JPH0272876A - トリプトフアンシンターゼの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はトリプトファンシンターゼの製造法に関し、更
に詳しくは、トリプトファンシンターゼ遺伝子を含むＤ
ＮＡ領域と、該遺伝子の発現を制御しうるプロモーター
及びオペレーターを含むＤＮＡ領域と、コリネ型細菌内
での自律増殖能及び安定化機能を有するＤＮＡ領域から
成るプラスミドで形質転換されたコリネ型細菌を培地で
培養することによりトリプトファンシンターゼを製造す
る方法に関する。

ブレビバクテリウム属細菌を含むコリネ型細菌は、アミ
ノ酸、有機酸、プリンヌクレオチド等を生産する工業的
に有用な微生物であるが、組換えＤＮＡ技術の導入によ
る菌株の育種改良は、エシエリヒア・コリ等に比べてま
だ遅れており、特に、コリネ型細菌を宿主とする工業的
に有用な安定性に優れＩ：ベクターの開発が強く望まれ
ている。

一般に造成プラスミドの宿主内での安定性に関して、従
来より、培養時に宿主からのプラスミドの脱落や挿入遺
伝子の欠落等積々の遺伝子的不安定性が報告されており
、その対応策が検討されている。

例えば、エシェリヒア属のストレプトマイシンに依存し
ないという性質をコードする染色体遺伝子ＤＮＡ断片が
組み込まれたプラスミドを、エシェリヒア属のストレプ
トマイシン依存性変異株に含有せしめて、プラスミドを
含有する微生物の性質を安定化する方法が提案されてい
る（特開昭５５−１５６５９１号公報参照）。

しかしながら、かかる方法は経済的に問題があるのみな
らず、目的のプラスミドに複雑な機能を組み込む必要が
あるため、宿主の分裂増殖時にプラスミドが安定に娘細
胞に分配され難いことが予想され、工業的に応用するに
はかなりの問題がある。

また、トリプトファンシンターゼの生合成を司る遺伝子
を含むＤＮＡ領域のクローニングについても従来からい
ろいろと研究されているが、トリプトファンシンターゼ
の生合成を司る遺伝子を含むＤＮＡ領域が導入されたベ
クタープラスミドは、例えばＪ　ｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　
Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｍ　ｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ｖｏ１
１１８、ｐ２５３（１９８０）に記載されているように
、宿主内での安定性に問題があり、トリプトファンの工
業的製造に応用するには多くの困難があると考えられて
いる。

本発明者らは、先にコリネ型細菌内で複製増殖しうるブ
レビバクテリウム・スタチオニスＩＦ０１２１４４由来
のプラスミドｐＢＹ５０３上に安定化機能を担うＤＮＡ
断片が存在することを発見し、該ＤＮＡ断片を不安定な
プラスミドベクターに結合させることにより安定化させ
る方法を提案した（特願昭６３−１８５４２８号）。

そこで本発明者らは、上記プラスミドの安定化機能を担
うＤＮＡ断片を利用し、トリプトファンシンターゼ遺伝
子を担うプラスミドを安定化させ、トリプトファンシン
ターゼを安定かつ大量に製造させる方法を検討した結果
、本発明を完成するに至った。

かくして、本発明によれば、トリプトファンシンターゼ
産生能を何するコリネ型細菌、殊に、少なくともトリプ
トファンシンターゼの生合成を司る遺伝子を含むＤＮＡ
領域と、コリネ型細菌内での自律増殖能及び安定化機能
を有するＤＮＡ領域とから成るプラスミドで形質転換さ
れたコリネ型細菌を培地で培養し、培養物からトリプト
ファンシンターゼを採取することを特徴とするトリプト
ファンシンターゼの製造方法が提供される。

本発明に従う上記プラスミドを構成する［トリプトファ
ンシンターゼの生合成を司る遺伝子を含むＤＮＡ領域」
（以下「Ｔ領域」と略称することがある）には、インド
ールとＬ−又はＤＬ−セリンからのＬ−トリプトファン
の生合成を司る遺伝子を含む領域が包含され、しかして
、Ｔ領域には、例えば、トリプトファンオペロン中のト
リプトファンシンターゼ遺伝子を含むＤＮＡ領域（ａ）
、すなわちｔｒｐＡ及びｔｒｐＢを含むＤＮＡ領域に、
トリプトファンオペロン由来の該遺伝子の発現を制御し
うるプロモーター及びオペレーターを含むＤＮＡ領域（
ｂ）が結合したものが挙げられる。これらのＴ領域とし
て実用的にはエシエリヒア・コリ（Ｅ　５ｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａ　ｃｏｌｉ）由来のものが好適に使用され、この
Ｔ領域の供給源としては例えば、エシエリヒア・コリＡ
ＴＣＣ２３２８２、エシエリヒア・コリＡＴＣＣ２３４
３７、エシエリヒア・コリＡＴＣＣ２３４６１等が有利
に使用される。

これら供給源微生物からＴ領域を調製するための基本操
作としては、染色体遺伝子中にファージＩ８０を感染さ
せた後誘発し、ファージＤＮＡ中にトリプトファンオペ
ロンを取り込んだ７アージを大量に調製する。次に７ア
ージＤＮＡを抽出し、制限酵素ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ
等を用いてトリフトファンオヘロンＤＮＡ断片を切り出
し、このＤＮＡ断片をさらに制限酵素ＨｉｎｃＩ［で部
分分解を行なえば、ｔｒｐＡ及びｔｒｐ１３遺伝子を含
むＤＮＡ断片が得られる。次に該ＤＮＡ断片に５ａｌｌ
リンカ−を付与し、プラスミドｐＤＲ７２０（ファルマ
シア製）の５ａｌＩ部位に挿入した後ＥｃｏＲＩで切り
出し、さらにプラスミドｐＵＣ９（７アルマシア製）の
ＥｃｏＲ１部位に挿入した後ＢａｍＨＩで切り出すこと
によりｔｒｐＡ及びｔｒｐＢとトリプトファンプロモー
ター及びオペレーターとが結合したＤＮＡ断片、すなわ
ちＴ領域を調製することができる。

一方、「コリネ型細菌内での安定化機能を有するＤＮＡ
領域」（以下（Ｓ領域」と略称することがある）には、
コリネ型細菌内で複製増殖可能なプラスミドを安定化さ
せ得る機能を担う領域が包含され、例えば、ブレビバク
テリウム・スタチオニス（Ｂ　ｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ　５ｔａｔｉｏｎｉｓ）　Ｉ　Ｆ　Ｏｌ　２１４４
（ＦＥＲＭ　　Ｐ−１０１３６）が保有するプラスミド
ｐＢＹ５０３（このプラスミドの詳細については特願昭
６２−２５３７９号出願明細書参照）をＫｐｎｌの如き
制限酵素で切り出すことにより得られる約７．４ｋｂの
大きさのＤＮＡ断片が挙げられ、該ＤＮＡ断片の各種制
限酵素切断による分子量を下記衣１に示す。

表１ Ｅ　ｃ　ｏ　ＲＩ　　　　　　３　　　　１．８（２，
７）、１．６（２，５）１．４（２，１）、０．０６（
０，１）Ｘ　ｂａ　Ｉ　　　　　　　　　１　　　　３
．８（５，９）、１．０（１，５）Ｓ　ａｃ　Ｉ　　　
　　　　　　１　　　　４．４（６，８）、０．４（０
，６）Ｓ　ｍａ　Ｉ　　　　　　　１　　　４．３（６
，６）、０．５（０，８）以上に述べたトリプトファン
シンターゼの生合成を司る遺伝子を含むＤＮＡ領域（Ｔ
領域）と、コリネ型細菌内での安定化機能を有するＤＮ
Ａ領域（Ｓ領域）とを組み込むためのベクタープラスミ
ドとしては、コリネ型細菌内で複製増殖可能なものであ
れば特に制限はなく、例えば、以下のものが挙げられる
が、代表例としては、特願昭６３−１３６５９号明細書
に開示されているプラスミドｐＣＲＹ−２、ｐＣＲＹ−
３等を例示することができる。

（１）　　ｐＡＭ３３０ （２）　　ｐＡＭ１５１９ （３）　　ｐＡＪ６５５ （４）　　ｐＡＪ６１１ （５）　　ｐＡＪ１８４４ （６）　　ｐｃＧｌ （７）　　ｐＣＧ２ （８）　　ｐＣＧ４ （９）　　ｐｃＧｌｌ ９号公報参照 ５号公報参照 ００号公報参照 同上 同上 ００号公報参照 ７号公報参照 ９９号公報参照 同上 （ｌ　Ｏ）　　ｐＣＲＹ−２特願昭６３−１３６５９号
明細書参照 （ｌ　ｌ）　　ｐＣＲＹ−３同上 上記プラスミドベクターｐＣＲＹ−２及びｐｃＲＹ−３
を造成する方法としては、ブレビバクテリウム・フラバ
ムＭＪ２３３（ＦＥＲＭ　　Ｐ−３０６８）及びブレビ
バクテリウム・スタチオニスＩＦＯ１２１４４（ＦＥＲ
Ｍ　　Ｐ−１０１３６）からプラスミドｐＢＹ５０２及
びｐＢＹ５０３ＤＮＡを抽出し、制限酵素Ｈｉｎｄｎｌ
又はＫｐｎＩ処理により４．ｌｋｂ及び６ｋｂのＤＮＡ
断片を得る。次に該ＤＮＡ断片とプラスミドｐＨ５Ｇ３
９８（宝酒造製）を同様の制限酵素で処理したものと結
合させることによりｐＣＲＹ−２及びｐＣＲＹ−３が造
成できる（特願昭６３−１３６５９号明細書参照）。

［Ｔ領域Ｊ及び「Ｓ領域」のかかるベクタープラスミド
への導入は、例えば、まずベクタープラスミドｐＣＲＹ
−３を制限酵素ＫｐｎＩで部分分解により開裂させ、そ
こにｐＢＹ５０３ＤＮＡをＫｐｎｌで完全分解すること
により得られる７゜４ｋｂの「Ｓ領域」を連結酵素処理
により結合させ、次に上記プラスミドをＢａｍＨＩで完
全分解により開裂させた後、そこに前記の「Ｔ領域」を
連結酵素処理により結合させることにより行うことがで
きる。

以上に述べたＴ領域及びＳ領域を導入したベクタープラ
スミドで形質転換しうるコリネ型細菌としては、例えば
ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ　ｆｌａｖｕｍ）Ｍ　Ｊ　２３３由来の菌株が
挙げられる。なお、本菌株を宿主として用いる場合、本
菌株が保有するｐＢＹ５０２（特開昭６３−３６７８７
号公報参照）により形質転換が困難になる場合があるの
で、そのような場合には、本菌株よりｐＢＹ５０２を除
去することが望ましい。

そのようなプラスミドを除去する方法としては、例えば
、継代培養を繰り返すことにより自然に欠失させること
も可能であるし、人為的に除去することも可能である［
Ｂａｃｔ、　Ｒｅｖ、　３６　　ｐ３６１〜４０５（１
９７２）参照］。

上記プラスミドを人為的に除去する方法の一例を示せば
以下のとおりである。

宿主ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３の生育を
不完全に阻害する濃度のアクリジンオレンジ（濃度：０
，２〜５０μｇ／　ｍ＋２）もしくはエチジウムプロミ
ド（濃度二〇、２〜５０μｇ／　ｍＱ）等を含む培地に
、１ｍ（ｌ当り約ＩＯ細胞になるように植菌し、生育を
不完全に阻害しながら、約２４時間３５℃で培養する。

培養液を希釈後寒天培地に塗布し、３５℃で約２日培養
する。出現したコロニから各々独立にプラスミド抽出操
作を行ない、プラスミドが除去されている株を選択する
。この操作によりｐＢＹ５０２が除去されたブレビバク
テリウム・フラバムＭＪ２３３由来菌株が得られる。

このようにして得られたブレビバクテリウム・フラバム
ＭＪ２３３由来菌株への前記プラスミドの形質転換法と
しては、エシエリヒア・コリ及びエルビニア・カロトボ
ラについて知られているように［Ｃａ１ｖｉｎ、Ｎ　、
Ｍ　　ａｎｄ　Ｈａｎａｖａｌｔ、　Ｐ　、Ｃ。

Ｊ　ｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、
　　１７０．２７９６（］　　９３３）；　　Ｔ　ｔｏ
、　　Ｋ、、Ｎ１５ｈｉｄａ、Ｔ　　ａｎｄ　　Ｔ　ｚ
ａｋｉ。

Ｋ　、　　Ａ　ｇｒｉｃｕｌＬｕｒａｌ　　ａｎｄ　　
Ｂ　ｉｏｌｏｇｉｃａｌ　　ＣｈｅｍｉｓＬｒｙ。

５２．２９３（１９８８）］　、ＤＮＡ受容菌にパルス
波を通電することによりプラスミドを導入することが可
能である。

上記の方法で形質転換して得られたトリプトファンンン
ターゼ産生能を有するブレビバクテリウム・フラバムＭ
Ｊ２３３由来株の培養はそれ自体既知の方法で行なうこ
とができ、例えば以下に述べる如くして行なうことがで
きる。

まず、培地に用いる炭素源としては例えばグルコース、
エタノール、メタノール、溌糖蜜等が、窒素源としては
アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝
酸アンモニウム、尿素等がそれぞれ単独もしくは混合し
て用いることができる。

無機塩としては、リン酸−水素カリウム、リン酸二水素
カリウム、硫酸マグネシウム等が用いられる。この他に
ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンステイープリ
カー、カザミノ酸、ビオチン等の各種ビタミン等の栄養
素を培地に添加して用いることができる。

培養は通気撹拌、振とう等の好気的条件下で行ない、培
養温度は２０〜４０℃、好ましくは２５〜３５°Ｃで行
なう。培養途中のｐＨは５〜ｌＯ１好ましくは７〜８付
近にて行ない、培養中のｐＨの調整には酸、アルカリを
添加して行なうことができる。

培養開始時の炭素源濃度は、好ましくは１〜５容量％、
更に好ましくは２〜３容量％である。培養期間は１〜７
日間、最適期間は１〜３日間である。

このようにして得られる培養物から菌体を集め、それ自
体既知の方法で処理することにより、トリプトファンシ
ンターゼ画分を得ることができる。

以上に本発明の内容を概括的に説明したが次に実施例に
よりさらに具体的に説明する。しかしながら下記の実施
例は本発明について具体的な認識を得る一助としてのみ
挙げたものであり、これによって本発明の範囲は何ら限
定するものではない。

実施例１ 造成と性質 （Ａ）　　プラスミドｐＢＹ５０３の調製プラスミドｐ
ＢＹ５０３は、ブレビバクテリウム・スタチオニスＩＦ
Ｏ１２１４４ＦＥＲＭ　　Ｐ−１０１３６から新たに分
離された分子量約１０メガダルトンのプラスミドであり
、特願昭６２２５２３７９号明細書に記載のプラスミド
であり、次のようにして調製した。

半合成培地Ａ培地［尿素２ｇ、（ＮＨ，）、Ｓｏ。

７ｇ、に２ＨＰＯｉ　０．５ｇ、ＫＨ２ＰＯ１０，５ｇ
、Ｍｇ５Ｏ＊　ｏ、！５ｇ、Ｆｅ　ＳＯ＊・７Ｈ２０６
ｍｇ１Ｍｎ　Ｓｏ４・４−６Ｈ２０６ｍｇ５酵母エキス
２．５ｇ、カザミノ酸５ｇ１ビオチン２００μｇ１塩酸
チアミン２００μｇ１　グルコース２０ｇ１純水１（２
］ｌＱに、ブレビバクテリウム・スタチオニスＩＦ○１
２１４４を対数増殖期後期まで培養し、菌体を集めた。

得られた菌体をｌ　Ｏｍｇ／　ｍＱの濃度にリゾチーム
を含む緩衝液［２５ｍＭｈリス（ヒドロキンメチル）ア
ミノメタン、ｌｏｍＭ　　ＥＤＴＡ１５０ｍＭグルコー
ス］２０ｍｆｆに懸濁し、３７°ｃ−ｃ’１時間反応さ
せた。反応液にアルカリ−５ＤＳ液［０，２Ｎ　　Ｎａ
ＯＨ，１％（ｗ／ｖ）Ｓ　Ｄ　Ｓ　］　４０　ｍ１２を
添加し、緩やかに混和して室温にて１５分間静置した。

次に、この反応液に酢酸カリウム溶液［５Ｍ酢酸カリウ
ム溶液６０ｍｆ２．酢酸１１．５ｍＱ。

純水２８．５ｎ＋Ｑの混合液］３０ｍＱを添加し、充分
混和してから氷水中に１５分間静置した。

溶菌物全量を遠心管に移し、４°Ｃで１０分間、１５、
ＯＯＯＸｇの遠心分離にかけ、上澄液を得た。

これに等量のフェノール−クロロホルム液（フェノール
／クロロホルムｌ／ｌ混和液）を加え懸濁した後、遠心
管に移し、室温下で５分間、１５゜０００Ｘｇの遠心分
離にかけ、水層を回収した。

水層に２倍量のエタノールを加え、−２０°Ｃで１時間
静置後、４°Ｃで１０分間、１５，０００Ｘｇの遠心分
離にかけ、沈殿を回収した。

沈殿を減圧乾燥後、ＴＥ緩衝液［トリス１０ｍＭ、ＥＤ
ＴＡ　　　ｌ　ｍＭ、ＨＣＱにてｐＨ−８，０に調整１
２ｍ１２に溶解した。溶解液に塩化セシウム溶液［５倍
濃度のＴＥ緩衝液１００＋ｎ４に塩化セシウム１７０ｇ
を溶解させた液］１５ｍｃとｌｏｍｇ／ｍＱエチジウム
ブロマイド溶液１ｍＱを加えて、密度を１．３９２ｇ／
ｍＱに合わせた。この溶液を１２°Ｃで４２時間、１１
６．ＯＯＯＸｇの遠心分離を行なつ　ｔこ　。

プラスミドｐＢＹ−５０３は紫外線照射により遠心管内
で下方のバンドとして見い出される。このバンドを注射
器で遠心管の側面から抜きとることにより、プラスミド
ｐＢＹ−５０３を含む分画液を得た。

次いでこの分画液を等量のイソアミルアルコールで４回
処理してエチジウムブロマイドを抽出除去し、その後に
ＴＥ緩衝液に対して透析を行なった。このようにして得
られたプラスミドｐＢＹ５０３を含む透析液に３Ｍ酢酸
ナトリウム溶液を最終濃度３０ｍＭに添加した後、２＠
量エタノールを加え、−２０°Ｃ１時間静置した。この
溶液を１５　、Ｑ　Ｑ　Ｑ　ｘｇの遠心分離にかけてＤ
ＮＡを沈降させ、プラスミドｐＢＹ−５０３を５０μｇ
得た。

（Ｂ）　　プラスミドｐＨ５Ｇ３９８の準備プラスミド
ｐＨ５Ｇ３９８は、エシェリヒア−コリ内で複製し、ク
ロラムフェニコール耐性全発現する分子量約１．４メガ
ダルトンのプラスミドであり、市販品として宝酒造より
購入が可能である。

（Ｃ）　　複合プラスミドｐＣＲＹ−３の造成プラスミ
ドｐＨ３Ｇ３９８（宝酒造製）０．５μｇに制限酵素Ｋ
　ｐ　ｎ　Ｉ　（５ｕｎｉｔｓ）を３７°Ｃ１時間反応
させ、プラスミドＤＮＡを完全に分解した。

前記（Ａ）項で調製したプラスミドｐＢＹ５０３２ｐｇ
に制限酵素Ｋ　ｐ　ｎ　Ｉ　（ｌ　ｕｎｉｔ）を３７°
Ｃで３０分間反応させ、プラスミドＤＮＡを部分分解し
　ｌこ　。

両者のプラスミドＤＮＡ分解物を混合し、制限酵素を不
活化するために６５°Ｃで１０分間加熱処理した後、該
失活溶液中の成分が最終濃度として各々５ＱｍＭ）リス
緩衝液ｐ　Ｈ７，６、ｌｏｍＭＭｇＣＱ、、１０ｍＭジ
チオスレイトール、１ｍＭ　　ＡＴＰ及びＴ４リガーゼ
１ｕｎｉｔになるように各成分を強化し、１６°Ｃで１
５時間保温した。

この溶液を用いてエシエリヒア・コリＪＭ１０９コンピ
テントセル（宝酒造製）を形質転換した。

形質転換株は３０μｇ／ｍＱｃ最終濃度）のタロラムフ
ェニコール、１００　μｇ／ｍ４（最終濃度）ＩＰＴＧ
（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）、
ｌ　ＯＯｐ　ｇ／ｍ（１（最終濃度）Ｘ　−ｇａＩ２（
５−ブロモ−４−クロロ−３インドリル−β−Ｄ−ガラ
クトピラノシド）を含むし培地（トリプトンｌｏｇ、酵
母エキス５　ｇｓ　Ｎ　ａ　Ｃ１２５ｇ−純水ＬＱ、ｐ
Ｈ７，２）で３７°Ｃにて２４時間培養し、生育株とし
て得られた。

これら生育株のうち、白いコロニーで生育してきたもの
を選択し、各々グラスミドをアルカリ−５ＤＳ法［Ｔ　
、Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｅ　、Ｆ　、Ｆ　ｒｉＬｓｃｈ
、　Ｊ　、　Ｓ　ａｍｂｒｏｏｋ、　”Ｍｏ１ｅｃｕｌ
ａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ”（１９８２）ｐ　９０〜９１参
照］により抽出した。

（Ｄ）　　複合プラスミドのコリネを細菌への形質転換 形質転換は電気パルス法を用いて行なった。ブレビバク
テリウム・フラバムＭＪ２３３（ＦＥＲＭ　　Ｐ−３０
６８）プラスミド除去株を１０Ｏｎ＋＋２の前記Ａ培地
で対数増殖期初期まで培養し、ペニシリンＧを１ユニッ
ト／ｍＱになるように添加しさらに２時間振盪培養し、
遠心分離により菌体を集め、菌体を２０ｍＱのパルス用
溶液（２７２ｍＭＳ　ｕｃｒｏｓｅｓ　７　ｍＭ　Ｋ　
Ｈ２Ｐ　Ｏ４，１ｍＭ　　ＭｇＣＱ２：ｐＨ７，４）に
て洗浄する。さらに菌体を遠心分離にて集め、５ｍαの
パルス用溶液に懸濁し、０．７５ｍ＋２の細胞と前記（
Ｃ）項で得られたＤＮＡ溶液５０ｍＱとを混合し、水中
にて２０分間静置する。シーンパルサー（バイオラド社
製）を用いて、２５００ポルト、２５μＦＤに設定し、
パルスを印加接水中に２０分間静置する。全量を３ｍＱ
の前記入培地に移し３０°Ｃにて１時間培養後、クロラ
ムフェニコール３μｇ／ｍ１２（最終濃度）を含む前記
Ａ寒天培地に植菌し３０°Ｃで２〜３日間培養する。出
現したクロラムフェニコール耐性株より、上記（Ａ）項
に記載の方法を用いてプラスミドを得た。このプラスミ
ドを各種制限酵素で分子量を測定した。

結果を下記の表２に示す。

表２ 制限酵素　　認識部位数　分子量［メガダルトン１０内
はｋｂを表わす。

Ｋ　ｐ　ｎ　Ｉ　　　　　　２　　　３．９（６，０）
、１．４（２，２）Ｓ　ａｕ　Ｉ　　　　　　　１　　
　５．３（８，２）ＢａｍＨＩ　　　　　　ｌ　　　　
５．３（８，２）Ｐ　ｓｔ　Ｉ　　　　　　　２　　　
３．７（５，７）、１．６（２，５）上記制限酵素によ
り特徴づけられるプラスミドを“ｐＣＲＹ−３″と命名
した。

なお、複合プラスミドｐＣＲＹ−３により形質転換され
たブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３ＧＥ１０２
は、茨城県筑波郡谷田部町東１丁目１番地３号の工業技
術院微生物工業技術研究所に、昭和６３年１月８日付で
受託番号：微工研菌寄第９８０２号（ＦＥＲＭ　　Ｐ−
９８０２）として寄託されている。

実施例２ プラスミドｐＣＲＹ−３への安定化機能を担うＤＮＡ断
片のクローニング （Ａ）　　安定化機能を担うＤＮＡ断片の調製プラスミ
ドｐＢＹ５０３は、ブレビバクテリウム・スタチオニス
ＩＦＯ１２１４４から実施例１の（Ａ）項に記載の方法
により調製した。このプラスミドＤＮＡ２０／ｌＺｇに
制限酵素ＫｐｎＩ（２０ｕｎｉｔｓ）を３７°Ｃで２時
間反応させ、プラスミドＤＮＡを完全に分解した。該分
解物を０．８％のアガロースゲル電気泳動にて分離させ
、約７ｋｂのＤＮＡ断片画分をゲルから切り出した。該
画分かもＤＮＡを抽出、精製し約５μｇのＤＮＡを得た
。

（Ｂ）　　プラスミドｐＣＲＹ−３への安定化機能を担
うＤＮＡ断片のクローニング 実施例１で得たプラスミドｐＣＲＹ−３ＤＮＡｌμｇに
制限酵素Ｋ　ｐ　ｎ　Ｉ　（５ｕｎｉｔｓ）を３７°Ｃ
で１５分間反応させプラスミドＤＮＡを部分分解し、前
記（Ａ）項で調製したＤＮＡ断片２μｇと混合し、制限
酵素を不活化するために６５℃で１０分間加熱処理した
後、該失活溶液中の成分が最終濃度として各々５０ｍＭ
トリス緩衝液ｐＨ７，６，１０ｍＭ　　ＭｇＣＯ２，１
０ｍＭジチオスＬ、イトール、１ｍＭ　　ＡＴＰ及びＴ
、リガーゼ（ｌ　ｕｎｉｔ）になるように各成分を強化
し、１６°Ｃで１５分間保温した。該溶液を用いてエシ
エリヒア・コリＨＢＩＯｌコンピテントセル（宝酒造製
）を形質転換した。

形質転換株は３０μｇ／ｍＱＣ最終濃度）のクロラムフ
ェニコールを含むし培地（トリプトンｌｏｇ。

酵母！＋ス５ｇ１Ｎａ＋１２５ｇ、純水ＬＬｐＨ７゜２
）で３７°Ｃにて２４時間培養し、生育様として得られ
た。得られた生育様から各々プラスミドをアルカリ−９
ＤＳ法［Ｔ　、Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｅ　、Ｆ　、Ｆ　ｒ
ｉｔｓｃｈ、　Ｊ　、　Ｓ　ａｍｂｒｏｏｋ、　”　Ｍ
ｏ１ｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ”（ｌ　９３２）ｐ
　９０〜９Ｉ参照１により抽出した。

（Ｃ）　　プラスミドのコリネ型細菌への形質転換形質
転換は実施例１の（Ｄ）項記載の電気パルス法を用いて
行なった。出現したクロラムフェニコール耐性株より上
記方法を用いてプラスミドを得た。このプラスミドを各
種制限酵素で分子量を測定した結果を下記の表３に示す
。

表３ 制限酵素　　認識部位数　分子量［メガダルトン１０内
はｋｂを表わす。

Ｋ　ｐ　ｎ　ｒ　　　　　　３　　　４．６（７，０）
、３．９（６，０）、１．４（２，２） Ｓ　ａｕ　Ｉ　　　　　　　２　　　６．６（１０，０
）、３．３（５，２）Ｐ　ｓｔ　Ｉ　　　　　　　２　
　　８．５（１３，０）、１．４（２，２）ＢａｍＨＩ
　　　　　　１　　　９．９（１５−２）上記制限酵素
で特徴づけられるプラスミドをｐＣＲＹ−３１”と命名
しｔ；。

実施例３ （Ａ）　　ファージ）８０ｐｔの調製 大腸菌（Ｅ　、ｃｏｌｉ）Ｋ　−１２株（ＩＦＯ３３０
１）を１０Ｏｎ＋Ｑのし培地（組成は前記と同じ）に接
種し、３７°Ｃで約４時間振盪した培養物０．２ｍＱと
、ファージｕ８０（ＡＴＣＣ１１４５６ａ−Ｂｌ）水溶
液（１０５ケ／ｍＱ）のＯ、ｌ　ｍＱとを、Ｌ培地軟寒
天（Ｌ培地＋寒天沫）中に混合したのち、Ｌ培地寒天プ
レート上に重層する。該プレートを３７℃にて約５時間
培養するとプラーク（溶菌斑）を生じ、さらに２〜３日
間３７°Ｃにて培養を継続すると、プラーク中にファー
ジＩ８０溶厚菌の生育コロニーを生ずる。該溶原菌をＬ
培地にて３７°Ｃで４時間培養後、上記と同じＬ培地寒
天プレート上に塗抹したのち、紫外線照射（４００〜８
００　ｅｒｇｓ／ｍｍ”、１０〜２０秒）による溶原フ
ァージの誘発によりファージｌ８０ｐｔＣトリプトフア
ンオペロンを含む７アージＤＮＡ）を調製する。

（Ｂ）　トリプトファンオペロン画分の調製大腸菌（Ｅ
　、ｃｏｌｉ）Ｋ　−１２株（ＩＦＯ３３０１）をｌＱ
の培地（組成は前記と同じ）に接種し、約３７℃で約３
時間振盪培養し、対数増殖期に２５％（ｗ／ｖ）グルコ
ース溶液１０ｍ１２と上記で調製した７アージー８０ｐ
ｔ溶液を１０”ケ／ｍＱの濃度で添加しくｍｏｉ２０）
、５時間振盪を継続後常法通りクロロホルムの添加によ
り、７アージｕ８０ｐｔを大量に調製した［Ｔ　、Ｍａ
ｎｉａｔｉｓ、Ｅ　、Ｆ　、Ｆ　ｒｉｔｓｃｈ。

Ｓ　ａｍｂｒｏｏｋ　；　　”　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　
ｃｌｏｎｉｎｇｌｌ（１９８２）ｐ　、７６−８０　　
Ｃｏ１ｄ　Ｓ　ｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ参照１゜ 次に取得した７アージｕｐｔ溶液をトリス緩衝液（ｐＨ
７，８）にて透析後、フェノール法により、ＤＮＡ抽出
法し上記“Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ　＋）
　、８５参照〕によってファージＤＮＡを抽出精製し、
これに制限酵素ＢａｍＨＩを与え３０°Ｃで３０分間反
応させ、トリプト７アンオペロン遺伝子画分を得た。

（Ｃ）　　ｐＢＲ３２２ｔｒｐの調製 前記（Ｂ）項で得たトリプトファンオペロン画分に制限
酵素５ａｌｌ及びＸｈｏＩを３７°Ｃにて１時間反応さ
せ、次いで６５°Ｃで５分間熱処理して制限酵素を失活
させた後、同様に制限酵素５ａｌｌで地理したプラスミ
ドｐＢＲ３２２を添加混合した。次いで該失活溶液中の
成分が最終濃度として各’＋５０ｍＭ）リス緩衝液ｐＨ
７，６，１０ｍＭ　　ＭｇＣＱ２．１０ｍＭジチオスレ
イトール、１ｍＭ　　ＡＴＰ及びＴ４リガーゼｌ　ｕｎ
ｉｔになるように各成分を強化し、１６°Ｃで１５時間
保温することによってＤＮＡを結合させた。

再結合後のＤＮＡを用いて大腸菌に一１２株（トリプト
ファン要求性変異株、ＡＴＣＣ２３７１８）を常法に従
い形質転換させ、形質転換株［Ｔｒｐ要求性の消失、す
なわちプラスミド上のｔｒｐＡｓ　ｔｒｐＢ遺伝子によ
り生合成可能となり、最小培地（Ｋ２ＨＰＯ４７ｇ１Ｋ
ＨｚＰ０４　２ｇｓ　ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００−１ｇ−
（ＮＨ４）ｚｓＯ＊　　Ｉｇ、グルコース２ｇ、純水Ｉ
Ｑ）上にて生育可能となった菌株］を得た。この菌株を
常法に従い液体培養し、培養液よりプラスミドｐ　Ｂ　
Ｒ３２２Ｌｒｐを分離精製しＩこ　。

（Ｄ）　　ｔｒｐＡＢ画分のクローニング上記（Ｃ）項
で得られたプラスミドｐＢＲ３２２ｔｒｐを制限酵素Ｓ
ａｃ［Ｉ、！：５ａｌＩで３７°Ｃで１時間切断し、ｔ
ｒｐＡ　Ｂ遺伝子を含む画分を得た。

次いで制限酵素Ｈ４ｎｃＩＩを用いて３７℃で部分的に
分解し、ｔｒｐＡ　Ｂを含む最小画分を得た。この断片
に５ａｌＩリンカ−を混合し、Ｔ、ＤＮＡリガーゼで結
合させて、両末端に５ａｉ１部位をもつｔｒｐＡ　Ｂ画
分を得た。

次いでｐＤＲ７２０（ファルマシア製）を制限酵素５ａ
ｌｌにて３７°Ｃ１時間反応させ、６５°Ｃで５分間加
熱処理して制限酵素を失活させた後、上記ｔｒｐＡ　Ｂ
画分を添加混合した。

該失活溶液中の成分が最終濃度として各々５０ｍＭトリ
ス緩衝液ｐＨ７−６，１０ｍＭ　　ＭｇＣＱ、、１０ｍ
Ｍジチオスレイトール、１ｍＭ　　ＡＴＰ及びＴ、リガ
ーゼ１ｕｎｉｔになるように各成分を強化し、１６°Ｃ
で１５時間保温することによって、ＤＮＡを結合させた
。

再結合後のＤＮＡを用いて大腸菌に一１２株（トリプト
ファン要求性変異株、ＡＴＣＣ２３７１８）を常法に従
い形質転換させ、形質転換株［Ｔｒｐ要求性の消失、す
なわちプラスミド上のｔｒｐＡ　５ｔｒｐＢ遺伝子によ
り生合成可能となり、最小培地（Ｋ２ＨＰＯ４７ｇ％Ｋ
　Ｈ２Ｐ　Ｏ４２ｇＳＭ　ｇ　Ｓ　Ｏ４・７Ｈｚ０　０
−１ｇ５　（ＮＨ４）２５０４　１ｇｓ　グルコース２
ｇ、純水ＩＱ）上にて生育可能となった菌株］を得ｔ；
。この菌株を常法に従い液体培養し、培養液よりプラス
ミドｐ　Ｄ　Ｒ７２０−ｔｒｐＡ　Ｂを分離精製した。

（Ｅ）　ｐＵＣ−９へのｔｒｐＡ　Ｂ遺伝子のりクロニ
ング 前（Ｄ）項で得たｐＤＲ７２０−ｔｒｐＡＢ画分を制限
酵素Ｅｃｏ　Ｉ　Ｉで３７°Ｃ１時間反応させ、６５°
Ｃ５分間熱処理して失活させた。同様にしてｐＵＣ−９
（ファルマシア製）を制限酵素ＥｃｏＲＩで処理し、前
記と同様にして結合させた。再結合後のＤＮＡを前記と
同様にして形質転換させた。

得られた菌株の中からｐＵＣ−９にｔｒｐＡ　Ｂ画分の
挿入されたものを選択し、常法に従いプラスミドｐ　Ｕ
　Ｃ−９ｔｒｐＡ　Ｂを抽出した。

実施例４ プラスミドｐＣＲＹ−３１−ｔｒｐｌの作成（Ａ）　　
プラスミドｐＣＲＹ−３１ｔｒｐｌの調製実施例３で調
製したプラスミドｐ　ｔｒ　ｃ　−９ｔｒｐＡＢＩＯμ
ｇおよび実施例２で調製したプラスミドｐｃＲＹ３１　
３ｐｇを制限酵素ＢａｍＨＩを用いて３７℃１時間反応
させることにより切断し、６５°Ｃで１０分間加温する
ことにより制限酵素を失活させた後、該失活溶液中の成
分が最終濃度として各々５０ｍＭトリス緩衝液ｐＨ７，
６，１０ｍＭ　　ＭｇＣＱ２．１０ｍＭジチオスレイト
ール、１ｍＭ　　ＡＴＰ及びＴ、リガーゼｌ　ｕｎｉｔ
になるように各成分を強化し、１６°Ｃで１５時間保温
することによって、ＤＮＡを結合させ、この溶液を用い
てエシエリヒリア・コリＨＢＩＯＩコンピテントセル（
宝酒造製）を形質転換した。

形質転換株は３０μｇ／　ｍＱ（最終濃度）のクロラム
フェニコールを含むし培地（トリプトン１０ｇ１酵母エ
キス５ｇ、ＮａＣｌ２５ｇ、純水ＩＬｐＨ７゜２）で３
７°Ｃにて２４時間培養し、生育株として得られた。得
られた生育株から各々プラスミドをアルカリ−３ＤＳ法
［Ｔ、ＭａｎｉａＬｉｓ、Ｅ、Ｆ　、Ｆｒ１ｔｓｃｈ、
Ｊ　、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、　　”Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　
ｃｌｏｎｉｎｇ”（１９８２）ｐ、９０〜９１参照］に
より抽出した。

（Ｂ）　　プラスミドのコリネ型細菌への形質転換形質
転換は実施例１（Ｄ）項記載の電気パルス法を用いて行
なった。出現したクロラムフェニコール耐性株より、上
記（Ａ）項記載の方法を用いてプラスミドを得た。該プ
ラスミドを各種制限酵素で分子量を測定した結果を下記
の表４に示す。

表４ 制限酵素　　認識部位数　分子量［メガダルトン１０内
はｋｂを表わす。

ＢａｍＨ１２９，９（１５，２）、１．８（２，８）Ｓ
　ａｕ　Ｉ　　　　　　　２　　　６．６（１０，０）
、５．１（８，０）Ｐ　ｓｔ　Ｉ　　　　　　　２　　
　１０．３（１５，８）、１．４（２，２）上記制限酵
素で特徴づけられるプラスミドをｐ　ＣＲＹ　−３１ｔ
ｒｐ１″と命名した。なお、プラスミドｐＣＲＹ−３１
ｔｒｐｌにより形質転換されたブレビバクテリウム・フ
ラバムＭＪ２３３ＧＥＩＯ０４は、茨城県筑波郡谷田部
町東１丁目１番地３号の工業技術院微生物工業技術研究
所に、昭和６３年５月２６８付で受託番号：微工研菌寄
第１００３５号（ＦＥＲＭ　　Ｐ−１００３５）として
寄託されている。

実施例５ プラスミドｐＣＲＹ−３１ｔｒｐｌの安定性前記のＡ培
地１００ｍ１２を５００ｍｆ２容三角クラスコにり注し
、１２０°Ｃで１５分間滅菌処理したものに、実施例４
（Ｂ）項で得た形質転換株を植菌し、３０°Ｃにて２４
時間振盪培養を行なった後、同様にして調製したＡ培地
１００＋ｎＱを５００ｍＱ容三角フラスコに分注し１２
０°Ｃで１５分間滅菌したものに］ｍｆ２当たり５０ｃ
ａｌｌｓの割合になるように植継し、同じく３０°Ｃに
て２４時間振盪培養を行なった。次に遠心分離を用いて
集菌し、菌体を洗浄後、クロラムフェニコールを５ｇｇ
／ｍＱの割合で添加したＡ培地および無添加のＡ培地と
して調製した平板培地に一定量塗抹し、３０°Ｃにて１
日培養後生育コロニーをカウントする。

この結果、クロラムフェニコール添加および無添加培地
に生育したコロニーは同数であること、さらにＡ培地生
育コロニーは全てクロラムフェニコール添加培地に生育
すること、すなわち該プラスミドの高度の安定性を確認
した。

実施例６ 培地（尿素０．４％、硫酸アンモニウム１．４％、Ｋ　
Ｈｘ　Ｐ　Ｏ４０，５％、Ｋ　ｚ　ＨＰ　Ｏ４０−０５
％、Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏ４・７　Ｈ２００−０５％、ＣａＣ
（２２・２Ｈｚ０　２ｐｐｍ、Ｆ　ｅ　ＳＯ＋・７Ｈｚ
○　２　ｐｐｍ、　Ｍ　ｎＳ　Ｏ４・４〜６　Ｈ２０２
ｐｐｍ、　Ｚ　ｎ　Ｓ　Ｏ＊　・７　Ｈ２Ｏ２ｐｐｍ、
　Ｎ　ａ　ＣＱ　２ｐｐｍ、ビオチン２００μｇ／Ｑ。

チアミン・ＨＣＱ１００μｇ／Ｌ　　トリプトン０゜１
％、酵母エキス０．１％）１００ｍＱを５００ｍｃ容三
角フラスコに分注、滅菌（滅菌後ｐ　Ｈ７，０・）した
後、本発明のプラスミドｐＣＲＹ−３１−ｔｒｐｌを保
持する菌株（ＦＥＲＭ　　Ｐ−１００３５）を植菌し無
菌的にグルコースを最終濃度２％（ｗ／Ｖ）となるよう
に加え３０℃にて１５時時間上う培養を行なった。

次に、本培養培地（硫酸アンモニウム２．３％、Ｋ　Ｈ
ｘ　ｐ　Ｏ４０，０５％、Ｋ、ＨＰｏ、０．０５％、Ｍ
　ｇ　Ｓ　Ｏ４’　７　Ｈ２００、０５％、ＦｅＳＯ４
・７Ｈ２０２０ｐｐｍ、　Ｍｎ　ＳＯ＊・ｎ　Ｈ２Ｏ２
０ｐｐｍｓビオチン２００μｇ／Ｑ１チアミン・ＨＣｌ
２１００μｇ／Ｑ、　　トリプトン０．３％、酵母エキ
ス０．３％）の１００１００Ｏを２Ｑ容通気撹拌槽に仕
込み、滅菌（１２０°Ｃｌ２Ｏ分間）後、無菌的にグル
コースを最終濃度２％（Ｗ／Ｖ）となるように加え、さ
らに前記培養物を２０ｍ（２添加して、回転数１００　
Ｏｒｐｍ。

通気量１　ｖｖｍ、温度３３°０ｐＨ７，６にて１８時
間培養を行った。

尚、グルコースは、培養中培地の濃度が２重量％を越え
ないように、約１〜２時間ごと断続的に添加した。

培養終了後、培養物４００＋＋＋Ｑから遠心分離にて集
菌後、脱塩蒸留水にて２度洗浄した菌体を反応液［イン
ドール５ｇ５ＤＬ−セリン２０ｇ１ピリドキサール−５
′−リン酸１０ｍｇ、　ＫＣＱ　２ｇ、蒸留水１０００
ｍＱ１００Ｏ，０に５Ｎ−ＫＯＨにて調整）］の１０１
００Ｏに懸濁後、該懸濁液を２Ｑ容通気撹拌槽に仕込み
、回転数３００　ｒｐｍ、温度３７°Ｃ１ｐＨ８，０で
１０時間反応させた。反応終了後、反応液から遠心分離
（６０００ｒｐｍ、　　１５分間、４°Ｃ）により上澄
液を調製し、該上澄液中のＬ−トリプトファンを液体ク
ロマトグラフィーにより測定した。

また、反応終了液５００ｍ（２をアンモニア型強酸性イ
オン交換樹脂（「ダイヤイオン５Ｋ−ＩＢＪ、三菱化成
社製）のカラムを通したのち、アルカリ溶液で溶出後、
濃縮しＬ−トリプトファンの粗結晶を析出させた。

その結果、Ｌ−トリプトファンの生成濃度は、３ｇ／Ｑ
で、精製量はＩｇであった。また比較としてプラスミド
ｐＣＲＹ−３１−ｔｒｐｌを保持シナい宿主菌体を用い
て上記方法で反応を実施例した結果、Ｌ−トリプトファ
ンの生成濃度は０．０５ｇ／Ｑ以下であった。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）トリプトファンシンターゼ産生能を有するコリネ型
   細菌を培地で培養し、培養物からトリプトファンシンタ
   ーゼを採取することを特徴とするトリプトファンシンタ
   ーゼの製造法。 ２）トリプトファンシンターゼ産生能を有するコリネ型
   細菌が、少なくともトリプトファンシンターゼ遺伝子を
   含むＤＮＡ領域（ａ）と、該遺伝子の発現を制御しうる
   プロモーター及びオペレーターを含むＤＮＡ領域（ｂ）
   と、コリネ型細菌細胞内での自律増殖能及び安定化機能
   を有するＤＮＡ領域（ｃ）とから成るプラスミドで形質
   転換されたコリネ型細菌である特許請求の範囲第１項記
   載の方法。 ３）トリプトファンシンターゼ遺伝子を含むＤＮＡ領域
   （ａ）が、エシエリヒア・コリ染色体由来のｔｒｐＡ及
   びｔｒｐＢを含むＤＮＡ領域である特許請求の範囲第２
   項記載の方法。 ４）トリプトファンシンターゼ遺伝子を発現制御しうる
   プロモーター及びオペレーターを含むＤＮＡ領域（ｂ）
   が、トリプトファンオペロン由来である特許請求の範囲
   第２項記載の方法。 ５）コリネ型細菌細胞内での自律増殖能及び安定化機能
   を有するＤＮＡ領域（ｃ）が、ブレビバクテリウム・ス
   タチオニスＩＦＯ１２１４４が保有するプラスミドｐＢ
   Ｙ５０３由来のＤＮＡである特許請求の範囲第２項記載
   の方法。 ６）プラスミドがプラスミドｐＣＲＹ−３１ｔｒｐ１で
   ある特許請求の範囲第２項記載の方法。 ７）コリネ型細菌がブレビバクテリウム・フラバムＭＪ
   ２３３由来の菌株である特許請求の範囲第２項記載の方
   法。 ８）トリプトファンシンターゼ産生能を有するコリネ型
   細菌が、プラスミドｐＣＲＹ−３１ｔｒｐ１で形質転換
   されたブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３である
   特許請求の範囲第１項記載の方法。 ９）少なくともトリプトファンシンターゼ遺伝子を含む
   ＤＮＡ領域（ａ）と、該遺伝子の発現を制御しうるプロ
   モーター及びオペレーターを含むＤＮＡ領域（ｂ）と、
   コリネ型細菌細胞内での自律増殖能を有するＤＮＡ領域
   （ｃ）及び安定化機能を有するＤＮＡ領域（ｄ）とから
   成るプラスミドで形質転換されたコリネ型細菌。 １０）プラスミドｐＣＲＹ−３１ｔｒｐ１で形質転換さ
   れたブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３。