrolýzu amidické vazby penicilinů i cefalosporinů. Mezi bakteriální producenty PGA patří zástupci rodů: Aeromonas, Achromobacter, Alcaligenes, Arthrobacter, Bacillus, Corynebacterium, Escherichia, Erwinia, Flavobacterium, Kluyvera, Micrococcus, Nocardia, Próteus, Providencia, Pseudomonas, Sarcina, Xanthomonas, Xylella (Process Biochem. 24:146-154, 1989, Process Biochem. 27:131-143,1992, Biotechnol. Adv. 18:289-301, 2000).
Kromě produkčních kmenů pro PGA získaných mutagenezí byly připraveny i rekombinantní mikroorganismy obsahující rekombinantní plazmidy se strukturním genem kódujícím PGA z Escherichia coli (Čs. patentový spis fy 244 343 a 246 957), Alcaligenes sp. nebo fecalis (Current Microbiology 39:2444-2448, 1999; EP 638649, Appl. Environ. Microbiol. 63: 34123418, 1997), Arthrobacter viscosus (Appl. Environ. Microbiol. 54: 2603-2607, 1988 a 55: 1351-1356, 1989; Gene 143: 79-83,1994), Bacillus megaterium (J. Bacteriol. 93: 302-306, 1967, Appl. Microbiol. Biotechnol. 25: 372-378, 1987; patent US 3 145 395; Process Biochemistry 29: 263-270, 1994), Kluyvera citrophila (Agric. Bíol. Chem. 39: 1225-1232, 1975; Gene 49: 69-80, Biotechnol.Letters 14: 285-290, 1992), Providencia rettgeri (Acta
Biochim. Polonica 28: 275-284, 1981; J. Bacteriol. 168: 431-433, 1986; DNA sequences 3: 195-200, 1992).
Většina prokaryotních producentů PGA jsou gram-negativní bakterie a enzym je v buňce lokalizován v periplasmě. Enzym je sekretován z buňky do média u kultury Bacillus megaterium.
Penicilin-G-acylázy jsou průmyslově využívány především pro hydrolýzu fenylacetylovaných derivátů cefalosporinů a penicilinu G za účelem přípravy intermediátů 6-APK a 7-ADCK. V poslední době jsou tyto enzymy využívány i pro syntetické reakce, acylace výše zmíněných intermediátů, které vedou k přípravě polosyntetických antibiotik (např.TTSjpatenty 5 753 458 aJÍ5 801 011; WO 98/04732; WO 97/04086; Enzyme Microb. Technol. 25: 336-343, 1999; Synthesis of β-lactam antibiotics: Chemistry, Biocatalysis and Process Integration, Ed.: A. Bruggink, Kluwer Academie Publishers, Dordrecht/Boston/London, 2001).
Za účelem opakovaného, dlouhodobého využívání PGA při katalýze enzymové reakce je enzym stabilizován imobilizaci nebo enkapsulací za vzniku enzymového katalyzátoru. V této podobě enzym vykazuje vyšší pH stabilitu, teplotní stabilitu a delší poločas životnosti za reakčních podmínek, při nichž katalyzuje průběh reakce.
Podstata vynálezu
Předmětem předloženého vynálezu je sekvence nukleotidů o velikosti 2646 bp, kódující tf penicilinacylázu, kde je pořadí nukleotidů nejméně z 95% identické s pořadím nukleotidů uvedeným na obr. 5.
Význakem vynálezu jsou dále 5'-koncové fragmenty sekvence nukleotidů podle předloženého vynálezu o délce nejméně 150 nukleotidů a začínající kterýmkoli nukleotidem s pořadovým číslem 1 až 14.
Dále jsou význakem vynálezu 3'-koncové fragmenty sekvence nukleotidů podle předloženého vynálezu o délce nejméně 150 nukleotidů a začínající kterýmkoli nukleotidem s pořadovým číslem 2606 až 2646.
Význakem vynálezu je také konstrukt nukleové kyseliny obsahující sekvenci nukleotidů podle předloženého vynálezu nebo 5'-koncové fragmenty nebo 3'-koncové fragmenty sekvence nukleotidů podle předloženého vynálezu, opatřený nejméně jednou regulační sekvencí řídící expresi genu a produkci polypeptidů s aktivitou penicilinacylázy.
Význakem vynálezu je i rekombinovaný plazmid obsahující sekvenci nukleotidů podle předloženého vynálezu nebo 5'-koncové fragmenty nebo 3'-koncové fragmenty sekvence podle předloženého vynálezu.
Dále je význakem vynálezu rekombinantní expresní vektor složený z konstruktu nukleové kyseliny podle předloženého vynálezu, promotoru, translačního start signálu a translačního a transkripčního stop signálu.
Význakem vynálezu je také hostitelská buňka obsahující konstrukt nukleové kyseliny podle předloženého vynálezu.
Dále je význakem vynálezu hostitelská buňka v níž je konstrukt nukleové kyseliny nesen na rekombinantním expresním vektoru podle předloženého vynálezu.
Význakem vynálezu je také hostitelská buňka v níž je konstrukt nukleové kyseliny integrován do genomu buňky.
Význakem vynálezu jsou dále rekombinované plazmidy pKXlPl, pKLP3 a pKLP6, charakterizované vloženou sekvencí nukleotidů podle předloženého vynálezu, izolovanou z kmene Achrorrtobacter sp., a restrikční mapou dle obr. 1 a 2.
Význakem vynálezu je také kmen Escherichia coli BL21 obsahující sekvenci podle předloženého vynálezu, nesenou plazmidy pKXlPl, pKLP3 nebo pKLPó.
Podstatou vynálezu je sekvence nukleotidů o velikosti 2646 bp, kde je pořadí nukleotidů identické s pořadím nukleotidů uvedeným na obr. 5., případně 5'-koncové fragmenty nebo 3'-koncové fragmenty této sekvence, kódující penicilinacylázu, o délce nejméně 150 bází. Uvedená sekvence může být součástí konstruktů nukleové kyseliny, rekombinantních plazmidů a vektorů. Pomocí vhodného vektoru může být uvedená sekvence vnesena do genomu bakteriálního nebo kvasinkového hostitele, kterého lze následně využít pro produkci penicilinacylázy.
Jedním zmožných provedení je kmen Escherichia coli BL21(pKXlPl) (CCM 7394) obsahující rekombinantní plasmid pKXlPl, připravený na bázi sekvence nukleotidů nové izolovaného strukturního genu s aktivitou penicilinacylázy. Uvedený plazmid je charakterizován vložením fragmentu DNA o velikosti 2646 bp (včetně oblasti s SD sekvencí) do plazmidového vektoru pK19 (R. D. Pridmore, Gene 56: 309-312, 1987), a restrikční mapou znázorněnou na obr.1. Příprava tohoto rekombinantního mikroorganismu spočívala v tom, že byla izolována chromosomální DNA z buněk kmene Achromobacter sp. CCM 4824 (původně Comamonas testosteroni CCM 4824; Plháčková a spol., Appl. Microbiol. Biotechnol. 62: 507-516, 2003) a připraven rekombinantní mikroorganismus E. coli TOP10(pKLP3) nesoucí 5,1 kb fragment chromosomální DNA. Nukleotidová sekvence strukturního genu pga byla získána pomocí PCR techniky (polymerázová řetězová reakce) za použití DNA plazmidu pKLP3. Podle stanovené NT sekvence genu byly navrženy DNA primery (tab. 1), které byly použity ke stanovení úplné nukleotidové sekvence genu včetně regulační oblasti s SD sekvencí pomocí téže PCR-sekvenační techniky. Na základě této kompletní nukleotidové sekvence byly navrženy primery umožňující PCR-amplifikaci celého strukturního genu pro penicilinacylázu (PCR; W. Rychlík: Methods in Molecular Biology 15, 31-39, 1993). Jako templát byla použita chromosomální DNA kmene Achromobacter sp. CCM 4824. Vzniklé PCR produkty byly izolovány a ligovány do mnohakopiového plazmidu pK19 (R. D. Pridmore, Gene: 309-312,1987) za vzniku rekombinantních plazmidů, jimiž byl následně transformován hostitelský kmen Escherichia coli TOP 10 (Invitrogen, USA.).
Příprava kompetentních buněk a transformace hostitelských kmenů populací rekombinantních plazmidů byla provedena dle H. Hanahan, J. Mol. Biol. 166: 557-580, 1983. Z narostlých kolonií byly metodou alkalické lyže (HC. Bimboim a J. Doly: Methods in Enzymology 100, 243-254, 1983) izolovány rekombinantní plazmidy a určena velikost inzertovaného fragmentu ajeho orientace.
U vybraných rekombinantních klonů hostitele TOP 10 byla testována aktivita enzymu penicilinacylázy v jednorázových kulturách v LB médiu. Rekombinantní plazmid vyizolovaný z kmene s nejvyšší celkovou aktivitou PGA byl označen jako pKXIPL Z tohoto plazmidového konstruktu je gen pga exprimován konstitutivně. Tímto plazmidem byl následně transformován hostitelský kmen BL21.
Výsledný rekombinantní kmen Escherichia coli nesoucí plazmid pKXlPl a produkující penicilinacylázu byl kultivován v míchaném bioreaktoru. Optimálním postupem je kultivace kmene na minerálním médiu M9 doplněném hydrolyzátem kaseinu a glycerolem jako zdrojem uhlíku a energie. Jednorázová přítokovaná kultivace probíhá při teplotě 20 až 30 °C za regulace pH v rozmezí 5,5 až 7,5 a koncentrace rozpuštěného kyslíku v mediu 10 až 40 %.
Přehled obrázků mt z v ýuuczcň
Obr. 1 znázorňuje restrikční mapu rekombinantního plazmidu pKXlPl.
Na obr. 2 jsou znázorněné plazmidy pKAG&w401, pKLP3 a pKLP6.
Obr. 3 znázorňuje průběh optické density kultury (OD600) a suché hmotnosti buněk (sušina) během přítokované kultivace kmene BL21(pKXlPl)v míchaném bioreaktoru.
Na obr. 4 je znázorněn průběh celkové aktivity (TA) a specifické aktivity (SA) během přítokované kultivace kmene BL21(pKXlPl) v míchaném bioreaktoru.
Na obr, 5 je uvedena nukleotidová sekvence strukturního genu pga a přilehlých oblastí.
Příklady provedení ty a·/·
Příklad 1
Kultivace A. sp. a izolace chromosomální DNA
Půdní izolát Achromobacter sp. CCM 4824 (Škrob a spol., Enzyme Microbiol. Technol. 32:738-744, 2003; Plháčková a spol., Appl. Microbiol. Biotechnol. 62: 507-516, 2003) byl li1 kultivován v 50 ml LB media (v g/1: trypton 10, kvasnicový extrakt 5, NaCl 5; pH 7,2/7,5) při iV °C na rotační třepačce (200 otáček/min) po dobu 12a 16 h. Biomasa z 2 ml kultury byla oddělena od media centrifugaci, promyta fyziologickým roztokem a uschována při -20 °C.
Chromosomální DNA byla izolována z rozmražené biomasy pomocí komerčně dostupných kolonek GENOMIC-TIP 100/G (Qiagen, Švýcarsko) a sady příslušných pufrů GENOMIC BUFFER SET(Qiagen).
Příklad 2
Technologie rekombinantní DNA
Všechny metody štěpení DNA restrikčními enzymy (Fermentas, Litva), analýza molekul DNA v 1,0% agarózovém gelu (USB, U.S.A.) v TBE pufru, ligace T4 DNA ligázou (Fermentas, Litva), byly prováděny podle standardních protokolů (J. Sambrook, 1989). Pro
PCR reakce a sekvenování DNA byly primery (Tab. 1) syntetizovány komerčními firmami MWG-Biotech AG, (Německo) a Metabion (Německo). Pro PCR reakce byl použit Thermocycler PTC-200 (MJ-Research, Inc.U.S.A.), přičemž všechny reakce byly prováděny pomocí Pwo SuperYield DNA Polymerase v přítomnosti GC-RICH Solution (ROCHE, Švýcarsko). Velikost produktů techniky PCR byla zjišťována v 1% agarózovém gelu v TBE pufru, přičemž jako standard molekulových vah byla použita DNA fága λ štěpená restrikční endonukleázou Pstl. Specifické produkty PCR určené k dalšímu subklonování nebo sekvenování byly izolovány z agarózového gelu pomocí QIAEX 11 Gel Extraction Kit
\ 4 (Qiagen, Německo) dle firemního protokolu. Unikátní DNA fragmenty byly purifikovány pomocí High Pure PCR Product Purification Kit (ROCHE, Švýcarsko) dle firemního protokolu. Příprava kompetentních buněk a transformace hostitelských kmenů byla provedena dle J. Hanahan, Mol. Biol. 166: 557-580, 1983, přičemž kompetentní buňky transformované plazmidy nesoucími požadované PCR fragmenty byly kultivovány po dobu 16 h při 37 °C na pevné kultivační půdě Luria-Bertani (LB,v g/l: trypton 10, kvasnicový extrakt 5, NaCl 5, agar 15; pH 7,2-7,5) doplněném antibiotikem kanamycmem (Km, 50pg/ml), popřípadě v 50 ml tekutého LB me^dia doplněného Km na orbitální třepačce Gallenkamp (200 otáček/min). Rekombinantní plazmidy byly pro následné analýzy izolovány pomocí Qiagen Plasmid Midi Kit (Qiagen, Německo) a High Pure Plasmid Isolation Kit (ROCHE, Švýcarsko) podle firemního protokolu. Stanovení všech NT sekvencí DNA byla prováděna v Mikrobiologickém ústavu AVČR automaticky na sekvenátoru 3100 DNA Sequencer (Perkin-Elmer, U.S.A.). Získané sekvence byly vyhodnoceny pomocí programu Lasergene (DNASTAR lne., U.S.A.). Homologie NT sekvencí byla ověřena pomocí programu BLAST (National Center for Biotechnology Information, U.S.A.; S. F. Altschul a spol.: Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, 1997).
Tab. 1 DNA primery a jejich lokalizace vzhledem k pga genu
| Lokalizace | | 2319...2302 1 | o \o Cl Cl Ό | 1495 ... 1475 | 1936...1917 | 2758...2738 1 | m C- un | Ή· O O 1—^ 1/3 00 θ' | Cl | Cl vO m | 1574...1596 | 1 rC rn 1 | -31 ... -4 | 1O O LO CJ Cl rn O Cl |
| Nukleotidové sekvence | I CGG CAC GCC CAG GAA GTT i | I CGC CAT GCC GGT CCT TCA AC | f TGT GCG CGT AGC CAA TGT TGC 1 | GTT GGC GCT CGC TGG TCA TC 1 | [ CAC CGG ACC ACG CTG GTG ATC | | ÍCAT CGC GCC GGA TCG TGA CCT T 1 | | CAG TTC GGC TGG TGG AAT CC | | | CCT GTT GGC GGC CAG TTC GT | | CAT GGC CAA CCG CTT TTC GG 1 | [GCC TGC TGC CGT TCT CTA CCA AT | [ GGC GCG GAC CCA TTC GAT AC | | H O < u O < O Φ υ δ S u H < U u O < o o U a u | GTG TAC TGCAGG CTT GCC AGC CAC CAG G |
| Velikost (NTs) | 00 | O CJ | Cl | o ΓΊ | Cd | Cl Cl | 1 20 I | O Cl | o rt | Cfa Cl | Cl | oo Cl | 00 π |
| Specifický primer | u < > £ | IREVACYL2 | | | REVACYL3 j | | REVACYL4 I | LO L U < > £ | co u < > ω | |UPACYL1 | | |UPACYL2 | | |UPACYL3 | | > u PL, Li | IUPACYL6 | | υ < PL, L | CL, L U > ΰ (2 |
Příklad 3
Stanovení nukleotidové sekvence pga genu a příprava expresního systému
Chromosomální DNA kmene Achromobacter sp. CCM 4824 byla parciálně štěpena enzymem &íw3AL Tyto DNA-fragmenty byly ligovány s SomHI-linearizo vanou plazmidovou DNA vektoru pK.19 (RD. Pridmore: Gene 56, 309-312, 1987). Vzniklými konstrukty byl následně transformován hostitelský kmen E. coli TOP 10. Plazmid pKAG&/«401 (obr.2) izolovaný z rekombinantního kmene E. coli vykazujícího penicilinacylázový fenotyp (PGA+) byl podroben restrikci pomocí PsfL Největší, cca 5,1 kb Pstl-fragment, byl následně subklonován do Pvl-linearizováného vektoru pK19 za vzniku 2 typů konstruktů pKLP3 a pKLP6 (obr.2) s opačně orientovaným Psfl-inzertem. Rekombinantní kmeny E. coli TOPÍ0(pKLP3) i E. coli TOPlO(pKLPó) byly fenotypu PGA+.
Izolované plazmidy pKLP3 a pK.LP6 byly použity jako templát pro získání celkové nukleotidové sekvence pga genu pomocí jak univerzálních M13/pUC sekvenačních primerů, tak následně odvozených pga-striktně specifických primerů (výčet viz tab.l). Nukleotidová sekvence strukturního genu pga čítající 2592 nukleotidů (včetně terminačního tripletu TAA) vykazuje v oblasti vymezené nukleotidy 63 až 2592 92% identitu s pga genem příbuzného mikroorganismu Achromobacter xylosoxidans ssp. xylosoxidans (GenBank AF490005).
Na základě takto získané celkové nukleotidové sekvence pga genu i sjeho přilehlými oblastmi byly navrženy primery umožňující PCR amplifikaci strukturního genu pga s chromosomální DNA kmene Achromobacter sp. CCM 4824 jako templátem. Navržená dvojice primerů UPACYLYbal + REVACYL^Jřl z oblastí přiléhajících ke strukturnímu genu pga s vloženými restrikčními místy Xbal, resp. /Nd (tab. 1) byla použita v PCR reakci obsahující následující kroky: 1) 5 min při 94 °C; 2) 30 cyklů s denaturací při 94 °C po dobu 45 s, vazbou primerů při 60 °C po dobu 45 s a polymerací při 72 °C po dobu 3min; 3) dokončení polymerace při 72 °C po dobu 10 min. Za těchto podmínek byl připraven specifický PCR produkt o velikosti 2663 bp nesoucí celý strukturní gen pga včetně jemu předcházející části regulační oblasti se Shine-Dalgamo sekvencí. Tento /jgn-specifícký PCR produkt byl podroben štěpení restrikení endonukleázou Xbal (cílová sekvence v primerů UPACYLA7>ízI) a následně ligován do vektoru pK19 štěpeného dvěma polylinkerovými enzymy Xbal a 5/hííI. Získaný rekombinantní konstrukt byl označen jako plazmid pKXlPl (obr.l). Analýzou sekvence DNA tohoto plazmidu bylo prokázáno, že při inzerci PCRproduktu nedošlo k žádným inserčně delečním mutacím, avšak byla zaznamenána záměnová mutace C -» T u 99. nukleotidu strukturního genu pga oproti dříve postulované nukleotidové sekvenci. Tato mutace je však tichá, neboť nemění typ aminokyseliny kódované tripletem. Izolovanými rekombinantními plazmidy pKLP6 a pKXlPl byl transformován prototrofní hostitelský kmen E. coli BL21 (Invitrogen, USA) a připraven prokaryotní expresní systém BL21(pKXlPl) pro PGA.
Příklad 4
Exprese pga v Escherichia coli
Příprava inokula pro kultivace kmenů Escherichia coli BL21 (pKXlPl)
Z glycerolové konzervy (narostlá kultura smíchaná s glycerolem podle J. Sambrook,1989) uchovávané v -70 °C bylo zaočkováno 50 ml media LB doplněného kanamycinem (Km, 50pg/ml), Inokulum bylo kultivováno 16 h při 28 °C v orbitálním inkubátoru Gallenkamp (200 otáček/min).
Kultivace v bioreaktoru
Kmen BL21 (pKXlPl) byl kultivován za přesně definovaných podmínek v mediu M9 (tab. 2) doplněném glycerolem (5-25 g/l) a kasein hydrolyzátem (5-25 g/l) jako zdroji uhlíku a energie v míchaném bioreaktoru Biostat MD (B. Braun Biotech Inti., Melsungen, Německo): v/ pracovní objem 8,2 1, vzdušnění 8 y- 91 vzduchu/min, počáteční frekvence míchání 200 až 300 otáček/min při teplotě v rozmezí 20 až 28 °C. pH média bylo udržováno v rozmezí 7,5 až 5,5 a koncentrace rozpuštěného kyslíku (pC>2) byla automaticky udržována změnou frekvence míchání od 200 do 840 otáček/min v rozmezí 5 až 30 % hodnoty maximálního nasycení média kyslíkem. Kultivace probíhala po dobu 20 až 25 hodin jako přítokovaná kultivace (obr. 3 a 4). V závěru kultivací byly stanoveny následující parametry: koncentrace biomasy (suchá hmotnost buněk, cdw), celková aktivita (TA) a specifická aktivita (SA) penicilinacylázy. Stanovené parametry:
koncentrace biomasy 28 g cdw/1 kultivačního media celková aktivita 18 000 U/l kultivačního média specifická aktivita 670 U/g cdw.
Enzymové stanovení
Pro stanovení aktivity enzymu PGA byly z produkční kultivace odebírány vzorky kultury o objemu 1 až 2 ml. Biomasa byla oddělena centrifugaci a po promytí 1 až 2 ml destilované vody a opětovné centrifugaci byla uchovávána v -2(^°C. Rozmražená biomasa byla resuspendována v 0,005 M fosfátovém pufru (pH 8,0).
Aktivita PGA byla stanovena titračně při 37 °C s penicilinem G jako substrátem.
Tab, 2 Komponenty kultivačního meZdia M9
| Substance | vzorec | koncentrace (g/L) |
| Síran amonný | (NH4)2SO4 | 4,0 |
| Dihydrofosforečnan draselný | kh2po4 | 13,6 |
| Chlorid sodný | NaCl | 10,0 |
| Hydroxid sodný | NaOH | 3,0 |
| Síran hořečnatý | MgSO4.7 H2O | 2,0 |
| Chlorid vápenatý | CaCI2.6 H2O | 0,05 |
| Síran železnatý | FeSO4.7 H2O | 0,01 |
Průmyslová využitelnost
Rekombinantní kmeny mikroorganismů obsahující sekvenci nukleotidů podle vynálezu lze využít k produkci penicilinacylázy pro různé aplikace v chemickém a farmaceutickém průmyslu.
Claims (11)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Sekvence nukleotidů o velikosti 2646 bp, kódující penicilinacylázu, kde je pořadí rnukleotidů nejméně z 95% identické s pořadím nukleotidů uvedeným na obr. 5.
- 2. 5'-koncové fragmenty sekvence nukleotidů podle nároku 1 o délce nejméně 150 nukleotidů a začínající kterýmkoli nukleotidem s pořadovým číslem 1 až 14,
- 3. . 3'-koncové fragmenty sekvence nukleotidů podle nároku 1 o délce nejméně 150 nukleotidů a začínající kterýmkoli nukleotidem s pořadovým číslem 2606 až 2646.
- 4. Konstrukt nukleové kyseliny obsahující sekvenci nukleotidů podle nároku 1 nebo fragment sekvence nukleotidů podle nároků 2 nebo 3, opatřený nejméně jednou regulační sekvencí řídící expresi genu a produkci polypeptidu s aktivitou penicilinacylázy.
- 5. Rekombinovaný plazmid obsahující sekvenci nukleotidů podle nároku 1 nebo fragment sekvence podle nároků 2 nebo 3.
- 6. Rekombinantní expresní vektor složený z konstruktu nukleové kyseliny podle nároku 4, promotoru, translačního start signálu a translačního a transkripčního stop signálu.
- 7. Hostitelská buňka obsahující konstrukt nukleové kyseliny podle nároku 4.
- 8. Hostitelská buňka podle nároku 7, v níž je konstrukt nukleové kyseliny nesen na rekombinantním expresním vektoru podle nároku 6.
- 9. Hostitelská buňka podle nároku 7, v níž je konstrukt nukleové kyseliny integrován do genomu buňky.
- 10. Rekombinované plazmidy pKXlPl, pKLP3 a pKLP6, charakterizované vloženou sekvencí nukleotidů podle nároku 1, izolovanou z kmene Achromobacter sp., a restrikční mapou dle obr. 1 a 2.ΐΌ» /i
- 11. Kmen Escherichia coli BL21 obsahující sekvenci podle nároku 1 nesenou plazmidy pKXlPl, pKLP3 nebo pKLPó podle nároku 10.
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ20070082A CZ300467B6 (cs) | 2007-01-31 | 2007-01-31 | Sekvence nukleotidu o velikosti 2646 bp, kódující penicilinacylázu, nové konstrukty rekombinantní nukleové kyseliny a rekombinantní mikroorganismy nesoucí tuto sekvenci |
| PCT/IN2007/000193 WO2008093351A1 (en) | 2007-01-31 | 2007-05-15 | Dna sequence encoding penicillin acylase, novel recombinant dna constructs and recombinant microorganisms carrying this sequence |
| KR1020097016144A KR20090114380A (ko) | 2007-01-31 | 2007-05-15 | 페니실린 아실라아제를 코딩하는 ｄｎａ 서열, 신규의 재조합 ｄｎａ 구조체 및 상기 서열을 갖는 재조합 미생물 |
| US12/524,713 US8039604B2 (en) | 2007-01-31 | 2007-05-15 | DNA sequence encoding penicillin acylase, novel recombinant recombinant DNA constructs and recombinant microorganisms |
| CNA2007800329360A CN101563459A (zh) | 2007-01-31 | 2007-05-15 | 编码青霉素酰化酶的dna序列，携带该序列的新型重组dna结构及重组微生物 |
| EP07827496A EP2109672A1 (en) | 2007-01-31 | 2007-05-15 | Dna sequence encoding penicillin acylase, novel recombinant dna constructs and recombinant microorganisms carrying this sequence |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ20070082A CZ300467B6 (cs) | 2007-01-31 | 2007-01-31 | Sekvence nukleotidu o velikosti 2646 bp, kódující penicilinacylázu, nové konstrukty rekombinantní nukleové kyseliny a rekombinantní mikroorganismy nesoucí tuto sekvenci |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ200782A3 true CZ200782A3 (cs) | 2009-05-27 |
| CZ300467B6 CZ300467B6 (cs) | 2009-05-27 |
Family
ID=39171372
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20070082A CZ300467B6 (cs) | 2007-01-31 | 2007-01-31 | Sekvence nukleotidu o velikosti 2646 bp, kódující penicilinacylázu, nové konstrukty rekombinantní nukleové kyseliny a rekombinantní mikroorganismy nesoucí tuto sekvenci |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US8039604B2 (cs) |
| EP (1) | EP2109672A1 (cs) |
| KR (1) | KR20090114380A (cs) |
| CN (1) | CN101563459A (cs) |
| CZ (1) | CZ300467B6 (cs) |
| WO (1) | WO2008093351A1 (cs) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009016642A1 (en) | 2007-07-27 | 2009-02-05 | Fermenta Biotech Limited | Process for the preparation of immobilized recombinant penicillin acylase catalyst from achromobacter sp. ccm 4824 expressed in e. coli bl 21 ccm 7394 and its use for the synthesis of beta-lactam antibiotics |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103184182B (zh) * | 2013-04-11 | 2015-02-11 | 南京工业大学 | 青霉素酰化酶、其高产菌株及应用 |
| CN103805671B (zh) * | 2013-11-11 | 2015-08-26 | 华北制药河北华民药业有限责任公司 | 一种制备头孢氨苄的方法 |
| CN104789510A (zh) * | 2015-05-06 | 2015-07-22 | 南京工业大学 | 一种青霉素酰化酶、编码基因、产生菌株及其应用 |
| CN110106161B (zh) * | 2019-05-09 | 2022-03-22 | 福建医科大学附属口腔医院 | 青霉素酰化酶基因及其编码蛋白 |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| BE790075A (fr) * | 1971-10-14 | 1973-04-13 | Bayer Ag | Procede de preparation de penicillinacylase cristalline pure etproduit obtenu |
| ATE124724T1 (de) * | 1990-04-18 | 1995-07-15 | Gist Brocades Nv | Penicillin-g-acylase, dafür kodierendes gen und verfahren zur herstellung von diesem enzym. |
| JPH069649A (ja) | 1992-04-24 | 1994-01-18 | Eli Lilly & Co | セファロスポリンの改良製法 |
| ES2141796T3 (es) | 1993-08-05 | 2000-04-01 | Dsm Nv | Nuevo uso de acilasa de penicilina g de alcaligenes faecalis. |
| ZA954839B (en) | 1994-06-10 | 1996-05-14 | Gist Brocades Bv | An acylation method |
| US5891703A (en) * | 1994-08-12 | 1999-04-06 | Gist-Hrocades | Mutated penicillin G acylase genes |
| WO1997004086A1 (en) | 1995-07-18 | 1997-02-06 | Gist-Brocades B.V. | An improved immobilized penicillin g acylase |
| TW555855B (en) | 1996-07-26 | 2003-10-01 | Bristol Myers Squibb Co | Synthesis of beta-lactam antibacterials using soluble side chain esters and enzyme acylase |
| US5850019A (en) | 1996-08-06 | 1998-12-15 | University Of Kentucky Research Foundation | Promoter (FLt) for the full-length transcript of peanut chlorotic streak caulimovirus (PCLSV) and expression of chimeric genes in plants |
| CZ291154B6 (cs) * | 2001-08-03 | 2002-12-11 | Mikrobiologický Ústav Av Čr | Kmen mikroorganismu Comamonas testosteroni CCM 4824 |
-
2007
- 2007-01-31 CZ CZ20070082A patent/CZ300467B6/cs not_active IP Right Cessation
- 2007-05-15 CN CNA2007800329360A patent/CN101563459A/zh active Pending
- 2007-05-15 KR KR1020097016144A patent/KR20090114380A/ko not_active Application Discontinuation
- 2007-05-15 EP EP07827496A patent/EP2109672A1/en not_active Withdrawn
- 2007-05-15 US US12/524,713 patent/US8039604B2/en active Active
- 2007-05-15 WO PCT/IN2007/000193 patent/WO2008093351A1/en active Application Filing
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009016642A1 (en) | 2007-07-27 | 2009-02-05 | Fermenta Biotech Limited | Process for the preparation of immobilized recombinant penicillin acylase catalyst from achromobacter sp. ccm 4824 expressed in e. coli bl 21 ccm 7394 and its use for the synthesis of beta-lactam antibiotics |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20090114380A (ko) | 2009-11-03 |
| US20100112673A1 (en) | 2010-05-06 |
| US8039604B2 (en) | 2011-10-18 |
| WO2008093351A1 (en) | 2008-08-07 |
| CZ300467B6 (cs) | 2009-05-27 |
| CN101563459A (zh) | 2009-10-21 |
| EP2109672A1 (en) | 2009-10-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US7294493B2 (en) | Nucleic acid fragments encoding nitrile hydratase and amidase enzymes from Comamonas testosteroni 5-MGAM-4D and recombinant organisms expressing those enzymes useful for the production of amides and acids | |
| EP1043398A1 (en) | Expression vector pUC NT, DNA coding for decarbamylase improved in thermostability and use thereof | |
| EP1456370A2 (en) | Process for the preparation of a beta-lactam antibiotic with mutated penicillin acylase | |
| WO1999038982A1 (en) | Nucleic acid molecule encoding a cephalosporin acetylesterase | |
| US8039604B2 (en) | DNA sequence encoding penicillin acylase, novel recombinant recombinant DNA constructs and recombinant microorganisms | |
| JPH0584078A (ja) | セフアロスポリンｃアシラーゼ | |
| JP3408737B2 (ja) | ニトリルヒドラターゼの活性化に関与するタンパク質及びそれをコードする遺伝子 | |
| EP1799817B1 (en) | Mutant expandases | |
| Becka et al. | Penicillin G acylase from Achromobacter sp. CCM 4824 | |
| AU4046699A (en) | Industrial method for producing heterologous proteins in E.coli and strains useful for said method | |
| US7070963B2 (en) | Amidase from variovorax | |
| KR100806991B1 (ko) | 신규 니트릴 히드라타아제 | |
| Kang et al. | Expression of penicillin G acylase gene from Bacillus megaterium ATCC 14945 in Escherichia coli and Bacillus subtilis | |
| KR100211002B1 (ko) | 다량의 글루타릴아실라제를 제조하는 방법 | |
| EP0786006B1 (en) | Cephalosporin c amidohydrolase, production and use | |
| Ryabchenko et al. | Cloning the amidase gene from Rhodococcus rhodochrous M8 and its expression in Escherichia coli | |
| JP6156442B2 (ja) | ニトリルヒドラターゼ遺伝子を置換した微生物 | |
| CA2198160A1 (en) | Enzyme with leudh activity, nucleotide sequence coding therefor and process for the preparation of the enzyme | |
| EP4083197A1 (en) | Corynebacterium glutamicum mutant strain having enhanced l-lysine productivity and method of producing l-lysine using the same | |
| US6403357B1 (en) | Thermostable D-hydantoinase and the application thereof | |
| EP1902140A2 (en) | Mutant expandases and their use in the production of beta-lactam compounds | |
| EP1694835A2 (en) | Glutaryl amidases and their uses | |
| CZ2015586A3 (cs) | Sekvence nukleotidů kódující hydrolasy esterů α-aminokyselin a rekombinantní mikroorganismy nesoucí tyto sekvence | |
| US20080102496A1 (en) | Expression of Nitrile Hydratases in a Two-Vector Expression System | |
| KR20220149376A (ko) | L-라이신 생산능이 향상된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주 및 이를 이용한 l-라이신의 생산 방법 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20240131 |