KR100211002B1

KR100211002B1 - 다량의 글루타릴아실라제를 제조하는 방법

Info

Publication number: KR100211002B1
Application number: KR1019920004319A
Authority: KR
Inventors: 콜러 클라우스-페터; 요하네스 리스 귄터; 아레츠 베르너
Original assignee: 엥겔하르트 라피체; 훽스트 악티엔게젤샤프트
Priority date: 1991-03-18
Filing date: 1992-03-17
Publication date: 1999-07-15
Also published as: ATE145238T1; CY2115B1; CA2063176A1; CZ284405B6; ES2096671T3; EP0504798A1; CN1065292A; KR920018222A; JP3366664B2; DE59207509D1; CA2063176C; EP0504798B1; IL101258A0; JPH05207879A; DE4136389A1; HK1006853A1; DE4136389C2; CS80492A3; GR3021610T3; DK0504798T3

Abstract

플라스미드 pCM 145(DSM 6409)에 함유된 글루타릴아실라제(GA)의 암호화 유전자는 이. 콜라이 내에서 GA를 고수율로 발현한다. 이에, 본 발명은 글루타릴아실라제를 다량으로 제조하는 방법을 제공한다.

Description

다량의 글루타릴아실라제를 제조하는 방법

제1도는 플라스미드 pCM 145의 제한지도이다.

제2도는 플라스미드 T 307의 제한지도이다.

제3도는 플라스미드 T 347의 제한지도이다.

제4도는 플라스미드 T 363의 제한지도이다.

세팔로스포린 C로부터 7-아미노세팔로스포란산의 효소적 제조에 있어서, 초기에 7β-(4-카복시부탄아미도)세팔로스포란산(글루타릴아미도세팔로스포란산)이 형성되는데 이는 효소 글루타릴아실라제(또는 글루타릴아미다제)(이하 GA라 한다)에 의해 7-아미노세팔로스포란산으로 탈아실화한다.

이. 콜라이를 이용한 GA의 유전공학적 제조는 이미 문헌[R.Matsuda and K.-I.Komatsu, J.Bact. 163(1985) 1222-1228]에 기술되어 있다. 그러나, GA의 특이활성을 단지 다소(사용된 균주 0.12 내지 0.2 단위/mg) 증가시킬 수 있을 뿐이었다.

상기 R. Matsuda의 문헌에서는 연구대상물로서 돌연변이 슈도모나스(Pseudomonas) 종 GK 16(기탁번호 미지정)을 사용하였다. 이의 출발 균주는 퍼멘테이션 리써치 인스티튜트(FRI)로부터 기탁번호 FERM 2410하에 입수가능한 슈도모나스 종 SY-77-1이다.

본 발명에 이르러, GA-암호화 유전자는 슈도모나스 균주로부터 분리될 수 있으며 이. 콜라이 내에서 이 유전자의 도움으로 5배 이상 높은 특이활성을 갖는 효소를 수득할 수 있다는 것이 밝혀졌다. 이 슈도모나스 균주로부터 분리된 이 효소는 상기 기탁된 균주로부터의 GA와 비교될 수 있다.

본 발명의 바람직한 양태 및 추가의 국면은 이하에서 설명되고 특허청구의 범위에서 정의된다.

상기 유전자를 pUC 18과 같은 고 복제수 벡터내로 클로닝시키면 정상적인 유도조건하에서 형질전환된 세포가 사멸된다. 이러한 이유로 저 복제수 벡터가 하기의 연구를 위해 작제되고 균주의 게놈의 유전자 뱅크를 설정하는데 사용되어 왔다. 이러한 벡터 plac 10, plac 100 및 plac 200은 공지 플라스미드 pACYC 184[참조 문헌 : A.C.YChang and S.N. Cohen, J.Bact. 134(1978) 1141-1156]의 복제원을 함유하므로 세포당 약 5개 복제물로 존재한다. 이들 벡터는 클로람페니콜로 선별되므로 세팔로스포린에 대해 작용할 수 있는 β-락타마제의 형성을 방지하게 한다.

GA 유전자의 동정의 경우, 처음에는 PstI 으로 분해된 완전한 게놈을 함유한 유전자뱅크가 설정되었다. 상기 Matsuda의 문헌에 따른 코돈 30 내지 40 및 41 내지 51에 상응하는 두 개의 탐침이 3.7Kb PstI 삽입체가 함유된 클론을 선별하는데 사용되었다. 후자는 파아지 M13mp 19 내로 재클로닝시킨 후 부분적으로 서열분석되었다. 이것은 아미노산 51 내지 209의 영역에서 공지된 서열과 98이상의 일차를 보여 주었다. 그런 다음 3.7Kb PstI 단편을 방사성표지 하고 탐침으로서 사용하여, 상기 균주의 부분적으로 PstI-절단된 DNA를 저 복제수 벡터 plac 100내로 클로닝시켜 작제된 플라스미드 유전자뱅크를 스크리닝하였다. 제한분석과 절단부위와 공지된 데이터와의 비교는 클론 pCM 145가 GA에 대한 완전한 유전자와 5'- 및 3'-플랭킹 서열을 함유한다는 것을 보여준다. 이 클론은 약 10Kb PstI 삽입체를 갖는 벡터 plac 100을 함유한다. 이것은 약 4U/ℓ GA를 생성한다. 이 클론은 부다페스트 협약하에 DSM에 기탁번호 DSM 6409로서 기탁되어 있다(1991. 3. 8).

제1도는 플라스미드 pCM 145의 제한지도이다. 클로닝에 중요한 제한 절단부위는 삽입체에 번호로 지정되어 있다.

또한, 재클로닝 및 아클로닝시켜 GA 수율을 약 450U/ℓ로 높일 수 있었다.

놀랍게도, 발효온도를 37℃ 내지 23℃, 바람직하게는 25 내지 30℃, 특히 27 내지 28℃로 감소시킬 때, 수율이 현저히 증가된다는 것이 밝혀졌다. 이 온도에서 발효는 장기간 가능한 반면에 37℃에서 IPTG에 의한 이. 콜라이 시스템의 유도는 숙주균주에 치명적이다.

유도는 대수기, 특히 대수기 말기에서 수행하는 것이 바람직하다. 바람직하게 사용되는 숙주균주는 에스터라제가 없거나 적은 이. 콜라이 K 12 균주인데 이는 이 경우에 작업이 상당히 편리하기 때문이다.

숙주 균주는 생산성에 영향을 미칠 수 있다. 적합한 균주로 입증된 것은 예를들면, 이. 콜라이 MC 1061(ATCC 53338), 이. 콜라이 W 3110(ATCC 27325) 또는 이. 콜라이 DH1(ATCC 33849)이다.

발효를 위해 공지된 무기배지 및 효모추출물, 펩톤, 트립톤 또는 카사미노산을 갖는 복합배지를 사용할 수 있다. 가장 유리한 조건은 당업자라면 간단한 예비 시험으로도 쉽게 설정할 수 있다.

재클로닝에 의해 수득된 하기(실시예 4)의 발현벡터 T 307은 이. 콜라이 균주 TG1(Braunschweig 소재 Amersham-Buchler로부터 입수가능함)을 사용했을 때 유도조건하에서 약 1000U/배양배지 ℓ당 약 1000U의 수율을 제공한다. 플라스미드 T 307은-락타마제 유전자를 갖는데 이의 유전자 생성물, 효소-락타마제는 재조합클론을 선별하기 위해 사용된다.-락타마제는, GA와 유사하게도 외질(periplasm)에 위치한 분비효소이다. 놀랍게도,-락타마제 구조유전자의 일부를 클로람페니콜-내성 유전자로 대체시켰을 때 수율이 현저히 개선되는 결과(비교 : 실시예 9, 플라스미드 T 347)를 알 수 있었다. 클로람페니콜에 대한 내성은,-락타마제와 대조적으로 세포내에 위치한 효소 아세틸트랜스퍼라제(CAT)에 의해 중재된다.

-락타마제 구조유전자의 일부를 결실시키고 뿐만 아니라 완전한 구조 유전자 영역, 특히-락타마제의 분비를 유도하는 시그날 펩타이드의 암호화 영역을 결실시키고 마찬가지로 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 유전자를 선별마커로서 사용할 때 수율의 현저한 개선을 이룰 수 있었다(비교 : 실시예 10, 플라스미드 T 363).

따라서, 본 발명은 선별유전자로서 외질에 내재한 분비유전자 생성물 또는 효소에 대한 유전자를 함유하지 않은 발현벡터의 사용에 관한 것이다. 고 복제 벡터, 바람직하게는-락타마제 유전자가 없는 선별벡터를 사용하는 것도 가능하다. 최적의 수율은 이. 콜라이 K 12 균주 W 3110 M 및 MC 1061를 사용할 때 달성됨이 밝혀졌다. 이러한 경우, 이들 플라스미드는 발효동안에 제거되지 않으며 안정한다.

그러나, 세포내에서 활성적인 선별마커 대신에 외질 또는 막에 내재한 마커를 플라스미드의 불안정성을 유도하지 않을 정도로 글루타릴아미다제에 대한 생성단계 동안 에 마커의 발현을 줄일 수 있다면, 사용하는 것도 가능하다. 적합한 예로는 상당히 엄격히 조절되는 Tu 1721의 테트라사이클린-내성유전자(참조 문헌 : Klock, G. et al., J. Bacteriol. 161, 332-1988) 또는 외질 또는 막에 내재한 마커를 암호화하는 비교적 엄격히 조절되는 유전자를 들 수 있다.

고 수율을 달성하기에 필요한 발현 벡터의 작제는 이하에서 상세히 설명된다. 사용된 효소는 New England Biolabs(Schwalbach) 또는 Gibco/BRL(Eggenstein)으로부터 구입하여 제조업체의 지시에 따라 사용한다. 상세히 기술되지 않은 유전 공학적 조작은 문헌[Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley interscience, 1987]의 상세한 지시에 따라 수행한다.

플라스미드의 크기(bp)에 관한 모든 사항은 근사치로 기술되고 있다.

본 발명의 세부사항은 하기 실시예에서 설명된다. 달리 언급되지 않는한, 퍼센트 데이터는 중량으로 나타낸 것이다.

[실시예 1]

[플라스미드 plac 10의 제조]

시판품 플라스미드 pBR 325(SIGMA)로부터 1.1Kb EcoRI-Hind III 단편을 분리하고 벡터 pACYC 184의 1.5Kb EcoRI-Hind III 단편에 연결시킨다. 이러한 방법으로 수득된 미니-pACYC를 HaeII로 부분 분해시키고, 폴리링커와 lacZ의 α-상보체를 함유하는 시판품 벡터 pUC 12의 819bp HaeII 단편에 연결시킨다. 폴리링커가 서열내에 절단부위 EcoRI-Hind III, 그 뒤에 복제원을 갖는 배열상태의 pACYC 184 단편의 HaeII 부위내에 삽입체를 합유한 벡터를 plac 10으로 명명하였다.

[실시예 2]

[벡터 plac 100 및 plac 200의 제조]

실시예 1에 기술된 미니-pACYC는 Hind III 절단부위에 ClaIdp 대한 두 개의 인접절단 부위를 함유한다.

plac 10으로부터 ClaI 단편을 결실시키면, 미니-pACYC를 수득하기 위한 연결에 사용되는 HindIII 절단부위를 더 이상 함유하지 않는 벡터 plac 100이 얻어진다.

실시예 1과 유사하게 HaeII로 plac 100을 부분분해시키고 pUC 12의 폴리링커를 갖는 HaeII 단편을 pUC 18의 상응하는 단편으로 대체시켜 벡터 plac 200을 얻는다.

[실시예 3]

[유전자 뱅크의 설정]

슈도모나스 균주의 완전한 DNA를 PstI으로 완전히 분해시키고 PstI으로 절단된 plac 10에 연결시킨다. 연결 혼합물로 이. 콜라이 TG1(pharmacia)를 형질전환시킨다.

초기에, 공지된 GA 서열의 코돈 30 내지 40 및 41 내지 51에 상응하는 두 개의 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 스크리닝한다. 3.7Kb PstI 삽입체를 함유하는 클론 pWK 96을 상기 방법으로 분리한다. 이것을 두탐침과 하이브리드화 한다. 파아지 M 13mp 19내로의 재클로닝 및 부분서열분석은, 아미노산 150 내지 209의 영역에서 공지된 DNA 서열과 98이상의 일치를 보여준다. 공지된 유전자 지도와 비교했을 때 관련된 절단부위에서 일치함을 알 수 있다.

삽입체를 방사성표지하고 PstI으로 부분분해된 완전한 DNA로부터 설정된 유전자뱅크에 대한 탐침으로서 사용하면, 약 10Kb 삽입체를 함유한 클론 pCM 145[DSM(Deutsche Sammlung Von Mikroorganismen Und Zellkulturen GmbH)에 1991년 3월 8일자로 DSM 6409로 기탁됨]가 발견된다. 제한분석 및 공지된 절단부위와의 비교는 완전한 유전자 및 5'- 과 3'-플랭킹서열이 클로닝되었음을 보여준다. 이 클론은 4U/ℓ GA의 수율을 제공한다. 이것을 하기의 조작을 위한 출발물질로서 사용한다.

[실시예 4]

[재클로닝]

플라스미드 plac 100을 EcoRI 및 Hind III으로 절단하고 GA 유전자를 갖는 삽입체를 동일한 효소에 의해 개방된 시판품 벡터 pUC 19 내로 재클로닝시킨다. 이러한 방식으로 수득된 클론 T 286은 23.5U/GA 의 수율을 제공한다. 이 경우에 효소 일부가 분비된다(출발균주에서 상기 효소는 단지 외질에서만 발견된다).

이. 콜라이 내에서 유전자의 발현을 방해할 가능성이 있는 서열을 결실시키기 위해, GA 유전자의 공지된 지도를 기본으로 하여 유전자를 재작제한다. 이와 관련하여 제1도에 기재된 제한 절단부위의 지정번호를 참조한다.

일차로, SalI 절단부위를 함유하는 0.8Kb의 BamHI 단편(BamHI(1)-BamHI(4))을 시판품 플라스미드 pUC 18내로 클로닝시킨다. 생성된 플라스미드를 SalI으로 절단하고 마찬가지로 0.8Kb의 SalI 단편(SalI(3)-SalI(6))을 삽입시킨다. 신규 플라스미드를 PstI으로 절단하고 0.9Kb의 PstI 단편(PstI(5)-PstI(8))을 클로닝시켜 클론 pT 93을 생성한다. 또한, 1.7Kb SalI 단편(SalI(6)-SalI(9))을 pUC 18내로 클로닝시키고 정확한 배향에 대해 검사한다; 생성물은 플라스미드 pT 98이다. 클로닝된 PstI 단편(PstI(5)-PstI(8))이 XhoI 절단부위를 함유하기 때문에, pT 93의 EcoRI-XhoI 단편을 pT 98의 XhoI-EcoRI 단편(이것은 복제원 및 내성유전자도 함유한다)과 연결시켜 완전한 유전자를 함께 클로닝시킬 수 있다. 이에따라 플라스미드 pT 103을 수득한다. 이 플라스미드로 형질전환된 이 콜라이 배양물은 130U 이하/ℓ GA을 생성한다. 발현은 슈도모나스 DNA의 5'-프로모터 활성에 의해 조절된다.

플라스미드 pT 103을 제한효소 SstI과 Hind III 으로 분해시킨 후 GA 유전자를 갖는 단편을 분리하고 이것을 동일효소로 절단된 벡터 plac 200 내로 클로닝시켜 발현벡터 pT 104를 수득한다. 이것으로 1000U/ℓ 이상의 GA 수율을 달성한다.

재작제된 유전자를 시판 발현벡터 pBtac(Boehringer-Mannheim에 의해 제조)의 EcoRI-HindIII 절단부위내로 재클로닝시켜 플라스미드 pT 105를 수득한다. 이것으로 형질전환된 이.콜라이 TG 1 균주는 진탕플라스크에서 37℃의 발효온도하에 3일간 발효시켰을 때 288U 이하/ℓ GA를 생성한다.

GA 유전자를 벡터 pTrc 99A[E. Amann et al., Gene 69(1998) 301-315]내에 클로닝시키기 위해 합성링커(서열동정번호 1)가 필요하다:

플라스미드 pCM 145를 효소 StyI 및 BamHI로 분해시킨 후 0.57Kb의 BamHI(4)-StyI(2) 단편을 분리한다(공지된 DNA 서열에서 StyI 절단부위는 아미노산 11 내지 13의 영역에 위치한다). 이 단편과 상기 언급된 링커를 NcoI 과 BamHI에 의해 절단된 플라스미드 pTrc 99A 내로 연결시켜 NcoI 절단부위가 결실된 플라스미드 T 297를 수득한다.

또한, 플라스미드 pCM 145로부터 1.5Kb SalI 단편(SalI(6)-SalI(9)) 및 0.34Kb BamHI-SalI 단편을 분리하고 SalI과 BamHI으로 개열된 pUC 18 벡터내에 연결시킨다. 이로써 플라스미드 T 306을 수득하고 SalI(6-9)단편의 배향이 정확한지를 조사한다. 상기 플라스미드 T 306을 BamHI 및 HindIII 로 처리하여 2.1Kb 단편(BamHI(4) 내지 SalI(9) 부위의 단편을 함유)을 분리한다. 이 단편을 BamHI 및 HindIII 효소로 개열된 T 297 벡터내에 연결시켜 플라스미드 T 307(제2도)을 얻는다. 이 플라스미드로 형질전환된 이. 콜라이 균은 28℃에서 2일 동안 발효 후 260U 이하/ℓ GA를 생성한다. 변형된 발효조건(하기 실시예 참조)하에서 상기 수율을 780U/ℓ 이상으로 증가시킬 수 있다.

37℃에서 IPTG를 사용하는 시스템의 배양은 고 복제수 벡터 T 307의 사용에 기여할 수 있는 형질전환된 이. 콜라이 균주에 치명적이다. 따라서, 30℃ 미만의 온도에서 수행한다.

[실시예 5]

[이. 콜라이 클론으로 GA 발효]

이. 콜라이 클론 DH1 T105 및 TG1 T307을 무기 및 복합배지상에서 배양할 수 있으며 대수기에서 조차도 GA를 생성한다. 최대의 GA 역가는 정지단계에서 달성된다. 이것은 GA 생성이 성장농도에 의존적임을 보여준다. 양클론에서 50내지 60의 효소는 세포질에, 40 내지 50는 외질에, 최대 10는 배양 여과물중에 존재한다.

GA의 완전한 방출을 위해 초음파, 프렌치 프레스 또는 다이노밀링기로 세포를 마쇄시킨다. 외질 GA는 세틸트리메틸암모늄 클로라이드 또는 톨루엔과 같은 세정제로 용해시킬 수 있다. EDTA 및 리소자임을 가하여 효율을 높일 수 있다. 발효 파라미터의 최적화에 관한 예비연구는 클론이 25℃ 내지 37℃의 온도범위에서 성장하고 생성할 수 있음을 보여준다. 그러나, 30℃ 이상의 온도에서 산소의 부분압은 5미만으로 유지시켜야 한다. 28℃의 성자온도는 GA 생성에 필요한 2시간 이상의 이배시간 증가를 낳는다; 이들 조건하에서 GA 생성은 더 이상 저 산소 부분압에 의존하지 않는다. 용량-기준 GA 생산성(U/배양물용액 ℓ) 및 생체량 농도(g/ℓ) 사이에 뚜렷한 상관관계가 있음이 밝혀졌다.

[실시예 6]

[무기배지에서의 GA 생성]

클론 TGI T 307을 -18℃이하에 YT-글리세롤 배지중에 유지시킨다:

이 현탁액을 동일한 배지가 함유된 아가 평판상에 플레이팅하고 28 내지 37℃에서 24시간 배양한 다음 예비배양물을 단일 콜로니로 접종한다.

300ml 엘렌메이어 플라스크중의 상기 영양액 100ml을 접종 후 28℃, 220rpm에서 24시간동안 배양한다. 배양물은 3.0의 0D_578nm값을 갖는다.

하기 주배양물(영양액 25ml/300ml 플라스크)을 2의 예비배양물로 접종하고 28℃, 220rpm에서 24 내지 72시간 동안 배양한다:

[실시예 7]

[복합배지에서의 GA 생성]

균주유지 및 예비배양은 실시예 6과 유사하게 수행하며 5ℓ 발효기를 하기의 복합배지(31)로 접종한다:

발효 파라미터 : 28℃, 400ppm; 0.5vvm

발효 시간 : 24 내지 72시간

72시간 후 생체량 : 7g 습윤중량/ℓ

72시간 후 GA : 460U/ℓ (배양액); 66U/g (습윤중량)

[보충된 복합배지중에서의 GA 생성]

클론 TG1 T 307을 하기배지중에서 실시예 7과 유사하게 배양한다:

발효 파라미터 : 28℃, 500ppm; 0.8vvm

53시간 후 생체량 : 15g 습윤중량/ℓ

63시간 후 GA : 780U/ℓ (배양액); 52U/g (습윤중량)

본 실시예는 생체량의 증가와 용량-기준 생산성의 증가 사이의 관계를 보여준다.

실시예 7과 유사하게 균주 DH1 T 104를 배양하여 70시간 후 생체량 11g (습윤중량)/ℓ 및 용량-기준 활성 1040U/ℓ (배양액)(97U/g 습윤중량)을 낳는다. 이것은 약 1U/단백질 1mg의 특이활성에 해당한다.

[실시예 8]

[GA 생성의 유도]

성장의 대수기 말기에서 클론 TG1 T 307을 IPTG(최종 농도 1 내지 5mM)로의 유도는 수율을 5 내지 10시간이내에 60까지 높인다.

[실시예 9]

[플라스미드 T 347]

균주 TG1(T 307)로부터 분리된 플라스미드 DNA를 효소 DraI으로 완전히 분해시키고 Trc 프로모터의 통제하의 복제원과 GA 유전자를 함유하는 큰 단편을 단편의 분리에 사용된 0.6아가로즈겔로부터 전기용출시켜 분리한다.

벡터 pACYC 184(Chang and Cohen, J. Bacteriol. 134, 1141-1156, 1978)을 제한효소(HaeII)로 분해시켜 CAT 유전자 및 이의 조절영역을 함유하는 약 1.3Kb의 DNA 단편을 분리한다. 유사하게는, 아가로즈겔에서 분리시킨 후 전기용출시켜 이 단편을 수득한다. 효소 HaeII를 사용하여 3'말단이 돌출된 단편을 생성한다. 이 말단을 평활말단을 함유하는 상기의 DraI 벡터단편에 연결시키기에 적합치않다. HaeII 단편의 돌출말단을 엑소뉴클레아제 S1으로 분해시키고 단편을 4 데옥시-뉴클레오타이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 폴리머라제 I으로 처리한다.

이러한 방식으로 제조된 Hae II 단편을 효소 DNA 리가제를 이용하여 DraI 벡터 단편에 연결시키고 이. 콜라이 MC 1061내로 형질전환시킨다. 적합한 재조합 이. 콜라이 클론을 클로람페니콜 내성과 효소 GA의 합성에 대해 선별한다. Schibuja 검정법으로 GA 생성을 측정한다. 재조합 클론은 플라스미드 T 347을 하유하며 이의 제한지도는 제3도에 도시되고 있다. 벡터내의 CAT 유전자 배향은 GA 발현수준에 중요한 요인은 아니다.

[실시예 10]

[플라스미드 T 363]

이. 콜라이 MC 1061(T 347)의 발효시간을 연장시키면 플라스미드-함유 세포의 수가 IPTG의 GA 발현 유도 후 현저히 감소함이 밝혀졌다. 불안정성에 대한 예정된 이유는 약 69개 아미노산으로 구성되고 시그날 펩타이드와-락타마제의 잔기를 함유하는 절두된(truncated)-락타마제 단백질이 현재 존재하는-락타마제 프로모터를 경유하여 생성된다는데 있다. 발현은 CAT 유전자내로 클로닝시킴으로써 억제될 수 없기 때문에, 이것은 아마도 음성 선별압, 즉 플라스미드의 상실을 초래한다. 발효 시간내내 안정한 벡터를 수득하기 위하여, 플라스미드 T 307을 효소 Sspi 및 DraI으로 이중분해시킨다. 하나의 복제원을 하유하고 다른 하나는 Trc 프로모터 부분을 갖는 GA 유전자를 함유하는 두 개의 가장 큰 단편을 0.6아가로즈겔 중에서 분별시킨 후 전기용출시켜 분리한다. CAT 유전자를 갖는 HaeII 단편을 실시예 9에서와 같이 제조하고 효소 DNA 리가제를 이용하여 두 개의 상기 단편과 연결시킨다. 연결혼합물로 이. 콜라이 균주 MC 1061을 형질전환시킨다. 재조합 클론을 클로람페니콜의 존재하에서 성장하고 효소 GA를 생성하는 능력을 기준으로 하여 선별한다.

플라스미드 T 363을 보유한 재조합 이. 콜라이 클론으로 최적으로 수율을 달성하였다. 플라스미드 T 363의 제한지도는 제4도에 도시되어 있다.

[실시예 11]

[이. 콜라이 균주 W 3110(T 347) 및 W 3110(T 363)의 발효]

배양조건 : 모든 배양을 다양한 파라미터를 제외하고 두클론에 대해 동일한 하기 조건하에서 수행한다 :

클론 -18℃하에 YT-글리세롤 배지중에 유지시킨다:

이 현탁액을 동일한 배지가 함유된 아가 평판상에 플레이팅하고 28℃에서 24시간 동안 배양하며 예비배양물(PC)을 단일 콜리니로 접종시킨다.

300ml 엘렌메이어 플라스크중의 상기 영양액 100ml를 배양 후 220rpm, 28℃에서 24시간 동안 배양한다. 배양물은 6.0 내지 8.0의 0D_578nm값을 갖는다.

하기 주배양물(MC)를 5 내지 10의 상기 PC(0D_578nm=3.0인 PC를 기준)로 접종시킨다.

공급배취 : 글리세롤 용액 : 글리세롤 525g(99)/MC 배지

(효모추출물 및 NH₄Cl 없음) L

주입속도 : 3.4ml/L^*h(연속첨가)(발효기내

최대 글리세롤 농도 : 0.2) 또는

(단일첨가)

최초 주입 : 약 7시간의 발효시간 후 pO₂= 40

내지 50또는 0D_578nm= 7 내지 9

주입시간 : 40 내지 60시간

pO₂: 약 40유지

유도 : IPTG(최종농도 1mM)로의 유도는 약 20시간 후 생체량이 70내지 80g(습윤)/L에 도달할 때 수행한다. 이후에 글리세롤 주입은 4 내지 40시간동안 계속되어야 한다.

수확 : 유도 후 24 내지 48시간 경과

[이. 콜라이 T 347에서의 GA 발현]

생체량을 증가시키고 뿐만 아니라 GA의 유도성을 입증하기 위한 목적으로 클론 T 347로 배취발효를 진행한다. 이것을 수행하기 위하여 글리세롤에 대한 여러 가지의 주입전략 및 이의 IPTG 유도에 대한 효과를 연구하였다.

* 40GA (세포내)

상기 표는 생체량의 증가와 GA 의 증가간의 양호한 상관관계를 입증하며 IPTG(이는 암모늄에 의해 억제되지 않고 0.2이상 농도의 글리세롤 및 글루코즈에 의해 억제된다)에 의한 GA 발현의 증가를 보여준다. 1mM IPTG는 유도인자(inducer)의 충분한 농도임이 입증되었다. 최적 유도시간은 배양이 성장의 정지단계로 변할때이다.

이 작제물의 플라스미드 안정성에 대한 연구에서, 유도시간(약 40시간의 발효)에서 단지 60의 클론이 그 플라스미드를 함유하였고 유도인자의 첨가 후 24시간내에 소멸된 것으로 나타났다. 연속배양에서 플라스미드의 반감기는 50시간 미만인 것으로 측정되었다.

[이. 콜라이 T 363에서의 GA 발현]

클론 T 363은 72시간 동안의 발효 후 모든 세포에 존재하는 플라스미드를 갖는다. 이의 결론은 뚜렷하게 더욱 높은 GA 역가가 발효시에 도달되고 있음이다. 상기의 최적 배취식 발효 조건하에서, 100g(습윤중량) 이하의 7000 내지 12000U GA/배양액 L이 약 70시간내에 생성될 수 있다. 이 활성의 최대 40는 세포질에 존재한다.

어떠한 요인이 유도에 영향을 미치는가를 밝히기 위하여, 하기의 파라미터를 상세히 연구하였다 :

1) 발효온도

용량-기준 최대 수율은 25 내지 28℃의 범위에서 최대 특이활성으로 얻어진다. 37℃에서 클론은 명백히 감소된 생체량으로 성장하고 최대 20U GA/L로만 발현한다. 유도시점에서 온도를 37℃에서 28℃로 전환했을 때도 마찬가지로 GA가 발현되지 않았다.

2) 복합질소원

용량-기준 GA 생산성의 관점에서, Oxoid로부터의 효모 추출물이 Bio Springer 또는 Marcor로부터의 효모추출물로 대체될 수 있다. 다른 복합질소원 가운데 Sheffield에 의해 공급된 NZ 아민 A, B, E 및 L, 및 락트알부민, 대두펩톤과 박토 펩톤이 50 내지 70의 용량-기준활성을 제공한다. 특이적 GA 활성과 관련하여, NZ 아민, 락트알부민 및 박토 펩톤으로 명백히 더욱 높은 값을 통상 달성한다.

현재까지 최상의 복합질소원은 효모 추출물(15 내지 30g/L)이다.

3) 유도인자 농도

1 내지 10mM 범위의 IPTG에 대한 연구결과 1mM 유도인자가 최상의 GA 발현을 유도하나 그이상의 고농도가 불리하지는 않는 것으로 나타났다.

4) 산소 공급

유도시점에서, 이. 콜라이 T 363은 약 80의 생체량을 생성하였으며 산소요구량은 약 50mmol/L^*이다. 이때 pO₂는 40포화로 유지한다. pO₂는 10이상의 포화로 남아 있는 한 유도자체에 부분적인 역할을 한다.

[실시예 12]

[이. 콜라이 K12(GA)의 발효]

균주 : 이. 콜라이 K12 W3110M : 델타 M 151acI^qpT 363/33

균주 유지 : -74℃ (저온 냉동)에서 앰플에 보관(2xLB 배지내 16.67글리 세롤 스톡)

2x LB 배지 : 박토 트립톤(Difco) 20g/ℓ

박토 효모 추출물(Difco) 10g/ℓ

NaCl 5g/ℓ

진탕 배양 : 2x LB 배지 1000ml (2 스틸 플라스크내)에 클로람페니콜 25mg을 첨가(상기 배지를 멸균한 후 멸균한 여과기를 통해 첨가함)하고 상기 앰플내 균주를 접종하고, 28℃ 진탕기(250rpm, 폭 1.25cm)상에서 4-5시간 동안 OD 값이 1.0에 도달할 때까지 배양한다.

예비단계 : DT 발효기(200 유효용적)에 1ℓ 진탕 배양물(OD 1.0)을 0.5접종한다. 약 6시간 성장시킨 후, OD 값이 3 내지 4에 도달한 후 주단계로 옮긴다.

[예비단계 배지]

[미량 원소 용액 5029]

하기 조건을 예비단계 발효동안 유지한다 :

온도 : 28℃ ; 압력 : 1.0바(bar) ; 공기 유입량 :

7㎥(STP)/h ; 회전수 : (최대 = 175rpm);

pH : 7.2 NH₃가스로 유지(접종전, 배지의 pH를 약 3.0 내지 3.5에서 7.2까지 상승시킨다).

주 단계 : ET 발효기(2㎥ 유효용적)에 DT 배양 육즙(broth)을 10접종한다.

발효시간은 60 내지 80시간이다.

[주 단계 배지]

하기 발효조건을 유지한다 :

온도 : 28℃

압력 : 1.0 바(bar)

전력 유입량 : 2.5KW/㎥

회전수 : 120rpm(600mm 직경의 터보 교반기(turbo stirrer)로 교반);

공기 유입량 : 80㎥(STP)/h (0.67vvm)

pH : 7.2(글루코즈 연속 첨가로 조절)

유도 : CD 50에서 1mM IPTG로 유도

연속첨가 : 글루코즈(30농도용액); 6-8h 후 시작; 양 : 0.5 g/ℓ/h

내지 2.5 g/ℓ/h (pH 변화에 따라)

성장 초기 단계에서, 상기 균주는 처음에는 효모 추출물을 이용하고 글루코즈의 주입을 시작하면, 지수적으로 성장하여 OD 값이 50에 도달한다. 동시에, 산소의 부분압력이 30 내지 10까지 저하된다. 지수성장기 동안 상기 균주에 적절한 산소(pO₂≥ 30)를 공급하기 위해, 전력 유입량을 회전수를 증가시키고/시키거나 공기 유입량을 3.5KW/㎥이상으로 증가시켜 상승시킬 수 있다.

pH를 글루코즈의 주입으로 단계별 또는 연속적 증가로 상기 제1발효단계동안 7.2로 유지한다.

상기 발효의 제2단계는 1mM IPTG(isopropyl thiogalactoside)를 배양 육즙(OD 50, 약 20-24h)에 첨가하여 생성물 형성의 유도를 시작하는 것이다.

상기 발효의 다음 단계는 상기 생성물(glutarylamidase)을 150-200U/ℓ 및 시간의 평균 생성속도로 합성하는 것이다. 이 단계동안 상기 균주는 비례 성장으로 변한다. 후속적인 클루코즈의 주입은 약 0.5g/ℓ 및 h로 감소되어 일정 pH(7.2)를 유지한다.

60-80h 배양 후, 생체량이 습윤중량 80-100g/ℓ(건조중량 22-25g/ℓ)까지 성장했을 때, 생성물 7000-10,000U/ℓ를 형성했을 때 상기 발효를 중지시킨다.

[서열목록]

서열 동정번호 : 1

서열 형태 : 대응 단백질의 뉴클레오타이드

서열 길이 : 각 경우에 33개 염기

쇄성 : 돌출 인지 서열을 가진 이본쇄

형상 : 선형

단편형태 : N-말단 단편(시그날 서열)

공급원 : 합성 DNA

Claims

플라스미드 pCM 145(DSM 6409)에 함유된 글루타릴아실라제(GA) 유전자를 발현시키는 단계를 포함하여, 이. 콜라이 내에서 GA를 제조하는 유전공학적 방법.
제1항에 있어서, GA 유전자를 이. 콜라이 프로모터의 조절하에서 발현시키는 방법.
제2항에 있어서, 프로모터가 유도성인 방법.
제3항에 있어서, 유도가 대수기에서 일어나는 방법.
제4항에 있어서, 유도가 대수기 말기에서 일어나는 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, GA 유전자가 저복제수 벡터에 존재하는 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, GA 유전자가 선별유전자로서 외질에 위치하는 분비 효소에 대한 유전자를 함유하지 않는 발현 벡터에 존재하는 방법.
제7항에 있어서, 발현벡터가 고복제수 벡터인 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, GA 유전자가 선별 유전자의 발현이 엄격히 조절되는 고복제수 벡터에 존재하는 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 발현이 약 25 내지 30℃의 발효 온도에서 일어나는 방법.
플라스미드 pCM 145(DSM 6409)
플라스미드 pCM 145(DSM 6409)에 함유된 GA 유전자.
제12항 청구된 유전자를 함유하는 유전자 작제물.
제6항에 있어서, 발현이 약 25 내지 30℃의 발효 온도에서 일어나는 방법.
제7항에 있어서, 발현이 약 25 내지 30℃의 발효 온도에서 일어나는 방법.
제8항에 있어서, 발현이 약 25 내지 30℃의 발효 온도에서 일어나는 방법.
제9항에 있어서, 발현이 약 25 내지 30℃의 발효 온도에서 일어나는 방법.