JP5064396B2 - L‐グルタミンの製造法 - Google Patents
L‐グルタミンの製造法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP5064396B2 JP5064396B2 JP2008532121A JP2008532121A JP5064396B2 JP 5064396 B2 JP5064396 B2 JP 5064396B2 JP 2008532121 A JP2008532121 A JP 2008532121A JP 2008532121 A JP2008532121 A JP 2008532121A JP 5064396 B2 JP5064396 B2 JP 5064396B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- seq
- dna
- protein
- amino acid
- sequence represented
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 title claims description 41
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 title claims description 39
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 16
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 101
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 66
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 64
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 62
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 35
- 241000186226 Corynebacterium glutamicum Species 0.000 claims description 25
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 claims description 23
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 5
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 138
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 91
- 238000000034 method Methods 0.000 description 55
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 54
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 49
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 48
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 39
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 33
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 33
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 21
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 21
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 18
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 17
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 17
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 17
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 17
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 17
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 17
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 16
- 239000000047 product Substances 0.000 description 16
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 13
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 13
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 13
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 13
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 13
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 12
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 12
- 229960002989 glutamic acid Drugs 0.000 description 12
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 12
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 11
- 108010065243 glutamine synthetase 2 Proteins 0.000 description 11
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 10
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 10
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 10
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 9
- 241001485655 Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 Species 0.000 description 9
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 9
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 8
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 8
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 8
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 8
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 7
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 7
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 6
- 241000186031 Corynebacteriaceae Species 0.000 description 6
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 description 6
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 6
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- 101150025220 sacB gene Proteins 0.000 description 6
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 5
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 5
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 5
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 5
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N aspartic acid group Chemical group N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 5
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 5
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 5
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 5
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 5
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 5
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 5
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 5
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N succinic acid Chemical compound OC(=O)CCC(O)=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 5
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 5
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 4
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 4
- 101100309436 Streptococcus mutans serotype c (strain ATCC 700610 / UA159) ftf gene Proteins 0.000 description 4
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000010216 calcium carbonate Nutrition 0.000 description 4
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 4
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 4
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 102200042487 rs141568342 Human genes 0.000 description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 206010061764 Chromosomal deletion Diseases 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 3
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 3
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 3
- -1 glucose Chemical class 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 102000005396 glutamine synthetase Human genes 0.000 description 3
- 108020002326 glutamine synthetase Proteins 0.000 description 3
- SURQXAFEQWPFPV-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate heptahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.[Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O SURQXAFEQWPFPV-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 3
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 102200076456 rs781838005 Human genes 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 3
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 2
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010010144 Completed suicide Diseases 0.000 description 2
- 241001517047 Corynebacterium acetoacidophilum Species 0.000 description 2
- 241000133018 Corynebacterium melassecola Species 0.000 description 2
- 241000337023 Corynebacterium thermoaminogenes Species 0.000 description 2
- 150000008540 L-glutamines Chemical class 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 2
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 2
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 2
- PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N Niacin Chemical compound OC(=O)C1=CC=CN=C1 PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 2
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 2
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 2
- 230000006154 adenylylation Effects 0.000 description 2
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 2
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 2
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 2
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 2
- 229910017053 inorganic salt Inorganic materials 0.000 description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 2
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 2
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 2
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 2
- WRUGWIBCXHJTDG-UHFFFAOYSA-L magnesium sulfate heptahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.[Mg+2].[O-]S([O-])(=O)=O WRUGWIBCXHJTDG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229940061634 magnesium sulfate heptahydrate Drugs 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 2
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M thiamine hydrochloride Chemical compound Cl.[Cl-].CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229960000344 thiamine hydrochloride Drugs 0.000 description 2
- 235000019190 thiamine hydrochloride Nutrition 0.000 description 2
- 239000011747 thiamine hydrochloride Substances 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AGNGYMCLFWQVGX-AGFFZDDWSA-N (e)-1-[(2s)-2-amino-2-carboxyethoxy]-2-diazonioethenolate Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CO\C([O-])=C\[N+]#N AGNGYMCLFWQVGX-AGFFZDDWSA-N 0.000 description 1
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NKDFYOWSKOHCCO-YPVLXUMRSA-N 20-hydroxyecdysone Chemical compound C1[C@@H](O)[C@@H](O)C[C@]2(C)[C@@H](CC[C@@]3([C@@H]([C@@](C)(O)[C@H](O)CCC(C)(O)C)CC[C@]33O)C)C3=CC(=O)[C@@H]21 NKDFYOWSKOHCCO-YPVLXUMRSA-N 0.000 description 1
- 108010039224 Amidophosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000186146 Brevibacterium Species 0.000 description 1
- 241000186248 Corynebacterium callunae Species 0.000 description 1
- 241001644925 Corynebacterium efficiens Species 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 108020004485 Nonsense Codon Proteins 0.000 description 1
- 108010009736 Protein Hydrolysates Proteins 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N Thiamine Natural products CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DFPAKSUCGFBDDF-ZQBYOMGUSA-N [14c]-nicotinamide Chemical compound N[14C](=O)C1=CC=CN=C1 DFPAKSUCGFBDDF-ZQBYOMGUSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 239000012670 alkaline solution Substances 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 description 1
- 235000012501 ammonium carbonate Nutrition 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 229950011321 azaserine Drugs 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000037429 base substitution Effects 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 241000186254 coryneform bacterium Species 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000011790 ferrous sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000003891 ferrous sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 1
- 229910000359 iron(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 1
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000007169 ligase reaction Methods 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- SCVOEYLBXCPATR-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate pentahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.[Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O SCVOEYLBXCPATR-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000011785 micronutrient Substances 0.000 description 1
- 235000013369 micronutrients Nutrition 0.000 description 1
- 150000007522 mineralic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 235000013379 molasses Nutrition 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 description 1
- 231100000707 mutagenic chemical Toxicity 0.000 description 1
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 1
- 229960003512 nicotinic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000001968 nicotinic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011664 nicotinic acid Substances 0.000 description 1
- 229910017464 nitrogen compound Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002830 nitrogen compounds Chemical class 0.000 description 1
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000001384 succinic acid Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 235000019157 thiamine Nutrition 0.000 description 1
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 1
- 239000011721 thiamine Substances 0.000 description 1
- KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SCN1CC1=CN=C(C)N=C1N KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000009281 ultraviolet germicidal irradiation Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
- C12N9/1205—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. protein kinases
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0008—Oxidoreductases (1.) acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/14—Glutamic acid; Glutamine
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
[1](1)配列番号1〜3のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、または(2)配列番号1〜3のいずれかで表されるアミノ酸配列と80%以上の相同性を有し、かつ配列番号1〜3のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質と実質的に同一の活性を有する蛋白質、の活性が低下または喪失しており、かつ(3)配列番号4で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、または(4)配列番号4で表されるアミノ酸配列と80%以上の相同性を有し、かつ配列番号4で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質と実質的に同一の活性を有する蛋白質、の活性が低下または喪失しているコリネバクテリウム属に属する微生物。
[2]コリネバクテリウム属に属する微生物が、コリネバクテリウム・グルタミクムである、[1]に記載の微生物。
[3][1]に記載の微生物、または以下の(1)〜(5)より選ばれる1つ以上の蛋白質の活性が低下、または喪失しているコリネバクテリウム属に属する微生物を培地に培養し、該培養物中にL−グルタミンを生成、蓄積させ、該培養物中からL−グルタミンを採取することを特徴とする、L−グルタミンの製造法。
(1)配列番号1で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
(2)配列番号2で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
(3)配列番号3で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
(4)配列番号4で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
(5)配列番号1〜4のいずれかのアミノ酸配列と80%以上の相同性を有し、かつ(1)〜(4)のいずれかの蛋白質と実質的に同一の活性を有する蛋白質
[4]コリネバクテリウム属に属する微生物が、コリネバクテリウム・グルタミクムである、[3]に記載のL‐グルタミンの製造法。
本発明の微生物および本発明の方法で用いられる微生物は、以下の(1)または(2)記載の蛋白質
(1)配列番号1〜3のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
(2)配列番号1〜3のいずれかで表されるアミノ酸配列と80%以上、好ましくは90%、より好ましくは95%、さらに好ましくは98%、最も好ましくは99%の相同性を有し、かつ配列番号1〜3のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質と実質的に同一の活性を有する蛋白質
の活性が低下または低下または喪失しており、かつ以下の(3)または(4)記載の蛋白質
(3)配列番号4で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
(4)配列番号4で表されるアミノ酸配列と80%以上、好ましくは90%、より好ましくは95%、さらに好ましくは98%、最も好ましくは99%の相同性を有し、かつ配列番号4で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質と実質的に同一の活性を有する蛋白質
の活性が低下または喪失した微生物、および以下の(5)〜(9)より選ばれる1つ以上の蛋白質
(5)配列番号1で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
(6)配列番号2で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
(7)配列番号3で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
(8)配列番号4で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
(9)配列番号1〜4のいずれかで表されるアミノ酸配列と80%以上、好ましくは90%、より好ましくは95%、さらに好ましくは98%、最も好ましくは99%の相同性を有し、かつ配列番号1〜4のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質と実質的に同一の活性を有する蛋白質
の活性が低下または喪失した微生物をあげることができる。
翻訳調節領域としては、染色体DNA上における翻訳領域の5’末端より上流側30塩基からなるDNAをあげることができ、好ましくは上流側10塩基からなるDNAをあげることができる。
微生物細胞としては、好ましくコリネバクテリウム属に属する微生物をあげることができ、野生株であってもよいし、該野生株からL‐グルタミンを効率よく生成するように育種された育種株でもよい。
L−グルタミンの生合成を制御する機構の少なくとも1つを緩和または解除した微生物としては、例えばアデニリル化によりグルタミンシンテターゼの制御を行なうグルタミンシンテターゼ・アデニリルトランスフェラーゼの活性が低下したコリネ型細菌[FEMS Microbiology Letters, 201, 91 (2001)、特開2002-300887号]、アデニリル化を受けるグルタミンシンテターゼの405番目のアミノ酸が置換したコリネ型細菌[FEMS Microbiology Letters, 201, 91 (2001)、特開2003-164297号]、およびPIIタンパク質の活性が低下したコリネ型細菌[FEMS Microbiology Letters, 173, 303 (1999)、特開2002-300887号]をあげることができる。野生型株に比べL−グルタミンアナログに対する耐性度が高い細胞株を選択して得られる微生物としては、例えばアザセリン耐性を付与したコリネ型細菌[特開昭55-148094号]、6−ジアゾ−5−オキソ−ノルロイシン耐性を付与したコリネ型細菌[特開平3-232497号]などが知られている。
2.本発明のL‐グルタミンの製造法
上記1の方法で調製することができる微生物を培地に培養し、培養物中にL−グルタミンを生成、蓄積させ、該培養物からL−グルタミンを採取することにより、L‐グルタミンを製造することができる。
炭素源としては、使用する微生物の資化できる炭素源であればいずれでもよく、例えばグルコース、糖蜜、フラクトース、シュークロース、マルトース、でんぷん加水分解物等の糖類、エタノール、グリセロールのようなアルコール類、酢酸、乳酸、コハク酸等の有機酸類などをあげることができる。
無機塩としては、リン酸第一水素カリウム、リン酸第二水素カリウム、硫酸アンモニウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、炭酸カルシウム等を用いることができる。
培養物中に蓄積したL−グルタミンは、通常の精製方法によって採取することができる。例えばL−グルタミンは、培養後、遠心分離などで菌体や固形物を除いたあと、活性炭処理、イオン交換樹脂処理、濃縮、結晶分別等の公知の方法を併用することによって採取することができる。
(1)染色体DNA相同組換え用ベクターpdXの作製
まず、TAクローニング法[Molecular cloning, a laboratory manual, Third Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)、以下、モレキュラー・クローニング第3版と略す]により、染色体組換え用断片をプラスミドpESB30にクローニングした。
使用したコリネバクテリウム・グルタミクムの野生株ATCC13032株の染色体DNAは、斉藤らの方法[Biochim.Biophys.Acta,72,619(1963)]により調製した。
該5.3kbのDNA断片の両末端をDNA Blunting Kit(タカラバイオ社製)を用い、添付のプロトコールに従って、平滑化した。該平滑化断片をフェノール・クロロホルム抽出及びエタノール沈殿により濃縮した後、Takara Ex Taq(タカラバイオ社製)および添付のバッファーを用いてdTTP存在下で70℃、2時間反応させ、3´末端にチミン1塩基が付加したDNA断片pESB30-Tを調製した。
各々のPCRにより得られた約0.7kbおよび約1.0kbの増幅産物を、各々Qiaquick PCR Purification Kit(Qiagen社製)を用いて精製した。
得られた約1.7kbのDNA断片をアガロースゲル電気泳動した後、GENECLEAN Kitを用いて抽出、精製した。
得られた結合産物を用い、常法に従って大腸菌DH5αを形質転換した。該形質転換体を、20μg/mlのカナマイシンを含むLB寒天培地に塗布後、30℃で一晩培養した。
生育した形質転換体を20μg/mlのカナマイシンを含むLB液体培地に植菌して30℃で一晩培養し、得られた培養液からアルカリSDS法によりプラスミドを抽出した。
(2)染色体DNA相同組換え用ベクターpdHの作製
コリネバクテリウム・グルタミクムATCC13032株の染色体DNA上の配列番号5の塩基番号1390から4424で表される塩基配列のうち、塩基番号2391から3424で表される領域を欠失させるためのプラスミドを(1)と同様の方法で作製した。
得られた約2.0kbのDNA断片をアガロースゲル電気泳動した後、GENECLEAN Kitを用いて抽出、精製した。
得られた結合産物を用い、常法に従って大腸菌DH5αを形質転換した。該形質転換体を、20μg/mlのカナマイシンを含むLB寒天培地に塗布後、30℃で一晩培養した。
生育した形質転換体を20μg/mlのカナマイシンを含むLB液体培地に植菌して30℃で一晩培養し、得られた培養液からアルカリSDS法によりプラスミドを抽出した。
(3)染色体DNA相同組換え用ベクターpdpGの作製
コリネバクテリウム・グルタミクムATCC13032株の染色体DNA上の配列番号5の塩基番号2977から6882で表される塩基配列のうち、塩基番号3627から5882で表される領域を欠失させるためのプラスミドを(1)と同様の方法で作製した。
得られた約1.7kbのDNA断片をアガロースゲル電気泳動した後、GENECLEAN Kitを用いて抽出、精製した。
得られた結合産物を用い、常法に従って大腸菌DH5αを形質転換した。該形質転換体を、20μg/mlのカナマイシンを含むLB寒天培地に塗布後、30℃で一晩培養した。
生育した形質転換体を20μg/mlのカナマイシンを含むLB液体培地に植菌して30℃で一晩培養し、得られた培養液からアルカリSDS法によりプラスミドを抽出した。
(4)染色体DNA相同組換え用ベクターpDGADの作製
コリネバクテリウム・グルタミクムATCC13032株の染色体DNA上の配列番号18で表される塩基配列のうち、塩基番号1001から4489で表される領域を欠失させるためのプラスミドを(1)と同様の方法で作製した。
得られた約2.0kbのDNA断片をアガロースゲル電気泳動した後、GENECLEAN Kitを用いて抽出、精製した。
得られた結合産物を用い、常法に従って大腸菌DH5αを形質転換した。該形質転換体を、20μg/mlのカナマイシンを含むLB寒天培地に塗布後、30℃で一晩培養した。
生育した形質転換体を20μg/mlのカナマイシンを含むLB液体培地に植菌して30℃で一晩培養し、得られた培養液からアルカリSDS法によりプラスミドを抽出した。
(5)染色体DNA相同組換え用ベクターpDGBの作製
コリネバクテリウム・グルタミクムGLA2株の染色体DNA上の配列番号18の塩基番号1847から2734で表される塩基配列を欠失させるためのプラスミドを(1)と同様の方法で作製した。
得られた約2.0kbのDNA断片をアガロースゲル電気泳動した後、GENECLEAN Kitを用いて抽出、精製した。
得られた結合産物を用い、常法に従って大腸菌DH5αを形質転換した。該形質転換体を、20μg/mlのカナマイシンを含むLB寒天培地に塗布後、30℃で一晩培養した。
生育した形質転換体を20μg/mlのカナマイシンを含むLB液体培地に植菌して30℃で一晩培養し、得られた培養液からアルカリSDS法によりプラスミドを抽出した。
(6)L−グルタミン生産菌GLA2への染色体欠失変異導入
プラスミドpdXが、コリネ型細菌内では自立複製できないことを利用し、以下の方法で、pdX中の組換え用DNA断片が、実験例で作製したL−グルタミン生産株であるコリネバクテリウム・グルタミクムGLA2株(GLA2の作製方法については後述する)の染色体DNA中に相同組換えにより組み込まれた株を選択した。
生育した該形質転換体のうちの1株から斉藤らの方法[Biochim.Biophys.Acta,72、619(1993)]により染色体DNAを調製し、得られた染色体DNAの構造をサザンハイブリダイゼーション[モレキュラー・クローニング第3版]により調べた結果、pdXがCampbellタイプの相同組み換えにより染色体に組み込まれていることが確かめられた。
SUC寒天培地で生育した1回組換え体から、斉藤らの方法により染色体DNAを調製した。得られた染色体DNAを鋳型として、配列番号6および9で表される塩基配列を有する合成DNAをプライマーとして、Pyrobest DNA Polymerase(タカラバイオ社製)と添付のバッファーを用いてPCRを行った。得られたPCR増幅断片の塩基配列を常法により決定し、GLA2株の染色体DNA上の配列番号5の塩基番号261から3389で表される塩基配列のうち、塩基番号1001から2389を欠失したDNA断片に置換されているGLA2X株を取得した。同様の方法でpdHを用いて配列番号5の塩基番号1390から4424で表される塩基配列のうち、塩基番号2391から3424で表される領域を欠失したDNA断片に置換されているGLA2H株を取得した。さらに同様の方法でpdpGを用いて配列番号5の塩基番号2977から6882で表される塩基配列のうち、塩基番号3627から5882で表される領域を欠失したDNA断片に置換されているGLA2PG株を取得した。
実施例1で得たGLA2X株、GLA2H株、GLA2PG株、GLA2GAD株、GLA2GB株、GLA2HGB株、およびこれらの親株であるGLA2株をそれぞれ種培地〔グルコース50g、肉エキス7g、ペプトン10g、塩化ナトリウム3g、硫酸アンモニウム5g、尿素5g、硫酸マグネシウム7水和物500mg、硫酸鉄7水和物50mg、チアミン塩酸塩500μg、ビオチン20μgを水1Lに含み、pH7.2に調整後、炭酸カルシウムを30g加えた培地〕8mlの入った試験管に接種し、30℃、220rpmの条件で16時間培養し、種培養液を得た。
結果を表1に示す。
[実験例]L‐グルタミン生産菌GLA2株の造成
(1)遺伝子置換用プラスミドpCglnA2の作製
配列番号27で表されるアミノ酸配列のN末端から第64番目のグルタミン酸がリジンに置換(Glu64Lys)されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするDNAを、PCRを用いる部位特異的変異法[モレキュラー・クローニング第3版]を用いて次のようにして取得した。
配列番号29で表される塩基配列の5’末端から1185〜1204番目の塩基配列の相補配列にBamHI認識配列を含むタグ配列を付加したDNA断片を合成し、その塩基配列を配列番号33に示した。
さらに、両精製物を鋳型とし、配列番号30で表される塩基配列を有するDNA断片と配列番号33で表される塩基配列を有するDNA断片をプライマーとして用いてPCRを行った。このPCRにより、配列番号27で表されるアミノ酸配列のN末端から第64番目のグルタミン酸をコードするコドン(gaa)がリジンをコードするコドン(aaa)に置換された約1.0kbのDNA断片を取得した。得られた約1.0kbのDNA断片をBamHI処理し、アガロースゲル電気泳動した後、GENECLEAN Kitを用いて抽出、精製した。
具体的にはpESB30をBamHIで切断後、アルカリフォスファターゼ処理を行ない、アガロースゲル電気泳動し、GENECLEAN Kitを用いてpESB30のBamHI処理断片を抽出、精製した。このpESB30断片と、上記で得られたBamHI処理した約1.0kbのDNA断片を混合し、ライゲーションキットver.1を用い、リガーゼ反応を行った。
該菌株を、20μg/mlのカナマイシンを含むLB寒天培地[バクトトリプトン(ディフコ社製)10g、酵母エキス(ディフコ社製)5g、塩化ナトリウム 10g、バクトアガー(ディフコ社製)16gを水1Lに含み、pH7.0に調整された培地]上で培養し、形質転換株を選択した。該形質転換株を20μg/mlのカナマイシンを含むLB培地で終夜培養し、得られた培養液からアルカリSDS法によりプラスミドを調製した。
(2)遺伝子発現用プラスミドpGlnA2の造成
配列番号27で表されるアミノ酸配列のN末端から第64番目のグルタミン酸がリジンに置換(Glu64Lys)されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするDNAを、(1)と同様の方法で取得した。
このpCS299P断片に上記で得られたBamHI処理した約1.9kbのDNA断片を(1)と同様の方法でクローン化した。
(3)遺伝子置換用プラスミドpCltsAの作製
配列番号36で表されるリゾチーム感受性に関わるポリペプチドのアミノ酸配列のN末端から第80番目のグリシンがアスパラギン酸に置換(Gly80Asp)されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするDNAを、(1)と同様の方法で取得した。同変異の導入によりリゾチーム感受性が付与されることが報告されている[BMC Biotechnol., 9, 1 (2001)]。
さらに、両精製物を鋳型とし、配列番号39で表される塩基配列を有するDNA断片と配列番号42で表される塩基配列を有するDNA断片をプライマーとして用いてPCRを行った。このPCRにより、配列番号36で表されるLtsAが有するアミノ酸配列のN末端から第80番目のグリシンをコードする領域(ggt)がアスパラギン酸をコードするコドン(gat)に置換された約1.0kbのDNA断片を取得した。この約1.0kbのDNA断片をBamHIで処理し(1)と同様の方法でpESB30にクローン化し、このプラスミドをpCltsAと命名した。
(4)L−グルタミン生産菌GLA2の造成
上記(1)で作製したプラスミドpCglnA2を用い、遺伝子置換法によってコリネバクテリウム・グルタミクム ATCC13032の染色体DNAにおいてグルタミンシンテターゼ2をコードする遺伝子に配列番号27で表されるアミノ酸配列のN末端から64番目のグルタミン酸をリジンに置換する変異(Glu64Lys)を導入した。
配列番号7−人工配列の説明:合成DNA
配列番号8−人工配列の説明:合成DNA
配列番号9−人工配列の説明:合成DNA
配列番号10−人工配列の説明:合成DNA
配列番号11−人工配列の説明:合成DNA
配列番号12−人工配列の説明:合成DNA
配列番号13−人工配列の説明:合成DNA
配列番号14−人工配列の説明:合成DNA
配列番号15−人工配列の説明:合成DNA
配列番号16−人工配列の説明:合成DNA
配列番号17−人工配列の説明:合成DNA
配列番号19−人工配列の説明:合成DNA
配列番号20−人工配列の説明:合成DNA
配列番号21−人工配列の説明:合成DNA
配列番号22−人工配列の説明:合成DNA
配列番号23−人工配列の説明:合成DNA
配列番号24−人工配列の説明:合成DNA
配列番号25−人工配列の説明:合成DNA
配列番号26−人工配列の説明:合成DNA
配列番号30−人工配列の説明:合成DNA
配列番号31−人工配列の説明:合成DNA
配列番号32−人工配列の説明:合成DNA
配列番号33−人工配列の説明:合成DNA
配列番号34−人工配列の説明:合成DNA
配列番号35−人工配列の説明:合成DNA
配列番号39−人工配列の説明:合成DNA
配列番号40−人工配列の説明:合成DNA
配列番号41−人工配列の説明:合成DNA
配列番号42−人工配列の説明:合成DNA
Claims (5)
- (1)配列番号1〜3のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、または(2)配列番号1〜3のいずれかで表されるアミノ酸配列と95%以上の同一性を有し、かつ配列番号1〜3のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質と同一の活性を有する蛋白質、の活性が低下または喪失しており、かつ(3)配列番号4で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、または(4)配列番号4で表されるアミノ酸配列と95%以上の同一性を有し、かつ配列番号4で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質と同一の活性を有する蛋白質、の活性が低下または喪失しているコリネバクテリウム属に属する微生物。
- コリネバクテリウム属に属する微生物が、コリネバクテリウム・グルタミクムである、請求項1に記載の微生物。
- 請求項1に記載の微生物、または以下の(1)または(2)より選ばれる1つ以上の蛋白質の活性が低下、または喪失しているコリネバクテリウム属に属する微生物を培地に培養し、該培養物中にL−グルタミンを生成、蓄積させ、該培養物中からL−グルタミンを採取することを特徴とする、L−グルタミンの製造法。
(1)配列番号4で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
(2)配列番号4のアミノ酸配列と95%以上の同一性を有し、かつ(1)の蛋白質と同一の活性を有する蛋白質 - 請求項3に記載の前記(1)または(2)より選ばれる1つ以上の蛋白質の活性が低下、または喪失しているコリネバクテリウム属に属する微生物が、さらに以下の(1)〜(4)より選ばれる1つ以上の蛋白質の活性が低下、または喪失しているコリネバクテリウム属に属する微生物である、請求項3に記載のL−グルタミンの製造法。
(1)配列番号1で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
(2)配列番号2で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
(3)配列番号3で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
(4)配列番号1〜3のいずれかのアミノ酸配列と95%以上の同一性を有し、かつ(1)〜(3)のいずれかの蛋白質と同一の活性を有する蛋白質 - コリネバクテリウム属に属する微生物が、コリネバクテリウム・グルタミクムである、請求項3または4に記載のL−グルタミンの製造法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2008532121A JP5064396B2 (ja) | 2006-09-01 | 2007-08-30 | L‐グルタミンの製造法 |
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2006237332 | 2006-09-01 | ||
JP2006237332 | 2006-09-01 | ||
PCT/JP2007/066910 WO2008026698A1 (fr) | 2006-09-01 | 2007-08-30 | Procédé de production d'acide l-glutamique |
JP2008532121A JP5064396B2 (ja) | 2006-09-01 | 2007-08-30 | L‐グルタミンの製造法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2008026698A1 JPWO2008026698A1 (ja) | 2010-01-21 |
JP5064396B2 true JP5064396B2 (ja) | 2012-10-31 |
Family
ID=39135980
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2008532121A Active JP5064396B2 (ja) | 2006-09-01 | 2007-08-30 | L‐グルタミンの製造法 |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US8187843B2 (ja) |
EP (2) | EP2062975B1 (ja) |
JP (1) | JP5064396B2 (ja) |
WO (1) | WO2008026698A1 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US10023888B2 (en) | 2014-10-08 | 2018-07-17 | Cj Cheiljedang Corporation | Microorganism for producing L-glutamine and method for producing L-glutamine using same |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2496867C2 (ru) | 2011-04-25 | 2013-10-27 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") | Способ получения l-аминокислоты семейства глутамата с использованием коринеформной бактерии |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2000270872A (ja) * | 1999-03-25 | 2000-10-03 | Ajinomoto Co Inc | L−グルタミン酸の製造法 |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS55148094A (en) | 1979-05-07 | 1980-11-18 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | Preparation of l-glutamine by fermentation |
JPH03232497A (ja) | 1990-02-08 | 1991-10-16 | Asahi Chem Ind Co Ltd | 発酵法によるl―グルタミンの製造方法 |
EP1111052B8 (en) * | 1998-09-04 | 2008-04-30 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Lysozyme insensitivity conferring gene |
US6893848B1 (en) | 1999-04-19 | 2005-05-17 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Desensitized aspartokinase |
JP4623825B2 (ja) | 1999-12-16 | 2011-02-02 | 協和発酵バイオ株式会社 | 新規ポリヌクレオチド |
JP4560998B2 (ja) | 2001-02-05 | 2010-10-13 | 味の素株式会社 | 発酵法によるl−グルタミンの製造法及びl−グルタミン生産菌 |
RU2230114C2 (ru) | 2001-11-30 | 2004-06-10 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" | Мутантная глутаминсинтетаза, фрагмент днк, штамм escherichia coli - продуцент l-глутамина и способ получения l-аминокислот |
-
2007
- 2007-08-30 EP EP07806387.2A patent/EP2062975B1/en active Active
- 2007-08-30 US US12/439,300 patent/US8187843B2/en active Active
- 2007-08-30 WO PCT/JP2007/066910 patent/WO2008026698A1/ja active Application Filing
- 2007-08-30 EP EP13157891.6A patent/EP2612915B1/en active Active
- 2007-08-30 JP JP2008532121A patent/JP5064396B2/ja active Active
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2000270872A (ja) * | 1999-03-25 | 2000-10-03 | Ajinomoto Co Inc | L−グルタミン酸の製造法 |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US10023888B2 (en) | 2014-10-08 | 2018-07-17 | Cj Cheiljedang Corporation | Microorganism for producing L-glutamine and method for producing L-glutamine using same |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP2062975A1 (en) | 2009-05-27 |
EP2062975B1 (en) | 2013-10-09 |
US20110124059A1 (en) | 2011-05-26 |
JPWO2008026698A1 (ja) | 2010-01-21 |
EP2062975A4 (en) | 2011-09-21 |
EP2612915A1 (en) | 2013-07-10 |
US8187843B2 (en) | 2012-05-29 |
EP2612915B1 (en) | 2015-04-08 |
WO2008026698A1 (fr) | 2008-03-06 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP4881739B2 (ja) | L−アルギニン、l−オルニチンまたはl−シトルリンの製造法 | |
JP4595506B2 (ja) | L−アミノ酸生産菌及びl−アミノ酸の製造方法 | |
US11555213B2 (en) | Nucleic acid encoding a modified homoserine dehydrogenase | |
JP2017023147A (ja) | 発酵法による目的物質の製造法 | |
AU2022211934A1 (en) | Prephenate dehydratase variant and method for producing branched-chain amino acid using same | |
JP2023540315A (ja) | L-グルタミン酸生産組換え微生物及びそれを用いたl-グルタミン酸製造方法 | |
JP5064396B2 (ja) | L‐グルタミンの製造法 | |
JP4152320B2 (ja) | アミノ酸の製造法 | |
JP2017513529A (ja) | ジアミンを生産する微生物及びそれらを用いてジアミンを生産する方法 | |
KR20230092008A (ko) | L-아미노산의 제조법 | |
US9023622B2 (en) | Method for producing L-amino acid using a microorganism with decreased aspartate aminotransferase activity | |
CN115003807A (zh) | 新半胱氨酸亚磺酸脱硫酶变体及使用其生产l-缬氨酸的方法 | |
JP2018517411A (ja) | O−アセチルホモセリンを生産する微生物及びそれを用いてo−アセチルホモセリンを生産する方法 | |
JP2023506053A (ja) | クエン酸シンターゼの活性が弱化した新規な変異型ポリペプチド及びそれを用いたl-アミノ酸生産方法 | |
JPWO2013154182A1 (ja) | アミノ酸の製造法 | |
CN114765989B (zh) | 新3-磷酸甘油醛脱氢酶变体及使用其生产l-缬氨酸的方法 | |
KR102679080B1 (ko) | 변이형 atp-의존적 프로테아제 및 이를 이용한 l-아미노산의 생산 방법 | |
JP2024526994A (ja) | LacI系DNA結合転写調節因子の活性が弱化した微生物およびこれを用いたL-グルタミン酸の生産方法 | |
CN115485373A (zh) | 新二氢硫辛酰胺乙酰基转移酶变体及使用其生产l-缬氨酸的方法 | |
CN114981293A (zh) | 新引发体组装蛋白变体及使用其生产l-赖氨酸的方法 | |
KR20230167496A (ko) | L-오르니틴 생산능을 가지는 미생물 및 이를 이용한 l-오르니틴 생산방법 | |
JP2024531681A (ja) | LysE変異体及びそれを用いたL-アルギニン生産方法 | |
JP2023511882A (ja) | L-分枝鎖アミノ酸生産能が強化された微生物及びそれを用いてl-分枝鎖アミノ酸を生産する方法 | |
CN115335515A (zh) | 新2-异丙基苹果酸合酶变体及使用其生产l-缬氨酸的方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20100820 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20120515 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20120629 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20120724 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20120808 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5064396 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20150817 Year of fee payment: 3 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |