WO2005021770A1 - コハク酸の製造方法 - Google Patents

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WO2005021770A1
WO2005021770A1 PCT/JP2004/012404 JP2004012404W WO2005021770A1 WO 2005021770 A1 WO2005021770 A1 WO 2005021770A1 JP 2004012404 W JP2004012404 W JP 2004012404W WO 2005021770 A1 WO2005021770 A1 WO 2005021770A1
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bacterium
gene
strain
dna
succinic acid
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PCT/JP2004/012404
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English (en)
French (fr)
Inventor
Makoto Murase
Ryusuke Aoyama
Miki Ikuta
Kenji Yamagishi
Mika Moriya
Jun Nakamura
Hiroyuki Kojima
Original Assignee
Mitsubishi Chemical Corporation
Ajinomoto Co., Inc.
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Filing date
Publication date
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Priority to US11/362,931 priority patent/US7763447B2/en

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/44—Polycarboxylic acids
    • C12P7/46—Dicarboxylic acids having four or less carbon atoms, e.g. fumaric acid, maleic acid

Definitions

  • the present invention relates to the production of succinic acid using bacteria such as coryneform bacteria.
  • Anaerobic bacteria such as the genus Anaerobiospirillum and the genus Actinobacillus have been used (US Pat. No. 5,142,834 and US Pat. No. 5,504,004, International Journal of Systematic Bacteriology (1999), 49,207). -216).
  • anaerobic bacteria When anaerobic bacteria are used, the yield of the product is high, but on the other hand, large amounts of organic nitrogen, such as CSL (corn steep liquor), are required in the medium due to the requirement of many nutrients for growth. Sources need to be added. Adding large amounts of these organic nitrogen sources not only raises the cost of the culture medium but also increases the cost of purification when removing the product, and is not economical.
  • aerobic bacteria such as coryneform bacteria are cultured once under aerobic conditions, and after the cells are grown, the cells are collected, washed, and non-amino as a static cell without oxygen aeration.
  • a method for producing an organic acid is also known (JP-A-11-113588 and JP-A-11-196888).
  • JP-A-11-113588 and JP-A-11-196888 A method for producing an organic acid.
  • the cells when the cells are grown, it is economical because the amount of organic nitrogen can be sufficiently increased in a simple medium with a small amount of added organic nitrogen, but the production amount, production concentration, and There was room for improvement, such as increasing the production rate per cell and simplifying the manufacturing process.
  • An object of the present invention is to provide a method for producing succinic acid with higher production efficiency.
  • the present inventors have conducted intensive studies in order to solve the above-mentioned problems, and as a result, clarified a bacterium modified so as to enhance fumarate reductase activity or a processed product thereof to carbonate ion or carbonate ion. Found that by acting on an organic raw material in a reaction solution containing bicarbonate ions or carbon dioxide gas, the consumption rate of the organic raw material, the production rate of succinic acid, or the yield was increased. It was completed.
  • Succinic acid by reacting a bacterium modified to enhance fumarate reductase activity or a processed product of the bacterium with an organic material in a reaction solution containing carbonate ions or bicarbonate ions or carbon dioxide gas. And producing the succinic acid.
  • the bacterium is any bacterium selected from the group consisting of a coryneform bacterium, a Bacillus bacterium, and a Rhizobium bacterium.
  • bacterium is a bacterium modified to enhance fumarate reductase activity by using a fumarate reductase gene derived from Escherichia coli.
  • a method for producing a succinic acid-containing polymer comprising a step of producing succinic acid by the method of any one of (8) and a step of polymerizing the obtained succinic acid.
  • FIG. 1 is a diagram showing a construction procedure of a plasmid pKMBl and a restriction enzyme map.
  • FIG. 2 is a diagram showing a procedure for constructing a plasmid ⁇ / ⁇ LDH.
  • Garden 3 Diagram showing the procedure for constructing plasmid pTZ4.
  • Bacteria that can be used in the production method of the present invention are bacteria that have been modified so that fumarate reductase activity is enhanced.
  • “fumarate reductase activity” refers to the activity of catalyzing the reaction of reducing and converting fumarate to succinate
  • “enhancing fumarate reductase activity” refers to wild-type or It means that the fumarate reductase activity is enhanced as compared to the unmodified fumarate reductase strain.
  • the fumarate reductase activity can be measured by a method for measuring a decrease in KFe (CN) as described below.
  • Escherichia coli fumarate reductase is the enzyme responsible for the reverse reaction of succinate dehydrogenase, which acts in the TCA cycle, but is involved in fumarate respiration under anaerobic conditions and is transcribed under aerobic conditions. It is known that gene expression is suppressed at the level (Jones, H. ⁇ ⁇ , Gunsalus, RP, J. BacterioL, 1985, Vol. 164, pi 100-1109). Therefore, if the activity of fumarate reductase is excessively enhanced, it is considered that the growth of bacterial cells is deteriorated.In the present invention, the activity of fumarate reductase is enhanced to such an extent that the growth of bacterial cells is not significantly inhibited. Is desirable.
  • Enhancement of fumarate reductase activity can be performed, for example, by modifying a parent bacterial strain by a genetic recombination method using a fumarate reductase gene.
  • the gene may encode a protein having a fumarate reductase activity simultaneously with the succinate dehydrogenase activity. Accordingly, the expression of a gene encoding a protein having both fumarate reductase activity and succinate dehydrogenase activity may be increased.
  • succinate dehydrogenase from coryneform bacteria produces succinate from fumarate, which is the reverse reaction. Can catalyze the reaction.
  • Succinate dehydrogenase activity can be measured by the method of Arkrell, BAC et al. (Meth Enzymol. 53, 466-483).
  • the parent strain of the bacterium that can be used in the present invention is not particularly limited as long as it has a succinic acid-producing ability.
  • Coryneform bacterium, Bacillus bacterium, or Rhizobium bacterium is preferred. Type bacteria are more preferred.
  • Examples of the coryneform bacterium include a microorganism belonging to the genus Corynebatera, a microorganism belonging to the genus Brevibataterum, and a microorganism belonging to the genus Arthrobacter. Among them, preferably, the genus Corynebacterium or the genus Brevibatatherium is used.
  • Corynebacterium-daltamicum (Crynebacterium glutamicum), Frevino quarium 'Hufnom (Brevibacterium f lavum), Brevibacterium' Brevibacterium ammoniagenes) Mentum (Brevibacterium lactofermentum).
  • Brevibacterium 'Flavum MJ-233 (FERM BP-1497), MJ-233 AB-41 (FERM BP-1498), Brevibacterium' ammoniagenes ATCC6872. And Corynebatadium Glutamicum ATCC 31831 and Brevibatatermi Ratatofamentum ATCC13869. It should be noted that Brevibataterum 'Flavum' is currently sometimes classified as Corynebataterum 'Dartamicum' (Lielbl, W., Ehrmann, ⁇ , Ludwig, W. and Schleifer, K. H "International Journal of Systematic Bacteriology, 1991, vol. 41, p255_260).
  • Flavum MJ-233 strain and its mutant MJ-233 AB-41 strain are each Corynebatatellium 'glutamicum. It shall be the same strain as MJ-233 and MJ-233 AB-41.
  • the bacterium used as a parent strain in the method of the present invention is a UV strain that can be used only in a wild strain. Any strain, such as a mutant strain obtained by ordinary mutation treatment such as irradiation or NTG treatment, or a recombinant strain derived by genetic techniques such as cell fusion or gene recombination, may be used. .
  • the host of the genetically modified strain may be of the same genus as the parent strain or of a different genus as long as it is a transformable microorganism. Preferably, the host is an aerobic bacterium.
  • the gene that can be used is not particularly limited as long as it encodes a protein having fumarate reductase activity.
  • a gene derived from Escherichia coli having the base sequence shown in SEQ ID NO: 19 can be mentioned. This gene encodes four subunits (frdA, frdB, frdC and frdD; SEQ ID NO: 2023) constituting fumarate reductase (base numbers 440 2245, 2241-2975, 2986-3381, SEQ ID NO: 19). And the operon gene containing 3392-3751), respectively.
  • each subunit gene encodes a subunit protein capable of forming a complex having FRD activity, DNA that hybridizes under stringent conditions with DNA having the above nucleotide sequence, or DNA that hybridizes under the stringent conditions, or It may be a homolog such as DNA having homology of at least 95%, preferably at least 95%, more preferably at least 99%.
  • the stringent bets conditions 60 ° C, 1 X SSC is an ordinary condition of washing in Southern hybrida I See Chillon, 0. 1 0/0 SDS, preferably ⁇ or, 0.
  • FRD gene homologs those encoding a protein in which the amino acid corresponding to the 17th amino acid of the B subunit (frdB) of FRD (SEQ ID NO: 21) is lysine are preferable.
  • the gene having the base sequence shown in SEQ ID NO: 19 or a homologue thereof can be obtained by the PCR method or the hybridization method.
  • a mutation such that the amino acid corresponding to the 17th amino acid of frdB is lysine can be introduced by a known method.
  • a gene encoding a protein having both succinate dehydrogenase and fumarate reductase activities may be used.
  • Sdh gene derived from a coryneform bacterium. This gene contains the three subunits (sdhA, sdhB and sdhC) of succinate dehydrogenase (base numbers 1153-3171, 3174-3920 and 363-1133 of SEQ ID NO: 28).
  • Operon gene The sdh operon of Corynebacterium 'daltamicum is described in Genebank accession No. NCgl0359 (sdhC) NCgl0360 (sdhA) NCgl0361 (sdhB).
  • each subunit gene encodes a subunit protein capable of forming a complex having FRD activity, DNA that hybridizes under stringent conditions with DNA having the above nucleotide sequence, or at least 90% with the above nucleotide sequence, Preferably 95 Q / o or more, more preferably 99. It may be a homolog such as DNA having homology of / 0 or more.
  • the stringent condition is a condition for washing the ordinary Southern hybridization 60. C, 1 X SSC, 0. 1 0/0 SDS, or preferably ⁇ , 0. 1 X SSC, Haiburidizu conditions and the like at a salt concentration corresponding to 0. 1% S DS.
  • amino acid sequence shown in SEQ ID NOS: 20 to 23 and SEQ ID NOs: 29 to 31 includes substitution, deletion, insertion, or addition of one or several amino acids.
  • FRD genes derived from bacteria other than Escherichia coli and coryneform bacteria, or from other microorganisms or animals and plants can also be used.
  • FRD genes derived from microorganisms or animals and plants a gene whose base sequence has already been determined, a gene encoding a protein having FRD activity based on homology, etc., is isolated from chromosomes of microorganisms, animals and plants, etc. A sequence determined and the like can be used. After the base sequence is determined, a gene synthesized according to the sequence can be used. These can be obtained by amplifying the region containing the promoter and the ⁇ RF portion by a hybridization method or a PCR method.
  • a DNA fragment containing the FRD gene is ligated to an appropriate plasmid
  • a recombinant plasmid capable of enhancing the expression of FRD in a coryneform bacterium can be obtained by introducing the plasmid into a plasmid vector containing at least a gene that controls the replication replication function of the plasmid in the coryneform bacterium.
  • the plasmid vector into which the FRD gene can be introduced into the coryneform bacterium is not particularly limited as long as it contains at least a gene that controls the replication growth function in the coryneform bacterium.
  • plasmid pCRY30 described in JP-A-3-210184
  • plasmids pCRY21, pCRY2KE and pCRY2KX described in JP-A-2-72876 and US Pat. No. 5,185,262.
  • the FRD gene When the FRD gene has an operon structure, it can be achieved by introducing a mutation into a promoter region that controls the expression, in addition to the above-described method, as described in WO0018935.
  • the promoter for expressing the FRD gene is not limited as long as it functions in coryneform bacteria, and any promoter can be used. You can.
  • the expression level of the FRD gene can be regulated by appropriately selecting a promoter. As described above, the example using coryneform bacteria has been described. However, when other bacteria are used, FRD activity can be enhanced by the same method. [0020] In this reaction, it is more effective to use a bacterial strain that has been modified so as to reduce ratatate dehydrogenase activity in addition to enhancing fumarate reductase activity.
  • the reduced ratate dehydrogenase activity means that the ratate dehydrogenase activity is lower than that of the unmodified ratate dehydrogenase strain. It is preferable that the ratate dehydrogenase activity is reduced to 10% or less per cell, as compared with a non-modified ratate dehydrogenase strain. Further, the ratate dehydrogenase activity may be completely deficient. Reduction of ratate dehydrogenase activity can be confirmed by measuring ratate dehydrogenase activity by a known method (L. Kanarek and RL Hill, J. Biol. Chem. 239, 4202 (1964)). it can.
  • Specific methods for producing a mutant strain of coryneform bacterium having reduced ratatate dehydrogenase activity include a method by homologous recombination into a chromosome described in JP-A-11-206385, or a method described in the present specification. Method using SacB gene described in the example (
  • the coryneform bacterium of the present invention in which the ratate dehydrogenase activity is reduced and the expression of the FRD gene is enhanced, is prepared, for example, as described in Example 2 below, by preparing a bacterium in which the LDH gene is disrupted, and culturing the bacterium. It can be obtained by transforming with a recombinant vector containing a gene. However, either the modification operation for reducing the LDH activity or the modification operation for enhancing the FRD activity may be performed first.
  • a bacterium modified so as to enhance pyruvate carboxylase activity in addition to enhancing fumarate reductase activity may be used.
  • the phrase "the activity of pyruvate carboxylase is enhanced” means that the activity of pyruvate carboxylase is increased relative to an unmodified strain such as a wild-type strain or a parent strain.
  • the activity of pyruvate carboxylase can be measured, for example, by a method for measuring a decrease in NADH as described below.
  • Coryneform bacterium in which the expression of fumarate reductase and pyruvate carboxylase has been enhanced can be obtained by the same method as described in JP-A-11-196888, by using the fumarate reductase (FRD) gene and pyruvate carboxylase (PC) gene. Can be produced by highly expressing in a coryneform bacterium.
  • the PC gene used in the method of the present invention has a nucleotide sequence already determined.
  • a DNA or a DNA fragment encoding a protein having PC activity can be isolated from a chromosome of a microorganism, animal or plant by a method as described below, and the nucleotide sequence determined can be used. After the nucleotide sequence is determined, a gene synthesized according to the sequence can also be used.
  • the DNA fragment containing the PC gene is present on chromosomes derived from microorganisms, animals and plants.
  • the basic operation for preparing a PC gene from these source microorganisms, animals and plants is as follows, taking as an example a coryneform bacterium whose sequence is known.
  • the PC gene is present on the chromosome of the above-mentioned coryneform bacterium Corynebacterium 'daltamicam ATCC13032 (Peters-Wendisch, PG et al. Microbiology, vol. 144 (1998) p915-927), and their sequences are shown.
  • Is known GenBank Database Accession No. APO 05276) (SEQ ID NO: 15), and can be isolated and obtained by PCR.
  • PCR is performed, the result is about 3.
  • a 7 kb PC gene can be amplified.
  • an appropriate restriction enzyme site to the 5 'end of the primer used for PCR, it can be ligated to an appropriate site of the vector described below, and the resulting recombinant vector can be used. It can be introduced into coryneform bacteria.
  • the protein is purified using the PC activity as an index, a probe is synthesized from the N-terminal amino acid sequence U and the partially degraded sequence, and the gene is synthesized by a commonly used hybridization technique. Fragments can be isolated. Further, it is possible to synthesize a probe or primer based on the amino acid sequence of the region conserved between PC proteins, and obtain a fragment by hybridization and PCR. The DNA sequence of the obtained fragment can be determined by an ordinary method.
  • the size of the cut DNA fragment and the size of the plasmid are determined by digesting DNA of Escherichia coli 'lambda' phage (phage a phage) with the restriction enzyme Hindlll when agarose gel electrophoresis is used. Based on the standard line drawn by the migration distance of the DNA fragment of known molecular weight obtained on the same agarose gel, and when using polyacrylamide gel electrophoresis, Escherichia coli E.
  • coli phage X 174 phage ( ⁇ ⁇ 174 phage) DNA based on a standard line drawn on the same polyacrylamide gel as the migration distance of a DNA fragment of known molecular weight obtained by cleaving DNA with the restriction enzyme Haelll. Can be calculated.
  • the results obtained by 1% agarose gel electrophoresis were used for the size of lkb or more, and the size of fragments from about 0.1 lkb to less than lkb was used.
  • the DNA fragment containing the PC gene used to enhance the PC activity is not limited to a DNA fragment isolated from Corynebacterium daltamicum chromosomal DNA, but may also be a commonly used DNA synthesizer, for example, It may be synthesized using a 394 DNA / RNA synthesizer manufactured by Applied Biosystems.
  • the PC gene obtained from the chromosomal DNA of the coryneform bacterium has the sequence of SEQ ID NO: 15 as long as it does not substantially impair the function of the coded PC, that is, the property involved in carbon dioxide fixation.
  • a part of the base sequence may be replaced or deleted, another base may be inserted, or a new base may be inserted. Any of these derivatives may be used in the present invention.
  • a DNA encoding a protein having PC activity can also be suitably used.
  • the Sutorinjiwento conditions, 60 o C, 1 X SSC is an ordinary condition of washing in Southern hybrida I See Chillon, 0. 1 0/0 SDS, preferably ⁇ or, 0. 1 X SSC, 0 . 1 0/0 SDS to Haiburidizu a salt concentration you primate equivalent to the condition and the like.
  • a PC gene derived from a bacterium other than Corynebacterium daltamicum, or from other microorganisms or animals and plants can also be used.
  • the sequences of the PC genes derived from microorganisms or animals and plants shown below have known sequences (the literature is shown below), and the ⁇ RF portion can be obtained by hybridization or PCR as described above. It can be obtained by amplification.
  • the DNA fragment containing the PC gene can be expressed by introducing it into an appropriate expression plasmid, for example, pUC118 (manufactured by Takara Shuzo), and introducing it into an appropriate host microorganism, for example, Escherichia coli JM109 (manufactured by Takara Shuzo).
  • the expressed PC gene product, pyruvate carboxylase (SEQ ID NO: 16) was confirmed directly from the transformant by the method of the crude enzyme solution Magasanik [J. Bacteriol., 158, 55-62, (1984)]. It can be confirmed by measuring the activity and comparing it with the PC activity of the crude enzyme solution extracted from the non-transformed strain.
  • a DNA fragment containing a PC gene into an appropriate plasmid, for example, a plasmid vector containing at least a gene responsible for the replication and growth function of the plasmid in a coryneform bacterium, high expression of PC can be achieved in a coryneform bacterium.
  • a recombinant plasmid can be obtained.
  • the promoter for expressing the PC gene can be a promoter possessed by a coryneform bacterium. Any promoter may be used.
  • a plasmid vector into which a PC gene including the TZ4 promoter as described in Example 3 described below can be introduced, as long as it contains at least a gene that controls replication and replication in coryneform bacteria.
  • a plasmid vector into which a PC gene including the TZ4 promoter as described in Example 3 described below can be introduced, as long as it contains at least a gene that controls replication and replication in coryneform bacteria.
  • Specific examples thereof include the plasmid pCRY30 described in JP-A-3-210184; the plasmid described in JP-A-2-72876 and US Pat. No. 5,185,262.
  • pCRY21, pCRY2KE, pCRY2KX, pCRY31, pCRY3KE and pCRY3KX plasmids pCRY2 and pCRY3 described in JP-A-1-191686; Japanese Patent Application Laid-Open No.
  • plasmid vectors used in the coryneform bacterium host-vector system include a gene that controls the replication replication function of the plasmid in the coryneform bacterium and a gene that controls the plasmid stabilization function in the coryneform bacterium.
  • plasmids having plasmids pCRY30, pCRY21, pCRY2KE, pCRY2KX, pCRY31, pCRY3KE, and pCRY3KX are preferably used.
  • a coryneform bacterium with enhanced PC gene expression can be obtained.
  • the PC activity can also be enhanced by introducing, replacing, or amplifying a PC gene on a chromosome by a known homologous recombination method to increase the expression.
  • a coryneform bacterium with enhanced expression of the PC gene and the FRD gene can be obtained. Either of the FRD gene and the PC gene may be introduced first. Transformation can be performed, for example, by the electric pulse method (Res. Microbiol., Vol. 144, p. 181-185, 1993).
  • a bacterium modified so that the activity of fumarate reductase and pyruvate carboxylase is enhanced and the activity of ratate dehydrogenase is reduced is particularly effective for the production of succinic acid. It is.
  • a bacterium can be obtained, for example, by transforming a coryneform bacterium in which the LDH gene has been disrupted with a recombinant vector containing the PC gene and the FRD gene.
  • the modification operation using these genes may be performed first, or the deviation operation may be performed first.
  • a solid medium such as an agar medium is used.
  • those obtained by slant culture may be used directly for the reaction, it is preferable to use those obtained by previously culturing the above bacteria in a liquid medium (seed culture).
  • Production can also be carried out by reacting the seed-cultured bacteria with an organic material while growing the same in a medium containing the organic material.
  • the cells can be produced by reacting the cells obtained by the propagation with an organic material in a reaction solution containing the organic material.
  • an aerobic coryneform bacterium it is preferable that the cells are first cultured under ordinary aerobic conditions before use.
  • a medium usually used for culturing microorganisms can be used.
  • a general medium in which a natural nutrient such as meat extract, yeast extract, and peptone is added to a composition comprising inorganic salts such as ammonium sulfate, potassium phosphate, and magnesium sulfate can be used.
  • the cultured cells are recovered by centrifugation, membrane separation, etc., and used for the reaction.
  • a processed product of bacterial cells can also be used.
  • the treated cells include immobilized cells in which the cells are immobilized with acrylamide, carrageenan, etc., crushed cells, crushed cells, centrifuged supernatant, or supernatant treated with ammonium sulfate. A partially purified fraction and the like can be mentioned.
  • the organic raw material used in the production method of the present invention is not particularly limited as long as it is a carbon source capable of assimilating succinic acid by assimilation of the present microorganism.
  • galactose, ratatose, gnorecose, funolectose, and glycerolone are used.
  • Carbohydrates such as sucrose, sucrose, starch, and senole starch; and fermentable sugars such as polyalcohols such as glycerin, mannitol, xylitoleone, and ribitol, and glucose, fructose, and glycerol are particularly preferred.
  • Glucose is preferred.
  • a starch saccharified solution, molasses, or the like containing the above fermentable carbohydrate is also used.
  • These fermentable carbohydrates can be used alone or in combination.
  • the use concentration of the above-mentioned organic raw materials is not particularly limited, but it is advantageous to make the concentration as high as possible without impairing the production of succinic acid, usually 5 30% (WZV), preferably 10 20% (WZV).
  • the reaction takes place within the range.
  • the organic raw material may be additionally added in accordance with the decrease of the organic raw material with the progress of the reaction.
  • the reaction solution containing the above-mentioned organic raw material is not particularly limited. Medium, or a buffer such as a phosphate buffer.
  • the reaction solution is preferably an aqueous solution containing a nitrogen source, an inorganic salt, and the like.
  • the nitrogen source is not particularly limited as long as the microorganism can assimilate and produce succinic acid, but specifically, ammonium salt, nitrate, urea, and soybean hydrolyzate.
  • various organic and inorganic nitrogen compounds such as casein decomposition products, peptone, yeast extract, meat extract, and corn steep liquor.
  • the inorganic salt various metal salts such as phosphates, sulfates, magnesium, potassium, manganese, iron, and zinc are used.
  • growth promoting factors such as vitamins such as biotin, pantothenic acid, inositol and nicotinic acid, nucleotides and amino acids are added as necessary.
  • the pH of the reaction solution can be adjusted by adding sodium carbonate, sodium bicarbonate, potassium carbonate, potassium bicarbonate, magnesium carbonate, sodium hydroxide, calcium hydroxide, magnesium hydroxide, or the like. Since the pH in this reaction is usually pH 5 to 10, preferably pH 6 to 9.5, the pH of the reaction solution may be adjusted to the above range with an alkaline substance, carbonate, urea, etc. during the reaction, if necessary. I do.
  • reaction solution used in the present invention water, a buffer solution, a medium, and the like are used, and a medium is most preferable.
  • the medium may contain, for example, the above-mentioned organic raw material and carbonate ion, bicarbonate ion or carbon dioxide gas and react under anaerobic conditions.
  • Carbonate ion or bicarbonate is supplied from magnesium carbonate, sodium carbonate, sodium bicarbonate, potassium carbonate, and potassium bicarbonate, which can also be used as a neutralizing agent.
  • carbonate or bicarbonate salts include, for example, magnesium carbonate, ammonium carbonate, sodium carbonate, potassium carbonate, ammonium bicarbonate, sodium bicarbonate, potassium bicarbonate and the like.
  • Carbonic acid ions and bicarbonate ions are added at a concentration of 0.001 to 5M, preferably 0.13M, and more preferably 12 to 12M. If carbon dioxide is to be contained, add 50 mg 25 g per liter of the solution, preferably ⁇ 100 mg 15 g, and more preferably ⁇ 150 mg-10 g.
  • the optimal growth temperature of the bacteria used in this reaction is usually 25 ° C to 35 ° C.
  • Reaction temperature The degree is usually from 25 ° C to 40 ° C, preferably from 30 ° C to 37 ° C.
  • the amount of the cells used for the reaction is not particularly limited, but is preferably 700 g / L, preferably 10-500 g / L, and more preferably 20-400 g / L.
  • the reaction time is preferably from 1 hour to 168 hours, more preferably from 3 hours to 72 hours.
  • the reaction for producing succinic acid may be carried out with aeration and stirring, or may be carried out in an anaerobic atmosphere without aeration and without supply of oxygen.
  • the anaerobic atmosphere means that the reaction is performed with the dissolved oxygen concentration in the solution kept low.
  • a method for this purpose for example, a method in which the reaction is carried out with the container sealed and without ventilation, an inert gas such as nitrogen gas is supplied and the reaction is performed, or an inert gas containing carbon dioxide gas is ventilated. Let's do it.
  • Succinic acid accumulated in the reaction solution can be separated and purified from the reaction solution according to a conventional method. Specifically, after removing solids such as cells by centrifugation, filtration, etc., desalting is performed with an ion exchange resin or the like, and succinic acid is separated and purified from the solution by crystallization or column chromatography. it can.
  • a succinic acid-containing polymer can be produced by producing succinic acid by the above-mentioned method of the present invention and then carrying out a polymerization reaction using the obtained succinic acid as a raw material.
  • the succinic acid produced in the present invention is used after being processed into polymers such as polyester and polyamide. Can do things.
  • succinic acid or a composition containing the succinic acid obtained by the production method of the present invention can be used for food-added carohydrates, pharmaceuticals, cosmetics, and the like.
  • Bacillus subtilis Bacillus subtilis (Bacillus subtilis ISWl 214) was cultured in lOmL until the late logarithmic growth phase, and the cells were collected. The obtained cells were suspended in 0.15 mL of a 10 mM NaCl / 20 mM Tris buffer (pH 8.0) / lmM EDTA '2Na solution containing lysozyme at a concentration of 10 mg / mL.
  • proteinase K was added to the above suspension to a final concentration of 100 ⁇ gZmL, and the mixture was incubated at 37 ° C. for 1 hour. Further, sodium dodecinole sulfate was added to the mixture so that the final concentration was 0.5%, and the mixture was incubated at 50 ° C for 6 hours to lyse the cells. Add an equal volume of phenol / chloroform solution to the lysate, shake gently at room temperature for 10 minutes, and centrifuge the whole (5, OOO X g, 20 minutes, 10-12 ° C). The supernatant fraction was collected, sodium acetate was added to a concentration of 0.3 M, and twice the amount of ethanol was added and mixed.
  • the precipitate collected by centrifugation (15,000 OX g, 2 minutes) was washed with 70% ethanol and air-dried.
  • To the obtained DNA was added 5 mL of a 10 mM Tris buffer ( ⁇ 7.5) _lmM EDTA ′ 2Na solution, and the mixture was allowed to stand at 4 ° C. for use as a subsequent type I DNA for PCR.
  • the DNA prepared in (A) above was used as type III, and a synthetic DNA (sequence) designed based on the previously reported base sequence 1J (GenBank Database Accession No.X02730) of the gene was used. This was performed by PCR using No. 1 and SEQ ID No. 2).
  • Reaction mixture composition Type 1 DNA 1 L, Pfx DNA polymerase (Invitrogen) 0.2 ⁇ L, 1x concentration attached buffer, 0.3 ⁇ ⁇ each primer, lmM MgSO, 0.25 ⁇
  • MdNTPs were mixed to make a total volume of 20 ⁇ l.
  • Reaction temperature conditions Using a DNA thermal cycler PTC-200 (manufactured by MJ Research), a cycle consisting of 94 ° C for 20 seconds and 68 ° C for 2 minutes was repeated 35 times. However, the heat retention at 94 ° C in the first cycle was 1 minute and 20 seconds, and the heat retention at 68 ° C in the final cycle was 5 minutes.
  • the amplification products were confirmed by separation by 0.75% agarose (SeaKem GTG agarose: FMC BioProducts) gel electrophoresis and visualization by bromide dye staining. As a result, a fragment of about 2 kb was detected.
  • the target DNA fragment was recovered from the gel using a QIAQuick Gel Extraction Kit (QIAGEN).
  • the recovered DNA fragment is phosphorylated at the 5 'end with T4 polynucleotide kinase (T4), and then is ligated with an E. coli vector (pBluescriptll: STRATEGENE) using a ligation kit ver. 2 (Takara Shuzo).
  • E. coli DH5 strain
  • the recombinant E. coli obtained in this manner is LB agar medium containing 50 ⁇ g / mL ampicillin and 50 ⁇ g / mL X-Gal [10 g of tryptone, 5 g of yeast extratato, 5 g of NaCl and 15 g of agar are dissolved in 1 L of distilled water. ].
  • the clone which formed a white colony on this medium was then transferred to an LB agar medium containing 50 ⁇ g / mL ampicillin and 10% sucrose and cultured at 37 ° C. for 24 hours.
  • these clones those that could not grow on a medium containing sucrose were subjected to liquid culture by a conventional method, and then the plasmid DNA was purified.
  • Strains in which the SacB gene is functionally expressed in E. coli should be unable to grow on sucrose-containing media.
  • the restriction enzymes Sail and Pstl an inserted fragment of about 2 kb was recognized, and the plasmid was named pBS / SacB.
  • Escherichia coli plasmid vector pHSG396 (Takara Shuzo: chloramphenicol resistance marker) 500 ng of the restriction enzyme PshBIl Ounits was allowed to react at 37 ° C for 1 hour, and then recovered by phenol / chloroform extraction and ethanol precipitation. This was blunt-ended at both ends with a tarenow fragment (K1 enow Fragment: Takara Shuzo), and then ligated with Mlul linker (Takara Shuzo) using a ligation kit ver. 2 (Takara Shuzo), and cyclized. E. coli (DH5a strain) was transformed. The recombinant E.
  • Plasmid DNA was prepared from the obtained clones by a conventional method, and a clone having a restriction enzyme Mlul cleavage site was selected and named pHSG396 Mlu.
  • the pBS / SacB constructed in the above (B) was cut with restriction enzymes Sail and Pstl, and then blunt-ended with a tarenow fragment.
  • Ligation kit ver.2 (Takarashu) Then, the Mlul linker was ligated using the above method, and a DNA fragment of about 2. Okb containing the SacB gene was separated and recovered by 0.75% agarose gel electrophoresis.
  • the SacB gene fragment was digested with the restriction enzyme Mlul, and ligated with a pHSG396Mlu fragment whose terminal was dephosphorylated with alkaline phosphatase (Alkaline Phosphatase Calf intestine: Takara Shuzo) using Ligation Kit ver. 2 (Takara Shuzo).
  • E. coli DH5 strain was transformed.
  • the recombinant Escherichia coli thus obtained was spread on an LB agar medium containing 34 ⁇ g / mL chloramphenicol.
  • the kanamycin resistance gene was obtained by PCR using the DNA of Escherichia coli plasmid vector PHSG299 (Takara Shuzo: kanamycin resistance marker) as type III and the synthetic DNAs shown in SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 as primers.
  • Reaction solution composition Type I DNAlng, Pyrobest DNA polymerase (Takara Shuzo) 0.1 ⁇ L, 1x concentration attached buffer, 0.5 ⁇ M each primer and 0.25 ⁇ MdNTPs were mixed to make a total volume of 20 ⁇ M.
  • Reaction temperature condition using DNA thermal cycler one PTC_200 (MJResearch Co.), 94 0 C in 20 ⁇ , 62 0 C in 15 ⁇ , the Saikunore comprising 1 minute 20 ⁇ force et at 72 0 C Repeated 20 times.
  • the heat retention at 94 ° C in the first cycle was 1 minute and 20 seconds, and the heat retention at 72 ° C in the final cycle was 5 minutes.
  • amplification products were confirmed by separation by gel electrophoresis of 0.75% agarose (SeaKem GTG agarose: manufactured by FMC BioProducts), and visualization by chidium bromide staining. Fragments were detected.
  • the target DNA fragment was recovered from the gel using a QIAQuick Gel Extraction Kit (manufactured by QIAGEN). The recovered DNA fragment was phosphorylated at the 5 ′ end with T4 polynucleotide kinase (T4).
  • E Construction of kanamycin resistant SacB vector
  • the approximately 3.5 kb DNA fragment obtained by cleaving the pCMB1 constructed in the above (C) with restriction enzymes Van91 I and Seal was separated and collected by 0.75% agarose gel electrophoresis. This was mixed with the kanamycin resistance gene prepared in (D) above and ligated using Ligation Kit ver. 2 (Takara Shuzo), and Escherichia coli (DH5a strain) was transformed with the obtained plasmid DNA. .
  • the recombinant Escherichia coli thus obtained was spread on an LB agar medium containing 50 ⁇ g / mL kanamycin.
  • the plasmid DNA prepared from the same strain was judged to be incorrect or missing in the structure shown in Fig. 1 due to the fact that fragments of 354, 473, 1807, and 1997 bp were generated by digestion with Hindlll restriction enzyme.
  • the plasmid was named pKMBl.
  • a medium (urea 2g, (NH) SO 7g, KH PO 0.5g, K HPO 0.5g, MgSO-7
  • Genomic DNA was prepared by the method shown in (A) of Example 1 above.
  • the DNA prepared in the above (A) was used as a type II, and a synthetic DNA (SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 5) designed based on the nucleotide sequence of the gene described in JP-A-11-206385. PCR was performed using SEQ ID NO: 6).
  • Reaction solution composition Type 1 DNA 1 ⁇ L, Taq DNA polymerase (Takara Shuzo) 0.2 ⁇ L, 1x attached buffer 1, 0.2 ⁇ Mix each primer, 0.25 ⁇ MdNTPs, and mix up to 20 ⁇ l.
  • Taq DNA polymerase Takara Shuzo
  • Reaction temperature conditions Using a DNA thermal cycler PTC_200 (manufactured by MJ Research), a cycle consisting of 94 ° C for 20 seconds, 55 ° C for 20 seconds, and 72 ° C for 1 minute was repeated 30 times. However The heat retention at 94 ° C in the first cycle was 1 minute and 20 seconds, and the heat retention at 72 ° C in the final cycle was 5 minutes.
  • the amplification products were confirmed by separation by gel electrophoresis of 0.75% agarose (SeaKem GTG agarose: manufactured by FMC BioProducts), and visualization by chidium bromide staining. Fragments were detected.
  • the target DNA fragment was recovered from the gel using a QIAQ uick Gel Extraction Kit (manufactured by QIAGEN).
  • the recovered DNA fragment is mixed with a PCR product cloning vector pGEM_TEasy (manufactured by Promega), ligated using Ligation Kit ver. 2 (manufactured by Takara Shuzo), and Escherichia coli (DH5a Strain).
  • the recombinant E. coli thus obtained was spread on an LB agar medium containing 50 ⁇ g ZmL ampicillin and 50 ⁇ g / mL X-Gal.
  • the strain grown on this medium was subjected to liquid culture by a conventional method, and then the plasmid DNA was purified.
  • the resulting plasmid DNA was cut with restriction enzymes Sad and Sphl to select a clone in which an inserted fragment of about 0.75 kb was recognized, and this was named pGEMT / ALDH.
  • Plasmid DNA was purified.
  • the obtained plasmid DNA was cut with restriction enzymes Sad and Sphl, and a plasmid in which an inserted fragment of about 0.75 kb was recognized was selected and named pKMBl / ALDH (FIG. 2).
  • Plasmid DNA used for the transformation of Brevibata teridium 'Flavam MJ-233 strain was prepared from E. coli JM110 strain transformed by the calcium chloride method using pKMBl / ALDH in the calcium chloride method (loumal of Molecular Biology, 53, 159, 1970). did.
  • Brevibataterum 'Flavum MJ-233 strain (FERM BP-1497) was prepared by a conventional method (Wolf H et al., J. Bacteriol. 1983, 156 (3) 1165-1170, Kurusu Y et al "Agric The endogenous plasmid was removed (cured) according to Biol Chem. 1990, 54 (2) 443-7), and the resulting plasmid-clearing strain Brevibataterum 'Flavam MJ233-ES strain was used for subsequent transformation. Transformation of Brevibataterium 'Flavam MJ233-ES strain was performed by an electric pulse method (Res. Microbiol., Vol. 144, p.
  • the homologous recombinant strain was liquid-cultured in an LBG medium containing 50 ⁇ g / mL of kanamycin. About 1 million equivalents of the number of cells in this culture were smeared on an LBG medium containing 10% sucrose. As a result, about 10 strains that were considered to be sucrose-insensitive due to the loss of the SacB gene by the second homologous recombination were obtained.
  • the strains thus obtained include those in which the ratate dehydrogenase gene has been replaced by a mutant derived from pKM BlZ A LDH and those which have returned to the wild type.
  • the cells obtained by liquid culture in LBG medium should be directly subjected to the PCR reaction to detect the ratate dehydrogenase gene. Can be easily confirmed.
  • Analysis using the primers (SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8) for amplifying the ratate dehydrogenase gene should reveal a DNA fragment of 720 bp for the wild type and 471 bp for the mutant having the deletion region. is there.
  • Brevibataterium 'Flavum MJ233 / ⁇ LDH strain prepared in (D) above was inoculated into medium A, and cultured at 30 ° C. for 15 hours under aerobic shaking. The obtained culture is centrifuged (3,000 X g, 4 ° C, 20 minutes) to collect the cells, and then a sodium-phosphate buffer [composition: 50 mM sodium phosphate buffer (PH7.3)] ].
  • 0.5 g (wet weight) of the washed cells was suspended in 2 mL of the above sodium-phosphate buffer, and the suspension was subjected to an ultrasonic homogenizer (manufactured by Branson) under ice cooling to obtain a cell homogenate.
  • the crushed product was centrifuged (10, OOO X g, 4 ° C, 30 minutes) to obtain a supernatant as a crude enzyme solution.
  • a crude enzyme solution of Brevibataterium 'Flavam MJ233-ES strain was prepared in the same manner and subjected to the following activity measurement.
  • the ratate dehydrogenase enzyme activity was confirmed by measuring the oxidation of coenzyme NADH to NAD + with the generation of lactic acid using pyruvate as a change in the absorbance of 340 ⁇ m for both crude enzyme solutions. Kanarek and R ⁇ .Hill, J. Biol. Chem. 239, 4202 (1964)]. The reaction was carried out at 37 ° C. in the presence of 50 mM potassium monophosphate buffer (pH 7.2), 10 mM pyruvate, and 0.4 mM NADH.
  • ratato dehydrogenase activity in the crude enzyme solution prepared from Brevibataterum 'Flavum MJ233-ES strain was lower than that in crude enzyme solution prepared from Brevibatatellium' Flavum MJ233 / ALDH strain. Tate dehydrogenase activity was less than one tenth.
  • This promoter fragment was obtained by synthesizing the Brevibatatellium flavum MJ233 genomic DNA prepared in (A) of Example 2 into type III and designing it based on the sequence described in SEQ ID NO: 4 of JP-A-7-95891. This was performed by PCR using DNA (SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10).
  • Reaction solution composition Type 1 DNA 1 ⁇ L, Pfx DNA polymerase (Invitrogen) 0.2 ⁇ L, 1-fold concentration attached buffer, 0.3 ⁇ ⁇ each primer, ImM MgSO, 0.25 ⁇ l
  • MdNTPs were mixed to make a total volume of 20 ⁇ l.
  • Reaction temperature conditions 94, using DNA Thermal Cycler PTC_200 (manufactured by MJ Research). 20 C, 60 C. 20 C, 72 in C. In C, he regained the power of 30 hectares and 35 times of the cycling reef. However, the heat retention at 94 ° C in the first cycle was 1 minute and 20 seconds, and the heat retention at 72 ° C in the final cycle was 2 minutes.
  • Amplification products were confirmed by separation by gel electrophoresis on 2.0% agarose (SeaKem GTG agarose: FMCBioProducts) and visualization by chidium bromide staining. Detected. The target DNA fragment was recovered from the gel using a QIAQuick Gel Extraction Kit (manufactured by QIAGEN).
  • the recovered DNA fragment is phosphorylated at the 5 'end with T4 polynucleotide kinase (T4), and then is ligated with an E. coli vector PUC19 (ligase kit ver. 2 (Takara Shuzo)). Plasmid that binds to the Smal site of Takara Shuzo E. coli (DH5a strain) was transformed with the DNA. The recombinant Escherichia coli thus obtained was spread on an LB agar medium containing 50 ⁇ g / mL ampicillin and 50 ⁇ g / mL X-Gal.
  • Plasmid DNA was purified. From the obtained plasmid DNAs, those cut by the restriction enzyme Notl were selected and named PUC / TZ4-SD.
  • PHSG298par_rep described in JP-A No. 12-93183 is used as a plasmid capable of autonomously replicating stably in coryneform bacteria.
  • This plasmid contains the replication region and stabilizing function of the natural plasmid pBY503, which is contained in the Brevibataterium 'Statios IFIF 144144 strain, the kanamycin resistance gene derived from the E. coli vector PHSG298 (Takara Shuzo), and the replication region of E. coli. Is provided.
  • the strain grown on this medium was subjected to liquid culture by a conventional method, and then the plasmid DNA was purified. From the obtained plasmid DNAs, those cut by the restriction enzyme Notl were selected, and the plasmid was named PTZ4 (the construction procedure is shown in FIG. 3).
  • Reaction temperature conditions Using a DNA thermal cycler PTC-200 (manufactured by MJ Research), a cycle consisting of 94 ° C for 20 seconds and 68 ° C for 4 minutes was repeated 35 times. However, the heat retention at 94 ° C in the first cycle was 1 minute and 20 seconds, and the heat retention at 68 ° C in the final cycle was 10 minutes. After completion of the PCR reaction, 0.1 ⁇ L of Takara Ex Taq (Takara Shuzo) was added, and the mixture was further incubated at 72 ° C. for 30 minutes.
  • the amplification product was confirmed by separation by gel electrophoresis of 0.75% agarose (SeaKem GTG agarose: manufactured by FMC BioProducts), and visualization by chidium bromide staining. Fragments were detected.
  • the target DNA fragment was recovered from the gel using a QIAQuick Gel Extraction Kit (manufactured by QIAGEN).
  • the recovered DNA fragment is mixed with a PCR product cloning vector pGEM-TEasy (manufactured by Promega) and ligated using a ligation kit ver. 2 (manufactured by Takara Shuzo). DH5a strain).
  • the recombinant E. coli thus obtained is spread on an LB agar medium containing 50 ⁇ g / mL ampicillin and 50 ⁇ g / mL X-Gal. It was.
  • the base sequence of the inserted fragment of pGEMZMJPC was determined using a base sequence decoding device (Model 377XL) manufactured by Applied Biosystems and a big dye terminator one-cycle sequence kit ver3.
  • the resulting DNA nucleotide sequence and deduced amino acid sequence are shown in SEQ ID NO: 15. Since this amino acid sequence has extremely high homology (99.4%) with that of the strain Corynebacterium 'Gnoretami tandem ATCC13032', the inserted fragment of pGE M / MJPC is derived from Brevibataterum 'Flavum MJ233' It was determined that the gene was a pyruvate carboxylase gene.
  • This DNA fragment was mixed with PTZ4 constructed in Example 3>, which was to be cleaved with restriction enzymes Pacl and Apal, and ligated using Ligation Kit ver. 2 (Takara Shuzo). Escherichia coli (DH5a strain) was transformed with the resulting plasmid DNA. The recombinant E. coli thus obtained was spread on an LB agar medium containing 50 ⁇ g / mL kanamycin.
  • the strain grown on this medium was subjected to liquid culture by a conventional method, and then the plasmid DNA was purified.
  • the resulting plasmid DNA was digested with the restriction enzymes Pacl and Apal to select those having an inserted fragment of about 3.7 kb, which was named pMJPCl (FIG. 4).
  • Plasmid DNA for transformation with pMJPCl capable of replication in Brevibatadium 'Flavum MJ233 strain was prepared from E. coli (DH5a strain) transformed in the above (B).
  • Transformation of Brevibataterum 'Flavam MJ233Z A LDH strain was carried out by an electric pulse method (Res. Microbiol., Vol. 144, p. 181-185, 1993), and the resulting transformant was obtained.
  • LBG agar medium containing 50 ⁇ g / mL of kanamycin [dissolve 10 g of tryptone, 5 g of yeast extratato, 5 g of NaCl, 20 g of glucose, and 15 g of agar in 1 L of distilled water].
  • the transformant strain Brevibataterium 'Flavam MJ233ZPCZ ⁇ LDH strain obtained in the above (C) was cultured overnight in 100 ml of A medium containing 2% glucose and 25 mg / L kanamycin.
  • the obtained cells were collected, washed with 50 ml of 50 mM potassium phosphate buffer (pH 7.5), and resuspended in 20 ml of a buffer having the same composition.
  • the suspension was crushed with SONIFIER 350 (manufactured by BRANS ⁇ N), and the supernatant obtained by centrifugation was used as a cell-free extract.
  • the pyruvate carboxylase activity was measured using the obtained cell-free extract.
  • Enzyme activity was measured using lOOmM Tris / HCl buffer (pH 7.5), O.lmg / lOml biotin, 5mM magnesium chloride, 50mM sodium bicarbonate, 5mM sodium pyruvate, 5mM adenosine triphosphate, 0.32mM NADH, The reaction was carried out at 25 ° C in a reaction solution containing 20 units / 1.5 ml malate dehydrogenase (manufactured by WAKO, derived from yeast) and the enzyme. 1 U was the amount of enzyme that catalyzes the reduction of 1 ⁇ mol NADH per minute.
  • the specific activity in the cell-free extract in which pyruvate carboxylase was expressed was 0.2 U / mg protein.
  • the pyruvate carboxylase activity was not detected by the present activity measurement method in the cells in which the parent strain MJ233 / ⁇ LDH strain was similarly cultured using the A medium.
  • Escherichia coli (Eschericia coli) strain JM109 was cultured in 10 mL of an LB medium until the late logarithmic growth phase, and the obtained cells were prepared as genomic DNA by the method shown in (A) of Example 1 above.
  • the Escherichia coli fumarate reductase gene was obtained by converting the DNA prepared in (A) above into type III and using the sequence of the gene of Escherichia coli K12-MG1655 (whose whole genome sequence was reported) (PCR was performed using synthetic DNA (SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 18) designed based on GenBank Database Accession No. U00096).
  • Reaction solution composition 1 ⁇ L of type I DNA, 0.2 ⁇ L of Pfx DNA polymerase (manufactured by Invitrogen), 1-fold concentration attached buffer, 0.3 ⁇ each primer, ImM MgSO
  • MdNTPs were mixed to make a total volume of 20 ⁇ l.
  • Reaction temperature conditions DNA thermal cycler Using a PTC-200 manufactured by MJ Research, a cycle consisting of 94 ° C for 20 seconds and 68 ° C for 4 minutes was repeated 35 times. However, the heat retention at 94 ° C in the first cycle was 1 minute and 20 seconds, and the heat retention at 68 ° C in the final cycle was 10 minutes. After completion of the PCR reaction, 0.1 ⁇ L of Takara Ex Taq (Takara Shuzo) was added, and the mixture was further incubated at 72 ° C for 30 minutes.
  • the amplification products were confirmed by separation by gel electrophoresis of 0.75% agarose (SeaKem GTG agarose: manufactured by FMC BioProducts), and visualization by chidium bromide staining. Fragments were detected.
  • the target DNA fragment was recovered from the gel using a QIAQuick Gel Extraction Kit (manufactured by QIAGEN).
  • the recovered DNA fragment was mixed with a PCR product cloning vector pT7Blue T—Vector (manufactured by Novagen) and ligated using Ligation Kit ver. 2 (manufactured by Takara Shuzo). (DH5a strain). Was smeared recombinant Escherichia coli thus obtained in the LB agar medium containing 50 beta g / mL ampicillin and 50 ⁇ g / mLX-Gal.
  • Plasmid DNA was purified. By cutting the obtained plasmid DNA with the restriction enzymes Hindlll and Kpnl, an inserted fragment of about 3.9 kb was recognized and named pFRD6.0.
  • nucleotide sequence of the inserted fragment of pFRD6.0 was determined using a nucleotide sequence decoding device (Model 377XL) manufactured by Applied Biosystems and a Big Dye Terminator One-Cycle Sequence Kit Ver3. The resulting DNA nucleotide sequence and deduced amino acid sequence are shown in SEQ ID NOs: 19, 20-23.
  • the strain grown on this medium was subjected to liquid culture by a conventional method, and then the plasmid DNA was purified. From the obtained plasmid DNAs, those cut by the restriction enzyme Ndel were selected and named pMJPC1.1.
  • E. coli Escherichia coli (DH5a strain) was transformed with the obtained plasmid DNA.
  • the recombinant E. coli thus obtained was spread on an LB agar medium containing 50 / g / mL kanamycin.
  • the strain grown on this medium was subjected to liquid culture by a conventional method, and then the plasmid DNA was purified. From the obtained plasmid DNA, fragments of 505, 2132, 2675, 3775 and 4193 bp were generated by restriction enzyme Hind III, and it was judged that the structure shown in FIG. 5 was correct. l.
  • the transformant strain Brevibataterum 'Flavam MJ233 / FRDZPC / ALDHH strain obtained in (B) above was cultured overnight in 100 ml of A medium containing 2% glucose and 25 mg / L kanamycin.
  • the obtained cells were collected, washed with 50 ml of 50 mM potassium phosphate buffer (pH 7.5), and resuspended in 20 ml of a buffer having the same composition.
  • the suspension was disrupted with SONIFIER 350 (manufactured by BR ANSON), and the supernatant obtained by centrifugation was used as a cell-free extract.
  • the fumarate reductase activity was measured using the obtained cell-free extract.
  • the amount of enzyme that catalyzes the reduction of Fe (CN) was used.
  • the specific activity of fumarate reductase in the cell-free extract in which plasmid pFRPC1.1 was expressed was 0.02 U / mg-protein.
  • the specific activity was 0.01 U / mg-protein in the cells of the parent strain, MJ233 / ALDH strain, which were similarly cultured using the A medium.
  • SDH succinate dehydrogenase
  • a DNA fragment containing each gene of sdhC_sdhA_sdhB that forms an operon is prepared by using the chromosomal DNA of Brevibataterium flavum MJ233 as a type I, and using a synthetic DNA having the sequences of SEQ ID NOS: 26 and 27 as a primer.
  • SEQ ID NO: 28 was obtained by PCR.
  • the PCR reaction was performed using KOD-PLUS- (manufactured by Toyobo) for one cycle of incubation at 94 ° C for 5 minutes, followed by denaturation at 94 ° C for 15 seconds, association at 56 ° C for 30 seconds, and extension at 72 ° C for 4 minutes. The cycle was repeated 25 times.
  • the resulting PCR product was purified by a conventional method and then digested with Smal. After digesting this DNA fragment and pVK7 (Japanese Patent Laid-Open No. 10-215883) with Sail, flatten it with DNA blunting Kit (Takara Bio). The lubricated DNA fragments were mixed and ligated with Ligation Kit ver.2 (Takara Bio).
  • This plasmid is used to transform a competent cell of Escherichia coli JM109 (Takara Bio Inc.), spread on an LB medium containing 25 / ig / ml of kanamycin (hereinafter abbreviated as Km), and culture the cells.
  • Km kanamycin
  • FIG. 6 shows the construction process of pVKSDH.
  • This DNA was used to transform a competent cell of Escherichia coli JM109 (Takara Bio Inc.), and chloramphenicol (hereinafter abbreviated as Cm) 25 ⁇ g / ml, X-Gal 50 ⁇ g / ml, and IPTG ImM were added.
  • pFRPCl.l which is a plasmid carrying the feverate reductase gene derived from Escherichia coli 'coli and the pyc gene derived from Flebium bateridium' flavum described in Example 6, with Kpnl and Ndel, the fumarate derived from Escherichia coli ' The remaining region excluding the reductase gene can be recovered as one fragment. Therefore, pFRPCl.l was digested with Kpnl and Ndel, blunt-ended, and the remaining partial DNA fragment excluding the fumarate reductase gene was recovered.
  • the DNA fragment containing sdhC, sdhA, and sdhB obtained by digesting pHSGSDH with Xbal and Sse8387I was blunt-ended to the recovered DNA fragment, and then ligated.
  • a competent cell of Escherichia coli JM109 manufactured by Takara Bio Inc. was transformed, applied to an LB medium containing Km25 / g / ml, and cultured overnight. Thereafter, the emerged colonies were picked, and single colonies were separated to obtain transformants.
  • Plasmids were extracted from the transformants, and those in which the frdA, frdB, frdC, and frdD genes had been removed and a DNA fragment containing sdhC, sdhA, and sdhB had been inserted were named pSDHPC (FIG. 8).
  • the pVKSDH and pSDHPC obtained in Examples 7 and 8 are capable of autonomous replication in coryneform bacterium cells. Thus, coryneform bacteria were transformed with this plasmid to obtain transformants.
  • the MJ233 / ⁇ LDH strain constructed in Example 2 was transformed with pVKSDH and pSDHPC using the electric pulse method, and a CM-Dex medium containing 25 ⁇ g / ml of kanamycin (glucose 5 g / L, polypeptone 10 g / L, Yeast Extra Tato 10g / L, KH PO
  • MJ233 / SDH / PC / ALDH the plasmid pVK7 and the plasmid pMJPCl constructed in Example 4 were also introduced into the MJ233 / ⁇ LDH strain using the above-described method to prepare a control strain.
  • the transformants thus obtained were designated as MJ233 / ⁇ LDH / pVK7 and MJ233 / PC / ALDH, respectively.
  • Urea 4 g, ammonium sulfate: 14 g, potassium monophosphate: 0.5 g, potassium phosphate 0.5 g, magnesium sulfate ⁇ 7 hydrate: 0.5 g, ferrous sulfate ⁇ 7 hydrate: 20 mg, Manganese sulfate ⁇ hydrate: 20 mg, D-biotin: 200 / ig, thiamine hydrochloride: 200 ⁇ g, yeast extract: lg, power zamino acid: lg, and distilled water: lOOOOmL of medium lOOmL into a 500mL Erlenmeyer flask Heat sterilized at 120 ° C for 20 minutes.
  • Urea 12 g, ammonium sulfate: 42 g, potassium monophosphate: 1.5 g, potassium diphosphate 1.5 g, magnesium sulfate ⁇ heptahydrate: 1.5 g, sulfuric acid Ferrous iron heptahydrate: 60 mg, manganese sulfate 'hydrate: 60 mg, D-pyotin: 600 ⁇ g, thiamine hydrochloride: 600 ⁇ , yeast extract 3 g, casamino acid 3 g, defoamer (Adekinol LG294 : Asahi Denka): lmL and distilled water: 2500mL of the medium was placed in a 5L fermenter, and sterilized by heating at 120 ° C for 20 minutes.
  • Adekinol LG294 Asahi Denka
  • the culture solution obtained by the above main culture was added to the cells collected by centrifugation at 8,000 rpm for 5 minutes, and resuspended to an OD (660 ⁇ m) of 60. .
  • 200 mL of this suspension and 200 mL of a previously sterilized 20% dulcose solution were mixed in a 1-L jar armmenter, and kept at 35 ° C.
  • the pH was maintained at 7.6 using 2M ammonium carbonate, and the reaction was carried out with aeration at 100 mL per minute and stirring at 400 revolutions per minute.
  • a suspension for reaction was prepared in the same manner as in Example 10 described above, and the pH was maintained at 7.6 using 2M ammonium carbonate, and the reaction was carried out without aeration and stirring at 200 rpm. Approximately 40 hours after the start of the reaction, gnorecose was almost consumed. The sugar consumption rate was 2.50 g / L / h, the succinic acid production rate was 1.35 g / L / h, and the yield was 78.4%.
  • the Brevibatatellium 'Flavam MJ233 / PC / ⁇ LDH strain prepared in Example 4 (C) was When reacted in the same manner, the sugar consumption rate was 2.38 g / L / h, the succinic acid production rate was 1.21 g / L / h, and the yield was 74.4%.
  • a suspension for reaction was prepared in the same manner as in Example 10 above, and the pH was maintained at 7.6 using 2M sodium carbonate, and the reaction was carried out in the same manner. About 28 hours after the start of the reaction, glucose was almost consumed. The sugar consumption rate was 3.60 g / L / h, the succinic acid production rate was 2.27 g / L / h, and the yield was 82.8%.
  • a suspension for reaction was prepared in the same manner as in Example 10 described above, and the pH was maintained at 7.6 using 2M ammonium carbonate, and the reaction was carried out without aeration and stirring at 200 rpm. Approximately 32 hours after the start of the reaction, gnorecose was almost consumed. The sugar consumption rate was 3.13 g / L / h, the succinic acid production rate was 1.80 g / L / h, and the yield was 97.1%.
  • MJ233 / ALDH / pVK7 Culture for succinic acid production was carried out as follows using Brevibataterium flavum strains MJ233 / ALDH / pVK7 and MJ233 / SDH / PC / ALDH.
  • MJ233 / ALDH / pVK7 strain obtained by culturing on CM-Dex plate medium (containing 25 ⁇ g / ml
  • MJ233 / SDH / PC / ALDH strain cells were seeded with 3 ml of seed medium (glucose 10 g / L, (NH 2) SO
  • Shaking culture was performed in a test tube at 31.5 ° C for about 15 hours.
  • the accumulated amount of succinic acid and by-product acetic acid in the culture solution can be determined by appropriately diluting the culture solution. After that, it was analyzed by liquid chromatography.
  • the column used was two Shim-pack SCR-102H (Simazu) connected in series, and the sample was eluted at 40 ° C using 5 mM p-toluenesulfonic acid. Neutralize the eluate with a 20 mM Bis-Tris aqueous solution containing 5 mM p-toluenesulfonic acid and 100 ⁇ M EDTA, and measure succinic acid and acetic acid by measuring electric conductivity with CDD-IOAD (Simazu) did. Table 2 shows the results.
  • the yield of the MJ233 / SDH / ⁇ LDH strain was about 4% higher than that of the MJ233 / ⁇ LDH / pVK7 strain in which the vector plasmid was introduced into the same host. Malic acid accumulation decreased by 3.6 g / L and fumaric acid accumulation decreased by 0.5 g / L.
  • yeast extract lg / L was inoculated into yeast extract lg / L) 3ml, about 15 hours with shaking cultured at the test tube at 31.5 ° C at aerobic conditions went.
  • MgO 142.8 g / L
  • succinic acid-producing culture was performed by tightly closing with a silicon stopper to prevent aeration.
  • the culture was shaken at 31.5 ° C for about 48 hours, and the culture was terminated before the sugar in the medium was exhausted.
  • succinic acid can be produced quickly and efficiently.
  • the obtained succinic acid can be used for food additives, pharmaceuticals, cosmetics and the like. Further, it is advantageous to produce a succinic acid-containing polymer by performing a polymerization reaction using the obtained succinic acid as a raw material.

Abstract

　フマル酸リダクターゼ活性が増強するように改変された細菌または該細菌の処理物を、炭酸イオンもしくは重炭酸イオンまたは二酸化炭素ガスを含有する反応液中で有機原料に作用させ、コハク酸を生成させる。より好ましくは、フマル酸リダクターゼ活性及びピルビン酸カルボキシラーゼ活性が増強し、かつラクテートデヒドロゲナーゼ活性が低減化するように改変された細菌または該細菌の処理物を、炭酸イオンもしくは重炭酸イオンまたは二酸化炭素ガスを含有する反応液中で有機原料に作用させ、コハク酸を生成させる。生成したコハク酸を回収することによってコハク酸を製造する。

Description

明 細 書
コハク酸の製造方法
技術分野
[0001] 本発明は、コリネ型細菌等の細菌を用いたコハク酸の製造に関するものである。
京技術
[0002] '酸などの非ァミノ有機酸を発酵により生産する場合、通常、
Anaerobiospirillum属、 Actinobacillus属等の嫌気性細菌が用いられてレ、る（米国特許 第 5, 142, 834号公報及び米国特許第 5, 504, 004号公報、 International Journal of Systematic Bacteriology (1999)， 49,207-216)。嫌気性細菌を用いる場合は、生産 物の収率が高いが、その一方では、増殖するために多くの栄養素を要求するために 、培地中に多量の CSL (コーンスティープリカ一）などの有機窒素源を添加する必要 がある。これらの有機窒素源を多量に添加することは培地コストの上昇をもたらすだ けでなぐ生産物を取り出す際の精製コストの上昇にもつながり経済的でない。
[0003] また、コリネ型細菌のような好気性細菌を好気性条件下で一度培養し、菌体を増殖 させた後、集菌、洗浄し、静止菌体として酸素を通気せずに非ァミノ有機酸を生産す る方法も知られてレヽる（特開平 11—113588号公報及び特開平 11一 196888号公報 )。この場合、菌体を増殖させるに当たっては、有機窒素の添加量が少なくてよぐ簡 単な培地で十分増殖できるため経済的ではあるが、 目的とする有機酸の生成量、生 成濃度、及び菌体当たりの生産速度の向上、製造プロセスの簡略化等、改善の余地 があった。また、ホスホェノールピルビン酸カルボキシラーゼの活性を増強させた細 菌を用いた非ァミノ有機酸の発酵生産などが報告されていたが (例えば、特開平 11 —196887号公報）、フマル酸リダクターゼの活性を増強させた細菌を用いて非ァミノ 有機酸を製造することは、これまで報告されていなかった。
発明の開示
[0004] 本発明の課題は、より生産効率の高いコハク酸の製造方法を提供することにある。
[0005] 本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、フマル酸リダクタ ーゼ活性が増強するように改変された細菌あるいはその処理物を、炭酸イオンもしく は重炭酸イオンまたは二酸化炭素ガスを含有する反応液中で有機原料に作用させ ることにより、有機原料の消費速度、コハク酸の生成速度、あるいは、収率が高まるこ とを見出し、本発明を完成するに至った。
[0006] すなわち本発明によれば、以下の発明が提供される。
(1) フマル酸リダクターゼ活性が増強するように改変された細菌または該細菌の 処理物を、炭酸イオンもしくは重炭酸イオンまたは二酸化炭素ガスを含有する反応液 中で有機原料に作用させることによってコハク酸を生成させ、該コハク酸を採取する ことを特徴とするコハク酸の製造方法。
(2) 細菌が、コリネ型細菌、バチルス属細菌、又はリゾビゥム属細菌からなる群より 選ばれるいずれかの細菌である、（1)の方法。
(3)細菌が、コリネ型細菌由来のコハク酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を用いることによ つてフマル酸リダクターゼ活性が増強するように改変された細菌である（1)または（2) の方法。
(4)上記細菌が、大腸菌由来のフマル酸リダクターゼ遺伝子を用いることによって フマル酸リダクターゼ活性が増強するように改変された細菌である（1)または（2)の 方法。
(5) 前記細菌が、さらに、ラタテートデヒドロゲナーゼ活性が非改変株に比べて 10 %以下に低減化するように改変された細菌である、 (1)一 (4)のいずれかの方法。
(6) 前記細菌が、さらに、ピルビン酸カルボキシラーゼ活性が増強するように改変 された細菌であることを特徴とする（1)一（5)のレ、ずれかの方法。
(7) 有機原料を嫌気的雰囲気下で作用させることを特徴する（1)一 (6)のいずれ かの方法。
(8) 有機原料が、グルコースである（1)一（7)のいずれかの方法。
(9) (1)一 (8)のいずれかの方法によりコハク酸を製造する工程、及び得られたコ ハク酸を重合させる工程を含む、コハク酸含有ポリマーの製造方法。
図面の簡単な説明
[0007] [図 1]プラスミド pKMBlの構築手順と制限酵素地図を示す図。
[図 2]プラスミド ρΚΜΒΙ/ Δ LDHの構築手順を示す図。 園 3]プラスミド pTZ4の構築手順を示す図。
園 4]プラスミド pMJPClの構築手順を示す図。
園 5]プラスミド pFRPC l . 1の構築手順を示す図。
園 6]プラスミド pVKSDHの構築手順を示す図。
園 7]プラスミド pHSGSDHの構築手順を示す図。
園 8]プラスミド pSDHPCの構築手順を示す図。
発明を実施するための最良の形態
[0008] 以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
[0009] 本発明の製造方法に用いることのできる細菌は、フマル酸リダクターゼ活性が増強 するように改変された細菌である。ここで、 「フマル酸リダクターゼ活性」とは、フマル 酸を還元してコハク酸に変換する反応を触媒する活性をいい、「フマル酸リダクタ一 ゼ活性が増強する」とは、野生株、あるいは、フマル酸リダクターゼ非改変株と比較し てフマル酸リダクターゼ活性が増強していることをいう。フマル酸リダクターゼ活性は、 後述するような K Fe(CN)の減少を測定する方法によって測定することができる。大腸 菌フマル酸リダクターゼは、 TCA回路の正回りで作用するコハク酸デヒドロゲナーゼ の逆反応を担う酵素であるが、嫌気的条件下におけるフマル酸呼吸に関与しており 、好気的条件下においては転写レベルでその遺伝子発現が抑制されていることが知 られている（Jones, H. Μ· , Gunsalus, R. P. , J. BacterioL , 1985， Vol. 164, pi 100-1109)。従って、フマル酸リダクターゼはその活性が増強されすぎると、菌体の 生育が悪くなることが考えられるため、本発明においては、フマル酸リダクターゼ活性 は菌体の生育が大きく阻害されない程度に増強されていることが望ましい。
[0010] フマル酸リダクターゼ活性の増強は、例えば、フマル酸リダクターゼ遺伝子を用い た遺伝子組換え法などにより、親株である細菌株を改変することによって行うことがで きる。また、コハク酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子力 コハク酸デヒドロゲナー ゼ活性と同時にフマル酸リダクターゼ活性を有するタンパク質をコードしている場合も ある。従って、フマル酸リダクターゼ活性及びコハク酸デヒドロゲナーゼ活性の両方を 有するタンパク質をコードする遺伝子の発現量を高めてもょレ、。例えばコリネ型細菌 のコハク酸デヒドロゲナーゼは、その逆反応であるフマル酸からコハク酸を生成する 反応を触媒できる。コハク酸デヒドロゲナーゼ活性は、 Arkrell,B.A.Cらの方法（Meth Enzymol.53,466-483)により測定出来る。
[0011] 本発明に使用できる細菌の親株は、コハク酸の生産能を有すれば特に限定されな いが、コリネ型細菌（coryneform bacterium)、バチルス属細菌、又はリゾビゥム属細菌 が好ましぐコリネ型細菌がより好ましい。コリネ型細菌としては、コリネバタテリゥム属 に属する微生物、ブレビバタテリゥム属に属する微生物又はアースロバクタ一属に属 する微生物が挙げられ、このうち好ましくは、コリネバタテリゥム属又はブレビバタテリ ゥム属に属するものが挙げられ、更に好ましくは、コリネバクテリウム-ダルタミカム（Co rynebacterium glutamicum)、フレビノ クァリウム 'フフノヽム (Brevibacterium f lavum)、ブレビノ クテリゥム 'アンモニアケ不ス (Brevibacterium ammoniagenes )又はフレビノ クテリゥム 'ラクトフアーメンタム (Brevibacterium lactofermentum )に属する微生物が挙げられる。
[0012] 上記細菌の親株の特に好ましい具体例としては、ブレビバクテリウム'フラバム MJ— 233 (FERM BP— 1497)、同 MJ— 233 AB— 41 (FERM BP— 1498)、ブレビバ クテリゥム'アンモニアゲネス ATCC6872、コリネバタテリゥム 'グルタミカム ATCC 31831、及びブレビバタテリゥム 'ラタトフアーメンタム ATCC13869等が挙げられる。 なお、ブレビバタテリゥム 'フラバムは、現在、コリネバタテリゥム 'ダルタミカムに分類さ れる場合もあることから（Lielbl, W., Ehrmann, Μ·， Ludwig, W. and Schleifer, K. H" International Journal of Systematic Bacteriology, 1991, vol. 41, p255_260)、本発明 においては、ブレビバタテリゥム.フラバム MJ—233株、及びその変異株 MJ— 233 A B—41株はそれぞれ、コリネバタテリゥム 'グルタミカム MJ—233株及び MJ—233 AB —41株と同一の株であるものとする。
ブレビバタテリゥム 'フラバム MJ— 233は、 1975年 4月 28日に通商産業省工業技術 院微生物工業技術研究所 (現独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託 センター）（T 305-8566 日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6)に受託番 号 FERM P-3068として寄託され、 1981年 5月 1日にブダペスト条約に基づく国際寄託 に移管され、 FERM BP-1497の受託番号で寄託されている。
[0013] 本発明の方法において親株として用いられる上記細菌は、野生株だけでなぐ UV 照射や NTG処理等の通常の変異処理により得られる変異株、細胞融合もしくは遺 伝子組換え法などの遺伝学的手法により誘導される組換え株などのいずれの株であ つてもよレ、。尚、上記遺伝子組み換え株の宿主としては、形質転換可能な微生物で あれば、親株と同じ属種であっても良いし、属種の異なるものであっても良いが、上 述のような好気性細菌を宿主とするのが好ましい。
[0014] フマル酸リダクターゼ（FRD)遺伝子を用いてフマル酸リダクターゼ活性が増強する ように改変する場合、用いることのできる遺伝子はフマル酸リダクターゼ活性を有する タンパク質をコードする限り特に限定されないが、例えば、配列番号 19に示す塩基 配列を有する大腸菌由来の遺伝子を挙げることができる。この遺伝子はフマル酸リダ クターゼを構成する 4つのサブユニット（frdA、 frdB、 frdC及び frdD；配列番号 20 23 )をコードする遺伝子（配列番号 19の塩基番号 440 2245, 2241— 2975,2986— 3381， 及び 3392— 3751)をそれぞれ含む、オペロン遺伝子である。この遺伝子の全長を細 菌に導入してもよいし、サブユニット遺伝子ごとに導入してもよい。各サブユニット遺 伝子は、 FRD活性を有する複合体を形成することのできるサブユニットタンパク質を コードする限り、上記塩基配列を有する DNAとストリンジェントな条件でハイブリダィズ する DNA、または上記塩基配列と 90%以上、好ましくは 95%以上、より好ましくは 99 %以上の相同性を有する DNAのようなホモログであってもよレ、。ここで、ストリンジェン トな条件としては、通常のサザンハイブリダィゼーシヨンの洗いの条件である 60°C、 1 X SSC, 0. 10/0SDS、好ましく ίま、 0. 1 X SSC、 0. 10/0SDSに申目当する塩濃度でノヽ イブリダィズする条件が挙げられる。なお、このような FRD遺伝子ホモログの中でも、 FRDの Bサブユニット（frdB) (配列番号 21)の 17番目のアミノ酸に対応するアミノ酸が リジンであるようなタンパク質をコードするものが好ましい。配列番号 19に示す塩基配 列を有する遺伝子又はそのホモログは、 PCR法やハイブリダィゼーシヨン法によって 得ること力 Sできる。
また、必要に応じて、 frdBの 17番目のアミノ酸に対応するアミノ酸がリジンになるよう な突然変異を、公知の方法により導入することもできる。
[0015] また、コハク酸デヒドロゲナーゼとフマル酸レダクターゼ両方の活性を有するタンパ ク質をコードする遺伝子を使用してもよい。例えば、配列番号 28に示す塩基配列を 有するコリネ型細菌由来の sdh遺伝子を挙げることができる。この遺伝子はコハク酸デ ヒドロゲナーゼを構成する 3つのサブユニット (sdhA, sdhBおよび sdhC)をコードする 遺伝子（配列番号 28の塩基番号 1153— 3171, 3174— 3920および 363— 1133)をそ れぞれ含む、オペロン遺伝子である。コリネバタテリゥム 'ダルタミカムの sdhオペロン は、 Genebank accession No.NCgl0359 (sdhC) NCgl0360(sdhA) NCgl0361(sdhB)に 記載されている。
この遺伝子の全長を細菌に導入してもよいし、サブユニット遺伝子ごとに導入しても よい。各サブユニット遺伝子は、 FRD活性を有する複合体を形成することのできるサ ブユニットタンパク質をコードする限り、上記塩基配列を有する DNAとストリンジヱント な条件でハイブリダィズする DNA、または上記塩基配列と 90%以上、好ましくは 95 Q/o以上、より好ましくは 99。/0以上の相同性を有する DNAのようなホモログであっても よレ、。ここで、ストリンジヱントな条件としては、通常のサザンハイブリダィゼーシヨンの 洗レヽの条件である 60。C、 1 X SSC, 0. 10/0SDS、好ましく ίま、 0. 1 X SSC、 0. 1 %S DSに相当する塩濃度でハイブリダィズする条件が挙げられる。
[0016] また、フマル酸レダクターゼ活性を有する限り、配列番号 20— 23、配列番号 29— 31 に示すアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または 付加を含むアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよレ、。ここ で、数個とは、例えば、 2— 20個、好ましくは 2— 10個、より好ましくは 2— 5個を意味 する。
[0017] また、大腸菌やコリネ型細菌以外の細菌、または他の微生物又は動植物由来の F RD遺伝子を使用することもできる。微生物または動植物由来の FRD遺伝子は、既 にその塩基配列が決定されている遺伝子、ホモロジ一等に基いて FRD活性を有す るタンパク質をコードする遺伝子を微生物、動植物等の染色体より単離し、塩基配列 を決定したものなどを使用することができる。また、塩基配列が決定された後には、そ の配列にしたがって合成した遺伝子を使用することもできる。これらはハイブリダィゼ ーシヨン法や PCR法によりそのプロモーターおよび〇RF部分を含む領域を増幅する ことによって、取得すること力できる。
[0018] コリネ型細菌を使用する場合、 FRD遺伝子を含む DNA断片を、適当なプラスミド、 例えばコリネ型細菌内でプラスミドの複製増殖機能を司る遺伝子を少なくとも含むプ ラスミドベクターに導入することにより、コリネ型細菌内で FRDの発現増強が可能な組 換えプラスミドを得ることができる。コリネ型細菌に FRD遺伝子を導入することができる プラスミドベクターとしては、コリネ型細菌内での複製増殖機能を司る遺伝子を少なく とも含むものであれば特に制限されない。その具体例としては、例えば、特開平 3— 2 10184号公報に記載のプラスミド pCRY30 ;特開平 2—72876号公報及び米国特許 5, 185， 262号明細書公報に記載のプラスミド pCRY21、 pCRY2KE、 pCRY2KX 、 pCRY31、 pCRY3KE及び pCRY3KX;特開平 1—191686号公報に記載のプラ スミド PCRY2および pCRY3；特開昭 58— 67679号公報に記載の pAM330；特開 日召 58—77895号公幸艮 (こ記載の ρίίΜΙ 519 ;特開日召 58—192900号公幸艮 ίこ記載の p AJ655、 pAJ611及び pAJ1844；特開昭 57— 134500号公報に記載の pCGl；特開 昭 58—35197号公報に記載の pCG2 ;特開昭 57—183799号公報に記載の pCG4 および pCGl l ;特開平 10-215883号公報に記載の pVK7等を挙げることができる なお、上述の通り、フマル酸リダクターゼはその活性が増強されすぎると、菌体の生 育が悪くなることが考えられるため、適当なコピー数のプラスミドを選択することにより 、菌体の生育を阻害しない程度に FRD遺伝子の発現量を調節することが好ましい。 なお、 FRD活性の増強は、公知の相同組換え法によって染色体上で FRD遺伝子を 導入、置換、増幅等によって高発現化させることによつても行うことができる。
また、 FRD遺伝子がオペロン構造であるときは、上記の方法のほかに WO0018935 記載のように、その発現を制御するプロモーター領域に変異を導入することにより達 成することちできる。
上記組み換えプラスミドまたは染色体上への組み込みにおいて、 FRD遺伝子を発 現させるためのプロモーターはコリネ型細菌において機能するものであればレ、かなる プロモーターであっても良ぐ用いる FRD遺伝子自身のプロモーターであってもよレ、。 プロモーターを適宜選択することによつても、 FRD遺伝子の発現量の調節が可能で ある。以上、コリネ型細菌を用いる例を述べたが、他の細菌を用いる場合も同様の方 法によって、 FRD活性の増強を達成することができる。 [0020] 本反応においては、フマル酸リダクターゼ活性の増強に加えて、ラタテートデヒドロ ゲナーゼ活性が低減化するように改変された細菌株を用いるとより有効である。ここ で、「ラタテートデヒドロゲナーゼ活性が低減化された」とは、ラタテートデヒドロゲナー ゼ非改変株と比較してラタテートデヒドロゲナーゼ活性が低下していることをいう。ラタ テートデヒドロゲナーゼ活性は、ラタテートデヒドロゲナーゼ非改変株と比較して、菌 体当たり 10%以下に低減化されていることが好ましい。また、ラタテートデヒドロゲナ ーゼ活性は完全に欠損していてもよい。ラタテートデヒドロゲナーゼ活性が低減化さ れたことは、公知の方法（L.Kanarek and R.L.Hill, J. Biol. Chem.239, 4202 (1964)) によりラタテートデヒドロゲナーゼ活性を測定することによって確認することができる。 コリネ型細菌のラタテートデヒドロゲナーゼ活性の低減化した変異株の具体的な製造 方法としては、特開平 11—206385号公報に記載されている染色体への相同組換え による方法、あるいは、本明細書実施例に記載の SacB遺伝子を用いる方法（
Schafer, A. et al. Gene 145 (1994) 69_73)等が挙げられる。本発明のラタテートデヒド ロゲナーゼ活性が低減化され FRD遺伝子の発現が増強されたコリネ型細菌は、例え ば後述の実施例 2のようにして、 LDH遺伝子が破壊された細菌を作製し、該細菌を FRD遺伝子を含む組換えベクターで形質転換することにより得ることができる。ただし 、LDH活性低減化のための改変操作と FRD活性増強のため改変操作はどちらを先 に行ってもよい。
[0021] また、本反応においては、フマル酸リダクターゼ活性の増強に加えて、ピルビン酸 カルボキシラーゼの活性が増強するように改変された細菌を用いてもよい。「ピルビン 酸カルボキシラーゼの活性が増強される」とは、ピルビン酸カルボキシラーゼの活性 が野生株又は親株等の非改変株に対して増加してレ、ることをレ、う。ピルビン酸カルボ キシラーゼの活性は例えば、後述するような NADHの減少を測定する方法により測定 すること力 Sできる。フマル酸リダクターゼ及びピルビン酸カルボキシラーゼの発現が増 強されたコリネ型細菌は、特開平 11—196888号公報に記載の方法と同様にして、 フマル酸リダクターゼ（FRD)遺伝子及びピルビン酸カルボキシラーゼ（PC)遺伝子 をコリネ型細菌中で高発現させることにより作製することができる。
[0022] 本発明の方法に使用される PC遺伝子は、既にその塩基配列が決定されている遺 伝子、もしくは、下記に示すような方法により PC活性を有するタンパク質をコードする DNA断片を微生物、動植物等の染色体より単離し、塩基配列を決定したものを使用 すること力 Sできる。また、塩基配列が決定された後には、その配列にしたがって合成し た遺伝子を使用することもできる。
[0023] PC遺伝子を含む DNA断片は、微生物、動植物由来の染色体上に存在している。
これらの供給源微生物、動植物から PC遺伝子を調製するための基本操作を、配列 が既知であるコリネ型細菌由来のものを一例として述べれば次のとおりである。 PC遺 伝子は、上記コリネ型細菌コリネバタテリゥム'ダルタミカム ATCC13032株の染色 体上に存在し（Peters-Wendisch, P.G. et al. Microbiology, vol.144 (1998) p915- 927 )、それらの配列が既知であるため（GenBank Database Accession No. APO 05276) (配列番号 15)、 PCR法により、単離 ·取得することができる。
[0024] 例えば、 PCRに用いるプライマーとして、配列番号 13及び 14に示す塩基配列を有 するオリゴヌクレオチドを用い、コリネバクテリウム'ダルタミカム由来の染色体を铸型と して PCRを行うと、約 3. 7kbからなる PC遺伝子を増幅させることができる。このとき、 PCRに使用するプライマーの 5 '末端に適当な制限酵素サイトを付加しておくことによ り、後述するベクターの適当な部位に連結させることができ、得られる組換えベクター を用いてコリネ型細菌に導入することができる。
[0025] また、遺伝子配列が不明であっても、 PC活性を指標に蛋白質を精製し、その N末 アミノ酸配歹 U、部分分解配列よりプローブを合成し、通常用いられるハイブリダィゼー シヨンの手法により遺伝子断片を単離できる。また、 PC蛋白質間で保存されている領 域のアミノ酸配列をもとにプローブまたはプライマーを合成し、ハイブリダィゼーシヨン 、 PCR法により断片を取得することが可能である。取得した断片は通常の手法により その DNA塩基配列を決定することができる。
[0026] 本明細書において、切断 DNA断片の大きさ及びプラスミドの大きさは、ァガロース ゲル電気泳動を用いる場合には、ェシエリヒア'コリのラムダ'ファージ a phage)の D NAを制限酵素 Hindlllで切断して得られる分子量既知の DNA断片の同一ァガロ ースゲル上での泳動距離で描かれる標準線に基づき、また、ポリアクリルアミドゲル電 気泳動を用いる場合には、ェシエリヒア'コリのフアイ'エックス 174ファージ（Φ Χ174 phage)の DNAを制限酵素 Haelllで切断して得られる分子量既知の DNA断片の 同一ポロアクリルアミドゲル上での泳動距離で描かれる標準線に基づき、切断 DNA 断片またはプラスミドの各 DNA断片の大きさを算出することができる。尚、各 DNA断 片の大きさの決定において、 lkb以上の断片の大きさについては、 1%ァガロースゲ ル電気泳動によって得られる結果を採用し、約 0. lkbから lkb未満の断片の大きさ については 4%ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって得られる結果を採用した。
[0027] 本発明において PC活性を増強させるために用いる上記 PC遺伝子を包含する DN A断片は、コリネバクテリウム'ダルタミカム染色体 DNAから単離されたもののみなら ず、通常用いられる DNA合成装置、例えばアプライド 'バイオシステムズ (Applied Biosystems)社製 394DNA/RNAシンセサイザーを用いて合成されたものであって もよレ、。また、前記の如くコリネ型細菌染色体 DNAから取得される PC遺伝子は、コ ードされる PCの機能、すなわち二酸化炭素固定に関与する性質を実質的に損なうこ とがない限り、配列番号 15の塩基配列において、一部の塩基が他の塩基と置換され ていてもよぐ又は削除されていてもよぐ或いは新たに塩基が挿入されていてもよく 、さらに塩基配列の一部が転位されているものであってもよぐこれらの誘導体のいず れも力 本発明に用いることができる。配列番号 15の塩基配列を有する DNAとストリ ンジェントな条件でハイブリダィズする DNA、または配列番号 15の塩基配列と 90% 以上、好ましくは 95%以上、より好ましくは 99%以上の相同性を有する DNAであって 、 PC活性を有するタンパク質をコードする DNAも好適に用いることができる。ここで、 ストリンジヱントな条件としては、通常のサザンハイブリダィゼーシヨンの洗いの条件で ある 60oC、 1 X SSC, 0. 10/0SDS、好ましく ίま、 0. 1 X SSC、0. 10/0SDSに申目当す る塩濃度でハイブリダィズする条件が挙げられる。
[0028] また、コリネバクテリウム'ダルタミカム以外の細菌、または他の微生物又は動植物 由来の PC遺伝子を使用することもできる。特に、以下に示す微生物または動植物由 来の PC遺伝子は、その配列が既知（以下に文献を示す）であり、上記と同様にして ハイブリダィゼーンシヨンにより、あるいは PCR法によりその〇RF部分を増幅すること によって、取得することができる。
[0029] ヒト [Biochem.Biophys.Res.Comm.， 202, 1009—1014, (1994)] マウス [Proc.Natl.Acad.Sci.USA.， 90, 1766-1779， (1993)]
ラット [GENE, 165, 331-332， (1995)]
酵母；サッカロマイセス 'セレビシェ (Saccharomyces cerevisiae)
[Mol.Gen.Genet., 229, 307—315, (1991)]
シンサッカロマイセス-ポンべ (Schizosaccnaromyces pombe)
[DDBJ Accession No. ; D78170]
ノ チノレス'ステアロサーモフイノレス (Bacillus stearothermophilus)
[GENE, 191， 47-50, (1997)]
リゾビゥム.ェトリ（Rhizobium etli)
[J.BacterioL , 178， 5960-5970， (1996)]
PC遺伝子を含む DNA断片は、適当な発現プラスミド、例えば pUC118 (宝酒造製 )へ揷入し、適当な宿主微生物、例えばェシエリヒア'コリ JM109 (宝酒造製）へ導入 することにより発現させることができる。発現した PC遺伝子産物であるピルビン酸カル ボキシラーゼ（配列番号 16)の確認は、該形質転換体から粗酵素液 Magasanikの 方法 [J.Bacteriol., 158， 55-62, (1984)]により直接 PC活性を測定し、非形質転換株か ら抽出した粗酵素液の PC活性と比較することにより、確認することができる。 PC遺伝 子を含む DNA断片を、適当なプラスミド、例えばコリネ型細菌内でプラスミドの複製 増殖機能を司る遺伝子を少なくとも含むプラスミドベクターに導入することにより、コリ ネ型細菌内で PCの高発現可能な組換えプラスミドを得ることができる。ここで、上記 組み換えプラスミドにおいて、 PC遺伝子を発現させるためのプロモーターはコリネ型 細菌が保有するプロモーターであることができる力 それに限られるものではなぐ P C遺伝子の転写を開始させるための塩基配列であればいかなるプロモーターであつ ても良い。例えば、後述の実施例 3に記載するような TZ4プロモーターが挙げられる PC遺伝子を導入することができるプラスミドベクターとしては、コリネ型細菌内での 複製増殖機能を司る遺伝子を少なくとも含むものであれば特に制限されない。その 具体例としては、例えば、特開平 3—210184号公報に記載のプラスミド pCRY30 ;特 開平 2— 72876号公報及び米国特許 5， 185, 262号明細書公報に記載のプラスミド pCRY21、 pCRY2KE、 pCRY2KX、 pCRY31、 pCRY3KE及び pCRY3KX;特 開平 1—191686号公報に記載のプラスミド pCRY2および pCRY3 ;特開昭 58—676 79号公幸艮 ίこ記載の pAM330 ;特開日召 58—77895号公幸 【こ記載の pHM1519 ;特 開昭 58— 192900号公報に記載の pAJ655、 pAJ611及び pAJ1844；特開昭 57— 1 34500号公報に記載の pCGl ;特開昭 58—35197号公報に記載の pCG2 ;特開昭 57—183799号公報に記載の pCG4および pCGl l等を挙げることができる。
[0031] それらの中でもコリネ型細菌の宿主一ベクター系で用いられるプラスミドベクターとし ては、コリネ型細菌内でプラスミドの複製増殖機能を司る遺伝子とコリネ型細菌内で プラスミドの安定化機能を司る遺伝子とを有するものが好ましぐ例えば、プラスミド p CRY30、 pCRY21、 pCRY2KE、 pCRY2KX、 pCRY31、 pCRY3KEおよび pCR Y3KX等が好適に使用される。
[0032] PC遺伝子を、上記したような好気性コリネ型細菌内で複製可能なプラスミドベクタ 一の適当な部位に挿入して得られる組み換えベクターで、コリネ型細菌、例えばブレ ビバクテリウム 'フラバム (Brevibacterium flavum)MJ_233株（FERM BP—1497)を形 質転換することにより、 PC遺伝子の発現が増強されたコリネ型細菌が得られる。なお 、 PC活性の増強は、公知の相同組換え法によって染色体上で PC遺伝子を導入、置 換、増幅等によって高発現化させることによつても行うことができる。得られた細菌を、 FRD遺伝子を含む組換えベクターで形質転換することにより、 PC遺伝子及び FRD 遺伝子の発現が増強されたコリネ型細菌が得られる。なお、 FRD遺伝子と PC遺伝子 の導入はどちらを先に行ってもよい。形質転換は、例えば、電気パルス法（Res. Microbiol., Vol.144, p.181-185, 1993)等によって行うことができる。
[0033] さらに、本発明においては、フマル酸リダクターゼ及びピルビン酸カルボキシラーゼ の活性が増強し、かつ、ラタテートデヒドロゲナーゼ活性が低減化するように改変され た細菌を用いると、コハク酸の製造に特に有効である。このような細菌は、例えば、 LDH遺伝子が破壊されたコリネ型細菌を、 PC遺伝子及び FRD遺伝子を含む組換え ベクターでそれぞれ形質転換することにより得ることができる。なお、これらの遺伝子 を用いた改変操作はレ、ずれの操作を先に行ってもょレ、。
[0034] コハク酸の製造反応に上記細菌を用いるに当たっては、寒天培地等の固体培地で 斜面培養したものを直接反応に用いても良いが、上記細菌を予め液体培地で培養（ 種培養）したものを用いるのが好ましい。このように種培養した細菌を有機原料を含 む培地で増殖させながら、有機原料と反応させることによつても製造することができる 。また、増殖させて得られた菌体を有機原料を含む反応液中で有機原料と反応させ ることによつても製造すること力できる。なお、好気性コリネ型細菌を本発明の方法に 用いるためには、先ず菌体を通常の好気的な条件で培養した後用いることが好まし レ、。培養に用いる培地は、通常微生物の培養に用いられる培地を用いることができる 。例えば、硫酸アンモニゥム、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム等の無機塩からなる 組成に、肉エキス、酵母エキス、ペプトン等の天然栄養源を添加した一般的な培地を 用いることができる。培養後の菌体は、遠心分離、膜分離等によって回収され、反応 に用いられる。
[0035] 本発明では細菌の菌体の処理物を使用することもできる。菌体の処理物としては、 例えば、菌体をアクリルアミド、カラギーナン等で固定化した固定化菌体、菌体を破 砕した破砕物、その遠心分離上清、又はその上清を硫安処理等で部分精製した画 分等が挙げられる。
[0036] 本発明の製造方法に用いる有機原料としては、本微生物が資化してコハク酸を生 成させうる炭素源であれば特に限定されないが、通常、ガラクトース、ラタトース、グノレ コース、フノレクトース、グリセローノレ、シユークロース、サッカロース、デンプン、セノレ口 ース等の炭水化物；グリセリン、マンニトール、キシリトーノレ、リビトール等のポリアルコ ール類等の発酵性糖質が用いられ、このうちグルコース、フルクトース、グリセロール が好ましぐ特にグルコースが好ましい。
[0037] また、上記発酵性糖質を含有する澱粉糖化液、糖蜜なども使用される。これらの発 酵性糖質は、単独でも組み合わせても使用できる。上記有機原料の使用濃度は特 に限定されないが、コハク酸の生成を阻害しない範囲で可能な限り高くするのが有利 であり、通常、 5 30% (WZV)、好ましくは 10 20% (WZV)の範囲内で反応が 行われる。また、反応の進行に伴う上記有機原料の減少にあわせ、有機原料の追加 添加を行っても良い。
[0038] 上記有機原料を含む反応液としては特に限定されず、例えば、細菌を培養するた めの培地であってもよいし、リン酸緩衝液等の緩衝液であってもよレ、。反応液は、窒 素源や無機塩などを含む水溶液であることが好ましい。ここで、窒素源としては、本 微生物が資化してコハク酸を生成させうる窒素源であれば特に限定されなレ、が、具 体的には、アンモニゥム塩、硝酸塩、尿素、大豆加水分解物、カゼイン分解物、ぺプ トン、酵母エキス、肉エキス、コーンスティープリカ一などの各種の有機、無機の窒素 化合物が挙げられる。無機塩としては各種リン酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カリウム 、マンガン、鉄、亜鉛等の金属塩が用いられる。また、ピオチン、パントテン酸、イノシ トール、ニコチン酸等のビタミン類、ヌクレオチド、アミノ酸などの生育を促進する因子 を必要に応じて添加する。また、反応時の発泡を抑えるために、培養液には市販の 消泡剤を適量添加しておくことが望ましい。
[0039] 反応液の pHは、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸カリウム、 炭酸マグネシウム、水酸化ナトリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム等を添 加することによって調整することができる。本反応における pHは、通常、 pH5— 10、 好ましくは pH6— 9.5であることが好ましいので、反応中も必要に応じて反応液の pH はアルカリ性物質、炭酸塩、尿素などによって上記範囲内に調節する。
[0040] 本発明で用いる反応液としては、水、緩衝液、培地等が用いられるが、培地が最も 好ましい。培地には、例えば上記した有機原料と炭酸イオン、重炭酸イオン又は炭酸 ガスを含有させ、嫌気的条件で反応させることができる。炭酸イオン又は重炭酸ィォ ンは、中和剤としても用いることのできる炭酸マグネシウム、炭酸ナトリウム、重炭酸ナ トリウム、炭酸カリウム、重炭酸カリウムから供給されるが、必要に応じて、炭酸若しく は重炭酸又はこれらの塩或いは炭酸ガスから供給することもできる。炭酸又は重炭酸 の塩の具体例としては、例えば炭酸マグネシウム、炭酸アンモニゥム、炭酸ナトリウム 、炭酸カリウム、重炭酸アンモニゥム、重炭酸ナトリウム、重炭酸カリウム等が挙げられ る。そして、炭酸イオン、重炭酸イオンは、 0. 001— 5M、好ましくは 0. 1 3M、さら に好ましくは 1一 2Mの濃度で添加する。炭酸ガスを含有させる場合は、溶液 1L当た り 50mg 25g、好まし <は lOOmg 15g、さらに好まし <は 150mg— 10gの炭酸ガ スを含有させる。
[0041] 本反応に用いる細菌の生育至適温度は、通常、 25°C— 35°Cである。反応時の温 度は、通常、 25°C— 40°C、好ましくは 30°C— 37°Cである。反応に用いる菌体の量 は、特に規定されなレ、が、 1一 700g/L、好ましくは 10— 500g/L、さらに好ましく は 20— 400g/Lが用いられる。反応時間は 1時間一 168時間が好ましぐ 3時間一 72時間がより好ましい。
[0042] 細菌の培養時は、通気、攪拌し酸素を供給することが必要である。一方、コハク酸 の生成反応は、通気、攪拌して行ってもよいが、通気せず、酸素を供給しない嫌気的 雰囲気下で行ってもよい。ここで言う嫌気的雰囲気とは、溶液中の溶存酸素濃度を 低く抑えて反応することを意味する。この場合、溶存酸素濃度として 0 2ppm、好ま しくは 0 lppm、さらに好ましくは 0— 0. 5ppmで反応させることが望ましレ、。そのた めの方法としては、例えば容器を密閉して無通気で反応させる、窒素ガス等の不活 性ガスを供給して反応させる、炭酸ガス含有の不活性ガスを通気する等の方法を用 レ、ることができる。
[0043] 反応液 (培養液）中に蓄積したコハク酸は、常法に従って、反応液より分離 '精製す ること力 Sできる。具体的には、遠心分離、ろ過等により菌体等の固形物を除去した後 、イオン交換樹脂等で脱塩し、その溶液から結晶化あるいはカラムクロマトグラフィー によりコハク酸を分離'精製することができる。
[0044] さらに本発明においては、上記した本発明の方法によりコハク酸を製造した後に、 得られたコハク酸を原料として重合反応を行うことによりコハク酸含有ポリマーを製造 することができる。近年、環境に配慮した工業製品が数を増す中、植物由来の原料を 用いたポリマーに注目が集まってきており、本発明において製造されるコハク酸は、 ポリエステルやポリアミドといったポリマーに加工されて用いる事が出来る。また、本発 明の製造法により得られるコハク酸または該コハク酸を含有する組成物は食品添カロ 物や医薬品、化粧品などに用いることができる。
[実施例]
以下に、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施 例により制限されるものではない。
実施例 1
[0045] <遺伝子破壊用ベクターの構築 > (A)枯草菌ゲノム DNAの抽出
LB培地 [組成：トリプトン 10g、イーストエキストラタト 5g、 NaCl 5gを蒸留水 1Lに溶 解] l OmLに、枯草菌（Bacillus subtilis ISWl 214)を対数増殖期後期まで培養 し、菌体を集めた。得られた菌体を 10mg/mLの濃度にリゾチームを含む 10mM N aCl/20mMトリス緩衝液（pH8. 0) /lmM EDTA ' 2Na溶液 0. 15mLに懸濁し た。
次に、上記懸濁液にプロテナーゼ Kを、最終濃度が 100 x gZmLになるように添 加し、 37°Cで 1時間保温した。さらにドデシノレ硫酸ナトリウムを最終濃度が 0. 5%に なるように添カ卩し、 50°Cで 6時間保温して溶菌した。この溶菌液に、等量のフエノール /クロロフオルム溶液を添カ卩し、室温で 10分間ゆるやかに振盪した後、全量を遠心 分離（5, OOO X g、 20分間、 10— 12°C)し、上清画分を分取し、酢酸ナトリウムを 0. 3Mとなるように添加した後、 2倍量のエタノールを加え混合した。遠心分離（15， 00 O X g、 2分）により回収した沈殿物を 70%エタノールで洗浄した後、風乾した。得られ た DNAに 10mMトリス緩衝液（ρΗ7· 5) _lmM EDTA' 2Na溶液 5mLを加え、 4 °Cでー晚静置し、以後の PCRの铸型 DNAに使用した。
[0046] (B) PCRによる SacB遺伝子の増幅およびクローニング
枯草菌 SacB遺伝子の取得は、上記 (A)で調製した DNAを铸型とし、既に報告され ている該遺伝子の塩基配歹 1J (GenBank Database Accession No. X02730) を基に設計した合成 DNA (配列番号 1および配列番号 2)を用いた PCRによって行 つた。
反応液組成：铸型 DNA1 L、 PfxDNAポリメラーゼ（インビトロジェン社製） 0· 2 μ L、 1倍濃度添付バッファー、 0. 3 μ Μ各々プライマー、 lmM MgSO、 0. 25 μ
MdNTPsを混合し、全量を 20 μしとした。
反応温度条件： DNAサーマルサイクラ一 PTC—200 (MJResearch社製）を用い 、 94°Cで 20秒、 68°Cで 2分からなるサイクルを 35回繰り返した。但し、 1サイクノレ目 の 94°Cでの保温は 1分 20秒、最終サイクルの 68°Cでの保温は 5分とした。
[0047] 増幅産物の確認は、 0. 75%ァガロース（SeaKem GTG agarose： FMCBioPro ducts製)ゲル電気泳動により分離後、臭化工チジゥム染色により可視化することによ り行レ、、約 2kbの断片を検出した。ゲルからの目的 DNA断片の回収は、 QIAQuick Gel Extraction Kit (QIAGEN製）を用いて行った。
回収した DNA断片は、 T4ポリヌクレオチドキナーゼ（T4 Polynucleotide Kinas e :宝酒造製）により 5'末端をリン酸化した後、ライゲーシヨンキット ver. 2 (宝酒造製） を用いて大腸菌ベクター（pBluescriptll : STRATEGENE製）の EcoRV部位に結 合し、得られたプラスミド DNAで大腸菌（DH5ひ株）を形質転換した。この様にして 得られた組換え大腸菌を 50 μ g/mLアンピシリンおよび 50 μ g/mLX- Galを含む L B寒天培地 [トリプトン 10g、イーストエキストラタト 5g、 NaCl 5g及び寒天 15gを蒸留 水 1Lに溶解]に塗抹した。
この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、次に 50 μ g/mLアンピシリン および 10%ショ糖を含む LB寒天培地に移し 37°C24時間培養した。これらのクロー ンのうち、ショ糖を含む培地で生育できなかったものについて、常法により液体培養し た後、プラスミド DNAを精製した。 SacB遺伝子が大腸菌内で機能的に発現する株 は、ショ糖含有培地にて生育不能となるはずである。得られたプラスミド DNAを制限 酵素 Sailおよび Pstlで切断することにより、約 2kbの挿入断片が認められ、該プラスミ ドを pBS/SacBと命名した。
[0048] (C)クロラムフエ二コール耐性 SacBベクターの構築
大腸菌プラスミドベクター pHSG396 (宝酒造：クロラムフエ二コール耐性マーカー） 500ngに制限酵素 PshBIl Ounitsを 37°Cで一時間反応させた後、フエノール/クロ ロフオルム抽出およびエタノール沈殿により回収した。これを、タレノウフラグメント（K1 enow Fragment :宝酒造製）により両末端を平滑化した後、ライゲーシヨンキット ver . 2 (宝酒造製）を用いて Mlulリンカ一（宝酒造)を連結、環状化させ、大腸菌 (DH5 a株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を 34 μ g/mLクロラムフ ェニコールを含む LB寒天培地に塗抹した。得られたクローンから常法によりプラスミ ド DNAを調製し、制限酵素 Mlulの切断部位を有するクローンを選抜し、 pHSG396 Mluと命名した。
[0049] 一方、上記（B)にて構築した pBS/SacBを制限酵素 Sailおよび Pstlで切断した後 、タレノウフラグメントにて末端を平滑化した。これにライゲーシヨンキット ver. 2 (宝酒 造製）を用いて Mlulリンカ一を連結したのち、 0. 75%ァガロースゲル電気泳動によ り SacB遺伝子を含む約 2. Okbの DNA断片を分離、回収した。この SacB遺伝子断 片を、制限酵素 Mlul切断後、アルカリフォスファターゼ（Alkaline Phosphatase Calf intestine：宝酒造）にて末端を脱リン酸化した pHSG396Mlu断片とライゲー シヨンキット ver. 2 (宝酒造製）を用いて連結させ、大腸菌（DH5ひ株）を形質転換し た。この様にして得られた組換え大腸菌を 34 μ g/mLクロラムフエ二コールを含む L B寒天培地に塗抹した。
こうして得られたコロニーを、次に 34 g/mLクロラムフエニコールおよび 10%ショ 糖を含む LB寒天培地に移し 37°C24時間培養した。これらのクローンのうち、ショ糖 を含む培地で生育できなかったものについて、常法によりプラスミド DNAを精製した 。こうして得られたプラスミド DNAを Mlul切断により解析した結果、約 2. Okbの揷入 断片を持つことが確認され、これを pCMB lと命名した。
[0050] (D)カナマイシン耐性遺伝子の取得
カナマイシン耐性遺伝子の取得は、大腸菌プラスミドベクター PHSG299 (宝酒造： カナマイシン耐性マーカー）の DNAを铸型とし、配列番号 3および配列番号 4で示し た合成 DNAをプライマーとした PCR法によって行った。反応液組成：铸型 DNAlng 、 PyrobestDNAポリメラーゼ（宝酒造） 0. 1 μ L、 1倍濃度添付バッファー、 0· 5 μ Μ各々プライマー、 0. 25 μ MdNTPsを混合し、全量を 20 μしとした。
[0051] 反応温度条件： DNAサーマルサイクラ一 PTC_200 (MJResearch社製）を用い 、 940Cで 20禾少、 620Cで 15禾少、 720Cで 1分 20禾少力らなるサイクノレを 20回繰り返した。 但し、 1サイクル目の 94°Cでの保温は 1分 20秒、最終サイクルの 72°Cでの保温は 5 分とした。
[0052] 増幅産物の確認は、 0. 75%ァガロース（SeaKem GTG agarose： FMCBioPro ducts製)ゲル電気泳動により分離後、臭化工チジゥム染色により可視化することによ り行レ、、約 1. lkbの断片を検出した。ゲルからの目的 DNA断片の回収は、 QIAQui ck Gel Extraction Kit (QIAGEN製）を用いて行った。回収した DNA断片は、 T4 ポリヌクレオチドキナーゼ（T4 Polynucleotide Kinase :宝酒造製）により 5'末端を リン酸化した。 [0053] (E)カナマイシン耐性 SacBベクターの構築
上記（C)で構築した pCMB lを制限酵素 Van91 Iおよび Sealで切断して得られた 約 3. 5kbの DNA断片を 0. 75%ァガロースゲル電気泳動により分離、回収した。こ れを上記（D)で調製したカナマイシン耐性遺伝子と混合し、ライゲーシヨンキット ver. 2 (宝酒造製）を用いて連結し、得られたプラスミド DNAで大腸菌（DH5 a株）を形質 転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を 50 μ g/mLカナマイシンを含む L B寒天培地に塗抹した。
このカナマイシン含有培地上で生育した株は、ショ糖含有培地にて生育不能である ことが確認された。また、同株から調製したプラスミド DNAは、制限酵素 Hindlll消化 により 354、 473、 1807、 1997bpの断片を生じたこと力ら、図 1に示した構造に間違 レ、がなレ、と判断し、該プラスミドを pKMB lと命名した。
実施例 2
[0054] < LDH遺伝子破壊株の作製 >
(A)ブレビバタテリゥム 'フラバム MJ233—ES株ゲノム DNAの抽出
A培地 [尿素 2g、 (NH ) SO 7g、 KH PO 0. 5g、 K HPO 0. 5g、 MgSO - 7
4 2 4 2 4 2 4 4
H〇 0. 5g、 FeSO - 7H O 6mg、 MnSO - 4-5H〇6mg、ピオチン 200 μ g、チ
2 4 2 4 2
ァミン 100 μ g、イーストエキストラタト lg、カザミノ酸 lg、グノレコース 20g、蒸留水 1 Uこ溶解] 10mLに、ブレビバタテリゥム 'フラバム MJ— 233株を対数増殖期後期まで 培養し、得られた菌体を上記実施例 1の (A)に示す方法にてゲノム DNAを調製した
[0055] (B)ラタテートデヒドロゲナーゼ遺伝子のクローニング
MJ233株ラタテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の取得は、上記 (A)で調製した DNA を錡型とし、特開平 1 1—206385に記載の該遺伝子の塩基配列を基に設計した合 成 DNA (配列番号 5および配列番号 6)を用いた PCRによって行った。反応液組成： 铸型 DNA1 μ L、 TaqDNAポリメラーゼ（宝酒造） 0. 2 μ L、 1倍濃度添付バッファ 一、 0. 2 μ Μ各々プライマー、 0. 25 μ MdNTPsを混合し、全量を 20 μしとした。
[0056] 反応温度条件： DNAサーマルサイクラ一 PTC_200 (MJResearch社製）を用い 、 94°Cで 20秒、 55°Cで 20秒、 72°Cで 1分力らなるサイクルを 30回繰り返した。但し 、 1サイクル目の 94°Cでの保温は 1分 20秒、最終サイクルの 72°Cでの保温は 5分とし
[0057] 増幅産物の確認は、 0. 75 %ァガロース（SeaKem GTG agarose： FMCBioPro ducts製)ゲル電気泳動により分離後、臭化工チジゥム染色により可視化することによ り行レ、、約 0. 95kbの断片を検出した。ゲルからの目的 DNA断片の回収は、 QIAQ uick Gel Extraction Kit (QIAGEN製）を用いて行った。
[0058] 回収した DNA断片を、 PCR産物クローニングベクター pGEM_TEasy (Promega 製）と混合し、ライゲーシヨンキット ver. 2 (宝酒造製）を用いて連結後、得られたブラ スミド DNAで大腸菌（DH5 a株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸 菌を 50 μ gZmLアンピシリンおよび 50 μ g/mLX-Galを含む LB寒天培地に塗抹し た。
この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、常法により液体培養した後、プ ラスミド DNAを精製した。得られたプラスミド DNAを制限酵素 Sadおよび Sphlで切 断することにより、約 1 . Okbの挿入断片が認められ、これを pGEMT/CgLDHと命
■^5し/
[0059] (C)ラタテートデヒドロゲナーゼ遺伝子破壊用プラスミドの構築
上記（B)で作製した pGEMT/CgLDHを制限酵素 EcoRVおよび Xbalで切断す ることにより約 0 · 25kbからなるラタテートデヒドロゲナーゼのコーディング領域を切り 出した。残った約 3. 7kbの DNA断片の末端をタレノウフラグメントにて平滑化し、ライ ゲーシヨンキット ver. 2 (宝酒造製）を用いて環状化させ、大腸菌 (DH5ひ株）を形質 転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を 50 /i g/mLアンピシリンを含む LB 寒天培地に塗抹した。
この培地上で生育した株を、常法により液体培養した後、プラスミド DNAを精製し た。得られたプラスミド DNAを制限酵素 Sadおよび Sphlで切断することにより、約 0. 75kbの揷入断片が認められたクローンを選抜し、これを pGEMT/ A LDHと命名し た。
[0060] 次に、上記 pGEMT/ A LDHを制限酵素 Sadおよび Sphlにて切断して生じる約 0. 75kbの DNA断片を、 0. 75 %ァガロースゲル電気泳動により分離、回収し、欠損 領域を含むラタテートデヒドロゲナーゼ遺伝子断片を調製した。この DNA断片を、制 限酵素 Sadおよび Sphlにて切断した実施例 1にて構築した pKMBlと混合し、ライ ゲーシヨンキット ver. 2 (宝酒造製）を用いて連結後、得られたプラスミド DNAで大腸 菌（DH5 α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を 50 μ g/mL カナマイシンおよび 50 μ g/mLX_Galを含む LB寒天培地に塗抹した。
この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、常法により液体培養した後、プ ラスミド DNAを精製した。得られたプラスミド DNAを制限酵素 Sadおよび Sphlで切 断することにより、約 0. 75kbの揷入断片が認められたものを選抜し、これを pKMBl / A LDHと命名した（図 2)。
[0061] (D)ブレビバタテリゥム 'フラバム MJ233—ES株由来ラタテートデヒドロゲナーゼ遺伝 子破壊株の作製
ブレビバタテリゥム 'フラバム MJ— 233株の形質転換に用いるプラスミド DNAは、 p KMBl/ A LDHを用いて塩化カルシウム法 loumal of Molecular Biology, 53, 159, 1970)により形質転換した大腸菌 JM110株から調製した。
[0062] ブレビバタテリゥム 'フラバム MJ— 233株（FERM BP— 1497)は、常法（Wolf H et al., J. Bacteriol. 1983， 156(3) 1165-1170、 Kurusu Y et al" Agric Biol Chem. 1990， 54(2) 443-7)に従って内在性プラスミドを除去（キュアリング）し、得られたプラスミドキ ユアリング株ブレビバタテリゥム 'フラバム MJ233— ES株を以後の形質転換に用いた ブレビバタテリゥム 'フラバム MJ233-ES株の形質転換は、電気パルス法（ Res.Microbiol., Vol.144, p.181-185, 1993)によって行い、得られた形質転換体を力 ナマイシン 50 §/111しを含む1^0寒天培地[トリプトン10§、イーストエキストラタト 5 g、 NaCl 5g、グルコース 20g、及び寒天 15gを蒸留水 1Lに溶解]に塗抹した。 この培地上に生育した株は、 pKMBl/ A LDHがブレビバタテリゥム 'フラバム MJ 233— ES株菌体内で複製不可能なプラスミドであるため、該プラスミドのラタテートデ ヒドロゲナーゼ遺伝子とブレビバタテリゥム.フラバム MJ—233株ゲノム上の同遺伝子 との間で相同組み換えを起こした結果、同ゲノム上に該プラスミドに由来するカナマ 耐性遺伝子および SacB遺伝子が揷入されているはずである。 [0063] 次に、上記相同組み換え株をカナマイシン 50 μ g/mLを含む LBG培地にて液体 培養した。この培養液の菌体数約 100万相当分を 10%ショ糖含有 LBG培地に塗抹 にした。結果、 2回目の相同組み換えにより SacB遺伝子が脱落しショ糖非感受性と なったと考えられる株約 10個得た。
この様にして得られた株の中には、そのラタテートデヒドロゲナーゼ遺伝子が pKM BlZ A LDHに由来する変異型に置き換わったものと野生型に戻ったものが含まれ る。ラタテートデヒドロゲナーゼ遺伝子が変異型であるか野生型であるかの確認は、 L BG培地にて液体培養して得られた菌体を直接 PCR反応に供し、ラタテートデヒドロ ゲナーゼ遺伝子の検出を行うことによって容易に確認できる。ラタテートデヒドロゲナ ーゼ遺伝子を PCR増幅するためのプライマー（配列番号 7および配列番号 8)を用い て分析すると、野生型では 720bp、欠失領域を持つ変異型では 471bpの DNA断片 を認めるはずである。
上記方法にてショ糖非感受性となった菌株を分析した結果、変異型遺伝子のみを 有する株を選抜し、該株をブレビバタテリゥム 'フラバム MJ233/ A LDHと命名した
[0064] (E)ラタテートデヒドロゲナーゼ活性の確認
上記（D)で作製したブレビバタテリゥム 'フラバム MJ233/ Δ LDH株を A培地に植 菌し、 30°Cで 15時間好気的に振とう培養した。得られた培養物を遠心分離（3, 000 X g、 4°C、 20分間）して菌体を回収後、ナトリウム-リン酸緩衝液 [組成： 50mMリン酸 ナトリウム緩衝液 (PH7.3)]で洗浄した。
[0065] 次いで、洗浄菌体 0. 5g (湿重量）を上記ナトリウム-リン酸緩衝液 2mLに懸濁し、 氷冷下で超音波破砕器 (ブランソン社製）にかけ菌体破砕物を得た。該破砕物を遠 心分離（10, OOO X g, 4°C， 30分間）し、上清を粗酵素液として得た。対照として、ブ レビバタテリゥム 'フラバム MJ233-ES株の粗酵素液を同様に調製し、以下の活性 測定に供した。
[0066] ラタテートデヒドロゲナーゼ酵素活性の確認は、両粗酵素液について、ピルビン酸 を基質とした乳酸の生成に伴い、補酵素 NADHが NAD+に酸化されるのを、 340η mの吸光度変化として測定した [し Kanarek and R丄. Hill, J. Biol. Chem.239, 4202 (1964)]。反応は、 50mMカリウム一リン酸緩衝液 (pH7.2)、 10mMピルビン酸、 0. 4 mMNADH存在下、 37°Cにて行った。その結果、ブレビバタテリゥム 'フラバム MJ2 33— ES株から調製された粗酵素液におけるラタテートデヒドロゲナーゼ活性に対し、 ブレビバタテリゥム 'フラバム MJ233/ A LDH株から調製された粗酵素液におけるラ クテートデヒドロゲナーゼ活性は、 10分の 1以下であった。
実施例 3
[0067] <コリネ型細菌発現ベクターの構築 >
(A)コリネ型細菌用プロモーター断片の調製
コリネ型細菌で強力なプロモーター活性を有することが報告された特開平 7— 9589 1の配列番号 4に記載の DNA断片（以降 TZ4プロモーターと称する）を利用すること とした。本プロモーター断片の取得は、実施例 2の (A)で調製したブレビバタテリゥム •フラバム MJ233ゲノム DNAを铸型とし、特開平 7—95891の配列番号 4に記載の 配列を基に設計した合成 DNA (配列番号 9および配列番号 10)を用いた PCRによ つて行った。
[0068] 反応液組成：铸型 DNA1 μ L、 PfxDNAポリメラーゼ（インビトロジェン社製） 0· 2 μ L、 1倍濃度添付バッファー、 0. 3 μ Μ各々プライマー、 ImM MgSO、 0. 25 μ
MdNTPsを混合し、全量を 20 μしとした。
[0069] 反応温度条件： DNAサーマルサイクラ一 PTC_200 (MJResearch社製）を用い 、 94。Cで 20禾少、 60。Cで 20禾少、 72。Cで 30禾少力、らなるサイクノレを 35回,操り返した。但 し、 1サイクノレ目の 94°Cでの保温は 1分 20秒、最終サイクルの 72°Cでの保温は 2分と した。
[0070] 増幅産物の確認は、 2. 0%ァガロース（SeaKem GTG agarose： FMCBioProd ucts製)ゲル電気泳動により分離後、臭化工チジゥム染色により可視化することにより 行レ、、約 0. 25kbの断片を検出した。ゲルからの目的 DNA断片の回収は、 QIAQui ck Gel Extraction Kit (QIAGEN製）を用いて行った。
[0071] 回収した DNA断片は、 T4ポリヌクレオチドキナーゼ（T4 Polynucleotide Kinas e :宝酒造製）により 5'末端をリン酸化した後、ライゲーシヨンキット ver. 2 (宝酒造製） を用いて大腸菌ベクター PUC19 (宝酒造）の Smal部位に結合し、得られたプラスミド DNAで大腸菌（DH5 a株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を 50 μ g/mLアンピシリンおよび 50 μ g/mLX-Galを含む LB寒天培地に塗抹した。 この培地上で白色のコロニーを形成した 6クローンについて、常法により液体培養し た後、プラスミド DNAを精製し、塩基配列を決定した。これ中で TZ4プロモーターが PUC 19の lacプロモーターと逆方向に転写活性を有するように揷入されたクローンを 選抜し、これを PUC/TZ4と命名した。
[0072] 次に、 pUC/TZ4を制限酵素 BamHIおよび Pstlで切断して調製した DNA断片 に、 5 '末端がリン酸化された合成 DNA (配列番号 1 1および配列番号 12)から成り、 両末端にそれぞれ BamHIと Pstlに対する粘着末端を有する DNAリンカ一を混合し 、ライゲーシヨンキット ver. 2 (宝酒造製）を用いて連結後、得られたプラスミド DNAで 大腸菌（DH5 α株）を形質転換した。本 DNAリンカ一には、リボソーム結合配列 (Α GGAGG)およびその下流に配したクローニングサイト（上流から順に、 Pacl、 NotI、 Apal)が含まれている。
この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、常法により液体培養した後、プ ラスミド DNAを精製した。得られたプラスミド DNAの中から制限酵素 Notlによって切 断されるものを選抜し、これを PUC/TZ4— SDと命名した。
この様にして構築した PUC/TZ4— SDを制限酵素 Pstlで切断後、タレノウフラグメ ントにて末端を平滑化し、次いで制限酵素 Kpnlで切断することにより生じた約 0. 3k bのプロモーター断片を、 2. 0%ァガロースゲル電気泳動により分離、回収した。
[0073] (B)コリネ型細菌発現ベクターの構築
コリネ型細菌にて安定的に自立複製可能なプラスミドとして、特開平 12-93183記 載の pHSG298par_repを利用する。本プラスミドは、ブレビバタテリゥム 'スタチォ二 ス IF012144株が保有する天然型プラスミド pBY503の複製領域および安定化機 能を有する領域と大腸菌ベクター PHSG298 (宝酒造）に由来するカナマイシン耐性 遺伝子および大腸菌の複製領域を備える。 pHSG298par~repを制限酵素 Sselで 切断後、タレノウフラグメントにて末端を平滑化し、次いで制限酵素 Kpnlで切断する ことによって調製した DNAを、上記 (A)で調製した TZ4プロモーター断片と混合し、 ライゲーシヨンキット ver. 2 (宝酒造製）を用いて連結後、得られたプラスミド DNAで 大腸菌（DH5 a株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を 50 μ g /mLカナマイシンを含む LB寒天培地に塗抹した。
この培地上で生育した株を、常法により液体培養した後、プラスミド DNAを精製し た。得られたプラスミド DNAの中から制限酵素 Notlによって切断されるものを選抜し 、該プラスミドを PTZ4と命名した（図 3に構築手順を示した)。
実施例 4
[0074] <ピルべ一トカルボキシラーゼ活性増強株の作製 >
(Α)ピルべ一トカルボキシラーゼ遺伝子の取得
ブレビバタテリゥム 'フラバム MJ233株由来ピルべ一トカルボキシラーゼ遺伝子の取 得は、く実施例 2 >の (Α)で調製した DNAを铸型とし、全ゲノム配列が報告されて レ、るコリネバタテリゥム.グルタミカム ATCC13032株の該遺伝子の配歹 lJ (GenBan k Database Accession No. AP005276)を基に設計した合成 DNA (配列番 号 13および配列番号 14)を用いた PCRによって行った。反応液組成:铸型 DNA1 /i L、 PfxDNAポリメラーゼ（インビトロジェン社製） 0. 2 レ 1倍濃度添付バッファ 一、 0. 3 μ Μ各々プライマー、 ImM MgSO、 0. 25 /i MdNTPsを混合し、全量を
4
20 μしとした。反応温度条件： DNAサーマルサイクラ一 PTC—200 (MJResearch 社製）を用い、 94°Cで 20秒、 68°Cで 4分からなるサイクルを 35回繰り返した。但し、 1 サイクル目の 94°Cでの保温は 1分 20秒、最終サイクルの 68°Cでの保温は 10分とし た。 PCR反応終了後、 Takara Ex Taq (宝酒造）を 0. 1 μ L加え、さらに 72°Cで 3 0分保温した。
[0075] 増幅産物の確認は、 0. 75%ァガロース（SeaKem GTG agarose： FMCBioPro ducts製)ゲル電気泳動により分離後、臭化工チジゥム染色により可視化することによ り行レ、、約 3. 7kbの断片を検出した。ゲルからの目的 DNA断片の回収は、 QIAQui ck Gel Extraction Kit (QIAGEN製）を用いて行った。
[0076] 回収した DNA断片を、 PCR産物クローニングベクター pGEM— TEasy (Promega 製）と混合し、ライゲーシヨンキット ver. 2 (宝酒造製)を用いて連結後、得られたブラ スミド DNAで大腸菌（DH5 a株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸 菌を 50 β g/mLアンピシリンおよび 50 μ g/mLX-Galを含む LB寒天培地に塗抹し た。
この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、常法により液体培養した後、プ ラスミド DNAを精製した。得られたプラスミド DNAを制限酵素 Paclおよび Apalで切 断することにより、約 3. 7kbの揷入断片が認められ、これを pGEM/MJPCと命名し た。
[0077] pGEMZMJPCの揷入断片の塩基配列は、アプライドバイオシステム社製塩基配 列解読装置（モデル 377XL)およびビックダイターミネータ一サイクルシークェンスキ ット ver3を用いて決定した。その結果得られた DNA塩基配列および推測されるアミ ノ酸配列を配列番号 15に記載する。本アミノ酸配列はコリネバタテリゥム 'グノレタミ力 ム ATCC13032株由来のそれと極めて高い相同性（99. 4%)を示すことから、 pGE M/MJPCの揷入断片がブレビバタテリゥム 'フラバム MJ233株由来のピルべートカ ルボキシラーゼ遺伝子であると断定した。
[0078] (B)ピルべ一トカルボキシラーゼ活性増強用プラスミドの構築
上記 (A)で作製した pGEM/MJPCを制限酵素 Paclおよび Apalで切断すること により生じる約 3. 7kbからなるピルべ一トカルボキシラーゼ遺伝子断片を、 0. 75% ァガロースゲル電気泳動により分離、回収した。
[0079] この DNA断片を、制限酵素 Paclおよび Apalにて切断したく実施例 3 >にて構築 した PTZ4と混合し、ライゲーシヨンキット ver. 2 (宝酒造製）を用いて連結後、得られ たプラスミド DNAで大腸菌（DH5 a株）を形質転換した。この様にして得られた組換 え大腸菌を 50 μ g/mLカナマイシンを含む LB寒天培地に塗抹した。
この培地上で生育した株を、常法により液体培養した後、プラスミド DNAを精製し た。得られたプラスミド DNAを制限酵素 Paclおよび Apalで切断することにより、約 3 . 7kbの揷入断片が認められたものを選抜し、これを pMJPClと命名した（図 4)。
[0080] (C)ブレビバタテリゥム.フラバム MJ233Z A LDH株への形質転換
ブレビバタテリゥム 'フラバム MJ233株内で複製可能な pMJPClによる形質転換用 のプラスミド DNAは、上記（B)で形質転換した大腸菌（DH5 a株）から調製した。
[0081] ブレビバタテリゥム 'フラバム MJ233Z A LDH株への形質転換は、電気パルス法（ Res. Microbiol. , Vol.144, p.181- 185, 1993)によって行い、得られた形質転換体 をカナマイシン 50 μ g/mLを含む LBG寒天培地 [トリプトン 10g、イーストエキストラ タト 5g、 NaCl 5g、グルコース 20g、及び寒天 15gを蒸留水 1Lに溶解]に塗抹した。 この培地上に生育した株から、常法により液体培養した後、プラスミド DNAを抽出、 制限酵素切断による解析を行った結果、同株が pMJPClを保持していることを確認 し、該株をブレビバタテリゥム ·フラバム MJ233/PC/ Δ LDH株と命名した。
[0082] (D)ピルべ一トカルボキシラーゼ酵素活性
上記（C)で得られた形質転換株ブレビバタテリゥム 'フラバム MJ233ZPCZ Δ LD H株をグルコース 2%、カナマイシン 25mg/Lを含む A培地 100mlで終夜培養を行つ た。得られた菌体を集菌後、 50mM リン酸カリウム緩衝液 (pH7.5) 50mlで洗浄し、 同組成の緩衝液 20mlに再度懸濁させた。懸濁液にを SONIFIER 350 (BRANS〇 N製)で破砕し、遠心分離した上清を無細胞抽出液とした。得られた無細胞抽出液を 用いピルべ一トカルボキシラーゼ活性を測定した。酵素活性の測定は lOOmM Tris/HCl緩衝液（pH7.5)、 O. lmg/lOmlピオチン、 5mM塩化マグネシウム、 50mM炭 酸水素ナトリウム、 5mMピルビン酸ナトリウム、 5mMアデノシン 3リン酸ナトリウム、 0.32 mM NADH、 20units/1.5mlリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（WAKO製、酵母由来）及 び酵素を含む反応液中で 25°Cで反応させることにより行った。 1Uは 1分間に 1 μ mol の NADHの減少を触媒する酵素量とした。ピルべ一トカルボキシラーゼを発現させた 無細胞抽出液における比活性は 0.2U/mg蛋白質であった。なお親株である MJ233/ △LDH株を A培地を用いて同様に培養した菌体では、本活性測定方法によりピル ベートカルボキシラーゼ活性は検出されなかった。
実施例 5
[0083] <大腸菌フマレートレダクターゼ遺伝子のクローニング>
(A)大腸菌 DNA抽出
LB培地 10mLに、大腸菌（Eschericia coli)JM109株を対数増殖期後期まで培 養し、得られた菌体を上記実施例 1の (A)に示す方法にてゲノム DNAを調製した。
[0084] (B)大腸菌フマレートレダクターゼ遺伝子のクローニング
大腸菌フマレートレダクターゼ遺伝子の取得は、上記 (A)で調製した DNAを铸型 とし、全ゲノム配列が報告されている大腸菌 K12-MG1655株の該遺伝子の配列（ GenBank Database Accession No. U00096)を基に設計した合成 DNA (配 列番号 17および配列番号 18)を用いた PCRによって行った。
[0085] 反応液組成：铸型 DNA1 μ L、 PfxDNAポリメラーゼ（インビトロジェン社製） 0· 2 μ L、 1倍濃度添付バッファー、 0. 3 μ Μ各々プライマー、 ImM MgSO
4、 0. 25 μ
MdNTPsを混合し、全量を 20 μしとした。
[0086] 反応温度条件： DNAサーマルサイクラ一 MJResearch社製 PTC—200を用レ、、 9 4°Cで 20秒、 68°Cで 4分からなるサイクルを 35回繰り返した。但し、 1サイクル目の 94 °Cでの保温は 1分 20秒、最終サイクルの 68°Cでの保温は 10分とした。 PCR反応終 了後、 Takara Ex Taq (宝酒造）を 0. 1 μ L加え、さらに 72°Cで 30分保温した。
[0087] 増幅産物の確認は、 0. 75%ァガロース（SeaKem GTG agarose： FMCBioPro ducts製)ゲル電気泳動により分離後、臭化工チジゥム染色により可視化することによ り行レ、、約 3. 8kbの断片を検出した。ゲルからの目的 DNA断片の回収は、 QIAQui ck Gel Extraction Kit (QIAGEN製）を用いて行った。
[0088] 回収した DNA断片を、 PCR産物クローニングベクター pT7Blue T— Vector (No vagen製）と混合し、ライゲーシヨンキット ver. 2 (宝酒造製）を用いて連結後、得られ たプラスミド DNAで大腸菌（DH5 a株）を形質転換した。この様にして得られた組換 え大腸菌を 50 β g/mLアンピシリンおよび 50 μ g/mLX-Galを含む LB寒天培地 に塗抹した。
この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、常法により液体培養した後、プ ラスミド DNAを精製した。得られたプラスミド DNAを制限酵素 Hindlllおよび Kpnlで 切断することにより、約 3. 9kbの挿入断片が認められ、これを pFRD6. 0と命名した。
[0089] pFRD6. 0の揷入断片の塩基配列は、アプライドバイオシステム社製塩基配列解 読装置（モデル 377XL)およびビッグダイターミネータ一サイクルシークェンスキット V er3を用いて決定した。その結果得られた DNA塩基配列および推測されるアミノ酸 配列を配列番号 19， 20— 23に記載する。
実施例 6
[0090] <ピルべ一トカルボキシラーゼおよびフマレートレダクターゼ活性増強株の作製 >
(A) pMJPC lの制限酵素部位改変 実施例 3にて構築した pMJPC 1を制限酵素 Kpnlにて完全に切断した後、アル力リ フォスファターゼ（Alkaline Phosphatase Calf intestine：宝酒造）を反応させて 5 '末端を脱リン酸化処理して調製した DNA断片に、 5 '末端がリン酸化された合成 DNA (配列番号 24および配列番号 25)力、ら成る DNAリンカ一を混合し、ライゲーシ ヨンキット ver. 2 (宝酒造製）を用いて連結後、得られたプラスミド DNAで大腸菌（DH 5ひ株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を 50 μ g/mLカナマ イシンを含む LB寒天培地に塗抹した。
この培地上で生育した株を、常法により液体培養した後、プラスミド DNAを精製し た。得られたプラスミド DNAから制限酵素 Ndelによって切断されるものを選抜し、こ れを pMJPC l . 1と命名した。
[0091] (B)ピルべ一トカルボキシラーゼおよびフマレートレダクターゼ活性増強用プラスミド の構築
実施例 5にて作製した pFRD6. 0を制限酵素 Hind IIIで切断後、タレノウフラグメント にて末端を平滑化し、次いで制限酵素 Kpnlで切断して生じた約 3. 9kbの DNA断 片を 0. 75%ァガロースゲル電気泳動により分離、回収した。この様にして調製した 大腸菌フマレートレダクターゼ遺伝子を含む断片を、上記 (A)で作製した pMJPC l . 1を制限酵素 Ndelで切断後、タレノウフラグメントにて末端を平滑化し、次いで制限 酵素 Kpnlで切断することによって調製した DNAと混合し、ライゲーシヨンキット ver. 2 (宝酒造製）を用いて連結後、得られたプラスミド DNAで大腸菌（DH5 a株）を形 質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を 50 / g/mLカナマイシンを含む LB寒天培地に塗抹した。
この培地上で生育した株を、常法により液体培養した後、プラスミド DNAを精製し た。得られたプラスミド DNAを制限酵素 Hind III消ィ匕により 505、 2132、 2675、 377 5、 4193bpの断片を生じたことから、図 5に示した構造に間違いがないと判断し、該 プラスミドを pFRPC l . 1と命名した。
[0092] (B)ブレビバタテリゥム.フラバム MJ233/ A LDH株の形質転換
pFRPC l . 1を用いたブレビバタテリゥム 'フラバム MJ233/ A LDH株の形質転換 は、実施例 4の（C)に記載の方法にて行レ、、プラスミド pFRPCl . 1を保持することが 確認された株を得、これをブレビバタテリゥム 'フラバム MJ233/FRD/PC/ A LD H株と命名した。
[0093] (C) FRD酵素活性測定
上記（B)で得られた形質転換株ブレビバタテリゥム 'フラバム MJ233/FRDZPC / A LDH株をグルコース 2%、カナマイシン 25mg/Lを含む A培地 100mlで終夜培 養を行った。得られた菌体を集菌後、 50mM リン酸カリウム緩衝液 (pH7.5) 50mlで 洗浄し、同組成の緩衝液 20mlに再度懸濁させた。懸濁液を SONIFIER 350 (BR ANSON製）で破砕し、遠心分離した上清を無細胞抽出液とした。得られた無細胞 抽出液を用いフマレートリダクターゼ活性を測定した。酵素活性の測定は 33mM Tris 塩酸緩衝液 (pH7.5)、 O. lmM EDTA、 20mMコハク酸 Na、 2mM K Fe(CN)及び酵素 を含む反応液中で 25°Cで反応させることにより行った。 1Uは 1分間に 2 μ molの Κ
Fe(CN)の減少を触媒する酵素量とした。プラスミド pFRPC 1.1を発現させた無細胞抽 出液におけるフマレートリダクターゼ比活性は 0.02U/mg-蛋白質であった。なお親株 である MJ233/ALDH株を A培地を用いて同様に培養した菌体では、比活性は 0.01 U/mg-蛋白質であつた。
実施例 7
[0094] <コリネ型細菌のコハク酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のクローニング>
ブレビバタテリゥム ·フラバム MJ233株のコハク酸デヒドロゲナーゼ（SDH)遺伝子（以 下、該遺伝子を sdhC、 sdhA、 sdhBとする）の取得は、既に公開されているコリネバクテ リウム 'グルタミカム ATCC13032 (GenBank Database Accession No.NC#003450)該 遺伝子の塩基配列を参考に設計した合成 DNAをプライマーとして PCRで取得した。 具体的には、ブレビバタテリゥム.フラバム MJ233の染色体 DNAを铸型とし、配列番号 26と 27の配列を有する合成 DNAをプライマーとして用いて、オペロンを形成する sdhC_sdhA_sdhBの各遺伝子を含む DNA断片（配列番号 28)を、 PCRにより取得した 。 PCR反応は、 KOD-PLUS- (東洋紡製)を用い、 94 °Cで 5分保温を 1サイクル行った 後、変性 94°C 15秒、会合 56°C 30秒、伸長 72°C 4分からなるサイクルを 25回繰り返し た。生成した PCR産物を常法により精製後 Smalで消化した。この DNA断片と、 pVK7 ( 特開平 10-215883)を Sailで消化後に DNAブランティング Kit (宝バイオ社製）で平 滑化した DNA断片を混合し、ライゲーシヨン Kit ver.2 (宝バイオ社製）で連結した。こ のプラスミドで、ェシエリヒア 'コリ JM109のコンビテントセル（宝バイオ社製）を形質転 換し、カナマイシン（以下、 Kmと略す） 25 /i g/mlを含む LB培地に塗布し、ー晚培養し た。その後、出現したコロニーを釣り上げ、単コロニーを分離し形質転換体を得た。得 られた形質転換体よりプラスミドを抽出し、 目的の PCR産物が揷入されていたものを pVKSDHと命名した。 pVKSDHの構築過程を図 6に示す。
実施例 8
<ピルべ一トカルボキシラーゼおよびコハク酸デヒドロゲナーゼ活性増強用プラスミド の構築 >
実施例 7で構築した pVKSDHを Xbalと Sse8387Iで消化することによって得られた sdhC、 sdhA、 sdhBの 3遺伝子を含む DNA断片と、 pHSG399(宝バイオ社製)を Xbalと Sse8387Iで消化した断片を混合し、 DNAライゲーシヨン Kit ver.2 (宝バイオ社製）で連 結した。この DNAでェシエリヒア'コリ JM109のコンビテントセル（宝バイオ社製）を形質 転換し、クロラムフエ二コール（以下、 Cmと略す） 25 μ g/ml、 X-Gal 50 μ g/ml、 IPTG ImMを含む LB培地に塗布し、ー晚培養した。その後、出現した白コロニーを釣り上 げ、単コロニーを分離し形質転換体を得た。得られた形質転換体よりプラスミドを抽 出し、 sdhC、 sdhA、 sdhBを含む DNA断片が揷入されていたものを pHSGSDHと命名し た（図 7)。
一方、実施例 6記載のェシエリヒア'コリ由来フマレートレダクターゼ遺伝子とブレビ バタテリゥム 'フラバム由来 pyc遺伝子が搭載されているプラスミドである pFRPCl. lを Kpnlと Ndelで消化することにより、ェシエリヒア'コリ由来フマレートレダクターゼ遺伝子 を除く残りの領域を 1断片として回収することが可能である。そこで pFRPCl.lを Kpnlと Ndelで消化した後に、平滑末端化し、フマレートレダクターゼ遺伝子を除いた残りの 部分 DNA断片を回収した。回収した DNA断片に、 pHSGSDHを Xbalと Sse8387Iで消 化することによって得られた sdhC、 sdhA、 sdhBを含む DNA断片を平滑末端化した後 に連結した。この DNAを用いて、ェシエリヒア'コリ JM109のコンビテントセル（宝バイオ 社製）を形質転換し、 Km25 / g/mlを含む LB培地に塗布し、一晩培養した。その後、 出現したコロニーを釣り上げ、単コロニーを分離し形質転換体を得た。得られた形質 転換体よりプラスミドを抽出し、 frdA、 frdB、 frdC、 frdD遺伝子が除去され、かつ sdhC 、 sdhA、 sdhBを含む DNA断片が挿入されていたものを pSDHPCと命名した（図 8)。 実施例 9
[0096] <ピルべ一トカルボキシラーゼおよびコハク酸デヒドロゲナーゼ増強株の構築 > 実施例 7および実施例 8で得られた pVKSDH、ならびに pSDHPCはコリネ型細菌の 細胞内で自律複製可能である。そこで本プラスミドでコリネ型細菌を形質転換し、形 質転換体を取得した。実施例 2で構築した MJ233/ Δ LDH株を電気パルス法を用い て pVKSDH、ならびに pSDHPCで形質転換し、カナマイシン 25 μ g/mlを含む CM-Dex 培地（グルコース 5g/L、ポリペプトン 10g/L、イーストエキストラタト 10g/L、 KH PO
2 4 lgん、 MgSO · 7Η O 0.4gん、 FeSO · 7Η Ο 0.01g/L、 MnSO · 7Η Ο 0.01g/L、尿素
4 2 4 2 4 2
3g/L、大豆加水分解物 1.2g/L、 ρΗ7·5(ΚΟΗ)、および寒天 15g/L)に塗布し、 31.5°C で約 24時間培養した。この培地上に生育した株は該プラスミドが導入されている株で ある。こうして得られた形質転換体をそれぞれ MJ233/SDH/ A LDH、
MJ233/SDH/PC/ A LDHとした。また、コントロール株作製のため、プラスミド pVK7、 ならびに実施例 4で構築したプラスミド pMJPClも上記方法を用いて MJ233/ Δ LDH株 に導入した。こうして得られた形質転換体をそれぞれ MJ233/ Δ LDH/pVK7、 MJ233/PC/ A LDHとした。
実施例 10
[0097] <菌体反応 (炭酸アンモニゥム中和、微好気反応） >
尿素： 4g、硫酸アンモニゥム： 14g、リン酸 1カリウム： 0· 5g、リン酸 2カリウム 0. 5g、 硫酸マグネシウム · 7水和物： 0. 5g、硫酸第一鉄 · 7水和物： 20mg、硫酸マンガン · 水和物： 20mg、 D—ビォチン： 200 /i g、塩酸チアミン： 200 μ g、酵母エキス： lg、力 ザミノ酸： lg、及び蒸留水： lOOOmLの培地 lOOmLを 500mLの三角フラスコにいれ 、 120°C、 20分加熱滅菌した。これを室温まで冷やし、あら力じめ滅菌した 50%グノレ コース水溶液を 4mL、無菌濾過した 5%カナマイシン水溶液を 50 / L添加し、実施 例 6 (B)で作製したブレビバタテリゥム 'フラバム MJ233/FRD/PC/ Δ LDH株を 接種して 24時間 30°Cにて種培養した。尿素： 12g、硫酸アンモニゥム： 42g、リン酸 1 カリウム： 1. 5g、リン酸 2カリウム 1. 5g、硫酸マグネシウム · 7水和物： 1. 5g、硫酸第 一鉄 · 7水和物： 60mg、硫酸マンガン '水和物： 60mg、 D—ピオチン： 600 μ g、塩酸 チアミン： 600 μ §、酵母エキス 3g、カザミノ酸 3g、消泡剤（アデ力ノール LG294 :旭 電化製）： lmL及び蒸留水： 2500mLの培地を 5Lの発酵糟に入れ、 120°C、 20分 加熱滅菌した。これを室温まで冷やした後、あらかじめ滅菌した 12%グルコース水溶 液を 500mL添加し、これに前述の種培養液を全量加えて、 30°Cに保温した。通気 は毎分 500mL、攪拌は毎分 500回転で本培養を行った。 12時間後にグルコースが ほぼ消費されていた。
[0098] 硫酸マグネシウム · 7水和物： 0. 2g、硫酸第一鉄 · 7水和物： 8mg、硫酸マンガン- 水和物： 8mg、 D_ピオチン： 80 μ g、塩酸チアミン： 80 μ g、消泡剤（アデ力ノール L G294：旭電化製）： 1ml及び蒸留水： 200mLの培地を 500mLの三角フラスコに入 れ、 120°C、 20分加熱滅菌した。室温まで冷やした後、上記の本培養により得られた 培養液を 8000rpm、 5分の遠心分離により集菌した菌体に添加して、 O. D. (660η m)が 60になるように再懸濁した。この懸濁液 200mLとあらかじめ滅菌した 20%ダル コース溶液 200mLを 1Lのジャーフアーメンターに入れて混合し、 35°Cに保温した。 pHは 2M炭酸アンモニゥムを用いて 7. 6に保ち、毎分 lOOmLで通気、毎分 400回 転で攪拌しながら反応を行った。
[0099] 反応開始後約 20時間でグルコースがほぼ消費されていた。糖消費速度は 5. 00g /L/hであり、コハク酸生産速度は 2. 66g/L/h、収率は 70. 1 %であった。一方 、実施例 4 (C)で作製したブレビバタテリゥム 'フラバム MJ233/PC/ A LDH株を 上記と同様にして反応させたとき、糖消費速度は 4. 74g/L/hであり、コハク酸生 産速度は 2. 13g/L/h、収率は 58. 7%であった。
実施例 11
[0100] <菌体反応 (炭酸アンモニゥム中和、嫌気反応） >
上記実施例 10と同様に反応用懸濁液を調製し、 pHを 2M炭酸アンモニゥムを用い て 7. 6に保ち、通気は行わず、毎分 200回転で攪拌しながら反応を行った。反応開 始後約 40時間でグノレコースがほぼ消費されていた。糖消費速度は 2. 50g/L/h であり、コハク酸生産速度は 1. 35g/L/h、収率は 78. 4%であった。一方、実施 例 4 (C)で作製したブレビバタテリゥム 'フラバム MJ233/PC/ Δ LDH株を上記と 同様にして反応させたとき、糖消費速度は 2. 38g/L/hであり、コハク酸生産速度 は 1. 21g/L/h、収率は 74. 4%であった。
実施例 12
[0101] <菌体反応 (炭酸ナトリウム中和、微好気反応） >
上記実施例 10と同様に反応用懸濁液を調製し、 pHを 2M炭酸ナトリウムを用いて 7. 6に保ち、同様に反応を行った。反応開始後約 28時間でグルコースがほぼ消費され ていた。糖消費速度は 3. 60g/L/hであり、コハク酸生産速度は 2. 27g/L/h、 収率は 82. 8%であった。一方、実施例 4 (C)で作製したブレビバタテリゥム 'フラバム MJ233/PC/ A LDH株を上記と同様にして反応させたとき、糖消費速度は 2. 97 g/L/hであり、コハク酸生産速度は 1. 97g/L/h、収率は 88. 0%であった。 実施例 13
[0102] <菌体反応 (炭酸ナトリウム中和、嫌気反応） >
上記実施例 10と同様に反応用懸濁液を調製し、 pHを 2M炭酸アンモニゥムを用い て 7. 6に保ち、通気は行わず、毎分 200回転で攪拌しながら反応を行った。反応開 始後約 32時間でグノレコースがほぼ消費されていた。糖消費速度は 3. 13g/L/h であり、コハク酸生産速度は 1. 80g/L/h,収率は 97. 1 %であった。一方、実施 例 4 (C)で作製したブレビバタテリゥム 'フラバム MJ233/PC/ Δ LDH株を上記と 同様にして反応させたとき、糖消費速度は 2. 70g/LZhであり、コハク酸生産速度 は 1 · 57g/L/h、収率は 88· 6%であった。
[0103] [表 1]
反応条件 分析項目 MJ233/PC/ DH MJ233 FRD/PC/ZILDH
Glc消費速度 (g/L/hr) 4.7 5.0 実施例 10:炭酸アンモ コハク酸生産速度 (g/L/hr) 2.1 2.7 ニァ中和、微好気反応 リンゴ酸蓄積 (g/L) 7.9 2.4
コハク酸収率 (％) 58.7 70.1
Glc消費速度 2.4 2.5 実施例 11：炭酸アンモ コハク酸生産比速度 1.2 1.4 ニァ中和、嫌気反応 リンゴ酸蓄積 2.9 0.6
コハク酸収率 74.4 78.4
Glc消费速度 3.0 3.6 実施例 12:炭酸ナトリ コハク酸生産比速度 2.0 2.3 ゥム中和、微好気反応 リンゴ酸蓄積 0.0 0.0
コハク酸収率 88.0 82.8
Glc消費速度 2.7 3.1 実施例 13:炭酸ナトリ コハク酸生産比速度 1.6 1.8 ゥム中和、嫌気反応 リンゴ酸蓄積 0.5 0.0
コハク酸収率 88.6 97.1 実施例 14
<菌体反応 (炭酸マグネシウム中和、嫌気培養） >
ブレビバタテリゥム.フラバム MJ233/ALDH/pVK7株及び MJ233/SDH/PC/ALDH を用いてコハク酸生産のための培養を以下のように行った。 CM-Dexプレート培地（力 ナマイシン 25 μ g/ml含有）にて培養して得た MJ233/ ALDH /pVK7株及び
MJ233/SDH/PC/ALDH株の菌体をシード培地 3ml(グルコース 10g/L、 (NH ) SO
4 2
2.5g /し、 KH PO 0.5g/L、 MgSO ·7Η〇 0.25g/L、尿素 2gん、 FeSO ·7Η〇 O.Olg/L
2 4 4 2 4 2
、 MnSO ·7Η O O.Olg/L,ピオチン 50 μ g/L、 VBl-HCl 100//g/L、プロトカテク酸
4 2
15mg /し、 CuSO 0.02mg/L、 CaCl 10mg/L、 pH7.0(K〇H))に接種し、好気条件にて
4 2
31.5°Cにて試験管で約 15時間振とう培養を行った。
その後、その試験管にメイン培地 3ml (グルコース 100g/L、 (NH ) SO 5g/L、 KH
4 2 4 2
PO 2g/L、尿素 3g/L、 FeSO -7H〇 0.01g/L、 MnSO -7H O O.Olg/L,ピオチン 200
4 4 2 4 2
zg/L、 VBl-HCl 200 μ g/L, MgCOs 71.4g /し、以上添加後最終濃度、 pH6.8(NaOH) )を添加し、通気を防ぐため、シリコン栓で密栓してコハク酸生産培養を行った。培養 は 31.5°Cで約 48時間振とうして培地中の糖がなくなる前に培養を終了した。
培養終了後、培養液中のコハク酸や副生酢酸の蓄積量は、培養液を適当に希釈し た後、液体クロマトグラフィーにより分析した。カラムは Shim-pack SCR-102H (Simazu )を二本直列接続したものを用レ、、サンプルは 5mM p-トルエンスルホン酸を用いて 40 °Cで溶出した。溶出液を 5mM p-トルエンスルホン酸および 100 μ M EDTAを含む 20mM Bis-Tris水溶液を用いて中和し、 CDD-lOAD(Simazu)にて電気伝導度を測定 することによりコハク酸や酢酸を測定した。このときの結果を表 2に示した。
MJ233/SDH/ Δ LDH株では、同宿主にベクタープラスミドを導入した MJ233/ Δ LDH/pVK7株に比べて、収率は約 4%の向上が認められた。また、リンゴ酸蓄積は 3.6g/L、フマル酸蓄積は 0.5g/L減少した。
[0105] [表 2] 表 2 . SDH增幅株のコハク酸、 リンゴ酸、 およびフマル酸生産
OD620
菌 消费 コハク収率 リンコ'酸 フマル酸
(x51希釈） (g/L) (%) (g/L) (g/L)
MJ233/A LDH/pVK7 0.258 66.1 55.8 6.4 1.6
MJ233/SDH/A LDH 0.370 82.1 60.2 2.8 1.1
[0106] (B) SDH、 PC同時増幅株の培養評価
ブレビバタテリゥム .フラバム MJ233/PC/ Δ LDH株及び MJ233/SDH/PC/ Δ LDH株 を用いてコハク酸生産のための培養を以下のように行った。 CM-Dexプレート培地に て培養して得た MJ233/PC/ Δ LDH株及び MJ233/SDH/PC/ Δ LDH株の菌体を A培 地（グルコース 20g/L、（NH ) S〇 14g/L、 KH P〇 0.5g/L、 K HPO 0.5g/L、 MgSO
•7H O 0.5g/L、尿素 4g/L、 FeSO - 7H O 0.02g/L、 MnSO - 7H O 0.02g/L、ピオチン
200 /i gん、 VBl ' HCl 200 μ §ん、カザミノ酸 lg/L、酵母エキス lg/L) 3mlに接種し、 好気条件にて 31.5°Cにて試験管で約 15時間振とう培養を行った。
その後、その試験管にメイン液（グルコース 200g/L、亜硫酸ナトリウム 30g/L、
MgCO 142.8g/L)3mlを添加し、通気を防ぐため、シリコン栓で密栓してコハク酸生産 培養を行った。培養は 31.5°Cで約 48時間振とうして培地中の糖がなくなる前に培養を 終了した。
[0107] 培養終了後、培養液中のコハク酸や副生酢酸の蓄積量は、培養液を適当に希釈し た後、液体クロマトグラフィーにより分析した。カラムは Shim-pack SCR-102H (Simazu )を二本直列接続したものを用レ、、サンプルは 5mM p -トルエンスルホン酸を用いて 40 °Cで溶出した。溶出液を 5mM p-トルエンスルホン酸および 100 μ M EDTAを含む 20mM Bis-Tris水溶液を用いて中和し、 CDD-lOAD(Simazu)にて電気伝導度を測定 することによりコハク酸や副生酢酸測定した。そのときの結果を表 3に示した。
[0108] [表 3] 表 3 . SDHと PCを組み合わせて増幅させた株のコハク酸、 リンゴ酸おょぴフマル酸生産
OD620 消 コハク収率 リンコ'酸 フマル酸 菌抹 (x51希釈） (g/L) (%) (g/u (g/L)
MJ233/PC/A LDH 0.521 94.3 60.6 6.5 0.8 J233/SDH/PC/A LDH 0.451 89.8 63.4 3.6 0.6
[0109] MJ233/SDH/PC/ Δ LDH株では PCのみの増強株である MJ233/PC/ Δ LDHに対し て コハク酸収率は約 3%向上し、リンゴ酸蓄積は 3.2g/レフマル酸蓄積は 0.2g/L減少 した。
この結果と上記 (A)の結果から、 SDH遺伝子の増幅がコハク酸収率の向上、およびコ ハク酸生産時のリンゴ酸およびフマル酸の副生量低減に有効であることが示された。 産業上の利用の可能性
[0110] 本発明の製造方法によれば、迅速かつ高効率でコハク酸を製造することができる。
得られたコハク酸は食品添加物や医薬品、化粧品等に用いることができる。また、得 られたコハク酸を原料として重合反応を行うことによりコハク酸含有ポリマーを製造す ることちでさる。

Claims

請求の範囲
[1] フマル酸リダクターゼ活性が増強するように改変された細菌または該細菌の処理物 を、炭酸イオンもしくは重炭酸イオンまたは二酸化炭素ガスを含有する反応液中で有 機原料に作用させることによってコハク酸を生成させ、該コハク酸を採取することを特 徴とするコハク酸の製造方法。
[2] 細菌が、コリネ型細菌、バチルス属細菌、又はリゾビゥム属細菌からなる群より選ばれ るレ、ずれかの細菌である、請求項 1に記載の方法。
[3] 上記細菌が、コリネ型細菌由来のコハク酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を用いることによ つてフマル酸リダクターゼ活性が増強するように改変された細菌である、請求項 1また は 2に記載の方法。
[4] 上記細菌が、大腸菌由来のフマル酸リダクターゼ遺伝子を用いることによってフマル 酸リダクターゼ活性が増強するように改変された細菌である、請求項 1または 2に記載 の方法。
[5] 前記細菌が、さらに、ラタテートデヒドロゲナーゼ活性力 S、非改変株に比べて 10%以 下に低減化するように改変された細菌である、請求項 1一 4のいずれか一項に記載 の方法。
[6] 前記細菌が、さらに、ピルビン酸カルボキシラーゼ活性が増強するように改変された 細菌であることを特徴とする、請求項 1一 5のいずれか一項に記載の方法。
[7] 有機原料を嫌気的雰囲気下で作用させることを特徴する請求項 1一 6のいずれか一 項に記載の方法。
[8] 有機原料が、グルコースである請求項 1一 7のいずれか一項に記載の方法。
[9] 請求項 1一 8のいずれか一項に記載の方法によりコハク酸を製造する工程、及び得ら れたコハク酸を重合させる工程を含む、コハク酸含有ポリマーの製造方法。
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