JPH04330284A - ジアミノペラルゴン酸アミノトランスフエラーゼ及びデスチオビオチンシンセターゼをコードする遺伝子並びにその利用 - Google Patents
ジアミノペラルゴン酸アミノトランスフエラーゼ及びデスチオビオチンシンセターゼをコードする遺伝子並びにその利用Info
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Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ジアミノペラルゴン酸
アミノトランスフエラーゼ及びデスチオビオチンシンセ
ターゼをコードする遺伝子、該遺伝子を有するＤＮＡ断
片を含む組換えプラスミド、該組換えプラスミドで形質
転換されたコリネ型細菌並びに該コリネ型細菌を用いる
ジアミノペラルゴン酸アミノトランスフエラーゼ及び／
又はデスチオビオチンシンセターゼの製造法に関する。
アミノトランスフエラーゼ及びデスチオビオチンシンセ
ターゼをコードする遺伝子、該遺伝子を有するＤＮＡ断
片を含む組換えプラスミド、該組換えプラスミドで形質
転換されたコリネ型細菌並びに該コリネ型細菌を用いる
ジアミノペラルゴン酸アミノトランスフエラーゼ及び／
又はデスチオビオチンシンセターゼの製造法に関する。
【０００２】ジアミノペラルゴン酸アミノトランスフエ
ラーゼ及びデスチオビオチンシンセターゼは、７−ケト
−８−アミノペラルゴン酸からデスチオビオチンを生成
するビオチン生合成反応に係る酵素であり、ビオチン製
造において産業上重要な酵素である。
ラーゼ及びデスチオビオチンシンセターゼは、７−ケト
−８−アミノペラルゴン酸からデスチオビオチンを生成
するビオチン生合成反応に係る酵素であり、ビオチン製
造において産業上重要な酵素である。
【０００３】またビオチンは、ヒト、動物、植物及びあ
る種の微生物の生育に必要とされるビタミンの１種であ
り、特に皮膚代謝の調整剤として、あるいはヒトの脱毛
防止養毛剤として、あるいは、家畜飼料への添加剤とし
て用いられる有用な物質である。
る種の微生物の生育に必要とされるビタミンの１種であ
り、特に皮膚代謝の調整剤として、あるいはヒトの脱毛
防止養毛剤として、あるいは、家畜飼料への添加剤とし
て用いられる有用な物質である。
【０００４】
【従来の技術】従来、微生物を用いたビオチンの製造法
としては、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、エシエリ
ヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、アグロバクテリウ
ム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、クロモバクテリ
ウム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、シユード
モナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、アースロバクタ
ー（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属等の微生物を用いる
方法が知られている。（特開昭５６−１６０９９８号公
報）。またこれら野生株に人工的に突然変異を生起させ
てビオチン生産能を付与する方法も提案されている（例
えば Ｈ． Ｙａｍａｇａｔａ ｅｔ ａｌ， Ａｇｒ
ｉ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ４７、 １６１１、
１９８３）。しかしながら、微生物を用いてビオチン
を製造しようとする場合、野生株はビオチンによる強力
なフイードバツク抑制機構のため（Ｙ． Ｉｚｕｍｉ，
Ｋ． Ｏｇａｔａ， Ａｄｖ．Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒ
ｏｂｉａｌ． ２２、 １５５−１５７、 １９７７）
。 ビオチンは極少量しか生成されない。また変異株を
用いる方法でも生成量は必ずしも満足し得るものではな
かつた。
としては、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、エシエリ
ヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、アグロバクテリウ
ム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、クロモバクテリ
ウム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、シユード
モナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、アースロバクタ
ー（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属等の微生物を用いる
方法が知られている。（特開昭５６−１６０９９８号公
報）。またこれら野生株に人工的に突然変異を生起させ
てビオチン生産能を付与する方法も提案されている（例
えば Ｈ． Ｙａｍａｇａｔａ ｅｔ ａｌ， Ａｇｒ
ｉ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ４７、 １６１１、
１９８３）。しかしながら、微生物を用いてビオチン
を製造しようとする場合、野生株はビオチンによる強力
なフイードバツク抑制機構のため（Ｙ． Ｉｚｕｍｉ，
Ｋ． Ｏｇａｔａ， Ａｄｖ．Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒ
ｏｂｉａｌ． ２２、 １５５−１５７、 １９７７）
。 ビオチンは極少量しか生成されない。また変異株を
用いる方法でも生成量は必ずしも満足し得るものではな
かつた。
【０００５】また、工業的利用上多くの利点を有するブ
レビバクテリウム属及びコリネバクテリウム属細菌を含
むコリネ型細菌のある種の苗株、例えばブレビバクテリ
ウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌ
ａｖｕｍ）ＭＪ−２３３、ブレビバクテリウム・ラクト
フアーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａ
ｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）ＡＴＣＣ１３８６９、コリ
ネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ３１８３
１、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｂｒｅｖ
ｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）Ａ
ＴＣＣ１３７４５等は、ビオチン要求性を有しており、
ビオチンを全く生産しないことが知られている。
レビバクテリウム属及びコリネバクテリウム属細菌を含
むコリネ型細菌のある種の苗株、例えばブレビバクテリ
ウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌ
ａｖｕｍ）ＭＪ−２３３、ブレビバクテリウム・ラクト
フアーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａ
ｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）ＡＴＣＣ１３８６９、コリ
ネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ３１８３
１、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｂｒｅｖ
ｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）Ａ
ＴＣＣ１３７４５等は、ビオチン要求性を有しており、
ビオチンを全く生産しないことが知られている。
【０００６】ビオチンの生合成に関与する遺伝子として
は、エシエリヒア・コリ由来の遺伝子がよく研究されて
おり、ｂｉｏＡ、ｂｉｏＢ、ｂｉｏＣ、ｂｉｏＤ、ｂｉ
ｏＦ、ｂｉｏＨ遺伝子が存在することが知られている。 このうち、ｂｉｏＡは７，８−ジアミノペラルゴン酸ア
ミノトランスフエラーゼ、ｂｉｏＢはビオチンシンセタ
ーゼ、ｂｉｏＣはピメリルＣｏＡシンテターゼ、ｂｉｏ
Ｄはデスチオビオチンシンセターゼ、ｂｉｏＦは７−ケ
ト−８−アミノペラルゴン酸シンテターゼをそれぞれコ
ードすることが知られ、ｂｉｏＨについては、その働き
は、また明らかでない（Ａ． Ｊ． Ｏｔｓｕｋａ ｅ
ｔ． ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６
３、 １９５７７−１９５８５、 １９８８）。また、
ｂｉｏＡ、ｂｉｏＢ、ｂｉｏＣ、ｂｉｏＤ、ｂｉｏＦ遺
伝子はｂｉｏＡＢＦＣＤなるオペロンを形成しており、
その発現は、ｂｉｏＡとｂｉｏＢ遺伝子の間に存在する
オペレーターにより制御されることがわかつている。ま
た、そのオペレーターの制御はｂｉｒＡ遺伝子にコード
されたビオチンリプレツサーが、ビオチンにより活性化
されることによりオペレーターに結合し、ビオチン生合
成オペロンの発現を抑制することが知られている。（Ｊ
． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６３、 １０１３−１
０１６、 １９８８）。
は、エシエリヒア・コリ由来の遺伝子がよく研究されて
おり、ｂｉｏＡ、ｂｉｏＢ、ｂｉｏＣ、ｂｉｏＤ、ｂｉ
ｏＦ、ｂｉｏＨ遺伝子が存在することが知られている。 このうち、ｂｉｏＡは７，８−ジアミノペラルゴン酸ア
ミノトランスフエラーゼ、ｂｉｏＢはビオチンシンセタ
ーゼ、ｂｉｏＣはピメリルＣｏＡシンテターゼ、ｂｉｏ
Ｄはデスチオビオチンシンセターゼ、ｂｉｏＦは７−ケ
ト−８−アミノペラルゴン酸シンテターゼをそれぞれコ
ードすることが知られ、ｂｉｏＨについては、その働き
は、また明らかでない（Ａ． Ｊ． Ｏｔｓｕｋａ ｅ
ｔ． ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６
３、 １９５７７−１９５８５、 １９８８）。また、
ｂｉｏＡ、ｂｉｏＢ、ｂｉｏＣ、ｂｉｏＤ、ｂｉｏＦ遺
伝子はｂｉｏＡＢＦＣＤなるオペロンを形成しており、
その発現は、ｂｉｏＡとｂｉｏＢ遺伝子の間に存在する
オペレーターにより制御されることがわかつている。ま
た、そのオペレーターの制御はｂｉｒＡ遺伝子にコード
されたビオチンリプレツサーが、ビオチンにより活性化
されることによりオペレーターに結合し、ビオチン生合
成オペロンの発現を抑制することが知られている。（Ｊ
． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６３、 １０１３−１
０１６、 １９８８）。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】この発明は、コリネ型
細菌のビオチン生合成に関与する遺伝子を解析・単離し
、該遺伝子を同種であるコリネ型細菌に導入し、該遺伝
子産物を効率的にコリネ型細菌から取得することを目的
としてなされたものである。
細菌のビオチン生合成に関与する遺伝子を解析・単離し
、該遺伝子を同種であるコリネ型細菌に導入し、該遺伝
子産物を効率的にコリネ型細菌から取得することを目的
としてなされたものである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記目的
を達成すべく鋭意研究を重ねた。その結果、ビオチン要
求性の大腸菌変異株を用いる交差相補性試験により、ビ
オチン要求性のコリネ型細菌は、少くともｂｉｏＢ、ｂ
ｉｏＡ、ｂｉｏＤの三種のビオチン生合成に関与する遺
伝子を保有していることが明らかとなり、該遺伝子を適
当なベクタープラスミドに導入して、コリネ型細菌を形
質転換し、該コリネ型細菌を培養することにより、培養
物中に効率的にビオチン生合成に関与する酵素が生成す
ることを見い出し本発明を完成するに至つた。
を達成すべく鋭意研究を重ねた。その結果、ビオチン要
求性の大腸菌変異株を用いる交差相補性試験により、ビ
オチン要求性のコリネ型細菌は、少くともｂｉｏＢ、ｂ
ｉｏＡ、ｂｉｏＤの三種のビオチン生合成に関与する遺
伝子を保有していることが明らかとなり、該遺伝子を適
当なベクタープラスミドに導入して、コリネ型細菌を形
質転換し、該コリネ型細菌を培養することにより、培養
物中に効率的にビオチン生合成に関与する酵素が生成す
ることを見い出し本発明を完成するに至つた。
【０００９】かくして本発明によれば、（１）コリネ型
細菌由来のジアミノペラルゴン酸アミノトランスフエラ
ーゼ及びデスチオビオチンシンセターゼをコードする遺
伝子を含むＤＮＡ断片、（２）該ＤＮＡ断片が導入され
た組換えプラスミド、（３）該組換えプラスミドで形質
転換されたコリネ型細菌、（４）該コリネ型細菌を培養
し、培養物中にジアミノペラルゴン酸アミノトランスフ
エラーゼ及び／又はデスチオビオチンシンセターゼを生
成せしめることを特徴とするジアミノペラルゴン酸アミ
ノトランスフエラーゼ及び／又はデスチオビオチンシン
セターゼの製造法が提供される。
細菌由来のジアミノペラルゴン酸アミノトランスフエラ
ーゼ及びデスチオビオチンシンセターゼをコードする遺
伝子を含むＤＮＡ断片、（２）該ＤＮＡ断片が導入され
た組換えプラスミド、（３）該組換えプラスミドで形質
転換されたコリネ型細菌、（４）該コリネ型細菌を培養
し、培養物中にジアミノペラルゴン酸アミノトランスフ
エラーゼ及び／又はデスチオビオチンシンセターゼを生
成せしめることを特徴とするジアミノペラルゴン酸アミ
ノトランスフエラーゼ及び／又はデスチオビオチンシン
セターゼの製造法が提供される。
【００１０】以下本発明についてさらに詳細に説明する
。
。
【００１１】本発明の「ジアミノペラルゴン酸アミノト
ランスフエラーゼ及び／又はデスチオビオチンシンセタ
ーゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片」（以下これ
を「ｂｉｏＡ ｂｉｏＤ断片」と略称することがある）
は、７−ケト−８−アミノペラルゴン酸から７，８−ジ
アミノペラルゴン酸への変換反応を触媒する酵素、すな
わちジアミノペラルゴン酸アミノトランスフエラーゼを
コードする以下（ｂｉｏＡ）及び／又は７，８−ジアミ
ノペラルゴン酸からデスチオビオチンへの変換を触媒す
る酸素、すなわちデスチオビオチンシンセターゼをコー
ドする遺伝子（ｂｉｏＤ）の両遺伝子又はいずれか一方
の遺伝子を含むＤＮＡ断片である。
ランスフエラーゼ及び／又はデスチオビオチンシンセタ
ーゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片」（以下これ
を「ｂｉｏＡ ｂｉｏＤ断片」と略称することがある）
は、７−ケト−８−アミノペラルゴン酸から７，８−ジ
アミノペラルゴン酸への変換反応を触媒する酵素、すな
わちジアミノペラルゴン酸アミノトランスフエラーゼを
コードする以下（ｂｉｏＡ）及び／又は７，８−ジアミ
ノペラルゴン酸からデスチオビオチンへの変換を触媒す
る酸素、すなわちデスチオビオチンシンセターゼをコー
ドする遺伝子（ｂｉｏＤ）の両遺伝子又はいずれか一方
の遺伝子を含むＤＮＡ断片である。
【００１２】上記ｂｉｏＡ ｂｉｏＤ断片の供給源とな
る微生物は、コリネ型細菌であれば特に限定されるもの
ではないが、一般的には、ブレビバクテリウム・フラバ
ムＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）および
その由来株、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（
Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎ
ｅｓ）ＡＴＣＣ６８７１、同ＡＴＣＣ１３７４５、同Ａ
ＴＣＣ１３７４６、ブレビバクテリウム・デバリカタム
（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｖａｒｉｃａｔ
ｕｍ）ＡＴＣＣ１４０２０、ブレビバクテリウム・ラク
トフアーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌ
ａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）ＡＴＣＣ１３８６９、コ
リネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ３１８
３１等が有利に使用される。
る微生物は、コリネ型細菌であれば特に限定されるもの
ではないが、一般的には、ブレビバクテリウム・フラバ
ムＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）および
その由来株、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（
Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎ
ｅｓ）ＡＴＣＣ６８７１、同ＡＴＣＣ１３７４５、同Ａ
ＴＣＣ１３７４６、ブレビバクテリウム・デバリカタム
（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｖａｒｉｃａｔ
ｕｍ）ＡＴＣＣ１４０２０、ブレビバクテリウム・ラク
トフアーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌ
ａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）ＡＴＣＣ１３８６９、コ
リネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ３１８
３１等が有利に使用される。
【００１３】これらの供給源微生物からｂｉｏＡ ｂｉ
ｏＤ断片を調製するための基本操作の一例を述べれば次
のとおりである。
ｏＤ断片を調製するための基本操作の一例を述べれば次
のとおりである。
【００１４】上記ｂｉｏＡ ｂｉｏＤ断片は、上記コリ
ネ型細菌、例えばブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−
２３３株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）の染色体上に
存在し、この染色体を適当な制限酵素で切断することに
より生ずる切断断片の中から以下に述べる方法で分離、
取得することができる。
ネ型細菌、例えばブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−
２３３株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）の染色体上に
存在し、この染色体を適当な制限酵素で切断することに
より生ずる切断断片の中から以下に述べる方法で分離、
取得することができる。
【００１５】先ず、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ
−２３３株の培養物から染色体ＤＮＡを抽出する。この
染色体ＤＮＡを適当な制限酵素、例えばＳａｕ３ＡＩを
用いて、ＤＮＡ断片の大きさが約２０〜３０ｋｂになる
ように部分分解する。
−２３３株の培養物から染色体ＤＮＡを抽出する。この
染色体ＤＮＡを適当な制限酵素、例えばＳａｕ３ＡＩを
用いて、ＤＮＡ断片の大きさが約２０〜３０ｋｂになる
ように部分分解する。
【００１６】得られたＤＮＡ断片をコスミドベクター例
えばｐＷＥ１５に挿入し、このコスミドを、λＤＮＡ
ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｋｉｔを用い
る形質導入により、ｂｉｏＡあるいはｂｉｏＤの欠損し
た大腸菌変異株（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌｏｇｙ， ｖｏｌ ９４、 ｐ２０６５−２０６
６、 １９６７及びＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅ
ｒｉｏｌｏｇｙ ｖｏｌ １１２、 ｐ８３０−８３９
、 １９７２参照）に導入する。この大腸菌変異株を、
ビオチンを含まない選択培地に塗沫する。
えばｐＷＥ１５に挿入し、このコスミドを、λＤＮＡ
ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｋｉｔを用い
る形質導入により、ｂｉｏＡあるいはｂｉｏＤの欠損し
た大腸菌変異株（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌｏｇｙ， ｖｏｌ ９４、 ｐ２０６５−２０６
６、 １９６７及びＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅ
ｒｉｏｌｏｇｙ ｖｏｌ １１２、 ｐ８３０−８３９
、 １９７２参照）に導入する。この大腸菌変異株を、
ビオチンを含まない選択培地に塗沫する。
【００１７】得られる形質転換株よりコスミドＤＮＡを
抽出し、制限酵素で解析することにより挿入されたブレ
ビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株染色体由来の
ｂｉｏＡ ｂｉｏＤ断片を確認・取得することができる
。
抽出し、制限酵素で解析することにより挿入されたブレ
ビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株染色体由来の
ｂｉｏＡ ｂｉｏＤ断片を確認・取得することができる
。
【００１８】かくして得られるｂｉｏＡ ｂｉｏＤ断片
は、大きさが約２０〜３０ｋｂと大きく、実用的でない
ので、さらに短かい断片に特定化する必要がある。
は、大きさが約２０〜３０ｋｂと大きく、実用的でない
ので、さらに短かい断片に特定化する必要がある。
【００１９】次に、上記で得られたｂｉｏＡ ｂｉｏＤ
断片を含むコスミドを適当な制限酵素を用いて切断し、
得られるＤＮＡ断片を、大腸菌で複製可能なベクタープ
ラスミドに挿入しこのベクタープラスミドを通常用いら
れる形質転換法、例えば、塩化カルシウム法あるいは電
気パルス法による形質転換により、前記ｂｉｏＡあるい
はｂｉｏＤの欠損した大腸菌変異株に導入する。この大
腸菌変異株を、ビオチンを含まない選択培地に塗沫する
。
断片を含むコスミドを適当な制限酵素を用いて切断し、
得られるＤＮＡ断片を、大腸菌で複製可能なベクタープ
ラスミドに挿入しこのベクタープラスミドを通常用いら
れる形質転換法、例えば、塩化カルシウム法あるいは電
気パルス法による形質転換により、前記ｂｉｏＡあるい
はｂｉｏＤの欠損した大腸菌変異株に導入する。この大
腸菌変異株を、ビオチンを含まない選択培地に塗沫する
。
【００２０】得られる形質転換株よりプラスミドＤＮＡ
を抽出し、制限酵素で解析することにより挿入されたブ
レビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株染色体由来
のｂｉｏＡ ｂｉｏＤ断片を確認・取得することができ
る。
を抽出し、制限酵素で解析することにより挿入されたブ
レビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株染色体由来
のｂｉｏＡ ｂｉｏＤ断片を確認・取得することができ
る。
【００２１】このようにして得られるｂｉｏＡ ｂｉｏ
Ｄ断片の一つは、前記ブレビバクテリウム・フラバムＭ
Ｊ−２３３株の染色体ＤＮＡを制限酵素Ｓａｕ３ＡＩの
部分分解により切り出し、さらにそれを、制限酵素Ｓａ
ｌＩで切り出すことによつて得られる大きさが約４．０
ｋｂのＤＮＡ断片を挙げることができる。
Ｄ断片の一つは、前記ブレビバクテリウム・フラバムＭ
Ｊ−２３３株の染色体ＤＮＡを制限酵素Ｓａｕ３ＡＩの
部分分解により切り出し、さらにそれを、制限酵素Ｓａ
ｌＩで切り出すことによつて得られる大きさが約４．０
ｋｂのＤＮＡ断片を挙げることができる。
【００２２】この約４．０ｋｂのｂｉｏＡ ｂｉｏＤ断
片を、各種の制限酵素で切断したときの認識部位数及び
切断断片の大きさを下記表１に示す。
片を、各種の制限酵素で切断したときの認識部位数及び
切断断片の大きさを下記表１に示す。
【００２３】なお、本明細書において、制限酵素による
「認識部位数」は、ＤＮＡ断片又はプラスミドを、過剰
の制限酵素の存在下で完全分解し、それらの分解物をそ
れ自体既知の方法に従い１％アガロースゲル電気泳動お
よびポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、分離可能
な断片の数から決定した値を採用した。
「認識部位数」は、ＤＮＡ断片又はプラスミドを、過剰
の制限酵素の存在下で完全分解し、それらの分解物をそ
れ自体既知の方法に従い１％アガロースゲル電気泳動お
よびポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、分離可能
な断片の数から決定した値を採用した。
【００２４】また、「切断断片の大きさ」及びプラスミ
ドの大きさは、アガロースゲル電気泳動を用いる場合に
は、エシエリヒア・コリのラムダフアージ（λｐｈａｇ
ｅ）のＤＮＡを制限酵素Ｈｉｎｄ ＩＩＩで切断して得
られる分子量既知のＤＮＡ断片の同一アガロースゲル上
での泳動距離で描かれる標準線に基づき、また、ポリア
クリルアミドゲル電気泳動を用いる場合には、エシエリ
ヒア・コリのフアイ・エツクス１７４フアージ（φ×１
７４ｐｈａｇｅ）のＤＮＡを制限酵素Ｈａｅ ＩＩＩで
切断して得られる分子量既知のＤＮＡ断片の同一ポリア
クリルアミドゲル上での泳動距離で描かれる標準線に基
づき、切断ＤＮＡ断片又はプラスミドの各ＤＮＡ断片の
大きさを算出する。プラスミドの大きさは、切断断片そ
れぞれの大きさを加算して求める。なお、各ＤＮＡ断片
の大きさの決定において、１ｋｂ以上の断片の大きさに
ついては、１％アガロースゲル電気泳動によつて得られ
る結果を採用し、約０．１ｋｂから１ｋｂ未満の断片の
大きさについては４％ポリアクリルアミドゲル電気泳動
によつて得られる結果を採用した。
ドの大きさは、アガロースゲル電気泳動を用いる場合に
は、エシエリヒア・コリのラムダフアージ（λｐｈａｇ
ｅ）のＤＮＡを制限酵素Ｈｉｎｄ ＩＩＩで切断して得
られる分子量既知のＤＮＡ断片の同一アガロースゲル上
での泳動距離で描かれる標準線に基づき、また、ポリア
クリルアミドゲル電気泳動を用いる場合には、エシエリ
ヒア・コリのフアイ・エツクス１７４フアージ（φ×１
７４ｐｈａｇｅ）のＤＮＡを制限酵素Ｈａｅ ＩＩＩで
切断して得られる分子量既知のＤＮＡ断片の同一ポリア
クリルアミドゲル上での泳動距離で描かれる標準線に基
づき、切断ＤＮＡ断片又はプラスミドの各ＤＮＡ断片の
大きさを算出する。プラスミドの大きさは、切断断片そ
れぞれの大きさを加算して求める。なお、各ＤＮＡ断片
の大きさの決定において、１ｋｂ以上の断片の大きさに
ついては、１％アガロースゲル電気泳動によつて得られ
る結果を採用し、約０．１ｋｂから１ｋｂ未満の断片の
大きさについては４％ポリアクリルアミドゲル電気泳動
によつて得られる結果を採用した。
【００２５】
【表２】
表１ 制限酵素 認識部位数
切断断片の大きさ（ｋｂ） ＢａｍＨＩ
１ ０．８、
３．２ Ｄｒａ ＩＩ １
１．２、 ２．８ Ｓａ
ｃ Ｉ １
１．８、 ２．２ Ｘｈｏ Ｉ
１ １．３、 ２．７上
記表１中、２．７ｋｂのＸｈｏＩ切断断片もまたジアミ
ノペラルゴン酸アミノトランスフエラーゼ及びデスチオ
ビオチンシンセターゼをコードする機能を有しているこ
とが確認されており、従つて、この切断断片もまた本発
明のＤＮＡ断片に包含される。
表１ 制限酵素 認識部位数
切断断片の大きさ（ｋｂ） ＢａｍＨＩ
１ ０．８、
３．２ Ｄｒａ ＩＩ １
１．２、 ２．８ Ｓａ
ｃ Ｉ １
１．８、 ２．２ Ｘｈｏ Ｉ
１ １．３、 ２．７上
記表１中、２．７ｋｂのＸｈｏＩ切断断片もまたジアミ
ノペラルゴン酸アミノトランスフエラーゼ及びデスチオ
ビオチンシンセターゼをコードする機能を有しているこ
とが確認されており、従つて、この切断断片もまた本発
明のＤＮＡ断片に包含される。
【００２６】かくして、上記したｂｉｏＡ ｂｉｏＤ
ＤＮＡ断片中に含まれるｂｉｏＡ ｂｉｏＤは、ブレビ
バクテリウム・フラバムＭＪ−２３３染色体ＤＮＡを制
限酵素ＳａｌＩ及びＸｈｏＩで切り出すことによつて得
られる大きさが約２．７ｋｂのＤＮＡ断片中に含まれる
ものと考えられる。
ＤＮＡ断片中に含まれるｂｉｏＡ ｂｉｏＤは、ブレビ
バクテリウム・フラバムＭＪ−２３３染色体ＤＮＡを制
限酵素ＳａｌＩ及びＸｈｏＩで切り出すことによつて得
られる大きさが約２．７ｋｂのＤＮＡ断片中に含まれる
ものと考えられる。
【００２７】上記約２．７ｋｂのＤＮＡ断片を、さらに
各種の制限酵素で切断したときの認識部位数及び切断断
片の大きさを下記表２に示す。
各種の制限酵素で切断したときの認識部位数及び切断断
片の大きさを下記表２に示す。
【００２８】
【表３】
表
２ 制限酵素 認識部位数
切断断片の大きさ（ｋｂ） ＳａｃＩ
１ ０．９，
１，８ ＤｒａＩＩ １
１．５，１．２ ＢａｍＨ
Ｉ １ １．９
，０．８かくして得られるＤＮＡ断片の遺伝子コード機
能の解析により、ｂｉｏＡ、ｂｉｏＤは、制限酵素Ｘｈ
ｏＩ及びＳａｌＩで切り出すことによって得られる２．
７ｋｂ中のＤＮＡ断片中の、ＸｈｏＩ部位側にｂｉｏＡ
、その下流ＳａｌＩ部位側にｂｉｏＤの位置関係を有し
て配列が存在すると考えられる。
２ 制限酵素 認識部位数
切断断片の大きさ（ｋｂ） ＳａｃＩ
１ ０．９，
１，８ ＤｒａＩＩ １
１．５，１．２ ＢａｍＨ
Ｉ １ １．９
，０．８かくして得られるＤＮＡ断片の遺伝子コード機
能の解析により、ｂｉｏＡ、ｂｉｏＤは、制限酵素Ｘｈ
ｏＩ及びＳａｌＩで切り出すことによって得られる２．
７ｋｂ中のＤＮＡ断片中の、ＸｈｏＩ部位側にｂｉｏＡ
、その下流ＳａｌＩ部位側にｂｉｏＤの位置関係を有し
て配列が存在すると考えられる。
【００２９】以上に詳述した大きさが約４．０ｋｂ、約
２．７ｋｂのｂｉｏＡ ｂｉｏＤ ＤＮＡ断片の制限酵
素切断点を図１に示す。
２．７ｋｂのｂｉｏＡ ｂｉｏＤ ＤＮＡ断片の制限酵
素切断点を図１に示す。
【００３０】一方、上記したブレビバクテリウム・フラ
バムＭＪ−２３３の染色体を、制限酵素ＳａｌＩを用い
て切り出すことにより得られる大きさが約４．０ｋｂの
ＤＮＡ断片を用いて、その塩基配列をプラスミドｐＵＣ
１８またはｐＵＣ１９を用いるジデオキシヌクレオチド
酵素法（ｄｉｄｅｏｘｙ ｃｈａｉｎ ｔｅｒｍｉｎａ
ｔｉｏｎ 法）（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ． ｅｔ ａｌ．，
Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳ
Ａ ７４、５４６３、１９７７）により決定することが
できる。
バムＭＪ−２３３の染色体を、制限酵素ＳａｌＩを用い
て切り出すことにより得られる大きさが約４．０ｋｂの
ＤＮＡ断片を用いて、その塩基配列をプラスミドｐＵＣ
１８またはｐＵＣ１９を用いるジデオキシヌクレオチド
酵素法（ｄｉｄｅｏｘｙ ｃｈａｉｎ ｔｅｒｍｉｎａ
ｔｉｏｎ 法）（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ． ｅｔ ａｌ．，
Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳ
Ａ ７４、５４６３、１９７７）により決定することが
できる。
【００３１】かくして、塩基配列中のオープンリーデン
グフレームの存在から決定されたジアミノペラルゴン酸
アミノトランスフエラーゼをコードする遺伝子（ｂｉｏ
Ａ）は、次の配列番号１で示される配列を有する４２３
のアミノ酸をコードする１２６９の塩基対より構成され
、またデスチオビオチンシンセターゼをコードする遺伝
子（ｂｉｏＤ）は、次の配列番号２で示される配列を有
する２２４のアミノ酸をコードする６７２の塩基対より
構成される：
配列番号：１ＡＴＧ ＧＡＡ ＡＡＣ ＣＣＣ
ＡＧＣ ＴＴＧ ＣＧＣ ＧＡＧ ＣＴＴ ＧＡＴ Ｃ
ＡＣ ＣＧＡ ＡＡＣ ＡＴＣ ＴＧＧ ＣＡＣ
４８Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｌｅｕ
Ａｒｇ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｈｉｓ Ａｒｇ
Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｈｉｓ １
５
１０ １５Ｃ
ＣＧ ＴＡＴ ＧＣＣ ＧＣＧ ＣＣＧ ＧＧＣ ＧＴ
Ｇ ＣＧＣ ＡＡＣ ＡＧＡ ＣＴＣ ＧＴＣ ＡＣＣ
ＡＡＣ ＡＣＴ ＧＡＴ ９６Ｐｒｏ Ｔｙｒ
Ａｌａ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ａｒｇ Ａ
ｓｎ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｔｈ
ｒ Ａｓｐ ２０
２５
３０ＧＧＧ ＧＴＧ ＴＴＣ ＴＴＧ
ＡＣＧ ＣＴＧ ＧＡＡ ＧＡＴ ＧＧＣ ＡＧＣ
ＡＣＣ ＧＴＧ ＡＴＴ ＧＡＣ ＧＣＧ ＡＴＧ
１４４Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｌｅ
ｕ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｖａｌ
Ｉｌｅ Ａｓｐ Ａｌａ Ｍｅｔ
３５ ４０
４５ＡＧＣ ＴＣＣ
ＴＧＧ ＴＧＧ ＴＣＧ ＧＣＡ ＡＴＴ ＣＡＴ Ｇ
ＧＡ ＣＡＣ ＧＧＡ ＣＡＣ ＣＣＣ ＣＧＡ ＣＴ
Ｇ ＡＡＡ １９２Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｔｒｐ Ｔｒｐ
Ｓｅｒ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｈｉｓ Ｇｌｙ Ｈｉｓ
Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｌｙｓ
５０ ５５
６０ＣＧＴ Ｇ
ＣＣ ＧＣＣ ＣＡＡ ＡＡＡ ＣＡＡ ＡＴＣ ＧＡ
Ｃ ＡＣＣ ＡＴＧ ＡＧＴ ＣＡＣ ＧＴＣ ＡＴＧ
ＴＴＣ ＧＧＣ ２４０Ａｒｇ Ａｌａ Ａｌａ
Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｍ
ｅｔ Ｓｅｒ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ｍｅｔ Ｐｈｅ Ｇｌ
ｙ ６５ ７０
７５
８０ＧＧＡ ＣＴＡ ＡＣＣ
ＣＡＣ ＧＡＧ ＣＣＣ ＧＣＣ ＡＴＴ ＡＡＧ
ＣＴＣ ＡＣＣ ＣＡＣ ＡＡＡ ＣＴＣ ＣＴＣ Ａ
ＡＴ ２８８Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ｇｌ
ｕ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｔｈｒ
Ｈｉｓ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｓｎ
８５
９０
９５ＣＴＣ ＡＣＴ ＧＧＣ ＡＡＴ ＧＣＣ Ｔ
ＴＴ ＧＡＣ ＣＡＣ ＧＴＣ ＴＴＴ ＴＡＴ ＴＣ
Ｃ ＧＡＴ ＴＣＧ ＧＧＣ ＴＣＧ ３３６Ｌｅｕ
Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ａｌａ Ｐｈｅ Ａｓｐ
Ｈｉｓ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｓ
ｅｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ １００
１０５
１１０ＧＴＣ ＴＣＧ ＧＴ
Ｇ ＧＡＧ ＧＴＣ ＧＣＣ ＡＴＣ ＡＡＡ ＡＴＧ
ＧＣＡ ＣＴＧ ＣＡＧ ＧＣＣ ＴＣＣ ＡＡＡ
ＧＧＡ ３８４Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｖ
ａｌ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ａｌａ Ｌｅ
ｕ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｇｌｙ
１１５ １
２０ １２５ＣＡＡ
ＧＧＣ ＣＡＣ ＣＣＧ ＧＡＡ ＣＧＣ ＡＣＡ
ＡＡＡ ＣＴＣ ＣＴＣ ＡＣＣ ＴＧＧ ＣＧＧ Ｔ
ＣＣ ＧＧＣ ＴＡＣ ４３２Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｈｉ
ｓ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｌｅｕ
Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｔｒｐ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｇｌｙ
Ｔｙｒ １３０
１３５ １４０
ＣＡＣ ＧＧＡ ＧＡＣ ＡＣＡ ＴＴＣ ＡＣＣ Ｇ
ＣＧ ＡＴＧ ＡＧＣ ＧＴＧ ＴＧＣ ＧＡＣ ＣＣ
Ａ ＧＡＡ ＡＡＴ ＧＧＣ ４８０Ｈｉｓ Ｇｌｙ
Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｍｅｔ
Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｃｙｓ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ａ
ｓｎ Ｇｌｙ１４５
１５０ １５５
１６０ＡＴＧ ＣＡ
Ｔ ＡＧＣ ＣＴＣ ＴＧＧ ＡＡＡ ＧＧＣ ＡＣＡ
ＣＴＣ ＣＣＣ ＧＡＧ ＣＡＧ ＡＴＴ ＴＴＣ
ＧＣＣ ＣＣＣ ５２８Ｍｅｔ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｌ
ｅｕ Ｔｒｐ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｐｒ
ｏ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｐｒｏ
１６５
１７０
１７５ＧＣＣ ＣＣＡ ＣＣＡ ＧＴＴ
ＣＧＧ ＧＧＧ ＴＣＡ ＴＣＧ ＣＣＧ ＣＡＧ Ｇ
ＣＡ ＡＴＴ ＴＣＣ ＧＡＧ ＴＡＣ ＣＴＧ ５
７６Ａｌａ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｇｌｙ
Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｉｌｅ
Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｔｙｒ Ｌｅｕ
１８０ １８５
１９０ＣＡＣ Ａ
ＧＣ ＡＴＧ ＧＡＡ ＴＴＧ ＣＴＴ ＡＴＣ ＧＡ
Ｃ ＧＡＧ ＡＣＣ ＧＴＣ ＴＣＣ ＧＣＡ ＡＴＣ
ＡＴＣ ＡＴＣ ６２４Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｍｅｔ
Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｔ
ｈｒ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ｉｌ
ｅ １９５
２００ ２
０５ＧＡＡ ＣＣＧ ＡＴＣ ＧＴＣ ＣＡＡ ＧＧＣ
ＧＣＴ ＧＧＡ ＧＧＣ ＡＴＧ ＣＧＣ ＴＴＴ
ＣＡＣ ＧＡＴ ＧＴＣ ＧＣＡ ６７２Ｇｌｕ Ｐ
ｒｏ Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌ
ｙ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｈｉｓ Ａｓｐ
Ｖａｌ Ａｌａ ２１０
２１５
２２０ＣＴＣ ＡＴＴ ＧＡＡ ＧＧＡ ＧＴＣ
ＧＣＧ ＧＣＡ ＣＴＧ ＴＧＣ ＡＡＧ ＡＡＧ Ｃ
ＡＣ ＧＡＴ ＣＧＴ ＴＴＣ ＴＴＧ ７２０Ｌｅ
ｕ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ａｌａ Ａｌａ
Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｈｉｓ Ａｓｐ
Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｌｅｕ２２５
２３０
２３５ ２４０Ａ
ＴＣ ＧＴＣ ＧＡＴ ＧＡＡ ＡＴＴ ＧＣＣ ＡＣ
Ｃ ＧＧＴ ＴＴＣ ＧＧＣ ＣＧＣ ＡＣＣ ＧＧＴ
ＧＡＡ ＣＴＡ ＴＴＴ ７６８Ｉｌｅ Ｖａｌ
Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｐ
ｈｅ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｌｅ
ｕ Ｐｈｅ ２４５
２５０
２５５ＧＣＣ ＡＣＧ ＴＴＡ
ＡＧＣ ＡＡＴ ＧＧＣ ＧＴＡ ＣＡＡ ＣＣＡ
ＧＡＣ ＡＴＣ ＡＴＧ ＴＧＴ ＧＴＧ ＧＧＣ Ａ
ＡＧ ８１６Ａｌａ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ａｓ
ｎ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｉｌｅ
Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｌｙｓ
２６０
２６５ ２７０
ＧＣＣ ＣＴＣ ＡＣＣ ＧＧＴ ＧＧＡ ＴＴＣ Ａ
ＴＧ ＴＣＴ ＴＴＴ ＧＣＣ ＧＣＣ ＡＣＴ ＧＴ
Ａ ＴＧＣ ＡＣＧ ＧＡＣ ８６４Ａｌａ Ｌｅｕ
Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｍｅｔ Ｓｅｒ
Ｐｈｅ Ａｌａ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｃｙｓ Ｔ
ｈｒ Ａｓｐ ２７５
２８０
２８５ＡＡＧ ＧＴＧ ＧＣＴ ＣＡＡ ＴＴ
Ｇ ＡＴＣ ＡＧＡ ＴＣＣ ＣＣＡ ＧＡＡ ＧＧＣ
ＧＧＡ ＧＧＴ ＧＴＧ ＣＴＧ ＡＴＧ ９１２
Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ａ
ｒｇ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌ
ｙ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｍｅｔ ２９０
２９５
３００ＣＡＴ ＧＧＣ ＣＣＣ ＡＣＣ
ＴＴＴ ＡＴＧ ＧＣＴ ＡＡＴ ＣＣＴ ＣＴＧ
ＧＣＣ ＴＧＴ ＧＡＧ ＧＴＴ ＴＣＧ ＣＡＣ
９６０Ｈｉｓ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｍｅ
ｔ Ａｌａ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｃｙｓ
Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｈｉｓ３０５
３１０
３１５
３２０ＧＣＴ ＴＣＧ ＣＴＡ ＧＡＡ ＡＴＣ Ａ
ＴＴ ＧＡＧ ＡＣＣ ＧＧＣ ＡＴＧ ＴＧＧ ＣＡ
Ｇ ＡＡＡ ＣＡＧ ＧＴＴ ＡＡＡ １００８Ａｌａ
Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ｇｌｕ
Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ｔｒｐ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｇ
ｌｎ Ｖａｌ Ｌｙｓ
３２５ ３３０
３３５ＡＡＡ ＡＴ
Ｃ ＧＡＡ ＧＣＣ ＡＡＡ ＣＴＴ ＡＴＣ ＧＣＡ
ＧＧＣ ＣＴＴ ＴＣＣ ＣＣＡ ＣＴＴ ＣＧＡ
ＴＧＴ ＡＴＴ １０５６Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ａ
ｌａ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｌｅ
ｕ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｉｌｅ
３４０
３４５
３５０ＣＣＡ ＧＧＡ ＧＴＴ ＧＣＣ ＧＡＴ
ＧＴＣ ＣＧＧ ＧＴＴ ＣＴＣ ＧＧＣ ＧＣＧ Ａ
ＴＴ ＧＧＣ ＧＴＣ ＡＴＣ ＧＡＡ １１０４Ｐｒ
ｏ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ａｌａ Ａｓｐ Ｖａｌ Ａｒｇ
Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｇｌｙ
Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｇｌｕ ３５５
３６０
３６５ＡＴＧ ＧＡＡ ＣＡＡ Ａ
ＡＴ ＧＴＧ ＡＡＴ ＧＴＣ ＧＡＡ ＧＡＡ ＧＣ
Ｃ ＡＣＴ ＣＡＧ ＧＣＴ ＧＣＡ ＴＴＡ ＧＡＴ
１１５２Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｖａｌ
Ａｓｎ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｇ
ｌｎ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｓｐ ３７０
３７５
３８０ ＣＡＣ ＧＧＴ
ＧＴＧ ＴＧＧ ＡＴＣ ＣＧＣ ＣＣＣ ＴＴＴ Ｇ
ＧＡ ＣＧＣ ＴＴＧ ＣＴＣ ＴＡＴ ＧＴＣ ＡＴ
Ｇ ＣＣＣ １２００Ｈｉｓ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｔｒｐ
Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ａｒｇ
Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ｍｅｔ Ｐｒｏ３８
５ ３９０
３９５
４００ＣＣＡ ＴＡＴ ＡＴＣ ＡＣ
Ｃ ＡＣＧ ＴＣＡ ＧＡＧ ＣＡＡ ＴＧＣ ＧＣＡ
ＣＡＧ ＡＴＣ ＴＧＣ ＣＧＣ ＧＣＧ ＣＴＴ
１２４８Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｓ
ｅｒ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｉｌ
ｅ Ｃｙｓ Ａｒｇ Ａｌａ Ｌｅｕ
４０５
４１０ ４１
５ＣＡＴ ＧＣＴ ＧＣＡ ＧＴＴ ＡＡＡ ＧＧＡ
ＡＡＡ ＴＡＡ
１２７２Ｈｉｓ Ａｌ
ａ Ａｌａ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｌｙｓ
４２０
配列番号：２ＡＴＧ ＣＣＡ ＴＴＴ ＴＴＡ
ＴＴＴ ＧＴＣ ＡＧＣ ＧＧＣ ＡＣＣ ＧＧＡ Ａ
ＣＣ ＧＧＧ ＧＴＴ ＧＧＡ ＡＡＧ ＡＣＣ
４８Ｍｅｔ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｖａｌ
Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｇｌｙ
Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｔｈｒ １
５
１０ １５ＴＴ
Ｃ ＴＣＣ ＡＣＡ ＧＣＣ ＧＴＴ ＴＴＧ ＧＴＴ
ＣＧＴ ＴＡＣ ＴＴＡ ＧＣＣ ＧＡＴ ＣＡＡ
ＧＧＡ ＣＡＣ ＧＡＴ ９６Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｔ
ｈｒ Ａｌａ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｔｙ
ｒ Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｈｉｓ
Ａｓｐ ２０
２５
３０ＧＴＴ ＣＴＧ ＣＣＣ ＧＴＡ
ＡＡＧ ＣＴＣ ＧＴＣ ＣＡＡ ＡＣＡ ＧＧＴ Ｇ
ＡＡ ＣＴＴ ＣＣＡ ＧＧＣ ＧＡＡ ＧＧＡ １
４４Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｌｅｕ
Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｌｅｕ
Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｇｌｙ ３
５ ４０
４５ＧＡＣ ＡＴＣ Ｔ
ＴＣ ＡＣＣ ＡＴＴ ＧＡＡ ＣＧＣ ＴＴＧ ＡＣ
Ｔ ＧＧＡ ＡＴＴ ＧＣＴ ＧＧＡ ＧＡＧ ＧＡＡ
ＴＴＴ １９２Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｔｈｒ
Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｉ
ｌｅ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｐｈｅ
５０ ５５
６０ＧＣＴ ＣＧ
Ｔ ＴＴＣ ＡＡＡ ＧＡＣ ＣＣＴ ＣＴＴ ＧＣＧ
ＣＣＡ ＡＡＴ ＣＴＧ ＧＣＡ ＧＣＣ ＣＧＡ
ＣＧＡ ＧＡＧ ２４０Ａｌａ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｌ
ｙｓ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｓ
ｎ Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｌａ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｇｌｕ
６５ ７０
７５
８０ＧＧＧ ＡＴＣ ＧＡＧ
ＣＣＡ ＡＴＡ ＣＡＧ ＴＴＴ ＧＡＴ ＣＡＧ Ａ
ＴＴ ＡＴＣ ＴＣＧ ＴＧＧ ＣＴＴ ＣＧＴ ＧＧ
Ｔ ２８８Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｉｌｅ
Ｇｌｎ Ｐｈｅ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｉｌｅ
Ｓｅｒ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｇｌｙ
８５
９０
９５ＴＴＴ ＧＡＣ ＧＡＣ ＣＣＡ ＧＡＴ ＣＧ
Ｃ ＡＴＣ ＡＴＴ ＧＴＧ ＧＴＧ ＧＡＧ ＧＧＣ
ＧＣＴ ＧＧＴ ＧＧＣ ＣＴＧ ３３６Ｐｈｅ
Ａｓｐ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｉ
ｌｅ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌ
ｙ Ｇｌｙ Ｌｅｕ １００
１０５
１１０ＣＴＧ ＧＴＣ ＡＧＡ
ＴＴＡ ＧＧＧ ＧＡＡ ＧＡＴ ＴＴＣ ＡＣＣ
ＣＴＧ ＧＣＡ ＧＡＴ ＧＴＴ ＧＣＣ ＴＣＣ Ｇ
ＣＴ ３８４Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｇｌ
ｙ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ａｌａ
Ａｓｐ Ｖａｌ Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｌａ
１１５ １２
０ １２５ＴＴＧ
ＡＡＴ ＧＣＡ ＣＣＣ ＴＴＡ ＧＴＧ ＡＴＴ Ｔ
ＧＧ ＡＣＡ ＡＧＣ ＡＣＣ ＧＧＡ ＴＴＧ ＧＧ
Ａ ＡＧＣ ＣＴＣ ４３２Ｌｅｕ Ａｓｎ Ａｌａ
Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｔｈｒ
Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｌ
ｅｕ １３０
１３５ １４０Ａ
ＡＣ ＧＣＴ ＧＣＴ ＧＡＡ ＴＴＡ ＡＧＣ ＧＴ
Ｔ ＧＡＧ ＧＣＡ ＧＣＡ ＡＡＣ ＣＧＣ ＣＧＡ
ＧＧＡ ＣＴＣ ＡＣＡ ４８０Ａｓｎ Ａｌａ
Ａｌａ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ａ
ｌａ Ａｌａ Ａｓｎ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｌｅ
ｕ Ｔｈｒ１４５
１５０ １５５
１６０ＧＴＧ ＴＴＧ
ＧＧＡ ＧＴＣ ＣＴＣ ＧＧＣ ＧＧＴ ＴＣＧ
ＡＴＣ ＣＣＴ ＣＡＡ ＡＡＴ ＣＣＴ ＧＡＴ Ｃ
ＴＡ ＧＣＴ ５２８Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｖａ
ｌ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｐｒｏ
Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｌａ
１６５
１７０
１７５ＡＣＧ ＡＴＧ ＣＴＴ ＡＡＴ Ｃ
ＴＣ ＧＡＡ ＧＡＡ ＴＴＴ ＧＡＧ ＡＧＡ ＧＴ
Ｃ ＡＣＣ ＧＧＣ ＧＴＧ ＣＣＣ ＴＴＴ ５７
６Ｔｈｒ Ｍｅｔ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｇｌｕ
Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｇ
ｌｙ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｐｈｅ
１８０ １８５
１９０ＴＧＧ ＧＧ
Ａ ＧＣＴ ＴＴＧ ＣＣＧ ＧＡＡ ＧＧＧ ＴＴＧ
ＴＣＡ ＣＧＧ ＧＴＧ ＧＡＧ ＧＧＧ ＴＴＣ
ＧＴＣ ＧＡＡ ６２４Ｔｒｐ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｌ
ｅｕ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ａｒ
ｇ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｇｌｕ
１９５
２００ ２０
５ ＡＡＧ ＣＡＡ
ＴＣＴ ＴＴＴ ＣＣＧ ＧＣＣ ＣＴＴ ＧＡＴ Ｇ
ＣＣ ＴＴＴ ＡＡＧ ＡＡＡ ＣＣＧ ＣＣＧ ＧＣ
Ａ ＡＧＧ ６７２Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｐｈｅ
Ｐｒｏ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｌａ Ｐｈｅ
Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ａｌａ Ａｒｇ
２１０ ２１５
２２０
ＴＧＡ
６７５ 上記の塩基配列を包含して成る本発明のジアミノペ
ラルゴン酸アミノトランスフエラーゼ及び／又はデスチ
オビオチンシンセターゼをコードする遺伝子を含むＤＮ
Ａ断片は、天然のコリネ型細菌染色体ＤＮＡから分離さ
れたもののみならず、通常用いられるＤＮＡ合成装置、
例えばベツクマン社製Ｓｙｓｔｅｍ−１Ｐｌｕｓを用い
て合成されたものであつてもよい。
グフレームの存在から決定されたジアミノペラルゴン酸
アミノトランスフエラーゼをコードする遺伝子（ｂｉｏ
Ａ）は、次の配列番号１で示される配列を有する４２３
のアミノ酸をコードする１２６９の塩基対より構成され
、またデスチオビオチンシンセターゼをコードする遺伝
子（ｂｉｏＤ）は、次の配列番号２で示される配列を有
する２２４のアミノ酸をコードする６７２の塩基対より
構成される：
配列番号：１ＡＴＧ ＧＡＡ ＡＡＣ ＣＣＣ
ＡＧＣ ＴＴＧ ＣＧＣ ＧＡＧ ＣＴＴ ＧＡＴ Ｃ
ＡＣ ＣＧＡ ＡＡＣ ＡＴＣ ＴＧＧ ＣＡＣ
４８Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｌｅｕ
Ａｒｇ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｈｉｓ Ａｒｇ
Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｈｉｓ １
５
１０ １５Ｃ
ＣＧ ＴＡＴ ＧＣＣ ＧＣＧ ＣＣＧ ＧＧＣ ＧＴ
Ｇ ＣＧＣ ＡＡＣ ＡＧＡ ＣＴＣ ＧＴＣ ＡＣＣ
ＡＡＣ ＡＣＴ ＧＡＴ ９６Ｐｒｏ Ｔｙｒ
Ａｌａ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ａｒｇ Ａ
ｓｎ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｔｈ
ｒ Ａｓｐ ２０
２５
３０ＧＧＧ ＧＴＧ ＴＴＣ ＴＴＧ
ＡＣＧ ＣＴＧ ＧＡＡ ＧＡＴ ＧＧＣ ＡＧＣ
ＡＣＣ ＧＴＧ ＡＴＴ ＧＡＣ ＧＣＧ ＡＴＧ
１４４Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｌｅ
ｕ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｖａｌ
Ｉｌｅ Ａｓｐ Ａｌａ Ｍｅｔ
３５ ４０
４５ＡＧＣ ＴＣＣ
ＴＧＧ ＴＧＧ ＴＣＧ ＧＣＡ ＡＴＴ ＣＡＴ Ｇ
ＧＡ ＣＡＣ ＧＧＡ ＣＡＣ ＣＣＣ ＣＧＡ ＣＴ
Ｇ ＡＡＡ １９２Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｔｒｐ Ｔｒｐ
Ｓｅｒ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｈｉｓ Ｇｌｙ Ｈｉｓ
Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｌｙｓ
５０ ５５
６０ＣＧＴ Ｇ
ＣＣ ＧＣＣ ＣＡＡ ＡＡＡ ＣＡＡ ＡＴＣ ＧＡ
Ｃ ＡＣＣ ＡＴＧ ＡＧＴ ＣＡＣ ＧＴＣ ＡＴＧ
ＴＴＣ ＧＧＣ ２４０Ａｒｇ Ａｌａ Ａｌａ
Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｍ
ｅｔ Ｓｅｒ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ｍｅｔ Ｐｈｅ Ｇｌ
ｙ ６５ ７０
７５
８０ＧＧＡ ＣＴＡ ＡＣＣ
ＣＡＣ ＧＡＧ ＣＣＣ ＧＣＣ ＡＴＴ ＡＡＧ
ＣＴＣ ＡＣＣ ＣＡＣ ＡＡＡ ＣＴＣ ＣＴＣ Ａ
ＡＴ ２８８Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ｇｌ
ｕ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｔｈｒ
Ｈｉｓ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｓｎ
８５
９０
９５ＣＴＣ ＡＣＴ ＧＧＣ ＡＡＴ ＧＣＣ Ｔ
ＴＴ ＧＡＣ ＣＡＣ ＧＴＣ ＴＴＴ ＴＡＴ ＴＣ
Ｃ ＧＡＴ ＴＣＧ ＧＧＣ ＴＣＧ ３３６Ｌｅｕ
Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ａｌａ Ｐｈｅ Ａｓｐ
Ｈｉｓ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｓ
ｅｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ １００
１０５
１１０ＧＴＣ ＴＣＧ ＧＴ
Ｇ ＧＡＧ ＧＴＣ ＧＣＣ ＡＴＣ ＡＡＡ ＡＴＧ
ＧＣＡ ＣＴＧ ＣＡＧ ＧＣＣ ＴＣＣ ＡＡＡ
ＧＧＡ ３８４Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｖ
ａｌ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ａｌａ Ｌｅ
ｕ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｇｌｙ
１１５ １
２０ １２５ＣＡＡ
ＧＧＣ ＣＡＣ ＣＣＧ ＧＡＡ ＣＧＣ ＡＣＡ
ＡＡＡ ＣＴＣ ＣＴＣ ＡＣＣ ＴＧＧ ＣＧＧ Ｔ
ＣＣ ＧＧＣ ＴＡＣ ４３２Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｈｉ
ｓ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｌｅｕ
Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｔｒｐ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｇｌｙ
Ｔｙｒ １３０
１３５ １４０
ＣＡＣ ＧＧＡ ＧＡＣ ＡＣＡ ＴＴＣ ＡＣＣ Ｇ
ＣＧ ＡＴＧ ＡＧＣ ＧＴＧ ＴＧＣ ＧＡＣ ＣＣ
Ａ ＧＡＡ ＡＡＴ ＧＧＣ ４８０Ｈｉｓ Ｇｌｙ
Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｍｅｔ
Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｃｙｓ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ａ
ｓｎ Ｇｌｙ１４５
１５０ １５５
１６０ＡＴＧ ＣＡ
Ｔ ＡＧＣ ＣＴＣ ＴＧＧ ＡＡＡ ＧＧＣ ＡＣＡ
ＣＴＣ ＣＣＣ ＧＡＧ ＣＡＧ ＡＴＴ ＴＴＣ
ＧＣＣ ＣＣＣ ５２８Ｍｅｔ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｌ
ｅｕ Ｔｒｐ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｐｒ
ｏ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｐｒｏ
１６５
１７０
１７５ＧＣＣ ＣＣＡ ＣＣＡ ＧＴＴ
ＣＧＧ ＧＧＧ ＴＣＡ ＴＣＧ ＣＣＧ ＣＡＧ Ｇ
ＣＡ ＡＴＴ ＴＣＣ ＧＡＧ ＴＡＣ ＣＴＧ ５
７６Ａｌａ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｇｌｙ
Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｉｌｅ
Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｔｙｒ Ｌｅｕ
１８０ １８５
１９０ＣＡＣ Ａ
ＧＣ ＡＴＧ ＧＡＡ ＴＴＧ ＣＴＴ ＡＴＣ ＧＡ
Ｃ ＧＡＧ ＡＣＣ ＧＴＣ ＴＣＣ ＧＣＡ ＡＴＣ
ＡＴＣ ＡＴＣ ６２４Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｍｅｔ
Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｔ
ｈｒ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ｉｌ
ｅ １９５
２００ ２
０５ＧＡＡ ＣＣＧ ＡＴＣ ＧＴＣ ＣＡＡ ＧＧＣ
ＧＣＴ ＧＧＡ ＧＧＣ ＡＴＧ ＣＧＣ ＴＴＴ
ＣＡＣ ＧＡＴ ＧＴＣ ＧＣＡ ６７２Ｇｌｕ Ｐ
ｒｏ Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌ
ｙ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｈｉｓ Ａｓｐ
Ｖａｌ Ａｌａ ２１０
２１５
２２０ＣＴＣ ＡＴＴ ＧＡＡ ＧＧＡ ＧＴＣ
ＧＣＧ ＧＣＡ ＣＴＧ ＴＧＣ ＡＡＧ ＡＡＧ Ｃ
ＡＣ ＧＡＴ ＣＧＴ ＴＴＣ ＴＴＧ ７２０Ｌｅ
ｕ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ａｌａ Ａｌａ
Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｈｉｓ Ａｓｐ
Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｌｅｕ２２５
２３０
２３５ ２４０Ａ
ＴＣ ＧＴＣ ＧＡＴ ＧＡＡ ＡＴＴ ＧＣＣ ＡＣ
Ｃ ＧＧＴ ＴＴＣ ＧＧＣ ＣＧＣ ＡＣＣ ＧＧＴ
ＧＡＡ ＣＴＡ ＴＴＴ ７６８Ｉｌｅ Ｖａｌ
Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｐ
ｈｅ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｌｅ
ｕ Ｐｈｅ ２４５
２５０
２５５ＧＣＣ ＡＣＧ ＴＴＡ
ＡＧＣ ＡＡＴ ＧＧＣ ＧＴＡ ＣＡＡ ＣＣＡ
ＧＡＣ ＡＴＣ ＡＴＧ ＴＧＴ ＧＴＧ ＧＧＣ Ａ
ＡＧ ８１６Ａｌａ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ａｓ
ｎ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｉｌｅ
Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｌｙｓ
２６０
２６５ ２７０
ＧＣＣ ＣＴＣ ＡＣＣ ＧＧＴ ＧＧＡ ＴＴＣ Ａ
ＴＧ ＴＣＴ ＴＴＴ ＧＣＣ ＧＣＣ ＡＣＴ ＧＴ
Ａ ＴＧＣ ＡＣＧ ＧＡＣ ８６４Ａｌａ Ｌｅｕ
Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｍｅｔ Ｓｅｒ
Ｐｈｅ Ａｌａ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｃｙｓ Ｔ
ｈｒ Ａｓｐ ２７５
２８０
２８５ＡＡＧ ＧＴＧ ＧＣＴ ＣＡＡ ＴＴ
Ｇ ＡＴＣ ＡＧＡ ＴＣＣ ＣＣＡ ＧＡＡ ＧＧＣ
ＧＧＡ ＧＧＴ ＧＴＧ ＣＴＧ ＡＴＧ ９１２
Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ａ
ｒｇ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌ
ｙ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｍｅｔ ２９０
２９５
３００ＣＡＴ ＧＧＣ ＣＣＣ ＡＣＣ
ＴＴＴ ＡＴＧ ＧＣＴ ＡＡＴ ＣＣＴ ＣＴＧ
ＧＣＣ ＴＧＴ ＧＡＧ ＧＴＴ ＴＣＧ ＣＡＣ
９６０Ｈｉｓ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｍｅ
ｔ Ａｌａ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｃｙｓ
Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｈｉｓ３０５
３１０
３１５
３２０ＧＣＴ ＴＣＧ ＣＴＡ ＧＡＡ ＡＴＣ Ａ
ＴＴ ＧＡＧ ＡＣＣ ＧＧＣ ＡＴＧ ＴＧＧ ＣＡ
Ｇ ＡＡＡ ＣＡＧ ＧＴＴ ＡＡＡ １００８Ａｌａ
Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ｇｌｕ
Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ｔｒｐ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｇ
ｌｎ Ｖａｌ Ｌｙｓ
３２５ ３３０
３３５ＡＡＡ ＡＴ
Ｃ ＧＡＡ ＧＣＣ ＡＡＡ ＣＴＴ ＡＴＣ ＧＣＡ
ＧＧＣ ＣＴＴ ＴＣＣ ＣＣＡ ＣＴＴ ＣＧＡ
ＴＧＴ ＡＴＴ １０５６Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ａ
ｌａ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｌｅ
ｕ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｉｌｅ
３４０
３４５
３５０ＣＣＡ ＧＧＡ ＧＴＴ ＧＣＣ ＧＡＴ
ＧＴＣ ＣＧＧ ＧＴＴ ＣＴＣ ＧＧＣ ＧＣＧ Ａ
ＴＴ ＧＧＣ ＧＴＣ ＡＴＣ ＧＡＡ １１０４Ｐｒ
ｏ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ａｌａ Ａｓｐ Ｖａｌ Ａｒｇ
Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｇｌｙ
Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｇｌｕ ３５５
３６０
３６５ＡＴＧ ＧＡＡ ＣＡＡ Ａ
ＡＴ ＧＴＧ ＡＡＴ ＧＴＣ ＧＡＡ ＧＡＡ ＧＣ
Ｃ ＡＣＴ ＣＡＧ ＧＣＴ ＧＣＡ ＴＴＡ ＧＡＴ
１１５２Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｖａｌ
Ａｓｎ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｇ
ｌｎ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｓｐ ３７０
３７５
３８０ ＣＡＣ ＧＧＴ
ＧＴＧ ＴＧＧ ＡＴＣ ＣＧＣ ＣＣＣ ＴＴＴ Ｇ
ＧＡ ＣＧＣ ＴＴＧ ＣＴＣ ＴＡＴ ＧＴＣ ＡＴ
Ｇ ＣＣＣ １２００Ｈｉｓ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｔｒｐ
Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ａｒｇ
Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ｍｅｔ Ｐｒｏ３８
５ ３９０
３９５
４００ＣＣＡ ＴＡＴ ＡＴＣ ＡＣ
Ｃ ＡＣＧ ＴＣＡ ＧＡＧ ＣＡＡ ＴＧＣ ＧＣＡ
ＣＡＧ ＡＴＣ ＴＧＣ ＣＧＣ ＧＣＧ ＣＴＴ
１２４８Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｓ
ｅｒ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｉｌ
ｅ Ｃｙｓ Ａｒｇ Ａｌａ Ｌｅｕ
４０５
４１０ ４１
５ＣＡＴ ＧＣＴ ＧＣＡ ＧＴＴ ＡＡＡ ＧＧＡ
ＡＡＡ ＴＡＡ
１２７２Ｈｉｓ Ａｌ
ａ Ａｌａ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｌｙｓ
４２０
配列番号：２ＡＴＧ ＣＣＡ ＴＴＴ ＴＴＡ
ＴＴＴ ＧＴＣ ＡＧＣ ＧＧＣ ＡＣＣ ＧＧＡ Ａ
ＣＣ ＧＧＧ ＧＴＴ ＧＧＡ ＡＡＧ ＡＣＣ
４８Ｍｅｔ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｖａｌ
Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｇｌｙ
Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｔｈｒ １
５
１０ １５ＴＴ
Ｃ ＴＣＣ ＡＣＡ ＧＣＣ ＧＴＴ ＴＴＧ ＧＴＴ
ＣＧＴ ＴＡＣ ＴＴＡ ＧＣＣ ＧＡＴ ＣＡＡ
ＧＧＡ ＣＡＣ ＧＡＴ ９６Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｔ
ｈｒ Ａｌａ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｔｙ
ｒ Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｈｉｓ
Ａｓｐ ２０
２５
３０ＧＴＴ ＣＴＧ ＣＣＣ ＧＴＡ
ＡＡＧ ＣＴＣ ＧＴＣ ＣＡＡ ＡＣＡ ＧＧＴ Ｇ
ＡＡ ＣＴＴ ＣＣＡ ＧＧＣ ＧＡＡ ＧＧＡ １
４４Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｌｅｕ
Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｌｅｕ
Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｇｌｙ ３
５ ４０
４５ＧＡＣ ＡＴＣ Ｔ
ＴＣ ＡＣＣ ＡＴＴ ＧＡＡ ＣＧＣ ＴＴＧ ＡＣ
Ｔ ＧＧＡ ＡＴＴ ＧＣＴ ＧＧＡ ＧＡＧ ＧＡＡ
ＴＴＴ １９２Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｔｈｒ
Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｉ
ｌｅ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｐｈｅ
５０ ５５
６０ＧＣＴ ＣＧ
Ｔ ＴＴＣ ＡＡＡ ＧＡＣ ＣＣＴ ＣＴＴ ＧＣＧ
ＣＣＡ ＡＡＴ ＣＴＧ ＧＣＡ ＧＣＣ ＣＧＡ
ＣＧＡ ＧＡＧ ２４０Ａｌａ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｌ
ｙｓ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｓ
ｎ Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｌａ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｇｌｕ
６５ ７０
７５
８０ＧＧＧ ＡＴＣ ＧＡＧ
ＣＣＡ ＡＴＡ ＣＡＧ ＴＴＴ ＧＡＴ ＣＡＧ Ａ
ＴＴ ＡＴＣ ＴＣＧ ＴＧＧ ＣＴＴ ＣＧＴ ＧＧ
Ｔ ２８８Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｉｌｅ
Ｇｌｎ Ｐｈｅ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｉｌｅ
Ｓｅｒ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｇｌｙ
８５
９０
９５ＴＴＴ ＧＡＣ ＧＡＣ ＣＣＡ ＧＡＴ ＣＧ
Ｃ ＡＴＣ ＡＴＴ ＧＴＧ ＧＴＧ ＧＡＧ ＧＧＣ
ＧＣＴ ＧＧＴ ＧＧＣ ＣＴＧ ３３６Ｐｈｅ
Ａｓｐ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｉ
ｌｅ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌ
ｙ Ｇｌｙ Ｌｅｕ １００
１０５
１１０ＣＴＧ ＧＴＣ ＡＧＡ
ＴＴＡ ＧＧＧ ＧＡＡ ＧＡＴ ＴＴＣ ＡＣＣ
ＣＴＧ ＧＣＡ ＧＡＴ ＧＴＴ ＧＣＣ ＴＣＣ Ｇ
ＣＴ ３８４Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｇｌ
ｙ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ａｌａ
Ａｓｐ Ｖａｌ Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｌａ
１１５ １２
０ １２５ＴＴＧ
ＡＡＴ ＧＣＡ ＣＣＣ ＴＴＡ ＧＴＧ ＡＴＴ Ｔ
ＧＧ ＡＣＡ ＡＧＣ ＡＣＣ ＧＧＡ ＴＴＧ ＧＧ
Ａ ＡＧＣ ＣＴＣ ４３２Ｌｅｕ Ａｓｎ Ａｌａ
Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｔｈｒ
Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｌ
ｅｕ １３０
１３５ １４０Ａ
ＡＣ ＧＣＴ ＧＣＴ ＧＡＡ ＴＴＡ ＡＧＣ ＧＴ
Ｔ ＧＡＧ ＧＣＡ ＧＣＡ ＡＡＣ ＣＧＣ ＣＧＡ
ＧＧＡ ＣＴＣ ＡＣＡ ４８０Ａｓｎ Ａｌａ
Ａｌａ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ａ
ｌａ Ａｌａ Ａｓｎ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｌｅ
ｕ Ｔｈｒ１４５
１５０ １５５
１６０ＧＴＧ ＴＴＧ
ＧＧＡ ＧＴＣ ＣＴＣ ＧＧＣ ＧＧＴ ＴＣＧ
ＡＴＣ ＣＣＴ ＣＡＡ ＡＡＴ ＣＣＴ ＧＡＴ Ｃ
ＴＡ ＧＣＴ ５２８Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｖａ
ｌ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｐｒｏ
Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｌａ
１６５
１７０
１７５ＡＣＧ ＡＴＧ ＣＴＴ ＡＡＴ Ｃ
ＴＣ ＧＡＡ ＧＡＡ ＴＴＴ ＧＡＧ ＡＧＡ ＧＴ
Ｃ ＡＣＣ ＧＧＣ ＧＴＧ ＣＣＣ ＴＴＴ ５７
６Ｔｈｒ Ｍｅｔ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｇｌｕ
Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｇ
ｌｙ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｐｈｅ
１８０ １８５
１９０ＴＧＧ ＧＧ
Ａ ＧＣＴ ＴＴＧ ＣＣＧ ＧＡＡ ＧＧＧ ＴＴＧ
ＴＣＡ ＣＧＧ ＧＴＧ ＧＡＧ ＧＧＧ ＴＴＣ
ＧＴＣ ＧＡＡ ６２４Ｔｒｐ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｌ
ｅｕ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ａｒ
ｇ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｇｌｕ
１９５
２００ ２０
５ ＡＡＧ ＣＡＡ
ＴＣＴ ＴＴＴ ＣＣＧ ＧＣＣ ＣＴＴ ＧＡＴ Ｇ
ＣＣ ＴＴＴ ＡＡＧ ＡＡＡ ＣＣＧ ＣＣＧ ＧＣ
Ａ ＡＧＧ ６７２Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｐｈｅ
Ｐｒｏ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｌａ Ｐｈｅ
Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ａｌａ Ａｒｇ
２１０ ２１５
２２０
ＴＧＡ
６７５ 上記の塩基配列を包含して成る本発明のジアミノペ
ラルゴン酸アミノトランスフエラーゼ及び／又はデスチ
オビオチンシンセターゼをコードする遺伝子を含むＤＮ
Ａ断片は、天然のコリネ型細菌染色体ＤＮＡから分離さ
れたもののみならず、通常用いられるＤＮＡ合成装置、
例えばベツクマン社製Ｓｙｓｔｅｍ−１Ｐｌｕｓを用い
て合成されたものであつてもよい。
【００３２】また前記の如くブレビバクテリウム・フラ
バムＭＪ−２３３の染色体ＤＮＡから取得される本発明
のＤＮＡ断片は、ジアミノペラルゴン酸アミノトランス
フエラーゼ及び／又はデスチオビオチンシンセターゼを
コードする機能を実質的に損なうことがない限り、塩基
配列の一部の塩基が他の塩基と置換されていてもよく又
は削除されていてもよく、或いは新たに塩基が挿入され
ていてもよく、さらに塩基配列の一部が転位されている
ものであつてもよく、これらの誘導体のいずれもが、本
発明のｂｉｏＡｂｉｏＤ断片に包含される。
バムＭＪ−２３３の染色体ＤＮＡから取得される本発明
のＤＮＡ断片は、ジアミノペラルゴン酸アミノトランス
フエラーゼ及び／又はデスチオビオチンシンセターゼを
コードする機能を実質的に損なうことがない限り、塩基
配列の一部の塩基が他の塩基と置換されていてもよく又
は削除されていてもよく、或いは新たに塩基が挿入され
ていてもよく、さらに塩基配列の一部が転位されている
ものであつてもよく、これらの誘導体のいずれもが、本
発明のｂｉｏＡｂｉｏＤ断片に包含される。
【００３３】本発明のｂｉｏＡ ｂｉｏＤ断片は、コリ
ネ型細菌でプラスミドの複製増殖機能を司る遺伝子を少
くとも含むプラスミドベクターに導入することにより、
コリネ型細菌でジアミノペラルゴン酸アミノトランスフ
エラーゼ及び／又はデスチオビオチンシンセターゼの高
発現可能な組換えプラスミドを得ることができる。
ネ型細菌でプラスミドの複製増殖機能を司る遺伝子を少
くとも含むプラスミドベクターに導入することにより、
コリネ型細菌でジアミノペラルゴン酸アミノトランスフ
エラーゼ及び／又はデスチオビオチンシンセターゼの高
発現可能な組換えプラスミドを得ることができる。
【００３４】本発明のｂｉｏＡ ｂｉｏＤ断片を導入す
ることができる、コリネ型細菌内での複製増殖機能を司
る遺伝子を少くとも含むプラスミドベクターとしては、
特願平２−４２１２号明細書に開示されているプラスミ
ドｐＣＲＹ３０；特願平２−２７６５７５号公報に記載
されているプラスミドｐＣＲＹ２１、ｐＣＲＹ２ＫＥ、
ｐＣＲＹ２ＫＸ、ｐＣＲＹ３Ｋ７、ｐＣＲＹ３ＫＥ、ｐ
ＣＲＹ３ＫＸ；特願平１−１９１６８６号公報に記載さ
れているプラスミドｐＣＲＹ２及びｐＣＲＹ３；特開昭
５８−６７６７９号公報に記載のｐＡＭ３３０；特開昭
５８−７７８９５号公報に記載のｐＨＭ１５１９；特開
昭５８−１９２９００号公報に記載のｐＡＪ６５５、ｐ
ＡＪ６１１及びｐＡＪ１８４４；特開昭５７−１３４５
００号に記載のｐＣＧ１；特開昭５８−３５１９７号公
報に記載のｐＣＧ２；特開昭５７−１８３７９９号公報
に記載のｐＣＧ４及びｐＣＧ１１等を挙げることができ
る。
ることができる、コリネ型細菌内での複製増殖機能を司
る遺伝子を少くとも含むプラスミドベクターとしては、
特願平２−４２１２号明細書に開示されているプラスミ
ドｐＣＲＹ３０；特願平２−２７６５７５号公報に記載
されているプラスミドｐＣＲＹ２１、ｐＣＲＹ２ＫＥ、
ｐＣＲＹ２ＫＸ、ｐＣＲＹ３Ｋ７、ｐＣＲＹ３ＫＥ、ｐ
ＣＲＹ３ＫＸ；特願平１−１９１６８６号公報に記載さ
れているプラスミドｐＣＲＹ２及びｐＣＲＹ３；特開昭
５８−６７６７９号公報に記載のｐＡＭ３３０；特開昭
５８−７７８９５号公報に記載のｐＨＭ１５１９；特開
昭５８−１９２９００号公報に記載のｐＡＪ６５５、ｐ
ＡＪ６１１及びｐＡＪ１８４４；特開昭５７−１３４５
００号に記載のｐＣＧ１；特開昭５８−３５１９７号公
報に記載のｐＣＧ２；特開昭５７−１８３７９９号公報
に記載のｐＣＧ４及びｐＣＧ１１等を挙げることができ
る。
【００３５】これらの中でもコリネ型細菌の宿主ベクタ
ー系で用いられるプラスミドベクターとしては、コリネ
型細菌内でプラスミドの複製増殖機能を司る遺伝子とコ
リネ型細菌内でプラスミドの安定化機能を司る遺伝子と
をもつものが好ましく、例えばプラスミドｐＣＲＹ３０
、ｐＣＲＹ２１、ｐＣＲＹ２ＫＥ、ｐＣＲＹ２ＫＥ、ｐ
ＣＲＹ２ＫＸ、ｐＣＲＹ３Ｋ７、ｐＣＲＹ３ＫＥ、ｐＣ
ＲＹ３ＫＸが好適に使用される。
ー系で用いられるプラスミドベクターとしては、コリネ
型細菌内でプラスミドの複製増殖機能を司る遺伝子とコ
リネ型細菌内でプラスミドの安定化機能を司る遺伝子と
をもつものが好ましく、例えばプラスミドｐＣＲＹ３０
、ｐＣＲＹ２１、ｐＣＲＹ２ＫＥ、ｐＣＲＹ２ＫＥ、ｐ
ＣＲＹ２ＫＸ、ｐＣＲＹ３Ｋ７、ｐＣＲＹ３ＫＥ、ｐＣ
ＲＹ３ＫＸが好適に使用される。
【００３６】上記プラスミドベクターｐＣＲＹ３０を調
製する方法としては、ブレビバクテリウム・スタチオニ
ス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｔａｔｉｏｎｉ
ｓ）ＩＦ０１２１４４（ＦＥＲＭ ＢＰ−２５１５）
からプラスミドｐＢＹ５０３ＤＮＡを抽出（このプラス
ミドの詳細は特開平１−９５７８５号公報参照）し、制
限酵素ＸｈｏＩで大きさが約４．０ｋｂのプラスミドの
複製増殖機能を司る遺伝子を含むＤＮＡ断片を切り出し
、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩで大きさが約２．
１ｋｂのプラスミドの安定化機能を司る遺伝子を含むＤ
ＮＡ断片を切り出す。これらの両断片をプラスミドｐＨ
ＳＧ２９８（宝酒造製）のＥｃｏＲＩ、ＫｐｎＩ部位及
びｓａｌＩ部位に組み込むことにより、プラスミドベク
ターｐＣＲＹ３０を調製することができる。
製する方法としては、ブレビバクテリウム・スタチオニ
ス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｔａｔｉｏｎｉ
ｓ）ＩＦ０１２１４４（ＦＥＲＭ ＢＰ−２５１５）
からプラスミドｐＢＹ５０３ＤＮＡを抽出（このプラス
ミドの詳細は特開平１−９５７８５号公報参照）し、制
限酵素ＸｈｏＩで大きさが約４．０ｋｂのプラスミドの
複製増殖機能を司る遺伝子を含むＤＮＡ断片を切り出し
、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩで大きさが約２．
１ｋｂのプラスミドの安定化機能を司る遺伝子を含むＤ
ＮＡ断片を切り出す。これらの両断片をプラスミドｐＨ
ＳＧ２９８（宝酒造製）のＥｃｏＲＩ、ＫｐｎＩ部位及
びｓａｌＩ部位に組み込むことにより、プラスミドベク
ターｐＣＲＹ３０を調製することができる。
【００３７】次に、上記プラスミドベクターへの本発明
のｂｉｏＡ ｂｉｏＤ断片の導入は、例えばプラスミド
ベクター中に１個所だけ存在する制限酵素部位を、該制
限酵素で開裂し、そこに本発明のｂｉｏＡ ｂｉｏＤ断
片を、必要に応じてＳ１ヌクレアーゼで処理して平滑末
端とするか、または適当なアダプターＤＮＡの存在下に
、ＤＮＡリガーゼ処理で連絡させることにより行うこと
ができる。
のｂｉｏＡ ｂｉｏＤ断片の導入は、例えばプラスミド
ベクター中に１個所だけ存在する制限酵素部位を、該制
限酵素で開裂し、そこに本発明のｂｉｏＡ ｂｉｏＤ断
片を、必要に応じてＳ１ヌクレアーゼで処理して平滑末
端とするか、または適当なアダプターＤＮＡの存在下に
、ＤＮＡリガーゼ処理で連絡させることにより行うこと
ができる。
【００３８】具体的には、例えば前記プラスミドｐＣＲ
Ｙ３０を制限酵素ＸｈｏＩで開裂させ、そこに前記制限
酵素ＳａｌＩを用いて切り出すことにより得られる大き
さが約４．０ｋｂのｂｉｏＡ ｂｉｏＤ断片を、ＤＮＡ
リガーゼで連結させることにより行うことができる。
Ｙ３０を制限酵素ＸｈｏＩで開裂させ、そこに前記制限
酵素ＳａｌＩを用いて切り出すことにより得られる大き
さが約４．０ｋｂのｂｉｏＡ ｂｉｏＤ断片を、ＤＮＡ
リガーゼで連結させることにより行うことができる。
【００３９】このようにして造成されるプラスミドｐＣ
ＲＹ３０に本発明の大きさが約４．０ｋｂのＤＮＡ断片
を導入した組換えプラスミドは、ジアミノペラルゴン酸
アミノトランスフエラーゼ及びデスチオビオチンシンセ
ターゼの製造に好適に用いることができる組換えプラス
ミドの一つであり、本発明者らはこれをプラスミドｐＣ
ＲＹ３０−ｂｉｏ３と命名した。プラスミドｐＣＲＹ３
０−ｂｉｏ３の造成については、後記実施例３及び４に
おいてさらに詳細に説明する。
ＲＹ３０に本発明の大きさが約４．０ｋｂのＤＮＡ断片
を導入した組換えプラスミドは、ジアミノペラルゴン酸
アミノトランスフエラーゼ及びデスチオビオチンシンセ
ターゼの製造に好適に用いることができる組換えプラス
ミドの一つであり、本発明者らはこれをプラスミドｐＣ
ＲＹ３０−ｂｉｏ３と命名した。プラスミドｐＣＲＹ３
０−ｂｉｏ３の造成については、後記実施例３及び４に
おいてさらに詳細に説明する。
【００４０】このプラスミドｐＣＲＹ３０−ｂｉｏ３の
制限酵素切断点地図を図２に示す。このようにして造成
されるｂｉｏＡ ｂｉｏＤを含むコリネ型細菌内で複製
増殖可能なプラスミドを、宿主微生物に導入し培養する
ことにより、ジアミノペラルゴン酸アミノトランスフエ
ラーゼ及びデスチオビオチンシンセターゼを安定に効率
よく生産することが可能となる。
制限酵素切断点地図を図２に示す。このようにして造成
されるｂｉｏＡ ｂｉｏＤを含むコリネ型細菌内で複製
増殖可能なプラスミドを、宿主微生物に導入し培養する
ことにより、ジアミノペラルゴン酸アミノトランスフエ
ラーゼ及びデスチオビオチンシンセターゼを安定に効率
よく生産することが可能となる。
【００４１】本発明によるプラスミドで形質転換しうる
宿主微生物としては、コリネ型細菌、例えばブレビバク
テリウム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−
１４９７）、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３
３−ＡＢ−４１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９８）、ブレ
ビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３−ＡＢＴ−１１
（ＦＥＲＭ ＢＰ−１５００）、ブレビバクテリウム
・フラバムＭＪ−２３３−ＡＢＤ−２１（ＦＥＲＭ
ＢＰ−１４９９）等が挙げられる。
宿主微生物としては、コリネ型細菌、例えばブレビバク
テリウム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−
１４９７）、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３
３−ＡＢ−４１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９８）、ブレ
ビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３−ＡＢＴ−１１
（ＦＥＲＭ ＢＰ−１５００）、ブレビバクテリウム
・フラバムＭＪ−２３３−ＡＢＤ−２１（ＦＥＲＭ
ＢＰ−１４９９）等が挙げられる。
【００４２】なお、上記のＦＥＲＭ ＢＰ−１４９８
の菌株は、ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７の菌株を親株と
してＤＬ−α−アミノ酪酸耐性を積極的に付与されたエ
タノール資化性微生物である（特公昭５９−２８３９８
号公報第３〜４欄参照）。また、ＦＥＲＭ ＢＰ−１
５００の菌株は、ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７の菌株を
親株としたＬ−α−アミノ酪酸トランスアミナーゼ高活
性変異株である（特開昭６２−５１９９８号公報参照）
。さらに、ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９９の菌株はＦＥＲ
ＭＢＰ−１４９７の菌株を親株としたＤ−α−アミノ酪
酸デアミナーゼ高活性変異株である（特開昭６１−１７
７９９３号公報参照）。
の菌株は、ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７の菌株を親株と
してＤＬ−α−アミノ酪酸耐性を積極的に付与されたエ
タノール資化性微生物である（特公昭５９−２８３９８
号公報第３〜４欄参照）。また、ＦＥＲＭ ＢＰ−１
５００の菌株は、ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７の菌株を
親株としたＬ−α−アミノ酪酸トランスアミナーゼ高活
性変異株である（特開昭６２−５１９９８号公報参照）
。さらに、ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９９の菌株はＦＥＲ
ＭＢＰ−１４９７の菌株を親株としたＤ−α−アミノ酪
酸デアミナーゼ高活性変異株である（特開昭６１−１７
７９９３号公報参照）。
【００４３】これらの微生物の他に、ブレビバクテリウ
ム・アンモニアゲネス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）ＡＴＣＣ６８７１、同Ａ
ＴＣＣ１３７４５、同ＡＴＣＣ１３７４６、ブレビバク
テリウム・デバリカタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ ｄｉｖａｒｉｃａｔｕｍ）ＡＴＣＣ１４０２０、ブ
レビバクテリウム・ラクトフアーメンタム（Ｂｒｅｖｉ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）
ＡＴＣＣ１３８６９、コリネバクテリウム・グルタミカ
ム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉ
ｃｕｍ）ＡＴＣＣ３１８３１等を宿主微生物として用い
ることもできる。
ム・アンモニアゲネス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）ＡＴＣＣ６８７１、同Ａ
ＴＣＣ１３７４５、同ＡＴＣＣ１３７４６、ブレビバク
テリウム・デバリカタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ ｄｉｖａｒｉｃａｔｕｍ）ＡＴＣＣ１４０２０、ブ
レビバクテリウム・ラクトフアーメンタム（Ｂｒｅｖｉ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）
ＡＴＣＣ１３８６９、コリネバクテリウム・グルタミカ
ム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉ
ｃｕｍ）ＡＴＣＣ３１８３１等を宿主微生物として用い
ることもできる。
【００４４】なお宿主としてブレビバクテリウム・フラ
バムＭＪ−２３３由来の菌株を用いる場合、本菌株が保
有するプラスミドｐＢＹ５０２（特開昭６３−３６７８
７号公報参照）のため、形質転換が困難である場合があ
るので、そのような場合には、本菌株よりプラスミドｐ
ＢＹ５０２を除去することが望ましい。そのようなプラ
スミドｐＢＹ５０２を除去する方法としては、例えば、
継代培養を繰り返すことにより、自然に欠失させること
も可能であるし、人為的に除去することも可能である「
Ｂａｃｔ． Ｒｅｖ． ３６ ｐ． ３６１〜４０５
（１９７２）参照］。上記プラスミドｐＢＹ５０２を人
為的に除去する方法の一例を示せば次のとおりである。
バムＭＪ−２３３由来の菌株を用いる場合、本菌株が保
有するプラスミドｐＢＹ５０２（特開昭６３−３６７８
７号公報参照）のため、形質転換が困難である場合があ
るので、そのような場合には、本菌株よりプラスミドｐ
ＢＹ５０２を除去することが望ましい。そのようなプラ
スミドｐＢＹ５０２を除去する方法としては、例えば、
継代培養を繰り返すことにより、自然に欠失させること
も可能であるし、人為的に除去することも可能である「
Ｂａｃｔ． Ｒｅｖ． ３６ ｐ． ３６１〜４０５
（１９７２）参照］。上記プラスミドｐＢＹ５０２を人
為的に除去する方法の一例を示せば次のとおりである。
【００４５】宿主ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−
２３３の生育を不完全に阻害する濃度のアクリジンオレ
ンジ（濃度：０．２〜５０μｇ／ｍｌ）もしくはエチジ
ウムプロミド（濃度：０．２〜５０μｇ／ｍｌ）等を含
む培地に、１ｍｌ当り約１０細胞になるように植菌し、
生育を不完全に阻害しながら、約２４時間約３５℃で培
養する。 培養液を希釈後寒天培地に塗布し、約３５℃で約２日培
養する。出現したコロニーから各々独立にプラスミド抽
出操作を行い、プラスミドｐＢＹ５０２が除去されてて
いる株を選択する。この操作によりプラスミドｐＢＹ５
０２が除去されたブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−
２３３由来菌株が得られる。
２３３の生育を不完全に阻害する濃度のアクリジンオレ
ンジ（濃度：０．２〜５０μｇ／ｍｌ）もしくはエチジ
ウムプロミド（濃度：０．２〜５０μｇ／ｍｌ）等を含
む培地に、１ｍｌ当り約１０細胞になるように植菌し、
生育を不完全に阻害しながら、約２４時間約３５℃で培
養する。 培養液を希釈後寒天培地に塗布し、約３５℃で約２日培
養する。出現したコロニーから各々独立にプラスミド抽
出操作を行い、プラスミドｐＢＹ５０２が除去されてて
いる株を選択する。この操作によりプラスミドｐＢＹ５
０２が除去されたブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−
２３３由来菌株が得られる。
【００４６】このようにして得られるブレビバクテリウ
ム・フラバムＭＪ−２３３由来菌株への前記プラスミド
の形質転換法としては、ＤＮＡ受容菌にパルス波を通電
することによりプラスミドを導入することが可能である
［Ｓａｔｏｈ，Ｙ． ｅｔ ａｌ， Ｊｏｕｒｎａｌｏ
ｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ
， ５、１５９（１９９０）参照］。
ム・フラバムＭＪ−２３３由来菌株への前記プラスミド
の形質転換法としては、ＤＮＡ受容菌にパルス波を通電
することによりプラスミドを導入することが可能である
［Ｓａｔｏｈ，Ｙ． ｅｔ ａｌ， Ｊｏｕｒｎａｌｏ
ｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ
， ５、１５９（１９９０）参照］。
【００４７】上記の方法で形質転換して得られるジアミ
ノペラルゴン酸アミノトランスフエラーゼ及び／又はデ
スチオビオチンシンセターゼ産生能を有するコリネ型細
菌、例えばブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３
由来株の培養方法を以下に述べる。
ノペラルゴン酸アミノトランスフエラーゼ及び／又はデ
スチオビオチンシンセターゼ産生能を有するコリネ型細
菌、例えばブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３
由来株の培養方法を以下に述べる。
【００４８】培養は炭素源、窒素源、無機塩等を含む通
常の栄養培地で行なうことができ、炭素源としては、例
えばグルコース、エタノール、メタノール、廃糖蜜等が
、そして窒素源としては、例えばアンモニア、硫酸アン
モニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素
等がそれぞれ単独もしくは混合して用いられる。また無
機塩としては、例えばリン酸一水素カリウム、リン酸二
水素カリウム、硫酸マグネシウム等が用いられる。この
他にペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンステイー
ブリカー、カザミノ酸、ビオチン等の各種ビタミン等の
栄養素を培地に添加することができる。
常の栄養培地で行なうことができ、炭素源としては、例
えばグルコース、エタノール、メタノール、廃糖蜜等が
、そして窒素源としては、例えばアンモニア、硫酸アン
モニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素
等がそれぞれ単独もしくは混合して用いられる。また無
機塩としては、例えばリン酸一水素カリウム、リン酸二
水素カリウム、硫酸マグネシウム等が用いられる。この
他にペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンステイー
ブリカー、カザミノ酸、ビオチン等の各種ビタミン等の
栄養素を培地に添加することができる。
【００４９】培養は、通常、電気撹拌、振とう等の好気
的条件下に、約２０〜４０℃、好ましくは２５〜３５℃
の温度で行うことができる。培養途中のｐＨは５〜１０
、好ましくは７〜８付近で行い、培養中のｐＨの調整は
酸又はアルカリを添加して行うことができる。
的条件下に、約２０〜４０℃、好ましくは２５〜３５℃
の温度で行うことができる。培養途中のｐＨは５〜１０
、好ましくは７〜８付近で行い、培養中のｐＨの調整は
酸又はアルカリを添加して行うことができる。
【００５０】培養開始時の炭素源濃度は、好ましくは１
〜５容量％、更に好ましくは２〜３容量％である。また
、培養期間は通常１〜７日間とすることができ、最適期
間は３日間である。
〜５容量％、更に好ましくは２〜３容量％である。また
、培養期間は通常１〜７日間とすることができ、最適期
間は３日間である。
【００５１】このようにして得られる培養物から遠心分
離等により菌体を取得することができる。
離等により菌体を取得することができる。
【００５２】かくして培養された菌体は、野生株を培養
した場合に比べてジアミノペラルゴン酸アミノトランス
フエラーゼ及び／又はびデスチオビオチンシンセターゼ
をその菌体内に多量に含有している。
した場合に比べてジアミノペラルゴン酸アミノトランス
フエラーゼ及び／又はびデスチオビオチンシンセターゼ
をその菌体内に多量に含有している。
【００５３】菌体内に産生された、ジアミノペラルゴン
酸アミノトランスフエラーゼ及びデスチオビオチンシン
セターゼの含量を調べる方法としては、例えば超音波処
理、酵素処理、ホモジナイズ等の通常用いられる手段に
て破砕し得られる無細胞抽出液を、ＳＤＳゲル電気泳動
法［例えば、「蛋白質・酵素の基礎実験法」南江堂刊、
３１４〜３３３頁等参照］に付することにより、菌体内
の蛋白質を分離した後、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉｌ
ｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ Ｒ−２５０による染色法あるい
は、銀染色法により染色した後、例えばフアルマシア社
製 Ｕｌｔｒｏ Ｓｃａｎ ＸＬ レ−ザーデンシトメ
ーターを用いることにより、菌体中の各種タンパク質量
を測定することができる。かくして、菌体内に産生され
た、ジアミノペラルゴン酸アミノトランスフエラーゼ及
び／又はデスチオビオチンシンセターゼ含量の増加を測
定することが可能である。
酸アミノトランスフエラーゼ及びデスチオビオチンシン
セターゼの含量を調べる方法としては、例えば超音波処
理、酵素処理、ホモジナイズ等の通常用いられる手段に
て破砕し得られる無細胞抽出液を、ＳＤＳゲル電気泳動
法［例えば、「蛋白質・酵素の基礎実験法」南江堂刊、
３１４〜３３３頁等参照］に付することにより、菌体内
の蛋白質を分離した後、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉｌ
ｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ Ｒ−２５０による染色法あるい
は、銀染色法により染色した後、例えばフアルマシア社
製 Ｕｌｔｒｏ Ｓｃａｎ ＸＬ レ−ザーデンシトメ
ーターを用いることにより、菌体中の各種タンパク質量
を測定することができる。かくして、菌体内に産生され
た、ジアミノペラルゴン酸アミノトランスフエラーゼ及
び／又はデスチオビオチンシンセターゼ含量の増加を測
定することが可能である。
【００５４】上記の如くジアミノペラルゴン酸アミノト
ランスフエラーゼ及び／又はデスチオビオチンシンセタ
ーゼを高含量含む菌体を用い、少なくともケトアミノペ
ラルゴン酸を含有する前記通常の栄養培地で培養するこ
とにより、高効率でビオチンを製造することができる。
ランスフエラーゼ及び／又はデスチオビオチンシンセタ
ーゼを高含量含む菌体を用い、少なくともケトアミノペ
ラルゴン酸を含有する前記通常の栄養培地で培養するこ
とにより、高効率でビオチンを製造することができる。
【００５５】本明細書では、ブレビバクテリウム・フラ
バムＭＪ−２３３からジアミノペラルゴン酸アミノトラ
ンスフエラーゼ及びデスチオビオチンシンセターゼをコ
ードする遺伝子（ｂｉｏＡ ｂｉｏＤ）を含むＤＮＡ断
片を単離し、該ＤＮＡ断片を導入した組換えプラスミド
を同じくブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３由
来株へ導入し、該微生物によるジアミノペラルゴン酸ア
ミノトランスフエラーゼ及び／又はデスチオビオチンシ
ンセターゼの生産能の向上について主として例示したが
、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３由来株の
代りに他のコリネ型細菌を用いても本発明の目的は達成
される。
バムＭＪ−２３３からジアミノペラルゴン酸アミノトラ
ンスフエラーゼ及びデスチオビオチンシンセターゼをコ
ードする遺伝子（ｂｉｏＡ ｂｉｏＤ）を含むＤＮＡ断
片を単離し、該ＤＮＡ断片を導入した組換えプラスミド
を同じくブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３由
来株へ導入し、該微生物によるジアミノペラルゴン酸ア
ミノトランスフエラーゼ及び／又はデスチオビオチンシ
ンセターゼの生産能の向上について主として例示したが
、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３由来株の
代りに他のコリネ型細菌を用いても本発明の目的は達成
される。
【００５６】いわゆるコリネ型細菌は、コリネバクテリ
ウム属やブレビバクテリウム属等の種々の属名、種々の
菌名が付されているが主な菌学的性質を同じくしている
。これらの菌群は、細胞壁のアミノ酸構成やＤＮＡの塩
基組成が画一的であり、菌種間には７０〜８０％のＤＮ
Ａの相同性があり、非常に近縁な微生物であることは明
らかである（Ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｆｅｒｍｅ
ｎｔａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔ
ｅｓ Ｎｏ．５５、 Ｐ．１−５、 １９８０、 Ｉｎ
ｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｙ
ｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ
． ３１、Ｐ．１３１−１３８、 １９８１参照）。
ウム属やブレビバクテリウム属等の種々の属名、種々の
菌名が付されているが主な菌学的性質を同じくしている
。これらの菌群は、細胞壁のアミノ酸構成やＤＮＡの塩
基組成が画一的であり、菌種間には７０〜８０％のＤＮ
Ａの相同性があり、非常に近縁な微生物であることは明
らかである（Ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｆｅｒｍｅ
ｎｔａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔ
ｅｓ Ｎｏ．５５、 Ｐ．１−５、 １９８０、 Ｉｎ
ｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｙ
ｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ
． ３１、Ｐ．１３１−１３８、 １９８１参照）。
【００５７】また、ビオチン要求性のコリネ型細菌、例
えばブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥ
ＲＭ ＢＰ−１４９７）、ブレビバクテリウム・ラク
トフアーメンタムＡＴＣＣ１３８６９およびコリネバク
テリウム・グルタミカムＡＴＣＣ３１８３１について、
ビオチン生合成に関与する各ステツプの遺伝子が欠損し
たビオチン要求性大腸菌変異株（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ， ｖｏｌ １１２、 ｐ
８３０−８３９、 １９７２およびＪｏｕｒｎａｌ ｏ
ｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ， ｖｏｌ ９４、 ｐ
２０６５−２０６６、 １９６７参照）との交差相補性
試験（Ｊｏｕｒｎａｌ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，
ｖｏｌ ９６、 ｐ５１５−５２４、 １９６８参照）
により、そのビオチン生合成系路について検討した結果
、これら３種の菌株は同様にピメリルＣｏＡシンセター
ゼをコードする遺伝子（ｂｉｏＣ）および７−ケト−８
−アミノペラルゴン酸シンテターゼをコードする遺伝子
（ｂｉｏＦ）が欠損しており、また少くとも７，８−ジ
アミノペラルゴン酸アミノトランスフエラーゼをコード
する遺伝子（ｂｉｏＡ）、デスチオビオチンシンセター
ゼをコードする遺伝子（ｂｉｏＤ）およびビオチンシン
セターゼをコードする遺伝子（ｂｉｏＢ）を保有してい
ることが明らかとなつた。
えばブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥ
ＲＭ ＢＰ−１４９７）、ブレビバクテリウム・ラク
トフアーメンタムＡＴＣＣ１３８６９およびコリネバク
テリウム・グルタミカムＡＴＣＣ３１８３１について、
ビオチン生合成に関与する各ステツプの遺伝子が欠損し
たビオチン要求性大腸菌変異株（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ， ｖｏｌ １１２、 ｐ
８３０−８３９、 １９７２およびＪｏｕｒｎａｌ ｏ
ｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ， ｖｏｌ ９４、 ｐ
２０６５−２０６６、 １９６７参照）との交差相補性
試験（Ｊｏｕｒｎａｌ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，
ｖｏｌ ９６、 ｐ５１５−５２４、 １９６８参照）
により、そのビオチン生合成系路について検討した結果
、これら３種の菌株は同様にピメリルＣｏＡシンセター
ゼをコードする遺伝子（ｂｉｏＣ）および７−ケト−８
−アミノペラルゴン酸シンテターゼをコードする遺伝子
（ｂｉｏＦ）が欠損しており、また少くとも７，８−ジ
アミノペラルゴン酸アミノトランスフエラーゼをコード
する遺伝子（ｂｉｏＡ）、デスチオビオチンシンセター
ゼをコードする遺伝子（ｂｉｏＤ）およびビオチンシン
セターゼをコードする遺伝子（ｂｉｏＢ）を保有してい
ることが明らかとなつた。
【００５８】これらの事実を踏まえれば、ブレビバクテ
リウム・フラバムＭＪ−２３３のみならず、コリネ型細
菌全般から単離されたジアミノペラルゴン酸アミノトラ
ンスフエラーゼ及び／又はデスチオビオチンシンセター
ゼをコードする遺伝子（ｂｉｏＡ及び／又はｂｉｏＤ）
を含むＤＮＡ断片も本発明の範囲に含まれ、また、本発
明のプラスミドで形質転換し得る宿主微生物は、ブレビ
バクテリウム・フラバムＭＪ−２３３に限らず、コリネ
型細菌が全て含まれることは明らかである。
リウム・フラバムＭＪ−２３３のみならず、コリネ型細
菌全般から単離されたジアミノペラルゴン酸アミノトラ
ンスフエラーゼ及び／又はデスチオビオチンシンセター
ゼをコードする遺伝子（ｂｉｏＡ及び／又はｂｉｏＤ）
を含むＤＮＡ断片も本発明の範囲に含まれ、また、本発
明のプラスミドで形質転換し得る宿主微生物は、ブレビ
バクテリウム・フラバムＭＪ−２３３に限らず、コリネ
型細菌が全て含まれることは明らかである。
【００５９】
【実施例】以上に本発明を説明してきたが、下記の実施
例によりさらに具体的に説明する。しかしながら、実施
例は本発明の具体的に認識を得る一助とみなすべきもの
であり、本発明の範囲を限定するためのものではないこ
とを理解しなければならない。
例によりさらに具体的に説明する。しかしながら、実施
例は本発明の具体的に認識を得る一助とみなすべきもの
であり、本発明の範囲を限定するためのものではないこ
とを理解しなければならない。
【００６０】
【実施例１】コリネ型細菌とビオチン要求性大腸菌変異
株との相補性試験 （Ａ）コリネ型細菌を含有するビオチン欠乏最少培地プ
レートの作成 半合成培地Ａ培地（組成：尿素２ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ
４７ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４０．５ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ ０．
５ｇ、ＭｇＳＯ４ ０．５ｇ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ
６ｍｇ、ＭｎＳＯ４・４〜６Ｈ２Ｏ６ｍｇ、酵母エ
キス２．５ｇ、カザミノ酸５ｇ、ビオチン２００μｇ、
塩酸チアミン２００μｇ、グルコース２０ｇ、純水１リ
ツトル］１リツトルに、ブレビバクテリウム・フラバム
ＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）を植菌し
てＯ．Ｄ．が約２．９になるまで培養し、菌体を集めた
。得られた菌体をＢＭ緩衝液［組成：尿素２ｇ、（ＮＨ
４）２ＳＯ４ ７ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４ ０．５ｇ、Ｋ
Ｈ２ＰＯ４ ０．５ｇ、ＭｇＳＯ４ ０．５ｇ］で
２回洗浄した。この菌体を１０ｍｌのＢＭ緩衝液に懸濁
し、その内１ｍｌを、滅菌後、５０℃に放置しておいた
ビオチン検定用Ｃ培地（尿素０．２％、硫酸アンモニウ
ム０．７％、ＫＨ２ＰＯ４ ０．０５％、Ｋ２ＨＰＯ
４ ０．０５％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０５
％、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ６ｐｐｍ、ＭｎＳＯ４・
４〜６Ｈ２Ｏ ６ｐｐｍ、チアミン・ＨＣｌ １０
０μｇ／リツトル、ビタミン・アツセイ用カザミノ酸０
．１％、グルコース０．２％、寒天１．０％）に添加し
、撹拌後、プレートに流し、固化した。
株との相補性試験 （Ａ）コリネ型細菌を含有するビオチン欠乏最少培地プ
レートの作成 半合成培地Ａ培地（組成：尿素２ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ
４７ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４０．５ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ ０．
５ｇ、ＭｇＳＯ４ ０．５ｇ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ
６ｍｇ、ＭｎＳＯ４・４〜６Ｈ２Ｏ６ｍｇ、酵母エ
キス２．５ｇ、カザミノ酸５ｇ、ビオチン２００μｇ、
塩酸チアミン２００μｇ、グルコース２０ｇ、純水１リ
ツトル］１リツトルに、ブレビバクテリウム・フラバム
ＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）を植菌し
てＯ．Ｄ．が約２．９になるまで培養し、菌体を集めた
。得られた菌体をＢＭ緩衝液［組成：尿素２ｇ、（ＮＨ
４）２ＳＯ４ ７ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４ ０．５ｇ、Ｋ
Ｈ２ＰＯ４ ０．５ｇ、ＭｇＳＯ４ ０．５ｇ］で
２回洗浄した。この菌体を１０ｍｌのＢＭ緩衝液に懸濁
し、その内１ｍｌを、滅菌後、５０℃に放置しておいた
ビオチン検定用Ｃ培地（尿素０．２％、硫酸アンモニウ
ム０．７％、ＫＨ２ＰＯ４ ０．０５％、Ｋ２ＨＰＯ
４ ０．０５％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０５
％、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ６ｐｐｍ、ＭｎＳＯ４・
４〜６Ｈ２Ｏ ６ｐｐｍ、チアミン・ＨＣｌ １０
０μｇ／リツトル、ビタミン・アツセイ用カザミノ酸０
．１％、グルコース０．２％、寒天１．０％）に添加し
、撹拌後、プレートに流し、固化した。
【００６１】同様にして、ブレビバクテリウム・フラバ
ムＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）の代わ
りに、ブレビバクテリウム・ラクトフアーメンタムＡＴ
ＣＣ１３８６９、あるいは、コリネバクテリウム・グル
タミカムＡＴＣＣ３１８３１を用いて各種のコリネ型細
菌を含んだビオチン欠乏最少培地プレートを作製した。 （Ｂ）ビオチン要求性大腸菌変異株との相補性試験ビオ
チン生合成系路の各ステツプの欠損したビオチン要求性
大腸菌変異株と各種コリネ型細菌との相補性試験により
、各種コリネ型細菌のビオチン生合成系路を推定するこ
とができる。
ムＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）の代わ
りに、ブレビバクテリウム・ラクトフアーメンタムＡＴ
ＣＣ１３８６９、あるいは、コリネバクテリウム・グル
タミカムＡＴＣＣ３１８３１を用いて各種のコリネ型細
菌を含んだビオチン欠乏最少培地プレートを作製した。 （Ｂ）ビオチン要求性大腸菌変異株との相補性試験ビオ
チン生合成系路の各ステツプの欠損したビオチン要求性
大腸菌変異株と各種コリネ型細菌との相補性試験により
、各種コリネ型細菌のビオチン生合成系路を推定するこ
とができる。
【００６２】上記（Ａ）項で作製した、３種のコリネ型
細菌含有ビオチン欠乏最少培地のプレートに、各種ビオ
チン要求性大腸菌変異株を線状に植菌した。用いたビオ
チン要求性大腸菌変異株は、エシエリヒア・コリ（Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ Ｃｏｌｉ）Ｒ８７３（ｂｉｏＡ４
）、同Ｒ８７４（ｂｉｏＦ１２）、同Ｒ８７５（ｂｉｏ
Ｂ１７）、同Ｒ８７６（ｂｉｏＣ１８）、同Ｒ８７７（
ｂｉｏＤ１９）である［（ ）内は各菌株の遺伝子型
（Ｇｅｎｏｔｙｐｅ）を示す、またこれらの菌株の詳細
および取得方法については、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ， ｖｏｌ ９４、 ｐ２０６
５−２０６６ （１９７２）、Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ， ｖｏｌ １１２、 ｐ８３
０−８３９ （１９７２）参照）。
細菌含有ビオチン欠乏最少培地のプレートに、各種ビオ
チン要求性大腸菌変異株を線状に植菌した。用いたビオ
チン要求性大腸菌変異株は、エシエリヒア・コリ（Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ Ｃｏｌｉ）Ｒ８７３（ｂｉｏＡ４
）、同Ｒ８７４（ｂｉｏＦ１２）、同Ｒ８７５（ｂｉｏ
Ｂ１７）、同Ｒ８７６（ｂｉｏＣ１８）、同Ｒ８７７（
ｂｉｏＤ１９）である［（ ）内は各菌株の遺伝子型
（Ｇｅｎｏｔｙｐｅ）を示す、またこれらの菌株の詳細
および取得方法については、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ， ｖｏｌ ９４、 ｐ２０６
５−２０６６ （１９７２）、Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ， ｖｏｌ １１２、 ｐ８３
０−８３９ （１９７２）参照）。
【００６３】これらのビオチン要求性大腸菌変異株とコ
リネ型細菌が相補した場合は、コリネ型細菌がビオチン
欠乏最小培地のプレート中に生育し、黄色いコロニーを
形成する。各種ビオチン要求性大腸菌変異化物に対応す
るコリネ型細菌のコロニー形成の有無により、コリネ型
細菌がビオチン生合成に関与する遺伝子のどの部分を欠
損し、どの部分を保有しているか容易に判別することが
できる。
リネ型細菌が相補した場合は、コリネ型細菌がビオチン
欠乏最小培地のプレート中に生育し、黄色いコロニーを
形成する。各種ビオチン要求性大腸菌変異化物に対応す
るコリネ型細菌のコロニー形成の有無により、コリネ型
細菌がビオチン生合成に関与する遺伝子のどの部分を欠
損し、どの部分を保有しているか容易に判別することが
できる。
【００６４】本相補試験の結果、ブレビバクテリウム・
フラバムＭＪ−２３３（ＦＥＲＮＢＰ−１４９７）、ブ
レビバクテリウム・ラクトフアーメンタムＡＴＣＣ１３
８６９、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ３
１８３１は、各菌株共、エシエリヒア・コリＲ８７３（
ｂｉｏＡ４）、同Ｒ８７５（ｂｉｏＢ１７）、同Ｒ８７
７（ｂｉｏＤ１９）を相補したが、同Ｒ８７４（ｂｉｏ
Ｆ１２）、同Ｒ８７６（ｂｉｏＣ１８）を相補しなかつ
た。即わち、各々のコリネ型細菌は、少なくとも、同様
に７，８−ジアミノペラルゴン酸アミノトランスフエラ
ーゼをコードする遺伝子（ｂｉｏＡ）、デスチオビオチ
ンシンセターゼをコードする遺伝子（ｂｉｏＤ）および
ビオチンシンセターゼをコードする遺伝子（ｂｉｏＢ）
を有していることが明らかとなつた。
フラバムＭＪ−２３３（ＦＥＲＮＢＰ−１４９７）、ブ
レビバクテリウム・ラクトフアーメンタムＡＴＣＣ１３
８６９、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ３
１８３１は、各菌株共、エシエリヒア・コリＲ８７３（
ｂｉｏＡ４）、同Ｒ８７５（ｂｉｏＢ１７）、同Ｒ８７
７（ｂｉｏＤ１９）を相補したが、同Ｒ８７４（ｂｉｏ
Ｆ１２）、同Ｒ８７６（ｂｉｏＣ１８）を相補しなかつ
た。即わち、各々のコリネ型細菌は、少なくとも、同様
に７，８−ジアミノペラルゴン酸アミノトランスフエラ
ーゼをコードする遺伝子（ｂｉｏＡ）、デスチオビオチ
ンシンセターゼをコードする遺伝子（ｂｉｏＤ）および
ビオチンシンセターゼをコードする遺伝子（ｂｉｏＢ）
を有していることが明らかとなつた。
【００６５】
【実施例２】ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３
３由来のジアミノペラルゴン酸アミノトランスフエラー
ゼ及びデスチオビオチンシンセターゼをコードする遺伝
子を含むＤＮＡ断片（ｂｉｏＡ ｂｉｏＤ断片）のクロ
ーン化 （Ａ）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３の全
ＤＮＡの抽出 半合成培地Ａ培地［組成：尿素２ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ
４７ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４０．５ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ ０．
５ｇ、ＭｇＳＯ４ ０．５ｇ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ
６ｍｇ、ＭｎＳＯ４・４〜６Ｈ２Ｏ６ｍｇ、酵母エ
キス２．５ｇ、カザミノ酸５ｇ、ビオチン２００μｇ、
塩酸チアミン２００μｇ、グルコース２０ｇ、純水１リ
ツトル］１リツトルに、ブレビバクテリウム・フラバム
ＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）を対数増
殖期後期で培養し、菌体を集めた。得られた菌体を１０
ｍｇ／ｍｌの濃度にリゾチームを含む１０ｍＭＮａＣｌ
−２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）−１ｍＭＥＤＴ
Ａ−２Ｎａ溶液１５ｍｌに懸濁した。次にプロテナーゼ
Ｋを、最終濃度が１００μｇ／ｍｌになるように添加し
、３７℃で１時間保温した。さらにドデシル硫酸ナトリ
ウムを最終濃度が０．５％になるように添加し、５０℃
で６時間保温して容菌した。この溶菌液に、等量のフエ
ノール／クロロホルム溶液を添加し、室温で１０分間ゆ
るやかに振とうした後、全量を遠心分離（５，０００×
ｇ、２０分間、１０〜１２℃）し、上清画分を分取し、
酢酸ナトリウムを０．３Ｍとなるように添加した後、２
倍量のエタノールをゆつくりと加えた。水層とエタノー
ル層の間に存在するＤＮＡをガラス棒でまきとり、７０
％エタノールで洗浄した後、風乾した。得られたＤＮＡ
に１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）−１ｍＭＥＤＴ
Ａ・２Ｎａ溶液５ｍｌを加え、４℃で一晩静置し、以後
の実験に用いた。
３由来のジアミノペラルゴン酸アミノトランスフエラー
ゼ及びデスチオビオチンシンセターゼをコードする遺伝
子を含むＤＮＡ断片（ｂｉｏＡ ｂｉｏＤ断片）のクロ
ーン化 （Ａ）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３の全
ＤＮＡの抽出 半合成培地Ａ培地［組成：尿素２ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ
４７ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４０．５ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ ０．
５ｇ、ＭｇＳＯ４ ０．５ｇ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ
６ｍｇ、ＭｎＳＯ４・４〜６Ｈ２Ｏ６ｍｇ、酵母エ
キス２．５ｇ、カザミノ酸５ｇ、ビオチン２００μｇ、
塩酸チアミン２００μｇ、グルコース２０ｇ、純水１リ
ツトル］１リツトルに、ブレビバクテリウム・フラバム
ＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）を対数増
殖期後期で培養し、菌体を集めた。得られた菌体を１０
ｍｇ／ｍｌの濃度にリゾチームを含む１０ｍＭＮａＣｌ
−２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）−１ｍＭＥＤＴ
Ａ−２Ｎａ溶液１５ｍｌに懸濁した。次にプロテナーゼ
Ｋを、最終濃度が１００μｇ／ｍｌになるように添加し
、３７℃で１時間保温した。さらにドデシル硫酸ナトリ
ウムを最終濃度が０．５％になるように添加し、５０℃
で６時間保温して容菌した。この溶菌液に、等量のフエ
ノール／クロロホルム溶液を添加し、室温で１０分間ゆ
るやかに振とうした後、全量を遠心分離（５，０００×
ｇ、２０分間、１０〜１２℃）し、上清画分を分取し、
酢酸ナトリウムを０．３Ｍとなるように添加した後、２
倍量のエタノールをゆつくりと加えた。水層とエタノー
ル層の間に存在するＤＮＡをガラス棒でまきとり、７０
％エタノールで洗浄した後、風乾した。得られたＤＮＡ
に１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）−１ｍＭＥＤＴ
Ａ・２Ｎａ溶液５ｍｌを加え、４℃で一晩静置し、以後
の実験に用いた。
【００６６】（Ｂ）組換え体の創製
上記（Ａ）項で得たブレビバクテリウム・フラバムＭＪ
−２３３の全ＤＮＡ９０μｌを制限酵素Ｓａｕ３ＡＩ１
ｕｎｉｔを用い、３７℃で２０分間反応させ部分分解し
た。 この部分分解ＤＮＡにコスミドｐＷＥ１５（ストラタジ
ーン社製）を制限酵素ＢａｍＨＩで切断した後、脱リン
酸化処理したものを混合し、５０ｍＭトリス緩衝液（ｐ
Ｈ７．６）、１０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭＡＴ
Ｐ、１０ｍＭＭｇＣｌ２及びＴ４ＤＮＡリガーゼ１ｕｎ
ｉｔの各成分を添加し（各成分の濃度は最終濃度である
）、４℃で１５時間反応させ、結合させた。
−２３３の全ＤＮＡ９０μｌを制限酵素Ｓａｕ３ＡＩ１
ｕｎｉｔを用い、３７℃で２０分間反応させ部分分解し
た。 この部分分解ＤＮＡにコスミドｐＷＥ１５（ストラタジ
ーン社製）を制限酵素ＢａｍＨＩで切断した後、脱リン
酸化処理したものを混合し、５０ｍＭトリス緩衝液（ｐ
Ｈ７．６）、１０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭＡＴ
Ｐ、１０ｍＭＭｇＣｌ２及びＴ４ＤＮＡリガーゼ１ｕｎ
ｉｔの各成分を添加し（各成分の濃度は最終濃度である
）、４℃で１５時間反応させ、結合させた。
【００６７】（Ｃ）ビオチン生合成に関与する酵素をコ
ードする遺伝子を含むコスミドの選抜 上記（Ｂ）項で得たコスミド混液を用い、前記エシエリ
ヒア・コリＲ８７３（ｂｉｏＡ４）株を形質導入し、ア
ンピシリン５０ｍｇを含む選択培地［Ｋ２ＨＰＯ４
７ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ ２ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４
１ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０．１ｇ、カザミノ酸１０
ｇ、グルコース２ｇ及び寒天１６ｇを蒸留水１リツトル
に溶解］に塗沫した。なお形質導入には、宝酒造より販
売されているλＤＮＡ ｉｎｖｉｔｒｏ Ｐａｃｋａｇ
ｉｎｇ Ｋｉｔ を用いて行つた。培地上の生育株を常
法により、液体培養し、培養液よりコスミドＤＮＡを抽
出し、該コスミドを制限酵素により切断し、アガロース
ゲル電気泳動を用いて調べたところ、コスミドｐＷＥ１
５の長さ８．８ｋｂのＤＮＡ断片に加え、長さ約３０ｋ
ｂのＤＮＡ断片が認められた。本コスミドをｐＷＥ１５
−ｂｉｏＡと命名した。
ードする遺伝子を含むコスミドの選抜 上記（Ｂ）項で得たコスミド混液を用い、前記エシエリ
ヒア・コリＲ８７３（ｂｉｏＡ４）株を形質導入し、ア
ンピシリン５０ｍｇを含む選択培地［Ｋ２ＨＰＯ４
７ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ ２ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４
１ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０．１ｇ、カザミノ酸１０
ｇ、グルコース２ｇ及び寒天１６ｇを蒸留水１リツトル
に溶解］に塗沫した。なお形質導入には、宝酒造より販
売されているλＤＮＡ ｉｎｖｉｔｒｏ Ｐａｃｋａｇ
ｉｎｇ Ｋｉｔ を用いて行つた。培地上の生育株を常
法により、液体培養し、培養液よりコスミドＤＮＡを抽
出し、該コスミドを制限酵素により切断し、アガロース
ゲル電気泳動を用いて調べたところ、コスミドｐＷＥ１
５の長さ８．８ｋｂのＤＮＡ断片に加え、長さ約３０ｋ
ｂのＤＮＡ断片が認められた。本コスミドをｐＷＥ１５
−ｂｉｏＡと命名した。
【００６８】（Ｄ）ｂｉｏＡ ｂｉｏＤ断片のプラスミ
ドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩへのサブクローニング上
記（Ｃ）項で得たコスミドｐＷＥ１５−ｂｉｏＡに含ま
れるＤＮＡ挿入断片は約３０ｋｂと大きく、実用的でな
いので、得られた断片のうち必要な部分だけに小型化す
るために、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ（ス
トラタジーン社より市販）へジアミノペラルゴン酸アミ
ノトランスフエラーゼ及びデスチオビオチンシンセター
ゼをコードする遺伝子（ｂｉｏＡ ｂｉｏＤ）を含むＤ
ＮＡ断片を下記のとおりサブクローニングした。
ドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩへのサブクローニング上
記（Ｃ）項で得たコスミドｐＷＥ１５−ｂｉｏＡに含ま
れるＤＮＡ挿入断片は約３０ｋｂと大きく、実用的でな
いので、得られた断片のうち必要な部分だけに小型化す
るために、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ（ス
トラタジーン社より市販）へジアミノペラルゴン酸アミ
ノトランスフエラーゼ及びデスチオビオチンシンセター
ゼをコードする遺伝子（ｂｉｏＡ ｂｉｏＤ）を含むＤ
ＮＡ断片を下記のとおりサブクローニングした。
【００６９】上記（Ｃ）項で得たコスミドｐＷＥ１５−
ｂｉｏＡを制限酵素ＳａｌＩで切断したものと、プラス
ミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩを制限酵素ＳａｌＩで
切断したものを混合し、５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７
．６）、１０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭＡＴＰ、
１０ｍＭＭｇＣｌ２及びＴ４ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔ
の各成分を添加し（各成分の濃度は最終濃度である）、
１２℃で１５時間反応させ、結合させた。
ｂｉｏＡを制限酵素ＳａｌＩで切断したものと、プラス
ミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩを制限酵素ＳａｌＩで
切断したものを混合し、５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７
．６）、１０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭＡＴＰ、
１０ｍＭＭｇＣｌ２及びＴ４ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔ
の各成分を添加し（各成分の濃度は最終濃度である）、
１２℃で１５時間反応させ、結合させた。
【００７０】得られたプラスミド混液を用い、塩化カル
シウム法（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ， ５３、 １５９、 １９７０）に従
いエシエリヒア・コリＲ８７３（ｂｉｏＡ４）株を形質
転換し、アンピシリン５０ｍｇを含む選択培地［Ｋ２Ｈ
ＰＯ４ ７ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ ２ｇ、（ＮＨ４）２
ＳＯ４ １ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．１ｇ、
カザミノ酸１０ｇ、グルコース２ｇ及び寒天 １６ｇを
蒸留水１リツトルに溶解］に塗沫した。
シウム法（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ， ５３、 １５９、 １９７０）に従
いエシエリヒア・コリＲ８７３（ｂｉｏＡ４）株を形質
転換し、アンピシリン５０ｍｇを含む選択培地［Ｋ２Ｈ
ＰＯ４ ７ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ ２ｇ、（ＮＨ４）２
ＳＯ４ １ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．１ｇ、
カザミノ酸１０ｇ、グルコース２ｇ及び寒天 １６ｇを
蒸留水１リツトルに溶解］に塗沫した。
【００７１】この培地上の生育株を常法により液体培養
し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミ
ドを制限酵素により切断し、アガロースゲル電気泳動を
用いて調べたところ、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐ
ｔＩＩの長さ３．９５ｋｂのＤＮＡ断片に加え、長さ４
．０ｋｂの挿入ＤＮＡ断片が認められた。このプラスミ
ドを用い、上記方法に従い前記エシエリヒア・コリＲ８
７７（ｂｉｏＤ１９）株を形質転換し、アンピシリン５
０ｍｇを含む選択培地［Ｋ２ＨＰＯ４ ７ｇ、ＫＨ２
ＰＯ４ ２ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４ １ｇ、ＭｇＳ
Ｏ４・７Ｈ２Ｏ ０．１ｇ、カザミノ酸１０ｇ、グル
コース２ｇ及び寒天１６ｇを蒸留水１リツトルに溶解］
に塗沫した。
し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミ
ドを制限酵素により切断し、アガロースゲル電気泳動を
用いて調べたところ、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐ
ｔＩＩの長さ３．９５ｋｂのＤＮＡ断片に加え、長さ４
．０ｋｂの挿入ＤＮＡ断片が認められた。このプラスミ
ドを用い、上記方法に従い前記エシエリヒア・コリＲ８
７７（ｂｉｏＤ１９）株を形質転換し、アンピシリン５
０ｍｇを含む選択培地［Ｋ２ＨＰＯ４ ７ｇ、ＫＨ２
ＰＯ４ ２ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４ １ｇ、ＭｇＳ
Ｏ４・７Ｈ２Ｏ ０．１ｇ、カザミノ酸１０ｇ、グル
コース２ｇ及び寒天１６ｇを蒸留水１リツトルに溶解］
に塗沫した。
【００７２】この培地上の生育株を常法により液体培養
し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミ
ドを制限酵素により切断し、アガロースゲル電気泳動を
用いて調べたところ、エシエリヒア・コリＲ８７３（ｂ
ｉｏＡ４）株の形質転換体から得られたプラスミドと全
く同様に、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩの長
さ２．９５ｋｂのＤＮＡ断片に加え、長さ約４．０ｋｂ
の挿入ＤＮＡ断片が認められた。長さ約４．０ｋｂのＤ
ＮＡ断片を各種の制限酵素で切断したときの制限酵素認
識部位数および切断断片の大きさは、前記表１に示した
とおりであつた。このＤＮＡ断片の制限酵素切断点地図
を図１に示す。また上記で得られたプラスミドを各種制
限酵素で切断して、切断断片の大きさを測定した。その
結果を下記の表３に示す。
し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミ
ドを制限酵素により切断し、アガロースゲル電気泳動を
用いて調べたところ、エシエリヒア・コリＲ８７３（ｂ
ｉｏＡ４）株の形質転換体から得られたプラスミドと全
く同様に、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩの長
さ２．９５ｋｂのＤＮＡ断片に加え、長さ約４．０ｋｂ
の挿入ＤＮＡ断片が認められた。長さ約４．０ｋｂのＤ
ＮＡ断片を各種の制限酵素で切断したときの制限酵素認
識部位数および切断断片の大きさは、前記表１に示した
とおりであつた。このＤＮＡ断片の制限酵素切断点地図
を図１に示す。また上記で得られたプラスミドを各種制
限酵素で切断して、切断断片の大きさを測定した。その
結果を下記の表３に示す。
【００７３】
【表４】
表３ プラスミドｐＢＳ−ｂｉｏＡＤ４
制限酵素 認識部位数
切断断片の大きさ（ｋｂ） ＨｉｎｄＩＩＩ
１ ６．９５
Ｘｈｏ Ｉ ２
４．２５、 ２．７ ＢａｍＨＩ
２ ３．７５
、 ３．２上記の制限酵素により特徴づけられるプラ
スミドをｐＢＳ−ｂｉｏＡＤ４と命名した。
制限酵素 認識部位数
切断断片の大きさ（ｋｂ） ＨｉｎｄＩＩＩ
１ ６．９５
Ｘｈｏ Ｉ ２
４．２５、 ２．７ ＢａｍＨＩ
２ ３．７５
、 ３．２上記の制限酵素により特徴づけられるプラ
スミドをｐＢＳ−ｂｉｏＡＤ４と命名した。
【００７４】以上の結果より、制限酵素ＳａｌＩで切り
出される、ジアミノペラルゴン酸アミノトランスフエラ
ーゼとデスチオビオチンシンセターゼをコードする遺伝
子を含む長さ４．０ｋｂのＤＮＡ断片を得ることができ
た。
出される、ジアミノペラルゴン酸アミノトランスフエラ
ーゼとデスチオビオチンシンセターゼをコードする遺伝
子を含む長さ４．０ｋｂのＤＮＡ断片を得ることができ
た。
【００７５】
【実施例３】ｂｉｏＡ及びｂｉｏＤの塩基配列の決定（
Ａ）デレーシヨンミユータントの作製実施例２の（Ｃ）
項で得られたプラスミドｐＢＳ−ｂｉｏＡＤ４ ３０
μｇを制限酵素ＸｂａＩを用いて、３７℃、１時間反応
により切断した。この反応液を７５℃で１５分間加熱し
て、制限酵素を失活させたのち、１ｍＨｔｈｉｏ−ｄＮ
ＴＰを２μｌ、クレノー断片（ｋｌｅｎｏｗ ｆｒａｇ
ｍｅｎｔ）５ｕｎｉｔｓを加え室温で１０分間反応させ
た。反応液と同量のフエノール／クロロホルム（１：１
）で切断断片を抽出したのち、２．５倍量のエタノール
を加えＤＮＡを沈殿させた。遠心分離後、真空乾燥し、
ＤＮＡを回収した。このＤＮＡを溶解し、制限酵素Ｅｃ
ｏＲＩで３７℃１時間反応により切断した。この溶液か
ら同量のフエノール／クロロホルム（１：１）でＤＮＡ
を抽出したのち、２．５倍量のエタノールを加えＤＮＡ
を沈殿させ、遠心分離後、真空乾燥し、ＤＮＡを回収し
た。
Ａ）デレーシヨンミユータントの作製実施例２の（Ｃ）
項で得られたプラスミドｐＢＳ−ｂｉｏＡＤ４ ３０
μｇを制限酵素ＸｂａＩを用いて、３７℃、１時間反応
により切断した。この反応液を７５℃で１５分間加熱し
て、制限酵素を失活させたのち、１ｍＨｔｈｉｏ−ｄＮ
ＴＰを２μｌ、クレノー断片（ｋｌｅｎｏｗ ｆｒａｇ
ｍｅｎｔ）５ｕｎｉｔｓを加え室温で１０分間反応させ
た。反応液と同量のフエノール／クロロホルム（１：１
）で切断断片を抽出したのち、２．５倍量のエタノール
を加えＤＮＡを沈殿させた。遠心分離後、真空乾燥し、
ＤＮＡを回収した。このＤＮＡを溶解し、制限酵素Ｅｃ
ｏＲＩで３７℃１時間反応により切断した。この溶液か
ら同量のフエノール／クロロホルム（１：１）でＤＮＡ
を抽出したのち、２．５倍量のエタノールを加えＤＮＡ
を沈殿させ、遠心分離後、真空乾燥し、ＤＮＡを回収し
た。
【００７６】得られたＤＮＡを１００μｌのＥｘｏＩＩ
Ｉバッファー［５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８
．０、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、
１０ｍＭ β−メルカプトエタノール］に溶解した。 このＤＮＡ溶液に１８０ｕｎｉｔｓのエキソヌクレアー
ゼＩＩＩを加えボルテックスにてかくはんし、３７℃に
てインキュベートした。この溶液を１分毎に１０μｌず
つサンプリングし、予め準備した１００μｌのＭＢヌク
レアーゼバッファー（４０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４．
５、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロール）中
へ順次加え、６５℃、５分間の処理によりエキソヌクレ
アーゼＩＩＩを失活させたのち３７℃にもどし、５０ｕ
ｎｉｔｓのＭｕｎｇ Ｂｅａｎヌクレアーゼを加え３０
分間インキュベートした。同量の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ−１ｍＭ ＥＤＴＡ飽和フエノールで１回上
清をクロロホルム／イソアミルアルコール（２４：１）
で１回、ＤＮＡをそれぞれ抽出した。上清を別のチュー
ブに移し、２．５倍量のエタノールを加え遠心分離にて
沈殿を回収し、７０％エタノールで洗浄したのち真空乾
燥した。
Ｉバッファー［５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８
．０、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、
１０ｍＭ β−メルカプトエタノール］に溶解した。 このＤＮＡ溶液に１８０ｕｎｉｔｓのエキソヌクレアー
ゼＩＩＩを加えボルテックスにてかくはんし、３７℃に
てインキュベートした。この溶液を１分毎に１０μｌず
つサンプリングし、予め準備した１００μｌのＭＢヌク
レアーゼバッファー（４０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４．
５、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロール）中
へ順次加え、６５℃、５分間の処理によりエキソヌクレ
アーゼＩＩＩを失活させたのち３７℃にもどし、５０ｕ
ｎｉｔｓのＭｕｎｇ Ｂｅａｎヌクレアーゼを加え３０
分間インキュベートした。同量の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ−１ｍＭ ＥＤＴＡ飽和フエノールで１回上
清をクロロホルム／イソアミルアルコール（２４：１）
で１回、ＤＮＡをそれぞれ抽出した。上清を別のチュー
ブに移し、２．５倍量のエタノールを加え遠心分離にて
沈殿を回収し、７０％エタノールで洗浄したのち真空乾
燥した。
【００７７】得られたＤＮＡを、５０μｌのクレノー（
ｋｌｅｎｏｗ）がバッファー［７ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ ｐＨ７．５、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、２０ｍ
Ｍ ＮａＣｌ、７ｍＭ ＭｇＣｌ２ ０．１ｍＭ
ｄＮＴＰｓ］に溶解させた後、２ｕｎｉｔｓのクレ
ノー断片を加え、３７℃、１５分間インキュベートした
。この溶液に２．５倍量のエタノールを加え、遠心分離
にて沈殿を回収し、７０％エタノールで洗浄後、真空乾
燥した。
ｋｌｅｎｏｗ）がバッファー［７ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ ｐＨ７．５、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、２０ｍ
Ｍ ＮａＣｌ、７ｍＭ ＭｇＣｌ２ ０．１ｍＭ
ｄＮＴＰｓ］に溶解させた後、２ｕｎｉｔｓのクレ
ノー断片を加え、３７℃、１５分間インキュベートした
。この溶液に２．５倍量のエタノールを加え、遠心分離
にて沈殿を回収し、７０％エタノールで洗浄後、真空乾
燥した。
【００７８】得られた沈殿を４０μｌのＴＥバッファー
に溶解し、１０ｍＭ ジチオスレイトール、１ｍＭ
ＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２およびＴ４リガーゼ
５ｕｎｉｔｓの各成分を添加し、１２℃で１５時間反応
させ結合させた。
に溶解し、１０ｍＭ ジチオスレイトール、１ｍＭ
ＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２およびＴ４リガーゼ
５ｕｎｉｔｓの各成分を添加し、１２℃で１５時間反応
させ結合させた。
【００７９】得られたＤＮＡミクスチャーを用い、エシ
エリヒア・コリＪＨ１０９（宝酒造製）を形質転換し、
アンピシリン（５０ｍｇ／ｍｌ）を含むＬＢ培地［１０
ｇ Ｔｒｙｐｔｏｎｅ， ５ｇ Ｙｅａｓｔ Ｅ
ｘｔｒａｃｔ， ５ｇ ＮａＣｌ １６ｇ ａｇａｒ
ｐｅｒ １ｌ］に塗沫した。
エリヒア・コリＪＨ１０９（宝酒造製）を形質転換し、
アンピシリン（５０ｍｇ／ｍｌ）を含むＬＢ培地［１０
ｇ Ｔｒｙｐｔｏｎｅ， ５ｇ Ｙｅａｓｔ Ｅ
ｘｔｒａｃｔ， ５ｇ ＮａＣｌ １６ｇ ａｇａｒ
ｐｅｒ １ｌ］に塗沫した。
【００８０】生育したコロニーよりプラスミドを抽出し
、インサートＤＮＡの大きさをしらべ、インサートの大
きさが２００ｂｐ〜４ｋｂまで約２５０ｂｐおきに２０
クローンを選抜した。
、インサートＤＮＡの大きさをしらべ、インサートの大
きさが２００ｂｐ〜４ｋｂまで約２５０ｂｐおきに２０
クローンを選抜した。
【００８１】同様にして逆方向のクローンについても２
０クローン選抜した。
０クローン選抜した。
【００８２】（Ｂ）デレーシヨンミユータントによる大
腸菌変異株の相補性試験 上記（Ａ）項で得たデレーションミュータントプラスミ
ドを、実施例１の（Ｄ）項に示す方法に従ってエシエリ
シア・コリＲ８７３（ｂｉｏＡ４）株およびＲ８７７株
（ｂｉｏＤ１９）を形質転換し、アンピシリン５０ｍｇ
を含む選択培地［Ｋ３ＨＰＯ４ ７ｇ、ＫＨ２ＰＯ４
２ｇ、（ＮＨ４）２ ＳＯ４１−ｇ、ＭｇＳＯ４
・７Ｈ２Ｏ ０．１ｇ、カザミノ酸１０ｇ、グルコー
ス２ｇ及び寒天１６ｇを蒸留水１ｌに溶解］に塗沫した
。
腸菌変異株の相補性試験 上記（Ａ）項で得たデレーションミュータントプラスミ
ドを、実施例１の（Ｄ）項に示す方法に従ってエシエリ
シア・コリＲ８７３（ｂｉｏＡ４）株およびＲ８７７株
（ｂｉｏＤ１９）を形質転換し、アンピシリン５０ｍｇ
を含む選択培地［Ｋ３ＨＰＯ４ ７ｇ、ＫＨ２ＰＯ４
２ｇ、（ＮＨ４）２ ＳＯ４１−ｇ、ＭｇＳＯ４
・７Ｈ２Ｏ ０．１ｇ、カザミノ酸１０ｇ、グルコー
ス２ｇ及び寒天１６ｇを蒸留水１ｌに溶解］に塗沫した
。
【００８３】この培地上への、変異株の生育を見ること
により、デレーションミュータントＤＮＡ断片による、
変異株の相補性を調べた。その結果を図２に示す４．０
ｋｂのＤＮＡ断片のうち、右側末端の約２．４ｋｂのＤ
ＮＡ断片上に左からｂｉｏＡ、ｂｉｏＤの順に各々遺伝
情報がコードされていることが明らかになった。
により、デレーションミュータントＤＮＡ断片による、
変異株の相補性を調べた。その結果を図２に示す４．０
ｋｂのＤＮＡ断片のうち、右側末端の約２．４ｋｂのＤ
ＮＡ断片上に左からｂｉｏＡ、ｂｉｏＤの順に各々遺伝
情報がコードされていることが明らかになった。
【００８４】（Ｃ）ジアミノペラルゴン酸アミノトラン
スフエラーゼをコードする遺伝子（ｂｉｏＡ）の塩基配
列の決定 実施例２の（Ｄ）項で得られた、ジアミノペラルゴン酸
アミノトランスフエラーゼ及びデスチオビオチンシンセ
ターゼをコードする遺伝子（ｂｉｏＡ及びｂｉｏＤ）を
含む長さ約４．０ｋｂの図２に示すＤＮＡ断片のうち、
右側末端の約２．４ｋｂのＤＮＡ断片について、実施例
３の（Ａ）項で得られた４０クローンのデレーションミ
ュータントからさらに選抜した１７クローン（図２中に
→で示す）を使って、その塩基配列をＭ１３ファージを
用いる、ダイデオキシヌクレオチド酵素法（ｄｉｄｅｏ
ｘｙ ｃｈａｉｎ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ 法）（Ｓ
ａｎｇｅｒ， Ｆ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎ
ａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７４、５４
６３、１９７７）により決定した。
スフエラーゼをコードする遺伝子（ｂｉｏＡ）の塩基配
列の決定 実施例２の（Ｄ）項で得られた、ジアミノペラルゴン酸
アミノトランスフエラーゼ及びデスチオビオチンシンセ
ターゼをコードする遺伝子（ｂｉｏＡ及びｂｉｏＤ）を
含む長さ約４．０ｋｂの図２に示すＤＮＡ断片のうち、
右側末端の約２．４ｋｂのＤＮＡ断片について、実施例
３の（Ａ）項で得られた４０クローンのデレーションミ
ュータントからさらに選抜した１７クローン（図２中に
→で示す）を使って、その塩基配列をＭ１３ファージを
用いる、ダイデオキシヌクレオチド酵素法（ｄｉｄｅｏ
ｘｙ ｃｈａｉｎ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ 法）（Ｓ
ａｎｇｅｒ， Ｆ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎ
ａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７４、５４
６３、１９７７）により決定した。
【００８５】その塩基配列中には、図１の切断点地図に
示したＳａｃＩ上流からＤｒａＩＩ、ＢａｍＨＩの方向
に向って一つの大きなオープンリーディングフレームと
、ＢａｍＨＩ下流からＳａｌＩの方向に向ってもう一つ
のオープンリーディングフレームが存在していた。
示したＳａｃＩ上流からＤｒａＩＩ、ＢａｍＨＩの方向
に向って一つの大きなオープンリーディングフレームと
、ＢａｍＨＩ下流からＳａｌＩの方向に向ってもう一つ
のオープンリーディングフレームが存在していた。
【００８６】この二つのオープンリーディングフレーム
のうち、ＳａｃＩ部位の１３３〜１３１塩基上流の翻訳
開始コドンから始まるオープンリーディングフレームの
存在から、ジアミノペラルゴン酸アミノトランスフエラ
ーゼをコードする遺伝子（ｂｉｏＡ）は、前記配列番号
１で示した塩基配列を有する４２３のアミノ酸をコード
する１２６９の塩基対より構成されていることが明らか
となった。
のうち、ＳａｃＩ部位の１３３〜１３１塩基上流の翻訳
開始コドンから始まるオープンリーディングフレームの
存在から、ジアミノペラルゴン酸アミノトランスフエラ
ーゼをコードする遺伝子（ｂｉｏＡ）は、前記配列番号
１で示した塩基配列を有する４２３のアミノ酸をコード
する１２６９の塩基対より構成されていることが明らか
となった。
【００８７】また、ＢａｍＨＩ部位の１１３〜１１５塩
基下流の翻訳開始コドンＡＴＧに続いて２２４のコドン
がつながっているオープンリーディングフレームの存在
から、デスチオビオチンシンセターゼをコードする遺伝
子（ｂｉｏＤ）は、前記配列番号２で示した塩基配列を
有する２２４のアミノ酸をコードする６７２の塩基対よ
り構成されていることが明らかとなった。
基下流の翻訳開始コドンＡＴＧに続いて２２４のコドン
がつながっているオープンリーディングフレームの存在
から、デスチオビオチンシンセターゼをコードする遺伝
子（ｂｉｏＤ）は、前記配列番号２で示した塩基配列を
有する２２４のアミノ酸をコードする６７２の塩基対よ
り構成されていることが明らかとなった。
【００８８】
【実施例４】コリネ型細菌内で複製した安定プラスミド
ベクターｐＣＲＹ３０の作成 （Ａ）プラスミドｐＢＹ５０３の調製 プラスミドｐＢＹ５０３は、ブレビバクテリウム・スタ
チオニスＩＦ０１２１４４（ＦＥＲＭ ＢＰ−２５１
５）から分離された分子量約１０メガダルトンのプラス
ミドであり、特開平１−９５７８５号公報に記載のよう
にして調製した。半合成培地Ａ培地［尿素２ｇ、（ＮＨ
４）２ＳＯ４ ７ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４ ０．５ｇ、Ｋ
Ｈ２ＰＯ４ ０．５ｇ、ＭｇＳＯ４ ０．５ｇ、Ｆ
ｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ６ｍｇ、ＭｎＳＯ４・４〜６Ｈ
２Ｏ ６ｍｇ、酵母エキス２．５ｇ、カザミノ酸５ｇ
、ビオチン２００μｇ、塩酸チアミン２００μｇ、グル
コース２０ｇ及び純水１リツトル］１リツトルに、ブレ
ビバクテリウム・スタチオニス１Ｆ０１２１４４を対数
増殖期後期まで培養し、菌体を集めた。得られた菌体を
１０ｍｇ／ｍｌの濃度にリゾチームを含む緩衝液［２５
ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、１０ｍ
ＭのＥＤＴＡ、５０ｍＭグルコース］２０ｍｌに懸濁し
、３７℃で１時間反応させた。反応液にアルカリ−ＳＤ
Ｓ液［０．２ＮＮａＯＨ、１％（Ｗ／Ｖ）ＳＤＳ］４０
ｍｌを添加し、緩やかに混和して室温にて１５分間静置
した。次に、この反応液に酢酸カリウム溶液［５Ｍ酢酸
カリウム溶液６０ｍｌ、酢酸１１．５ｍｌ、純水２８．
５ｍｌの混合液］３０ｍｌを添加し、充分混和してから
氷水中に１５分間静置した。
ベクターｐＣＲＹ３０の作成 （Ａ）プラスミドｐＢＹ５０３の調製 プラスミドｐＢＹ５０３は、ブレビバクテリウム・スタ
チオニスＩＦ０１２１４４（ＦＥＲＭ ＢＰ−２５１
５）から分離された分子量約１０メガダルトンのプラス
ミドであり、特開平１−９５７８５号公報に記載のよう
にして調製した。半合成培地Ａ培地［尿素２ｇ、（ＮＨ
４）２ＳＯ４ ７ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４ ０．５ｇ、Ｋ
Ｈ２ＰＯ４ ０．５ｇ、ＭｇＳＯ４ ０．５ｇ、Ｆ
ｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ６ｍｇ、ＭｎＳＯ４・４〜６Ｈ
２Ｏ ６ｍｇ、酵母エキス２．５ｇ、カザミノ酸５ｇ
、ビオチン２００μｇ、塩酸チアミン２００μｇ、グル
コース２０ｇ及び純水１リツトル］１リツトルに、ブレ
ビバクテリウム・スタチオニス１Ｆ０１２１４４を対数
増殖期後期まで培養し、菌体を集めた。得られた菌体を
１０ｍｇ／ｍｌの濃度にリゾチームを含む緩衝液［２５
ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、１０ｍ
ＭのＥＤＴＡ、５０ｍＭグルコース］２０ｍｌに懸濁し
、３７℃で１時間反応させた。反応液にアルカリ−ＳＤ
Ｓ液［０．２ＮＮａＯＨ、１％（Ｗ／Ｖ）ＳＤＳ］４０
ｍｌを添加し、緩やかに混和して室温にて１５分間静置
した。次に、この反応液に酢酸カリウム溶液［５Ｍ酢酸
カリウム溶液６０ｍｌ、酢酸１１．５ｍｌ、純水２８．
５ｍｌの混合液］３０ｍｌを添加し、充分混和してから
氷水中に１５分間静置した。
【００８９】溶菌物全量を遠心管に移し、４℃で１０分
間、１５，０００×ｇの遠心分離にかけ、上澄液を得た
。
間、１５，０００×ｇの遠心分離にかけ、上澄液を得た
。
【００９０】これに等量のフエノール−クロロホルム液
（フエノール：クロロホルム＝１：１混和液）を加え懸
濁した後、遠心管に移し、室温下で５分間、１５，００
０×ｇの遠心分離にかけ、水層を回収した。水層に２倍
量のエタノールを加え、−２０℃で１時間静置後、４℃
で１０分間、１５，０００×ｇの遠心分離にかけ、沈澱
を回収した。
（フエノール：クロロホルム＝１：１混和液）を加え懸
濁した後、遠心管に移し、室温下で５分間、１５，００
０×ｇの遠心分離にかけ、水層を回収した。水層に２倍
量のエタノールを加え、−２０℃で１時間静置後、４℃
で１０分間、１５，０００×ｇの遠心分離にかけ、沈澱
を回収した。
【００９１】沈澱を減圧乾燥後、ＴＥ緩衝液［トリス１
０ｍＭ、ＥＤＴＡ１ｍＭ、ＨＣｌにてｐＨ８．０に調整
］２ｍｌに溶解した。溶解液に塩化セシウム溶液［５倍
濃度のＴＥ緩衝液１００ｍｌに塩化セシウム１７０ｇを
溶解させた液］１５ｍｌと１０ｍｇ／ｍｌエチジウムプ
ロマイド溶液１ｍｌを加えて、密度を１．３９２ｇ／ｍ
ｌに合わせた。この溶液を１２℃で４２時間、１１６，
０００×ｇの遠心分離を行つた。
０ｍＭ、ＥＤＴＡ１ｍＭ、ＨＣｌにてｐＨ８．０に調整
］２ｍｌに溶解した。溶解液に塩化セシウム溶液［５倍
濃度のＴＥ緩衝液１００ｍｌに塩化セシウム１７０ｇを
溶解させた液］１５ｍｌと１０ｍｇ／ｍｌエチジウムプ
ロマイド溶液１ｍｌを加えて、密度を１．３９２ｇ／ｍ
ｌに合わせた。この溶液を１２℃で４２時間、１１６，
０００×ｇの遠心分離を行つた。
【００９２】プラスミドｐＢＹ５０３は紫外線照射によ
り遠心管内で下方のバンドとして見い出される。このバ
ンドを注射器で遠心管の側面から抜きとることにより、
プラスミドｐＢＹ５０３を含む分画液を得た。
り遠心管内で下方のバンドとして見い出される。このバ
ンドを注射器で遠心管の側面から抜きとることにより、
プラスミドｐＢＹ５０３を含む分画液を得た。
【００９３】次いでこの分画液を等量のイソアミルアル
コールで４回処理してエチジウムプロマイドを抽出除去
し、その後にＴＥ緩衝液に対して透析を行つた。このよ
うにして得られたプラスミドｐＢＹ５０３を含む透析液
に３Ｍ酢酸ナトリウム溶液を最終濃度３０ｍＭに添加し
た後、２倍量エタノールを加え、−２０℃１時間静置し
た。この溶液を１５，０００×ｇの遠心分離にかけてＤ
ＮＡを沈降させ、プラスミドｐＢＹ５０３を５０μｇ得
た。
コールで４回処理してエチジウムプロマイドを抽出除去
し、その後にＴＥ緩衝液に対して透析を行つた。このよ
うにして得られたプラスミドｐＢＹ５０３を含む透析液
に３Ｍ酢酸ナトリウム溶液を最終濃度３０ｍＭに添加し
た後、２倍量エタノールを加え、−２０℃１時間静置し
た。この溶液を１５，０００×ｇの遠心分離にかけてＤ
ＮＡを沈降させ、プラスミドｐＢＹ５０３を５０μｇ得
た。
【００９４】（Ｂ）プラスミドベクターｐＣＲＹ３０の
作成 プラスミドｐＨＳＧ２９８（宝酒造製）０．５μｇに制
限酵素ＳａｌＩ（５ｕｎｉｔ）を３７℃１時間反応させ
、プラスミドＤＮＡを完全に分解した。
作成 プラスミドｐＨＳＧ２９８（宝酒造製）０．５μｇに制
限酵素ＳａｌＩ（５ｕｎｉｔ）を３７℃１時間反応させ
、プラスミドＤＮＡを完全に分解した。
【００９５】前記（Ａ）項で調製したプラスミドｐＢＹ
５０３の２μｇに制限酵素ＸｈｏＩ（１ｕｎｉｔ）を３
７℃で３０分間反応させ、プラスミドＤＮＡを部分分解
した。
５０３の２μｇに制限酵素ＸｈｏＩ（１ｕｎｉｔ）を３
７℃で３０分間反応させ、プラスミドＤＮＡを部分分解
した。
【００９６】両者のプラスミドＤＮＡ分解物を混合し、
制限酵素を不活性化するために６５℃で１０分間加熱処
理した後、該失活溶液中の成分が最終濃度として各々５
０ｍＭトリス緩衝液ｐＨ７．６、１０ｍＭＭｇＣｌ２、
１０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭＡＴＰ及びＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔになるように各成分を強化し、
１６℃で１５時間保温した。この溶液を用いてエシエリ
ヒア・コリＪＭ１０９コンピテントセル（宝酒造製）を
形質転換した。
制限酵素を不活性化するために６５℃で１０分間加熱処
理した後、該失活溶液中の成分が最終濃度として各々５
０ｍＭトリス緩衝液ｐＨ７．６、１０ｍＭＭｇＣｌ２、
１０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭＡＴＰ及びＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔになるように各成分を強化し、
１６℃で１５時間保温した。この溶液を用いてエシエリ
ヒア・コリＪＭ１０９コンピテントセル（宝酒造製）を
形質転換した。
【００９７】形質転換株は３０μｇ／ｍｌ（最終濃度）
のカナマイシン、１００μｇ／ｍｌ（最終濃度）のＩＰ
ＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド
）、１００μｇ／ｍｌ（最終濃度）のＸ−ｇａｌ（５−
ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラク
トピラノシド）を含むＬ培地（トリプトン１０ｇ、酵母
エキス５ｇ、ＮａＣｌ５ｇ及び純水１リツトル、ｐＨ７
．２）で３７℃にて２４時間培養し、生育株として得ら
れた。これらの生育株のうち、白いコロニーで生育して
きたものを選択し、各々プラスミドをアルカリ−ＳＤＳ
法［Ｔ． Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｅ． Ｆ． Ｆｒｉｔ
ｓｃｈ， Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ， ”Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ” （１９８２） ｐ９０−９
１参照］により抽出した。
のカナマイシン、１００μｇ／ｍｌ（最終濃度）のＩＰ
ＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド
）、１００μｇ／ｍｌ（最終濃度）のＸ−ｇａｌ（５−
ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラク
トピラノシド）を含むＬ培地（トリプトン１０ｇ、酵母
エキス５ｇ、ＮａＣｌ５ｇ及び純水１リツトル、ｐＨ７
．２）で３７℃にて２４時間培養し、生育株として得ら
れた。これらの生育株のうち、白いコロニーで生育して
きたものを選択し、各々プラスミドをアルカリ−ＳＤＳ
法［Ｔ． Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｅ． Ｆ． Ｆｒｉｔ
ｓｃｈ， Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ， ”Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ” （１９８２） ｐ９０−９
１参照］により抽出した。
【００９８】その結果、プラスミドｐＨＳＧ２９８のＳ
ａｌＩ部位にプラスミドｐＢＹ５０３由来の約４．０ｋ
ｂの断片が挿入されたプラスミドｐＨＳＧ２９８−ｏｒ
ｉが得られた。
ａｌＩ部位にプラスミドｐＢＹ５０３由来の約４．０ｋ
ｂの断片が挿入されたプラスミドｐＨＳＧ２９８−ｏｒ
ｉが得られた。
【００９９】次の同様の方法を用い、前記（Ａ）項で得
られたプラスミドｐＢＹ５０３ＤＮＡを制限酵素Ｋｐｎ
Ｉ及びＥｃｏＲＩにて処理して得られる約２．１ｋｂの
ＤＮＡ断片を上記プラスミドｐＨＳＧ２９８−ｏｒｉの
ＫｐｎＩ及びＥｃｏＲＩ部位にクローニングし、プラス
ミドベクターｐＣＲＹ３０を調製した。
られたプラスミドｐＢＹ５０３ＤＮＡを制限酵素Ｋｐｎ
Ｉ及びＥｃｏＲＩにて処理して得られる約２．１ｋｂの
ＤＮＡ断片を上記プラスミドｐＨＳＧ２９８−ｏｒｉの
ＫｐｎＩ及びＥｃｏＲＩ部位にクローニングし、プラス
ミドベクターｐＣＲＹ３０を調製した。
【０１００】
【実施例５】プラスミドｐＣＲＹ３０−ｂｉｏ３の作成
及びコリネ型細菌への導入 実施例２で得られたプラスミドｐＢＳ−ｂｉｏＡＤ４の
５μｇを制限酵素ＳａｌＩを５ｕｎｉｔ用いて３７℃で
１時間反応させ分解したものと、実施例３で得られたプ
ラスミドｐＣＲＹ３０の１μｇを制限酵素ＸｈｏＩの１
ｕｎｉｔを用いて３７℃で１時間反応させ分解したもの
を混合し、５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．６）、１０
ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭＡＴＰ、１０ｍＭＭｇ
Ｃｌ２およびＴ４ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔの各成分を
添加し（各成分の濃度は最終濃度である）、１２℃で１
５時間反応させ結合させた。このプラスミドを用いて前
記方法に従いエシエリヒア・コリＲ８７３（ｂｉｏＡ４
）株を形質転換し、カナマイシン５０μｇ／ｍｌを含む
選択培地［Ｋ２ＨＰＯ４ ７ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ ２
ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４ １ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２
Ｏ ０．１ｇ、カザミノ酸１０ｇ、グルコース２ｇ及
び寒天１６ｇを蒸留水１リツトルに溶解］に塗沫した。
及びコリネ型細菌への導入 実施例２で得られたプラスミドｐＢＳ−ｂｉｏＡＤ４の
５μｇを制限酵素ＳａｌＩを５ｕｎｉｔ用いて３７℃で
１時間反応させ分解したものと、実施例３で得られたプ
ラスミドｐＣＲＹ３０の１μｇを制限酵素ＸｈｏＩの１
ｕｎｉｔを用いて３７℃で１時間反応させ分解したもの
を混合し、５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．６）、１０
ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭＡＴＰ、１０ｍＭＭｇ
Ｃｌ２およびＴ４ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔの各成分を
添加し（各成分の濃度は最終濃度である）、１２℃で１
５時間反応させ結合させた。このプラスミドを用いて前
記方法に従いエシエリヒア・コリＲ８７３（ｂｉｏＡ４
）株を形質転換し、カナマイシン５０μｇ／ｍｌを含む
選択培地［Ｋ２ＨＰＯ４ ７ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ ２
ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４ １ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２
Ｏ ０．１ｇ、カザミノ酸１０ｇ、グルコース２ｇ及
び寒天１６ｇを蒸留水１リツトルに溶解］に塗沫した。
【０１０１】この培地上の生育株を常法により液体培養
し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミ
ドを制限酵素により切断し、アガロースゲル電気泳動を
用いて調べたところ、プラスミドｐＣＲＹ３０の長さ８
．６ｋｂのＤＮＡ断片に加え、長さ４．０ｋｂの挿入Ｄ
ＮＡ断片が認められた。
し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミ
ドを制限酵素により切断し、アガロースゲル電気泳動を
用いて調べたところ、プラスミドｐＣＲＹ３０の長さ８
．６ｋｂのＤＮＡ断片に加え、長さ４．０ｋｂの挿入Ｄ
ＮＡ断片が認められた。
【０１０２】上記の如く調製されたプラスミドＤＮＡを
コリネ型細菌へ形質転換した。
コリネ型細菌へ形質転換した。
【０１０３】形質転換は、電気パルス法を用いて行つた
。ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−１４９７）プラスミドｐＢＹ５０２除去株
を１００ｍｌの前記Ａ培地で対数増殖初期まで培養し、
ペニシリンＧを１ユニツト／ｍｌになるように添加して
、さらに２時間振とう培養し、遠心分離により菌体を集
め、菌体を２０ｍｌのパルス用溶液（２７２ｍＭ Ｓｕ
ｃｒｏｓｅ、７ｍＭＫＨ２ＰＯ４、１ｍＭＭｇＣｌ２：
ｐＨ７．４）にて洗浄した。 さらに菌体を遠心分離して集め、５ｍｌのパルス用溶液
に懸濁し、０．７５ｍｌの細胞と、前記で得られたプラ
スミドＤＮＡ溶液５０μｌとを混合し、水中にて２０分
間静置した。ジーンパルサー（バイオラド社製）を用い
て、２５００ボルト、２５μＦＤに設定し、パルスを印
加後氷中に２０分間静置した。全量を３ｍｌの前記Ａ培
地に移し３０℃にて１時間培養後、カナマイシン１５μ
ｇ／ｍｌ（最終濃度）を含む前記Ａ寒天培地に植菌し３
０℃で２〜３日間培養した。出現したカナマイシン耐性
株より、前記実施例２（Ａ）項に記載の方法を用いてプ
ラスミドを得た。このプラスミドを各種制限酵素で切断
し、切断断片の大きさを測定した。その結果を下記の表
４に示す。
。ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−１４９７）プラスミドｐＢＹ５０２除去株
を１００ｍｌの前記Ａ培地で対数増殖初期まで培養し、
ペニシリンＧを１ユニツト／ｍｌになるように添加して
、さらに２時間振とう培養し、遠心分離により菌体を集
め、菌体を２０ｍｌのパルス用溶液（２７２ｍＭ Ｓｕ
ｃｒｏｓｅ、７ｍＭＫＨ２ＰＯ４、１ｍＭＭｇＣｌ２：
ｐＨ７．４）にて洗浄した。 さらに菌体を遠心分離して集め、５ｍｌのパルス用溶液
に懸濁し、０．７５ｍｌの細胞と、前記で得られたプラ
スミドＤＮＡ溶液５０μｌとを混合し、水中にて２０分
間静置した。ジーンパルサー（バイオラド社製）を用い
て、２５００ボルト、２５μＦＤに設定し、パルスを印
加後氷中に２０分間静置した。全量を３ｍｌの前記Ａ培
地に移し３０℃にて１時間培養後、カナマイシン１５μ
ｇ／ｍｌ（最終濃度）を含む前記Ａ寒天培地に植菌し３
０℃で２〜３日間培養した。出現したカナマイシン耐性
株より、前記実施例２（Ａ）項に記載の方法を用いてプ
ラスミドを得た。このプラスミドを各種制限酵素で切断
し、切断断片の大きさを測定した。その結果を下記の表
４に示す。
【０１０４】
【表５】
表４ プラスミドｐＣＲＹ３０−ｂｉｏ３
制限酵素 認識部位数 切
断断片の大きさ（ｋｂ） ＢａｍＨＩ
２ １．１、 ３
．９ ＥｃｏＲＩ １
１２．６ Ｋｐｎ Ｉ
１ １２．６
Ｓａｃ Ｉ ２
２．５、 １０．１ Ｓａｌ
Ｉ ２ ０
．４、 １２．２ Ｘｈｏ Ｉ
１ １２．６上記制限
酵素により特徴づけられるプラスミドをｐＣＲＹ３０−
ｂｉｏ３と命名した。このプラスミドの制限酵素切断点
地図を図２に示す。
制限酵素 認識部位数 切
断断片の大きさ（ｋｂ） ＢａｍＨＩ
２ １．１、 ３
．９ ＥｃｏＲＩ １
１２．６ Ｋｐｎ Ｉ
１ １２．６
Ｓａｃ Ｉ ２
２．５、 １０．１ Ｓａｌ
Ｉ ２ ０
．４、 １２．２ Ｘｈｏ Ｉ
１ １２．６上記制限
酵素により特徴づけられるプラスミドをｐＣＲＹ３０−
ｂｉｏ３と命名した。このプラスミドの制限酵素切断点
地図を図２に示す。
【０１０５】なお、プラスミドｐＣＲＹ３０−ｂｉｏ３
により形質転換されたブレビバクテリウム・フラバムＭ
Ｊ２３３−ＢＩＯ３は、茨城県つくば市東１丁目１番３
号の工業技術院微生物工業技術研究所に、平成３年２月
２６日付で：微工研菌寄第１２０４１号（ＦＥＲＭ
Ｐ−１２０４１）として寄託されている。
により形質転換されたブレビバクテリウム・フラバムＭ
Ｊ２３３−ＢＩＯ３は、茨城県つくば市東１丁目１番３
号の工業技術院微生物工業技術研究所に、平成３年２月
２６日付で：微工研菌寄第１２０４１号（ＦＥＲＭ
Ｐ−１２０４１）として寄託されている。
【０１０６】
【実施例６】プラスミドｐＣＲＹ３０−ｂｉｏ３の安定
性 前記のＡ培地１００ｍｌを５００ｍｌ容三角フラスコに
分注し、１２０℃で１５分間滅菌処理したものに、実施
例４で得た形質転換ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ
２３３−ＢＩＯ３を植菌し、３０℃にて２４時間振とう
培養を行つた後、同様にして調製したＡ培地１００ｍｌ
を５００ｍｌ容三角フラスコに分注し、１２０℃で１５
分間滅菌したものに、１ｍｌ当たり５０ｃｅｌｌｓの割
合になるように植継し、同じく３０℃にて２４時間振と
う培養を行つた。次に遠心分離して集菌し、菌体を洗浄
後、カナマイシンを５０μｇ／ｍｌの割合で添加したＡ
培地及び無添加のＡ培地を用いて調製した平板培地に一
定量塗沫し、３０℃にて１日培養後生育コロニーをカウ
ントした。
性 前記のＡ培地１００ｍｌを５００ｍｌ容三角フラスコに
分注し、１２０℃で１５分間滅菌処理したものに、実施
例４で得た形質転換ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ
２３３−ＢＩＯ３を植菌し、３０℃にて２４時間振とう
培養を行つた後、同様にして調製したＡ培地１００ｍｌ
を５００ｍｌ容三角フラスコに分注し、１２０℃で１５
分間滅菌したものに、１ｍｌ当たり５０ｃｅｌｌｓの割
合になるように植継し、同じく３０℃にて２４時間振と
う培養を行つた。次に遠心分離して集菌し、菌体を洗浄
後、カナマイシンを５０μｇ／ｍｌの割合で添加したＡ
培地及び無添加のＡ培地を用いて調製した平板培地に一
定量塗沫し、３０℃にて１日培養後生育コロニーをカウ
ントした。
【０１０７】この結果、カナマイシン添加および無添加
培地に生育したコロニーは同数であること、さらにＡ培
地生育コロニーは全てカナマイシン添加培地に生育する
こと、すなわち該プラスミドの高度の安定性を確認した
。
培地に生育したコロニーは同数であること、さらにＡ培
地生育コロニーは全てカナマイシン添加培地に生育する
こと、すなわち該プラスミドの高度の安定性を確認した
。
【０１０８】
【実施例７】ジアミノペラルゴン酸アミノトランスフエ
ラーゼ及びデスチオビオチンシンセターゼの製造培地（
尿素０．２％、硫酸アンモニム０．７％、ＫＨ２ＰＯ４
０．０５％、Ｋ２ＨＰＯ４ ０．０５％、ＭｇＳ
Ｏ４・７Ｈ２Ｏ ０．０５％、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ
６ｐｐｍ、ＭｎＳＯ４・４〜６Ｈ２Ｏ ６ｐｐｍ
、チアミン・ＨＣｌ １００μｇ／ｌ、及びビオチン
２００μｇ／ｌ）１００ｍｌを５００ｍｌ容三角フラス
コに分注、滅菌（滅菌後ｐＨ７．０）した後、ブレビバ
クテリウム・フラバムＭＪ２３３−ＢＩＯ３株を植菌し
、無菌的にグルコースを最終濃度２％（Ｗ／Ｖ）なるよ
うに加え、３０℃にて３日間振とう培養を行つた。
ラーゼ及びデスチオビオチンシンセターゼの製造培地（
尿素０．２％、硫酸アンモニム０．７％、ＫＨ２ＰＯ４
０．０５％、Ｋ２ＨＰＯ４ ０．０５％、ＭｇＳ
Ｏ４・７Ｈ２Ｏ ０．０５％、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ
６ｐｐｍ、ＭｎＳＯ４・４〜６Ｈ２Ｏ ６ｐｐｍ
、チアミン・ＨＣｌ １００μｇ／ｌ、及びビオチン
２００μｇ／ｌ）１００ｍｌを５００ｍｌ容三角フラス
コに分注、滅菌（滅菌後ｐＨ７．０）した後、ブレビバ
クテリウム・フラバムＭＪ２３３−ＢＩＯ３株を植菌し
、無菌的にグルコースを最終濃度２％（Ｗ／Ｖ）なるよ
うに加え、３０℃にて３日間振とう培養を行つた。
【０１０９】対照としてプラスミドｐＣＲＹ３０−ｂｉ
ｏ３を保持しないブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２
３３株を植菌し、同様に培養を行つた。
ｏ３を保持しないブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２
３３株を植菌し、同様に培養を行つた。
【０１１０】この培養液をベツクマン遠心機 Ｍｏｄｅ
ｌ Ｊ２−２１を用いて、８０００ｒｐｍで１０分間、
遠心し、菌体を集菌する。本試量菌体約５ｍｇに、０．
５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）を０．１２５ｍ
ｌ、１０％（Ｗ／Ｖ）ＳＤＳを０．２００ｍｌ、β−メ
ルカプトエタノールを０．０５０ｍｌを添加し、水で全
量を１．０ｍｌに合わせる。この試料液を沸騰水中で約
３分間処理する。上記の試料液１ｍｌに対して、０．０
５％（Ｗ／Ｖ）ＢＰＢと７０％（Ｖ／Ｖ）グリセロール
を含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）
の０．１ｍｌを加えたものを泳動用試料液とする。
ｌ Ｊ２−２１を用いて、８０００ｒｐｍで１０分間、
遠心し、菌体を集菌する。本試量菌体約５ｍｇに、０．
５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）を０．１２５ｍ
ｌ、１０％（Ｗ／Ｖ）ＳＤＳを０．２００ｍｌ、β−メ
ルカプトエタノールを０．０５０ｍｌを添加し、水で全
量を１．０ｍｌに合わせる。この試料液を沸騰水中で約
３分間処理する。上記の試料液１ｍｌに対して、０．０
５％（Ｗ／Ｖ）ＢＰＢと７０％（Ｖ／Ｖ）グリセロール
を含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）
の０．１ｍｌを加えたものを泳動用試料液とする。
【０１１１】試料液を「第一化学薬品（株）」製ＳＤＳ
−ＰＡＧプレート１０／２０−１０１０を用い、試料を
５μｌアプライした後、６０ｍＡの定電流で、約６０分
間泳動する。
−ＰＡＧプレート１０／２０−１０１０を用い、試料を
５μｌアプライした後、６０ｍＡの定電流で、約６０分
間泳動する。
【０１１２】Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ
Ｂｌｕｅ Ｒ−２５０の０．２５％（Ｗ／Ｖ）（正味
の濃度）を含むエタノール−酢酸−水（９：２：９、Ｖ
／Ｖ）混液にゲルプレートを浸して分離ゲル中の試料蛋
白質の染色を行う。室温で約６時間染色した後、エタノ
ール・酢酸・水（２５：８：６５、Ｖ／Ｖ）混液（脱色
液）に浸し、軽く振とうし、直ちに、新しい脱色液と交
換する。以後は、約１時間ごとに新しい脱色液と交換す
る。この脱色操作を分離ゲル中の蛋白質のバンドがかな
り明瞭に見えるようになるまで繰り返す（３〜５時間）
。つぎに、分離ゲルをメタノール・酢酸・水（１０：１
５：１７５、Ｖ／Ｖ）混液（保存液）に浸して、蛋白質
の存在していない部分（バツクグランド）を完全に脱色
する。かくして、ゲル上に分子量４万と、約２万の２つ
のタンパク質のバンドとして染色されていることにより
、各々、ジアミノペラルゴン酸アミノトランスフエラー
ゼおよび、デスチオビオチンシンセターゼが菌体内で産
生されてることを確認することができる。このバンドの
濃度を、フアルマシア社製「Ｕｌｔｒｏ Ｓｃａｎ Ｘ
Ｌレーザーデンシトメーター」を用いて、測定した結果
、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３−Ｂ１０３
株中に含まれるジアミノペラルゴン酸アミノトランスフ
エラーゼ及びデスチオビオチンシンセターゼの含量は、
ｐＣＲＹ３０−ｂｉｏ３を保持しないブレビバクテリウ
ム・フラバムＭＪ−２３３株に比べて、約５倍に上昇し
ていることが明らかとなつた。
Ｂｌｕｅ Ｒ−２５０の０．２５％（Ｗ／Ｖ）（正味
の濃度）を含むエタノール−酢酸−水（９：２：９、Ｖ
／Ｖ）混液にゲルプレートを浸して分離ゲル中の試料蛋
白質の染色を行う。室温で約６時間染色した後、エタノ
ール・酢酸・水（２５：８：６５、Ｖ／Ｖ）混液（脱色
液）に浸し、軽く振とうし、直ちに、新しい脱色液と交
換する。以後は、約１時間ごとに新しい脱色液と交換す
る。この脱色操作を分離ゲル中の蛋白質のバンドがかな
り明瞭に見えるようになるまで繰り返す（３〜５時間）
。つぎに、分離ゲルをメタノール・酢酸・水（１０：１
５：１７５、Ｖ／Ｖ）混液（保存液）に浸して、蛋白質
の存在していない部分（バツクグランド）を完全に脱色
する。かくして、ゲル上に分子量４万と、約２万の２つ
のタンパク質のバンドとして染色されていることにより
、各々、ジアミノペラルゴン酸アミノトランスフエラー
ゼおよび、デスチオビオチンシンセターゼが菌体内で産
生されてることを確認することができる。このバンドの
濃度を、フアルマシア社製「Ｕｌｔｒｏ Ｓｃａｎ Ｘ
Ｌレーザーデンシトメーター」を用いて、測定した結果
、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３−Ｂ１０３
株中に含まれるジアミノペラルゴン酸アミノトランスフ
エラーゼ及びデスチオビオチンシンセターゼの含量は、
ｐＣＲＹ３０−ｂｉｏ３を保持しないブレビバクテリウ
ム・フラバムＭＪ−２３３株に比べて、約５倍に上昇し
ていることが明らかとなつた。
【０１１３】
【発明の効果】本発明の新規なＤＮＡ断片は、コリネ型
細菌のビオチン生合成に関与する酵素のうち、ジアミノ
ペラルゴン酸アミノトランスフエラーゼ及びデスチオビ
オチンシンセターゼをコードする遺伝子（ｂｉｏＡ ｂ
ｉｏＤ）を含むＤＮＡ断片であり、該ＤＮＡ断片を含む
本発明のプラスミドを用いることにより、コリネ型細菌
に属する微生物の遺伝子操作による改良が可能となる。
細菌のビオチン生合成に関与する酵素のうち、ジアミノ
ペラルゴン酸アミノトランスフエラーゼ及びデスチオビ
オチンシンセターゼをコードする遺伝子（ｂｉｏＡ ｂ
ｉｏＤ）を含むＤＮＡ断片であり、該ＤＮＡ断片を含む
本発明のプラスミドを用いることにより、コリネ型細菌
に属する微生物の遺伝子操作による改良が可能となる。
【０１１４】また、このようにして改良された本発明の
コリネ型細菌に属する微生物を培養することにより、微
生物菌体内でジアミノペラルゴン酸アミノトランスフエ
ラーゼ及びデスチオビオチンシンセターゼの産生が増加
し、該酵素の菌体内への高度蓄積が可能となる。
コリネ型細菌に属する微生物を培養することにより、微
生物菌体内でジアミノペラルゴン酸アミノトランスフエ
ラーゼ及びデスチオビオチンシンセターゼの産生が増加
し、該酵素の菌体内への高度蓄積が可能となる。
【０１１５】
【配列表】配列番号：１
配列の長さ：１２７２
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ
起源
生物名：ブレビバクテリウム フラバム（Ｂｒｅｖｉ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ） 株名：ＭＪ２３３ 配列の特徴 特徴を表す記号：Ｐｅｐｔｉｄｅ 存在位置：１−１２６９ 特徴を決定した方法：Ｓ 配列： ＡＴＧ ＧＡＡ ＡＡＣ ＣＣＣ ＡＧＣ ＴＴＧ Ｃ
ＧＣ ＧＡＧ ＣＴＴ ＧＡＴ ＣＡＣ ＣＧＡ ＡＡ
Ｃ ＡＴＣ ＴＧＧ ＣＡＣ ４８Ｍｅｔ Ｇｌｕ
Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｇｌｕ
Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｈｉｓ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｔ
ｒｐ Ｈｉｓ １ ５
１０
１５ＣＣＧ ＴＡＴ ＧＣ
Ｃ ＧＣＧ ＣＣＧ ＧＧＣ ＧＴＧ ＣＧＣ ＡＡＣ
ＡＧＡ ＣＴＣ ＧＴＣ ＡＣＣ ＡＡＣ ＡＣＴ
ＧＡＴ ９６Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ａｌａ Ａｌａ Ｐ
ｒｏ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ａｒｇ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｌｅ
ｕ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ａｓｐ
２０
２５ ３
０ＧＧＧ ＧＴＧ ＴＴＣ ＴＴＧ ＡＣＧ ＣＴＧ
ＧＡＡ ＧＡＴ ＧＧＣ ＡＧＣ ＡＣＣ ＧＴＧ Ａ
ＴＴ ＧＡＣ ＧＣＧ ＡＴＧ １４４Ｇｌｙ Ｖａ
ｌ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ａｓｐ
Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ａｓｐ
Ａｌａ Ｍｅｔ ３５
４０
４５ＡＧＣ ＴＣＣ ＴＧＧ ＴＧＧ Ｔ
ＣＧ ＧＣＡ ＡＴＴ ＣＡＴ ＧＧＡ ＣＡＣ ＧＧ
Ａ ＣＡＣ ＣＣＣ ＣＧＡ ＣＴＧ ＡＡＡ １９
２Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｔｒｐ Ｔｒｐ Ｓｅｒ Ａｌａ
Ｉｌｅ Ｈｉｓ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｐ
ｒｏ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｌｙｓ ５０
５５
６０ＣＧＴ ＧＣＣ ＧＣＣ ＣＡ
Ａ ＡＡＡ ＣＡＡ ＡＴＣ ＧＡＣ ＡＣＣ ＡＴＧ
ＡＧＴ ＣＡＣ ＧＴＣ ＡＴＧ ＴＴＣ ＧＧＣ
２４０Ａｒｇ Ａｌａ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｇ
ｌｎ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ｈｉ
ｓ Ｖａｌ Ｍｅｔ Ｐｈｅ Ｇｌｙ ６５
７０
７５
８０ＧＧＡ ＣＴＡ ＡＣＣ ＣＡＣ ＧＡＧ
ＣＣＣ ＧＣＣ ＡＴＴ ＡＡＧ ＣＴＣ ＡＣＣ Ｃ
ＡＣ ＡＡＡ ＣＴＣ ＣＴＣ ＡＡＴ ２８８Ｇｌ
ｙ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ａｌａ
Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ｌｙｓ
Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｓｎ
８５ ９０
９５ＣＴＣ Ａ
ＣＴ ＧＧＣ ＡＡＴ ＧＣＣ ＴＴＴ ＧＡＣ ＣＡ
Ｃ ＧＴＣ ＴＴＴ ＴＡＴ ＴＣＣ ＧＡＴ ＴＣＧ
ＧＧＣ ＴＣＧ ３３６Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｇｌｙ
Ａｓｎ Ａｌａ Ｐｈｅ Ａｓｐ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ｐ
ｈｅ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｓｅ
ｒ １００
１０５
１１０ＧＴＣ ＴＣＧ ＧＴＧ ＧＡＧ ＧＴＣ
ＧＣＣ ＡＴＣ ＡＡＡ ＡＴＧ ＧＣＡ ＣＴＧ
ＣＡＧ ＧＣＣ ＴＣＣ ＡＡＡ ＧＧＡ ３８４Ｖ
ａｌ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ａｌａ Ｉｌ
ｅ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ａｌａ
Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｇｌｙ １１５
１２０
１２５ＣＡＡ ＧＧＣ ＣＡＣ
ＣＣＧ ＧＡＡ ＣＧＣ ＡＣＡ ＡＡＡ ＣＴＣ Ｃ
ＴＣ ＡＣＣ ＴＧＧ ＣＧＧ ＴＣＣ ＧＧＣ ＴＡ
Ｃ ４３２Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｐｒｏ Ｇｌｕ
Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｔｈｒ
Ｔｒｐ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｔｙｒ １３
０ １３５
１４０ＣＡＣ ＧＧＡ Ｇ
ＡＣ ＡＣＡ ＴＴＣ ＡＣＣ ＧＣＧ ＡＴＧ ＡＧ
Ｃ ＧＴＧ ＴＧＣ ＧＡＣ ＣＣＡ ＧＡＡ ＡＡＴ
ＧＧＣ ４８０Ｈｉｓ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｔｈｒ
Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｃ
ｙｓ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｇｌｙ１４５
１５０
１５５
１６０ＡＴＧ ＣＡＴ ＡＧＣ ＣＴＣ
ＴＧＧ ＡＡＡ ＧＧＣ ＡＣＡ ＣＴＣ ＣＣＣ
ＧＡＧ ＣＡＧ ＡＴＴ ＴＴＣ ＧＣＣ ＣＣＣ
５２８Ｍｅｔ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｔｒｐ Ｌｙ
ｓ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｇｌｎ
Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｐｒｏ
１６５
１７０ １７５
ＧＣＣ ＣＣＡ ＣＣＡ ＧＴＴ ＣＧＧ ＧＧＧ Ｔ
ＣＡ ＴＣＧ ＣＣＧ ＣＡＧ ＧＣＡ ＡＴＴ ＴＣ
Ｃ ＧＡＧ ＴＡＣ ＣＴＧ ５７６Ａｌａ Ｐｒｏ
Ｐｒｏ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｓｅｒ
Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｔ
ｙｒ Ｌｅｕ １８０
１８５
１９０ＣＡＣ ＡＧＣ ＡＴＧ ＧＡ
Ａ ＴＴＧ ＣＴＴ ＡＴＣ ＧＡＣ ＧＡＧ ＡＣＣ
ＧＴＣ ＴＣＣ ＧＣＡ ＡＴＣ ＡＴＣ ＡＴＣ
６２４Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｌ
ｅｕ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｓｅ
ｒ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ｉｌｅ
１９５ ２００
２０５ＧＡＡ ＣＣＧ
ＡＴＣ ＧＴＣ ＣＡＡ ＧＧＣ ＧＣＴ ＧＧＡ
ＧＧＣ ＡＴＧ ＣＧＣ ＴＴＴ ＣＡＣ ＧＡＴ Ｇ
ＴＣ ＧＣＡ ６７２Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｉｌｅ Ｖａ
ｌ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｍｅｔ
Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｈｉｓ Ａｓｐ Ｖａｌ Ａｌａ
２１０ ２１
５ ２２０ＣＴＣ
ＡＴＴ ＧＡＡ ＧＧＡ ＧＴＣ ＧＣＧ ＧＣＡ Ｃ
ＴＧ ＴＧＣ ＡＡＧ ＡＡＧ ＣＡＣ ＧＡＴ ＣＧ
Ｔ ＴＴＣ ＴＴＧ ７２０Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｇｌｕ
Ｇｌｙ Ｖａｌ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｃｙｓ
Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｈｉｓ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｌ
ｅｕ２２５ ２３０
２３５
２４０ＡＴＣ ＧＴＣ ＧＡ
Ｔ ＧＡＡ ＡＴＴ ＧＣＣ ＡＣＣ ＧＧＴ ＴＴＣ
ＧＧＣ ＣＧＣ ＡＣＣ ＧＧＴ ＧＡＡ ＣＴＡ
ＴＴＴ ７６８Ｉｌｅ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｉ
ｌｅ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ａｒ
ｇ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｐｈｅ
２４５
２５０
２５５ＧＣＣ ＡＣＧ ＴＴＡ ＡＧＣ ＡＡＴ
ＧＧＣ ＧＴＡ ＣＡＡ ＣＣＡ ＧＡＣ ＡＴＣ Ａ
ＴＧ ＴＧＴ ＧＴＧ ＧＧＣ ＡＡＧ ８１６Ａｌ
ａ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｖａｌ
Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｍｅｔ Ｃｙｓ
Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｌｙｓ ２６
０ ２６５
２７０ＧＣＣ ＣＴＣ Ａ
ＣＣ ＧＧＴ ＧＧＡ ＴＴＣ ＡＴＧ ＴＣＴ ＴＴ
Ｔ ＧＣＣ ＧＣＣ ＡＣＴ ＧＴＡ ＴＧＣ ＡＣＧ
ＧＡＣ ８６４Ａｌａ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｇｌｙ
Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ａｌａ Ａ
ｌａ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｓｐ
２７５
２８０ ２８５ＡＡ
Ｇ ＧＴＧ ＧＣＴ ＣＡＡ ＴＴＧ ＡＴＣ ＡＧＡ
ＴＣＣ ＣＣＡ ＧＡＡ ＧＧＣ ＧＧＡ ＧＧＴ
ＧＴＧ ＣＴＧ ＡＴＧ ９１２Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａ
ｌａ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｐｒ
ｏ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｌｅｕ
Ｍｅｔ ２９０
２９５ ３０
０ＣＡＴ ＧＧＣ ＣＣＣ ＡＣＣ ＴＴＴ ＡＴＧ
ＧＣＴ ＡＡＴ ＣＣＴ ＣＴＧ ＧＣＣ ＴＧＴ Ｇ
ＡＧ ＧＴＴ ＴＣＧ ＣＡＣ ９６０Ｈｉｓ Ｇｌ
ｙ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｍｅｔ Ａｌａ Ａｓｎ
Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｖａｌ
Ｓｅｒ Ｈｉｓ３０５
３１０ ３１５
３２０ＧＣＴ Ｔ
ＣＧ ＣＴＡ ＧＡＡ ＡＴＣ ＡＴＴ ＧＡＧ ＡＣ
Ｃ ＧＧＣ ＡＴＧ ＴＧＧ ＣＡＧ ＡＡＡ ＣＡＧ
ＧＴＴ ＡＡＡ １００８Ａｌａ Ｓｅｒ Ｌｅｕ
Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｍ
ｅｔ Ｔｒｐ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ｌｙ
ｓ ３２５
３３０
３３５ＡＡＡ ＡＴＣ ＧＡＡ ＧＣＣ
ＡＡＡ ＣＴＴ ＡＴＣ ＧＣＡ ＧＧＣ ＣＴＴ
ＴＣＣ ＣＣＡ ＣＴＴ ＣＧＡ ＴＧＴ ＡＴＴ １
０５６Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｌｅ
ｕ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｐｒｏ
Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｉｌｅ
３４０ ３４
５ ３５０ＣＣＡ
ＧＧＡ ＧＴＴ ＧＣＣ ＧＡＴ ＧＴＣ ＣＧＧ Ｇ
ＴＴ ＣＴＣ ＧＧＣ ＧＣＧ ＡＴＴ ＧＧＣ ＧＴ
Ｃ ＡＴＣ ＧＡＡ １１０４Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｖａｌ
Ａｌａ Ａｓｐ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｌｅｕ
Ｇｌｙ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｇ
ｌｕ ３５５
３６０
３６５ＡＴＧ ＧＡＡ ＣＡＡ ＡＡＴ ＧＴＧ ＡＡ
Ｔ ＧＴＣ ＧＡＡ ＧＡＡ ＧＣＣ ＡＣＴ ＣＡＧ
ＧＣＴ ＧＣＡ ＴＴＡ ＧＡＴ １１５２Ｍｅｔ
Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｖａｌ Ｇ
ｌｕ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ａｌａ Ａｌ
ａ Ｌｅｕ Ａｓｐ ３７０
３７５
３８０ ＣＡＣ ＧＧＴ ＧＴＧ ＴＧＧ Ａ
ＴＣ ＣＧＣ ＣＣＣ ＴＴＴ ＧＧＡ ＣＧＣ ＴＴ
Ｇ ＣＴＣ ＴＡＴ ＧＴＣ ＡＴＧ ＣＣＣ １２０
０Ｈｉｓ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｔｒｐ Ｉｌｅ Ａｒｇ
Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｔ
ｙｒ Ｖａｌ Ｍｅｔ Ｐｒｏ３８５
３９０
３９５ ４
００ＣＣＡ ＴＡＴ ＡＴＣ ＡＣＣ ＡＣＧ ＴＣＡ
ＧＡＧ ＣＡＡ ＴＧＣ ＧＣＡ ＣＡＧ ＡＴＣ
ＴＧＣ ＣＧＣ ＧＣＧ ＣＴＴ １２４８Ｐｒｏ Ｔ
ｙｒ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｇｌ
ｎ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｃｙｓ Ａｒｇ
Ａｌａ Ｌｅｕ ４
０５ ４１０
４１５ＣＡＴ ＧＣＴ
ＧＣＡ ＧＴＴ ＡＡＡ ＧＧＡ ＡＡＡ ＴＡＡ
１２７２Ｈｉｓ Ａｌａ Ａｌａ Ｖａｌ
Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｌｙｓ
４２０ 配列番号：２ 配列の長さ：６７５ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：ブレビバクテリウム フラバム（Ｂｒｅｖｉ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ） 株名：ＭＪ２３３ 配列の特徴 特徴を表す記号：Ｐｅｐｔｉｄｅ 存在位置：１−６７２ 配列を決定した方法：Ｓ 配列： ＡＴＧ ＣＣＡ ＴＴＴ ＴＴＡ ＴＴＴ ＧＴＣ Ａ
ＧＣ ＧＧＣ ＡＣＣ ＧＧＡ ＡＣＣ ＧＧＧ ＧＴ
Ｔ ＧＧＡ ＡＡＧ ＡＣＣ ４８Ｍｅｔ Ｐｒｏ
Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｇｌｙ
Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｌ
ｙｓ Ｔｈｒ １ ５
１０
１５ＴＴＣ ＴＣＣ ＡＣＡ
ＧＣＣ ＧＴＴ ＴＴＧ ＧＴＴ ＣＧＴ ＴＡＣ
ＴＴＡ ＧＣＣ ＧＡＴ ＣＡＡ ＧＧＡ ＣＡＣ Ｇ
ＡＴ ９６Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｖａ
ｌ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ａｌａ
Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ａｓｐ
２０
２５ ３０
ＧＴＴ ＣＴＧ ＣＣＣ ＧＴＡ ＡＡＧ ＣＴＣ Ｇ
ＴＣ ＣＡＡ ＡＣＡ ＧＧＴ ＧＡＡ ＣＴＴ ＣＣ
Ａ ＧＧＣ ＧＡＡ ＧＧＡ １４４Ｖａｌ Ｌｅｕ
Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｎ
Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｇ
ｌｕ Ｇｌｙ ３５
４０
４５ＧＡＣ ＡＴＣ ＴＴＣ ＡＣＣ ＡＴ
Ｔ ＧＡＡ ＣＧＣ ＴＴＧ ＡＣＴ ＧＧＡ ＡＴＴ
ＧＣＴ ＧＧＡ ＧＡＧ ＧＡＡ ＴＴＴ １９２
Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ａ
ｒｇ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｇｌ
ｙ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｐｈｅ ５０
５５
６０ＧＣＴ ＣＧＴ ＴＴＣ ＡＡＡ
ＧＡＣ ＣＣＴ ＣＴＴ ＧＣＧ ＣＣＡ ＡＡＴ
ＣＴＧ ＧＣＡ ＧＣＣ ＣＧＡ ＣＧＡ ＧＡＧ
２４０Ａｌａ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｐｒ
ｏ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ａｌａ
Ａｌａ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｇｌｕ ６５
７０
７５
８０ＧＧＧ ＡＴＣ ＧＡＧ ＣＣＡ ＡＴＡ Ｃ
ＡＧ ＴＴＴ ＧＡＴ ＣＡＧ ＡＴＴ ＡＴＣ ＴＣ
Ｇ ＴＧＧ ＣＴＴ ＣＧＴ ＧＧＴ ２８８Ｇｌｙ
Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ｐｈｅ
Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｔｒｐ Ｌ
ｅｕ Ａｒｇ Ｇｌｙ
８５ ９０
９５ＴＴＴ ＧＡ
Ｃ ＧＡＣ ＣＣＡ ＧＡＴ ＣＧＣ ＡＴＣ ＡＴＴ
ＧＴＧ ＧＴＧ ＧＡＧ ＧＧＣ ＧＣＴ ＧＧＴ
ＧＧＣ ＣＴＧ ３３６Ｐｈｅ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｐ
ｒｏ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｖａ
ｌ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｌｅｕ
１００
１０５
１１０ＣＴＧ ＧＴＣ ＡＧＡ ＴＴＡ ＧＧＧ
ＧＡＡ ＧＡＴ ＴＴＣ ＡＣＣ ＣＴＧ ＧＣＡ Ｇ
ＡＴ ＧＴＴ ＧＣＣ ＴＣＣ ＧＣＴ ３８４Ｌｅ
ｕ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ａｓｐ
Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｓｐ Ｖａｌ
Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｌａ １１５
１２０
１２５ＴＴＧ ＡＡＴ ＧＣＡ Ｃ
ＣＣ ＴＴＡ ＧＴＧ ＡＴＴ ＴＧＧ ＡＣＡ ＡＧ
Ｃ ＡＣＣ ＧＧＡ ＴＴＧ ＧＧＡ ＡＧＣ ＣＴＣ
４３２Ｌｅｕ Ａｓｎ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｌｅｕ
Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｇ
ｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｌｅｕ １３０
１３５
１４０ＡＡＣ ＧＣＴ ＧＣ
Ｔ ＧＡＡ ＴＴＡ ＡＧＣ ＧＴＴ ＧＡＧ ＧＣＡ
ＧＣＡ ＡＡＣ ＣＧＣ ＣＧＡ ＧＧＡ ＣＴＣ
ＡＣＡ ４８０Ａｓｎ Ａｌａ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｌ
ｅｕ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ａｌａ Ａｌａ Ａｓ
ｎ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｔｈｒ１４５
１５０
１５５
１６０ＧＴＧ ＴＴＧ ＧＧＡ ＧＴＣ
ＣＴＣ ＧＧＣ ＧＧＴ ＴＣＧ ＡＴＣ ＣＣＴ Ｃ
ＡＡ ＡＡＴ ＣＣＴ ＧＡＴ ＣＴＡ ＧＣＴ ５
２８Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇｌｙ
Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ａｓｎ
Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｌａ
１６５
１７０ １７５Ａ
ＣＧ ＡＴＧ ＣＴＴ ＡＡＴ ＣＴＣ ＧＡＡ ＧＡ
Ａ ＴＴＴ ＧＡＧ ＡＧＡ ＧＴＣ ＡＣＣ ＧＧＣ
ＧＴＧ ＣＣＣ ＴＴＴ ５７６Ｔｈｒ Ｍｅｔ
Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｇ
ｌｕ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｐｒ
ｏ Ｐｈｅ １８０
１８５
１９０ＴＧＧ ＧＧＡ ＧＣＴ ＴＴＧ
ＣＣＧ ＧＡＡ ＧＧＧ ＴＴＧ ＴＣＡ ＣＧＧ
ＧＴＧ ＧＡＧ ＧＧＧ ＴＴＣ ＧＴＣ ＧＡＡ
６２４Ｔｒｐ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｇｌ
ｕ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｇｌｕ
Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｇｌｕ １
９５ ２００
２０５
ＡＡＧ ＣＡＡ ＴＣＴ ＴＴＴ Ｃ
ＣＧ ＧＣＣ ＣＴＴ ＧＡＴ ＧＣＣ ＴＴＴ ＡＡ
Ｇ ＡＡＡ ＣＣＧ ＣＣＧ ＧＣＡ ＡＧＧ ６７
２Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ａｌａ
Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｐ
ｒｏ Ｐｒｏ Ａｌａ Ａｒｇ ２１０
２１５
２２０
ＴＧＡ
６７５
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ） 株名：ＭＪ２３３ 配列の特徴 特徴を表す記号：Ｐｅｐｔｉｄｅ 存在位置：１−１２６９ 特徴を決定した方法：Ｓ 配列： ＡＴＧ ＧＡＡ ＡＡＣ ＣＣＣ ＡＧＣ ＴＴＧ Ｃ
ＧＣ ＧＡＧ ＣＴＴ ＧＡＴ ＣＡＣ ＣＧＡ ＡＡ
Ｃ ＡＴＣ ＴＧＧ ＣＡＣ ４８Ｍｅｔ Ｇｌｕ
Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｇｌｕ
Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｈｉｓ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｔ
ｒｐ Ｈｉｓ １ ５
１０
１５ＣＣＧ ＴＡＴ ＧＣ
Ｃ ＧＣＧ ＣＣＧ ＧＧＣ ＧＴＧ ＣＧＣ ＡＡＣ
ＡＧＡ ＣＴＣ ＧＴＣ ＡＣＣ ＡＡＣ ＡＣＴ
ＧＡＴ ９６Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ａｌａ Ａｌａ Ｐ
ｒｏ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ａｒｇ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｌｅ
ｕ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ａｓｐ
２０
２５ ３
０ＧＧＧ ＧＴＧ ＴＴＣ ＴＴＧ ＡＣＧ ＣＴＧ
ＧＡＡ ＧＡＴ ＧＧＣ ＡＧＣ ＡＣＣ ＧＴＧ Ａ
ＴＴ ＧＡＣ ＧＣＧ ＡＴＧ １４４Ｇｌｙ Ｖａ
ｌ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ａｓｐ
Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ａｓｐ
Ａｌａ Ｍｅｔ ３５
４０
４５ＡＧＣ ＴＣＣ ＴＧＧ ＴＧＧ Ｔ
ＣＧ ＧＣＡ ＡＴＴ ＣＡＴ ＧＧＡ ＣＡＣ ＧＧ
Ａ ＣＡＣ ＣＣＣ ＣＧＡ ＣＴＧ ＡＡＡ １９
２Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｔｒｐ Ｔｒｐ Ｓｅｒ Ａｌａ
Ｉｌｅ Ｈｉｓ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｐ
ｒｏ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｌｙｓ ５０
５５
６０ＣＧＴ ＧＣＣ ＧＣＣ ＣＡ
Ａ ＡＡＡ ＣＡＡ ＡＴＣ ＧＡＣ ＡＣＣ ＡＴＧ
ＡＧＴ ＣＡＣ ＧＴＣ ＡＴＧ ＴＴＣ ＧＧＣ
２４０Ａｒｇ Ａｌａ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｇ
ｌｎ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ｈｉ
ｓ Ｖａｌ Ｍｅｔ Ｐｈｅ Ｇｌｙ ６５
７０
７５
８０ＧＧＡ ＣＴＡ ＡＣＣ ＣＡＣ ＧＡＧ
ＣＣＣ ＧＣＣ ＡＴＴ ＡＡＧ ＣＴＣ ＡＣＣ Ｃ
ＡＣ ＡＡＡ ＣＴＣ ＣＴＣ ＡＡＴ ２８８Ｇｌ
ｙ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ａｌａ
Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ｌｙｓ
Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｓｎ
８５ ９０
９５ＣＴＣ Ａ
ＣＴ ＧＧＣ ＡＡＴ ＧＣＣ ＴＴＴ ＧＡＣ ＣＡ
Ｃ ＧＴＣ ＴＴＴ ＴＡＴ ＴＣＣ ＧＡＴ ＴＣＧ
ＧＧＣ ＴＣＧ ３３６Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｇｌｙ
Ａｓｎ Ａｌａ Ｐｈｅ Ａｓｐ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ｐ
ｈｅ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｓｅ
ｒ １００
１０５
１１０ＧＴＣ ＴＣＧ ＧＴＧ ＧＡＧ ＧＴＣ
ＧＣＣ ＡＴＣ ＡＡＡ ＡＴＧ ＧＣＡ ＣＴＧ
ＣＡＧ ＧＣＣ ＴＣＣ ＡＡＡ ＧＧＡ ３８４Ｖ
ａｌ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ａｌａ Ｉｌ
ｅ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ａｌａ
Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｇｌｙ １１５
１２０
１２５ＣＡＡ ＧＧＣ ＣＡＣ
ＣＣＧ ＧＡＡ ＣＧＣ ＡＣＡ ＡＡＡ ＣＴＣ Ｃ
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Ｃ ４３２Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｐｒｏ Ｇｌｕ
Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｔｈｒ
Ｔｒｐ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｔｙｒ １３
０ １３５
１４０ＣＡＣ ＧＧＡ Ｇ
ＡＣ ＡＣＡ ＴＴＣ ＡＣＣ ＧＣＧ ＡＴＧ ＡＧ
Ｃ ＧＴＧ ＴＧＣ ＧＡＣ ＣＣＡ ＧＡＡ ＡＡＴ
ＧＧＣ ４８０Ｈｉｓ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｔｈｒ
Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｃ
ｙｓ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｇｌｙ１４５
１５０
１５５
１６０ＡＴＧ ＣＡＴ ＡＧＣ ＣＴＣ
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ＧＡＧ ＣＡＧ ＡＴＴ ＴＴＣ ＧＣＣ ＣＣＣ
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１６５
１７０ １７５
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Ｃ ＧＡＧ ＴＡＣ ＣＴＧ ５７６Ａｌａ Ｐｒｏ
Ｐｒｏ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｓｅｒ
Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｔ
ｙｒ Ｌｅｕ １８０
１８５
１９０ＣＡＣ ＡＧＣ ＡＴＧ ＧＡ
Ａ ＴＴＧ ＣＴＴ ＡＴＣ ＧＡＣ ＧＡＧ ＡＣＣ
ＧＴＣ ＴＣＣ ＧＣＡ ＡＴＣ ＡＴＣ ＡＴＣ
６２４Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｌ
ｅｕ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｓｅ
ｒ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ｉｌｅ
１９５ ２００
２０５ＧＡＡ ＣＣＧ
ＡＴＣ ＧＴＣ ＣＡＡ ＧＧＣ ＧＣＴ ＧＧＡ
ＧＧＣ ＡＴＧ ＣＧＣ ＴＴＴ ＣＡＣ ＧＡＴ Ｇ
ＴＣ ＧＣＡ ６７２Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｉｌｅ Ｖａ
ｌ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｍｅｔ
Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｈｉｓ Ａｓｐ Ｖａｌ Ａｌａ
２１０ ２１
５ ２２０ＣＴＣ
ＡＴＴ ＧＡＡ ＧＧＡ ＧＴＣ ＧＣＧ ＧＣＡ Ｃ
ＴＧ ＴＧＣ ＡＡＧ ＡＡＧ ＣＡＣ ＧＡＴ ＣＧ
Ｔ ＴＴＣ ＴＴＧ ７２０Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｇｌｕ
Ｇｌｙ Ｖａｌ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｃｙｓ
Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｈｉｓ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｌ
ｅｕ２２５ ２３０
２３５
２４０ＡＴＣ ＧＴＣ ＧＡ
Ｔ ＧＡＡ ＡＴＴ ＧＣＣ ＡＣＣ ＧＧＴ ＴＴＣ
ＧＧＣ ＣＧＣ ＡＣＣ ＧＧＴ ＧＡＡ ＣＴＡ
ＴＴＴ ７６８Ｉｌｅ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｉ
ｌｅ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ａｒ
ｇ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｐｈｅ
２４５
２５０
２５５ＧＣＣ ＡＣＧ ＴＴＡ ＡＧＣ ＡＡＴ
ＧＧＣ ＧＴＡ ＣＡＡ ＣＣＡ ＧＡＣ ＡＴＣ Ａ
ＴＧ ＴＧＴ ＧＴＧ ＧＧＣ ＡＡＧ ８１６Ａｌ
ａ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｖａｌ
Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｍｅｔ Ｃｙｓ
Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｌｙｓ ２６
０ ２６５
２７０ＧＣＣ ＣＴＣ Ａ
ＣＣ ＧＧＴ ＧＧＡ ＴＴＣ ＡＴＧ ＴＣＴ ＴＴ
Ｔ ＧＣＣ ＧＣＣ ＡＣＴ ＧＴＡ ＴＧＣ ＡＣＧ
ＧＡＣ ８６４Ａｌａ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｇｌｙ
Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ａｌａ Ａ
ｌａ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｓｐ
２７５
２８０ ２８５ＡＡ
Ｇ ＧＴＧ ＧＣＴ ＣＡＡ ＴＴＧ ＡＴＣ ＡＧＡ
ＴＣＣ ＣＣＡ ＧＡＡ ＧＧＣ ＧＧＡ ＧＧＴ
ＧＴＧ ＣＴＧ ＡＴＧ ９１２Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａ
ｌａ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｐｒ
ｏ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｌｅｕ
Ｍｅｔ ２９０
２９５ ３０
０ＣＡＴ ＧＧＣ ＣＣＣ ＡＣＣ ＴＴＴ ＡＴＧ
ＧＣＴ ＡＡＴ ＣＣＴ ＣＴＧ ＧＣＣ ＴＧＴ Ｇ
ＡＧ ＧＴＴ ＴＣＧ ＣＡＣ ９６０Ｈｉｓ Ｇｌ
ｙ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｍｅｔ Ａｌａ Ａｓｎ
Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｖａｌ
Ｓｅｒ Ｈｉｓ３０５
３１０ ３１５
３２０ＧＣＴ Ｔ
ＣＧ ＣＴＡ ＧＡＡ ＡＴＣ ＡＴＴ ＧＡＧ ＡＣ
Ｃ ＧＧＣ ＡＴＧ ＴＧＧ ＣＡＧ ＡＡＡ ＣＡＧ
ＧＴＴ ＡＡＡ １００８Ａｌａ Ｓｅｒ Ｌｅｕ
Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｍ
ｅｔ Ｔｒｐ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ｌｙ
ｓ ３２５
３３０
３３５ＡＡＡ ＡＴＣ ＧＡＡ ＧＣＣ
ＡＡＡ ＣＴＴ ＡＴＣ ＧＣＡ ＧＧＣ ＣＴＴ
ＴＣＣ ＣＣＡ ＣＴＴ ＣＧＡ ＴＧＴ ＡＴＴ １
０５６Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｌｅ
ｕ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｐｒｏ
Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｉｌｅ
３４０ ３４
５ ３５０ＣＣＡ
ＧＧＡ ＧＴＴ ＧＣＣ ＧＡＴ ＧＴＣ ＣＧＧ Ｇ
ＴＴ ＣＴＣ ＧＧＣ ＧＣＧ ＡＴＴ ＧＧＣ ＧＴ
Ｃ ＡＴＣ ＧＡＡ １１０４Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｖａｌ
Ａｌａ Ａｓｐ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｌｅｕ
Ｇｌｙ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｇ
ｌｕ ３５５
３６０
３６５ＡＴＧ ＧＡＡ ＣＡＡ ＡＡＴ ＧＴＧ ＡＡ
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ｌｕ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ａｌａ Ａｌ
ａ Ｌｅｕ Ａｓｐ ３７０
３７５
３８０ ＣＡＣ ＧＧＴ ＧＴＧ ＴＧＧ Ａ
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Ｇ ＣＴＣ ＴＡＴ ＧＴＣ ＡＴＧ ＣＣＣ １２０
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Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｔ
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Ａｌａ Ｌｅｕ ４
０５ ４１０
４１５ＣＡＴ ＧＣＴ
ＧＣＡ ＧＴＴ ＡＡＡ ＧＧＡ ＡＡＡ ＴＡＡ
１２７２Ｈｉｓ Ａｌａ Ａｌａ Ｖａｌ
Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｌｙｓ
４２０ 配列番号：２ 配列の長さ：６７５ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：ブレビバクテリウム フラバム（Ｂｒｅｖｉ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ） 株名：ＭＪ２３３ 配列の特徴 特徴を表す記号：Ｐｅｐｔｉｄｅ 存在位置：１−６７２ 配列を決定した方法：Ｓ 配列： ＡＴＧ ＣＣＡ ＴＴＴ ＴＴＡ ＴＴＴ ＧＴＣ Ａ
ＧＣ ＧＧＣ ＡＣＣ ＧＧＡ ＡＣＣ ＧＧＧ ＧＴ
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Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｇｌｙ
Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｌ
ｙｓ Ｔｈｒ １ ５
１０
１５ＴＴＣ ＴＣＣ ＡＣＡ
ＧＣＣ ＧＴＴ ＴＴＧ ＧＴＴ ＣＧＴ ＴＡＣ
ＴＴＡ ＧＣＣ ＧＡＴ ＣＡＡ ＧＧＡ ＣＡＣ Ｇ
ＡＴ ９６Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｖａ
ｌ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ａｌａ
Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ａｓｐ
２０
２５ ３０
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ＴＣ ＣＡＡ ＡＣＡ ＧＧＴ ＧＡＡ ＣＴＴ ＣＣ
Ａ ＧＧＣ ＧＡＡ ＧＧＡ １４４Ｖａｌ Ｌｅｕ
Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｎ
Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｇ
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Ａｌａ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｇｌｕ ６５
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７５
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ｅｕ Ａｒｇ Ｇｌｙ
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Ｃ ＧＡＣ ＣＣＡ ＧＡＴ ＣＧＣ ＡＴＣ ＡＴＴ
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ＧＧＣ ＣＴＧ ３３６Ｐｈｅ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｐ
ｒｏ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｖａ
ｌ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｌｅｕ
１００
１０５
１１０ＣＴＧ ＧＴＣ ＡＧＡ ＴＴＡ ＧＧＧ
ＧＡＡ ＧＡＴ ＴＴＣ ＡＣＣ ＣＴＧ ＧＣＡ Ｇ
ＡＴ ＧＴＴ ＧＣＣ ＴＣＣ ＧＣＴ ３８４Ｌｅ
ｕ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ａｓｐ
Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｓｐ Ｖａｌ
Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｌａ １１５
１２０
１２５ＴＴＧ ＡＡＴ ＧＣＡ Ｃ
ＣＣ ＴＴＡ ＧＴＧ ＡＴＴ ＴＧＧ ＡＣＡ ＡＧ
Ｃ ＡＣＣ ＧＧＡ ＴＴＧ ＧＧＡ ＡＧＣ ＣＴＣ
４３２Ｌｅｕ Ａｓｎ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｌｅｕ
Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｇ
ｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｌｅｕ １３０
１３５
１４０ＡＡＣ ＧＣＴ ＧＣ
Ｔ ＧＡＡ ＴＴＡ ＡＧＣ ＧＴＴ ＧＡＧ ＧＣＡ
ＧＣＡ ＡＡＣ ＣＧＣ ＣＧＡ ＧＧＡ ＣＴＣ
ＡＣＡ ４８０Ａｓｎ Ａｌａ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｌ
ｅｕ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ａｌａ Ａｌａ Ａｓ
ｎ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｔｈｒ１４５
１５０
１５５
１６０ＧＴＧ ＴＴＧ ＧＧＡ ＧＴＣ
ＣＴＣ ＧＧＣ ＧＧＴ ＴＣＧ ＡＴＣ ＣＣＴ Ｃ
ＡＡ ＡＡＴ ＣＣＴ ＧＡＴ ＣＴＡ ＧＣＴ ５
２８Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇｌｙ
Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ａｓｎ
Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｌａ
１６５
１７０ １７５Ａ
ＣＧ ＡＴＧ ＣＴＴ ＡＡＴ ＣＴＣ ＧＡＡ ＧＡ
Ａ ＴＴＴ ＧＡＧ ＡＧＡ ＧＴＣ ＡＣＣ ＧＧＣ
ＧＴＧ ＣＣＣ ＴＴＴ ５７６Ｔｈｒ Ｍｅｔ
Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｇ
ｌｕ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｐｒ
ｏ Ｐｈｅ １８０
１８５
１９０ＴＧＧ ＧＧＡ ＧＣＴ ＴＴＧ
ＣＣＧ ＧＡＡ ＧＧＧ ＴＴＧ ＴＣＡ ＣＧＧ
ＧＴＧ ＧＡＧ ＧＧＧ ＴＴＣ ＧＴＣ ＧＡＡ
６２４Ｔｒｐ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｇｌ
ｕ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｇｌｕ
Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｇｌｕ １
９５ ２００
２０５
ＡＡＧ ＣＡＡ ＴＣＴ ＴＴＴ Ｃ
ＣＧ ＧＣＣ ＣＴＴ ＧＡＴ ＧＣＣ ＴＴＴ ＡＡ
Ｇ ＡＡＡ ＣＣＧ ＣＣＧ ＧＣＡ ＡＧＧ ６７
２Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ａｌａ
Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｐ
ｒｏ Ｐｒｏ Ａｌａ Ａｒｇ ２１０
２１５
２２０
ＴＧＡ
６７５
【図１】本発明のジアミノペラルゴン酸アミノトランス
フエラーゼ及びデスチオビオチンシンセターゼをコード
する遺伝子（ｂｉｏＡ ｂｉｏＤ）を含むＤＮＡ断片の
制限酵素切断点地図。
フエラーゼ及びデスチオビオチンシンセターゼをコード
する遺伝子（ｂｉｏＡ ｂｉｏＤ）を含むＤＮＡ断片の
制限酵素切断点地図。
【図２】本発明のｂｉｏＡ及びｂｉｏＤ塩基配列決定の
戦略図。
戦略図。
【図３】本発明のプラスミドｐＣＲＹ３０−ｂｉｏ３の
制限酵素切断点地図。
制限酵素切断点地図。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 【請求項１】 コリネ型細菌由来のジアミノペラルゴ
ン酸アミノトランスフエラーゼ及びデスチオビオチンシ
ンセターゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片。 【請求項２】 コリネ型細菌がビオチン要求性の菌株
である請求項１記載のＤＮＡ断片。 【請求項３】 ビオチン要求性のコリネ型細菌がブレ
ビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３である請求項２
記載のＤＮＡ断片。 【請求項４】 制限酵素ＳａｌＩで切り出すことによ
り得られる大きさが約４．０ｋｂである請求項３記載の
ＤＮＡ断片。 【請求項５】 下記表１に記載する制限酵素で切断し
た場合、下記表１に記載する認識部位数と切断断片の大
きさを示す請求項２記載のＤＮＡ断片。 【表１】
表１ 制限酵素 認識部位数
切断断片の大きさ（ｋｂ） ＢａｍＨＩ
１ ０．８、
３．２ Ｄｒａ ＩＩ １
１．２、 ２．８ Ｓａ
ｃ Ｉ １
１．８、 ２．２ Ｘｈｏ Ｉ
１ １．３、 ２．７【
請求項６】 次のＤＮＡ塩基配列で示されるジアミノ
ペラルゴン酸アミノトランスフエラーゼをコードする遺
伝子ＤＮＡ断片。 ＡＴＧＧＡＡＡＡＣＣ ＣＣＡＧＣＴＴＧＣＧ ＣＧＡ
ＧＣＴＴＧＡＴ ＣＡＣＣＧＡＡＡＣＡ ＴＣＴＧＧＣ
ＡＣＣＣ ＧＴＡＴＧＣＣＧＣＧ ６０ＣＣＧＧＧ
ＣＧＴＧＣ ＧＣＡＡＣＡＧＡＣＴ ＣＧＴＣＡＣＣＡ
ＡＣ ＡＣＴＧＡＴＧＧＧＧ ＴＧＴＴＣＴＴＧＡＣ
ＧＣＴＧＧＡＡＧＡＴ １２０ＧＧＣＡＧＣＡＣＣＧ
ＴＧＡＴＴＧＡＣＧＣ ＧＡＴＧＡＧＣＴＣＣ ＴＧ
ＧＴＧＧＴＣＧＧ ＣＡＡＴＴＣＡＴＧＧ ＡＣＡＣＧ
ＧＡＣＡＣ １８０ＣＣＣＣＧＡＣＴＧＡ ＡＡＣＧ
ＴＧＣＣＧＣ ＣＣＡＡＡＡＡＣＡＡ ＡＴＣＧＡＣＡ
ＣＣＡ ＴＧＡＧＴＣＡＣＧＴ ＣＡＴＧＴＴＣＧＧＣ
２４０ＧＧＡＣＴＡＡＣＣＣ ＡＣＧＡＧＣＣＣＧ
Ｃ ＣＡＴＴＡＡＧＣＴＣ ＡＣＣＣＡＣＡＡＡＣ Ｔ
ＣＣＴＣＡＡＴＣＴ ＣＡＣＴＧＧＣＡＡＴ ３００
ＧＣＣＴＴＴＧＡＣＣ ＡＣＧＴＣＴＴＴＴＡ ＴＴＣ
ＣＧＡＴＴＣＧ ＧＧＣＴＣＧＧＴＣＴ ＣＧＧＴＧＧ
ＡＧＧＴ ＣＧＣＣＡＴＣＡＡＡ ３６０ＡＴＧＧＣ
ＡＣＴＧＣ ＡＧＧＣＣＴＣＣＡＡ ＡＧＧＡＣＡＡＧ
ＧＣ ＣＡＣＣＣＧＧＡＡＣ ＧＣＡＣＡＡＡＡＣＴ
ＣＣＴＣＡＣＣＴＧＧ ４２０ＣＧＧＴＣＣＧＧＣＴ
ＡＣＣＡＣＧＧＡＧＡ ＣＡＣＡＴＴＣＡＣＣ ＧＣ
ＧＡＴＧＡＧＣＧ ＴＧＴＧＣＧＡＣＣＣ ＡＧＡＡＡ
ＡＴＧＧＣ ４８０ＡＴＧＣＡＴＡＧＣＣ ＴＣＴＧ
ＧＡＡＡＧＧ ＣＡＣＡＣＴＣＣＣＣ ＧＡＧＣＡＧＡ
ＴＴＴ ＴＣＧＣＣＣＣＣＧＣ ＣＣＣＡＣＣＡＧＴＴ
５４０ＣＧＧＧＧＧＴＣＡＴ ＣＧＣＣＧＣＡＧＧ
Ｃ ＡＡＴＴＴＣＣＧＡＧ ＴＡＣＣＴＧＣＡＣＡ Ｇ
ＣＡＴＧＧＡＡＴＴ ＧＣＴＴＡＴＣＧＡＣ ６００
ＧＡＧＡＣＣＧＴＣＴ ＣＣＧＣＡＡＴＣＡＴ ＣＡＴ
ＣＧＡＡＣＣＧ ＡＴＣＧＴＣＣＡＡＧ ＧＣＧＣＴＧ
ＧＡＧＧ ＣＡＴＧＣＧＣＴＴＴ ６６０ＣＡＣＧＡ
ＴＧＴＣＧ ＣＡＣＴＣＡＴＴＧＡ ＡＧＧＡＧＴＣＧ
ＣＧ ＧＣＡＣＴＧＴＧＣＡ ＡＧＡＡＧＣＡＣＧＡ
ＴＣＧＴＴＴＣＴＴＧ ７２０ＡＴＣＧＴＣＧＡＴＧ
ＡＡＡＴＴＧＣＣＡＣ ＣＧＧＴＴＴＣＧＧＣ ＣＧ
ＣＡＣＣＧＧＴＧ ＡＡＣＴＡＴＴＴＧＣ ＣＡＣＧＴ
ＴＡＡＧＣ ７８０ＡＡＴＧＧＣＧＴＡＣ ＡＡＣＣ
ＡＧＡＣＡＴ ＣＡＴＧＴＧＴＧＴＧ ＧＧＣＡＡＧＧ
ＣＣＣ ＴＣＡＣＣＧＧＴＧＧ ＡＴＴＣＡＴＧＴＣＴ
８４０ＴＴＴＧＣＣＧＣＣＡ ＣＴＧＴＡＴＧＣＡ
Ｃ ＧＧＡＣＡＡＧＧＴＧ ＧＣＴＣＡＡＴＴＧＡ Ｔ
ＣＡＧＡＴＣＣＣＣ ＡＧＡＡＧＧＣＧＧＡ ９００
ＧＧＴＧＴＧＣＴＧＡ ＴＧＣＡＴＧＧＣＣＣ ＣＡＣ
ＣＴＴＴＡＴＧ ＧＣＴＡＡＴＣＣＴＣ ＴＧＧＣＣＴ
ＧＴＧＡ ＧＧＴＴＴＣＧＣＡＣ ９６０ＧＣＴＴＣ
ＧＣＴＡＧ ＡＡＡＴＣＡＴＴＧＡ ＧＡＣＣＧＧＣＡ
ＴＧ ＴＧＧＣＡＧＡＡＡＣ ＡＧＧＴＴＡＡＡＡＡ
ＡＡＴＣＧＡＡＧＣＣ １０２０ＡＡＡＣＴＴＡＴＣＧ
ＣＡＧＧＣＣＴＴＴＣ ＣＣＣＡＣＴＴＣＧＡ ＴＧ
ＴＡＴＴＣＣＡＧ ＧＡＧＴＴＧＣＣＧＡ ＴＧＴＣＣ
ＧＧＧＴＴ １０８０ＣＴＣＧＧＣＧＣＧＡ ＴＴＧＧ
ＣＧＴＣＡＴ ＣＧＡＡＡＴＧＧＡＡ ＣＡＡＡＡＴＧ
ＴＧＡ ＡＴＧＴＣＧＡＡＧＡ ＡＧＣＣＡＣＴＣＡＧ
１１４０ＧＣＴＧＣＡＴＴＡＧ ＡＴＣＡＣＧＧＴＧ
Ｔ ＧＴＧＧＡＴＣＣＧＣ ＣＣＣＴＴＴＧＧＡＣ Ｇ
ＣＴＴＧＣＴＣＴＡ ＴＧＴＣＡＴＧＣＣＣ １２００
ＣＣＡＴＡＴＡＴＣＡ ＣＣＡＣＧＴＣＡＧＡ ＧＣＡ
ＡＴＧＣＧＣＡ ＣＡＧＡＴＣＴＧＣＣ ＧＣＧＣＧＣ
ＴＴＣＡ ＴＧＣＴＧＣＡＧＴＴ １２６０ＡＡＡＧＧ
ＡＡＡＡＴ ＡＡ
１２７２ 【請求項７】 次のアミノ酸配列を有するジアミノペ
ラルゴン酸アミノトランスフエラーゼをコードする遺伝
子ＤＮＡ断片。 Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ａ
ｒｇ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｈｉｓ Ａｒｇ Ａｓ
ｎ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｈｉｓ １
５
１０ １５Ｐｒｏ
Ｔｙｒ Ａｌａ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｖａｌ
Ａｒｇ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ａ
ｓｎ Ｔｈｒ Ａｓｐ ２０
２５
３０Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｐｈ
ｅ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｇｌｙ
Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ａｌａ
Ｍｅｔ ３５
４０
４５Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｔｒｐ Ｔｒｐ Ｓｅｒ Ａ
ｌａ Ｉｌｅ Ｈｉｓ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｇｌｙ Ｈｉ
ｓ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｌｙｓ ５０
５５
６０Ａｒｇ Ａｌａ Ａｌａ
Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｔｈｒ
Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ｍｅｔ Ｐｈｅ Ｇ
ｌｙ ６５ ７０
７５
８０Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｔｈ
ｒ Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｌｙｓ
Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｌｅｕ
Ａｓｎ ８５
９０
９５Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ａ
ｓｎ Ａｌａ Ｐｈｅ Ａｓｐ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ｐｈ
ｅ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ
１００
１０５
１１０Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｖａｌ
Ａｌａ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｇ
ｌｎ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｇｌｙ
１１５ １２０
１２５Ｇｌｎ Ｇｌ
ｙ Ｈｉｓ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｌｙｓ
Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｔｒｐ Ａｒｇ Ｓｅｒ
Ｇｌｙ Ｔｙｒ １３０
１３５
１４０Ｈｉｓ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｔ
ｈｒ Ａｌａ Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｃｙｓ Ａｓ
ｐ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｇｌｙ１４５
１５０
１５５
１６０Ｍｅｔ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｔｒｐ
Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｇ
ｌｎ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｐｒｏ
１６５
１７０ １
７５Ａｌａ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｇｌｙ
Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｉｌｅ
Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｔｙｒ Ｌｅｕ
１８０ １８５
１９０Ｈｉｓ Ｓ
ｅｒ Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ａｓ
ｐ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｉｌｅ
Ｉｌｅ Ｉｌｅ １９５
２００
２０５Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｉｌｅ Ｖａｌ
Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ａ
ｒｇ Ｐｈｅ Ｈｉｓ Ａｓｐ Ｖａｌ Ａｌａ
２１０ ２１５
２２０Ｌｅｕ Ｉｌ
ｅ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｅｕ
Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｈｉｓ Ａｓｐ Ａｒｇ
Ｐｈｅ Ｌｅｕ２２５
２３０ ２３５
２４０Ｉｌｅ Ｖ
ａｌ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｇｌ
ｙ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ
Ｌｅｕ Ｐｈｅ ２
４５ ２５０
２５５Ａｌａ Ｔｈｒ
Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｐ
ｒｏ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｇｌ
ｙ Ｌｙｓ ２６０
２６５
２７０Ａｌａ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｇｌｙ
Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ａｌａ
Ａｌａ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｓｐ
２７５
２８０ ２８５Ｌ
ｙｓ Ｖａｌ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ａｒ
ｇ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ
Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｍｅｔ ２９０
２９５
３００Ｈｉｓ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｔｈｒ
Ｐｈｅ Ｍｅｔ Ａｌａ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ａ
ｌａ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｈｉｓ３０５
３１０
３１５
３２０Ａｌａ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｇｌｕ
Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｍｅｔ
Ｔｒｐ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ｌｙｓ
３２５
３３０
３３５Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｌｙ
ｓ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｓｅｒ
Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｉｌｅ
３４０
３４５ ３５０
Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ａｌａ Ａｓｐ Ｖａｌ Ａ
ｒｇ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｇｌ
ｙ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｇｌｕ ３５５
３６０
３６５Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ｇｌｎ
Ａｓｎ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｇｌｕ
Ａｌａ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａ
ｓｐ ３７０
３７５ ３８０
Ｈｉｓ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｔｒｐ Ｉｌｅ Ａｒｇ
Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｔ
ｙｒ Ｖａｌ Ｍｅｔ Ｐｒｏ３８５
３９０
３９５ ４
００Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｓｅｒ
Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｉｌｅ
Ｃｙｓ Ａｒｇ Ａｌａ Ｌｅｕ
４０５
４１０ ４１５Ｈ
ｉｓ Ａｌａ Ａｌａ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｌｙ
ｓ ４２０ 【請求項８】 次のＤＮＡ塩基配列で示されるデスチ
オビオチンシンセターゼをコードする遺伝子ＤＮＡ断片
。 ＡＴＧＣＣＡＴＴＴＴ ＴＡＴＴＴＧＴＣＡＧ ＣＧＧ
ＣＡＣＣＧＧＡ ＡＣＣＧＧＧＧＴＴＧ ＧＡＡＡＧＡ
ＣＣＴＴ ＣＴＣＣＡＣＡＧＣＣ ６０ＧＴＴＴＴ
ＧＧＴＴＣ ＧＴＴＡＣＴＴＡＧＣ ＣＧＡＴＣＡＡＧ
ＧＡ ＣＡＣＧＡＴＧＴＴＣ ＴＧＣＣＣＧＴＡＡＡ
ＧＣＴＣＧＴＣＣＡＡ １２０ＡＣＡＧＧＴＧＡＡＣ
ＴＴＣＣＡＧＧＣＧＡ ＡＧＧＡＧＡＣＡＴＣ ＴＴ
ＣＡＣＣＡＴＴＧ ＡＡＣＧＣＴＴＧＡＣ ＴＧＧＡＡ
ＴＴＧＣＴ １８０ＧＧＡＧＡＧＧＡＡＴ ＴＴＧＣ
ＴＣＧＴＴＴ ＣＡＡＡＧＡＣＣＣＴ ＣＴＴＧＣＧＣ
ＣＡＡ ＡＴＣＴＧＧＣＡＧＣ ＣＣＧＡＣＧＡＧＡＧ
２４０ＧＧＧＡＴＣＧＡＧＣ ＣＡＡＴＡＣＡＧＴ
Ｔ ＴＧＡＴＣＡＧＡＴＴ ＡＴＣＴＣＧＴＧＧＣ Ｔ
ＴＣＧＴＧＧＴＴＴ ＴＧＡＣＧＡＣＣＣＡ ３００
ＧＡＴＣＧＣＡＴＣＡ ＴＴＧＴＧＧＴＧＧＡ ＧＧＧ
ＣＧＣＴＧＧＴ ＧＧＣＣＴＧＣＴＧＧ ＴＣＡＧＡＴ
ＴＡＧＧ ＧＧＡＡＧＡＴＴＴＣ ３６０ＡＣＣＣＴ
ＧＧＣＡＧ ＡＴＧＴＴＧＣＣＴＣ ＣＧＣＴＴＴＧＡ
ＡＴ ＧＣＡＣＣＣＴＴＡＧ ＴＧＡＴＴＴＧＧＡＣ
ＡＡＧＣＡＣＣＧＧＡ ４２０ＴＴＧＧＧＡＡＧＣＣ
ＴＣＡＡＣＧＣＴＧＣ ＴＧＡＡＴＴＡＡＧＣ ＧＴ
ＴＧＡＧＧＣＡＧ ＣＡＡＡＣＣＧＣＣＧ ＡＧＧＡＣ
ＴＣＡＣＡ ４８０ＧＴＧＴＴＧＧＧＡＧ ＴＣＣＴ
ＣＧＧＣＧＧ ＴＴＣＧＡＴＣＣＣＴ ＣＡＡＡＡＴＣ
ＣＴＧ ＡＴＣＴＡＧＣＴＡＣ ＧＡＴＧＣＴＴＡＡＴ
５４０ＣＴＣＧＡＡＧＡＡＴ ＴＴＧＡＧＡＧＡＧ
Ｔ ＣＡＣＣＧＧＣＧＴＧ ＣＣＣＴＴＴＴＧＧＧ Ｇ
ＡＧＣＴＴＴＧＣＣ ＧＧＡＡＧＧＧＴＴＧ ６００
ＴＣＡＣＧＧＧＴＧＧ ＡＧＧＧＧＴＴＣＧＴ ＣＧＡ
ＡＡＡＧＣＡＡ ＴＣＴＴＴＴＣＣＧＧ ＣＣＣＴＴＧ
ＡＴＧＣ ＣＴＴＴＡＡＧＡＡＡ ６６０ＣＣＧＣＣ
ＧＧＣＡＡ ＧＧＴＧＡ
６７５ 【請求項９】 次のアミノ酸配列を有するデスチオビ
オチンシンセターゼをコードする遺伝子ＤＮＡ断片。 Ｍｅｔ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｓ
ｅｒ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｖａ
ｌ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｔｈｒ １
５ １
０ １５Ｐｈｅ
Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａ
ｒｇ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｇｌ
ｙ Ｈｉｓ Ａｓｐ ２０
２５
３０Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｐｒｏ
Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｔｈｒ
Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｇ
ｌｙ ３５
４０
４５Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｇｌ
ｕ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ａｌａ
Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｐｈｅ ５０
５５
６０Ａｌａ Ａｒｇ Ｐｈｅ
Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａ
ｓｎ Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｌａ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｇｌ
ｕ ６５ ７０
７５
８０Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｇｌｕ
Ｐｒｏ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ｐｈｅ Ａｓｐ Ｇｌｎ
Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｇ
ｌｙ ８５
９０
９５Ｐｈｅ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｐｒ
ｏ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｖａｌ
Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｌｅｕ
１００
１０５
１１０Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｇ
ｌｕ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｓ
ｐ Ｖａｌ Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｌａ
１１５ １２０
１２５Ｌｅｕ Ａｓｎ
Ａｌａ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｔｒｐ
Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｓ
ｅｒ Ｌｅｕ １３０
１３５
１４０Ａｓｎ Ａｌａ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｓｅ
ｒ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ａｌａ Ａｌａ Ａｓｎ Ａｒｇ
Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｔｈｒ１４５
１５０
１５５
１６０Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇ
ｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ａｓ
ｎ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｌａ
１６５
１７０ １７
５Ｔｈｒ Ｍｅｔ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｇｌｕ
Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｇ
ｌｙ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｐｈｅ
１８０ １８５
１９０Ｔｒｐ Ｇｌ
ｙ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｌｅｕ
Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｐｈｅ
Ｖａｌ Ｇｌｕ １９５
２００
２０５ Ｌｙｓ Ｇ
ｌｎ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｓ
ｐ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｐｒｏ
Ａｌａ Ａｒｇ ２１０
２１５
２２０ 【請求項１０】 請求項１〜９のいずれかに記載され
たＤＮＡ断片が導入された組換えプラスミド。 【請求項１１】 請求項１〜９のいずれかに記載され
たＤＮＡ断片と、プラスミドｐＢＹ５０３に由来するコ
リネ型細菌内で複製増殖機能を司る遺伝子を含むＤＮＡ
断片及び安定化機能を司る遺伝子を含むＤＮＡ断片を保
有する組換えプラスミド。 【請求項１２】 請求項１０〜１１のいずれかに記載
の組換えプラスミドで形質転換されたコリネ型細菌。 【請求項１３】 請求項１２記載のコリネ型細菌を培
養し、培養物中にジアミノペラルゴン酸アミノトランス
フエラーゼ及び／又はデスチオビオチンシンセターゼを
生成せしめることを特徴とするジアミノペラルゴン酸ア
ミノトランスフエラーゼ及び／又はデスチオビオチンシ
ンセターゼの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17475791A JPH04330284A (ja) | 1991-03-04 | 1991-06-20 | ジアミノペラルゴン酸アミノトランスフエラーゼ及びデスチオビオチンシンセターゼをコードする遺伝子並びにその利用 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6257291 | 1991-03-04 | ||
| JP3-62572 | 1991-03-04 | ||
| JP17475791A JPH04330284A (ja) | 1991-03-04 | 1991-06-20 | ジアミノペラルゴン酸アミノトランスフエラーゼ及びデスチオビオチンシンセターゼをコードする遺伝子並びにその利用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04330284A true JPH04330284A (ja) | 1992-11-18 |
Family
ID=26403621
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP17475791A Pending JPH04330284A (ja) | 1991-03-04 | 1991-06-20 | ジアミノペラルゴン酸アミノトランスフエラーゼ及びデスチオビオチンシンセターゼをコードする遺伝子並びにその利用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH04330284A (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1702980A1 (en) | 1999-07-01 | 2006-09-20 | Basf Aktiengesellschaft | Corynebacterium glutamicum gene encoding Hpr of phosphoenolpyruvate:sugar phosphotransferase system |
| US7273721B2 (en) | 1999-06-25 | 2007-09-25 | Basf Aktiengesellschaft | Corynebacterium glutamicum genes encoding proteins involved in membrane synthesis and membrane transport |
| US7393675B2 (en) | 1999-06-25 | 2008-07-01 | Basf Aktiengesellschaft | Corynebacterium glutamicum genes encoding proteins involved in carbon metabolism and energy production |
| US7410766B2 (en) | 1999-07-01 | 2008-08-12 | Basf Se | Corynebacterium glutamicum genes encoding phosphoenolpyruvate: sugar phosphotransferase system proteins |
| US7439050B2 (en) | 1999-06-25 | 2008-10-21 | Basf Aktiengesellschaft | Corynebacterium glutamicum genes encoding diaminopimelate epimerase |
-
1991
- 1991-06-20 JP JP17475791A patent/JPH04330284A/ja active Pending
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7273721B2 (en) | 1999-06-25 | 2007-09-25 | Basf Aktiengesellschaft | Corynebacterium glutamicum genes encoding proteins involved in membrane synthesis and membrane transport |
| US7393675B2 (en) | 1999-06-25 | 2008-07-01 | Basf Aktiengesellschaft | Corynebacterium glutamicum genes encoding proteins involved in carbon metabolism and energy production |
| US7439050B2 (en) | 1999-06-25 | 2008-10-21 | Basf Aktiengesellschaft | Corynebacterium glutamicum genes encoding diaminopimelate epimerase |
| EP1702980A1 (en) | 1999-07-01 | 2006-09-20 | Basf Aktiengesellschaft | Corynebacterium glutamicum gene encoding Hpr of phosphoenolpyruvate:sugar phosphotransferase system |
| US7410766B2 (en) | 1999-07-01 | 2008-08-12 | Basf Se | Corynebacterium glutamicum genes encoding phosphoenolpyruvate: sugar phosphotransferase system proteins |
| US7425435B2 (en) | 1999-07-01 | 2008-09-16 | Basf Aktiengesellschaft | Corynebacterium glutamicum genes encoding phosphoenolpyruvate: sugar phosphotransferase system proteins |
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