JP4771437B2

JP4771437B2 - 増加したコハク酸産生を有する変異Ｅ．ｃｏｌｉ株

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Publication number: JP4771437B2
Application number: JP2007530238A
Authority: JP
Inventors: カ−イウサン，; ジョージエヌベネット，; エイレンサンチェス，
Original assignee: ライスユニバーシティー
Priority date: 2004-08-27
Filing date: 2005-08-29
Publication date: 2011-09-14
Anticipated expiration: 2025-08-29
Also published as: WO2006031424A3; US7223567B2; EP1781797B1; WO2006031424A2; EP3130676A1; KR101245428B1; KR20070053716A; CN101044245B; EP1781797A4; EP1781797A2; CN101044245A; US20070184539A1; US7790416B2; US20060046288A1; JP2008516585A; BRPI0514734B1; BRPI0514734A

Description

（発明の分野）
本発明は、代謝的に操作された微生物において、コハク酸、リンゴ酸、フマル酸、および他のカルボン酸を産生する方法に関する。

（発明の背景）
価値の高い特殊化学製品であるコハク酸およびその誘導体は、広範な産業的用途を有する。コハク酸は、食物、医薬、プラスチック、化粧品、および織物の原料として、ならびに被覆および廃棄ガス洗浄において、使用されている（非特許文献１）。コハク酸は、１，４−ブタンジオール（ＢＤＯ）、テトラヒドロフラン、およびγ−ブチロラクトンのようなプラスチック前駆体のための原材料として機能し得る。さらに、コハク酸およびＢＤＯは、ポリエステル用のモノマーとして使用され得る。コハク酸のコストが減少すれば、コハク酸は、他の大量の化学品を製造するための中間原材料としてより有用になる（４７）。コハク酸と共に、他の４炭素ジカルボン酸（例えば、リンゴ酸およびフマル酸）もまた、原材料としてのポテンシャルを有する。

コハク酸、リンゴ酸およびフマル酸の、グルコース、キシロース、ソルビトールおよび他の「緑色の」再生可能な原材料（この場合には、醗酵プロセスによって）からの産生は、再生可能ではない供給源からそのような酸を誘導するよりエネルギーの激しい方法に代わる方法である。コハク酸は、プロピオン酸産生細菌による嫌気醗酵のための中間体であるが、このプロセスは、低収率および低濃度しかもたらさない。酸の混合物がＥ．ｃｏｌｉ醗酵から産生されることは、長く知られていた。しかしながら、醗酵される各モルのグルコースに対して、１．２モルのギ酸、０．１〜０．２モルの乳酸、および０．３〜０．４モルのコハク酸しか産生されない。したがって、醗酵的にカルボン酸を産生させるための取り組みは、所望の産物には変換されない比較的大量の増殖基質（例えば、グルコース）をもたらす。

コハク酸の収率および生産性を増加させるためにＥ．ｃｏｌｉの嫌気中心代謝経路を代謝的に操作する多数の試みが、行われている（７、８、１２、１４、１５、２０、２４、３２、４４、４８）。産生条件の最適化と組み合わせた遺伝子操作もまた、コハク酸産生を増加させることが示されている。１つの例は、二相醗酵（ｄｕａｌｐｈａｓｅｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ）産生様式を使用するコハク酸産生変異Ｅ．ｃｏｌｉ株の増殖である。この二相醗酵産生様式は、最初の好気増殖相と、続く嫌気産生相とを含むか、または／かつ二酸化炭素、水素または両方のガスの混合物を使用する嫌気醗酵の上部空間条件を変化させることによる（特許文献１、非特許文献２）。

具体的には、特定の経路の増幅、付加または低減によって酵素レベルを操ることによって、高収率の所望の産物がもたらされ得る。Ｅ．ｃｏｌｉの混合酸醗酵経路を使用する、嫌気条件下でのコハク酸産生のための種々の遺伝的改善が、記載されている。１つの例は、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ｐｅｐｃ）の過剰発現である（３４）。別の例では、フマル酸のコハク酸への変換は、Ｅ．ｃｏｌｉにおける元来のフマル酸レダクターゼ（ｆｒｄ）の過剰発現によって改善される（１７、５３）。特定の酵素は、Ｅ．ｃｏｌｉに固有のものではないが、コハク酸産生を増加させるのを潜在的に助け得る。Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍｅｔｌｉ由来のピルビン酸カルボキシラーゼ（ｐｙｃ）をＥ．ｃｏｌｉに導入することによって、コハク酸産生が強化された（非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５）。他の代謝操作戦略としては、コハク酸の競合経路を不活性化することが挙げられる。不活性化されたピルビン酸ギ酸リアーゼ（ｐｆｌ）および乳酸デヒドロゲナーゼ（Ｉｄｈ）遺伝子を有する宿主においてリンゴ酸酵素を過剰発現させると、コハク酸が主要な醗酵産物になった（非特許文献６、非特許文献７）。同じ変異株（ｐｆｌ−かつＩｄｈ−）における不活性グルコースホスホトランスフェラーゼ系（ｐｔｓＧ）もまた、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるより高い収率のコハク酸産生および増殖の向上をもたらすことが示された（非特許文献８）。

嫌気条件下でのグルコースからのコハク酸の最大の理論的収率（モルベース）は、全ての炭素フラックスが本来のコハク酸醗酵経路を通ると仮定すると、１モル／モルに制限される（図１）。この醗酵性経路は、オキサロ酢酸（ＯＡＡ）をリンゴ酸、フマル酸、次いでコハク酸に変換し、そしてこの経路は、産生されるコハク酸当たり２モルのＮＡＤＨを必要とする。醗酵性経路による高いコハク酸収率の１つの大きな障害は、ＮＡＤＨ制限に起因する。これは、１モルのグルコースは、解糖系を通るとわずか２モルのＮＡＤＨしか提供しないからである；しかしながら、本来の醗酵性経路を通るコハク酸の１モルの形成には、２モルのＮＡＤＨが必要である。コハク酸の嫌気産生はまた、遅い細胞増殖および産生の制限によっても束縛される。

代謝的操作は、代謝経路のスループットを操ることによって、プロセスの生産性をかなり改善するポテンシャルを有する。具体的には、特定の経路の増幅、付加または欠失による酵素レベルを操ることが、高収率の所望の産物をもたらし得る。当該分野で必要とされているのは、従来提供されていたものよりも高レベルのコハク酸および他のカルボン酸を産生する改善された細菌株である。
Ｎｇｈｉｅｍら、米国特許第５，８６９，３０１号Ｚｅｉｋｕｓら、Ａｐｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９９）５１：５４５−５２Ｖｅｍｕｒｉら、Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００２）２８：３２５−３２Ｇｏｋａｒｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｌｅｔ．（１９９８）２０：７９５−８Ｇｏｋａｒｎら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（２０００）６６：１８４４−５０Ｇｏｋａｒｎら、Ａｐｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００１）５６：１８８−９５ＳｔｏｌｓおよびＤｏｎｎｅｌｌｙ、Ａｐｐ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９７）６３：２６９５−７０１ＨｏｎｇおよびＬｅｅ，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００２）５８：２８６−９０Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅら、ＡｐｐｌＥｎｖｉｒｏｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．（２００１）６７：１４８−５４

嫌気条件下でのカルボン酸産生を改善するために不活性化された２つより多い経路タンパク質を有する細菌が記載される。ここで、産生されるカルボン酸は、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸、オキサロ酢酸またはグリオキシル酸である。本発明の１つの実施形態において、タンパク質ＡＤＨＥ、ＬＤＨＡ、ＡＣＫＡ、ＰＴＡ、ＩＣＬＲおよびＡＲＣＡが不活性化される。本発明の別の実施形態において、ＡＤＨＥ、ＬＤＨＡ、ＡＣＫＡ、ＰＴＡ、ＩＣＬＲ、およびＡＲＣＡを含むタンパク質の種々の組み合わせが、不活性化される。これらのタンパク質の不活性化はまた、ＡＣＥＡ、ＡＣＥＢ、ＡＣＥＫ、ＰＥＰＣ、ＰＹＣ、またはＣＩＴＺの過剰発現と組み合わされ得る。

本発明の１つの実施形態において、破壊株が作製され、ここで、ａｄｈＥ、ｉｄｈＡ、ｉｃｌＲ、ａｒｃＡ、およびａｃｋ−ｐｔａ遺伝子が破壊される。本発明の別の実施形態において、ａｄｈＥ、ＩｄｈＡ、ｉｃｌＲ、ａｒｃＡ、およびａｃｋ−ｐｔａ遺伝子の組み合わせが破壊される。ＳＢＳ３３０ＭＧ、ＳＢＳ４４０ＭＧ、ＳＢＳ５５０ＭＧ、ＳＢＳ６６０ＭＧ、およびＳＢＳ９９０ＭＧと命名された変異株が、本発明のいくつかの実施形態を提供する。

さらに、変異株を用いてカルボン酸を産生する嫌気的方法が記載される。この方法は、培地に上述の変異細菌株を接種する工程、この細菌株を嫌気条件下で培養する工程、および媒体からカルボン酸を単離する工程を包含する。細菌株は、フラスコ、バイオリアクター、流加バイオリアクター、またはケモスタットバイオリアクターにおいて培養され得、カルボン酸を得ることができる。カルボン酸の収率は、嫌気条件下でのコハク酸産生の前に、好気条件下でその細胞を培養することによって、さらに増加され得る。

さらに、ＯＡＡ−クエン酸およびＯＡＡ−リンゴ酸経路を通るカルボン酸を分配するための、細菌における解糖フラックスを変更することが、実証される。解糖フラックスは、１０〜４０％の間のクエン酸および９０〜６０％の間のリンゴ酸、より好ましくは約３０％のクエン酸および約７０％のリンゴ酸の比率であり得る。上述の細菌株は、この様式で解糖フラックスを分配している。

（発明の実施形態の説明）
本明細書中に記載されるカルボン酸は、構造、ｐＨおよび存在するイオンによって、塩、酸、塩基または誘導体であり得る。例えば、用語「コハク酸（ｓｕｃｃｉｎａｔｅ）」および「コハク酸（ｓｕｃｃｉｎｉｃａｃｉｄ）」は、本明細書中で互換的に使用される。コハク酸はまた、ブタン二酸（Ｃ_４Ｈ_６Ｏ_４）とも呼ばれる。本明細書中に記載される化学物質としては、ギ酸、グリオキシル酸、乳酸、リンゴ酸、オキサロ酢酸（ＯＡＡ）、ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）、およびピルビン酸が挙げられる。Ｋｒｅｂｓ回路（クエン酸回路、トリカルボン酸回路またはＴＣＡサイクルとも呼ばれる）を含む細菌の代謝経路は、ＬｅｈｎｉｎｇｅｒによるＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙならびに他の生化学の文献において見ることができる。

本明細書中で使用される場合、用語「操作可能に結合された」または「操作可能に連結された」とは、機能的に連結された核酸配列をいう。

「低下した活性」または「不活性」は、本明細書中では、適切なコントロール種と比較して、タンパク質活性における少なくとも７５％の低下であると定義される。好ましくは、活性における少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％の低下に達し、最も好ましい実施形態では、その活性は排除（１００％）される。タンパク質は、インヒビターで、変異によって、または発現または翻訳の抑制などによって不活性化され得る。

「過剰発現」または「過剰発現した」とは、本明細書中では、適切なコントロール種と比較して、少なくとも１５０％のタンパク質活性であると定義される。過剰発現は、タンパク質を変異させて、より活性な形態または阻害に耐性な形態を生み出すことによって、インヒビターを除去することによって、またはアクチベーターを付加することなどによって、達成され得る。過剰発現はまた、リプレッサーを除去することによって、細胞に多コピーの遺伝子を加えることによって、または内在性遺伝子をアップレギュレートすることなどによっても、達成され得る。

本明細書中で使用される場合、用語「破壊」および「破壊株」は、本来の遺伝子またはタンパク質が、その遺伝子の活性を減少させるように、変異、欠失、挿入、またはダウンレギュレートされている細胞株をいう。遺伝子は、全ゲノムＤＮＡ配列のノックアウトまたは除去によって、完全に（１００％）低減され得る。フレームシフト変異、早期ストップコドン、致命的な残基の点変異、または欠失もしくは挿入などは、活性タンパク質の転写および／または翻訳を完全に妨げることによって、遺伝子産物を完全に（１００％）不活性化し得る。

本明細書中で使用される場合、「組み換え」は、遺伝子操作された物質に関連するか、遺伝子操作された物質に由来するか、または遺伝子操作された物質を含む。

遺伝子は、以下のように略される：イソクエン酸リアー（ａｃｅＡａ．ｋ．ａ．ｉｃｔ）；リンゴ酸シンターゼ（ａｃｅＢ）；グリオキシル酸分路オペロン（ｔｈｙｇｌｙｏｘｙｌａｔｅｓｈｕｎｔｏｐｅｒｏｎ）（ａｃｅＢＡＫ）；イソクエンデヒドロゲナーゼキナーゼ／ホスホリラーゼ（ａｃｅＫ）；酢酸キナーゼホスホトランスアセチラーゼ（ａｃｋＡ−ｐｔａ）；アルコールデヒドロゲナーゼ（ａｄｈＥ）；好気呼吸コントロールレギュレーターＡおよびＢ（ａｒｃＡＢ）；過酸化物感受性（ａｒｇ−ｌａｃ）；アルコールアセチルトランスフェラーゼ１および２（ａｔｆｌおよびａｔｆ２）；推定カダベリン／リジンアンチポーター（ｃａｄＲ）；クエン酸シンターゼ（ｃｉｔＺ）；脂肪酸分解レギュロン（ｆａｄＲ）；フマル酸レダクターゼ（ｆｒｄ）；フルクトースレギュロン（ｆｒｕＲ）；フマラーゼＡ、Ｂ、またはＣ（ｆｕｍＡＢＣ）；イソクエンデヒドロゲナーゼ（ｉｃｄ）；イソクエン酸リアーゼ（ｉｃｆ）；ａｃｅＢＡＫオペロンリプレッサー（ｉｃｌＲ）；乳酸デヒドロゲナーゼ（ｉｄｈＡ）；リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ｍｄｈ）；ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ｐｅｐＣ）；ピルビン酸ギ酸リアーゼ（ｐｆｌ）；ピルビン酸オキシダーゼ（ｐｏｘＢ）；ホスホトランスフェラーゼ系遺伝子ＦおよびＧ（ＰＴＳＦおよびＰＴＳＧ）；ピルビン酸カルボキシラーゼ（ｐｙｃ）；グアノシン３’，５’−ビスリン酸シンターゼＩ（ｒｅｌＡｌ）；リボソームタンパク質Ｓ１２（ｒｐｓＬ）；ならびにコハク酸デヒドロゲナーゼ（ｓｄｈ）。Δｌａｃ（ａｒｇ−ｌａｃ）２０５（Ｕｌ６９）は、Ｈ２Ｏ２に対して細胞を感受性にする遺伝子を保持するａｒｇ−ｌａｃ領域の染色体欠失である（５１）。ＰＹＣは、種々の種に由来しており、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓのｐｙｃが１つの例（ＡＦ０６８７５９）として発現されている。

略語：アンピシリン（Ａｐ）；オキサシリン（Ｏｘ）；カルベニシリン（Ｃｎ）；クロラムフェニコール（Ｃｍ）；カナマイシン（Ｋｍ）；ストレプトマイシン（Ｓｍ）；テトラサイクリン（Ｔｃ）；ナリジクス酸（Ｎａｌ）；エリスロマイシン（Ｅｍ）；アンピシリン耐性（Ａｐ^Ｒ）；チアンフェニコール／クロラムフェニコール耐性（Ｔｈｉ^Ｒ／Ｃｍ^Ｒ）；マクロライド、リンコサミドおよびストレプトアビジンＡ耐性（ＭＬＳ^Ｒ）；ストレプトマイシン耐性（Ｓｍ^Ｒ）；カナマイシン耐性（Ｋｍ^Ｒ）；グラム陰性菌複製起点（ＣｏｌＥ１）；グラム陽性菌複製起点（ＯｒｉＩＩ）。一般的な制限酵素および制限酵素部位は、ＮＥＢ（登録商標）（ＮＥＷＥＮＧＬＡＮＤＢＩＯＬＡＢＳ（登録商標）、ｗｗｗ．ｎｅｂ．ｃｏｍ）およびＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ（登録商標）（ｗｗｗ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ）において見ることができる。ＡＴＣＣ（登録商標）、ＡＭＥＲＩＣＡＮＴＹＰＥＣＵＬＴＵＲＥＣＯＬＬＥＣＴＩＯＮ^ＴＭ（ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ）。

本発明の特定の実施形態において使用されるプラスミドおよび株は、表１および表２に記載される。ＭＧ１６６５は、Ｆ接合型欠損のＦ⁻γ⁻自然突然変異であり、Ｇｕｙｅｒら（１８）に報告されるとおりである。経路の欠失は、Ｐ１ファージ形質導入およびλｒｅｄリコンビナーゼに基づく一工程不活性化を使用して実施した。プラスミドおよび変異Ｅ．ｃｏｌｉ株の構築は、本明細書中で参照され、Ｓａｍｂｒｏｏｋ（３８）およびＡｕｓｅｂｅｌ（５）において記載されている標準的な生化学技術を使用して実施した。

各実験について、適切な場合は、上記の株をプラスミドで新しく形質転換した。シングルコロニーを適切な抗生物質を含有するプレート上に再びストリークした。シングルコロニーを、５０ｍｌのＬＢ培地を適切な抗生物質と一緒に含んでいる２５０ｍｌ攪拌フラスコに移し、２５０ｒｐｍで１２時間攪拌しながら３７℃で好気的に増殖させた。細胞をＬＢ培地で２回洗浄し、適切な抗生物質濃度を有する各４００ｍｌのＬＢ培地を含む２Ｌの攪拌フラスコ内で１％ｖ／ｖでインキュベートし、２５０ｒｐｍで１２時間攪拌しながら３７℃で好気的に増殖させた。適切な細胞バイオマス（約１．４ｇＣＤＷ）を遠心分離によって収集し、その上清を廃棄した。この細胞を６０ｍｌの嫌気性ＬＢ培地（２０ｇ／Ｌのグルコース、１ｇ／ＬのＮａＨＣＯ_３を補充したＬＢブロス培地）に再懸濁し、直ちにリアクターに約１０ＯＤ_６００の濃度で接種した。

醗酵は、完全に嫌気的な条件下で行った。１Ｌのバイオリアクターに、適切な抗生物質を含む０．６６ＬのＬＢ培地の初期容量を含めた。０時点において、このリアクターは、記載されたように約１０のＯＤ_６００に接種された。リアクターにおける記載されたグルコース、抗生物質および細胞密度の初期濃度は、種菌が培養濃度を変化させるのに十分なときには、その種菌による希釈を考慮に入れた後の濃度である。ｐＨは、１．０ＭのＮａ_２ＣＯ_３で７．０に維持し、醗酵期間の間、０．２Ｌ／分のＣＯ_２の一定の流量を、培地を通して散布した。温度および攪拌は、それぞれ３７℃および２５０ｒｐｍに維持した。グルコースおよび産物濃度の決定のためのサンプルは、リアクターから回収し、０．２μｍフィルターを通して濾過して直ちにＨＰＬＣによって分析した。

（実施例１：ＮＡＤＨ競合経路の除去）
アルコールデヒドロゲナーゼ（ａｄｈＥ）および乳酸デヒドロゲナーゼ（ｉｄｈＡ）活性を、ＳＢＳ１１０ＭＧにおいて低減させ、コハク酸を犠牲にしてアルコールおよび乳酸を産生するためのＮＡＤＨの損失に取り組んだ（３９）。ＳＢＳ１１０ＭＧ（ｐＴｒｃ９９Ａ）は、１１％の初期グルコースを消費し、低いコハク酸収率および高い酢酸収率を有した。

（実施例２：ピルビン酸カルボキシラーゼの発現）
Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓ（プラスミドｐＨＬ４１３）由来の異種ＰＹＣの発現は、ピルビンさんのＯＡＡへの直接的な変換によってＯＡＡプールを増加させるのを助ける。ＯＡＡは、グリオキシル酸および醗酵経路の前駆体として機能し、これらはいずれも、図１に示されるようにコハク酸酸性をもたらす。
ＳＢＳ９９０ＭＧ株は、予測されたように、活性ｉｃｌＲに起因して、ＳＢＳ３３０ＭＧ（ｐＨＬ４１３）およびＳＢＳ５５０ＭＧ（ｐＨＬ４１３）よりも低いＩＣＬおよびＭＳ活性を示したが、基礎的な酵素レベルは、グリオキシル酸経路を駆動するのに十分なようである。

コハク酸酸性Ｅ．ｃｏｌｉ株におけるＰＹＣの異種発現は、ピルビン酸からＯＡＡへのフラックスを増加させる。ＰＹＣは、ピルビン酸をＯＡＡに回し、コハク酸産生を優先させる。Ｌ．ｌａｃｔｉｓ由来の異種ピルビン酸カルボキシラーゼをコードするプラスミドｐＨＬ４１３を保持するＳＢＳ１１０ＭＧは、ＣＯ_２大気における２４時間の培養あと、１８．７ｇ／Ｌ（１０４ｍＭ）のグルコースから１５．６ｇ／Ｌ（１３２ｍＭ）のコハク酸を産生した。この収率は、グルコース１モル当たり１．３モルのコハク酸であった。コハク酸産生を増加させるためのＯＡＡの増加の有効性が実証された。

（実施例３：グリオキシル酸分路の活性化）
ＩＣＬＲの不活性化は、ａｃｅＢＡＫオペロンの活性化によってアセチルＣｏＡをコハク酸の産生へと回し、それによって、酢酸を通る炭素フラックスを減少させ、アセチルＣｏＡの再利用を続ける。ＳＢＳ３３０ＭＧ（ｐＨＬ４１３）ＡＣＫ−ＰＴＡ株は、活性であり、それゆえこの経路が遺伝的に活性化されているときでさえ、ほとんど炭素の流れがグリオキシル酸に回らない。グリオキシル酸経路の活性は、野生型コントロールに対してこの株によって示されるより高い酵素活性によって証明される（データは示さず）。より高いＩＣＬおよびＭＳ活性を有する株は、ＳＢＳ３３０ＭＧ（ｐＨＬ４１３）およびＳＢＳ５５０ＭＧ（ｐＨＬ４１３）であった。これらの株は、野生型株の２倍を超える活性を示した。ＳＢＳ３３０ＭＧ株は、ａｄｈ、ｌｄｈ変異株のＳＢＳ１１０ＭＧにおいてｉｃｌＲ遺伝子の不活性化により、中間株として作製した。ｌｄｈＡａｄｈＥ変異株において、アセチル−ＣｏＡは、グリオキシル酸経路に回され、それゆえ酢酸の排出を減少させる。この株においてグリオキシル酸経路が継続的に活性化されているときでさえ、アセチル−ＣｏＡは、酢酸経路を通って供給される。

図３において見られるように、ＳＢＳ３３０ＭＧ株は、グルコース１モル当たり１．１モルのコハク酸、グルコース１モル当たり０．６６モルのギ酸、およびグルコース１モル当たり０．８９モルの酢酸を産生する。ＳＢＳ３３０ＭＧ（ｐＨＬ４１３）はかなりのコハク酸を産生するが、この株はまた、最高レベルのギ酸および酢酸も産生する。

（実施例４：好気呼吸制御の除去）
ＡＲＣＡタンパク質は、二成分（ＡＲＣＢ−ＡＲＣＡ）シグナル伝達系ファミリーに属し、同属の感覚性キナーゼであるＡＲＣＢと協働して、多くのオペロン（例えば、プラビンタンパク質クラスのいくつかのデヒドロゲナーゼ、末端オキシダーゼ、トリカルボン酸サイクル、グリオキシル酸分路の酵素および脂肪酸分解のための経路の酵素）の発現を負または正に制御する、全体的な調節系を代表する。変異株ＳＢＳ４４０ＭＧＣは、好気呼吸の制御に関与するタンパク質をコードする遺伝子である、ａｒｃＡの変異バージョンを含む。

ＳＢＳ４４０ＭＧＣ株におけるａｒｃＡの欠失は、図３において見られるように、グルコース１モル当たり１．０２モルのコハク酸、グルコース１モル当たり０．４５モルのギ酸、およびグルコース１モル当たり０．７５モルの酢酸を産生した。ＡＲＣＡの除去は、グルコース消費には劇的には影響しなかったが（図２）、全体的なコハク酸収率をわずかに減少させた（図３）。

（実施例５：酢酸産生の低減）
ＳＢＳ９９０ＭＧＣ株において、酢酸キナーゼホスホトランスアセチラーゼ（ａｃｋＡ−ｐｔａ）を、アルコールデヒドロゲナーゼ（ａｄｈＥ）および乳酸デヒドロゲナーゼ（ｉｄｈＡ）の背景において低減し、コハク酸産生を増加させ、エタノールおよび乳酸産生によるＮＡＤＨ消費を減少させた。ａｃｋおよびｐｔａ遺伝子の欠失により、主要な酢酸形成経路は排除される。変異株ＳＢＳ９９０ＭＧはａｄｈＥ、ｌｄｈＡおよびａｃｋ−ｐｔａ欠失を含むが、ＳＢＳ９９０ＭＧはなおインタクトのｉｃｌＲを有する。活性なＩＣＬＲはＡＣＥＢＡＫ発現を低下させ得るが、残ったＡＣＥＡおよびＡＣＥＢ酵素活性はなお、残ったグリオキシル酸分路活性を可能にする。

ＳＢＳ９９０ＭＧにおける増加したＮＡＤＨアベイラビリティーは、完全に好気的条件下で、グルコースからのコハク酸収率を１．６モル／モルに増加させている（図２および図３）。ＳＢＳ９９０ＭＧは、高いコハク酸収率を達成することができた。

（実施例６：二重のコハク酸合成経路）
活性化グリオキシル酸経路での経路設計は、コハク酸収率を増加させ、ＮＡＤＨアベイラビリティーの制約を緩和するように、インシリコで以前に開発および試験され（９）、遺伝子操作されたＥ．ｃｏｌｉによってインビボで実現された（４１）。ＳＢＳ５５０ＭＧ（ｐＨＬ４１３）株は、二重のコハク酸合成経路を有するように構築した。この経路は、必要とされる量のＮＡＤＨを伝統的な醗酵経路に回し、そして醗酵経路とグリオキシル酸経路（これは、ＮＡＤＨ所要量が少ない）とのバランスをとることによってコハク酸に変換される炭素を最大限にする（４１）。再設計された経路は、野生型Ｅ．ｃｏｌｉ株における１モルのコハク酸当たり２モルのＮＡＤＨという理論的所要量に対して、コハク酸１モル当たり約１．２５モルのＮＡＤＨというグルコースからの実験的ＮＡＤＨ所要量を示した。

ｌｄｈＡａｄｈＥｉｃｌＲ変異株におけるａｃｋ−ｐｔａの不活性化がアセチルＣｏＡをグリオキシル経路に導くための鍵であることが証明された。酢酸経路の欠失は、グリオキシル酸およびコハク酸の形成に回されるアセチルＣｏＡの形態で、炭素分子を保存するのを助ける。グリオキシル酸からリンゴ酸へ、フマル酸へ、そして最終的にはコハク酸へのさらなる変換もまた、ＮＡＤＨ所要量を減少させるのを助ける。この経路は、２モルのアセチル−ＣｏＡおよび１モルのＯＡＡから２モルのコハク酸を産生するのに、１モルだけのＮＡＤＨを必要とする。

ＰＹＣを過剰発現しているＳＢＳ５５０ＭＧ株の性能を試験し、その結果を図２に示した。ＰＹＣを有するＳＢＳ５５０ＭＧ株は、好気条件下では理論的によく増殖できるが、本研究では好気条件は細胞を嫌気的コハク酸産生相に供する前に、バイオマスを迅速に蓄積させるために使用した。ｐＨＬ５３１を有するかまたは有さないＳＢＳ５５０ＭＧ株は、グルコース１００％を消費し、両方の株は、１００ｍＭのグルコースから類似のレベルのコハク酸（１６０ｍＭ）を産生した。残留ギ酸の増加および酢酸レベルの低下を、ＮＡＤＨ非感受性クエン酸シンターゼを過剰発現するプラスミドｐＨＬ５３１を保有する株を用いて観察した。ＳＢＳ５５０ＭＧベースの株の培養物において見出された酢酸レベルは、ＳＢＳ１１０ＭＧ（ｐＨＬ４１３）の培養物において見出された酢酸レベルよりも、ずっと低かった。ＳＢＳ５５０ＭＧ（ｐＨＬ４１３、ｐＨＬ５３１）およびＳＢＳ５５０ＭＧ（ｐＨＬ４１３、ｐＤＨＫ２９)のコハク酸収率は、非常に類似していた（１モルのグルコース当たり約１．６モルのコハク酸）。

ＮＡＤＨ非感受性クエン酸シンターゼの過剰発現にもかかわらず、１．６モル／モルの高いコハク酸収率が変わらないままであるという事実はまた、本来のクエン酸シンターゼ系はグリオキシル酸経路を駆動するのにすでに十分であるということも示唆した。さらに、この結果は、二重経路のコハク酸産生系は非常に頑強であり；この系は収率における大きな変化なしにＯＡＡノードにおける顕著な摂動に対処することができたことを示した。明らかに、この細胞は、コハク酸産生を効率的に最大にするために等価物および炭素原子を利用可能に減少する観点から、醗酵経路とグリオキシル酸経路との間のバランスのとれた分配を達成することができる。

ＳＢＳ６６０ＭＧベースの株の培養物は、２４時間の最後において、２５％〜３５％のグルコースしか消費していなかった。ＳＢＳ６６０ＭＧ（ρＨＬ４１３、ｐＨＬ５３１）株およびＳＢＳ６６０ＭＧ（ｐＨＬ４１３、ｐＤＨＫ２９）株は両方とも、約１．７モル／モルという類似のコハク酸収率を産生した。これらの収率の値は、研究した全ての下部の中で最高である（表３）。形質転換された変異株ＳＢＳ６６０ＭＧ（ｐＨＬ４１３、ｐＨＬ５３１）のコハク酸、酢酸またはギ酸収率において、そのコントロールに対して顕著な差異は観察されなかった（図３）。ａｒｃＡの欠失は、グルコース１モル当たりのコハク酸産生を増加させたが、グルコース消費を減少させた。

（実施例７：クエン酸シンターゼの発現）
図１は、ピルビン酸カルボキシラーゼをコードするプラスミドｐＨＬ４１３およびクエン酸シンターゼを発現するプラスミドｐＨＬ５３１で形質転換された、Ｅ．ｃｏｌｉ変異株のＳＢＳ５５０ＭＧ、ＳＢＳ６６０ＭＧＣおよびＳＢＳ９９０ＭＧＣにおいて産生された種々の代謝物を示す。これらの結果は、より高いＮＡＤＨレベルによって引き起こされ、より低いＮＡＤ＋レベルを好む、クエン酸シンターゼのいくつかの阻害が存在し得ることを示唆する。ＮＡＤＨがクエン酸シンターゼをアロステリックに阻害し（３３、４３）、そしてＮＡＤ＋はＮＡＤＨ結合の弱い競合的インヒビターである（１３）ことは、周知である。ＳＢＳ３３０ＭＧ（ｐＨＬ４１３）において観察された絶対的なインビトロでのクエン酸シンターゼ活性は、研究した全ての株で最低であった。

ＳＢＳ５５０ＭＧ（ｐＨＬ４１３＋ｐＤＨＫ２９）をコントロールとして使用し、ＳＢＳ５５０ＭＧ（ｐＨＬ４１３＋ｐＨＬ５３１）は、異種ＰＹＣおよびクエン酸シンターゼを共発現する。ｐＨＬ５３１を有するＳＢＳ５５０ＭＧ株およびｐＨＬ５３１を有さないＳＢＳ５５０ＭＧ株は、１００％のグルコースを消費し、両方の株は、１００ｍＭのグルコースから類似のレベルのコハク酸（１６０ｍＭ）を産生した。酢酸経路がノックアウトされていたという事実にも関わらず、醗酵の最後に培養物において低濃度の酢酸を検出した。残りのギ酸における増加および酢酸レベルにおける減少を、ＮＡＤＨ非感受性クエン酸シンターゼを過剰発現するｐＨＬ５３１プラスミドを保持する株で観察した。

ＳＢＳ６６０ＭＧ（ｐＨＬ４１３、ｐＨＬ５３１）株におけるＮＡＤＨクエン酸シンターゼの発現は、ＳＢＳ６６０ＭＧ（ｐＨＬ４１３、ｐＤＨ２９）コントロール株と比較して、グルコース消費を増加させ、そして産生される代謝物を約４０％増加させた。ＳＢＳ６６０ＭＧ（ｐＨＬ４１３、ｐＨＬ５３１）株およびＳＢＳ６６０ＭＧ（ｐＨＬ４１３、ｐＤＨＫ２９）株は両方、約１．７モル／モルという類似のコハク酸収率を産生した。これらの収率の値は、研究した全ての株の中で最高である（表３）。ＳＢＳ９９０ＭＧ（ｐＨＬ４１３、ｐＤＨＫ２９）株によって産生されるコハク酸レベルは、ＳＢＳ５５０ＭＧ（ｐＨＬ４１３、ｐＤＨＫ２９）株のコハク酸レベルと非常に類似していた。

この結果は、二重経路のコハク酸産生系は非常に頑強であり；この系は収率における大きな変化なしにＯＡＡノードにおける顕著な摂動に対処することができたことを示した。操作された細胞は、コハク酸産生を効率的に最大にするために等価物および炭素原子を利用可能に減少する観点から、醗酵経路とグリオキシル酸経路との間のバランスのとれた分配を達成することができる。これらの結果はさらに、ａｄｈＥ、ｌｄｈＡおよびａｃｋ−ｐｔａが不活性化されるときに、グリオキシル酸経路のある程度の活性化が存在し得るという仮説を支持する。

（実施例８：ＮＡＤＨフラックス解析）
回分培養条件下で得られた測定されたフラックスを、細胞内フラックスを推定し、重要な分岐点のフラックス分裂比率を同定するために使用した。異なる変異の結果としてのＯＡＡノードにおけるグリオキシル酸経路および醗酵経路への分岐点フラックス分裂比率における変化の比較により、これらの操作に対してコハク酸の収率が感受性であることが明らかになった。

代謝マトリックスは、細胞内中間代謝物の質量保存の法則および擬似定常状態仮定（ｐｓｅｕｄｏ−ｓｔｅａｄｙｓｔａｔｅｈｙｐｏｔｈｅｓｉｓ）（ＰＳＳＨ）に基づいて構築した。図１に示される代謝ネットワークに基づいて公式化された一次方程式のセットから得られた化学量論的行列により、測定された代謝物、細胞内代謝物についてのＰＳＳＨバランスおよびＮＡＤＨバランスのみに基づいて、１５×１５次元の正方行列を得た。ＮＡＤＨバランスについては、ＮＡＤＨの産生と消費とは等しいはずであると想定した。レドックスバランスの誘導は、バイオマスに同化されたいずれの炭素も考慮に入れなかった。バイオマス（ν_２）は、野生型を除いて全ての変異株についてゼロであると仮定し、解が最小二乗法フィッティングによって見つけられた過剰決定体系を生じた測定値として使用した。上記ネットワークにおける種々の種に関する数学的表示、化学量論的行列および正味の変換方程式は、表４に示される。

ベクトルｒ（ｔ）（ｍ×１）（ここで、ｍ＝１５，１６または１７）は、種々の代謝物に対する正味の変換速度を意味する：

ＭＧ１６５５（ｐＨＬ４１３）については、Ｈ２およびバイオマスについてのバランスは除外し、したがって行列Ａは１５×１５の正方行列に縮小した。正確な解は、式１によって得た：

全ての変異株ＳＢＳ１１０ＭＧ（ｐＨＬ４１３）、ＳＢＳ３３０ＭＧ（ｐＨＬ４１３）、ＳＢＳ５５０ＭＧ（ｐＨＬ４１３）およびＳＢＳ９９０ＭＧ（ｐＨＬ４１３）について、Ｈ２バランスを除外し、バイオマスを含めることによって、結果として過剰決定体系（ｍ＝１６かつｎ＝１５）を得た。これを、最小二乗法フィッティングアプローチによって解き、以下の式２に従って計算した：

排出された代謝物の時間変動濃度のケイ酸は、ｔ＝０ｈと、ｔ＝６ｈまたはｔ＝７ｈとの間で決定し、以下（４）のように、平均細胞密度に基づいた：

コハク酸の収率は、ＰＥＰ／ＰＹＲノードよりもＯＡＡノードにおける分離比率に対して、比較的より感受性であることを見出した。最高のコハク酸収率を得るための最も好ましい分離比率は、ＳＢＳ５５０ＭＧ（ｐＨＬ４１３）株およびＳＢＳ９９０ＭＧ（ｐＨＬ４１３）株において得られた、ＯＡＡからグリオキシル酸へ０．３２、および醗酵経路へ０．６８という分配比であった。これら２つの株において達成されたコハク酸収率は、それぞれ、１．６モル／モルおよび１．７モル／モルであった。ｉｄｈＡ、ａｄｈＥ、ａｃｋ−ｐｔａ変異株における活性名グリオキシル酸経路が、嫌気的に達成される高いコハク酸収率を担っていることが示された。野生型と比較してＮＡＤＨおよびアセチルＣｏＡの高い細胞内レベルが、嫌気醗酵の開始時にＳＢＳ５５０ＭＧ（ｐＨＬ４１３）およびＳＢＳ９９０ＭＧ（ｐＨＬ４１３）において見出されたが、これらのレベルは急速に低下し、このことは、これらの株がＰＥＰ／ＰＹＲ分岐点の下流の酵素の不活性化にもかかわらず高い解糖フラックスに対処することができることを示唆している。

ＳＢＳ５５０ＭＧ（ｐＨＬ４１３）株の解糖フラックス（ν_１〜ν_４）は、ＳＢＳ３３０ＭＧ（ｐＨＬ４１３）に対して増加したが、野生型コントロール株に対しては減少した。ＰＦＬフラックス（ν_７）もまた、野生型コントロール株に対して減少し、酢酸およびギ酸フラックスにおける主要な減少を引き起こした。これらの解糖フラックスは、高いコハク酸収率がＯＡＡ−クエン酸とＯＡＡ−リンゴ酸との間のカルボン酸の分配に依存していることを実証している。このフラックスは、ＮＡＤＨ消費のバランスをとり、コハク酸の産生増加につながる。高コハク酸産生株における分配は、１０〜４０％のクエン酸由来コハク酸と、９０〜６０％のリンゴ酸由来コハク酸との間で変動する（図１を参照のこと）。

（実施例９：流加嫌気醗酵）
バイオリアクターは、より制御された環境に起因して、より高い生産性を生じる。回分実験を二連で実施し、制御条件下でのコハク酸産生についてＳＢＳ５５０（ｐＨＬ３１４）の効率を試験した（図５）。この実験において、このバイオリアクターに、最初にＬＢを充填し、８６ｍＭのグルコースを補充した。０時点において、このリアクターにＯＤ１７まで接種した。グルコースは、矢印によって示されるようにグルコースが約２０ｍＭまで落ちたときに、律動的に添加した。試行の間の初期グルコース濃度およびグルコース添加時間における差異は、株の性能に影響しなかった。

図５において見られるように、この株は、コハク酸を産生するのに非常に効率的である。コハク酸産生は、１時間当たり１２〜９ｍＭのコハク酸の範囲であり、収率は非常に効率的な１．６モル／モルである。この系は、非常に少量の他の代謝物（例えば、ギ酸および酢酸）のみを副産物として産生した。この系は、コハク酸収率を１．８モル／モル、１．９モル／モルまたは２．０モル／モル、あるいはそれより高くにさえ改善するように、さらに最適化され得ることもまた、予期される。

本明細書中で引用される全ての参考文献は、明示的に参考として援用される。

本明細書中に組み込まれ、かつその一部を形成する添付の図面は、本発明を例示しており、そして説明と一緒になって、本発明の原理を説明するのに役立つ。
図１は、遺伝子操作された嫌気代謝経路である。ＮＡＤＨ競合経路：乳酸（ＬＤＨ）、エタノール（ＡＤＨ）、および酢酸経路（ＡＣＫ−ＰＴＡ）。グリオキシル酸バイパス（ＩＣＬＲノックアウト）の開始およびＬ．ｌａｃｔｉｓ由来の外来性ピルビン酸カルボキシラーゼ（ＰＹＣ）の過剰発現。図１に示される遺伝子操作された株は、代表株のＳＢＳ５５０ＭＧである。図１は、遺伝子操作された嫌気代謝経路である。ＮＡＤＨ競合経路：乳酸（ＬＤＨ）、エタノール（ＡＤＨ）、および酢酸経路（ＡＣＫ−ＰＴＡ）。グリオキシル酸バイパス（ＩＣＬＲノックアウト）の開始およびＬ．ｌａｃｔｉｓ由来の外来性ピルビン酸カルボキシラーゼ（ＰＹＣ）の過剰発現。図１に示される遺伝子操作された株は、代表株のＳＢＳ５５０ＭＧである。図２は、グルコースの消費および産生濃度である。図３は、産物の収率である。図４は、累積的なコハク酸収量である。図５は、ＳＢＳ５５０ＭＧ（ｐＨＬ４１３）を用いた流加産生である。黒い記号は、最初の試行において測定された代謝物に対応し、白い記号は、反復試行において測定された代謝物に対応する。グルコースは、矢印によって示されるようにグルコースが約２０ｍＭまで落ちたときに、律動的に添加した。

Claims

遺伝子操作された細菌株であって、該細菌株は、
ａ）乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の破壊；
ｂ）アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）の破壊；ならびに
ｃ）酢酸キナーゼホスホトランスアセチラーゼ（ＡＣＫ−ＰＴＡ）の破壊
を含む、細菌株。
前記細菌株は、ａｃｅＢＡＫオペロンリプレッサー（ＩＣＬＲ）の破壊を含む、請求項１に記載の細菌株。
前記細菌株は、発現構築物に操作可能に連結されたピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子を含む、請求項１に記載の細菌株。
前記ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｌａｃｔｉｓに由来するｐｙｃである、請求項３に記載の細菌株。
前記細菌株は、発現構築物に操作可能に連結されたクエン酸シンターゼ遺伝子を含む、請求項１に記載の細菌株。
前記クエン酸シンターゼ遺伝子は、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓに由来するｃｉｔＺである、請求項５に記載の細菌株。
コハク酸を産生する方法であって、該方法は、
ａ）請求項１〜６のいずれか１項に記載の細菌株を、嫌気条件下で培養する工程、
ｂ）糖基質を提供する工程、
ｃ）該細菌に該基質を代謝させる工程、および
ｄ）コハク酸を単離する工程
を包含する、方法。
前記細菌株は、グルコース１モル当たり１．５モルを超えるコハク酸を産生する、請求項１に記載の細菌株。
前記細菌株は、グルコース１モル当たり１．５モルを超えるコハク酸を産生する、請求項７に記載の方法。
コハク酸を産生する方法であって、該方法は、
ａ）以下のｉ）〜ｉｖ）
ｉ）乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）、
ｉｉ）アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）、
ｉｉｉ）ａｃｅＢＡＫオペロンリプレッサー（ＩＣＬＲ）、および
ｉｖ）酢酸キナーゼとホスホトランスアセチラーゼ（ＡＣＫ−ＰＴＡ）の双方
の破壊を含む遺伝子操作されたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ細菌を提供する工程、
ｂ）該細菌を、バイオリアクターにおいて嫌気条件下で培養する工程
を包含し、オキサロ酢酸（ＯＡＡ）からの解糖フラックスが、クエン酸１０〜４０％とリンゴ酸９０〜６０％の間の比率で分配され、該細菌は、グルコース１モル当たり１．５モルを超えるコハク酸を産生する、方法。
前記解糖フラックスは、クエン酸約３０％とリンゴ酸約７０％の比率で分配される、請求項１０に記載の方法。
前記細菌は、ピルビン酸カルボキシラーゼ（ＰＹＣ）をコードする発現構築物をさらに含み、該ＰＹＣは、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｌａｃｔｉｓに由来する、請求項１０に記載の方法。