CN102174458A - 一种制备重组大肠杆菌发酵生产丁二酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种制备重组大肠杆菌发酵生产丁二酸的方法，属于生物工程技术领域。本发明主要通过在大肠杆菌中过量表达NAD+生物合成相关的基因，并在厌氧培养基中添加一定浓度的烟酸作为NAD+生物合成的前体物质，从而提高菌株在厌氧条件下的生长速率及丁二酸的合成速率。通过该方法，可以解决重组大肠杆菌专一性厌氧发酵过程中丁二酸生产速率慢的问题，同时为利用大肠杆菌厌氧生产酶制剂提高了一种手段。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，涉及一种制备重组大肠杆菌发酵生产丁二酸的方法，具体涉及一种通过提高菌株胞内NAD+的生物合成加快菌株生长速率进而提高厌氧条件下丁二酸生产能力的方法，具体涉及利用分子生物学手段在大肠杆菌中过量表达NAD+生物合成相关的一个或者多个基因，并且添加一定浓度的前体物质，最终实现专一性厌氧条件下菌株丁二酸的生产能力。
背景技术
丁二酸为大宗化学品，被广泛应用于医药、农药、染料、香料、油漆、食品和塑料等行业，同时作为优秀的C4平台化合物，可用于合成1,4-丁二醇、四氢呋喃、γ-丁内酯等有机化学品以及聚丁二酸丁二醇酯（PBS）类生物可降解材料，被美国能源部认为是未来12种最有价值的生物炼制产品之一。
利用微生物发酵法转化可再生资源（葡萄糖、木糖等）生产丁二酸，由于原料来源广泛且价格低廉，污染小，环境友好，且在发酵过程中可吸收固定CO2，能有效缓解温室效应，开辟了温室气体二氧化碳利用的新途径，近年来成为研究的热点。丁二酸的生产菌株主要包括naerobiospirillum succiniciproducens、Actinobacillus succinogenes、Mannheimia succiniciproducens、重组谷氨酸棒杆菌和重组大肠杆菌。利用野生菌株生产丁二酸，虽然获得了较高的产物浓度，但培养过程培养基成本较高，且甲酸、乙酸等副产物积累较多，阻碍了其工业化进程。
大肠杆菌由于遗传背景清楚、易操作、易调控、培养基要求简单和生长迅速等优点，近年来被广泛用于研究以获得产丁二酸优秀菌株。大肠杆菌作为一种兼性好氧菌，在有氧及厌氧条件下均能生长，但在有氧条件下，菌株生长快速，采用合适的策略细胞最终密度可以提高至细胞干重几百，且胞内碳代谢走三羧酸循环；在厌氧条件下大肠杆菌生长缓慢，且终细胞干重较低，其主要原因可能是厌氧条件下细胞进行混合酸发酵，有大量抑制物产生，另有原因可能是厌氧条件下胞内的电子传递链不起作用，辅酶NAD+和ATP供给不足。
利用大肠杆菌生产丁二酸的发酵模式主要包括专一性厌氧发酵及两阶段发酵。国外Vemuri等人利用大肠杆菌AFP111（PYC）两阶段发酵，其厌氧阶段可完成1.1 g·g-1的丁二酸收率和1.3 g·L-1·h-1的丁二酸生产强度（Applied Environmental Microbiology. 2002, 68, 1715～1727）。但如果考虑有氧阶段消耗的糖及花费的时间，收率和生产强度将下降。而专一性厌氧发酵时，由于菌株生长缓慢，且最终菌体密度低，丁二酸终浓度和收率均较低。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于提供一种提高大肠杆菌厌氧条件下生长能力的方法，进而提高专一性厌氧发酵过程丁二酸的生产能力。
为实现本发明的技术目的，本发明采用以下技术方案：
一种制备重组大肠杆菌发酵生产丁二酸的方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）在产丁二酸大肠杆菌出发菌株中过量表达pncB，nadD，nadE三种基因中的一个或者多个，得到重组大肠杆菌菌株；
（2）在发酵厌氧培养基中添加烟酸；
（3）利用步骤（1）得到的重组大肠杆菌专一性厌氧发酵生产丁二酸。
其中，本发明所述的发酵厌氧培养基应理解为现有技术中任意大肠杆菌发酵产丁二酸用的常规培养基，特殊地，步骤（2）中所述的添加烟酸的浓度为0.1 mmol/L～1 mmol/L。
本发明的有益效果在于：附图1是NAD+的生物合成途径相关的基因；本发明通过过量表达NAD+生物合成相关的基因，并且另一方面在发酵厌氧培养基中添加烟酸作为NAD+生物合成的前体物质，这样加快了菌株生长速率，将可大幅度提高专一性厌氧发酵生产丁二酸的能力。
附图说明
图1 NAD+的生物合成途径。
图2 加入不同浓度的烟酸进行诱导后对菌体生物量及丁二酸产量影响
其中，A是NZN111添加0.5 mmol/L烟酸，B是NZN111/pTrc99a添加0.5 mmol/L烟酸，C至E是NZN111/pTrc99a-pncB添加0.1 mmol/L，0.3 mmol/L，0.5mmol/L和1mmol/L烟酸。
具体实施方式
下面的实施例对本发明作详细说明，但对本发明没有限制。
本发明所述的大肠杆菌K12的来源是：购自中国科学院北京微生物研究所。
本发明所述的表达质粒用pTrc99a的来源是：购自Introvegen公司。
本发明所述的E.coli NZN111的来源是：Biotechnol Bioeng, 2001,74:89～95。
本发明所述的发酵用培养基为：LB+葡萄糖（20 g/L）+碱式碳酸镁0.48 g+Kan(卡那霉素30 μg/mL)+Amp(氨苄青霉素50 μg/mL)+Chl(氯霉素25 μg/mL)+0.3 mM IPTG。
实施例1
本实施例说明在大肠杆菌NZN111中过量表达pncB后，通过IPTG诱导，可有效提高胞内NADH和NAD+的浓度。
大肠杆菌NZN111(CGSC7726)当导入质粒pTrc99a-pncB，过量表达烟酸磷酸核糖转移酶，恢复了NZN111在厌氧条件下代谢葡萄糖的能力，且有高产量的琥珀酸积累。
具体操作是：
1、构建过量表达烟酸磷酸核糖转移酶的表达质粒，其过程包括：
（1）合成带有Nco I 和Hind III酶切位点的引物，
上游引物：5’- CATGCCATGGATGACACAATTCGCTTCTCCTG-3’
下游引物：5’-CCCAAGCTTCACTTGTCCACCCGTAAATGG-3’
（2）以大肠杆菌K12系列为模板，PCR扩增目的基因片段，反应条件为：94℃，5 min；(94℃ 45 s，55℃ 45 s，72℃ 1 min，35个循环)；72℃，10 min。纯化扩增出的pncB基因后，表达质粒用pTrc99a分别用Nco I 和Hind III双酶切、连接获得重组质粒pTrc99a-pncB。
2、将质粒pTrc99a-pncB导入E.coliNZN111的感受态，得到重组大肠杆菌发酵菌株。
为了考察过量表达烟酸磷酸核糖转移酶后对胞内辅酶的影响，采用专一性厌氧发酵模式，按1%（v/v）接种量从冻存管接入三角瓶中，当厌氧培养菌体OD600至0.3左右时，加入烟酸至终浓度为0.5 mmol/L，30℃，170 rpm厌氧培养8 h。
E.coli NZN111和构建的重组菌株胞内NADH和NAD+的测定，结果见表1。
表1 过量表达烟酸磷酸核糖转移酶对E.coli NZN111胞内辅酶的影响
实施例2
本实施例说明要提高菌株胞内NAD+的生物合成，除了需要过量表达pncB等重组表达质粒外，还需添加一定浓度的烟酸。
1、为了考察过量表达烟酸磷酸核糖转移酶后，前体物质烟酸对胞内辅酶的影响，采用专一性厌氧发酵模式，按1%（v/v）接种量从冻存管接入三角瓶中，当厌氧培养菌体OD600至0.3左右时，加入IPTG至终浓度为0.3 mmol/L，烟酸至终浓度为0.1～1.0 mmol/L之间，30℃，170 rpm厌氧培养24 h。
2、E.coli NZN111和构建的重组菌株胞内NADH和NAD+的测定，结果见图2。
实施例3
本实施例说明通过提高大肠杆菌胞内NAD+的生物合成后对葡萄糖消耗及产物分布的影响。
1、为了考察过量表达烟酸磷酸核糖转移酶提高NAD+生物合成后对胞内辅酶和代谢分布的影响，采用专一性厌氧发酵模式，按1%（v/v）接种量从冻存管接入三角瓶中，当厌氧培养菌体OD600至0.3左右时，加入IPTG至终浓度为0.3 mmol/L，烟酸至终浓度为0.5 mmol/L之间，30℃，170 rpm厌氧培养48 h。
2、E.coli NZN111和构建的重组菌株底物消耗和产物分布见表2。
表1 过量表达烟酸磷酸核糖转移酶对E.coli NZN111产物分布的影响
实施例4
本实施例说明除按照实施例1的方法导入pncB重组表达质粒外，导入其他质粒获得重组大肠杆菌的方法，其他涉及烟酸的添加和专一厌氧发酵的实施例同实施例2。
1、过量表达nadD基因：
构建过量表达烟酸单核苷酸腺苷酰转移酶的表达质粒，其过程包括：
（1）合成带有Nco I 和Hind III酶切位点的引物，
上游引物：5’- CATGCCATGGGGCGGACGTATTTATCGACGGTTGA -3’
下游引物：5’- CCCAAGCTTCAGATTTTGCGCTTGCTCAATACCG -3’
（2）以大肠杆菌K12系列为模板，PCR扩增目的基因片段，反应条件为：94℃，5 min；(94℃ 45 s，60℃ 45 s，72℃ 48s，35个循环)；72℃，10 min。纯化扩增出的nadD基因后，表达质粒用pTrc99a分别用Nco I 和Hind III双酶切、连接获得重组质粒pTrc99a-nadD。
将质粒pTrc99a-nadD导入E.coliNZN111的感受态，得到重组大肠杆菌发酵菌株。
2、过量表达nadE基因：
构建过量表达NAD合成酶的表达质粒，其过程包括：
（1）合成带有Nco I 和Hind III酶切位点的引物，
上游引物：5’-CATGCCATGGCGCTTGTCGTTTCAGTAGCAACGGG-3’
下游引物：5’-CCCAAGCTTCGCATCCGGCGTGAACAAATTACTC-3’
（2）以大肠杆菌K12系列为模板，PCR扩增目的基因片段，反应条件为：94℃，5 min；(94℃ 45 s，64℃ 45 s，72℃ 57s，35个循环)；72℃，10 min。纯化扩增出的nadE基因后，表达质粒用pTrc99a分别用Nco I 和Hind III双酶切、连接获得重组质粒pTrc99a-nadE。
将质粒pTrc99a-nadE导入E.coliNZN111的感受态，得到重组大肠杆菌发酵菌株。
3、过量表达pncB基因和nadD基因：
构建过量表达共表达烟酸磷酸核糖转移酶和烟酸单核苷酸腺苷酰转移酶的表达质粒，其过程包括：
（1）合成两端都带有Hind III酶切位点的引物，
上游引物：5’- CCCAAGCTTGGCGGACGTATTTATCGACGGTTGA -3’
下游引物：5’- CCCAAGCTTCAGATTTTGCGCTTGCTCAATACCG -3’
（2）以大肠杆菌K12系列为模板，PCR扩增目的基因片段，反应条件为：94℃，5 min；(94℃ 45 s，60℃ 45 s，72℃ 48s， 35个循环)；72℃，10 min。纯化扩增出的nadD基因后，表达质粒pTrc99a-pncB（实施例1中得到）用Hind III双酶切、连接获得重组质粒pTrc99a-pncB-nadD。
将质粒pTrc99a-pncB-nadD导入E.coliNZN111的感受态，获得的阳性转化子为新构建菌株，得到重组大肠杆菌发酵菌株。
4、过量表达pncB基因和nadE基因：
构建过量表达共表达烟酸磷酸核糖转移酶和NAD合成酶的表达质粒，其过程包括：
（1）合成两端都带有Hind III酶切位点的引物，
上游引物：5’-CCCAAGCTTCGCTTGTCGTTTCAGTAGCAACGGG-3’
下游引物：5’-CCCAAGCTTCGCATCCGGCGTGAACAAATTACTC-3’
（2）以大肠杆菌K12系列为模板，PCR扩增目的基因片段，反应条件为：94℃，5 min；(94℃ 45 s，64℃ 45 s，72℃ 57s， 35个循环)；72℃，10 min。纯化扩增出的nadE基因后，表达质粒pTrc99a-pncB（实施例1中得到）用Hind III双酶切、连接获得重组质粒pTrc99a-pncB-nadE。
将质粒pTrc99a-pncB-nadE导入E.coliNZN111的感受态，得到重组大肠杆菌发酵菌株。
5、过量表达nadD基因和nadE基因：
构建过量表达共表达烟酸单核苷酸腺苷酰转移酶和NAD合成酶的表达质粒，其过程包括：
（1）合成两端都带有Hind III酶切位点的引物，
上游引物：5’-CCCAAGCTTCGCTTGTCGTTTCAGTAGCAACGGG-3’
下游引物：5’-CCCAAGCTTCGCATCCGGCGTGAACAAATTACTC-3’
（2）以大肠杆菌K12系列为模板，PCR扩增目的基因片段，反应条件为：94℃，5 min；(94℃ 45 s，64℃ 45 s，72℃ 57s， 35个循环)；72℃，10 min。纯化扩增出的nadE基因后，表达质粒pTrc99a-nadD（本实施例第1项中得到）用Hind III双酶切、连接获得重组质粒pTrc99a-nadD-nadE。
将质粒pTrc99a-nadD-nadE导入E.coliNZN111的感受态，得到重组大肠杆菌发酵菌株。
6、过量表达pncB基因、nadD基因和nadE基因：
构建过量表达共表达烟酸磷酸核糖转移酶、烟酸单核苷酸腺苷酰转移酶和NAD合成酶的表达质粒，其过程包括：
（1）合成两端都带有Hind III酶切位点的引物，
上游引物：5’-CCCAAGCTTCGCTTGTCGTTTCAGTAGCAACGGG-3’
下游引物：5’-CCCAAGCTTCGCATCCGGCGTGAACAAATTACTC-3’
（2）以大肠杆菌K12系列为模板，PCR扩增目的基因片段，反应条件为：94℃，5 min；(94℃ 45 s，64℃ 45 s，72℃ 57s， 35个循环)；72℃，10 min。纯化扩增出的nadE基因后，表达质粒pTrc99a-pncB-nadD（本实施例第3项中得到）用Hind III双酶切、连接获得重组质粒pTrc99a-pncB-nadD-nadE。
将质粒pTrc99a-pncB-nadD-nadE导入E.coliNZN111的感受态，得到重组大肠杆菌发酵菌株。
Claims (2)
1. 一种制备重组大肠杆菌发酵生产丁二酸的方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）在产丁二酸大肠杆菌出发菌株中过量表达pncB，nadD，nadE三种基因中的一个或者多个，得到重组大肠杆菌菌株；
（2）在发酵厌氧培养基中添加烟酸；
（3）利用步骤（1）得到的重组大肠杆菌专一性厌氧发酵生产丁二酸。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的步骤（2）中添加烟酸的浓度为0.1 mmol/L～1 mmol/L。
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