CN102827800B

CN102827800B - 一种大肠杆菌工程菌株及其低氧发酵生产琥珀酸的应用

Info

Publication number: CN102827800B
Application number: CN201210349656.5A
Authority: CN
Inventors: 祁庆生; 梁泉峰; 李明记
Original assignee: Shandong University
Current assignee: Shandong University
Priority date: 2012-09-19
Filing date: 2012-09-19
Publication date: 2014-02-26
Anticipated expiration: 2032-09-19
Also published as: CN102827800A

Abstract

本发明公开了一种大肠杆菌工程菌株及其低氧发酵生产琥珀酸的应用，所述菌株名为埃希氏大肠杆菌(Escherichia coli)QMJ05,菌株的基因型为MG1655 ΔptsG ΔpoxB ΔptaΔiclR ΔsdhA ΔarcA ΔldhA，该菌已于2012年7月19日保藏在“中国典型培养物保藏中心”，保藏编号为CCTCC NO:M 2012291。本发明的工程菌株在低氧条件下能够积累大量的琥珀酸，并同时拥有较快的生长速率，从而节约了无菌空气用量和能耗，降低了成本，具有可观的应用价值和前景。

Description

一种大肠杆菌工程菌株及其低氧发酵生产琥珀酸的应用

技术领域

本发明涉及一种大肠杆菌工程菌株及其低氧发酵生产琥珀酸的应用，属于代谢工程和微生物发酵领域。

背景技术

琥珀酸是一种天然的二元羧酸，是三羧酸（Tricarboxylic acid cycle，TCA）循环中的一个中间产物，广泛地存在于动植物和微生物中。琥珀酸作为一种重要额有机合成中间体，其衍生物在食品、医药、香料、农药、染料、油漆和塑料等领域广泛应用，用于生产许多化工产品如己二酸、1，4-丁二醇、四氢呋喃、γ-丁内酯、琥珀酸盐，n-甲基吡咯烷酮和2-吡咯烷酮等，因此有着广阔的需求市场。并且随着一些新应用领域的不断拓展，琥珀酸的需求量继续猛增。以可再生资源作为原料利用微生物发酵法生产的琥珀酸摆脱了对石油化工原料的依赖，是一种绿色平台产品。

能够利用微生物发酵法积累琥珀酸的菌株有很多，目前用于研究微生物法生产琥珀酸的菌株主要集中在产琥珀酸厌氧螺菌（Anaerobiospirillum succiniciproducens）、产琥珀酸放线杆菌（Actinobacillus succinogenes）、产琥珀酸曼海姆菌（Mannheimiasucciniciproducens）和大肠杆菌（Escherichia coli）。其中，产琥珀酸厌氧螺菌发酵条件较为苛刻，营养条件复杂，发酵周期较长，无法耐受高浓度的葡萄糖和琥珀酸盐，并且具有潜在的致病性；产琥珀酸放线杆菌和产琥珀酸曼海姆菌属于瘤胃菌，其生理、代谢和遗传背景并不十分清楚，遗传工具发展也不成熟，且发酵副产物较多。

大肠杆菌是一种兼性厌氧菌，作为一种模式生物，其遗传背景和代谢途径清楚，分子操作技术发展较为成熟，菌种筛选和代谢途径的改造比较容易，培养条件相对简单，可利用碳源范围广，生长速度快，因此成为研究琥珀酸代谢途径和提高琥珀酸产量的理想载体。但是琥珀酸是野生大肠杆菌的一种TCA循环中间产物，产量很低，需要通过基因工程的改造提高其产量。利用大肠杆菌工程菌好氧发酵生产琥珀酸，大肠杆菌工程菌生长相对较快，生物量较大，但是在菌体快速生长繁殖或高密度发酵琥珀酸生产中，往往会出现通气量不足，TCA循环受到抑制，而造成副产物乳酸积累影响琥珀酸的产量。相对好氧发酵，低氧发酵有着培养过程简单、生产规模容易扩大的优点，并且能够减少发酵工业中最大的能量消耗成本----通气搅拌成本。同时低氧发酵也无需像严格厌氧发酵那样需要在氮气保护等辅助手段下进行，因此在生产上更为简单易行，对设备的要求也更低。因此低氧发酵生产琥珀酸相对现在普遍采用的好氧发酵具有明显的优势。

经检索，利用低氧发酵生产琥珀酸的工程菌还未见报道。

发明内容

针对利用大肠杆菌好氧发酵生产琥珀酸过程中存在的上述缺陷，本发明提供了一种大肠杆菌工程菌株及其低氧发酵生产琥珀酸的应用。

本发明通过基因工程技术，利用基因敲除技术构建了一株用于低氧发酵生产琥珀酸的大肠杆菌工程菌株，所述菌株名为埃希氏大肠杆菌(Escherichia coli)QMJ05,菌株的基因型为MG1655 ΔptsG ΔpoxB Δpta ΔiclR ΔsdhA ΔarcA ΔldhA，该菌已于2012年7月19日保藏在“中国典型培养物保藏中心”，保藏编号为CCTCC NO:M 2012291。

上述大肠杆菌（Escherichia coli）QMJ05，属于革兰氏阴性菌。该菌呈杆状，大小为0.4~0.6微米×1~3微米，有普通菌毛和性菌毛，无芽孢，生长温度范围在15~46℃之间，最适生长温度为37℃。

上述大肠杆菌工程菌株的出发菌株是大肠杆菌K-12系列MG1655。

上述大肠杆菌工程菌株的构建及检测步骤是：

(1).ptsG基因的敲除

通过Red重组系统在大肠杆菌MG1655中敲除基因ptsG（磷酸转移酶系统II）。所得缺失ptsG基因的大肠杆菌MG1655(ΔptsG)。

(2).poxB基因的敲除

通过Red重组系统在大肠杆菌MG1655(ΔptsG)中敲除基因poxB（丙酮酸氧化酶）。所得缺失poxB基因的大肠杆菌MG1655(ΔptsGΔpoxB)。

(3).pta基因的敲除

通过Red重组系统在大肠杆菌MG1655(ΔptsGΔpoxB)中敲除基因pta（磷酸转乙酰基酶）。所得缺失pta基因的大肠杆菌MG1655(ΔptsGΔpoxBΔpta)。

（4）iclR基因的敲除

通过Red同源重组系统在大肠杆菌MG1655(ΔptsG ΔpoxB Δpta)中敲除基因iclR（aceBAK操纵子阻遏物）。所得缺失iclR基因的大肠杆菌MG1655(ΔptsG ΔpoxB ΔptaΔiclR)命名为QZ1110。

(5)sdhA基因的敲除

通过Red同源重组系统在大肠杆菌MG1655(ΔptsG ΔpoxB Δpta ΔiclR)中敲除基因sdhA（琥珀酸脱氢酶）。所得缺失sdhA基因的大肠杆菌MG1655(ΔptsG ΔpoxB Δpta ΔiclRΔsdhA)命名为QZ1111。

（6）arcA基因的敲除

通过Red同源重组系统在大肠杆菌MG1655(ΔptsG ΔpoxB Δpta ΔiclR ΔsdhA)中敲除基因arcA（琥珀酸脱氢酶）。所得缺失arcA基因的大肠杆菌MG1655(ΔptsG ΔpoxB ΔptaΔiclR ΔsdhA ΔarcA)命名为QMJ03。

（7）ldhA基因的敲除

通过Red同源重组系统在大肠杆菌MG1655(ΔptsG ΔpoxB Δpta ΔiclR ΔsdhA ΔarcA)中敲除基因ldhA（琥珀酸脱氢酶）。所得缺失ldhA基因的大肠杆菌MG1655(ΔptsG ΔpoxBΔpta ΔiclR ΔsdhA ΔarcA ΔldhA)命名为QMJ05，并于2012年7月19日保藏在“中国典型培养物保藏中心”，保藏编号为CCTCC NO:M 2012291。

上述Red同源重组系统，是利用质粒pKD46表达重组酶Gam，Bet和Exo，通过设计引物以pKD3或pKD4或单基因突变菌株为模板扩增出带有长同源臂和筛选标记kan(卡那霉素抗性基因)或筛选标记cam（氯霉素抗性基因）的重组片断。然后将重组片断通过电穿孔仪电击而转入表达λ噬菌体重组酶Gam，Bet和Exo的目的菌株中。重组片断在重组酶的作用下与基因组上的目的基因发生重组，从而将原来的基因替换下来。而抗性基因是通过质粒pCP20表达FLP内切酶，从而将其从基因组上切除掉。

本发明所述大肠杆菌工程菌株在低氧条件下发酵生产琥珀酸的应用，其特征在于，所述低氧条件是指维持发酵液溶氧在5%～10%之间，在整个发酵过程中，补充浓度以重量百分比计为2%的葡萄糖，并用4M Na₂CO₃或NH₃·H₂O维持pH在7.0±0.1，发酵培养基组成以重量百分比计为：Na₂HPO₄·12H₂O,1.51%;KH₂PO₄,0.35%;NaCl,0.05%;NH₄Cl,0.05%;MgSO₄·7H₂O,0.25%;CaCl₂,0.01%;酵母粉,0.5%；余量为水。

上述工程菌株在含有葡萄糖培养基中的发酵比较

将上述改造后的工程菌株用种子培养基活化后，以5%的接种量接种到含有葡萄糖的发酵培养基中发酵，生产琥珀酸。

种子培养基为LB培养基，具体组分以重量百分比计为：1%蛋白胨，1%NaCl，0.5%酵母粉，余量为水。

发酵培养基为改良的M9培养基，组分以重量百分比计为：Na₂HPO₄·12H₂O,1.51%;KH₂PO₄,0.35%;NaCl,0.05%;NH₄Cl,0.05%;MgSO₄·7H₂O,0.25%;CaCl₂,0.01%;酵母粉,0.5%；余量为水。

所使用的碳源为葡萄糖，初始浓度以重量百分比计为2%，葡萄糖消耗到0.5%以下后补充至2%。

发酵方式可分为两种：1.好氧环境培养发酵积累琥珀酸；2.低氧培养发酵积累琥珀酸。

所述的好氧培养为大肠杆菌通常使用的好氧培养条件，如37℃，220rpm转速摇瓶（250ml摇瓶中50ml装液量）震荡培养或发酵罐中通气搅拌培养，用Na₂CO₃或NH₃·H₂O维持pH在7.0左右。

所述的低氧条件是指37℃培养，维持培养基中溶氧量在5%~10%之间，如摇瓶（250ml摇瓶中100ml装液量）中用150rpm转速震荡培养；发酵罐则维持溶氧量在5%~10%之间，并用Na₂CO₃或NH₃·H₂O维持pH在7.0左右。

每间隔4~8h取样，然后再600nm波长下检测菌液的光吸收值。即取1ml菌液10，000~12，000rpm转速离心2min。弃去上清，用等体积的H₂O重悬，稀释至合适倍数后于600nm波长检测其光吸收值。

发酵液中的残糖和有机酸等代谢物采用高压液相色谱仪（HPLC）分析。具体方法为取1ml发酵液室温下12,000rpm离心2min，取上清，然后用孔径为0.22μm的无菌滤膜过滤，用高效液相色谱检测有机酸和葡萄糖浓度。

检测条件为：色谱柱为HPX-87H(BioRad Labs,300mm×7.8mm)，检测器为示差折光检测器RID-10A，柱温为65℃，流动相为5mM H₂SO₄溶液，流速为0.6ml/min。

本发明所述低氧琥珀酸生产大肠杆菌工程菌株在好氧环境、低氧环境都可以积累琥珀酸。而低氧培养条件下，能够快速扩增菌体的同时大量积累琥珀酸，并同时拥有较快的生长速率，降低了成本；同时琥珀酸生产过程副产物较少且能实现高生产速率，节约了由琥珀酸的分离纯化而引起的成本。最终的5L发酵罐结果显示在低氧条件下工程菌的琥珀酸产量达到66.2g/L和0.89mol/mol。相对好氧条件下提高了26.3%，琥珀酸产率提高了43.5%。而好氧发酵的通气成本却高于低氧发酵。因此本发明所述工程菌具有可观的应用价值和前景。

附图说明

本发明所述埃希氏大肠杆菌(Escherichia coli)QMJ05菌株已于2012年7月19日保藏在“中国典型培养物保藏中心”，保藏编号为CCTCC NO:M 2012291（地址：中国.武汉.武汉大学，邮编：430072）。

图1为本发明构建的低氧生产琥珀酸途径平台。

具体实施方式

本发明所用大肠杆菌菌株E.coli MG1655购自普如汀生物技术（北京）有限公司。所述质粒pKD3、pKD4、pKD46和pCP20质粒购自ATCC(美国菌种保藏中心)。所述质粒pUC19购自fermentas公司。大肠杆菌E.coli DH5α购自北京全式金生物技术有限公司。

实施例1工程菌株的构建

(1).ptsG基因的敲除：

菌种：大肠杆菌MG1655

所述LB培养基为:蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，氨苄青霉素,100mg/L，氯霉素50mg/L。

所述氨苄霉素抗性平板为含有100mg/L的氨苄青霉素，1.5%的琼脂粉的LB固体培养基。

所述氯霉素抗性平板为含有50mg/L的氯霉素，1.5%的琼脂粉的LB固体培养基。

所述SOC培养基为：蛋白胨2g/L，酵母粉0.5g/L，NaCl 0.0585g/L，KCl 0.0186g/L，MgCl₂ 0.203g，MgSO₄ 0.246g/L，葡萄糖20mmol/L。

a同源重组片断的克隆

利用Red重组系统对目的基因进行敲除。根据Genbank公布的ptsG基因序列设计引物：

pKD-ptsG F:

5′-ACGTAAAAAAAGCACCCATACTCAGGAGCACTCTCAATTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3′

pKD-ptsGR:

5′-AGCCATCTGGCTGCCTTAGTCTCCCCAACGTCTTACGGAATGGGAATTAGCCATGGTCC-3′

以pKD3通过PCR(聚合酶链式反应)体外扩增获得带有氯霉素抗性的重组片断。PCR反应条件：97℃预变性10min，94℃变性60s，58℃退火30s，72℃延伸90s，30个循环后72℃延伸10min，4℃保存。通过DpnI内切酶消化后，回收纯化浓缩同源重组片断。

b电转化感受态细胞的制备

(Ⅰ)挑取带有pKD46质粒的大肠杆菌MG1655，转入LB培养基中，同时加入0.2%的阿拉伯糖，培养OD₆₀₀至0.5；

(Ⅱ)冰浴15min，离心菌体，然后利用10%的甘油洗涤三次；

(Ⅲ)加入10%的甘油，浓缩至50倍，分装感受态。

c电转化，筛选重组子

(Ⅰ)吸取1mg的同源重组片断，加入100μl的感受态细胞中，混匀。调节电穿孔仪，2.5Kv，电击；

(Ⅱ)加入900μl的SOC培养基，37℃，150转/min，培养1h；

(Ⅲ)涂布氯霉素抗性平板，调取重组子利用

ptsG test F:5′-CCTGTACACGGCGAGGCTCT-3′

ptsG test R:5′-AATAACACCTGTAAAAAAGGCAGCC-3′

进行PCR检测，通过PCR产物测序进一步证实ptsG基因已被氯霉素抗性基因替换。

(Ⅳ)FRT位点专一重组

将pCP20转入氯霉素抗性克隆，30℃培养8h，后提高至42℃过夜，热诱导FLP重组酶表达，质粒也逐渐丢失。利用接种环蘸取菌液在无抗性培养基上划线，将长出的单克隆同时转入无抗性平板和氯霉素抗性平板上培养，在无抗性平板上生长而在氯霉素抗性平板上不生长的已被FLP重组酶删除。利用检测引物ptsG test F和ptsG test R进一步鉴定。

(Ⅴ)获得工程菌株MG1655（△ptsG）。

(2).poxB基因的敲除：

菌种：大肠杆菌MG1655（△ptsG）

所述SOC培养基为：蛋白胨2g/L，酵母粉0.5g/L，NaCl 0.0585g/L，KCl 0.0186g/L，MgCl₂0.203g，MgSO₄0.246g/L，葡萄糖20mmol/L。

(1)同源重组片断的克隆

利用Red重组系统对目的基因进行敲除。根据Genbank公布的poxB基因序列设计引物：

pKD-poxB F:

5′-AAACTTGTTACCGTTATCACATTCAGGAGATGGAGAACCGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3′

pKD-poxB R:

5′-CATGGCATGTCCTTATTATGACGGGAAATGCCACCCTTTATGGGAATTAGCCATGGTCC-3′

(2)电转化感受态细胞的制备

(Ⅰ)挑取带有pKD46质粒的大肠杆菌MG1655（△ptsG），转入LB培养基中，同时加入0.2%的阿拉伯糖，培养OD₆₀₀至0.5；

(Ⅱ)冰浴15min，离心菌体，然后利用10%的甘油洗涤三次；

(Ⅲ)加入10%的甘油，浓缩至50倍，分装感受态。

(3)电转化，筛选重组子

(Ⅱ)加入900μl的SOC培养基，37℃，150转/min，培养1h；

(Ⅲ)涂布氯霉素抗性平板，调取重组子利用

poxB test F:5′-TCCCCCTCCGTCAGATGA-3′

poxB test R:5′-GGTATCACTGCGTAAATCAA-3′

进行PCR检测，通过PCR产物测序进一步证实poxB基因已被氯霉素抗性基因替换。

(Ⅳ)FRT位点专一重组

将pCP20转入氯霉素抗性克隆，30℃培养8h，后提高至42℃过夜，热诱导FLP重组酶表达，质粒也逐渐丢失。利用接种环蘸取菌液在无抗性培养基上划线，将长出的单克隆同时转入无抗性平板和氯霉素抗性平板上培养，在无抗性平板上生长而在氯霉素抗性平板上不生长的已被FLP重组酶删除。利用检测引物poxB test F和poxB test R进一步鉴定。

(Ⅴ)获得工程菌株MG1655（△ptsGΔpoxB）。

(3)pta基因的敲除

菌种：大肠杆菌MG1655（△ptsGΔpoxB）

所述氨苄霉素抗性平板为含有100mg/L的氨苄青霉素，1.5%的琼脂粉的LB固体培养基。所述氯霉素抗性平板为含有50mg/L的氯霉素，1.5%的琼脂粉的LB固体培养基。所述SOC培养基为：蛋白胨2g/L，酵母粉0.5g/L，NaCl 0.0585g/L，KCl 0.0186g/L，MgCl₂0.203g，MgSO₄0.246g/L，葡萄糖20mmol/L。

(1)同源重组片断的克隆

利用Red重组系统对目的基因进行敲除。根据Genbank公布的pta基因序列设计引物：

pKD-pta F

5′-GTAACCCGCCAAATCGGCGGTAACGAAAGAGGATAAACCGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3′

pKD-pta R

5′-TCAGATATCCGCAGCGCAAAGCTGCGGATGATGACGAGAATGGGAATTAGCCATGGTCC-3′

(2)电转化感受态细胞的制备

(Ⅰ)挑取带有pKD46质粒的大肠杆菌MG1655（△ptsG△poxB），转入LB培养基中，同时加入0.2%的阿拉伯糖，培养OD₆₀₀至0.5；

(Ⅱ)冰浴15min，离心菌体，然后利用10%的甘油洗涤三次；

(Ⅲ)加入10%的甘油，浓缩至50倍，分装感受态。

(3)电转化，筛选重组子

(Ⅱ)加入900μl的SOC培养基，37℃，150转/min，培养1h；

(Ⅲ)涂布氯霉素抗性平板，调取重组子利用

Pta test F 5′-TCAGCTGGCGGTGCTGTTT-3′

Pta test R 5′-ACCGGAAATAGTGATTATTTCCGG-3′

进行PCR检测，通过PCR产物测序进一步证实pta已被氯霉素抗性基因替换。

(Ⅳ)FRT位点专一重组

将pCP20转入氯霉素抗性克隆，30℃培养8h，后提高至42℃过夜，热诱导FLP重组酶表达，质粒也逐渐丢失。利用接种环蘸取菌液在无抗性培养基上划线，将长出的单克隆同时转入无抗性平板和氯霉素抗性平板上培养，在无抗性平板上生长而在氯霉素抗性平板上不生长的已被FLP重组酶删除。利用检测引物Pta test F和Pta test R进一步鉴定。

(Ⅴ)获得工程菌株MG1655（△ptsGΔpoxBΔpta）。

（4）iclR基因的敲除：

菌株：MG1655（△ptsG△poxBΔpta）

所使用的LB培养基为：1%蛋白胨，1%NaCl，0.5%酵母粉。

所使用的氨苄霉素抗性平板为含有100mg/L氨苄霉素和1.5%琼脂粉的LB固体培养基。

所使用的卡那霉素抗性平板为含有50mg/L卡那霉素和1.5%琼脂粉的LB固体培养基。

a.同源重组片段的克隆

利用Red同源重组系统对目的基因进行敲除。根据Genbank公布的iclR基因序列在距其上下游约250bp处设计引物：

iclR-F：5′-ATACCGCCGTCCAGCACCAGAATA-3′

iclR-R：5′-CTCAATCTCATAATGCAGCCGT-3′

以MG1655(ΔiclR::kan)为模板，通过PCR（聚合酶链式反应）扩增获得带有卡那霉素抗性的重组片段。PCR反应体系如下：

10×缓冲液5μl；10mmol/L dNTP混合液4μl；20μmol/L iclR-F引物1μl；20μmol/LiclR-R引物1μl；TaqDNA聚合酶0.5μl；模板DNA1μl，加水补至50μl；

PCR反应条件：95℃预变性5min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸2min，30个循环后72℃终延伸10min，4℃保存。回收纯化浓缩同源重组片断备用。

b．电转化感受态细胞的制备

1)挑取带有pKD46质粒的大肠杆菌MG1655(ΔptsG ΔpoxB Δpta)，接种到LB培养基中，同时加入1ml 10%阿拉伯糖，培养OD₆₀₀至0.6；

2)冰浴10min，收集菌体后利用10%的甘油洗涤三~五次；

3)用100μl的10%甘油重悬即得到电转化感受态细胞，置于冰上备用。

c.电转化，筛选重组子

1)取1mg纯化好的重组片段，加入到100μl电转化感受态细胞中，混匀并冰置2min后，2.5Kv电击。

2)迅速加入900μl LB培养基，37℃，150rpm回复培养1h。

3)将菌体涂布于卡那霉素抗性平板上，挑去重组子划线后，利用检测引物

iclR test F:5’-AAAATCGGCTTCGTTCAGTC-3’

iclR test R：5’-CGAGGAATACGAGTAATCA-3’

进行PCR检测。

d.抗性筛选标记的去除

将质粒pCP20转入重组子，30℃ 220rpm培养6h，然后转入到42℃ 220rpm培养过夜。用接种环蘸取菌液在无抗性平板上划线，将长出的单克隆转接到无抗性平板和卡那霉素抗性平板上，能够在无抗性平板上生长而不能在卡那霉素抗性平板上生长的即为抗性已去除的重组子，然后利用iclR test F和iclR test R进一步PCR检测确定是否去除成功。

e.去除抗性成功的菌株即为工程菌株MG1655(ΔptsG ΔpoxB Δpta ΔiclR)，命名为QZ1110。

（5）sdhA基因的敲除

菌株：MG1655(ΔptsG ΔpoxB Δpta ΔiclR)

所使用的LB培养基为：1%蛋白胨，1%NaCl，0.5%酵母粉。

b.同源重组片段的克隆

利用Red同源重组系统对目的基因进行敲除。根据Genbank公布的sdhA基因序列在距其上下游约250bp处设计引物：

sdhA-F：5′-GTCCTGACGCTCTACATCATTTA-3′

sdhA-R：5′-GCTGGTTGAGTGCCGAAATC-3′

以MG1655（ΔsdhA::kan）为模板，通过PCR（聚合酶链式反应）扩增获得带有卡那霉素抗性的重组片段。PCR反应体系如下：

10×缓冲液5μl；10mmol/L dNTP混合液4μl；20μmol/L sdhA-F引物1μl；20μmol/LsdhA-R引物1μl；TaqDNA聚合酶0.5μl；模板DNA1μl，加水补至50μl；

b．电转化感受态细胞的制备

1)挑取带有pKD46质粒的大肠杆菌MG1655(ΔptsG ΔpoxB Δpta ΔiclR)，接种到LB培养基中，同时加入1ml10%阿拉伯糖，培养OD₆₀₀至0.6；

2)冰浴10min，收集菌体后利用10%的甘油洗涤三~五次；

c.电转化，筛选重组子

2)迅速加入900μl LB培养基，37℃，150rpm回复培养1h。

sdhA test F:5’-AAGCAACGCCTCCGCATTAG-3’

sdhA test R：5’-TAAACCTGGCAGCGGGCGAAT-3’

进行PCR检测。

d.抗性筛选标记的去除

将质粒pCP20转入重组子，30℃ 220rpm培养6h，然后转入到42℃220rpm培养过夜。用接种环蘸取菌液在无抗性平板上划线，将长出的单克隆转接到无抗性平板和卡那霉素抗性平板上，能够在无抗性平板上生长而不能在卡那霉素抗性平板上生长的即为抗性已去除的重组子，然后利用sdhA test F和sdhA test R进一步PCR检测确定是否去除成功。

e.去除抗性成功的菌株即为工程菌株MG1655(ΔptsG ΔpoxB Δpta ΔiclR ΔsdhA)，命名为QZ1111。

（6）arcA基因的敲除

菌株：MG1655(ΔptsG ΔpoxB Δpta ΔiclR ΔsdhA)

所使用的LB培养基为：1%蛋白胨，1%NaCl，0.5%酵母粉。

c.同源重组片段的克隆

利用Red同源重组系统对目的基因进行敲除。根据Genbank公布的arcA基因序列在距其上下游约250bp处设计引物：

arcA-F：5’-AACGAAGCGTAGTTTTATTGGGTGTCCG-3’

arcA-R：5’-TTGCTGGATGGTGTGATGTGGGGAC-3’

以MG1655（ΔarcA::kan）为模板，通过PCR（聚合酶链式反应）扩增获得带有卡那霉素抗性的重组片段。PCR反应体系如下：

10×缓冲液5μl；10mmol/L dNTP混合液4μl；20μmol/L arcA-F引物1μl；20μmol/LarcA-R引物1μl；TaqDNA聚合酶0.5μl；模板DNA1μl，加水补至50μl；

b．电转化感受态细胞的制备

1)挑取带有pKD46质粒的大肠杆菌MG1655(ΔptsG ΔpoxB Δpta ΔiclR ΔsdhA)，接种到LB培养基中，同时加入1ml10%阿拉伯糖，培养OD₆₀₀至0.6；

2)冰浴10min，收集菌体后利用10%的甘油洗涤三~五次；

c.电转化，筛选重组子

2)迅速加入900μl LB培养基，37℃，150rpm回复培养1h。

arcA test F:5’-GGATTCACCACGTTTATTAG-3’

arcA test R：5’-GGGCGATAATGAACGGTA-3’

进行PCR检测。

d.抗性筛选标记的去除

将质粒pCP20转入重组子，30℃220rpm培养6h，然后转入到42℃220rpm培养过夜。用接种环蘸取菌液在无抗性平板上划线，将长出的单克隆转接到无抗性平板和卡那霉素抗性平板上，能够在无抗性平板上生长而不能在卡那霉素抗性平板上生长的即为抗性已去除的重组子，然后利用arcA test F和arcA test R进一步PCR检测确定是否去除成功。

e.去除抗性成功的菌株即为工程菌株MG1655(ΔptsG ΔpoxB Δpta ΔiclR ΔsdhAΔarcA)，命名为QMJ03。

（7）ldhA基因的敲除

菌株：MG1655(ΔptsG ΔpoxB Δpta ΔiclR ΔsdhA ΔarcA)

所使用的LB培养基为：1%蛋白胨，1%NaCl，0.5%酵母粉。

d.同源重组片段的克隆

利用Red同源重组系统对目的基因进行敲除。根据Genbank公布的ldhA基因序列在距其上下游约250bp处设计引物：

ldhA-F：5’-CAGCGTCAACGGCACAAGAAT-3’

ldhA-R：5’-GCTGATTTCTGGCGGATTTTT-3’

以MG1655（ΔldhA::kan）为模板，通过PCR（聚合酶链式反应）扩增获得带有卡那霉素抗性的重组片段。PCR反应体系如下：

10×缓冲液5μl；10mmol/L dNTP混合液4μl；20μmol/L ldhA-F引物1μl；20μmol/LldhA-R引物1μl；TaqDNA聚合酶0.5μl；模板DNA1μl，加水补至50μl；

b．电转化感受态细胞的制备

1)挑取带有pKD46质粒的大肠杆菌MG1655(ΔptsG ΔpoxB Δpta ΔiclR ΔsdhAΔarcA)，接种到LB培养基中，同时加入1ml 10%阿拉伯糖，培养OD₆₀₀至0.6；

2)冰浴10min，收集菌体后利用10%的甘油洗涤三~五次；

c.电转化，筛选重组子

2)迅速加入900μl LB培养基，37℃，150rpm回复培养1h。

ldhA test F:5’-TGCAATACGTGTCCCGAG-3’

ldhA test R:5’-CAGTTTGCCTTCACCGCT-3’

进行PCR检测。

d.抗性筛选标记的去除

将质粒pCP20转入重组子，30℃ 220rpm培养6h，然后转入到42℃ 220rpm培养过夜。用接种环蘸取菌液在无抗性平板上划线，将长出的单克隆转接到无抗性平板和卡那霉素抗性平板上，能够在无抗性平板上生长而不能在卡那霉素抗性平板上生长的即为抗性已去除的重组子，然后利用ldhA test F和ldhA test R进一步PCR检测确定是否去除成功。

e.去除抗性成功的菌株即为工程菌株MG1655(ΔptsG ΔpoxB Δpta ΔiclR ΔsdhAΔarcA ΔldhA)，命名为埃希氏大肠杆菌(Escherichia coli)QMJ05。上述菌株已于2012年7月19日保藏在“中国典型培养物保藏中心”，保藏编号为CCTCC NO:M 2012291。

所构建工程菌株的碳源代谢途径见图1。如图所示改造的工程菌株E.coli QMJ05(保藏编号为CCTCC NO:M 2012291)的葡萄糖代谢途径中,ptsG的缺失将减少丙酮酸的积累，从而进一步减少流向乙酸的碳流量；poxB和pta基因的缺失阻断了乙酸盐的生成途径，从而降低了乙酸盐的生成；ldhA基因的敲除，阻断了乳酸的生成途径，低氧条件下使得大部分碳流量流向琥珀酸；iclR的缺失使乙醛酸途径被激活，增加琥珀酸的生成；sdhA的缺失可以阻断琥珀酸的进一步氧化；低氧条件下，大肠杆菌的TCA循环和乙醛酸循环中大部分酶都受到arcA的抑制。敲除arcA基因，有助于解除其对TCA循环和乙醛酸循环的抑制。

实施例2好氧和低氧条件下摇瓶发酵生产琥珀酸的结果比较

工程菌株：埃希氏大肠杆菌(Escherichia coli)QMJ05(保藏编号为CCTCC NO:M2012291)。

冷冻甘油管保存的大肠杆菌QMJ05划线接种于LB平板（1%蛋白胨，1%NaCl，0.5%酵母粉，1.5%琼脂粉），37℃培养16h。

将上述平板上长出的单菌落接入装有50ml的LB液体培养基（1%蛋白胨，1%NaCl，0.5%酵母粉）的250ml三角瓶中，37℃，220rpm转速震荡培养活化。

1）好氧培养：取2.5ml活化的培养液转接到装有50ml发酵培养基（Na₂HPO₄·12H₂O,1.51%;KH₂PO₄,0.35;NaCl,0.05%;NH₄Cl,0.05%;MgSO₄·7H₂O,0.25%;CaCl₂,0.01%;酵母粉,葡萄糖2%）的250ml三角瓶中，37℃，220rpm好氧培养110h，并以Na₂CO₃维持pH在7.0左右。琥珀酸的产量和对葡萄糖的产率分别达到27.57g/L和0.64mol/mol（表一）。

2）低氧培养：取5ml活化的培养液转接到装有100ml发酵培养基（Na₂HPO₄·12H₂O,1.51%;KH₂PO₄,0.35;NaCl,0.05%;NH₄Cl,0.05%;MgSO₄·7H₂O,0.25%;CaCl₂,0.01%;酵母粉,葡萄糖2%）的250ml三角瓶中，37℃，150rpm低氧培养110h，并以Na₂CO₃维持pH在7.0左右。琥珀酸的产量和对葡萄糖的产率分别达到35.7g/L和0.93mol/mol（表一）。

表一：

比较上述结果表明：在低氧条件下的工程菌琥珀酸的产量达到35.7g/L，相对好氧条件下提高了29.5%。琥珀酸产率提高了45.3%。

实施例3好氧和低氧条件下5L发酵罐生产琥珀酸结果比较

一级种子：将上述平板上长出的单菌落接入装有50ml的LB培养基（1%蛋白胨，1%NaCl，0.5%酵母粉）的250ml三角瓶中，37℃，220rpm震荡培养活化。

二级种子：取7.5ml活化的培养液转接到装有150ml发酵培养基（Na₂HPO₄·12H₂O,1.51%;KH₂PO₄,0.35;NaCl,0.05%;NH₄Cl,0.05%;MgSO₄·7H₂O,0.25%;CaCl₂,0.01%;酵母粉,葡萄糖2%）的1，000ml三角瓶中，37℃，220rpm好氧培养30h。

发酵：接种150mL二级种子到装有3.5L发酵培养基的5L发酵罐中，初始葡萄糖浓度为20g/L，

1）37℃好氧发酵，搅拌速度控制在285rpm。这个搅拌速度采用Alexeeva et al.(2002)。以Na₂CO₃维持pH在7.0左右，最终琥珀酸的产量和对葡萄糖的产率分别达到52.4g/L和0.62mol/mol。

2）37℃低氧发酵，维持发酵液溶氧5%-10%，最终琥珀酸的产量和对葡萄糖的产率分别达到66.2g/L和0.89mol/mol。

比较上述结果表明：在低氧条件下的工程菌琥珀酸的5L发酵罐产量达到66.2g/L，相对好氧条件下提高了26.3%，琥珀酸产率提高了43.5%。而好氧发酵的通气成本却高于低氧发酵。

Claims

1.一种大肠杆菌工程菌株，其特征在于：所述菌株名为埃希氏大肠杆菌(Escherichiacoli)QMJ05,菌株的基因型为MG1655 ΔptsG ΔpoxB Δpta ΔiclR ΔsdhA ΔarcA ΔldhA，该菌已于2012年7月19日保藏在“中国典型培养物保藏中心”，保藏编号为CCTCC NO:M2012291。

2.权利要求1所述大肠杆菌工程菌株在低氧条件下发酵生产琥珀酸的应用，其特征在于，所述低氧条件是指维持发酵液溶氧在5%～10%之间，在整个发酵过程中，补充浓度以重量百分比计为2%的葡萄糖，并用4M Na₂CO₃或NH₃·H₂O维持pH在7.0±0.1，发酵培养基组成以重量百分比计为：Na₂HPO₄·12H₂O,1.51%;KH₂PO₄,0.35%;NaCl,0.05%;NH₄Cl,0.05%;MgSO₄·7H₂O,0.25%;CaCl₂,0.01%;酵母粉,0.5%；余量为水。