JPH11196888A - ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子組み換え菌体による有機酸の製造法 - Google Patents
ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子組み換え菌体による有機酸の製造法Info
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- JPH11196888A JPH11196888A JP10020361A JP2036198A JPH11196888A JP H11196888 A JPH11196888 A JP H11196888A JP 10020361 A JP10020361 A JP 10020361A JP 2036198 A JP2036198 A JP 2036198A JP H11196888 A JPH11196888 A JP H11196888A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 効率よく、かつ 高収率でコハク酸等の有機
酸を製造する方法を提供する。 【解決手段】 ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子で組
み換えた好気性コリネ型細菌あるいはその調製物を、炭
酸イオンもしくは重炭酸イオンまたは二酸化炭素ガスを
含有する反応液中で嫌気的に有機原料に作用させ、有機
酸を生成させることを特徴とする有機酸の製造方法。
酸を製造する方法を提供する。 【解決手段】 ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子で組
み換えた好気性コリネ型細菌あるいはその調製物を、炭
酸イオンもしくは重炭酸イオンまたは二酸化炭素ガスを
含有する反応液中で嫌気的に有機原料に作用させ、有機
酸を生成させることを特徴とする有機酸の製造方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ピルビン酸カルボ
キシラーゼ遺伝子で組み換えた好気性コリネ型細菌また
はその調製物を用いた有機酸の製造方法に関する。
キシラーゼ遺伝子で組み換えた好気性コリネ型細菌また
はその調製物を用いた有機酸の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ピルビン酸カルボキシラーゼ（以下これ
を「ＰＣ」と略称することがある）は、解糖系の代謝中
間化合物であるピルビン酸に二酸化炭素（重炭酸イオ
ン）を固定することによりオキザロ酢酸を生成し、トリ
カルボン酸（ＴＣＡ）サイクルに４炭素（Ｃ4）化合物
を補充する生理的役割を果たすとされている。
を「ＰＣ」と略称することがある）は、解糖系の代謝中
間化合物であるピルビン酸に二酸化炭素（重炭酸イオ
ン）を固定することによりオキザロ酢酸を生成し、トリ
カルボン酸（ＴＣＡ）サイクルに４炭素（Ｃ4）化合物
を補充する生理的役割を果たすとされている。
【０００３】ピルビン酸カルボキシラーゼは微生物、動
植物においてひろくその存在が確認されている。該酵素
をコードする遺伝子に関しては、ほ乳類に関し多数研究
されているものの、微生物に関しては、バチルス・ステ
アロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）
由来の遺伝子［GENE, 191, 47-50, (1997)参照］、Rhiz
obium etli由来の遺伝子［J.Bacteriol., 178, 5960-59
70, (1996)］、酵母サッカロマイセス・セレビシエ（Sa
ccharomyces serevisiae）由来の遺伝子[Mol.Gen.Gene
t.,229, 307-315, (1991)]、が単離され、その塩基配列
が決定されているのみである。
植物においてひろくその存在が確認されている。該酵素
をコードする遺伝子に関しては、ほ乳類に関し多数研究
されているものの、微生物に関しては、バチルス・ステ
アロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）
由来の遺伝子［GENE, 191, 47-50, (1997)参照］、Rhiz
obium etli由来の遺伝子［J.Bacteriol., 178, 5960-59
70, (1996)］、酵母サッカロマイセス・セレビシエ（Sa
ccharomyces serevisiae）由来の遺伝子[Mol.Gen.Gene
t.,229, 307-315, (1991)]、が単離され、その塩基配列
が決定されているのみである。
【０００４】ＴＣＡサイクルは、アミノ酸等各種有用物
質生合成系において重要な代謝経路である。該遺伝子を
利用することにより、ＴＣＡサイクルへの物質供給が強
化され、オキザロ酢酸から生合成されるアミノ酸（アス
パラギン酸、スレオニン等）の生産能の増強が期待され
ている。
質生合成系において重要な代謝経路である。該遺伝子を
利用することにより、ＴＣＡサイクルへの物質供給が強
化され、オキザロ酢酸から生合成されるアミノ酸（アス
パラギン酸、スレオニン等）の生産能の増強が期待され
ている。
【０００５】本発明者らが知る限り工業的観点からの利
用については、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラ
ーゼ遺伝子で組み換えた菌体を用いたオキザロ酢酸から
生合成されるアミノ酸（アスパラギン酸、スレオニン
等）製造法［特公平７−８３７１４，特開平９−１２１
８７２］の報告はあるが、ＰＣ組み換え菌株の利用につ
いては殆ど検討されていない。
用については、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラ
ーゼ遺伝子で組み換えた菌体を用いたオキザロ酢酸から
生合成されるアミノ酸（アスパラギン酸、スレオニン
等）製造法［特公平７−８３７１４，特開平９−１２１
８７２］の報告はあるが、ＰＣ組み換え菌株の利用につ
いては殆ど検討されていない。
【０００６】すなわち、ＰＣ遺伝子を増強した好気性コ
リネ型細菌を用いて、オキザロ酢酸からＴＣＡサイクル
を逆行してリンゴ酸、フマール酸、コハク酸等を生成さ
せる効率のよい製造方法は全く知られていなかった。
リネ型細菌を用いて、オキザロ酢酸からＴＣＡサイクル
を逆行してリンゴ酸、フマール酸、コハク酸等を生成さ
せる効率のよい製造方法は全く知られていなかった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】そのため、本発明の目
的は、ＰＣ遺伝子で組み換えた好気性コリネ型細菌を用
いてリンゴ酸、フマール酸、コハク酸等の有機酸の製造
方法を提供することである。
的は、ＰＣ遺伝子で組み換えた好気性コリネ型細菌を用
いてリンゴ酸、フマール酸、コハク酸等の有機酸の製造
方法を提供することである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】そこで、本発明者等は、
好気性コリネ型細菌を用いてこれらの有機酸を生産する
方法について検討したところ、好気性コリネ型細菌ある
いはその調製物を、炭酸イオンもしくは重炭酸イオン又
は二酸化炭素ガスを含有する反応液中で嫌気的的に有機
原料に作用させることにより、これら有機酸を効率よく
生産可能であることを見いだし、さらに好気性コリネ型
細菌をＰＣ遺伝子で組み換えることにより、ＰＣ活性を
増強し、ＣＯ２をピルビン酸に取り込ませる能力増強し
た菌体を用いることによりこれら有機酸の生産性が著し
く向上することを見いだし、本発明を完成した。
好気性コリネ型細菌を用いてこれらの有機酸を生産する
方法について検討したところ、好気性コリネ型細菌ある
いはその調製物を、炭酸イオンもしくは重炭酸イオン又
は二酸化炭素ガスを含有する反応液中で嫌気的的に有機
原料に作用させることにより、これら有機酸を効率よく
生産可能であることを見いだし、さらに好気性コリネ型
細菌をＰＣ遺伝子で組み換えることにより、ＰＣ活性を
増強し、ＣＯ２をピルビン酸に取り込ませる能力増強し
た菌体を用いることによりこれら有機酸の生産性が著し
く向上することを見いだし、本発明を完成した。
【０００９】即ち、本発明の要旨は、ピルビン酸カルボ
キシラーゼ遺伝子で組み換えた好気性コリネ型細菌ある
いはその調製物を、炭酸イオンもしくは重炭酸イオンま
たは二酸化炭素ガスを含有する反応液中で嫌気的に有機
原料に作用させ、有機酸を生成させることを特徴とする
有機酸の製造方法に関する。
キシラーゼ遺伝子で組み換えた好気性コリネ型細菌ある
いはその調製物を、炭酸イオンもしくは重炭酸イオンま
たは二酸化炭素ガスを含有する反応液中で嫌気的に有機
原料に作用させ、有機酸を生成させることを特徴とする
有機酸の製造方法に関する。
【００１０】上記方法において、反応液に炭酸イオンも
しくは重炭酸イオンまたは二酸化炭素ガスを含有させる
方法としては、炭酸もしくは重炭酸またはそれらの塩を
反応液に添加する方法、または反応液に二酸化炭素ガス
を供給する方法が挙げられる。
しくは重炭酸イオンまたは二酸化炭素ガスを含有させる
方法としては、炭酸もしくは重炭酸またはそれらの塩を
反応液に添加する方法、または反応液に二酸化炭素ガス
を供給する方法が挙げられる。
【００１１】上記ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子と
しては、微生物または動植物由来の遺伝子が挙げられ
る。上記ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子としては、
ヒト、マウス、ラット、酵母、又はコリネバクテリウム
属、バチルス属、リゾビウム属もしくはエシェリヒア属
に属する微生物由来の遺伝子が挙げられる。
しては、微生物または動植物由来の遺伝子が挙げられ
る。上記ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子としては、
ヒト、マウス、ラット、酵母、又はコリネバクテリウム
属、バチルス属、リゾビウム属もしくはエシェリヒア属
に属する微生物由来の遺伝子が挙げられる。
【００１２】上記好気性コリネ型細菌としては、ブレビ
バクテリウム・フラバム(Brevibacterium flavum) が挙
げられる。また、ブレビバクテリウム・フラバムとして
は、ブレビバクテリウム・フラバム MJ-233が挙げられ
る。以下、本発明を詳細に説明する。
バクテリウム・フラバム(Brevibacterium flavum) が挙
げられる。また、ブレビバクテリウム・フラバムとして
は、ブレビバクテリウム・フラバム MJ-233が挙げられ
る。以下、本発明を詳細に説明する。
【００１３】
【発明の実施の形態】本発明に使用されるＰＣ遺伝子
は、既にその塩基配列が決定されている遺伝子を、もし
くは、通常の方法によりＰＣ活性を有するタンパク質を
コードするＤＮＡ断片を微生物、動植物等の染色体より
単離し、塩基配列を決定したものを使用することができ
る。また、塩基配列が決定された後には、その配列にし
たがって合成した遺伝子を使用することもできる。
は、既にその塩基配列が決定されている遺伝子を、もし
くは、通常の方法によりＰＣ活性を有するタンパク質を
コードするＤＮＡ断片を微生物、動植物等の染色体より
単離し、塩基配列を決定したものを使用することができ
る。また、塩基配列が決定された後には、その配列にし
たがって合成した遺伝子を使用することもできる。
【００１４】本発明のＰＣ遺伝子を含むＤＮＡ断片は、
微生物、動植物由来の染色体上に存在している。これら
の供給源微生物、動植物からＰＣ遺伝子を調製するため
の基本操作を、配列が既知である、酵母サッカロマイセ
ス・セレビシエ由来のものを一例として述べれば次のと
おりである。
微生物、動植物由来の染色体上に存在している。これら
の供給源微生物、動植物からＰＣ遺伝子を調製するため
の基本操作を、配列が既知である、酵母サッカロマイセ
ス・セレビシエ由来のものを一例として述べれば次のと
おりである。
【００１５】ＰＣ遺伝子は、上記サッカロマイセス・セ
レビシエの染色体上に少なくとも２種類存在し、それら
の配列が既知であるため[Mol.Gen.Genet., 229, 307-31
5, (1991)]、ＰＣＲ法により、ＰＣ遺伝子を分離・取得
することができる。
レビシエの染色体上に少なくとも２種類存在し、それら
の配列が既知であるため[Mol.Gen.Genet., 229, 307-31
5, (1991)]、ＰＣＲ法により、ＰＣ遺伝子を分離・取得
することができる。
【００１６】例えば、ＰＣＲに用いるプライマーとし
て、配列番号１及び２に示す塩基配列を有するオリゴヌ
クレオチドを用いてサッカロマイセス・セレビシエ由来
の染色体を鋳型としてＰＣＲを行うと、３．５６ｋｂか
らなるＰＣ遺伝子（ＰＹＣ２）を増幅させることができ
る。
て、配列番号１及び２に示す塩基配列を有するオリゴヌ
クレオチドを用いてサッカロマイセス・セレビシエ由来
の染色体を鋳型としてＰＣＲを行うと、３．５６ｋｂか
らなるＰＣ遺伝子（ＰＹＣ２）を増幅させることができ
る。
【００１７】また、ＰＣＲに用いるプライマーとして、
配列番号９及び１０に示す塩基配列を有するオリゴヌク
レオチドを用いてサッカロマイセス・セレビシエ由来の
染色体を鋳型としてＰＣＲを行うと、３．５４ｋｂから
なるＰＣ遺伝子（ＰＹＣ１）を増幅させることができ
る。
配列番号９及び１０に示す塩基配列を有するオリゴヌク
レオチドを用いてサッカロマイセス・セレビシエ由来の
染色体を鋳型としてＰＣＲを行うと、３．５４ｋｂから
なるＰＣ遺伝子（ＰＹＣ１）を増幅させることができ
る。
【００１８】このとき、ＰＣＲに使用するプライマーの
５’末端に適当な制限酵素サイトを付加しておくことに
より、後述するベクターの適当な部位に連結させること
ができ、得られる組換えベクターを用いてコリネ型細菌
に導入することができる。
５’末端に適当な制限酵素サイトを付加しておくことに
より、後述するベクターの適当な部位に連結させること
ができ、得られる組換えベクターを用いてコリネ型細菌
に導入することができる。
【００１９】また、遺伝子配列が不明であっても、ＰＣ
活性を指標に蛋白質を精製し、そのＮ末アミノ酸配列、
部分分解配列より、通常用いられるハイブリダイゼーシ
ョンの手法により遺伝子断片を単離できる。また、ＰＣ
蛋白質間で保存されている領域のアミノ酸配列をもと
に、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ法により断片を取
得することが可能である。取得した断片は通常の手法に
よりそのＤＮＡ塩基配列を決定することができる。
活性を指標に蛋白質を精製し、そのＮ末アミノ酸配列、
部分分解配列より、通常用いられるハイブリダイゼーシ
ョンの手法により遺伝子断片を単離できる。また、ＰＣ
蛋白質間で保存されている領域のアミノ酸配列をもと
に、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ法により断片を取
得することが可能である。取得した断片は通常の手法に
よりそのＤＮＡ塩基配列を決定することができる。
【００２０】本明細書における「切断断片の大きさ」及
びプラスミドの大きさは、アガロースゲル電気泳動を用
いる場合には、エシェリヒア・コリのラムダ・ファージ
（λｐｈａｇｅ）のＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで
切断して得られる分子量既知のＤＮＡ断片の同一アガロ
ースゲル上での泳動距離で描かれる標準線に基づき、ま
た、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いる場合に
は、エシェリヒア・コリのファイ・エックス１７４ファ
ージ（φＸ１７４ ｐｈａｇｅ）のＤＮＡを制限酵素Ｈ
ａｅＩＩＩで切断して得られる分子量既知のＤＮＡ断片
の同一ポロアクリルアミドゲル上での泳動距離で描かれ
る標準線に基づき、切断ＤＮＡ断片またはプラスミドの
各ＤＮＡ断片の大きさを算出することができる。。尚、
各ＤＮＡ断片の大きさの決定において、１ｋｂ以上の断
片の大きさについては、１％アガロースゲル電気泳動に
よって得られる結果を採用し、約０．１ｋｂから１ｋｂ
未満の断片の大きさについては４％ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動によって得られる結果を採用した。
びプラスミドの大きさは、アガロースゲル電気泳動を用
いる場合には、エシェリヒア・コリのラムダ・ファージ
（λｐｈａｇｅ）のＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで
切断して得られる分子量既知のＤＮＡ断片の同一アガロ
ースゲル上での泳動距離で描かれる標準線に基づき、ま
た、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いる場合に
は、エシェリヒア・コリのファイ・エックス１７４ファ
ージ（φＸ１７４ ｐｈａｇｅ）のＤＮＡを制限酵素Ｈ
ａｅＩＩＩで切断して得られる分子量既知のＤＮＡ断片
の同一ポロアクリルアミドゲル上での泳動距離で描かれ
る標準線に基づき、切断ＤＮＡ断片またはプラスミドの
各ＤＮＡ断片の大きさを算出することができる。。尚、
各ＤＮＡ断片の大きさの決定において、１ｋｂ以上の断
片の大きさについては、１％アガロースゲル電気泳動に
よって得られる結果を採用し、約０．１ｋｂから１ｋｂ
未満の断片の大きさについては４％ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動によって得られる結果を採用した。
【００２１】上記ＰＣ遺伝子を包含する本発明に用いる
ＤＮＡ断片は、サッカロマイセス・セレビシエ染色体Ｄ
ＮＡから分離されたもののみならず、通常用いられるＤ
ＮＡ合成装置、例えばアプライド・バイオシステムズ(A
pplied Biosystems)社製３９４ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサ
イザーを用いて合成されたものであってもよい。
ＤＮＡ断片は、サッカロマイセス・セレビシエ染色体Ｄ
ＮＡから分離されたもののみならず、通常用いられるＤ
ＮＡ合成装置、例えばアプライド・バイオシステムズ(A
pplied Biosystems)社製３９４ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサ
イザーを用いて合成されたものであってもよい。
【００２２】また、前記の如く酵母（Saccharomyces se
revisiae）染色体ＤＮＡから取得されるＰＣ遺伝子は、
コードされるＰＣの機能、すなわち二酸化炭素固定に関
与する性質を実質的に損なうことがない限り、塩基配列
の一部の塩基が他の塩基と置換されていてもよく、又は
削除されていてもよく、或いは新たに塩基が挿入されて
いてもよく、さらに塩基配列の一部が転位されているも
のであってもよく、これらの誘導体のいずれもが、本発
明に用いることができる。
revisiae）染色体ＤＮＡから取得されるＰＣ遺伝子は、
コードされるＰＣの機能、すなわち二酸化炭素固定に関
与する性質を実質的に損なうことがない限り、塩基配列
の一部の塩基が他の塩基と置換されていてもよく、又は
削除されていてもよく、或いは新たに塩基が挿入されて
いてもよく、さらに塩基配列の一部が転位されているも
のであってもよく、これらの誘導体のいずれもが、本発
明に用いることができる。
【００２３】また、サッカロマイセス・セレビシエ以外
の酵母、または他の微生物又は動植物由来のＰＣ遺伝子
を使用することもできる。特に、以下に示す微生物また
は動植物由来のＰＣ遺伝子は、その配列が既知（括弧内
に文献を示す）であり、上記と同様にしてハイブリダイ
ゼーンションにより、あるいはＰＣＲ法によりそのＯＲ
Ｆ部分を増幅することによって、取得することができ
る。得られた遺伝子は、後記実施例２（Ｂ）作製のベク
ターのｔａｃプロモーター下流に挿入することができ
る。挿入したプラスミドを実施例２（Ｄ）の方法に従っ
て好気性コリネ型細菌を形質転換し、有機酸の製造に使
用することができる。
の酵母、または他の微生物又は動植物由来のＰＣ遺伝子
を使用することもできる。特に、以下に示す微生物また
は動植物由来のＰＣ遺伝子は、その配列が既知（括弧内
に文献を示す）であり、上記と同様にしてハイブリダイ
ゼーンションにより、あるいはＰＣＲ法によりそのＯＲ
Ｆ部分を増幅することによって、取得することができ
る。得られた遺伝子は、後記実施例２（Ｂ）作製のベク
ターのｔａｃプロモーター下流に挿入することができ
る。挿入したプラスミドを実施例２（Ｄ）の方法に従っ
て好気性コリネ型細菌を形質転換し、有機酸の製造に使
用することができる。
【００２４】ヒト［Biochem.Biophys.Res.Comm., 202,
1009-1014, (1994)］ マウス［Proc.Natl.Acad.Sci.USA., 90, 1766-1779, (1
993)］ ラット［GENE, 165, 331-332, (1995)］ 酵母； シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces
pombe） ［DDBJ Accession No.; D78170］ バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearot
hermophilus） ［GENE, 191, 47-50, (1997)］ リゾビウム・エトリ（Rhizobium etli） ［J.Bacteriol., 178, 5960-5970, (1996)］
1009-1014, (1994)］ マウス［Proc.Natl.Acad.Sci.USA., 90, 1766-1779, (1
993)］ ラット［GENE, 165, 331-332, (1995)］ 酵母； シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces
pombe） ［DDBJ Accession No.; D78170］ バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearot
hermophilus） ［GENE, 191, 47-50, (1997)］ リゾビウム・エトリ（Rhizobium etli） ［J.Bacteriol., 178, 5960-5970, (1996)］
【００２５】ＰＣ遺伝子を含むＤＮＡ断片は、適当な発
現プラスミド、例えばｐＵＣ１１８（宝酒造製）へ挿入
し、適当な宿主微生物、例えばエシェリヒア・コリＪＭ
１０９（宝酒造製）へ導入することにより発現させるこ
とができる。発現したＰＣ遺伝子産物であるピルビン酸
カルボキシラーゼの確認は、該形質転換体から粗酵素液
を抽出し、Fisher & Magasanikの方法[J.Bacteriol., 1
58, 55-62, (1984)]により直接ＰＣ活性を測定し、非形
質転換株から抽出した粗酵素液のＰＣ活性と比較するこ
とにより、確認することができる。
現プラスミド、例えばｐＵＣ１１８（宝酒造製）へ挿入
し、適当な宿主微生物、例えばエシェリヒア・コリＪＭ
１０９（宝酒造製）へ導入することにより発現させるこ
とができる。発現したＰＣ遺伝子産物であるピルビン酸
カルボキシラーゼの確認は、該形質転換体から粗酵素液
を抽出し、Fisher & Magasanikの方法[J.Bacteriol., 1
58, 55-62, (1984)]により直接ＰＣ活性を測定し、非形
質転換株から抽出した粗酵素液のＰＣ活性と比較するこ
とにより、確認することができる。
【００２６】ＰＣ遺伝子を含むＤＮＡ断片は、適当なプ
ラスミド、例えばコリネ型細菌内でプラスミドの複製増
殖機能を司る遺伝子を少なくとも含むプラスミドベクタ
ーに導入することにより、コリネ型細菌内でＰＣの高発
現可能な組換えプラスミドを得ることができる。
ラスミド、例えばコリネ型細菌内でプラスミドの複製増
殖機能を司る遺伝子を少なくとも含むプラスミドベクタ
ーに導入することにより、コリネ型細菌内でＰＣの高発
現可能な組換えプラスミドを得ることができる。
【００２７】ここで、上記組み換えプラスミドにおい
て、ＰＣ遺伝子を発現させるためのプロモーターはコリ
ネ型細菌が保有するプロモーターであることができる
が、それに限られるものではなく、ＰＣ遺伝子の転写を
開始させるための塩基配列であればいかなるプロモータ
ーであっても良い。
て、ＰＣ遺伝子を発現させるためのプロモーターはコリ
ネ型細菌が保有するプロモーターであることができる
が、それに限られるものではなく、ＰＣ遺伝子の転写を
開始させるための塩基配列であればいかなるプロモータ
ーであっても良い。
【００２８】ＰＣ遺伝子を導入することができるプラス
ミドベクターとしては、コリネ型細菌内での複製増殖機
能を司る遺伝子を少なくとも含むものであれば特に制限
されない。その具体例としては、例えば、特開平３−２
１０１８４号公報に記載のプラスミドｐＣＲＹ３０；特
開平２−７２８７６号公報及び米国特許５，１８５，２
６２号明細書公報に記載のプラスミドｐＣＲＹ２１、ｐ
ＣＲＹ２ＫＥ、ｐＣＲＹ２ＫＸ、ｐＣＲＹ３１、ｐＣＲ
Ｙ３ＫＥ及びｐＣＲＹ３ＫＸ；特開平１−１９１６８６
号公報に記載のプラスミドｐＣＲＹ２およびｐＣＲＹ
３；特開昭５８−６７６７９号公報に記載のｐＡＭ３３
０；特開昭５８−７７８９５号公報に記載のｐＨＭ１５
１９；特開昭５８−１９２９００号公報に記載のｐＡＪ
６５５、ｐＡＪ６１１及びｐＡＪ１８４４；特開昭５７
−１３４５００号公報に記載のｐＣＧ１；特開昭５８−
３５１９７号公報に記載のｐＣＧ２；特開昭５７−１８
３７９９号公報に記載のｐＣＧ４およびｐＣＧ１１等を
挙げることができる。
ミドベクターとしては、コリネ型細菌内での複製増殖機
能を司る遺伝子を少なくとも含むものであれば特に制限
されない。その具体例としては、例えば、特開平３−２
１０１８４号公報に記載のプラスミドｐＣＲＹ３０；特
開平２−７２８７６号公報及び米国特許５，１８５，２
６２号明細書公報に記載のプラスミドｐＣＲＹ２１、ｐ
ＣＲＹ２ＫＥ、ｐＣＲＹ２ＫＸ、ｐＣＲＹ３１、ｐＣＲ
Ｙ３ＫＥ及びｐＣＲＹ３ＫＸ；特開平１−１９１６８６
号公報に記載のプラスミドｐＣＲＹ２およびｐＣＲＹ
３；特開昭５８−６７６７９号公報に記載のｐＡＭ３３
０；特開昭５８−７７８９５号公報に記載のｐＨＭ１５
１９；特開昭５８−１９２９００号公報に記載のｐＡＪ
６５５、ｐＡＪ６１１及びｐＡＪ１８４４；特開昭５７
−１３４５００号公報に記載のｐＣＧ１；特開昭５８−
３５１９７号公報に記載のｐＣＧ２；特開昭５７−１８
３７９９号公報に記載のｐＣＧ４およびｐＣＧ１１等を
挙げることができる。
【００２９】それらの中でもコリネ型細菌の宿主−ベク
ター系で用いられるプラスミドベクターとしては、コリ
ネ型細菌内でプラスミドの複製増殖機能を司る遺伝子と
コリネ型細菌内でプラスミドの安定化機能を司る遺伝子
とを有するものが好ましく、例えば、プラスミドｐＣＲ
Ｙ３０、ｐＣＲＹ２１、ｐＣＲＹ２ＫＥ、ｐＣＲＹ２Ｋ
Ｘ、ｐＣＲＹ３１、ｐＣＲＹ３ＫＥおよびｐＣＲＹ３Ｋ
Ｘ等が好適に使用される。
ター系で用いられるプラスミドベクターとしては、コリ
ネ型細菌内でプラスミドの複製増殖機能を司る遺伝子と
コリネ型細菌内でプラスミドの安定化機能を司る遺伝子
とを有するものが好ましく、例えば、プラスミドｐＣＲ
Ｙ３０、ｐＣＲＹ２１、ｐＣＲＹ２ＫＥ、ｐＣＲＹ２Ｋ
Ｘ、ｐＣＲＹ３１、ｐＣＲＹ３ＫＥおよびｐＣＲＹ３Ｋ
Ｘ等が好適に使用される。
【００３０】ＰＣ遺伝子を好気性コリネ型細菌内で複製
可能なプラスミドベクターの適当な部位に挿入して得ら
れる組み換えベクターで、コリネ型細菌、例えばブレビ
バクテリウム フラバム(Brevibacterium flavum)MJ-23
3（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）を形質転換することに
より、本発明で用いるＰＥＰＣ遺伝子で組み換えられた
好気性コリネ型細菌が得られる。
可能なプラスミドベクターの適当な部位に挿入して得ら
れる組み換えベクターで、コリネ型細菌、例えばブレビ
バクテリウム フラバム(Brevibacterium flavum)MJ-23
3（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）を形質転換することに
より、本発明で用いるＰＥＰＣ遺伝子で組み換えられた
好気性コリネ型細菌が得られる。
【００３１】本発明に用いられるＰＣ遺伝子で組み換え
られた好気性コリネ型細菌又はその調製物とは、通常の
好気的条件で増殖可能なコリネ型細菌またはその調製物
であれば特に限定されるものではないが、例えば、ブレ
ビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、アースロバ
クター属等のコリネ型細菌またはその調製物が挙げられ
る。これらのうち、特にブレビバクテリウム フラバム
（Brevibacterium flavum）ＭＪ−２３３(ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−１４９７), 同ＭＪ−２３３−ＡＢ−４１（ＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−１４９８）、ブレビバクテリウム アンモニ
アゲネス （Brevibacterium ammoniagenes）ＡＴＣＣ６
８７２、コリネバクテリウム グルタミカム（Coryneba
cterium glutamicum）ＡＴＣＣ３１８３１、ブレビバク
テリウムラクトファーメンタム（Brevibacterium lacto
fermentum）ＡＴＣＣ１３８６９等のコリネ型細菌また
はその調製物が好適に用いられる。
られた好気性コリネ型細菌又はその調製物とは、通常の
好気的条件で増殖可能なコリネ型細菌またはその調製物
であれば特に限定されるものではないが、例えば、ブレ
ビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、アースロバ
クター属等のコリネ型細菌またはその調製物が挙げられ
る。これらのうち、特にブレビバクテリウム フラバム
（Brevibacterium flavum）ＭＪ−２３３(ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−１４９７), 同ＭＪ−２３３−ＡＢ−４１（ＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−１４９８）、ブレビバクテリウム アンモニ
アゲネス （Brevibacterium ammoniagenes）ＡＴＣＣ６
８７２、コリネバクテリウム グルタミカム（Coryneba
cterium glutamicum）ＡＴＣＣ３１８３１、ブレビバク
テリウムラクトファーメンタム（Brevibacterium lacto
fermentum）ＡＴＣＣ１３８６９等のコリネ型細菌また
はその調製物が好適に用いられる。
【００３２】好気性コリネ型細菌を本発明の方法に用い
るためには、まず菌体を通常の好気的な条件で培養した
のち用いることができる。培養に用いる培地は、通常微
生物の培養に用いられる培地を用いることができる。例
えば、硫酸アンモニウム、リン酸カリウム、硫酸マグネ
シウム等の無機塩からなる組成に、肉エキス、酵母エキ
ス、ペプトン等の天然栄養源を添加した一般的な培地を
用いる事ができる。
るためには、まず菌体を通常の好気的な条件で培養した
のち用いることができる。培養に用いる培地は、通常微
生物の培養に用いられる培地を用いることができる。例
えば、硫酸アンモニウム、リン酸カリウム、硫酸マグネ
シウム等の無機塩からなる組成に、肉エキス、酵母エキ
ス、ペプトン等の天然栄養源を添加した一般的な培地を
用いる事ができる。
【００３３】培養後の菌体は、遠心分離、膜分離等によ
って回収し、菌体をそのまま又は調製物として次に示す
反応に用いられる。ここでいう調製物とは、例えば、菌
体をアクリルアミド、カラギーナン等で固定化した固定
化菌体、菌体を破砕した破砕物、その遠心分離上清、ま
たその上清を硫安処理等で部分精製したＰＥＰＣ活性を
有する画分等を指す。
って回収し、菌体をそのまま又は調製物として次に示す
反応に用いられる。ここでいう調製物とは、例えば、菌
体をアクリルアミド、カラギーナン等で固定化した固定
化菌体、菌体を破砕した破砕物、その遠心分離上清、ま
たその上清を硫安処理等で部分精製したＰＥＰＣ活性を
有する画分等を指す。
【００３４】反応液には、水、緩衝液、培地等が用いら
れるが、適当な無機塩を含有した培地が最も好ましい。
反応液には、例えばグルコース、エタノール等の有機原
料と炭酸イオン、重炭酸イオンまたは二酸化炭素ガスを
含有させ、嫌気的条件で反応させることが特徴である。
この場合の、有機原料としては、特に限定されることな
く、目的とする有機酸に応じて選択可能であり、一般的
な有機原料から選択できる。具体的には、安価であり、
目的の有機酸の生成速度の速いグルコースやエタノール
が好適に用いられる。この場合、グルコースの添加濃度
は、０．５ｇ／Ｌｌ〜５００ｇ／Ｌが好ましく、エタノ
ールの添加濃度は、０．５ｇ／Ｌ〜３０ｇ／が好まし
い。
れるが、適当な無機塩を含有した培地が最も好ましい。
反応液には、例えばグルコース、エタノール等の有機原
料と炭酸イオン、重炭酸イオンまたは二酸化炭素ガスを
含有させ、嫌気的条件で反応させることが特徴である。
この場合の、有機原料としては、特に限定されることな
く、目的とする有機酸に応じて選択可能であり、一般的
な有機原料から選択できる。具体的には、安価であり、
目的の有機酸の生成速度の速いグルコースやエタノール
が好適に用いられる。この場合、グルコースの添加濃度
は、０．５ｇ／Ｌｌ〜５００ｇ／Ｌが好ましく、エタノ
ールの添加濃度は、０．５ｇ／Ｌ〜３０ｇ／が好まし
い。
【００３５】炭酸イオン、重炭酸イオンは、１ｍＭ〜５
００ｍＭ、好ましくは２〜３００ｍＭ、さらに好ましく
は３〜２００ｍＭの濃度で添加する。二酸化炭素ガスを
含有させる場合は、溶液１Ｌ当たり５０ｍｇ〜２５ｇ、
好ましくは１００ｍｇ〜１５ｇ、さらに好ましくは１５
０ｍｇ〜１０ｇの二酸化炭素ガスを含有させる。
００ｍＭ、好ましくは２〜３００ｍＭ、さらに好ましく
は３〜２００ｍＭの濃度で添加する。二酸化炭素ガスを
含有させる場合は、溶液１Ｌ当たり５０ｍｇ〜２５ｇ、
好ましくは１００ｍｇ〜１５ｇ、さらに好ましくは１５
０ｍｇ〜１０ｇの二酸化炭素ガスを含有させる。
【００３６】また、嫌気的条件とは、溶液中の溶存酸素
濃度を低く抑えて反応させることを指す。この場合、溶
存酸素濃度として０〜２ｐｐｍ、好ましくは０〜１ｐｐ
ｍ、さらに好ましくは０〜０．５ｐｐｍで反応させるこ
とが望ましい。そのための方法としては、例えば容器を
密閉して無通気で反応させる、窒素ガス等の不活性ガス
を供給して反応させる、二酸化炭素ガス含有の不活性ガ
スを通気する等の方法を用いることができる。
濃度を低く抑えて反応させることを指す。この場合、溶
存酸素濃度として０〜２ｐｐｍ、好ましくは０〜１ｐｐ
ｍ、さらに好ましくは０〜０．５ｐｐｍで反応させるこ
とが望ましい。そのための方法としては、例えば容器を
密閉して無通気で反応させる、窒素ガス等の不活性ガス
を供給して反応させる、二酸化炭素ガス含有の不活性ガ
スを通気する等の方法を用いることができる。
【００３７】反応の温度は、通常１５℃〜４５℃、好ま
しくは２５℃〜３７℃で行う。ｐＨは、５〜９、好まし
くは６〜８の範囲で行う。反応は、通常５時間から１２
０時間行う。反応に用いる菌体の量は、とくに規定され
ないが、１ｇ／ｌ〜７００ｇ／ｌ、好ましくは１０ｇ／
ｌ〜５００ｇ／ｌさらに好ましくは２０ｇ／ｌ〜４００
ｇ／ｌが用いられる。菌体の調製物を用いる場合は、上
記の量の菌体量に相当する量を用いることが好ましい。
しくは２５℃〜３７℃で行う。ｐＨは、５〜９、好まし
くは６〜８の範囲で行う。反応は、通常５時間から１２
０時間行う。反応に用いる菌体の量は、とくに規定され
ないが、１ｇ／ｌ〜７００ｇ／ｌ、好ましくは１０ｇ／
ｌ〜５００ｇ／ｌさらに好ましくは２０ｇ／ｌ〜４００
ｇ／ｌが用いられる。菌体の調製物を用いる場合は、上
記の量の菌体量に相当する量を用いることが好ましい。
【００３８】上記でいう調製物とは、例えば、菌体をア
クリルアミド、カラギーナン等で固定化した固定化菌
体、菌体を破砕した破砕物、その遠心分離上清、またそ
の上清を硫安処理等で部分精製した画分等を指す。
クリルアミド、カラギーナン等で固定化した固定化菌
体、菌体を破砕した破砕物、その遠心分離上清、またそ
の上清を硫安処理等で部分精製した画分等を指す。
【００３９】以上の様な方法で製造した有機酸は、必要
に応じて、反応液から通常の分離、精製方法で分離、精
製することができる。具体的には、限外ろ過膜分離、遠
心分離等により菌体及びその調製物と分離した後、カラ
ム法、晶析法等の公知の方法で精製し、乾燥させる事に
より、結晶として採取する方法等が挙げられる。
に応じて、反応液から通常の分離、精製方法で分離、精
製することができる。具体的には、限外ろ過膜分離、遠
心分離等により菌体及びその調製物と分離した後、カラ
ム法、晶析法等の公知の方法で精製し、乾燥させる事に
より、結晶として採取する方法等が挙げられる。
【００４０】本発明で、製造の対象となる有機酸として
は、特に限定されるものではないが、本発明の効果から
は、酸素含有雰囲気で、好気性コリネ細菌又はその調製
物で効率的に製造できない化合物が特に好ましい。
は、特に限定されるものではないが、本発明の効果から
は、酸素含有雰囲気で、好気性コリネ細菌又はその調製
物で効率的に製造できない化合物が特に好ましい。
【００４１】具体的には、有機カルボン酸が挙げられ、
より具体的にはコハク酸、リンゴ酸、フマル酸等が挙げ
られる。
より具体的にはコハク酸、リンゴ酸、フマル酸等が挙げ
られる。
【００４２】以上に本発明を説明してきたが、下記の実
施例により更に具体的に説明する。しかしながら、実施
例は本発明の具体的な認識を得る一助とみなすべきのも
のであり、本発明の範囲を限定するものではないことを
理解すべきである。
施例により更に具体的に説明する。しかしながら、実施
例は本発明の具体的な認識を得る一助とみなすべきのも
のであり、本発明の範囲を限定するものではないことを
理解すべきである。
【００４３】
【実施例】〔実施例１〕酵母サッカロマイセス・セレビ
シエ由来のＰＣ遺伝子（ＰＹＣ２）を含むＤＮＡ断片の
クローン化 （Ａ）サッカロマイセス・セレビシエの全ＤＮＡの抽
出：酵母用増殖培地（ＹＰＡＤ）１Ｌ［組成：１０ｇ Y
east Extract，２０ｇ ペプトン，２０ｇ グルコース，
１００ｍｇ アデニン及び蒸留水：１０００ｍｌ］にサ
ッカロマイセス・セレビシエ Ｗ３０３−１Ａ株（Yeas
t, Vol.2, 163-167 (1986)）を白金耳を用いて植菌し、
対数増殖期後期まで３０℃で培養し、菌体を集めた。
シエ由来のＰＣ遺伝子（ＰＹＣ２）を含むＤＮＡ断片の
クローン化 （Ａ）サッカロマイセス・セレビシエの全ＤＮＡの抽
出：酵母用増殖培地（ＹＰＡＤ）１Ｌ［組成：１０ｇ Y
east Extract，２０ｇ ペプトン，２０ｇ グルコース，
１００ｍｇ アデニン及び蒸留水：１０００ｍｌ］にサ
ッカロマイセス・セレビシエ Ｗ３０３−１Ａ株（Yeas
t, Vol.2, 163-167 (1986)）を白金耳を用いて植菌し、
対数増殖期後期まで３０℃で培養し、菌体を集めた。
【００４４】得られた菌体を１０ｍｇ／ｍｌの濃度にな
るよう、１０ｍｇ／ｍｌ リゾチーム、１０ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ、２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８.０）及び１ｍＭ
ＥＤＴＡ・２Ｎａの各成分を含有する溶液１５ｍｌ
（各成分の濃度は最終濃度である）に懸濁した。次にプ
ロテナーゼＫを最終濃度が１００μｇ／ｍｌになるよう
に添加し、３７℃で１時間保温した。さらにドデシル硫
酸ナトリウム（ＳＤＳ）を 最終濃度が０.５％になるよ
うに添加し、５０℃で６時間保温して溶菌した。この溶
菌液に、等量のフェノール／クロロホルム溶液を添加
し、室温で１０分間ゆるやかに振盪した後、全量を遠心
分離（５,０００×ｇ， ２０分間，１０〜１２℃）し、
上清画分を分取した。この上清に酢酸ナトリウムを０.
３Ｍとなるよう添加した後、２倍量のエタノールをゆっ
くりと加えた。水層とエタノール層の間に存在するＤＮ
Ａをガラス棒でまきとり、７０％エタノールで洗浄した
後、風乾した。得られたＤＮＡに１０ｍＭトリス緩衝液
（ｐＨ７.５）−１ｍＭＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液５ｍｌを
加え、４℃で一晩静置し、以後の実験に用いた。
るよう、１０ｍｇ／ｍｌ リゾチーム、１０ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ、２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８.０）及び１ｍＭ
ＥＤＴＡ・２Ｎａの各成分を含有する溶液１５ｍｌ
（各成分の濃度は最終濃度である）に懸濁した。次にプ
ロテナーゼＫを最終濃度が１００μｇ／ｍｌになるよう
に添加し、３７℃で１時間保温した。さらにドデシル硫
酸ナトリウム（ＳＤＳ）を 最終濃度が０.５％になるよ
うに添加し、５０℃で６時間保温して溶菌した。この溶
菌液に、等量のフェノール／クロロホルム溶液を添加
し、室温で１０分間ゆるやかに振盪した後、全量を遠心
分離（５,０００×ｇ， ２０分間，１０〜１２℃）し、
上清画分を分取した。この上清に酢酸ナトリウムを０.
３Ｍとなるよう添加した後、２倍量のエタノールをゆっ
くりと加えた。水層とエタノール層の間に存在するＤＮ
Ａをガラス棒でまきとり、７０％エタノールで洗浄した
後、風乾した。得られたＤＮＡに１０ｍＭトリス緩衝液
（ｐＨ７.５）−１ｍＭＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液５ｍｌを
加え、４℃で一晩静置し、以後の実験に用いた。
【００４５】（Ｂ）サッカロマイセス・セレビシエ由来
のＰＣ遺伝子（ＰＹＣ２）を含むＤＮＡ断片のクローン
化及び組換え体の創製：上記（Ａ）項で調製した染色体
ＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲを行った。ＰＣＲに際して
は、下記の１対のプライマーを、アプライド・バイオシ
ステムズ（Applied Biosystems）社製「３９４ ＤＮＡ
／ＲＮＡシンセサイザー（synthesizer）」を用いて合
成し、使用した。 （ａ−１）5'-TTT CAT ATG AGC AGT AGC AAG AAA TTG -
3'（配列番号１） （ｂ−１）5'-TTT CCT GCA GGT TAA CGA GTA AAA ATT A
CT TT -3'（配列番号２）
のＰＣ遺伝子（ＰＹＣ２）を含むＤＮＡ断片のクローン
化及び組換え体の創製：上記（Ａ）項で調製した染色体
ＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲを行った。ＰＣＲに際して
は、下記の１対のプライマーを、アプライド・バイオシ
ステムズ（Applied Biosystems）社製「３９４ ＤＮＡ
／ＲＮＡシンセサイザー（synthesizer）」を用いて合
成し、使用した。 （ａ−１）5'-TTT CAT ATG AGC AGT AGC AAG AAA TTG -
3'（配列番号１） （ｂ−１）5'-TTT CCT GCA GGT TAA CGA GTA AAA ATT A
CT TT -3'（配列番号２）
【００４６】実際のＰＣＲは、パーキンエルマーシータ
ス社製の「ＤＮＡサーマルサイクラー」を用い、反応試
薬として、レコンビナント・タックＤＮＡ・ポリメラー
ゼ・タカラ・タック（Recombinant TaqDNA Polymerase
TaKaRa Taq）（宝酒造製）を用いて下記の条件で行っ
た。
ス社製の「ＤＮＡサーマルサイクラー」を用い、反応試
薬として、レコンビナント・タックＤＮＡ・ポリメラー
ゼ・タカラ・タック（Recombinant TaqDNA Polymerase
TaKaRa Taq）（宝酒造製）を用いて下記の条件で行っ
た。
【００４７】 反応液： （１０×）ＰＣＲ緩衝液 １０μｌ １．２５ｍＭ ｄＮＴＰ混合液 １６μｌ 鋳型ＤＮＡ １０μｌ（DNA 含有量 １μＭ以下） 上記記載のａ−１，ｂ−１プライマー 各々１μｌ（最終濃度０．２５μＭ ） レコンビナント・タックＤＮＡ・ポリメラーゼ ０．５μｌ 滅菌蒸留水 ６１．５μｌ 以上を混合し、この１００μｌの反応液をＰＣＲにかけ
た。
た。
【００４８】ＰＣＲサイクル： デナチュレーション過程：９４℃ ６０秒 アニーリング過程 ：５２℃ ６０秒 エクステンション過程 ：７２℃ １２０秒
【００４９】以上を１サイクルとし、２５サイクル行っ
た。上記で生成した反応液１０μｌを０．８％アガロー
スゲルにより電気泳動を行い、約３．５６ｋｐのＤＮＡ
断片が検出できた。
た。上記で生成した反応液１０μｌを０．８％アガロー
スゲルにより電気泳動を行い、約３．５６ｋｐのＤＮＡ
断片が検出できた。
【００５０】〔実施例２〕ＰＣ遺伝子によるコリネ型細
菌組み換え体の作製 （Ａ）シャトルベクターの構築 特開平３−２１０１８４号公報に記載のプラスミドｐＣ
ＲＹ３０内に存在する、コリネ型細菌内でのプラスミド
の安定化に必要な領域の配列をもとに、下記の１対のプ
ライマーを、アプライド・バイオシステムズ（Applied
Biosystems）社製「３９４ ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイ
ザー（synthesizer）」を用いて合成した。
菌組み換え体の作製 （Ａ）シャトルベクターの構築 特開平３−２１０１８４号公報に記載のプラスミドｐＣ
ＲＹ３０内に存在する、コリネ型細菌内でのプラスミド
の安定化に必要な領域の配列をもとに、下記の１対のプ
ライマーを、アプライド・バイオシステムズ（Applied
Biosystems）社製「３９４ ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイ
ザー（synthesizer）」を用いて合成した。
【００５１】（ａ−２）5'-TTT CTC GAG CGC ATT ACC T
CC TTG CTA CTG-3'（配列番号３） （ｂ−２）5'-TTT GAA TTC GAT ATC AAG CTT GCA CAT C
AA-3'（配列番号４）
CC TTG CTA CTG-3'（配列番号３） （ｂ−２）5'-TTT GAA TTC GAT ATC AAG CTT GCA CAT C
AA-3'（配列番号４）
【００５２】上記プラスミドｐＣＲＹ３０は、次のよう
にして構築されたプラスミドである。ブレビバクテリウ
ム・スタチオニス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓ
ｔａｔｉｏｎｉｓ） ＩＦＯ１２１４４（工業技術院生
命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ ＢＰ−２５１５の受
託番号で寄託されている）からプラスミドｐＢＹ５０３
（このプラスミドの詳細については特開平１−９５７８
５号公報参照）ＤＮＡを抽出し、制限酵素ＸｈｏＩで大
きさが約４．０ｋｂのプラスミドの複製増殖機能を司る
遺伝子を含むＤＮＡ断片（複製領域）を切り出し、制限
酵素ＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩで大きさが約２．１ｋｂ
のプラスミドの安定化機能を司る遺伝子を含むＤＮＡ断
片（安定化領域）を切り出す。これらの両ＤＮＡ断片を
プラスミドｐＨＳＧ２９８（宝酒造製）のＥｃｏＲＩ−
ＫｐｎＩ部位及びＳａｌＩ部位にそれぞれ組み込むこと
により、プラスミドベクターｐＣＲＹ３０を調製するこ
とができる。
にして構築されたプラスミドである。ブレビバクテリウ
ム・スタチオニス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓ
ｔａｔｉｏｎｉｓ） ＩＦＯ１２１４４（工業技術院生
命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ ＢＰ−２５１５の受
託番号で寄託されている）からプラスミドｐＢＹ５０３
（このプラスミドの詳細については特開平１−９５７８
５号公報参照）ＤＮＡを抽出し、制限酵素ＸｈｏＩで大
きさが約４．０ｋｂのプラスミドの複製増殖機能を司る
遺伝子を含むＤＮＡ断片（複製領域）を切り出し、制限
酵素ＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩで大きさが約２．１ｋｂ
のプラスミドの安定化機能を司る遺伝子を含むＤＮＡ断
片（安定化領域）を切り出す。これらの両ＤＮＡ断片を
プラスミドｐＨＳＧ２９８（宝酒造製）のＥｃｏＲＩ−
ＫｐｎＩ部位及びＳａｌＩ部位にそれぞれ組み込むこと
により、プラスミドベクターｐＣＲＹ３０を調製するこ
とができる。
【００５３】実際のＰＣＲは、パーキンエルマーシータ
ス社製の「ＤＮＡサーマルサイクラー」を用い、反応試
薬として、レコンビナント・タックＤＮＡ・ポリメラー
ゼ・タカラ・タック（Recombinant TaqDNA Polymerase
TaKaRa Taq）（宝酒造製）を用いて下記の条件で行っ
た。
ス社製の「ＤＮＡサーマルサイクラー」を用い、反応試
薬として、レコンビナント・タックＤＮＡ・ポリメラー
ゼ・タカラ・タック（Recombinant TaqDNA Polymerase
TaKaRa Taq）（宝酒造製）を用いて下記の条件で行っ
た。
【００５４】 反応液： （１０×）ＰＣＲ緩衝液 １０μｌ １．２５ｍＭ ｄＮＴＰ混合液 １６μｌ 鋳型ＤＮＡ １０μｌ（DNA 含有量 １μＭ以下） 上記記載のａ−２，ｂ−２プライマー 各々１μｌ（最終濃度０．２５μＭ ） レコンビナント・タックＤＮＡ・ポリメラーゼ ０．５μｌ 滅菌蒸留水 ６１．５μｌ 以上を混合し、この１００μｌの反応液をＰＣＲにかけ
た。
た。
【００５５】ＰＣＲサイクル： デナチュレーション過程：９４℃ ６０秒 アニーリング過程 ：５２℃ ６０秒 エクステンション過程 ：７２℃ １２０秒
【００５６】以上を１サイクルとし、２５サイクル行っ
た。上記で生成した反応液１０μｌを０．８％アガロー
スゲルにより電気泳動を行い、約１．１ｋｂのＤＮＡ断
片が検出できた。
た。上記で生成した反応液１０μｌを０．８％アガロー
スゲルにより電気泳動を行い、約１．１ｋｂのＤＮＡ断
片が検出できた。
【００５７】上記で増幅産物を確認できた反応液 １０
μｌ、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ＋
１μｌを各々制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで完全
に切断し、７０℃で１０分間処理させることにより制限
酵素を失活させた後、両者を混合し、これに、Ｔ4 ＤＮ
Ａリガーゼ１０×緩衝液 １μｌ、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ
１ｕｎｉｔの各成分を添加し、滅菌蒸留水で１０μｌに
して、１５℃で３時間反応させ、結合させた。
μｌ、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ＋
１μｌを各々制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで完全
に切断し、７０℃で１０分間処理させることにより制限
酵素を失活させた後、両者を混合し、これに、Ｔ4 ＤＮ
Ａリガーゼ１０×緩衝液 １μｌ、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ
１ｕｎｉｔの各成分を添加し、滅菌蒸留水で１０μｌに
して、１５℃で３時間反応させ、結合させた。
【００５８】得られたプラスミド混液を用い、塩化カル
シウム法〔Journal of MolecularBiology, 53, 159(197
0)〕によりエシェリヒア・コリＪＭ１０９（宝酒造製）
を形質転換し、アンピシリン ５０ｍｇを含む培地〔ト
リプトン １０ｇ、イーストエキストラクト ５ｇ、Ｎａ
Ｃｌ ５ｇ及び寒天 １６ｇを蒸留水１Ｌに溶解〕に塗抹
した。
シウム法〔Journal of MolecularBiology, 53, 159(197
0)〕によりエシェリヒア・コリＪＭ１０９（宝酒造製）
を形質転換し、アンピシリン ５０ｍｇを含む培地〔ト
リプトン １０ｇ、イーストエキストラクト ５ｇ、Ｎａ
Ｃｌ ５ｇ及び寒天 １６ｇを蒸留水１Ｌに溶解〕に塗抹
した。
【００５９】この培地上の生育株を常法により液体培養
し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミ
ドを制限酵素（ＥｃｏＲＩ，ＸｈｏＩ）により切断し、
挿入断片を確認した。この結果、プラスミドｐＢｌｕｅ
ｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ＋の長さ３．０ｋｂのＤＮＡ断片
に加え、長さ１．１ｋｂの挿入ＤＮＡ断片が認められ
た。本プラスミドをｐＢＳｐａｒと命名した。
し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミ
ドを制限酵素（ＥｃｏＲＩ，ＸｈｏＩ）により切断し、
挿入断片を確認した。この結果、プラスミドｐＢｌｕｅ
ｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ＋の長さ３．０ｋｂのＤＮＡ断片
に加え、長さ１．１ｋｂの挿入ＤＮＡ断片が認められ
た。本プラスミドをｐＢＳｐａｒと命名した。
【００６０】米国特許５，１８５，２６２号明細書記載
のプラスミドｐＣＲＹ３１内に存在する、コリネ型細菌
内でのプラスミドの複製に必要な領域の配列をもとに、
下記の１対のプライマーを、アプライド・バイオシステ
ムズ（Applied Biosystems）社製「３９４ ＤＮＡ／Ｒ
ＮＡシンセサイザー（synthesizer ）」を用いて合成し
た。
のプラスミドｐＣＲＹ３１内に存在する、コリネ型細菌
内でのプラスミドの複製に必要な領域の配列をもとに、
下記の１対のプライマーを、アプライド・バイオシステ
ムズ（Applied Biosystems）社製「３９４ ＤＮＡ／Ｒ
ＮＡシンセサイザー（synthesizer ）」を用いて合成し
た。
【００６１】（ａ−３）5'-TTT GGT ACC GAC TTA GAT A
AA GGT CTA-3'（配列番号５） （ｂ−３）5'-TTT CTC GAG TGC TGG TAA AAC AAC TTT-
3'（配列番号６）
AA GGT CTA-3'（配列番号５） （ｂ−３）5'-TTT CTC GAG TGC TGG TAA AAC AAC TTT-
3'（配列番号６）
【００６２】上記プラスミドｐＣＲＹ３１は、次のよう
にして構築されたプラスミドである。前記ｐＢＹ５０３
由来の複製領域とプラスミドｐＨＳＧ３９８（宝酒造
製）とを連結したプラスミドｐＣＲＹ３（このプラスミ
ドを保持するブレビバクテリウム・フラバム MJ233 GE1
02は、ＦＥＲＭ ＢＰ−２５１３として工業技術院生命
工学工業技術研究所に寄託されている）をＫｐｎＩで部
分分解してＤＮＡ断片を得る。一方、ｐＢＹ５０３をブ
レビバクテリウム・ラクトファーメンタムＩＦＯ１２１
４４（ＦＥＲＭ ＢＰ−２５１５）から調製し、Ｋｐｎ
Ｉで完全分解し、約７ｋｂのＤＮＡ断片を精製する。こ
れらのＤＮＡ断片を連結し、各種制限酵素で切断したと
きに下記表に示す切断パターンを示すプラスミドを選択
することによって、ｐＣＲＹ３１が得られる。
にして構築されたプラスミドである。前記ｐＢＹ５０３
由来の複製領域とプラスミドｐＨＳＧ３９８（宝酒造
製）とを連結したプラスミドｐＣＲＹ３（このプラスミ
ドを保持するブレビバクテリウム・フラバム MJ233 GE1
02は、ＦＥＲＭ ＢＰ−２５１３として工業技術院生命
工学工業技術研究所に寄託されている）をＫｐｎＩで部
分分解してＤＮＡ断片を得る。一方、ｐＢＹ５０３をブ
レビバクテリウム・ラクトファーメンタムＩＦＯ１２１
４４（ＦＥＲＭ ＢＰ−２５１５）から調製し、Ｋｐｎ
Ｉで完全分解し、約７ｋｂのＤＮＡ断片を精製する。こ
れらのＤＮＡ断片を連結し、各種制限酵素で切断したと
きに下記表に示す切断パターンを示すプラスミドを選択
することによって、ｐＣＲＹ３１が得られる。
【００６３】
【表１】 ────────────────────── 制限酵素 認識部位数 断片の長さ(kb) ────────────────────── KpnI ３ 7.0, 6.0, 2.2 SauI ２ 10.0, 5.2 PstI ２ 13.0, 2.2 BamHI １ 15.2 ──────────────────────
【００６４】実際のＰＣＲは、パーキンエルマーシータ
ス社製の「ＤＮＡサーマルサイクラー」を用い、反応試
薬として、レコンビナント・タックＤＮＡ・ポリメラー
ゼ・タカラ・タック（Recombinant TaqDNA Polymerase
TaKaRa Taq）（宝酒造製）を用いて下記の条件で行っ
た。
ス社製の「ＤＮＡサーマルサイクラー」を用い、反応試
薬として、レコンビナント・タックＤＮＡ・ポリメラー
ゼ・タカラ・タック（Recombinant TaqDNA Polymerase
TaKaRa Taq）（宝酒造製）を用いて下記の条件で行っ
た。
【００６５】 反応液： （１０×）ＰＣＲ緩衝液 １０μｌ １．２５ｍＭ ｄＮＴＰ混合液 １６μｌ 鋳型ＤＮＡ １０μｌ（DNA 含有量 １μＭ以下） 上記記載のａ−３，ｂ−３プライマー 各々１μｌ（最終濃度０．２５μＭ ） レコンビナント・タックＤＮＡ・ポリメラーゼ ０．５μｌ 滅菌蒸留水 ６１．５μｌ 以上を混合し、この１００μｌの反応液をＰＣＲにかけ
た。
た。
【００６６】ＰＣＲサイクル： デナチュレーション過程：９４℃ ６０秒 アニーリング過程 ：５２℃ ６０秒 エクステンション過程 ：７２℃ １２０秒
【００６７】以上を１サイクルとし、２５サイクル行っ
た。上記で生成した反応液１０μｌを０．８％アガロー
スゲルにより電気泳動を行い、約１．８ｋｂのＤＮＡ断
片が検出できた。
た。上記で生成した反応液１０μｌを０．８％アガロー
スゲルにより電気泳動を行い、約１．８ｋｂのＤＮＡ断
片が検出できた。
【００６８】上記で増幅産物を確認できた反応液１０μ
ｌ、プラスミドｐＢＳｐａｒ １μｌを各々制限酵素Ｘ
ｈｏＩおよびＫｐｎＩで完全に切断し、７０℃１０分処
理させることにより制限酵素を失活させた後、両者を混
合し、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ１０×）緩衝液 １μｌ、Ｔ
4 ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔの各成分を添加し、滅菌蒸
留水で１０μｌにして、１５℃で３時間反応させ、結合
させた。
ｌ、プラスミドｐＢＳｐａｒ １μｌを各々制限酵素Ｘ
ｈｏＩおよびＫｐｎＩで完全に切断し、７０℃１０分処
理させることにより制限酵素を失活させた後、両者を混
合し、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ１０×）緩衝液 １μｌ、Ｔ
4 ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔの各成分を添加し、滅菌蒸
留水で１０μｌにして、１５℃で３時間反応させ、結合
させた。
【００６９】得られたプラスミド混液を用い、塩化カル
シウム法〔Journal of MolecularBiology, 53, 159(197
0)〕によりエシェリヒア・コリＪＭ１０９（宝酒造製）
を形質転換し、アンピシリン ５０ｍｇを含む培地〔ト
リプトン １０ｇ、イーストエキストラクト ５ｇ、Ｎ
ａＣｌ ５ｇ及び寒天 １６ｇを蒸留水１Ｌに溶解〕に
塗抹した。
シウム法〔Journal of MolecularBiology, 53, 159(197
0)〕によりエシェリヒア・コリＪＭ１０９（宝酒造製）
を形質転換し、アンピシリン ５０ｍｇを含む培地〔ト
リプトン １０ｇ、イーストエキストラクト ５ｇ、Ｎ
ａＣｌ ５ｇ及び寒天 １６ｇを蒸留水１Ｌに溶解〕に
塗抹した。
【００７０】この培地上の生育株を常法により液体培養
し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミ
ドを制限酵素（ＸｈｏＩ，ＫｐｎＩ）により切断し、挿
入断片を確認した。この結果、プラスミドｐＢＳｐａｒ
の長さ４．１ｋｂのＤＮＡ断片に加え、長さ１．８ｋｂ
の挿入ＤＮＡ断片が認められた。本プラスミドをｐＢＳ
ｐａｒ−ｒｅｐと命名した。
し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミ
ドを制限酵素（ＸｈｏＩ，ＫｐｎＩ）により切断し、挿
入断片を確認した。この結果、プラスミドｐＢＳｐａｒ
の長さ４．１ｋｂのＤＮＡ断片に加え、長さ１．８ｋｂ
の挿入ＤＮＡ断片が認められた。本プラスミドをｐＢＳ
ｐａｒ−ｒｅｐと命名した。
【００７１】上記で作製したプラスミドｐＢＳｐａｒ−
ｒｅｐ １μｌ、ｐＨＳＧ２９８（宝酒造社製） １μ
ｌを各々制限酵素ＫｐｎＩおよびＥｃｏＲＩで完全に切
断し、７０℃で１０分処理させることにより制限酵素を
失活させた後、両者を混合し、これに、Ｔ4 ＤＮＡリガ
ーゼ１０×緩衝液 １μｌ、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ１ｕｎ
ｉｔの各成分を添加し、滅菌蒸留水で１０μｌにして、
１５℃で３時間反応させ、結合させた。
ｒｅｐ １μｌ、ｐＨＳＧ２９８（宝酒造社製） １μ
ｌを各々制限酵素ＫｐｎＩおよびＥｃｏＲＩで完全に切
断し、７０℃で１０分処理させることにより制限酵素を
失活させた後、両者を混合し、これに、Ｔ4 ＤＮＡリガ
ーゼ１０×緩衝液 １μｌ、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ１ｕｎ
ｉｔの各成分を添加し、滅菌蒸留水で１０μｌにして、
１５℃で３時間反応させ、結合させた。
【００７２】得られたプラスミド混液を用い、塩化カル
シウム法〔Journal of MolecularBiology, 53, 159(197
0)〕によりエシェリヒア・コリＪＭ１０９（宝酒造製）
を形質転換し、カナマイシン ５０ｍｇを含む培地〔ト
リプトン １０ｇ、イーストエキストラクト ５ｇ、Ｎ
ａＣｌ ５ｇ及び寒天 １６ｇを蒸留水１Ｌに溶解〕に
塗抹した。
シウム法〔Journal of MolecularBiology, 53, 159(197
0)〕によりエシェリヒア・コリＪＭ１０９（宝酒造製）
を形質転換し、カナマイシン ５０ｍｇを含む培地〔ト
リプトン １０ｇ、イーストエキストラクト ５ｇ、Ｎ
ａＣｌ ５ｇ及び寒天 １６ｇを蒸留水１Ｌに溶解〕に
塗抹した。
【００７３】この培地上の生育株を常法により液体培養
し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミ
ドを制限酵素により切断し、挿入断片を確認した。この
結果、プラスミドｐＨＳＧ２９８の長さ２．６ｋｂのＤ
ＮＡ断片に加え、長さ２．９ｋｂの挿入ＤＮＡ断片が認
められた。本プラスミドをｐＨＳＧ２９８ｐａｒ−ｒｅ
ｐと命名した。
し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミ
ドを制限酵素により切断し、挿入断片を確認した。この
結果、プラスミドｐＨＳＧ２９８の長さ２．６ｋｂのＤ
ＮＡ断片に加え、長さ２．９ｋｂの挿入ＤＮＡ断片が認
められた。本プラスミドをｐＨＳＧ２９８ｐａｒ−ｒｅ
ｐと命名した。
【００７４】（Ｂ）ｔａｃプロモーターの挿入 ｔａｃプロモーターを含有するプラスミドｐＴｒｃ９９
Ａ（ファルマシア社製）を鋳型としたＰＣＲ法により、
ｔａｃプロモーター断片を増幅させるべく、下記の１対
のプライマーを、アプライド・バイオシステムズ（Appl
ied Biosystems）社製「３９４ ＤＮＡ／ＲＮＡシンセ
サイザー（synthesizer ）」を用いて合成した。
Ａ（ファルマシア社製）を鋳型としたＰＣＲ法により、
ｔａｃプロモーター断片を増幅させるべく、下記の１対
のプライマーを、アプライド・バイオシステムズ（Appl
ied Biosystems）社製「３９４ ＤＮＡ／ＲＮＡシンセ
サイザー（synthesizer ）」を用いて合成した。
【００７５】 （ａ−４）5'-TTT GGT ACC GAT AGC TTA CTC CCC ATC CCC-3'（配列番号７） （ｂ−４）5'-TTT GGA TCC CAA CAT ATG AAC ACC TCC TTT TTA TCC GCT CAC AAT TCC ACA CAT-3'（配列番号８）
【００７６】実際のＰＣＲは、パーキンエルマーシータ
ス社製の「ＤＮＡサーマルサイクラー」を用い、反応試
薬として、レコンビナント・タックＤＮＡ・ポリメラー
ゼ・タカラ・タック（Recombinant TaqDNA Polymerase
TaKaRa Taq）（宝酒造製）を用いて下記の条件で行っ
た。
ス社製の「ＤＮＡサーマルサイクラー」を用い、反応試
薬として、レコンビナント・タックＤＮＡ・ポリメラー
ゼ・タカラ・タック（Recombinant TaqDNA Polymerase
TaKaRa Taq）（宝酒造製）を用いて下記の条件で行っ
た。
【００７７】 反応液： （１０×）ＰＣＲ緩衝液 １０μｌ １．２５ｍＭ ｄＮＴＰ混合液 １６μｌ 鋳型ＤＮＡ １０μｌ（DNA 含有量 １μＭ以下） 上記記載のａ−４，ｂ−４プライマー 各々１μｌ（最終濃度０．２５μＭ ） レコンビナント・タックＤＮＡ・ポリメラーゼ ０．５μｌ 滅菌蒸留水 ６１．５μｌ 以上を混合し、この１００μｌの反応液をＰＣＲにかけ
た。
た。
【００７８】ＰＣＲサイクル： デナチュレーション過程：９４℃ ６０秒 アニーリング過程 ：５２℃ ６０秒 エクステンション過程 ：７２℃ １２０秒
【００７９】以上を１サイクルとし、２５サイクル行っ
た。上記で生成した反応液１０μｌを３％アガロースゲ
ルにより電気泳動を行い、約１００ｂｐのＤＮＡ断片が
検出できた。
た。上記で生成した反応液１０μｌを３％アガロースゲ
ルにより電気泳動を行い、約１００ｂｐのＤＮＡ断片が
検出できた。
【００８０】上記で増幅産物を確認できた反応液１０μ
ｌ、上記（Ａ）で作製したプラスミドｐＨＳＧ２９８ｐ
ａｒ−ｒｅｐ ５μｌを各々制限酵素ＢａｍＨＩおよび
ＫｐｎＩで完全に切断し、７０℃で１０分処理させるこ
とにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、これ
に、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ１０×緩衝液 １μｌ、Ｔ4Ｄ
ＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔの各成分を添加し、滅菌蒸留水
で１０μｌにして、１５℃で３時間反応させ、結合させ
た。
ｌ、上記（Ａ）で作製したプラスミドｐＨＳＧ２９８ｐ
ａｒ−ｒｅｐ ５μｌを各々制限酵素ＢａｍＨＩおよび
ＫｐｎＩで完全に切断し、７０℃で１０分処理させるこ
とにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、これ
に、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ１０×緩衝液 １μｌ、Ｔ4Ｄ
ＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔの各成分を添加し、滅菌蒸留水
で１０μｌにして、１５℃で３時間反応させ、結合させ
た。
【００８１】得られたプラスミド混液を用い、塩化カル
シウム法〔Journal of MolecularBiology, 53, 159(197
0)〕によりエシェリヒア・コリＪＭ１０９（宝酒造製）
を形質転換し、カナマイシン ５０ｍｇを含む培地〔ト
リプトン １０ｇ、イーストエキストラクト ５ｇ、Ｎ
ａＣｌ ５ｇ及び寒天 １６ｇを蒸留水１Ｌに溶解〕に
塗抹した。
シウム法〔Journal of MolecularBiology, 53, 159(197
0)〕によりエシェリヒア・コリＪＭ１０９（宝酒造製）
を形質転換し、カナマイシン ５０ｍｇを含む培地〔ト
リプトン １０ｇ、イーストエキストラクト ５ｇ、Ｎ
ａＣｌ ５ｇ及び寒天 １６ｇを蒸留水１Ｌに溶解〕に
塗抹した。
【００８２】この培地上の生育株を常法により液体培養
し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミ
ドを制限酵素により切断し、挿入断片を確認した。この
結果、上記（Ａ）作製のプラスミドの長さ５．５ｋｂの
ＤＮＡ断片に加え、長さ０．１ｋｂの挿入ＤＮＡ断片が
認められた。このプラスミドをｐＨＳＧ２９８ｔａｃと
命名した。
し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミ
ドを制限酵素により切断し、挿入断片を確認した。この
結果、上記（Ａ）作製のプラスミドの長さ５．５ｋｂの
ＤＮＡ断片に加え、長さ０．１ｋｂの挿入ＤＮＡ断片が
認められた。このプラスミドをｐＨＳＧ２９８ｔａｃと
命名した。
【００８３】（Ｃ）ＰＣ遺伝子のシャトルベクターへの
挿入 実施例１（Ｂ）で増幅産物を確認できた反応液１０μ
ｌ、上記（Ｂ）で作製したプラスミドｐＨＳＧ２９８ｔ
ａｃ ５μｌを各々制限酵素ＢｇｌII、ＳｓｅＩまたは
ＢａｍＨＩ、ＳｓｅＩで各々切断し、７０℃で１０分処
理させることにより制限酵素を失活させた後、両者を混
合し、これに、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ１０×緩衝液 １μ
ｌ、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔの各成分を添加し、
滅菌蒸留水で１０μｌにして、１５℃で３時間反応さ
せ、結合させた。
挿入 実施例１（Ｂ）で増幅産物を確認できた反応液１０μ
ｌ、上記（Ｂ）で作製したプラスミドｐＨＳＧ２９８ｔ
ａｃ ５μｌを各々制限酵素ＢｇｌII、ＳｓｅＩまたは
ＢａｍＨＩ、ＳｓｅＩで各々切断し、７０℃で１０分処
理させることにより制限酵素を失活させた後、両者を混
合し、これに、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ１０×緩衝液 １μ
ｌ、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔの各成分を添加し、
滅菌蒸留水で１０μｌにして、１５℃で３時間反応さ
せ、結合させた。
【００８４】得られたプラスミド混液を用い、塩化カル
シウム法〔Journal of MolecularBiology, 53, 159(197
0)〕によりエシェリヒア・コリＪＭ１０９（宝酒造製）
を形質転換し、カナマイシン ５０ｍｇを含む培地〔ト
リプトン １０ｇ、イーストエキストラクト ５ｇ、Ｎ
ａＣｌ ５ｇ及び寒天 １６ｇを蒸留水１Ｌに溶解〕に
塗抹した。
シウム法〔Journal of MolecularBiology, 53, 159(197
0)〕によりエシェリヒア・コリＪＭ１０９（宝酒造製）
を形質転換し、カナマイシン ５０ｍｇを含む培地〔ト
リプトン １０ｇ、イーストエキストラクト ５ｇ、Ｎ
ａＣｌ ５ｇ及び寒天 １６ｇを蒸留水１Ｌに溶解〕に
塗抹した。
【００８５】この培地上の生育株を常法により液体培養
し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミ
ドを制限酵素（ＳｓｅＩ，ＮｄｅＩ）により切断し、挿
入断片を確認した。この結果、上記（Ｂ）作製のプラス
ミドの長さ５．６ｋｂのＤＮＡ断片に加え、長さ３．５
６ｋｂの挿入ＤＮＡ断片が認められた。このプラスミド
をｐＰＣ−ＰＹＣ２と命名した。
し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミ
ドを制限酵素（ＳｓｅＩ，ＮｄｅＩ）により切断し、挿
入断片を確認した。この結果、上記（Ｂ）作製のプラス
ミドの長さ５．６ｋｂのＤＮＡ断片に加え、長さ３．５
６ｋｂの挿入ＤＮＡ断片が認められた。このプラスミド
をｐＰＣ−ＰＹＣ２と命名した。
【００８６】（Ｄ）ブレビバクテリウム・フラバム MJ-
233-AB-41株の形質転換 本プラスミドを米国特許第５，１８５，２６２号明細書
記載の方法に従って、ブレビバクテリウム・フラバム M
J-233-AB-41（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９８）に導入し
た。
233-AB-41株の形質転換 本プラスミドを米国特許第５，１８５，２６２号明細書
記載の方法に従って、ブレビバクテリウム・フラバム M
J-233-AB-41（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９８）に導入し
た。
【００８７】ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３
３−ＡＢ−４１は、１９７６年１１月１７日に、通商産
業省工業技術院生命工学工業技術研究所(日本国茨城県
つくば市東１丁目１番３号、郵便番号305)に受託番号Ｆ
ＥＲＭ Ｐ−３８１２として寄託され、１９８１年５月
１日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受
託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９８が付与されている。
３−ＡＢ−４１は、１９７６年１１月１７日に、通商産
業省工業技術院生命工学工業技術研究所(日本国茨城県
つくば市東１丁目１番３号、郵便番号305)に受託番号Ｆ
ＥＲＭ Ｐ−３８１２として寄託され、１９８１年５月
１日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受
託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９８が付与されている。
【００８８】〔実施例３〕有機酸の製造（Ｉ） 尿素：４ｇ、（ＮＨ4）2ＳＯ4：１４ｇ，ＫＨ2ＰＯ4：
０．５ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4：０．５ｇ， ＭｇＳＯ4・７Ｈ2
Ｏ：０．５ｇ，ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ：２０ｍｇ，ＭｎＳ
Ｏ4・ｎＨ2Ｏ：２０ｍｇ、Ｄ−ビオチン：２００μｇ、
塩酸チアミン：１００μｇ、酵母エキス１ｇ、カザミノ
酸１ｇ及び蒸留水：１０００ｍｌ（ｐＨ６．６）の培地
を１００ｍｌずつ５００ｍｌ容の三角フラスコに分注
し、１２０℃、１５分間滅菌処理したものに滅菌済み５
０％グルコース水溶液４ｍｌを加え、上記ｐＰＣプラス
ミドを導入し形質転換させたブレビバクテリウム フラ
バムＭＪ−２３３−ＡＢ−４１菌株を植菌し、３３℃に
て２４時間振とう培養した（好気的培養）。培養終了
後、遠心分離(8000g、２０分)により菌体を回収した。
得られた菌体全量を以下の反応に供試した。
０．５ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4：０．５ｇ， ＭｇＳＯ4・７Ｈ2
Ｏ：０．５ｇ，ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ：２０ｍｇ，ＭｎＳ
Ｏ4・ｎＨ2Ｏ：２０ｍｇ、Ｄ−ビオチン：２００μｇ、
塩酸チアミン：１００μｇ、酵母エキス１ｇ、カザミノ
酸１ｇ及び蒸留水：１０００ｍｌ（ｐＨ６．６）の培地
を１００ｍｌずつ５００ｍｌ容の三角フラスコに分注
し、１２０℃、１５分間滅菌処理したものに滅菌済み５
０％グルコース水溶液４ｍｌを加え、上記ｐＰＣプラス
ミドを導入し形質転換させたブレビバクテリウム フラ
バムＭＪ−２３３−ＡＢ−４１菌株を植菌し、３３℃に
て２４時間振とう培養した（好気的培養）。培養終了
後、遠心分離(8000g、２０分)により菌体を回収した。
得られた菌体全量を以下の反応に供試した。
【００８９】（ＮＨ4）2ＳＯ4：２３ｇ，ＫＨ2ＰＯ4：
０．５ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4：０．５ｇ，ＭｇＳＯ4・７Ｈ
2Ｏ：０．５ｇ，ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ：２０ｍｇ，Ｍｎ
ＳＯ4・ｎＨ2Ｏ：２０ｍｇ、Ｄ−ビオチン：２００μ
ｇ、塩酸チアミン：１００μｇ、炭酸ナトリウム２０ｇ
／Ｌ、蒸留水：１０００ｍｌの培地を２Ｌ容のジャーフ
ァーメンターに入れ、上記菌体とグルコース５０％液１
２０ｍｌを添加し、密閉した状態で（溶存酸素濃度０．
１ｐｐｍ）、これを３０℃にて２４時間ゆるく(200rpm)
攪拌し、反応させた。得られた培養液を遠心分離（８０
００ｒｐｍ、１５分、４℃）して得られた上清液を分析
したところ、乳酸が２８．５ｇ／Ｌ、酢酸が３．５ｇ／
Ｌ、コハク酸が１６ｇ／Ｌ、リンゴ酸が１．２ｇ／Ｌ生
成していた。
０．５ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4：０．５ｇ，ＭｇＳＯ4・７Ｈ
2Ｏ：０．５ｇ，ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ：２０ｍｇ，Ｍｎ
ＳＯ4・ｎＨ2Ｏ：２０ｍｇ、Ｄ−ビオチン：２００μ
ｇ、塩酸チアミン：１００μｇ、炭酸ナトリウム２０ｇ
／Ｌ、蒸留水：１０００ｍｌの培地を２Ｌ容のジャーフ
ァーメンターに入れ、上記菌体とグルコース５０％液１
２０ｍｌを添加し、密閉した状態で（溶存酸素濃度０．
１ｐｐｍ）、これを３０℃にて２４時間ゆるく(200rpm)
攪拌し、反応させた。得られた培養液を遠心分離（８０
００ｒｐｍ、１５分、４℃）して得られた上清液を分析
したところ、乳酸が２８．５ｇ／Ｌ、酢酸が３．５ｇ／
Ｌ、コハク酸が１６ｇ／Ｌ、リンゴ酸が１．２ｇ／Ｌ生
成していた。
【００９０】〔実施例４〕有機酸の製造（II） 実施例３と同様に培養した菌体を、以下の反応に供試し
た。
た。
【００９１】（ＮＨ4）2ＳＯ4：２３ｇ，ＫＨ2ＰＯ4：
０．５ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4：０．５ｇ，ＭｇＳＯ4・７Ｈ
2Ｏ：０．５ｇ，ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ：２０ｍｇ，Ｍｎ
ＳＯ4・ｎＨ2Ｏ：２０ｍｇ、Ｄ−ビオチン：２００μ
ｇ、塩酸チアミン：１００μｇ、蒸留水：１０００ｍｌ
の培地を２Ｌ容のジャーファーメンターに入れ、上記菌
体とグルコース５０％液１２０ｍｌを添加し、ここに１
０％二酸化炭素ガス(９０％窒素ガス）を0.1vvmの速度
で供給しながら３０℃にて２４時間ゆるく(200rpm)攪拌
し、反応させた。得られた培養液を遠心分離（８０００
ｒｐｍ、１５分、４℃）して得られた上清液を分析した
ところ、乳酸が２７ｇ／Ｌ、酢酸が２．５ｇ／Ｌ、コハ
ク酸が１７ｇ／Ｌ、リンゴ酸が１．５ｇ／Ｌ生成してい
た。
０．５ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4：０．５ｇ，ＭｇＳＯ4・７Ｈ
2Ｏ：０．５ｇ，ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ：２０ｍｇ，Ｍｎ
ＳＯ4・ｎＨ2Ｏ：２０ｍｇ、Ｄ−ビオチン：２００μ
ｇ、塩酸チアミン：１００μｇ、蒸留水：１０００ｍｌ
の培地を２Ｌ容のジャーファーメンターに入れ、上記菌
体とグルコース５０％液１２０ｍｌを添加し、ここに１
０％二酸化炭素ガス(９０％窒素ガス）を0.1vvmの速度
で供給しながら３０℃にて２４時間ゆるく(200rpm)攪拌
し、反応させた。得られた培養液を遠心分離（８０００
ｒｐｍ、１５分、４℃）して得られた上清液を分析した
ところ、乳酸が２７ｇ／Ｌ、酢酸が２．５ｇ／Ｌ、コハ
ク酸が１７ｇ／Ｌ、リンゴ酸が１．５ｇ／Ｌ生成してい
た。
【００９２】〔比較例１〕形質転換してないブレビバク
テリウム・フラバム ＭＪ−２３３−ＡＢ−４１株を用
いた以外は、実施例４と同様に行った。
テリウム・フラバム ＭＪ−２３３−ＡＢ−４１株を用
いた以外は、実施例４と同様に行った。
【００９３】尿素：４ｇ、（ＮＨ4）2ＳＯ4：１４ｇ，
ＫＨ2ＰＯ4：０．５ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4：０．５ｇ， Ｍｇ
ＳＯ4・７Ｈ2Ｏ：０．５ｇ，ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ：２０
ｍｇ，ＭｎＳＯ4・ｎＨ2Ｏ：２０ｍｇ、Ｄ−ビオチン：
２００μｇ、塩酸チアミン：１００μｇ、酵母エキス１
ｇ、カザミノ酸１ｇ及び蒸留水：１０００ｍｌ（ｐＨ
６．６）の培地を１００ｍｌずつ５００ｍｌ容の三角フ
ラスコに分注し、１２０℃、１５分間滅菌処理したもの
に滅菌済み５０％グルコース水溶液４ｍｌを加え、ブレ
ビバクテリウム・フラバム ＭＪ−２３３−ＡＢ−４１
菌株を植菌し、３３℃にて２４時間振とう培養した（好
気的培養）。培養終了後、遠心分離(8000g、２０分)に
より菌体を回収した。得られた菌体全量を以下の反応に
供試した。
ＫＨ2ＰＯ4：０．５ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4：０．５ｇ， Ｍｇ
ＳＯ4・７Ｈ2Ｏ：０．５ｇ，ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ：２０
ｍｇ，ＭｎＳＯ4・ｎＨ2Ｏ：２０ｍｇ、Ｄ−ビオチン：
２００μｇ、塩酸チアミン：１００μｇ、酵母エキス１
ｇ、カザミノ酸１ｇ及び蒸留水：１０００ｍｌ（ｐＨ
６．６）の培地を１００ｍｌずつ５００ｍｌ容の三角フ
ラスコに分注し、１２０℃、１５分間滅菌処理したもの
に滅菌済み５０％グルコース水溶液４ｍｌを加え、ブレ
ビバクテリウム・フラバム ＭＪ−２３３−ＡＢ−４１
菌株を植菌し、３３℃にて２４時間振とう培養した（好
気的培養）。培養終了後、遠心分離(8000g、２０分)に
より菌体を回収した。得られた菌体全量を以下の反応に
供試した。
【００９４】（ＮＨ4）2ＳＯ4：２３ｇ，ＫＨ2ＰＯ4：
０．５ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4：０．５ｇ，ＭｇＳＯ4・７Ｈ
2Ｏ：０．５ｇ，ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ：２０ｍｇ，Ｍｎ
ＳＯ4・ｎＨ2Ｏ：２０ｍｇ、Ｄ−ビオチン：２００μ
ｇ、塩酸チアミン：１００μｇ、炭酸ナトリウム２０ｇ
／ｌ、蒸留水：１０００ｍｌの培地を２Ｌ容のジャーフ
ァーメンターに入れ、上記菌体とグルコース５０％液１
２０ｍｌを添加し、密閉した状態で（溶存酸素濃度０．
１ｐｐｍ）、これを３０℃にて２４時間ゆるく(200rpm)
攪拌し、反応させた。得られた培養液を遠心分離（８０
００ｒｐｍ、１５分、４℃）して得られた上清液を分析
したところ、乳酸が３３．４ｇ／Ｌ、酢酸が５ｇ／Ｌ、
コハク酸が１０ｇ／Ｌ、リンゴ酸が０．５ｇ／Ｌ生成し
ていた。
０．５ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4：０．５ｇ，ＭｇＳＯ4・７Ｈ
2Ｏ：０．５ｇ，ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ：２０ｍｇ，Ｍｎ
ＳＯ4・ｎＨ2Ｏ：２０ｍｇ、Ｄ−ビオチン：２００μ
ｇ、塩酸チアミン：１００μｇ、炭酸ナトリウム２０ｇ
／ｌ、蒸留水：１０００ｍｌの培地を２Ｌ容のジャーフ
ァーメンターに入れ、上記菌体とグルコース５０％液１
２０ｍｌを添加し、密閉した状態で（溶存酸素濃度０．
１ｐｐｍ）、これを３０℃にて２４時間ゆるく(200rpm)
攪拌し、反応させた。得られた培養液を遠心分離（８０
００ｒｐｍ、１５分、４℃）して得られた上清液を分析
したところ、乳酸が３３．４ｇ／Ｌ、酢酸が５ｇ／Ｌ、
コハク酸が１０ｇ／Ｌ、リンゴ酸が０．５ｇ／Ｌ生成し
ていた。
【００９５】〔比較例２〕炭酸イオンを添加しない以外
は、実施例４と同様に行った。
は、実施例４と同様に行った。
【００９６】（ＮＨ4）2ＳＯ4：２３ｇ，ＫＨ2ＰＯ4：
０．５ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4：０．５ｇ，ＭｇＳＯ4・７Ｈ
2Ｏ：０．５ｇ，ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ：２０ｍｇ，Ｍｎ
ＳＯ4・ｎＨ2Ｏ：２０ｍｇ、Ｄ−ビオチン：２００μ
ｇ、塩酸チアミン：１００μｇ、蒸留水：１０００ｍｌ
の培地を２Ｌ容のジャーファーメンターに入れ、実施例
４と同様に培養した菌体とグルコース５０％液１２０ｍ
ｌを添加し、密閉した状態で（溶存酸素濃度０．１ｐｐ
ｍ）、３０℃で２４時間ゆるく(200rpm)攪拌し、反応さ
せた。得られた培養液を遠心分離（８０００ｒｐｍ、１
５分、４℃）して得られた上清液を分析したところ、乳
酸が１４ｇ／Ｌ、酢酸が３．６ｇ／Ｌ、コハク酸が２．
４ｇ／Ｌ生成していた。
０．５ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4：０．５ｇ，ＭｇＳＯ4・７Ｈ
2Ｏ：０．５ｇ，ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ：２０ｍｇ，Ｍｎ
ＳＯ4・ｎＨ2Ｏ：２０ｍｇ、Ｄ−ビオチン：２００μ
ｇ、塩酸チアミン：１００μｇ、蒸留水：１０００ｍｌ
の培地を２Ｌ容のジャーファーメンターに入れ、実施例
４と同様に培養した菌体とグルコース５０％液１２０ｍ
ｌを添加し、密閉した状態で（溶存酸素濃度０．１ｐｐ
ｍ）、３０℃で２４時間ゆるく(200rpm)攪拌し、反応さ
せた。得られた培養液を遠心分離（８０００ｒｐｍ、１
５分、４℃）して得られた上清液を分析したところ、乳
酸が１４ｇ／Ｌ、酢酸が３．６ｇ／Ｌ、コハク酸が２．
４ｇ／Ｌ生成していた。
【００９７】〔実施例５〕酵母（Saccharomyces cerevi
siae）由来ＰＣ遺伝子（ＰＹＣ１）を用いた有機酸製造 酵母（Saccharomyces cerevisiae）由来のＰＣ遺伝子の
一つであるＰＹＣ１はその配列が既知（Mol.Gen.Gene
t., 229, 307-315, (1991)）であるため、実施例１
（Ａ）に示したように菌体を培養し、染色体ＤＮＡを調
製し、これをＰＣＲの鋳型として用いて、実施例１
（Ｂ）で使用したプライマーの代わりに、次の２つのプ
ライマー（ａ−４，ｂ−４）により、ＰＣをコードする
遺伝子部分を増幅させることができる。以下実施例２
（Ｄ）と同様の手法で、酵母（Saccharomycescerevisia
e）由来のＰＣ遺伝子（ＰＹＣ１）で組み換えた好気性
コリネ型細菌を得ることができる。
siae）由来ＰＣ遺伝子（ＰＹＣ１）を用いた有機酸製造 酵母（Saccharomyces cerevisiae）由来のＰＣ遺伝子の
一つであるＰＹＣ１はその配列が既知（Mol.Gen.Gene
t., 229, 307-315, (1991)）であるため、実施例１
（Ａ）に示したように菌体を培養し、染色体ＤＮＡを調
製し、これをＰＣＲの鋳型として用いて、実施例１
（Ｂ）で使用したプライマーの代わりに、次の２つのプ
ライマー（ａ−４，ｂ−４）により、ＰＣをコードする
遺伝子部分を増幅させることができる。以下実施例２
（Ｄ）と同様の手法で、酵母（Saccharomycescerevisia
e）由来のＰＣ遺伝子（ＰＹＣ１）で組み換えた好気性
コリネ型細菌を得ることができる。
【００９８】（ａ−４）5'-TTT CAT ATG TCG CAA AGA A
AA TTC GCC -3'（配列番号９） （ｂ−４）5'-TTT CCT GCA GGT CAT GCC TTA GTT TCA A
CA GGA AC -3'（配列番号１０）
AA TTC GCC -3'（配列番号９） （ｂ−４）5'-TTT CCT GCA GGT CAT GCC TTA GTT TCA A
CA GGA AC -3'（配列番号１０）
【００９９】得られたコリネ型細菌を実施例３の方法に
従って培養したところ、コハク酸が１５．５ｇ／Ｌ生成
していた。
従って培養したところ、コハク酸が１５．５ｇ／Ｌ生成
していた。
【０１００】〔実施例６〕リゾビウム・エトリ由来ＰＣ
遺伝子を用いた有機酸製造 リゾビウム・エトリ由来のＰＣ遺伝子はその配列が既知
（J.Bacteriol., 178,5960-5970, (1996)）であるた
め、実施例１（Ａ）に示したように菌体を培養し、染色
体ＤＮＡを調製し、これをＰＣＲの鋳型として用いて、
実施例１（Ｂ）で使用したプライマーの代わりに、次の
２つのプライマー（ａ−５，ｂ−５）を用いて、ＰＣを
コードする遺伝子部分を増幅させることができる。以下
実施例２（Ｄ）と同様の手法で、Rhizobium etli由来の
ＰＣ遺伝子で組み換えた好気性コリネ型細菌を得ること
ができる。
遺伝子を用いた有機酸製造 リゾビウム・エトリ由来のＰＣ遺伝子はその配列が既知
（J.Bacteriol., 178,5960-5970, (1996)）であるた
め、実施例１（Ａ）に示したように菌体を培養し、染色
体ＤＮＡを調製し、これをＰＣＲの鋳型として用いて、
実施例１（Ｂ）で使用したプライマーの代わりに、次の
２つのプライマー（ａ−５，ｂ−５）を用いて、ＰＣを
コードする遺伝子部分を増幅させることができる。以下
実施例２（Ｄ）と同様の手法で、Rhizobium etli由来の
ＰＣ遺伝子で組み換えた好気性コリネ型細菌を得ること
ができる。
【０１０１】（ａ−５）5'-TTT CAT ATG CCC ATA TCC A
AG ATA CTC -3'（配列番号１１） （ｂ−５）5'-TTT CCT GCA GGT CAT CCG CCG TAA ACC T
CC AGC AG -3'（配列番号１２）
AG ATA CTC -3'（配列番号１１） （ｂ−５）5'-TTT CCT GCA GGT CAT CCG CCG TAA ACC T
CC AGC AG -3'（配列番号１２）
【０１０２】得られたコリネ型細菌を実施例３の方法に
従って培養したところ、コハク酸が１４．５ｇ／Ｌ生成
していた。
従って培養したところ、コハク酸が１４．５ｇ／Ｌ生成
していた。
【０１０３】〔実施例７〕バチルス・ステアロサーモフ
ィルス由来ＰＣ遺伝子を用いた有機酸製造 バチルス・ステアロサーモフィルス由来のＰＣ遺伝子は
その配列が既知（GENE, 191, 47-50, (1997)）であるた
め、実施例１（Ａ）に示したように菌体を培養し、染色
体ＤＮＡを調製し、これをＰＣＲの鋳型として用いて、
実施例２（Ｄ）で使用したプライマーの代わりに、次の
２つのプライマー（ａ−６，ｂ−６）を用いて、ＰＣを
コードする遺伝子部分を増幅させることができる。以下
実施例２（Ｄ）と同様の手法で、Bacillus atearotherm
ophilus由来のＰＣ遺伝子で組み換えた好気性コリネ型
細菌を得ることができる。
ィルス由来ＰＣ遺伝子を用いた有機酸製造 バチルス・ステアロサーモフィルス由来のＰＣ遺伝子は
その配列が既知（GENE, 191, 47-50, (1997)）であるた
め、実施例１（Ａ）に示したように菌体を培養し、染色
体ＤＮＡを調製し、これをＰＣＲの鋳型として用いて、
実施例２（Ｄ）で使用したプライマーの代わりに、次の
２つのプライマー（ａ−６，ｂ−６）を用いて、ＰＣを
コードする遺伝子部分を増幅させることができる。以下
実施例２（Ｄ）と同様の手法で、Bacillus atearotherm
ophilus由来のＰＣ遺伝子で組み換えた好気性コリネ型
細菌を得ることができる。
【０１０４】（ａ−６）5'-TTT CAT ATG AAG ACA AGA C
GA ATT CGC -3'（配列番号１３） （ｂ−６）5'-TTT CCT GCA GGT TAT TTG GAC AAC TCC A
TG AGC AA -3'（配列番号１４）
GA ATT CGC -3'（配列番号１３） （ｂ−６）5'-TTT CCT GCA GGT TAT TTG GAC AAC TCC A
TG AGC AA -3'（配列番号１４）
【０１０５】得られたコリネ型細菌を実施例３の方法に
従って培養したところ、コハク酸が１４．０ｇ／Ｌ生成
していた。
従って培養したところ、コハク酸が１４．０ｇ／Ｌ生成
していた。
【０１０６】
【発明の効果】本発明の方法によれば、ＰＣ遺伝子で組
み換えた好気性コリネ型細菌を用いた培養法あるいは酵
素法により、効率よく、かつ 高収率でコハク酸等の有
機酸を製造することができる。
み換えた好気性コリネ型細菌を用いた培養法あるいは酵
素法により、効率よく、かつ 高収率でコハク酸等の有
機酸を製造することができる。
【０１０７】
配列番号：１ 配列の長さ：27 鎖の数：一本鎖 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 TTTCATATGA GCAGTAGCAA GAAATTG 27
【０１０８】配列番号：２ 配列の長さ：32 鎖の数：一本鎖 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 TTTCCTGCAG GTTAACGAGT AAAAATTACT TT 32
【０１０９】配列番号：３ 配列の長さ：30 鎖の数：一本鎖 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 TTTCTCGAGC GCATTACCTC CTTGCTACTG 30
【０１１０】配列番号：４ 配列の長さ：30 鎖の数：一本鎖 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 TTTGAATTCG ATATCAAGCT TGCACATCAA 30
【０１１１】配列番号：５ 配列の長さ：27 鎖の数：一本鎖 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 TTTGGTACCG ACTTAGATAA AGGTCTA 27
【０１１２】配列番号：６ 配列の長さ：27 鎖の数：一本鎖 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 TTTCTCGAGT GCTGGTAAAA CAACTTT 27
【０１１３】配列番号：７ 配列の長さ：30 鎖の数：一本鎖 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 TTTGGTACCG ATAGCTTACT CCCCATCCCC 30
【０１１４】配列番号：８ 配列の長さ：54 鎖の数：一本鎖 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 TTTGGATCCC AACATATGAA CACCTCCTTT TTATCCGCTC ACAATTCCAC ACAT 54
【０１１５】配列番号：９ 配列の長さ：27 鎖の数：一本鎖 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 TTTCATATGT CGCAAAGAAA ATTCGCC 27
【０１１６】配列番号：１０ 配列の長さ：35 鎖の数：一本鎖 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 TTTCCTGCAG GTCATGCCTT AGTTTCAACA GGAAC 35
【０１１７】配列番号：１１ 配列の長さ：27 鎖の数：一本鎖 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 TTTCATATGC CCATATCCAA GATACTC 27
【０１１８】配列番号：１２ 配列の長さ：35 鎖の数：一本鎖 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 TTTCCTGCAG GTCATCCGCC GTAAACCGCC AGCAG 35
【０１１９】配列番号：１３ 配列の長さ：27 鎖の数：一本鎖 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 TTTCATATGA AGACAAGACG AATTCGC 27
【０１２０】配列番号：１４ 配列の長さ：35 鎖の数：一本鎖 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 TTTCCTGCAG GTTATTTGGA CAACTCCATG AGCAA 35
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:13） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:865） (72)発明者 湯川 英明 茨城県稲敷郡阿見町中央八丁目３番１号 三菱化学株式会社筑波研究所内
Claims (6)
- 【請求項１】 ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子で組
み換えた好気性コリネ型細菌あるいはその調製物を、炭
酸イオンもしくは重炭酸イオンまたは二酸化炭素ガスを
含有する反応液中で嫌気的に有機原料に作用させ、有機
酸を生成させることを特徴とする有機酸の製造方法。 - 【請求項２】 炭酸もしくは重炭酸またはそれらの塩を
反応液に添加すること、または反応液に二酸化炭素ガス
を供給することにより、炭酸イオンもしくは重炭酸イオ
ンまたは二酸化炭素ガスを反応液に含有させる請求項１
記載の方法。 - 【請求項３】 ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子が、
微生物あるいは動植物由来である請求項１または２記載
の方法。 - 【請求項４】 ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子が、
ヒト、マウス、ラット、酵母、又はコリネバクテリウム
属、バチルス属、リゾビウム属もしくはエシェリヒア属
に属する微生物由来である請求項３記載の方法。 - 【請求項５】 好気性コリネ型細菌が、ブレビバクテリ
ウム・フラバム(Brevibacterium flavum) である請求項
１〜４のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項６】 ブレビバクテリウム・フラバムが、ブレ
ビバクテリウム・フラバム MJ-233である請求項５記載
の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP02036198A JP3967812B2 (ja) | 1998-01-16 | 1998-01-16 | ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子組み換え菌体による有機酸の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP02036198A JP3967812B2 (ja) | 1998-01-16 | 1998-01-16 | ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子組み換え菌体による有機酸の製造法 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2006347209A Division JP2007125030A (ja) | 2006-12-25 | 2006-12-25 | ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子組み換え菌体による有機酸の製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11196888A true JPH11196888A (ja) | 1999-07-27 |
| JP3967812B2 JP3967812B2 (ja) | 2007-08-29 |
Family
ID=12024963
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP02036198A Expired - Lifetime JP3967812B2 (ja) | 1998-01-16 | 1998-01-16 | ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子組み換え菌体による有機酸の製造法 |
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Cited By (28)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005010182A1 (ja) * | 2003-07-29 | 2005-02-03 | Research Institute Of Innovative Technology For The Earth | コリネ型細菌形質転換体及びそれを用いるジカルボン酸の製造方法 |
| WO2005021770A1 (ja) | 2003-08-28 | 2005-03-10 | Mitsubishi Chemical Corporation | コハク酸の製造方法 |
| WO2005026349A1 (ja) * | 2003-09-17 | 2005-03-24 | Mitsubishi Chemical Corporation | 非アミノ有機酸の製造方法 |
| WO2005030973A1 (ja) | 2003-09-30 | 2005-04-07 | Ajinomoto Co., Inc. | 発酵液からのコハク酸の精製方法 |
| JP2005095169A (ja) * | 2003-08-28 | 2005-04-14 | Mitsubishi Chemicals Corp | コハク酸の製造方法 |
| JP2005333886A (ja) * | 2004-05-27 | 2005-12-08 | Showa Denko Kk | 微生物によるコハク酸の製造方法 |
| JP2006000091A (ja) * | 2004-05-20 | 2006-01-05 | Mitsubishi Chemicals Corp | オキザロ酢酸またはオキザロ酢酸誘導体の製造方法 |
| WO2007046389A1 (ja) | 2005-10-18 | 2007-04-26 | Ajinomoto Co., Inc. | コハク酸の製造方法 |
| EP1760143A4 (en) * | 2004-05-20 | 2007-06-27 | Ajinomoto Kk | BACTERIA PRODUCING SUCCINIC ACID AND PROCESS FOR PRODUCING SUCCINIC ACID |
| WO2007099867A1 (ja) | 2006-02-24 | 2007-09-07 | Mitsubishi Chemical Corporation | 有機酸生産菌及び有機酸の製造法 |
| JP2008525026A (ja) * | 2004-12-22 | 2008-07-17 | ミシガン バイオテクノロジー インスティテュート | 有機酸を高産生するための組換え微生物米国政府の援助に関する記載本発明は、エネルギー省によって授与された協力契約番号（ＣｏｏｐｅｒａｔｉｖｅＡｇｒｅｅｍｅｎｔＮｏ．）ＤＥ−ＦＣ３６−０２ＧＯ１２００１において米国政府から援助を受けてなされた。米国政府は、本発明において一定の権利を有する。 |
| WO2008126896A1 (ja) | 2007-04-10 | 2008-10-23 | Ajinomoto Co., Inc. | 有機酸の製造方法 |
| JP2008259451A (ja) * | 2007-04-12 | 2008-10-30 | Mitsubishi Chemicals Corp | 有機酸生産微生物の菌体の調製法及び有機酸の製造法 |
| WO2008133161A1 (ja) | 2007-04-17 | 2008-11-06 | Ajinomoto Co., Inc. | カルボキシル基を有する酸性物質の製造法 |
| WO2009025363A1 (ja) | 2007-08-23 | 2009-02-26 | Mitsubishi Chemical Corporation | コハク酸の製造方法 |
| WO2009072562A1 (ja) | 2007-12-06 | 2009-06-11 | Ajinomoto Co., Inc. | 有機酸の製造方法 |
| US7833763B2 (en) | 2003-07-09 | 2010-11-16 | Mitsubishi Chemical Corporation | Method for producing organic acid |
| JP4771437B2 (ja) * | 2004-08-27 | 2011-09-14 | ライス ユニバーシティー | 増加したコハク酸産生を有する変異Ｅ．ｃｏｌｉ株 |
| WO2011111693A1 (ja) | 2010-03-09 | 2011-09-15 | 三菱化学株式会社 | コハク酸の製造方法 |
| US8076111B2 (en) | 2007-04-16 | 2011-12-13 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing an organic acid |
| WO2012115084A1 (ja) | 2011-02-22 | 2012-08-30 | 東レ株式会社 | ジオール組成物およびポリエステル |
| WO2012128231A1 (ja) | 2011-03-18 | 2012-09-27 | 三菱化学株式会社 | ポリマーの製造方法、有機酸の製造方法及び有機酸生産菌 |
| WO2013069786A1 (ja) | 2011-11-11 | 2013-05-16 | 三菱化学株式会社 | コハク酸の製造方法 |
| US8497104B2 (en) | 2009-05-27 | 2013-07-30 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing an organic acid |
| US8628941B2 (en) | 2004-11-25 | 2014-01-14 | Ajinomoto Co., Inc. | L-amino acid-producing bacterium and a method for producing L-amino acid |
| WO2015005406A1 (ja) | 2013-07-09 | 2015-01-15 | 味の素株式会社 | 有用物質の製造方法 |
| WO2016104814A2 (en) | 2014-12-26 | 2016-06-30 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing dicarboxylic acid |
| US9533931B2 (en) | 2013-04-12 | 2017-01-03 | Toray Industries, Inc. | Process of producing 1,4-butanediol |
-
1998
- 1998-01-16 JP JP02036198A patent/JP3967812B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (47)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7833763B2 (en) | 2003-07-09 | 2010-11-16 | Mitsubishi Chemical Corporation | Method for producing organic acid |
| US7368268B2 (en) | 2003-07-29 | 2008-05-06 | Research Institute Of Innovative Technology For The Earth | Coryneform bacterium transformant and process for producing dicarboxylic acids using the same |
| WO2005010182A1 (ja) * | 2003-07-29 | 2005-02-03 | Research Institute Of Innovative Technology For The Earth | コリネ型細菌形質転換体及びそれを用いるジカルボン酸の製造方法 |
| WO2005021770A1 (ja) | 2003-08-28 | 2005-03-10 | Mitsubishi Chemical Corporation | コハク酸の製造方法 |
| JP2005095169A (ja) * | 2003-08-28 | 2005-04-14 | Mitsubishi Chemicals Corp | コハク酸の製造方法 |
| US7763447B2 (en) | 2003-08-28 | 2010-07-27 | Ajinomoto Co., Inc. | Method of producing succinic acid with bacterium comprising a modified fumarate reductase gene or a modified succinate dehydrogenase gene |
| JP4619291B2 (ja) * | 2003-09-17 | 2011-01-26 | 三菱化学株式会社 | 非アミノ有機酸の製造方法 |
| US7563606B2 (en) | 2003-09-17 | 2009-07-21 | Mitsubishi Chemical Corporation | Method for producing non-amino organic acid |
| JPWO2005026349A1 (ja) * | 2003-09-17 | 2007-11-08 | 三菱化学株式会社 | 非アミノ有機酸の製造方法 |
| WO2005026349A1 (ja) * | 2003-09-17 | 2005-03-24 | Mitsubishi Chemical Corporation | 非アミノ有機酸の製造方法 |
| WO2005030973A1 (ja) | 2003-09-30 | 2005-04-07 | Ajinomoto Co., Inc. | 発酵液からのコハク酸の精製方法 |
| EP1760143A4 (en) * | 2004-05-20 | 2007-06-27 | Ajinomoto Kk | BACTERIA PRODUCING SUCCINIC ACID AND PROCESS FOR PRODUCING SUCCINIC ACID |
| JP5023701B2 (ja) * | 2004-05-20 | 2012-09-12 | 味の素株式会社 | コハク酸生産菌及びコハク酸の製造方法 |
| JP2006000091A (ja) * | 2004-05-20 | 2006-01-05 | Mitsubishi Chemicals Corp | オキザロ酢酸またはオキザロ酢酸誘導体の製造方法 |
| US7972823B2 (en) | 2004-05-20 | 2011-07-05 | Ajinomoto Co., Inc. | Succinic acid-producing bacterium and process for producing succinic acid |
| JP2005333886A (ja) * | 2004-05-27 | 2005-12-08 | Showa Denko Kk | 微生物によるコハク酸の製造方法 |
| JP4771437B2 (ja) * | 2004-08-27 | 2011-09-14 | ライス ユニバーシティー | 増加したコハク酸産生を有する変異Ｅ．ｃｏｌｉ株 |
| US8628941B2 (en) | 2004-11-25 | 2014-01-14 | Ajinomoto Co., Inc. | L-amino acid-producing bacterium and a method for producing L-amino acid |
| JP2008525026A (ja) * | 2004-12-22 | 2008-07-17 | ミシガン バイオテクノロジー インスティテュート | 有機酸を高産生するための組換え微生物米国政府の援助に関する記載本発明は、エネルギー省によって授与された協力契約番号（ＣｏｏｐｅｒａｔｉｖｅＡｇｒｅｅｍｅｎｔＮｏ．）ＤＥ−ＦＣ３６−０２ＧＯ１２００１において米国政府から援助を受けてなされた。米国政府は、本発明において一定の権利を有する。 |
| JP5088136B2 (ja) * | 2005-10-18 | 2012-12-05 | 味の素株式会社 | コハク酸の製造方法 |
| US7829316B2 (en) | 2005-10-18 | 2010-11-09 | Ajinomoto Co., Inc. | Process for production of succinic acid |
| WO2007046389A1 (ja) | 2005-10-18 | 2007-04-26 | Ajinomoto Co., Inc. | コハク酸の製造方法 |
| US7993888B2 (en) | 2006-02-24 | 2011-08-09 | Mitsubishi Chemical Corporation | Bacterium having enhanced 2-oxoglutarate dehydrogenase activity |
| WO2007099867A1 (ja) | 2006-02-24 | 2007-09-07 | Mitsubishi Chemical Corporation | 有機酸生産菌及び有機酸の製造法 |
| US9080189B2 (en) | 2007-04-10 | 2015-07-14 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing an organic acid |
| WO2008126896A1 (ja) | 2007-04-10 | 2008-10-23 | Ajinomoto Co., Inc. | 有機酸の製造方法 |
| JP2008259451A (ja) * | 2007-04-12 | 2008-10-30 | Mitsubishi Chemicals Corp | 有機酸生産微生物の菌体の調製法及び有機酸の製造法 |
| US8076111B2 (en) | 2007-04-16 | 2011-12-13 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing an organic acid |
| WO2008133161A1 (ja) | 2007-04-17 | 2008-11-06 | Ajinomoto Co., Inc. | カルボキシル基を有する酸性物質の製造法 |
| US9822385B2 (en) | 2007-04-17 | 2017-11-21 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing an L-glutamic acid and L-aspartic acid using a recombinant microorganism having enhanced expression of a ybjL protein |
| WO2009025363A1 (ja) | 2007-08-23 | 2009-02-26 | Mitsubishi Chemical Corporation | コハク酸の製造方法 |
| WO2009072562A1 (ja) | 2007-12-06 | 2009-06-11 | Ajinomoto Co., Inc. | 有機酸の製造方法 |
| US8247201B2 (en) | 2007-12-06 | 2012-08-21 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing an organic acid |
| US8497104B2 (en) | 2009-05-27 | 2013-07-30 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing an organic acid |
| WO2011111693A1 (ja) | 2010-03-09 | 2011-09-15 | 三菱化学株式会社 | コハク酸の製造方法 |
| WO2012115084A1 (ja) | 2011-02-22 | 2012-08-30 | 東レ株式会社 | ジオール組成物およびポリエステル |
| US10696785B2 (en) | 2011-02-22 | 2020-06-30 | Toray Industries, Inc. | Diol composition and polyester |
| JP2016154565A (ja) * | 2011-03-18 | 2016-09-01 | 三菱化学株式会社 | ポリマーの製造方法、有機酸の製造方法及び有機酸生産菌 |
| US9388433B2 (en) | 2011-03-18 | 2016-07-12 | Mitsubishi Chemical Corporation | Method for producing polymer, method for producing organic acid, and organic acid-producing microorganism |
| JP6032198B2 (ja) * | 2011-03-18 | 2016-11-24 | 三菱化学株式会社 | ポリマーの製造方法、有機酸の製造方法及び有機酸生産菌 |
| US10077456B2 (en) | 2011-03-18 | 2018-09-18 | Mitsubishi Chemical Corporation | Method for producing polymer, method for producing organic acid, and organic acid-producing microorganism |
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| US9533931B2 (en) | 2013-04-12 | 2017-01-03 | Toray Industries, Inc. | Process of producing 1,4-butanediol |
| WO2015005406A1 (ja) | 2013-07-09 | 2015-01-15 | 味の素株式会社 | 有用物質の製造方法 |
| EP3521433A1 (en) | 2013-07-09 | 2019-08-07 | Ajinomoto Co., Inc. | Process for producing l-glutamic acid |
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